Физика ионных каналов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

российская академия наук

ПЕТЕРБУРГСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ им Б П. КОНСТАНТИНОВА

УДК 538 9 " На правах рукописи

Безруков Сергей Михайлович ФИЗИКА, ИОННЫХ КАНАЛОВ

01 04 07 - физика конденсированного состояния

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Гатчина 2007

003065692

Работа выполнена в Петербургском институте" ядерной физики им Б. П Константинова Российской академии наук и частично в национальных институтах здравоохранения США

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук - Саул Лейбович Гинзбург,

доктор физико-математических наук Вениамин Иванович Козуб,

доктор физико-математических наук Владимир Владимирович Клюбин

Ведущая организация Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится " 2007-г в 11 часов на заседании

диссертационного совета Д 002 115 01 при Петербургском институте ядерной физики им Б. П Константинова Российской академии наук по адресу 188300, г Гатчина Ленинградской области, Орлова роща

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ПИЯФ РАН Автореферат разослан « аглсгл^ии? 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

И А Митропольский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Методы, подходы и, что, пожалуй, наиболее важно, концепции физики конденсированного состояния все чаще находят свой путь в биологию Современная наука о жизни немыслима без молекулярной биологии, которая рассматривает молекулы как физические машины, обладающие определённой структурой и выполняющие функции, этой структурой обусловленные При этом наиважнейшая задача молекулярной биологии - это установление связи между структурой и функцией Быстро растущее влияние физики на биологические науки тем и объясняется, что именно она предоставляет ключ к пониманию этой связи

Однако существует и обратное влияние Стремление всё возрастающего числа физиков внести свой вклад в биологию связано с желанием обратиться к сложным, мезоскопическим объектам, где знакомые подходы макроскопической физики уже перестают работать, в то время как квантовая и, тем более, ядерная физика еще не входят в свои права В результате, усилия физиков описать объекты, изучаемые биологией, способствуют развитию новых и углублению старых разделов физики

Прогресс в области молекулярной биологии во многом обязан успехам в развитии структурных физических методов Рентгеновский структурный анализ, прежде всего кристаллография высокого разрешения, ядерный магнитный и электронный парамагнитный резонансы, динамическое светорассеяние, малоугловое нейтронное и рентгеновское рассеяние и другие методы дают богатую и детальную информацию как об отдельных молекулах, так и об их сборке в функциональные надмолекулярные структуры Вне всякого сомнения, именно эта структурная информация является тем фундаментом, на котором впоследствии строятся физическая теория и интерпретация

Однако все чаще и чаще мы убеждаемся в том, что структурная информация сама по себе недостаточна для понимания функциональных свойств молекул и надмолекулярных структур Изначальный оптимизм, существовавший двадцать - тридцать лет назад, не оправдал себя Действительно, возьмем в качестве примера широко известную ситуацию с калиевым каналом Структура этого канала, полученная с разрешением вплоть до 0 19 нм [1], известна, по меньшей мере, четыре года Тем не менее исследователи до сих пор не пришли к единой физической картине, объясняющей его транспортные свойства и

переходы между конформационными состояниями Причина такого положения, по-видимому, состоит в том, что развитие физики конденсированного состояния применительно к наноскопическим системам, к которым принадлежат ионные каналы, отстает от развития структурных методов

Основная цель работы Цикл работ, по которым написана данная диссертация, направлен на ликвидацию этого отставания и имеет своей целью разработку нового направления - физики ионных каналов Для достижения этой цели было проведено всестороннее экспериментальное и теоретическое изучение реконструированных в искусственные бимолекулярные липидные мембраны ионных каналов различной природы При этом использованы существующие и развитые нами новые методы физики конденсированного состояния для анализа наноскопических структур В силу малых размеров изучаемых объектов основное внимание уделялось не только средним параметрам, характеризующим транспортные свойства каналов, но и детальному изучению флуктуаций этих параметров

Научная новизна Основная часть экспериментов проведена на уровне работы с одиночными молекулами Большинство как экспериментальных, так и теоретических результатов получено впервые

Новизна многих из них носит концептуальный характер Так, например, идея использования ионного канала в качестве наноскопического "молекулярного счетчика Коултера", опубликованная нами в журнале Nature в 1994 году, нашла широчайшее применение во множестве биотехнологических разработок В настоящее время она стремительно развивается в сторону использования искусственных наноскопических каналов, полученных на базе применения традиционных методов физики твердого тела

Другим примером могут служить экспериментальное обнаружение (Nature, 1995) и математическое обоснование (Nature, 1997) явления стохастического резонанса (индуцированного шумом эффекта увеличения степени порядка [2] ) на молекулярном уровне В серии наших работ стохастический резонанс был впервые продемонстрирован в нединамических беспороговых системах, что способствовало углублению понимания статистической природы этого явления

В исследованиях динамики одиночных полимерных молекул, захваченных ионным каналом, нами был продемонстрирован новый 'конфигурационный эффект, в котором свободная часть молекулы

действует на ее захваченную часть как энтропийная пружина (Physical Review Letters, 2006) Это исследование является яркой иллюстрацией потенциальных возможностей экспериментов с одиночными молекулами в области физики полимеров

Основные положения, выносимые на защиту

Эксперимент

1 Разработаны новые методы анализа флуктуации электропроводности для изучения динамики одиночных молекул

2, Установлена иерархия электрических флуктуаций в ионных проводниках

3 Показана роль электростатических эффектов в проводимости и селективности мезоскопических ионных каналов

4 Обнаружен катализирующий эффект взаимодействий между ионными каналами и молекулами, которые эти каналы эффективно транспортируют

