Влияние поли-L-лизина на функционирование грамицидиновых ионных каналов в липидных мембранах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

;г5 од

КРЫЛОВ Андрей Владимирович у.^

ВЛИЯНИЕ ПОЛИ-Ы1ИЗИНА НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ГРАМИЦИДИНОВЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ В ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ

02.00.06- Химия высокомолекулярных соединений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук А.А.Ярославов доктор биологических наук Ю.Н.Антоненко

Официальные оппоненты: доктор химических наук С.Ю.Зайцев доктор биологических наук, профессор И.И.Иванов

Ведущая организация: Институт биохимической физики им.Н.М.Эмануэля РАН.

Защита состоится "-15"" ало^аТс- 2000 года в часов на заседании диссертационного совета Д 053.u5.43 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан "И"

г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.А.Миронова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время синтетические полиэлектролиты находят все большее применение в различных областях медицины и биологии. Это заставляет обратиться к исследованию их поведения в биологическом окружении и, в первую очередь, к изучению механизмов их взаимодействия с клетками и модельными системами, среди которых широкое распространение получили бислойные липидные мембраны (БЛМ). Известно, что клетки несут суммарный отрицательный поверхностный заряд. Поэтому наибольший интерес вызывает исследование взаимодействия отрицательно заряженных БЛМ с поликатионами.

Показано (Galla and Sackmann, 1975, Biochimica et Biophysica Acta, 401, 509-529; Hartmann and Galla, 1978, Biochimica et Biophysica Acta, 509, 474-490; Carrier et al., 1935, Biochimica et Biophysica Acta, 820, 131-139), что адсорбция синтетических поликатионов на отрицательно заряженных БЛМ может сопровождаться увеличением температуры фазового перехода липидного бислоя, латеральной сегрегацией и трансбислойной миграцией липидов, а также увеличением проницаемости мембраны по отношению к неорганическим ионам. Полученные результаты представляют интерес с точки зрения прогнозирования возможных последствий контакта поликатионов с клеточной поверхностью.

Вместе с тем известно, что клеточная мембрана наряду с липидами содержит большее количество (до 60 вес.%) разнообразных по составу и свойствам белков. Адсорбция поликатионов на поверхности клеток может влиять на функционирование мембранных белков и, в частности, тех, которые ответственны за ионный транспорт. Ионные каналы играют существенную роль в жизнедеятельности клеток. Функционирование ионных каналов лежит в основе выполнения клетками важнейших биологических функций, таких как проведение нервного возбуждения, мышечное сокращение, зрительная рецепция, гормональная регуляция. Несмотря на очевидную важность этого вопроса, к настоящему времени известно ограниченное число работ, посвященных исследованию влияния поликатионов на свойства ионных каналов. Имеющаяся информация носит описательный и отрывочный характер, что не позволяет сделать выводы о механизме воздействия поликатионов на функционирование ионных каналов.

Цель работы состояла в изучении влияния катионного полипептида поли-1_-лизина на функционирование встроенных в БЛМ природных каналообразующих пептидов грамицидинового ряда. В работе исследованы:

• влияние полилизина на интегральную проводимость БЛМ, индуцированную нейтральным грамицидином О (грР) и отрицательно заряженным О-пиромеллитилграмицидином (Пгр);

• влияние полилизина на кинетику фотоинактивации Пгр каналов в БЛМ;

• реакции конкурентного взаимодействия, протекающие в тройной системе полилизин — грамицидин — БЛМ.

Научная новизна. Исследовано взаимодействие катионного полипептида поли-Ь лизина с БЛМ, содержащими встроенные молекулы нейтрального грО или отрицательно заряженного Пгр. Показано, что полилизин не влияет на кинетику фотоинактивации грО, но оказывает существенное влияние на кинетику фотоинактивации Пгр: добавление возрастающих концентраций полилизина приводит вначале к росту, а потом уменьшению характерного времени фотоинактивации (ХВФ) Пгр. Уменьшение эффективности электростатического взаимодействия полилизина с молекулами Пгр, например, в результате увеличения ионной силы раствора, введения отрицательно заряженных липидов в мембрану и проч., уменьшают эффективность взаимодействия полилизина с молекулами Пгр и понижают влияние полилизина на кинетику фотоинактивации Пгр каналов. Предложен механизм взаимодействия полилизина с Пгр-содержащей БЛМ. Адсорбция полилизина на БЛМ сопровождается фазовым разделением в мембране и образованием Пгр доменов. Резкое ограничение подвижности молекул Пгр в доменах является причиной стабилизации проводящего состояния Пгр при низких и промежуточных концентрациях полилизина. Дальнейшая адсорбция полилизина приводит к изменению конформации адсорбированных макромолекул, разрыхлению доменов и уменьшению ХВФ.

При низких и высоких концентрациях полилизина кинетика фотоинактивации Пгр адекватно описывается моноэкспоненциальной зависимостью. При промежуточных концентрациях полилизина кинетика фотоинактивации описывается суммой двух экспонент. Быстрая кинетика соответствует инактивации мономерной формы Пгр, медленная — инактивации доменной формы Пгр.

Практическая значимость работы. Полученные результаты имеют принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия синтетических поликатионов и биологически активных веществ на их основе с клеточной мембраной, а также могут служить основой создания биосенсоров и датчиков для определения биологически активных веществ.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на 42 Ежегодном Съезде Американского Биофизического Общества, Канзас-Сити, США, 1998, Международной Конференции Студентов и Аспирантов "Ломоносов-98", Москва, 1998, 15 Европейской Конференции по химии поверхности Иерусалим, Израиль, 1998, II Всероссийском Биофизическом Съезде, Москва, 1999, XIII Международном биофизическом Конгрессе, Нью-Дели, Индия, 1999 и международной конференции "Lipid and Surfactant Dispersed Systems", Москва, 1999.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на -iXi страницах машинописного текста и включает Введение, Литературный обзор, Материалы и методы, Обсуждение результатов, Выводы и Список цитируемой литературы из iSif ссылок. В работе содержится рисунков.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

В Литературном обзоре проанализированы имеющиеся в литературе данные о влиянии поликатионов на структуру и свойства БЛМ, теоретическом обосновании фазового разделения, возникающего при взаимодействии олиго- и полипептидов с модельными мембранами, сконструированными из смеси нейтрального и отрицательно заряженного липида, кластеризации ионных каналов в клеточных и модельных мембранах. Дано описание структуры и свойств ионного канала грамицидина А, факторов, влияющих на его функционирование в БЛМ, изложены основы фотодинамического повреждения ионных каналов.

В Экспериментальной Части описаны объекты и методы исследования.

В работе был использован гидробромид поли-Ь-лизина. Были взяты фракции полимеров со средними молекулярными массами 3,800 (ПЛз.а), 12,000 (ПЛ12), 50,000 (ПЛ5о), 90,000 (ПЛэо), 102,000 (ПЛюо). Молекулярно-массовое распределение для фракций составляло 1.1-1.3. Была использована полиакриловая кислота со средней

молекулярной массой 250,000. Концентрации всех полиэлектролитах приведены в молях мономерных звеньев на литр раствора.

БЛМ формировали, используя модифицированный метод Мюллера-Рудина, на отверстии тефлоновой перегородки, разделяющей два отсека с буферными растворами. Мембраны формировали из 2% раствора чистого дифитаноилфофатидилхолина (ДФФХ) или его смеси с дифитаноилфосфатидил-глицерином (ДФФГ) или дифитаноилфосфатидилсерином (ДФФС) в н-декане. Полимеры, если не оговорено особо, добавляли в ячейку с двух сторон мембраны.

В работе использовали грамицидин D, состоящий из смеси грамицидинов А (72%), В (9%), С (19%), а также О-сукцинилграмицидин и О-пиромеллитилграмицидин. В типичном эксперименте раствор каналоформера добавляли в оба отсека ячейки в концентрации приблизительно 10"5 мг/мл.

Для определения электрической проводимости бислойных липидных мембран применялся метод фиксации напряжения. На мембрану подавали постоянную разность потенциалов, при этом с цис-стороны был потенциал заземления, а с транс-стороны отличный от нуля потенциал. В качестве фотосенсибилизатора использовался трисульфоалюмофталоцианин, который добавляли в ячейку с цис-стороны. Источником возбуждающего света служила ксеноновая лампа-вспышка с энергией около 0.3 Дж и длительностью =2 мс.

Эксперименты, если не оговорено особо, проводились в буферном растворе с pH 7, содержащем 100 мМ KCl, 10 мМ Трис, 10 мМ Mes, 50 цМ ЭДТА, при комнатной температуре (19-22°С).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В литературе довольно подробно изучен механизм влияния поликатионов на структуру модельных липидных мембран, в частности, показано при каких условиях происходят латеральная сегрегация и трансбислойная миграция липидов. Однако в состав биологических мембран наряду с липидами входят различные белковые комплексы, в том числе и те, которые отвечают за ионный транспорт. Функционирование ионных каналов необходимо для выполнения клетками своих биологических функций. Изучение влияния поликатионов на свойства ионных каналов в модельных липидных мембранах позволит приблизиться к пониманию механизма взаимодействия полиэлектролитов с клетками.

Взаимодействие полилизина с мембранами, содержащими встроенные

наналоформеры.

Грамицидин D (rpD) — природный пентадекапептид, получаемый из Bacillus brevis, является наиболее охарактеризованным на данный момент природным каналоформером.

Молекула грамицидина благодаря уникальному чередованию L- и D-аминокислот имеет конформацию спирали. Все гидрофобные боковые аминокислотные группы находятся снаружи спирали, обуславливая самопроизвольное встраивание молекулы грамицидина в бислой. Гидрофильные карбонильные группы выстилают внутреннюю поверхность поры, обеспечивая проход ионов. Длина одной спирали примерно равна толщине одного липидного монослоя, поэтому проводящий ток канал образуется только при взаимодействии двух молекул грамицидина, находящихся в разных монослоях мембраны (рис.1).. Такое взаимодействие стабилизировано четырьмя межмолекулярными

Рис.1. Схема, иллюстрирующая формирование канала грамицидина в БЛМ.

водородными связями. Образовавшийся проводящий димер через некоторое время, называемое средним временем жизни одиночного канала, распадается на составляющие его мономеры. В работе помимо нейтрального грО были также использованы О-сукцинилграмицидин (Сгр) и О-пиромеллитилграмицидин (Пгр), несущие один и три отрицательных заряда, соответственно.

Добавление каждого из перечисленных выше грамицидинов к БЛМ, сформированной из нейтрального ДФФХ, сопровождалось резким повышением уровня тока, текущего через мембрану, что являлось результатом встраивания грамицидиновых молекул в липидный бислой. Последующее добавление полилизина в раствор, омывающий мембрану со встроенным грО, не влияло на ее проводимость. Напротив, добавление полилизина к БЛМ со встроенным

отрицательно заряженным Пгр приводило к дополнительному увеличению проводимости мембраны. Это свидетельствовало об адсорбции полилизина на мембране, очевидно, за счет образования ионных контактов между его положительно заряженными звеньями и отрицательно заряженными группами Пгр. Избыток полиакриловой кислоты полностью вытеснял адсорбированный полилизин в раствор (в виде отрицательно заряженного интерполиэлектролитного комплекса) и устранял его влияние на проводимость мембраны.

Изучение свойств ионных каналов грамицидина и его производных методом сенсибилизированной фотоинактивации.

Обнаруженный нами эффект влияния полилизина на проводимость БЛМ, содержащей отрицательно заряженный грамицидин, может быть связан с возрастанием времени жизни грамицидиновых каналов при их взаимодействии с полилизином. Для проверки этого предположения была исследована кинетика распада-образования грамицидиновых каналов с использованием методики сенсибилизированной фотоинактивации грамицидина. Этот подход позволяет провести оценку времени жизни одиночного канала грамицидина по измерению кинетики светоиндуцированного спада тока, текущего через БЛМ. Суть метода состоит в следующем. В раствор, омывающий мембрану, добавляется фотосенсибилизатор— трисульфоалюмофталоцианин. При освещении мембраны вспышкой видимого света (рис.2) молекулы фталоцианина, адсорбированные на поверхности мембраны, поглощают кванты электромагнитного излучения и генерируют активные формы кислорода. Основной мишенью последующего окислению являются триптофановые остатки в молекуле грамицидина. Повреждения одного триптофанового остатка достаточно для полной инактивации канала. Ранее было показано (Rokitskaya et al., 1996, Biochimica et Biophysics Acta, 1275, 221-226), что в использованных нами условиях фотодинамическому повреждению подвержены в основном мономерные единицы грамицидина, а доля окисляемого грамицидина, находящегося в составе димеров, не превышает 1%. Уменьшение концентрации мономеров грамицидина в мембране приводит к диссоциации димеров, что в свою очередь ведет к снижению величины тока. Скорость окисления триптофанов в грамицидине гораздо выше скорости диссоциации димеров, поэтому лимитирующей стадией является распад каналов.

Рис.2. Схема, иллюстрирующая процесс фотоинактивации грамицидина.

Регистрируемый в эксперименте спад тока, возникающий после вспышки света, обуславливается только диссоциацией димерных форм грамицидина.

Типичная кинетическая кривая фотоинактивации грамицидина D представлена на рис.3. Видно, что сразу же за освещением мембраны вспышкой видимого света происходит уменьшение ее проводимости. Такая кинетическая кривая хорошо апроксимируется моноэкспоненциальной зависимостью (Rokitskaya et al, 1996, Biochimica et Biophysica Acta, 1275, 221-226):

/(') = 4+(/o-4)exp(-'/r),

где /а - ток через мембрану в начальный момент времени (до вспышки), /«, -ток через мембрану после установления стационарного значения, т - коэффициент показателя экспоненты (далее именуется характерное время фотоинактивации, ХВФ). В дальнейшем, если это не оговорено особо, расчеты значений т выполнены в предположении моноэкслоненциального характера кинетики фотоинактивации. Наиболее информативным параметром этого уравнения является величина т, которая близка значению среднего времени жизни грамицидинового канала. Поэтому, говоря ниже о ХВФ, фактически мы будем вести речь о времени жизни канала грамицидина. Другой параметр кинетики фотоинактивации: относительная

амплитуда светоиндуци-рованного уменьшения тока,

а = —-—, отражает долю 'о

диссоциирующих после

вспышки димеров.

Оказалось, что

добавление полилизина

практически не влияет на кинетику фотоинактивации нейтрального грО, встроенного в нейтральную БЛМ, сформированную из ДФФХ. Если грО был встроен в мембрану, сформированную из смеси ДФФХ и отрицательно заряженного ДФФГ в молярном соотношении ы:ч, то дооавление полилизина к ней приводило только к уменьшению амплитуды фотоинактивации, ХВФ при этом не изменялось. Уменьшение амплитуды фотоинактивации в присутствии поликатиона можно объяснить тем, что он вызывает частичную агрегацию отрицательно заряженных молекул фталоцианина, уменьшая тем самым концентрацию генерируемых активных форм кислорода.

На рис.4 представлены результаты, полученные при исследовании влияния полилизина на кинетику фотоинактивации отрицательно заряженного Пгр, встроенного в мембрану из ДФФХ. Кривая 1 соответствует фотоинактивации в отсутствии полимера. При добавлении 20 цМ полилизина в раствор, омывающий мембрану только с одной ее стороны (кривая 2), не наблюдали значительных изменений ни амплитуды, ни характеристического времени фотоинактивации. Если же полилизин в той же концентрации добавляли к мембране с двух сторон (кривая 3), то это приводило, во-первых, к уменьшению амплитуды фотоинактивации в два раза, и, во-вторых, к увеличению ХВФ с 0.6 до 3.2 секунд. Таким образом, полилизин, взаимодействуя со встроенным в БЛМ Пгр, способен в значительной степени стабилизировать открытое состояние ионного канала, что проявляется в

время, с

Рис.3. Типичная кинетика спада индуцированного ПГр тока через БЛМ после вспышки видимого света в присутствии 1 мкМ трисульфоалюмо-фталоцианина. БЛМ сформирована из 2% раствора ДФФХ в н-декане. Момент вспышки света происходил в нулевой- момент времени. Сплошная кривая соответствует экспериментальной кинетической зависимости, пунктирная кривая- теоретической моноэкспоненциальной зависимости. 10- начальная, конечная

величина тока, а- относительная амплитуда светоиндуцированного уменьшения тока.

замедлении кинетики

фотоинакгивации. Если в раствор, омывающий

мембрану с адсорбированным полилизином, добавляли избыток полиакриловой кислоты, то амплитуда и ХВФ уменьшались до исходных значений (кривая 4). Таким образом, десорбция полилизина с мембраны в виде комплекса с полиакрилат-анионом приводит к тому, что свойства ионных каналов восстанавливаются.

Полученные результаты показывают, что влияние полилизина на кинетику распада-

образования каналов Пгр в плоских БЛМ обуславливается электростатическим взаимодействием положительно заряженных лизиновых остатков в молекуле полимера с отрицательно заряженной пиромеллитовой группировкой, находящейся на С-конце молекулы каналоформера. Такая иммобилизация молекул Пгр, по-видимому, приводит к уменьшению их латеральной и вращательной подвижности, и, следовательно, к стабилизации открытого состояния канала, что проявляется как увеличение ХВФ.

Взаимодействие полилизинов разной молекулярной массы с О-пиромеллитилграмицидином в БЛМ.

На рис.5 представлены зависимости ХВФ Пгр каналов от концентрации добавленного полилизина для трех фракций полимера с молекулярными массами 3,800, 12,000 и 90,000. Видно, что все концентрационные зависимости имеют

100

£ 95

30

85

80

0

-2 -3 ■4 1 \ 3

0 2 4 6 9 3 1

4 ^^

го

2 4 5

время, С

10

Рис.4. Влияние полилизина ПЛ12 на кинетику фотоинактивации О-пиромеллитилграмицидина в БЛМ в присутствии 1 цМ трисульфоалюмо-фталоцианина. Кривая 1 соответствует фотоинактивации в отсутствии полилизина. ПЛ12 добавляли в концентрации 20 цМ с одной (кривая 2) и с двух сторон мембраны (кривая 3). Последующее добавление 100 рМ ПАК250 (кривая 4) с двух сторон мембраны снимает эффект полилизина. Вспышка света происходила в момент времени 1=0. На вставке данные кривых 1 и 3 представлены в координатах (1-1*,)/(1о-1») -время, где I® — стационарный уровень тока.