5 Выявлены эффекты конфигурационных ограничений и неидеальности полимерных растворов во взаимодействиях полимерных цепей с ионными каналами

6 Показана конструктивная роль флуктуаций в передаче сигнала (стохастический резонанс) на молекулярном уровне

7 Продемонстрирована регуляторная функция взаимодействий между каналообразующим белком и мембранным матриксом в конформационном равновесии ионных каналов

Теория

1 С использованием диффузионного описания динамики частиц построена теория молекулярного транспорта через ионные каналы

2 На базе идей скейлинга развита теория распределения полимерных клубков в наноскопических полостях в случае сильной неидеальности полимерных растворов

3 В рамках анализа пуассоновских процессов с модулированной плотностью событий создана теория стохастического резонанса в ионных каналах и других беспороговых молекулярных системах с ограниченной статистикой

Практическая значимость работы Основная научно-практическая ценность данной работы заключается в - формировании нового направления - физики ионных каналов Проведенные исследования расширяют наши познания о физических свойствах этих сложных

мезоскопических объектов и предлагают методы их описания на языке физики конденсированного состояния

Помимо этого, данная работа представляет конкретный практический интерес в медицинских приложениях, в частности в области создания новых лечебных препаратов А именно (а) установленная нами роль взаимодействий молекул антибиотиков пенициллиновой группы с бактериальными каналами облегчает направленный поиск новых активных антибиотиков, (б) обнаруженный нами молекулярный механизм эффективного ингибирования токсина сибирской язвы производными циклодекстринов является основой для создания эффективных противоядий, (в) выявленные нами причины резистентности бактерии Pseudomonas aeruginosa к антибиотическим препаратам позволяют более эффективно искать способы борьбы с этим опасным патогеном

Апробация работы Результаты исследований опубликованы в 91 работе в реферируемых отечественных (15 статей) и международных (76 статей) журналах и, кроме того, в 24 работах в сборниках трудов конференций и тематических сборниках Результаты также были представлены в качестве приглашённых докладов на многих международных конференциях, в частности, за последние три года, на Winter Symposium on Physics of Quantum Electronics, Snowbird, США, Workshop on Complex Dynamical Processes m Electroreceptors and Hair Cells, Дрезден, Германия, 2nd International Symposium on Fluctuations and Noise, Канары, Испания, Gordon Research Conference on Ion Channels, Tilton School, США, 17th Marian Smoluchowski Symposium on Statistical Physics, Закопане, Польша, International School "100 Years of Brownian Motion", Эриче, Италия, First and Second Summer Schools "Bio-sensing with channels", Международный университет Бремена, Германия, Second Focused Workshop on Electronic Recognition of Bio-molecules, Beckman Institute, CUIA, Centennial Marian Smoluchowski Symposium on Statistical Physics, Краков, Польша, XX Sitges Conference "Physical Biology From Molecular Interactions to Cellular Behavior Behavior", Барселона, Испания; Annual March Meeting of the American Physical Society, Денвер, США, конференции "Physics Inspired by Biology", Миннеаполис, США.

По материалам работ проведены семинары в Московском государственном университете им М В Ломоносова, в Санкт-Петербургском государственном университете, в Институте электрохимии РАН (Москва), в Институте биофизики РАН (Пущино),

в университетах Гарварда и Принстона (США), а также во многих других отечественных и зарубежных научных центрах

Структура диссертации Диссертация изложена на 297 страницах и состоит из введения, 9 глав, заключения и 85 рисунков, библиография -478 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обсуждаются актуальность проблемы, состояние исследований в данной области на начало работы, формулируются цель работы, ее научная и практическая ценность, представлен список научных положений, выносимых на защиту Кроме того, дана краткая характеристика объектов исследования и приведены основные параметры экспериментальных установок

Мембраны клеток, от бактерий до млекопитающих, построены по одному и тому же принципу. В основе лежит способность липидов — основного материала биологических мембран — к самоорганизации в бислой [3] Наше понимание биологических мембран во многом обязано развитию малоуглового рентгеновского и нейтронного рассеяния, ядерного магнитного резонанса и компьютерных методов В то же время трудно переоценить роль моделирования биологических мембран, предложенного в 1962 году Мюллером (Mueller) и коллегами [4] Эта методика позволяет формировать плоские липидные бислои макроскопических размеров и изучать их физические свойства

Одно из основных физических свойств, обеспечивающих барьерную функцию биологической мембраны, связано с низкой диэлектрической постоянной углеводородной фазы мембраны (s ~ 2) Расчёт показывает [5, 6], что, несмотря на малую толщину бислоя {h ~ 5 нм), изменение борновской энергии иона радиусом 0 2 нм при его переносе из водной фазы в мембрану составляет ~ 40 ккал/моль То есть липидный бислой является весьма эффективным барьером как для ионов, так и для других хорошо растворимых в воде молекул Тем не менее жизнедеятельность клетки требует постоянного транспорта веществ через клеточную мембрану Этот транспорт в значительной степени обеспечивается с помощью специальных мембранных белков, подкласс которых составляют ионные каналы Таким образом, ионные каналы — это разновидность белковых молекул, встроенных в липидный матрикс биологических мембран и образующих водонаполненные

трансмембранные туннели, которые облегчают транспорт ионов и других полярных молекул,

В настоящее время существует два подхода, позволяющих работать с ионными каналами на уровне одиночных молекул. Это так называемый метод фиксации потенциала на изолированном фрагменте мембраны -"patch-clamp method" [7], в котором при помощи специальной микропипетки удаётся изолировать участок клеточной мембраны микронных размеров. Часто оказывается, что такой участок содержит всего один ионный канал, который может быть изучен в натисных условиях с использованием соответствующих статистических подходоп.

Рис. I. Блок-схема эксперимента по реконструкции и измерению параметров одиночных ионных каналов. В левом нижнем углу помещена микрофотография типичной —80 мкм апертуры в 15 мкм тефлоновой плёнке, используемой в эксперименте

Альтернативным является метод реконструкции ионных каналов в липидные бислои [8]. В этом подходе к а нало образующий белок сначала выделяется из клеточной мембраны с использованием методов мягкой,

неразрушающей экстракции, затем тщательно очищается и, наконец, реконструируется "обратно" в липидную бислойную мембрану

Общая схема измерений показана на Рис 1 Исследуемый белок (полипептид) обычно добавляется к водной фазе, окружающей бислой, сформированный в специальной электрохимической ячейке В экспериментах с одиночными каналами концентрация каналообразующего белка подбирается так, чтобы временной интервал между встраиванием в мембрану первого и последующих каналов был достаточен для статистического анализа свойств одиночного канала Процесс встраивания является случайным, поэтому точный момент появления канала непредсказуем, однако предсказуемо среднее время ожидания этого события Это время зависит от множества параметров, включающих, прежде всего, концентрацию белка, а также температуру, кислотность и солевой состав среды, липидный состав мембраны, приложенное к мембране напряжение и др

Спонтанное встраивание канала регистрируется как резкое увеличение ионного тока Разрешающая способность определяется соотношением сигнал/шум, подробно рассмотренным во Введении

В первой главе, написанной по материалам публикаций 10, 14, 22, 33, 34, 39, 47 и 50, приведены результаты исследования электростатических эффектов в ионной проводимости каналов Электростатика биологических мембран и встроенных в них белков является исключительно важным предметом хотя бы по той причине, что она позволяет проверить наше понимание особенностей кулоновских взаимодействий на характерных расстояниях в один нанометр Такие вопросы как дебаевское экранирование заряда внутри каналов, содержащих всего несколько подвижных ионов, эффекты электрического поля на расстояниях, сравнимых или даже меньших, чем длина Бьеррума, диэлектрические свойства воды вблизи поверхности белков и др. неизменно привлекают внимание исследователей

В одной из наших работ в качестве датчика поверхностного потенциала и, соответственно, ионизационного состояния полярных групп липидов, образующих мембрану, был использован ионный канал, формируемый полипептидом грамицидином А Мы изучили эффект поверхностного заряда мембраны на проводимость грамицидинового канала, титруя этот заряд при помощи изменения концентрации протонов в окружающем мембрану растворе, а также варьируя заряд мембраны изменением соотношения заряженного и нейтрального

липидов В дальнейшем результаты этой работы были использованы при исследованиях ряда мезоскопических ионных каналов

Для расчета концентрации проникающих ионов у входа в канал использовались различные теоретические подходы, основанные на приближении среднего поля Сравнение результатов нашего анализа протонного равновесия карбоксильных групп липидных молекул с литературными данными, полученными с привлечением более традиционных макроскопических методов, позволило оценить границы применимости уравнений Гуи-Чапмена и Пуассона-Больцмана для описания концентраций противоионов на нанометровых расстояниях от фиксированных зарядов и установить основные критерии проявления электростатических эффектов в транспортных свойствах каналов

Во второй главе, обозревающей публикации 1, 3, 4, 7-10, 13, 14, 16, 20, 26-30, 32, 37, 38, 40, 42, 44, 47, 49, 51, 57-60 и 63, обсуждаются эмпирическая картина и теория флуктуационных явлений в ионных проводниках Флуктуации величин, описывающих физическую систему, являются естественным следствием дискретной природы материи Следуя Ван Кемпену [9], можно повторить, что с молекулярной точки зрения их существование является вполне естественным, в то время как удивление вызывает скорее то, что существуют простые макроскопические законы — такие как законы термодинамики, транспортные уравнения и законы скоростей химических реакций По этой причине понятно, что исследования шумов и флуктуаций в наноструктурах имеют как теоретическое, так и - в связи с развитием нанотехнологий - прикладное значение.

Классификация шумов, давно используемая в физике твердого тела, вполне уместна и в отношении ионных систем Фундаментальные источники шума обычно подразделяются на (а) шум Джонсона (равновесные флуктуации напряжения или тока), (б) дробовой шум (шум транспорта заряда), (в) шум проводимости (модуляция ионного тока флуктуациями импеданса) и (г) 1Я-шум (фликкер-шум) Все эти типы флуктуаций подробно рассмотрены во второй главе, которая демонстрирует наш существенный вклад в теорию и практику этой области знания

Шумы ионных каналов также могут быть классифицированы по их амплитуде, как это сделано в Таблице

В качестве конкретного примера кратко остановимся на шуме проводимости канала, генерируемом обратимым протонированием аминокислотных остатков образующей его молекулы Радиус

проводящей поры мезоскопического канала (/1 ~ 1 нм) соизмерим с радиусом дебасвского экранирования в растворах 1:1 электролитов умеренных концентраций. Прямым следствием этого обстоятельства является Зависимость проводимости канала от зарядового состояния аминокислотных остатков.

Таблица. Иерархия шумов мезоскопических ионных каналов

Механизм генерации шума Тип спектра Диапазон амплитуд*, А /Гц

Конформационная динамика Лоренциан, 1/Т ю-г|-10-24

Блокирование Лоренциан Ю^-КГ2*

Протонирование аминокислот Лоренциан ] 0-^1 о-29

Транспорт нейтральных молекул Диффузионный, лоренциан 10"24-10'29

Протонирование липидов Диффузионный, лоренциан Ю'29-Ю-30

Дробовой шум Белый 10'29-10"30

Шум Джонсона Белый 10^-10"30

* Диапазон дан для типичного мезоскопического канала проводимостью от 0.1 до 1.0 нСм в низкочастотной области звукового диапазона при приложенном напряжении 100 мВ.