8

одинаковую колоколообразную форму: добавление возрастающих концентраций полилизина приводит вначале к росту, а потом уменьшению ХВФ.

Мы предлагаем следующий механизм, описывающий взаимодействие полилизина с БЛМ, содержащей отрицательно заряженные молекулы Пгр. По-видимому, в исходной мембране молекулы Пгр и липида распределены гомогенно (рис.бА). Добавление полилизина приводит к его адсорбции на мембране и формированию комплексов

полилизин - Пгр, стабилизированных ионными связями звеньев поликатиона и карбоксильных групп Пгр (рис.бБ). Совокупность молекул каналоформера, связанных с одной цепью полилизина, мы будем называть кластером. Увеличение концентрации полилизина в растворе приводит к возрастанию количества кластеров в БЛМ. При некоторой концентрации полилизина кластеры начинают объединяться в более крупные домены (рис.бВ), что сопровождается микрофазовым разделением в мембране. Этот процесс качественно совпадает с описанным ранее процессом латеральной сегрегации в смешанных мембранах, приготовленных из липидов или липидолодобных ПАВ, под действием адсорбированных полиэлектролитов (Boggs et а(., 1977, Biochemistry, 16, 2325-2329; Yaroslavov et at., 1994, FEBS Letters, 340,121-123).

Очевидно, связывание молекул Пгр в комплекс с полилизином должно сопровождаться ограничением их латеральной и вращательной подвижности. Это, в свою очередь, должно приводить к стабилизации грамицидиновых каналов (возрастанию времени их жизни) и увеличению ХВФ. Как следует из рисунка 5, последнее и наблюдается в эксперименте.

По-видимому, стабилизация грамицидиновых каналов в присутствии полилизина начинается только на стадии формирования доменов; кластеризации молекул грамицидина в пределах одной адсорбированной цепи поликатиона для этого недостаточно. На это, в частности, указывает нелинейный (S-образный)

ю-5 ю-4 ю-3 10'!

[ПЛ], м

Рис.5. Зависимость характерного времени фотоинаетивации ПГр в мембранах из ДФФХ от концентрации полилизина для полимеров разной молекулярной массы. Кривая, обозначенная квадратиками соответствует ПЛзд, кружками — ПЛ12, ромбиками — ПЛз.а.

о

аза^>50с>

« "о о о э о о г»о

А

^О ЭОООЗ'

Э Э О ээ э

ЕЭШЕЭЕЗ

"»Оввь^3 — -

о о о о о

эзооо

в

характер зависимости ХВФ от

концентрации полилизина.

Действительно, если бы

увеличение ХВФ было следствием

образования кластеров, то

зависимость ХВФ от концентрации

полилизина описывалась бы

ленгмюровской кривой с

постепенным выходом на

насыщение. Однако на самом

деле это не так.

Снижение ХВФ при высоких

концентрациях полилизина можно f

объяснить следующим образом. По-видимому, при малой степени заполнения поверхности

мембраны полилизином его молекулы принимают

конформацию, при которой количество ионных контактов с мембраной максимально (рис.бВ) (Macdonald et al., 1998, Biochem. Cell Biol., 76, 452-464). Адсорбция дополнительных количеств полилизина приводит к образованию петель с избыточным положительным зарядом. Электростатическое расталкивание находящихся на таких петлях зарядов приводит к уменьшению плотности упаковки молекул Пгр в доменах за счет встраивания в них дополнительного количества молекул нейтрального липида (рис.бГ), что и приводит к уменьшению ХВФ.

гтч/

SKs.'-^gggB.jga;

ед

е.

г

и*

■

Рис.6. Схема взаимодействия поликатиона со встроенными в БЛМ молекулами ПГр.

Конкурентные взаимодействия в системе БЛМ-каналоформер-поликатион.

Поскольку взаимодействие полилизина с Пгр обусловлено образованием ионных контактов между боковыми аминокислотными остатками поликатиона и отрицательно заряженной пиромеллитовой группой молекулы Пгр, то, очевидно, что изменение ионной силы раствора и появление дополнительных зарядов в мембране скажется на эффективности такого взаимодействия и, следовательно, на величине ХВФ.

На рис.7 приведены зависимости ХВФ Пгр от концентрации полилизина при разных значениях ионной силы. Видно, что увеличение концентрации хлорида калия приводит к заметному уменьшению максимального значения ХВФ. Если для 50 и 100 мМ KCl максимальное ХВФ равно примерно 17 и 16 секундам соответственно, то при 150 мМ максимум х составляет 6.5 секунд, а при 200 мМ хлорида калия — всего 1.9 секунды. При 500 мМ KCl полилизин вообще не вызывает замедления кинетики фотоинактивации (данные не показаны). Очевидно, повышение концентрации низкомолекулярного электролита приводит к ослаблению ионных связей между положительно заряженными цепями полимера и отрицательно заряженными группами в составе каналоформера. Следует также отметить, что

ослабление взаимодействия

полилизина с молекулами Пгр проявляется и в том, что максимум на концентрационной кривой по мере увеличения ионной силы раствора сдвигается в область больших концентраций полимера.

Известно, что катионы двухвалентных металлов более эффективно экранируют заряды мембран в водных растворах, чем одновалентные. Мы провели эксперимент, в котором мембрану формировали в буфере, содержащем 100 мМ KCl и 3 мМ CaCI2. Оказалось, что добавление хлорида кальция в указанной

20

16

12

в

10"'

ю-«

ю-3

10-5 10-4

[ПЛ12], М

Рис.7. Зависимость характерного времени фотоинактивации ПГр от концентрации добавленного полилизина ПЛ12 при различных концентрациях хлорида калия в омывающем мембрану растворе (кривая, обозначенная кружками соответствует буферу с 50 мМ KCl, треугольниками — 100 мМ KCl, квадратиками — 150 мМ KCl, ромбиками — 200 мМ KCl). Количество каналов в БЛМ во всех проведенных экспериментах было примерно одинаковым.

концентрации значительно

уменьшает эффект полилизина на кинетику фотоинактивации Пгр.

Если вместо Пгр, несущего три отрицательных заряда, в мембрану встроить однозарядный Сгр, то добавление полилизина к такой мембране вплоть до концентрации 100 мМ не приводит к увеличению ХВФ. Очевидно, уменьшение плотности отрицательного заряда на мембране при такой замене приводит к

резкому уменьшению эффективности адсорбции полилизина и снижению его способности оказывать влияние на ХВФ грамицидиновых каналов.

Во всех описанных ранее экспериментах Пгр встраивали в мембрану, сконструированную из нейтрального ДФФХ. В этом случае адсорбция поликатиона на БЛМ определялась его электростатическим взаимодействием с тремя отрицательными зарядами молекулы каналоформера. В следующем эксперименте Пгр встраивали в мембрану, сформированную из смеси ДФФХ с отрицательно

заряженным

дифитаноилфосфатилилглицери ном (ДФФГ). На рис.8 приведены зависимости ХВФ грамицидиновых каналов от концентрации добавленного полилизина

молекулярной массы 12,000 для мембран с разным содержанием ДФФГ. При введении в мембрану 10% отрицательно заряженного липида максимальное значение ХВФ снижается в два раза по сравнению с нейтральной мембраной. Кроме того, происходит сдвиг максимального т в область больших концентраций полилизина. Если же мембрану формировали из смеси равного количества отрицательного заряженного и нейтрального липида, то кинетика фотоинактивации Пгр была практически не чувствительна к количеству добавленного полилизина.

Таким образом, введение в мембрану дополнительного отрицательного заряда ДФФГ заметно ослабляет эффект замедления кинетики фотоинактивации, вызываемый полилизином. Дополнительно вводимый липид выступает как конкурент каналоформера за связывание с положительно заряженной цепью полилизина. Это уменьшает эффективность связывания полилизина с Пгр и ослабляет влияние поликатиона на ХВФ.

[ПЛ12], м

Рис.8. Зависимость характерного времени фотоинактивации ПГр (т), от концентрации добавленного полилизина ПЛ12. Квадраты соответствуют мембране, сформированной из чистого ДФФХ, кружки - из смеси ДФФХ и ДФФГ состава 9:1; треугольники — из смеси ДФФХ и ДФФГ состава 1:1.

Конкуренция иного рода наблюдается при введении в систему полиакрилат-анионов. Как было описано выше, добавление избытка полиакриловой кислоты к полилизину, адсорбированному на БЛМ со встроенным Пгр, приводит к десорбции поликатиона с мембраны. При этом ХВФ восстанавливается до прежних значений.

Биэкспоненциальный характер кинетики фотоинактивации.

Все приведенные выше оценки ХВФ грамицидиновых каналов были получены в предположении о моноэкспоненциальном характере кинетики фотоинакгивации. Вместе с тем, как это следует из предложенной нами схемы взаимодействия полилизина с БЛМ, в присутствии полилизина в мембране должны обнаруживаться два типа ионных каналов: сформированные одиночными молекулами отрицательно заряженного Пгр и молекулами Пгр, связанными с адсорбированным поликатионом, то есть объединенными в домены. При увеличении концентрации полилизина в растворе, омывающем мембрану, доля каналоформера, включенного в домены, должна возрастать, а доля единичных каналов уменьшаться. Это означает, что кинетика фотоинактивации Пгр в присутствии лолилиэина должна описываться суммой как минимум двух экспонент с двумя разными значениями т. Особенно отчетливо это должно проявляться на промежуточных стадиях заполнения мембраны адсорбированным полилизином.

Это соображение заставило нас вновь обратиться к экспериментальным данным по фотоинактивации Пгр в присутствии полилизина и проанализировать их с учетом возможности биэкспоненциального характера кинетики этого процесса. Оказалось, что при низких и высоких концентрациях полилизина кинетика фотоинактивации Пгр адекватно описывается моноэкспоненциальной зависимостью. Это соответствует присутствию в мембране лишь одной формы Пгр — мономерной и доменной, соответственно. При промежуточных концентрациях полилизина кинетика фотоинактиаации наилучшим образом описывается суммой двух экспонент. Быстрая мода с низким ХВФ соответствует диссоциации одиночных каналов Пгр, медленная мода с высоким ХВФ —диссоциации молекул Пгр, включенных в домены.

На рис.9 воспроизведены данные рис.5 о влиянии полилизина молекулярной массы 3,800 на ХВФ Пгр каналов в предположении моноэкспоненциального характера кинетики фотоинактивации (серые кружки). В дополнение к этому в промежуточной области концентраций полилизина приведены результаты обработки экспериментальных данных с учетом биэкспоненциального характера кинетики фотоинактивации: закрытые треугольники соответствуют экспоненте с меньшим значением ХВФ, открытые — экспоненте с большим значением ХВФ. Видно, что биэкспоненциальный характер

кинетики начинает проявляться при концентрации поликатиона большей 5 цМ. Поведение обеих экспонент при этом качественно подчиняется описанным выше закономерностям: в обоих случаях увеличение концентрации полилизина приводит вначале к увеличению, а затем к уменьшению ХВФ.

Как упоминалось выше, в простейшем случае кинетика фотоинактивации Пгр каналов должна описываться суммой двух экспонент с двумя различными ХВФ, которые должны оставаться постоянными при изменении концентрации поликатиона. Меняться при этом должны только вклады (удельные веса) этих экспонент в кинетику фотоинактивации. На практике дело обстоит несколько иначе. Как следует из данных рис.9, значения ХВФ обоих экспонент меняются по мере увеличения концентрации полилизина в растворе. По-видимому, в исследованной нами системе существует распределение образующихся доменов по размеру. Если это так, то медленный рост ХВФ при увеличении концентрации полилизина может отражать процесс укрупнения доменов.

[ПЛЗВ], м

Рис.9. Зависимость характерного времени фотоинактивации ПГр от концентрации добавленного ПЛэ.д- Кружками обозначены значения ХВФ, полученные обсчетом экспериментальных данных по моноэкспоненциальному спаду тока, треугольники соответствуют обсчету тех же данных, проведенных по бизкспоненциальной зависимости; открытые треугольники относятся к экспоненте с большим характерным временем, закрытые — к экспоненте с меньшим показателем.

выводы.

1. Исследовано взаимодействие катионного полипептида поли-1_-лизина с бислойными липидными мембранами (БЛМ), содержащими встроенные молекулы нейтрального грамицидина О (грй) или отрицательно заряженного О-пиромеллитилфамицидина (Пгр). Показано, что полилизин не взаимодействует с нейтральной БЛМ. Добавление полилизина к отрицательно заряженной БЛМ приводит к его адсорбции на мембране.

2. Показано, что полилизин не влияет на кинетику фотоинактивации ионных каналов, сформированных нейтральным фй. В то же время полилизин оказывает существенное влияние на кинетику фотоинактивации каналов, сформированных отрицательно заряженным Пгр: добавление возрастающих концентраций полилизина приводит вначале к росту, а потом к уменьшению характерного времени фотоинактивации (ХВФ) Пгр.

3. Увеличение ионной силы раствора, введение отрицательно заряженных липидов в мембрану и уменьшение степени полимеризации полилизина снижают эффективность взаимодействия полилизина с молекулами Пф и уменьшают влияние полилизина на кинетику фотоинактивации Пгр каналов. Полианионы полностью вытесняют адсорбированный полилизин с поверхности БЛМ и восстанавливают кинетические свойства Пгр каналов.

4. Предложен механизм взаимодействия полилизина с БЛМ, содержащей молекулы Пгр. Адсорбция полилизина на БЛМ, обусловленная электростатическим взаимодействием звеньев поликатиона и карбоксильных групп Пгр, сопровождается фазовым разделением в мембране и образованием доменов, обогащенных Пгр, в которых латеральная и вращательная подвижность молекул Пгр резко ограничена. Это является причиной стабилизации проводящего состояния Пгр при низких и промежуточных концентрациях полилизина. Дальнейшая адсорбция полилизина приводит к увеличению доли звеньев, сосредоточенных в петлях и хвостах адсорбированных макромолекул. Это сопровождается изменением состава доменов (их разрыхлением) и уменьшением ХВФ.

5. При низких и высоких концентрациях полилизина кинетика фотоинактивации Пф адекватно описывается моноэкспоненциальной зависимостью, что соответствует присутствию в мембране формы Пгр в виде одиночных каналов или в виде доменов, соответственно. При промежуточных концентрациях полилизина кинетика фотоинактивации описывается суммой двух экспонент. Быстрая мода с

низким ХВФ соответствует диссоциации одиночных каналов Пгр, медленная мода с высоким ХВФ — диссоциации молекул Пгр, включенных в доменную фазу.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. A.V.Krylov, Yu.N.Antonenko, E.A.Kotova, T.I.Rokitskaya, A.A.Yaroslavov Polylysine Decelerates Kinetics of Negatively Charged Gramicidin Channels as Shown by Sensitized Photoinactivation, FEBS Letters, 1998, 440,1-2, 235-238.

2. A.V.Krylov, Yu.N.Antonenko, A.A.Yaroslavov, T.I.Rokitskaya, E.A.Kotova, R.E.Koeppe, II, D.V.Greathouse, O.S.Andersen Polylysine Decelerates Channel Kinetics of Negatively Charged Gramicidin as Shown by Sensitized Photoinactivation, Biophysical Journal, 1998,74, 387a.

3. A.V.Krylov, Yu.N.Antonenko, E.A.Kotova, and YaroslavovA.A. Deceleration of O-pyromellitylgramicidin channel kinetics in bilayer lipid membranes by polylysines of different chain length, Journal of Biosciences, 1999, 24, 1, 125.

4. A.V.Krylov, E.A.Kotova, A.A.Yaroslavov, and Antonenko Yu.N. Segregation of O-pyromellitylgramicidin Channels by Polylysines of Different Chain Lengths in Lipid Bilayers Studied by Sensitized Photoinactivation Biophysical Journal (направлено в печать).

5. A.V.Krylov, Yu.N.Antonenko, E.A.Kotova, and Yaroslavov A.A. The Influence of Polylysines of Different Chain Length on Channel Kinetics of O-pyromellitylgramicidin in Bilayer Lipid Membranes, Proceedings of the International Symposium on "Lipid and Surfactant Dispersed Systems", 79-80, Moscow, 26-28 September 1999.

6. А.В.Крылов Стабилизация каналов О-пиромеллитилграмицидина в бислойных липидных мембранах под действием поли^-лизина, в сборнике тезисов Международной Конференции Студентов и Аспирантов "Ломоносов-98", Москва, 8-10 апреля, 1998.

7. A.V.Krylov, Yu.N.Antonenko, A.A.Yaroslavov, E.A.Kotova The poly-L-lysine interaction with the negatively charged gramicidin A in black lipid membranes в сборнике тезисов 15 Европейской Конференции по химии поверхности Иерусалим, Израиль, 18-22 октября, 1998.

8. А.В.Крылов, Ю.Н.Антоненко, Е.А.Котова, А.А.Ярославов Действие поли^-лизина на кинетику фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов в бислойных липидных мембранах, в сборнике тезисов II Всероссийского Биофизического Съезда, VII.53, 526, Москва, 22-28 августа, 1999.

ВВЕДЕНИЕ.

1. Взаимодействие полимеров с модельными и клеточными мембранами.

1.1. Адсорбция полипептидов на БЛМ.

1.2. Фазовое разделение в БЛМ, индуцированное адсорбцией полиэлектролитов.

1.3. Взаимодействие поликатионов с ионными каналами в БЛМ.