Заряд конкретного

титруемого остатка определяется рН среды, диэлектрическим окружением и другими параметрами только в смысле его среднего значения. Действительное, мгновенное значение заряда флуктуирует, что приводит к сильной модуляции локального

электрического поля. Если

Рис. 2. Схематическое пояснение генерации флуктуации тока при обратимой ионизации канала

аминокислотный остаток находится вблизи проводящей поры, то такая модуляция индуцирует вполне измеримые флуктуации проводимости

Рис 2 иллюстрирует вышесказанное для некоторого гипотетического канала, в котором два титруемых остатка могут находиться либо в нейтральном, либо в заряженном, протонированном состоянии В этом случае канал выполняет роль весьма чувствительного усилителя Действительно, элементарное событие, состоящее в переносе одного протона из бассейна раствора на аминокислотный остаток, в состоянии привести к изменению тока, как показано ниже, в несколько пА, то есть в 107 —108 зарядов в секунду

Пример, изображенный на Рис 3, демонстрирует записи реализаций ионного тока канала альфа-гемолизина при разных значениях кислотности раствора соли (1 М №01) в Н20 и Б20 Увеличение рН (рБ)

раствора монотонно понижает проводимость канала, но немонотонно изменяет ширину шумовой дорожки В Н20 шум ионного тока канала при рН 5 9 больше, чем как при рН 4 6, так и при рН 7 55 Качественное объяснение этого наблюдения состоит в том, что при относительно высокой

концентрации протонов (в данном случае рН 4 6) аминокислотный остаток

практически всегда находится в протонированном состоянии и по этой причине не вносит существенного вклада во флуктуации проводимости При относительно же низкой концентрации протонов

(рН 7 55) остаток проводит основное время в

депротонированном состоянии протонированное Наибольший при кислотности раствора,

рН 4 б рН 5 9 рН 7 55

н2о

25 пА

о2о

1 с

рБ 5 0 рБ 6 2 рБ 7 95

Рис 3 Ионный ток одиночного альфа-гемолизинового канала при изменяющейся кислотности среды и напряжении 100 мВ

и только весьма редко переходит в уровень флуктуаций достигается

соответствующей половинной заселенности аминокислотного остатка

протоном, то есть при рН = рКа, где рКа - константа протонного равновесия, учитывающая конкретное положение остатка в молекуле канала

Пример количественного анализа этих экспериментальных данных

приведён на Рис 4, который показывает зависимость низкочастотной

спектральной плотности флуктуаций тока от кислотности раствора

Используя для анализа простую кинетическую модель (плавные кривые),

для Н20 мы получаем константу протонного равновесия рКа = 5 5 и

среднее время жизни протона

на аминокислотном остатке

тНА = 40 мкс, в случае D20

имеем рКа = 6 0 и тш = 150 мкс

Изменение ионного тока в

результате перезарядки одного

остатка оценивается как 3 пА

Здесь мы упомянули лишь

одно из многих применений

флуктуационной спектроскопии,

рассмотренных во второй главе

Другие примеры относятся к

исследованиям динамики канало-

образующих белковых молекул,

их конформационных переходов,

„ , „ а также кинетических параметров

Рис 4 Спектральная плотность

, , транспорта неэлектролитов

флуктуации тока как функция _

т J J Третья глава, посвященная

кислотности раствора а -

г спектроскопии флуктуации

ионных токов биологических мембран, написана по результатам работ 2, 5 и 6 Она показывает возможности метода анализа флуктуаций на примере исследования механизмов регуляции натриевой проницаемости апикальных мембран клеток эпителия Rana temporaria Препараты биологических мембран, используемые для электрических измерений, обычно содержат большое число разнообразных и одновременно действующих белково-липидных структур, способных транспортировать ионы Вклад от одиночной структуры в общий ток, протекающий через мембрану, в таких случаях неразрешим, однако именно индивидуальные характеристики, такие как скорость переноса ионов через одиночный ионный канал, наличие

рН, pD

различающихся по проводимости или кинетическим свойствам состояний, времена жизни в этих состояниях, как раз и представляют наибольший интерес

Упростить задачу помогло применение динамических блокаторов Оно позволило выделить транспорт ионов через исследуемые каналы в лимитирующую стадию всего трансэпителиального переноса ионов и, как следствие, надежно идентифицировать источник флуктуаций, генерируемых обратимым связыванием блокатора с каналом

В результате удалось выяснить механизм действия ионов кобальта на натриевые каналы эпителия и обнаружить новый регуляторный участок -на внешней поверхности апикальной мембраны Таким образом, наша работа продемонстрировала возможности флуктуационого анализа в комбинации с более традиционными фармакологическими методами при изучении тонких механизмов биологической регуляции

Четвёртая глава посвящена так называемому стохастическому резонансу и написана по материалам публикаций 15, 17-19, 21, 23, 35 и 43 Стохастический резонанс — явление усиления слабых сигналов внешними, не коррелированными с сигналом флуктуациями - был обнаружен в широком спектре разнообразных систем [2] Концепция стохастического резонанса была изначально предложена для объяснения регулярности земных ледниковых периодов С тех пор это явление приобрело междисциплинарное значение - оно наблюдалось в электронных, физических и биологических системах Ожидается, что особое значение стохастический резонанс будет иметь для обработки и передачи информации при дальнейшей миниатюризации устройств, где, по причине малых размеров, значительные флуктуации будут являться важным неустранимым фактором функционирования таких устройств