2. Ионный канал грамицидина А в бислойных липидных мембранах. Факторы, влияющие на его функционирование.

2.1. Структура канала грамицидина А.

2.2. Факторы, влияющие на функционирование канала грамицидина.

2.3. Роль триптофановых остатков молекулы грамицидина в ориентации и функционировании канала.

3. Фотодинамическое воздействие на природные и искусственные мембраны.

3.1. Повреждение ионных каналов при ФДВ.

3.2. Изучение повреждения канала грамицидина А, вызванного ультрафиолетовым и ионизирующим излучением, а также фотодинамическим воздействием.

3.3. Изучение кинетики формирования-распада канала грамицидина методом сенсибилизированной фотоинактивации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Используемые материалы.

1.1. Фосфолипиды.

1.2. Полимеры.

1.3. Каналоформеры.

1.4. Фотосенсибилизаторы.

1.5. Буферные растворы.

2. Ячейки и электроды.

3. Формирование мембран.

4. Источники света.

5. Измерение проводимости мембраны при постоянном потенциале.

6. Измерение граничных потенциалов методом компенсации внутримембранного поля.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Взаимодействие полилизина с плоскими липидными мембранами.

2. Влияние полилизина на проводимость мембран, содержащих грамицидин.

3. Изучение свойств ионных каналов грамицидина и его производных методом сенсибилизированной фотоинактивации.

4. Образование обогащенных О-пиромеллитилграмицидином доменов при адсорбции полилизина на БЛМ.

5. Взаимодействие полилизинов разной молекулярной массы с О-пиромеллитилграмицидином, встроенным в БЛМ.

6. Конкурентные взаимодействия в системе БЛМ - каналоформер -поликатион.

7. Биэкспоненциальный характер кинетики фото инактивации. 88 ВЫВОДЫ. 93 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

В последнее время синтетические полиэлектролиты находят все большее применение в различных областях медицины и биологии. Это заставляет обратиться к исследованию их поведения в биологическом окружении и, в первую очередь, к изучению механизмов их взаимодействия с клетками и модельными системами, среди которых широкое распространение получили бислойные липидные мембраны (БЛМ). Известно, что клетки несут суммарный отрицательный поверхностный заряд. Поэтому наибольший интерес вызывает исследование взаимодействия отрицательно заряженных БЛМ с поликатионами.

Показано [1-3], что адсорбция синтетических поликатионов на отрицательно заряженных БЛМ может сопровождаться увеличением температуры фазового перехода липидного бислоя, латеральной сегрегацией и трансбислойной миграцией липидов, а также увеличением проницаемости мембраны по отношению к неорганическим ионам. Полученные результаты представляют интерес с точки зрения прогнозирования возможных последствий контакта поликатионов с клеточной поверхностью.

Вместе с тем известно, что клеточная мембрана наряду с липидами содержит большое количество (до 60 вес.%) разнообразных по составу и свойствам белков. Адсорбция поликатионов на поверхности клеток может влиять на функционирование мембранных белков и, в частности, тех, которые ответственны за ионный транспорт. Ионные каналы играют существенную роль в жизнедеятельности клеток. Функционирование ионных каналов лежит в основе выполнения клетками важнейших биологических функций, таких как проведение нервного возбуждения, мышечное сокращение, зрительная рецепция, гормональная регуляция. Несмотря на очевидную важность этого вопроса, к настоящему времени известно ограниченное число работ, посвященных исследованию влияния поликатионов на свойства ионных каналов. Имеющаяся 4 информация носит описательный и отрывочный характер, что не позволяет сделать выводы о механизме воздействия поликатионов на функционирование ионных каналов.

Цель настоящей работы состояла в изучении влияния катионного полипептида поли-1-лизина на функционирование встроенных в БЛМ природных каналообразующих пептидов грамицидинового ряда. В работе исследованы: влияние полилизина на интегральную проводимость БЛМ, индуцированную нейтральным грамицидином Р и отрицательно заряженным О-пиромеллитил грамицидином; влияние полилизина на кинетику фотоинактивации пиромеллитилграмицидиновых каналов в БЛМ; реакции конкурентного взаимодействия, протекающие в тройной системе полилизин — грамицидин — БЛМ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ВЫВОДЫ.

1. Исследовано взаимодействие катионного полипептида поли-1-лизина с бислойными липидными мембранами (БЛМ), содержащими встроенные молекулы нейтрального грамицидина й или отрицательно заряженного О-пиромеллитилграмицидина (Пгр). Показано, что полилизин не взаимодействует с нейтральной БЛМ. Добавление полилизина к отрицательно заряженной БЛМ приводит к его адсорбции на мембране.

2. Показано, что полилизин не влияет на кинетику фотоинактивации ионных каналов, сформированных нейтральным грамицидином О. В то же время полилизин оказывает существенное влияние на кинетику фотоинактивации каналов, сформированных отрицательно заряженным Пгр: добавление возрастающих концентраций полилизина приводит вначале к росту, а потом уменьшению характерного времени фотоинактивации (ХВФ) Пгр.

3. Увеличение ионной силы раствора, введение дополнительных отрицательно заряженных липидов в мембрану и снижение молекулярной массы полилизина снижают эффективность взаимодействия полилизина с молекулами Пгр и понижают влияние полилизина на кинетику фотоинактивации Пгр каналов. Полианионы полностью вытесняют адсорбированный полилизин с поверхности БЛМ и восстанавливают кинетические свойства Пгр каналов.

4. Предложен механизм взаимодействия полилизина с БЛМ, содержащей молекулы Пгр. Адсорбция полилизина на БЛМ, обусловленная электростатическим взаимодействием звеньев поликатиона и карбоксильных групп Пгр, сопровождается фазовым разделением в мембране и образованием доменов, обогащенных Пгр, в которых латеральная и вращательная подвижность молекул Пгр резко ограничена. Это является причиной стабилизации проводящего состояния Пгр при низких и промежуточных концентрациях полилизина. Дальнейшая адсорбция полилизина приводит к увеличению доли

94 звеньев, сосредоточенных в петлях и хвостах адсорбированных макромолекул. Это сопровождается изменением состава доменов (их разрыхлением) и уменьшением ХВФ.

5. При низких и высоких концентрациях полилизина кинетика фотоинактивации Пгр адекватно описывается моноэкспоненциальной зависимостью, что соответствует присутствию в мембране Пгр в виде одиночных каналов и формы, включенной в образование доменов, соответственно. При промежуточных концентрациях полилизина кинетика фотоинактивации описывается суммой двух экспонент. Быстрая мода с низким ХВФ соответствует диссоциации одиночных каналов Пгр, медленная мода с высоким ХВФ — распаду каналов Пгр, включенных в доменную фазу.

1. Galla H.J., Sackmann Е. (1975) Chemically induced lipid phase separation in model membranes containing charged lipids: a spin label study. Biochim BiophysActa, 401(3), 509-529.

2. Hartmann W., Galla H.J. (1978) Binding of polylysine to charged bilayer membranes: molecular organization of a lipid-peptide complex. Biochim Biophys Acta, 509(3), 474-490.

3. Carrier D., Dufourcq J., Faucon J.F., Pezolet M. (1985) A fluorescence investigation of the effects of polylysine on dipalmitoylphosphatidylglycerol bilayers. Biochim Biophys Acta, 820, 131-139.

4. Hammes G.G., Schullery S.E. (1970) Structure of macromolecular aggregates. II. Construction of model membranes from phospholipids and polypeptides . Biochemistry, 9( 13), 2555-2563.

5. Jozefonvicz J., Jozefowicz M. (1990) Interactions of biospecific functional polymers with blood proteins and cells. J Biomater Sci Poiym Ed, 1(3), 147165.

6. Mcintosh T.J., Waldbillig R.C., Robertson J.D. (1977) The molecular organization of asymmetric lipid bilayers and lipid- peptide complexes. Biochim Biophys Acta, 466(2), 209-230.

7. King Т.Е., Steinrauf L.K. (1972) Stabilization of a lipid bilayer membrane by polylysine. Biochem Biophys Res Commun, 49(6), 1433-1437.

8. Carrier D., Pezolet M. (1986) Investigation of polylysine-dipalmitoylphosphatidylglycerol interactions in model membranes. Biochemistry, 25(14), 4167-4174.

9. Brown L.R., Wuthrich K. (1977) NMR and ESR studies of the interactions of cytochrome c with mixed cardiolipin-phosphatidylcholine vesicles. Biochim BiophysActa, 468(3), 389-410.

10. Haverstick D.M., Glaser M. (1989) Influence of proteins on the reorganization of phospholipid bilayers into large domains. Biophys J, 55(4), 677-682.

11. Boggs J.M., Rangaraj G., Moscarello M.A., Koshy K.M. (1985) Interaction of myelin basic protein and polylysine with synthetic species of cerebroside sulfate. Biochim BiophysActa, 816(2), 208-220.

12. Orr J.W., Newton A.C. (1992) Interaction of protein kinase C with phosphatidylserine. 1. Cooperativity in lipid binding. Biochemistry, 31(19), 4661-4667.

13. Goldberg E.M., Borchardt D.B., Zidovetzki R. (1998) Effects of histone and diolein on the structure of phosphatidylcholine/phosphatidylserine or phosphatidylcholine/phosphatidylglycerol bilayers. Eur J Biochem, 258(2), 722-728.

14. Carrier D., Pezolet M. (1984) Raman spectroscopic study of the interaction of poly-L-lysine with dipalmitoylphosphatidylglycerol bilayers. Biophys J, 46(4), 497-506.

15. Kim J., Mosior M., Chung L.A., Wu H., McLaughlin S. (1991) Binding of peptides with basic residues to membranes containing acidic phospholipids. Biophys J, 60(1), 135-148.

16. Montich G., Scarlata S., McLaughlin S., Lehrmann R., Seelig J. (1993) Thermodynamic characterization of the association of small basic peptides with membranes containing acidic lipids. Biochim Biophys Acta, 1146(1), 1724.

17. Gad A.E., Elyashiv G., Rosenberg N. (1986) The induction of large unilamellar vesicle fusion by cationic polypeptides: the effect of mannitol, size, charge density and hydrophobicity of the cationic polypeptides. Biochim Biophys Acta, 860, 314-324.

18. Gad A.E., Bental M., Elyashiv G„ Weinberg H. (1985) Promotion and inhibition of vesicle fusion by polylylsine. Biochemistry, 84, 6277-6282.

19. Gad A.E. (1983) Cationic polypeptide-induced fusion of acidic liposomes. Biochim Biophys Acta, 728(3), 377-382.

20. Oku N., Yamaguchi N., Yamaguchi N., Shibamoto S., Ito F., Nango M. (1986) The fusogenic effect of synthetic polycations on negatively charged lipid bilayers. Journal of Biochemistry, 100(4), 935-944.

21. Gad A.E., Silver B.L., Eytan G.D. (1982) Polycation-induced fusion of negatively-charged vesicles. Biochim Biophys Acta, 690(1), 124-132.

22. Walter A., Steer C.J., Blumenthal R. (1986) Polylysine induces pH-dependent fusion of acidic phospholipid vesicles: a model for polycation-induced fusion. Biochim Biophys Acta , 861(2), 319-330.

23. Uster P.S., Deamer D.W. (1985) pH-dependent fusion of liposomes using titratable polycations. Biochemistry, 24(1), 1-8.

24. Yaroslavov A.A., Kul'kovV.E., Polinsky A.S., Baibakov B.A., Kabanov V.A. (1994) A polycation causes migration of negatively charged phospholipids from the inner to outer leaflet of the liposomal membrane. FEBS Lett, 340(1-2), 121-123.

25. Oku N., Shibamoto S., Ito F., Gondo H., Nango M. (1987) Low pH induced membrane fusion of lipid vesicles containing proton- sensitive polymer. Biochemistry, 26(25), 8145-8150.

26. Ito T., Ohnishi S. (1974) Ca2+-induced lateral phase separations in phosphatidic acid- phosphatidylcholine membranes. Biochim Biophys Acta, 352(1), 29-37.

27. Eklund K.K., Vuorinen J., Mikkola J., Virtanen J.A., Kinnunen P.K. (1988) Ca2+-induced lateral phase separation in phosphatidic acid / phosphatidylcholine monolayers as revealed by fluorescence microscopy. Biochemistry, 27(9), 3433-3437.

28. Hoekstra D. (1982) Fluorescence method for measuring the kinetics of Ca2+-induced phase separations in phosphatidylserine-containing lipid vesicles. Biochemistry, 21(5), 1055-1061.

29. Haverstick D.M., Glaser M. (1987) Visualization of Ca2+-induced phospholipid domains. Proc Natl Acad Sci USA, 84(13), 4475-4479.

30. Haverstick D.M., Glaser M. (1988) Visualization of domain formation in the inner and outer leaflets of a phospholipid bilayer. J Cell Biol, 106(6), 18851892.

31. Birrell G.B., Griffith O.H. (1976) Cytochrome c induced lateral phase separation in a diphosphatidylglycerol-steroid spin-label model membrane. Biochemistry, 15(13), 2925-2929.

32. Subramanian M., Jutila A., Kinnunen P.K. (1998) Binding and dissociation of cytochrome c to and from membranes containing acidic phospholipids. Biochemistry, 37(5), 1394-1402.

33. Boggs J.M., Rangaraj G., Koshy K.M. (1988) Photolabeling of myelin basic protein in lipid vesicles with the hydrophobic reagent 3-(trifluoromethyl)-3-(m-125l.-iodophenyl)diazirine. Biochim Biophys Acta, 937(1), 1-9.

34. Sankaram M.B., Brophy P.J., Marsh D. (1989) Selectivity of interaction of phospholipids with bovine spinal cord myelin basic protein studied by spinlabel electron spin resonance. Biochemistry, 28(25), 9699-9707.

35. Bazzi M.D., Nelsestuen G.L. (1991) Extensive segregation of acidic phospholipids in membranes induced by protein kinase C and related proteins. Biochemistry, 30(32), 7961-7969.

36. Yang L., Glaser M. (1995) Membrane domains containing phosphatidylserine and substrate can be important for the activation of protein kinase C. Biochemistry, 34(5), 1500-1506.

37. Bazzi M.D., Nelsestuen G.L. (1992) Interaction of annexin VI with membranes: highly restricted dissipation of clustered phospholipids in membranes containing phosphatidylethanolamine. Biochemistry, 31(42), 10406-10413.

38. Junker M., Creutz C.E. (1993) Endonexin (annexin IV)-mediated lateral segregation of phosphatidylglycerol in phosphatidylglycerol/phosphatidylcholine membranes. Biochemistry, 32(38), 9968-9974.

39. Buser C.A., Kim J., McLaughlin S., Peitzsch R.M. (1995) Does the binding of clusters of basic residues to acidic lipids induce domain formation in membranes? Review. [57 refs]. Molecular Membrane Biology, 12(1), 69-75.

40. Epand R.M., Stevenson C., Bruins R., Schram V., Glaser M. (1998) The chirality of phosphatidylserine and the activation of protein kinase C. Biochemistry, 37(35), 12068-12073.

41. Yang L., Glaser M. (1996) Formation of membrane domains during the activation of protein kinase C. Biochemistry, 35(44), 13966-13974.

42. Mosior M., McLaughlin S. (1992) Electrostatics and reduction of dimensionality produce apparent cooperativity when basic peptides bind to acidic lipids in membranes. Biochim Biophys Acta, 1105(1), 185-187.

43. Mltrakos P., Macdonald P.M. (1997) Domains in cationic lipid plus polyelectrolyte bilayer membranes: detection and characterization via 2H nuclear magnetic resonance. Biochemistry, 36(44), 13646-13656.

44. Hartmann W., Galla H.J., Sackmann E. (1978) Polymyxin binding to charged lipid membranes. An example of cooperative lipid-protein interaction. Biochim Biophys Acta, 510(1), 124-139.

45. Theretz A., Ranck J.L., Tocanne J.F. (1983) Polymyxin B induced phase separation and acyl chain interdigitation inphosphatidylcholine / phosphatidylglycerol mixtures. Biochim Biophys Acta, 732(3), 499-508.

46. Kubesch P., Boggs J., Luciano L., Maass G., Tummler B. (1987) Interaction of polymyxin B nonapeptide with anionic phospholipids. Biochemistry, 26(8), 2139-2149.

47. Sixl F., Galla H.J. (1981) Polymyxin interaction with negatively charged lipid bilayer membranes and the competitive effect of Ca2+. Biochim Biophys Acta, 643(3), 626-635.

48. Laroche G., Dufourc E.J., Pezolet M., Dufourcq J. (1990) Coupled changes between lipid order and polypeptide conformation at the membrane surface. A 2H NMR and Raman study of polylysine-phosphatidic acid systems. Biochemistry, 29(27), 6460-6465.

49. Laroche G., Carrier D., Pezolet M. (1988) Study of the effect of poly(L-lysine) on phosphatide acid and phosphatidylcholine / phosphatide acid bilayers by Raman spectroscopy. Biochemistry, 27(17), 6220-6228.

50. Ben Tal N., Honig B., Peitzsch R.M., Denisov G., McLaughlin S. (1996) Binding of small basic peptides to membranes containing acidic lipids: theoretical models and experimental results. Biophys J, 71(2), 561-575.

51. Macdonald P.M., Crowell K.J., Franzin C.M., Mitrakos P., Semchyschyn D.J. (1998) Polyelectrolyte-induced domains in lipid bilayer membranes: the deuterium NMR perspective. Biochem Cell Biol, 76(2-3), 452-464.

52. Bradley A.J., Maurer-Spurej E., Brooks D.E., Devine D.V. (1999) Unusual electrostatic effects on binding of C1q to anionic liposomes: role of anionic phospholipid domains and their line tension. Biochemistry, 38(25), 8112-8123.