Наш вклад в прогресс в данной области состоит в том, что нам удалось продемонстрировать как экспериментально, так и теоретически существование стохастического резонанса в нединамической беспороговой системе В отличие от пороговых систем, в которых подпороговые сигналы не вызывают отклика, ионные каналы, конформационное равновесие которых чувствительно к приложенному электрическому напряжению, способны передавать сколь угодно малые сигналы В пределе бесконечно малого сигнала коэффициент передачи приближается к конечному значению

а = 1 + пе¥н !квТ,

О)

где Ун обозначает величину постоянного напряжения, приложенного к мембране, кн и Т имеют свой обычный смысл константы Больцмана и абсолютной температуры, е - заряд протона, а п характеризует

чувствительность системы к приложенному напряжению и, по традиции, установленной в литературе о потенциалозависимых каналах, носит название "воротного заряда". Слагаемое |пе Ун [/ квТ может быть сколь угодно больше единицы; чисто омическому отклику соответствует п = 0 или Ун = О, В этом и состоит основное качественное отличие потенциалозависимых ионных каналов от пороговых устройств, упомянутых выше.

В экспериментальной части мы исследовали простую систему параллельных ионных каналов, образованных в липидной мембране хорошо изученным полипептидом аламетицином. Ионный ток через мембрану определяется приложенным к ней напряжением и числом одновременно открытых каналов, которое, в свою очередь, также зависит от напряжения (Рис. 5). Вероятность найти аламетициновый канал в открытом состоянии является экспоненциальной функцией приложенного напряжения. Сначала было изучено прохождение электрического сигнала в такой системе без приложения внешнего электрического шума. Затем мы приложили шум от внешнего источника и показали, что существует его оптимальное значение, улучшающее прохождение сигнала.

В теоретической части были рассмотрены статистические свойства последовательности импульсов, генерируемых открыванием и закрыванием каналов. Мы ограничились адиабатическим приближением слабых и медленных периодических сигналов. Используя наблюдение об экспоненциальной зависимости скорости генерации импульсов г от приложенного к мембране напряжения, для случая, когда на вход системы подаётся потенциал, состоящий из трёх компонентов — постоянного потенциала смещения Ун (которому соответствует скорость

Рис. 5. Ориентация молекул аламетицина, несущих

дигюльный момент около 80 Д, зависит от приложенного поля

генерации г{Ун)), внешнего шума Уц(0 {с нулевым средним гауссовым распределением) и сигнала , имеем

г[У(г)] = г(У„)ех р

квТ

О 1.5

Рис. 6. Соотношение сигнал/шум на выходе (уравнение (3), относительные единицы) как функция параметров входного шума

Анализируя корреляции между моментами генерации импульсов, мы рассчитываем как выходной сигнал, отвечающий периодической составляющей на входе, так и суммарный шум на выходе системы. ¡3 результате для соотношения сигиал/шум при условии

сильной нелинейности \пеУ„/(квТ) |»1 и слабого сигнала

получаем

-

пеУя) НУн)

ехр

пеа |

г\

"Л

ехр

/ г ч2

1 I пеа 1 у1 ' I пеа 1

(3)

где и а - ширина полосы и эффективное значение "белого" входного шума , а Д/п - ширина полосы анализирующего сигнал устройства. Рис. 6 показывает, что аддитивный шум на входе способен значительно поднять качество сигнала на выходе. Частота /с указана в герцах, эффективное значение шума а в единицах к^Т/\еп\, г(Ун) = 10Гц.

Таким образом, наши исследования впервые показали существование стохастического резонанса: (а) на молекулярном уровне и (6) в

беспороговой нединамической системе Эти результаты важны для более углубленного понимания физической природы этого явления, а также для практического применения в будущем, когда продвижение в область микронных и, тем более, нанометровых размеров не позволит пренебрегать флуктуациями

В пятой главе, написанной по результатам работ 1, 7-9, 13, 16, 20, 26, 29, 32, 37, 38, 40, 42, 44, 49, 51, 57, 58, 60 и 61, излагаются основные принципы использования ионных каналов как "молекулярных счетчиков Коултера" Принцип счетчика Коултера, сформулированный в начале пятидесятых годов, состоит в следующем Когда непроводящая частица, взвешенная в жидкой проводящей среде, попадает внутрь капиллярного канала, она увеличивает его сопротивление по сравнению с капилляром, заполненным только проводящей средой Суспензия частиц протекает через канал под действием приложенного гидростатического давления, что, при постоянном токе, приводит к генерации импульсов напряжения Импульсы усиливаются и анализируются по их амплитуде и средней частоте Такой анализ позволяет судить как о размере, так и о концентрации частиц Впервые эта методика была применена для счета клеток крови, а затем, при последующей модификации, нашла широкий спектр применений от медицины до геологии

Биологические каналы, такие как, например, потенциалозависимый канал внешней мембраны митохондрии, многие бактериальные порины и канал альфа-гемолизина, являются хорошими кандидатами на роль "молекулярных капилляров" - сенсорных элементов в молекулярной версии счетчика Коултера Диаметры их водонаполненных пор находятся в пределах от одного до нескольких нанометров Каковы же основные последствия перехода от микронных размеров к нанометрам? В пятой главе мы рассматриваем три таких последствия (а) преобладание диффузии на малых масштабах, (б) возрастающее значение заряда анализируемых частиц, (в) возрастающую роль взаимодействий между частицами и каналом

Предложенная нами концепция оказалась весьма плодотворной и прочно заняла своё место в нано- и биотехнологических разработках

Шестая глава, обозревающая работы 9, 12, 13, 16, 25, 26, 36, 37, 46—48, 51, 53, 55, 61 и 65, посвящена нашему вкладу в развитие физических принципов использования водорастворимых полимеров в изучении ионных каналов