53. Lipowsky R. (1993) Domain-induced budding of fluid membranes. Biophys J, 64, 1133-1138.

54. Darnell J, Lodish HF, Baltimor D. Molecular Cell Biology. Freeman ed. New York: 1990.

55. Гелетюк В.И., Казаченко В.Н. Кластерная организация ионных каналов. "Наука", Москва: 1990.

56. Erb Е.-М., Tangemann К., Bohrmann В., Mueller В., Engel J. (1997) Integrin all/33 reconstitututed into lipid bilayers is nonclustered in its activated state but clusters after fibrinogen binding. Biochemistry, 36, 7395-7402.

57. Kim E., Niethammer M., Rothschild A., Jan Y.N., Sheng M. (1995) Clustering of Shaker-type K+ channels by interaction with a family of membrane-associated guanylate kinases. Nature, 378(6552), 85-88.

58. Williams К. (1997) Interaction of polyamines with ion channels. Biochem J, 325, 289-297.

59. Tabor C.W., Tabor H. (1984) Polyamines. Annu Rev Biochem, 53, 749790.

60. Rock D.M., Macdonald R.M. (1995) Polyamine regulation of N-methyl-D-aspartate receptor channels. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 35, 463-482.

61. Scott R., Sutton K., Dolphin A. (1993) Interaction of polyamines with neuronal ion channels. Trends in Neurosciences, 16(4), 153-169.

62. Rink Т., Bartel H„ Jung G., Bannwarth W„ Boheim G. (1994) Effects of polycations on ion channels formed by neutral and negatively charged alamethicins. EurBiophysJ, 23(3), 155-165.

63. Tosteson D.C., Andreoli Т.Е., Tieffenberg M„ Cook P. (1968) The effects of macrocyclic compounds on cation transport in sheep red cells and thin and thick lipid membranes. J Gen Physiol, 51(5), Suppl.

64. Andersen O.S. (1984) Gramicidin channels. Annu Rev Physiol, 46, 531548.

65. Арсеньев A.C., Овчинников Ю.А., Барсуков И.Л., Быстрое В.Ф. (1986) Трансмембранный канал грамицидина А. Реконстукция простанственной структуы по данным ЯМР спектроскопии и оптимизация конформационной энергии. Биологические Мембраны, 3, 1077-1103.

66. Sarges R., Witkop В. (1965) Gramicidin А. V. The structure of valine- and isoleucine-gramicidin A. J Am Chem Soc, 87, 2011-2020.

67. Hladky S.B., Haydon D.A. (1970) Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature, 5231(231), 451-453.

68. Urry D.W. (1971) The gramicidin A transmembrane channel: a proposed tt(L,D) helix. Proc Natl Acad Sci USA, 68(3), 672-676.

69. Veatch W.R., Fossel E.T., Blout E.R. (1974) The conformation of gramicidin A. Biochemistry, 13(26), 5249-5256.

70. Apell H.J., Bamberg E., Alpes H., Lauger P. (1977) Formation of ion channels by a negatively charged analog of gramicidin A. J Membrane Biol, 31(1-2), 171-188.

71. Urry D.W., Trapane T.L., Prasad K.U. (1983) Is the gramicidin A transmembrane channel single stranded or double stranded helix? A simple unequivocal determination. Science, 221, 1064-1067.

72. Weinstein S., Durkin J.T., Veatch W.R., Blout E.R. (1985) Conformation of the gramicidin a channel in phospholipid vesicles: a fluorine-19 nuclear magnetic resonance study. Biochemistry, 24(16), 4374-4382.

73. Venkatachalam C.M., Urry D.W. (1983) Theoretical conformational analysis of the gramicidin A transmembrane channel. I. Helix sense and energetics of head-to-head dimerization. J Comput Chem, 4, 461-469.

74. Арсеньев A.C., Барсуков И.Л., Быстрое В.Ф., Овчинников Ю.А. (1986) Пространственное строение трансмембранного ионного канала грамицидина А. ЯМР-анализ в мицеллах. Биологические Мембраны, 3, 437-462.

75. Weiler-Felchenfeld Н„ Pullman A., Berthod Н. (1970) J Mol Structure, 6, 296-304.

76. Cotten М., Tian С., Busath D.D., Shirts R.B., Cross T.A. (1999) Modulating dipoles for structure-function correlations in the gramicidin A channel. Biochemistry, 38(29), 9185-9197.

77. Hladky S.B., Haydon D.A. (1984) Ion Movements in Gramicidin Channels. Curr Topics in Membr Transport, 21, 327-372.

78. Ring A. (1996) Gramicidin channel-induced lipid membrane deformation energy: influence of chain length and boundary conditions. Biochim Biophys Acta, 1278(2), 147-159.

79. Hladky S.B., Haydon D.A. (1972) Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A. I. Studies of the unit conductance channel. Biochim Biophys Acta, 274(2), 294-312.

80. Bamberg E., Noda K., Gross E., Lauger P. (1976) Single-channel parameters of gramicidin A, B, and C. Biochim Biophys Acta, 419(2), 223-228.

81. Sung S.S., Jordan P.C. (1987) Why is gramicidin valence selective? A theoretical study. Biophys J, 51(4), 661-672.

82. Andersen O.S. (1983) Ion movement through gramicidin a channels, single-channel measurements at very high potentials. Biophys J, 41(2), 119133.

83. Rosenberg P.A., Finkelstein A. (1978) Interaction of ions and water in gramicidin A channels: streaming potentials across lipid bilayer membranes . Journal Of General Physiology, 72(3), 327-340.

84. Etchebest C., Pullman A. (1986) The gramicidin A channel: energetics and structural characteristics of the progression of a sodium ion in the presence of water. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 3(4), 805-825.

85. Bamberg E., Läuger P. (1973) Channel formation kinetics of gramicidin A in lipid bilayer membranes. J Membrane Biol, 11(2), 177-194.

86. Bamberg E., Läuger P. (1974) Temperature-dependent properties of gramicidin A channels. Biochim Biophys Acta, 367(2), 127-133.

87. Fröhlich O. (1979) Asymmetry of the gramicidin channel in bilayers of asymmetric lipid composition: II. Voltage dependence of dimerization. J Membrane Biol, 48(4), 385-401.

88. Fröhlich O. (1979) Asymmetry of the gramicidin channel In bilayers of asymmetric lipid composition: I. Single channel conductance. J Membrane Biol, 48(4), 365-383.

89. Kolb H.A., Bamberg E. (1977) Influence of membrane thickness and Ion concentration on the properties of the gramicidin a channel. Autocorrelation, spectral power density, relaxation and single-channel studies. Biochim Biophys Acta, 464(1), 127-141.

90. Neher E., Eibl H. (1977) The influence of phospholipid polar groups on gramicidin channels. Biochim Biophys Acta, 464(1), 37-44.

91. Rudnev V.S., Ermishkin L.N., Fonina L.A., Rovin Yu.G. (1981) The dependence of the conductance and lifetime of gramicidin channels on the thickness and tension of lipid bilayers. Biochim Biophys Acta, 642(1), 196-202.

92. Elliott J.R., Needham D., Dilger J.P., Haydon D.A. (1983) The effects of bilayer thickness and tension on gramicidin single-channel lifetime. Biochim Biophys Acta, 735(1), 95-103.

93. Lundbask J.A., Birn P., Girshman J., Hansen A.J., Andersen O.S. (1996) Membrane stiffness and channel function. Biochemistry, 35, 3825-3830.

94. Lundbask J.A., Maer A.M., Andersen O.S. (1997) Lipid bilayer electrostatic energy, curvature stress, and assembly of gramicidin channels. Biochemistry, 36(19), 5695-5701.

95. Ростовцева Т.К., Осипов В.В., Лев А.А. (1987) Зависимость проводимости одиночных грамицидиновых каналов от потенциала, задаваемого адсорбцией анионов 1-анилинонафталин-8-сульфоната на липидных мембранах. Биологические Мембраны, 4, 955-964.

96. Симонова М., Черный В.В., Донат Е., Соколов B.C., Маркин B.C. (1986) Граничные потенциалы бислойных мембран в присутствии ремантадина: анализ трех методов измерений. Биологические Мембраны, 3, 846-857.

97. Ни W., Lee К.С., Cross Т.А. (1993) Tryptophans in membrane proteins: indole ring orientations and functional implications in the gramicidin channel. Biochemistry, 32(27), 7035-7047.

98. Ни W., Cross T.A. (1995) Tryptophan hydrogen bonding and electric dipole moments: functional roles in the gramicidin channel and implications for membrane proteins. Biochemistry, 34(43), 14147-14155.

99. Mukherjee S., Chattopadhyay A. (1994) Motionally restricted tryptophan environments at the peptide-lipid interface of gramicidin channels. Biochemistry, 33(17), 5089-5097.

100. Busath D. (1993) The use of physical methods in determining gramicidin channel structure and function. Annu Rev Physiol, 55, 473-501.

101. Seoh S.A., Busath D. (1995) Gramicidin tryptophans mediate formamidinium-induced channel stabilization. BiophysJ, 68(6), 2271-2279.

102. Schiffer M., Chang C.H., Stevens F.J. (1992) The functions of tryptophan residues in membrane proteins. Protein Eng, 5(3), 213-214.