Глава состоит из пяти частей, обсуждающих (а) электропроводность водно-солевых растворов полиэтиленгликоля (ПЭГ), (б) термодинамику

и кинетику полимеров в поре ионного канала, (в) эффекты неидеальности полимерных растворов, (I-) осмотические эффекты растворённых полимеров и (д) разрешенные во времени одномолекулярные события обмена полимеров между каналом и свободным раствором в случае сильных взаимодействий между полимером и каналом

Прогресс физики полимеров и, в частности, наше понимание основных взаимодействий, участвующих в процессах переноса полимеров через наноскопические каналы, важны во многих областях науки и техники Особое положение здесь занимают эксперименты,

описывающие системы на уровне одиночных молекул и позволяющие в деталях изучать кинетику процессов переноса В наших работах с альфа-гемолизином было замечено, что увеличение концентрации соли приводит к увеличению сродства между ПЭГ и этим каналом Для того чтобы увеличить это сродство, мы провели эксперименты при

экстремально большой

концентрации хлорида калия, а именно при 4 М -концентрации, которая

близка к растворимости этой соли в воде при 25 °С В результате взаимодействие полимера с каналом возросло настолько, что события входа и выхода отдельной полимерной молекулы стало возможно наблюдать как дискретные изменения в ионном токе, протекающем через канал

Примеры записей тока одиночного альфа-гемолизинового канала при напряжении 40 мВ в присутствии малых концентраций ПЭГ различных молекулярных весов приведены на Рис 7 Концентрации полимера и масштабы временной развертки выбраны так, чтобы облегчить сравнение событий Видно, что полимерные молекулы индуцируют скачкообразные

Рис 7 Разрешённое во времени блокирование тока одиночного альфа-гемолизинового канала

флуктуации ионного тока, причем как их амплитуда, так и продолжительность т^, отвечающая времени пребывания полимерной молекулы в канале, зависят от молекулярного веса полимера \\>

Сначала, при увеличении молекулярного веса полимера от 600 до 2000 Да, время пребывания в канале растет экспоненциально с молекулярным весом (Рис 8) Используя простые аргументы об освобождении полимерной молекулы из глубокой потенциальной ямы, глубина которой А/Г(ЛГ) пропорциональна числу мономерных звеньев полимерной молекулы N , можем записать

-expf^M'

квТ

AF{N) = XN,

(4)

100

10

к S

J- 01-J

0 01

где параметр х описывает взаимодействие между полимером и каналом в пересчете на мономер Для ПЭГ (-СН2-СН2-0-)н ЛГ = и>/44 Используя это обстоятельство, из наклона начального участка зависимости тод (>у) на Рис 8 имеем х ~ 0 2^7" Кривая зависимости времени пребывания полимера в канале от и' выходит на максимум в районе ПЭГ 3000, и затем значения времен

начинают уменьшаться Анализ амплитуд блокирования показывает, что в случае больших полимерных молекул часть молекулы оказывается за пределами канала Эта часть полимерной цепи начинает действовать как энтропийная пружина, компенсирующая силы притяжения между полимером и каналом Энергия энтропийного противодействия для

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 Молекулярный вес полимера, Да

Рис 8. Зависимость среднего времени жизни одиночной молекулы полимера в канале от размера молекулы

ПЭГ 8000 может быть оценена как 4 квТ Для гипотетического удлинения пружины L = 5 нм (длина цилиндрической части поры альфа-гемолизинового канала) это приводит к силе /« 610'12 Н Интересно сравнить эту силу с силой, рассчитанной по модели Рауза (Rouse)

/»Щ-L, (5)

Na2

где а - длина одного звена, a JV — число звеньев в молекуле полимера Подставляя L - 5 нм, а -0 35 нм и N = 180 (для ПЭГ 8000), получаем /даЗЮ'12 Н, что вполне удовлетворительно, учитывая простоту используемой модели

Таким образом, исследования динамического распределения одиночных полимерных молекул между свободным раствором и наноскопической полостью ионного канала позволяют изучать детальные кинетические особенности этого процесса и, тем самым, углублять наше понимание соответствующих взаимодействий Как уже отмечалось выше, такое понимание необходимо не только для прогресса в области биотехнологических приложений, но и для дальнейшего развития физики транспортных явлений и физики полимеров

В седьмой главе, написанной по материалам работ 11, 24, 31, 39, 57 и 63, рассматриваются возможности экспериментов с ионными каналами в исследованиях молекулярной упаковки и конформационного равновесия белков Среди новых вопросов, возникающих в результате совершенствования методов работы с одиночными молекулами, одно из центральных мест занимает вопрос о статической и динамической неупорядоченности молекулярной упаковки белка В таких экспериментах статический беспорядок виден как сохраняющиеся во времени отклонения скоростей биохимических реакций, измеренных на одиночной белковой молекуле, от их средних по ансамблю значений Динамический беспорядок может быть виден как флуктуации скоростей реакций во времени Изучение этих вопросов имеет как чисто теоретический [10], так и вполне прикладной интерес, так как все увеличивающееся число болезней находит свое объяснение в ошибках в молекулярной упаковке белка

Реконструкция ионных каналов в плоские липидные мембраны является исторически первой методикой, позволившей изучать одиночные белковые молекулы в их полностью функциональных состояниях Спонтанное встраивание канала в мембрану регистрируется

как ступенчатое возрастание её проводимости Начиная с самых первых экспериментов, стало понятно, что амплитуда "дискретных ступенек проводимости" демонстрирует определенный разброс вокруг их среднего значения и что этот разброс надежно превышает точность измерений Тем не менее на протяжении более чем 35 лет со времени первых экспериментов это наблюдение не привлекало какого-либо серьезного анализа По нашему мнению, основная причина такого положения в том, что язык для обсуждения причин флуктуаций скоростей ферментативных реакций появился сравнительно недавно

Статическая и динамическая неупорядоченность молекулярной упаковки белка была изучена нами на примере мальтопоринового канала Этот канал является хорошим кандидатом для таких исследований, поскольку в дополнение к своей основной функции - транспорту Сахаров - он обладает ещё и способностью проводить ионы При этом скорость транспорта Сахаров может быть измерена в тех же экспериментах, что и ионная проводимость канала Статистический анализ показал, что полностью функциональное состояние белковой молекулы может реализоваться не в одном, а во многих надежно отличающихся друг от друга субконформациях

В части работы, посвященной конформационному равновесию белков, мы рассматриваем эффекты, связанные с эластическими напряжениями в гидрофобной зоне мембранного бислоя В экспериментах с модельными каналами (грамицидином и аламетицином) и митохондриальным каналом мы демонстрируем важность учета эластического компонента в энергетическом балансе, управляющем конформационными переходами мембранных белков

Восьмая глава, написанная по материалам работ 29, 32, 38, 41, 42, 44, 45, 52, 54, 58, 62 и 64, посвящена катализирующей роли взаимодействий между каналом и проникающими молекулами Трансмембранные каналы с относительно большими водными порами традиционно принято рассматривать как "молекулярные сита", проницаемость которых для различных молекул определяется лишь их размерами Этот упрощенный взгляд, однако, противоречит быстро накапливающимся данным о том, что транспорт через такие структуры включает сложные молекулярные взаимодействия Все большее количество экспериментальных примеров показывает, что каналы, созданные природой для транспорта определенных метаболитов, обладают сродством к этим метаболитам Таким образом, оказывается,

что проникающие молекулы не просто "проскальзывают" через канал, а взаимодействуют с аминокислотными остатками, выстилающими пору канала Однако в стандартной модели с одиночным центром связывания, увеличение сродства между частицей и центром приведет к увеличению времени нахождения частицы в канале и, как следствие, к уменьшению потока частиц через канал Почему же тогда эксперименты указывают на

существование сродства между каналами и молекулами, которые эти каналы транспортируют?

Мы отвечаем на этот вопрос, анализируя роль взаимодействий между проникающей частицей и каналом в рамках стохастической модели диффузии частицы внутри канала, и показываем, что существует взаимодействие, оптимизирующее поток частиц

Отличие нашей модели от стандартного описания состоит в том, что, основываясь на уравнениях диффузии, мы учитываем не только захват частицы каналом, но и её динамику внутри канала (Рис 9) Движение в цилиндрическом канале длиной Ь и радиусом Л мы описываем как одномерную диффузию, а трехмерность объёмов за пределами канала - используя радиационные граничные условия В канале (0 < х < Ь ) частица диффундирует в потенциале средней силы II (х) с коэффициентом диффузии £>(х), а за его пределами - с коэффициентом диффузии йь Поведение частицы может быть описано функцией Грина С(:м|*0)> которая определена как плотность вероятности найти частицу в точке с координатой х в момент времени t при условии, что в момент времени / = О она находилась в точке х0 Функция Грина удовлетворяет уравнению Смолуховского

дв(х,1\х„) 5 Г ( ЩяЛэГ (Щх)) .. , Л|

потенциала средней силы, действующей на частицу

с начальным условием

0[л:о) = 3(х-х0)

(7)

и радиационными граничными условиями на выходах канала при х = 0 и х = Ь

0(0)

дх

С0м|хо)ехр

Щх)

А т.

= кех р

/С/(0)Л кквТ

дх

С(х,Нх0)ехр

Щх)

V V.

= кгехр

[чш

I V.

(8)

где к — константа скорости, выбранная из условия детального равновесия согласно следующим соображениям В случае равновесия не взаимодействующих с каналом частиц бесконечно малого размера одномерная плотность частиц в канале равна ж Я2 с, где с - объемная концентрация частиц Соответствующий поток частиц, выходящих из канала, может быть записан через искомую константу скорости как ]<яи ~ КлКгс В равновесии этот поток должен быть скомпенсирован входящим потоком, рассчитываемым как скорость осаждения частиц на идеально поглощающем круглом диске радиуса К }т = ЛОьКс Условие 3,п = 1ош приводит к

4Д,

к = -

кВ.

(9)

Такая постановка задачи позволяет получить аналитические выражения не только для вероятности транслокации частицы через канал, но и для характерных времен ее пребывания в канале (среднее время транслокации, возврата и жизни в канале) В частности, для вероятности транслокации частицы, находящейся на входе в канал, имеем

Р,=-

1

4А лЯ

2 + -^-|ехр

Ц(х) квТ ,

ск

(10)

Это уравнение получено при условии U(0) = U[L) Оно показывает, что глубокая потенциальная яма, занимающая большую часть длины канала, способна существенно увеличить вероятность прохождения частицы через канал В то же время очевидно, что такая яма существенно замедляет выход частицы из канала. В связи с этим возникает вопрос о принципиальной возможности оптимизации транспорта за счет взаимодействий между частицей и каналом

В том случае, когда прямоугольная потенциальная яма глубиной U0 занимает весь канал, D(x) = Dch, а канал может быть занят только одной частицей, можно показать, что поток частиц через канал равен

J =

2 ¿уг(с,-с2)

mR2L(C. +с,) 1 +-у-— ехр

MiL квТ

, 2 DbL ( U0

1 +-— ехр ——

nDr„R Fl к„Т

(П)