103. Красновский A.A. (1990) Синглетный молекуляный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения. Итоги Науки и Техники, Серия Современные Проблемы Лазерной Физики, 3, 63-135.

104. Duprat F., Guillemare Е., Romey G., Fink M., Lesage F., Lazdunski M., Honore E. (1995) Susceptibility of cloned K+ channels to reactive oxygen species. Proc Natl Acad Sci USA, 92(25), 11796-11800.

105. Straple M., Stark G., Wilhelm M. (1987) Effects of ionizing radiation on artificial (planar) lipid membranes. I. Radiation inactivation of the ion channel gramicidin A. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med, 51 (2), 265-286.

106. Stuhmer W., Aimers W. (1982) Photobleaching through glass micropipettes: sodium channels without lateral mobility in the sarcolemma of frog skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci USA, 79(3), 946-950.

107. Kuo S.S., Saad A.H., Koong A.C., Hahn G.M., Giaccia A.J. (1993) Potassium-channel activation in response to low doses of gamma- irradiation involves reactive oxygen intermediates in nonexcitatory cells. Proc Natl Acad Sci US A, 90(3), 908-912.

108. Pooler J.P. (1968) Light-induced changes in dye-treated lobster giant axons. BiophysJ, 8, 1009-1026.

109. Pooler J.P., Valenzeno D.P. (1979) The role of singlet oxygen in photooxidation of excitable cell membranes. Photochem Photobiol, 30(5), 581584.

110. Starkus J.G., Rayner M.D., Fleig A., Ruben P.C. (1993) Fast and slow inactivation of sodium channels: effects of photodynamic modification by methylene blue. Biophys J, 65(2), 715-726.

111. Tarr M., Arriaga E., Valenzeno D.P. (1995) Progression of cardiac potassium current modification after brief exposure to reactive oxygen. J Mol Cell Cardiol, 27(5), 1099-1109.

112. Kunz L., Stark G. (1997) Photodynamic membrane damage at the level of single ion channels. Biochim Biophys Acta, 1327(1), 1-4.

113. Dubbelman Т.М., Van Steveninck J. (1984) Photodynamic effects of hematoporphyrin-derivative on transmembrane transport systems of murine L929 fibroblasts. Biochim Biophys Acta, 771(2), 201-207.

114. Pooler J.P. (1985) The kinetics of colloid osmotic hemolysis. I. Nystatin-induced lysis. Biochim Biophys Acta, 812(1), 193-198.

115. Watson B.D., Haynes D.H. (1982) Structural and functional degradation of Ca2+:Mg2+-ATPase rich sarcoplasmic reticulum vesicles photosensitized by erythrosin B. Chem Biol Interact, 41(3), 313-325.

116. Busath D., Waldbillig R.C. (1983) Photolysis of gramicidin A channels in lipid bilayers. Biochim Biophys Acta, 736, 28-38.

117. Straple M., Stark G. (1992) Photodynamic inactivation of an ion channel: gramicidin A. Photochem Photobiol, 55(3), 461-463.

118. Jones D., Hayon E., Busath D. (1986) Tryptophan photolysis is responsible for gramicidin-channel inactivation by ultraviolet light. Biochim BiophysActa, 861(1), 62-66.

119. Busath D., Hayon E. (1988) Ultraviolet flash photolysis of gramicidin-doped lipid bilayers. Biochim Biophys Acta, 944(1), 73-78.

120. Straple M„ Stark G., Wilhelm M., Daumas P., Heitz F., Lazaro R. (1989) Radiolysis and photolysis of ion channels formed by analogues of gramicidin a with a varying number of tryptophan residues. Biochim Biophys Acta, 980(3), 305-314.

121. Barth C., Stark G. (1991) Radiation inactivation of ion channels formed by gramicidin A. Protection by lipid double bonds and by alpha-tocopherol. Biochim BiophysActa, 1066(1), 54-58.

122. Stark G., Straple M., Wilhelm M. (1984) Pulse radiolysis at planar lipid membranes doped with ion carriers or pore formers. Biochim, 755, 265-268.

123. Kunz L., Zeidler U., Haegele K„ Przybylski M., Stark G. (1995) Photodynamic and radiolytic inactivation of ion channels formed by gramicidin a: oxidation and fragmentation. Biochemistry, 34, 11895-11903.

124. Kolb H.A., Lauger P., Bamberg E. (1975) Correlation analysis of electrical noise in lipid bilayer membranes: kinetics of gramicidin A channels. J Membrane Biol, 20(1-2), 133-154.

125. Zingsheim H.P., Neher E. (1974) The equivalence of fluctuation analysis and chemical relaxation measurements: a kinetic study of ion pore formation in thin lipid membranes. Biophys Chem, 2(3), 197-207.

126. Hickok N.J., Kustin К., Veatch W. (1986) Relaxation spectra of gramicidin dimerization in a lipid bilayer membrane. Biochim Biophys Acta, 858(1), 99-106.

127. Stark G., Straple M., Takacz Z. (1986) Temperature-jump and voltage-jump experiments at planar lipid membranes support an aggregational (micellar) model of the gramicidin A ion channel. J Membr Biol, 89(1 ), 23-37.

128. Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N., Kotova E.A. (1993) The interaction of phthalocyanine with planar lipid bilayers photodynamic inactivation of gramicidin channels. FEBS Lett, 329, 332-335.

129. Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N., Kotova E.A. (1996) Photodynamic inactivation of gramicidin channels:a flash- photolysis study. Biochim Biophys Acta, 1275, 221-226.

130. Красновский A.A. (1994) Синглетный молекулярный кислород: механизмы образования и пути дезактивации в фотосинтетических системах. Биофизика, 39, 236-250.

131. Girotti A.W. (1990) Photodynamic lipid peroxidation in biological systems. Photochem Photobiol, 51(4), 497-509.

132. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. (1963) Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution. J Phys Chem, 67, 534-535.

133. Соколов B.C., Кузьмин В.Г. (1980) Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока. Биофизика, 25, 170-172.

134. Carious W. (1976) Voltage dependence of bilayer membrane capacitance. Harmonic response to AC exitation with DC-bias. J Coll Interface Sci, 57, 301-307.

135. Galla H.J., Sackmann E. (1975) Chemically induced phase separation in mixed vesicles containing phosphatidic acid. An optical study. Journal of the American Chemical Society, 97(14), 4114-4120.

136. Ярославов A.A., Ефимова A.A., Лобышев В.И., Ермаков Ю.А., Кабанов В.А. (1996) Обратимость структурных изменений липидных мембран в процессе адсорбции/десорбции поликатиона. Биологические Мембраны, 13, 628-633.

137. Соколов B.C., Черный В.В., Маркин B.C. (1984) Измерение потенциалов, индуцированных адсорбцией флоретина и флорицина на БЛМ, методом компенсации внутримембранного поля. Биофизика, 29, 424-429.

138. Ермаков Ю.А., Февралева И.С., Атауллаханов Р.И. (1985) Влияние поликатионов на граничный потенциал бимлойных липидных мембран. Биологические Мембраны, 2(11), 1094-1100.

139. Гуляева Ж.Г., Полетаева O.A., Калачев A.A., Касаикин В.А., Зезин А. Б. (1976) Исследование водорастворимых полиэлектролитных комплексов на основе полиакрилата натрия и 5,6-ионенбромида. Высокомолекулярные Соединения Серия А, 18(12), 2800-2805.

140. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.l., Ermakov Y.A., Kabanov V.A. (1997) Reversibility of structural rearrangements in lipid membranes induced by adsorption-desorption of a polycation. Membrane & Cell Biology, 10(6), 683-688.

141. Valenzeno D.P., Tarr M. Membrane Photomodification and its Use to Study Reactive Oxygen Effects. In: Rabek J.F., editor, Photochemistry and Photophysics. Boca Raton, Ann Arbor, Boston: CRC Press, 1991, 137-191.

142. Antonenko Y.N., Rokitskaya T.I., Kotova E.A., Koeppe R.E.JI, Andersen O.S. (1997) A study of channel kinetics of gramicidin analogues in planar bilayer membranes by sensitized photoinactivation. Biophys J, 72, 396a.

143. Shapovalov V.L., Kotova E.A., Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N. (1999) Effect of gramicidin A on the dipole potential of phospholipid membranes. Biophys J, 77(1), 299-305.

144. Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N., Kotova E.A. (1997) Effect of the dipole potential of a bilayer lipid membrane on gramicidin channel dissociation kinetics. Biophys J, 73, 850-854.

145. Mittler-Neher SM Knoll W. (1989) Phase separation in bimolecular mixed lipid membranes induced by polylysine. Biochem Biophys Res Commun, 162(1), 124-129.

146. Raudino A., Castelli F. (1997) Polyelectrolyte-Multicomponent Lipid Bilayer Interactions. Unusual effects on going from the dilute to the semidilute regime. Macromolecules, 30(8), 2495-2502.

147. Barber J., Mills J., Love A. (1977) Electrical diffuse layers and their influence on photosynthetic processes. FEBS Lett, 74(2), 174-181.