8000

6000

4000

2000

L =^05 нм

0 2 4 6 8 10 12 14 16 Глубина потенциальной ямы, квТ

Рис 10 Зависимость потока частиц от энеогии их взаимодействия с каналом

где с, и с2 -концентрации частиц в бассейнах (Рис 9) Уравнение (11) предсказывает немонотонное поведение потока (Рис 10) Оптимальная глубина потенциальной ямы обеспечивает компромисс между увеличением вероятности транслокации и временными задержками частиц в канале. Эта глубина зависит от нескольких параметров, в том числе и от концентрации частиц

4А

n2DchR'(cx +с2)

Таким образом, основной результат нашего анализа состоит в том, что он позволил создать физическую картину явления, объясняющую катализирующую роль наблюдаемых в эксперименте взаимодействий между каналами и транспортируемыми ими частицами

В девятой главе, написанной по результатам работ 44, 56 и 59, обсуждаются пути конкретных практических применений полученных результатов В этой главе мы рассматриваем три проекта, выводы которых обладают непосредственной практической ценностью К ним относятся наши работы по (а) исследованию проницаемости антибиотиков пенициллиновой группы через бактериальные каналы, (б) блокированию каналов одного из компонентов токсина сибирской язвы производными циклодекстринов; (в) выяснению причин резистентности бактерий Pseudomonas aeruginosa к антибактериальным препаратам

Основные выводы

1 Анализ электростатических эффектов в транспортных свойствах каналов позволил выяснить пределы применимости теоретических подходов, основанных на приближении среднего поля В частности, для бактериального порина OmpF обнаружено, что ионная селективность и асимметрия его транспортных свойств связаны с распределением заряда во всей белковой молекуле, а не только с зарядом зоны ограничения, как считалось ранее

2 Всестороннее исследование флуктуаций проводимости на уровне одиночных каналов позволяет утверждать, что (а) основными источниками шумов ионных токов, протекающих через каналы, являются равновесная конформационная динамика каналообразующих молекул и обратимое протонирование их аминокислотных остатков, (б) l/f-шум не является фундаментальным свойством ионного транспорта и во всех проанализированных нами случаях объясняется равновесными флуктуациями проводимости

3 Флуктуационный анализ натриевой проницаемости апикальных мембран клеток эпителия Rana temporana продемонстрировал возможности этого метода в исследовании биологических мембран В частности, обнаружен ранее неизвестный регуляторный участок натриевых каналов на внешней поверхности апикальной мембраны.

4 Установлено, что стохастический резонанс - индуцированный шумом эффект увеличения степени порядка [2] - можно наблюдать уже на молекулярном уровне потенциалозависимых ионных каналов Более

того, показано, что его существование не обязательно связано с динамическими или пороговыми системами, как считалось ранее

5 Предложена экспериментально и обоснована теоретически идея использования мезоскопических ионных каналов в качестве сенсорных элементов "молекулярных счетчиков Коултера" Показано, что чувствительность таких сенсорных элементов позволяет детектировать и анализировать одиночные молекулы различной природы

6 Установлены основные физические принципы взаимодействий водорастворимых полимеров с каналами Показана роль конфигурационных ограничений в общем балансе свободной энергии полимерных молекул в окружающем растворе и в канале, в том числе с учетом эффектов неидеальности полимерных растворов

7 В части работы, посвященной проблемам молекулярной упаковки белковых молекул [10], установлено, что так называемая "оптимальная упаковка" является в действительности набором полностью функциональных, но различающихся структур, сохраняющих свои индивидуальные свойства во временных масштабах сотен секунд

8 В рамках диффузионного описания динамики частиц в канале построена физическая теория, объясняющая катализирующий эффект взаимодействий между транспортируемыми частицами и каналами

9 В качестве потенциальных практических применений показана важность взаимодействий молекул антибиотиков пенициллиновой группы с бактериальными каналами, установлен механизм блокирования токсинов сибирской язвы производными циклодекстрина; выявлены причины низкой проницаемости мембран бактерии Pseudomonas aeruginosa д ля антибиотиков

Литература

[1] Y X Jiang et al, X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel Nature, 423, 33 (2003)

[2] В С Анищенко и др , Стохастический резонанс как индуцированный шумом эффект увеличения степени порядка Успехи физических наук, 169, 7 (1999)

[3] В Г Ивков и Г Н Берестовский, Динамическая структура липидного бислоя, М Наука, 1981, 293 с

[4] Р Mueller et al, Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system Nature, 194, 979 (1962)

[5] V A Parsegian, Energy of an ion crossing a low dielectric membrane Solutions to four relevant electrostatic problems Nature, 221, 844 (1969)

[6] В С Маркин и Ю А Чизмаджев, Индуцированный ионный транспорт, М Наука, 1974, 251 с

[7] Single-Channel Recording, ed В Sakmann and E Neher, N Y Plenum Press, 1985, 700 p

[8] Ion Channel Reconstitution, ed С Miller, N Y Plenum Press, 1986, 577 p

[9] N. G van Kampen, Stochastic Processes in Physics and Chemistry, Amsterdam, Elsevier, 1992,405 p

[10] А В Финкельштейн, О Б Птицин, Физика белка Курс лекций, М Книжный дом "Университет", 2005, 354 с

Содержание работы изложено в следующих основных публикациях

1 S М Bezrukov, G М Drabkin, and A I Sibilev Conductance fluctuations in the laminar flow of a colloid Journal of Colloid and Interface Science, 1986,113, 194-202

2 CM Безруков, В Г Покровский, Ю И Наточин Механизм стимуляции натриевых каналов апикальных клеточных мембран кожи лягушки катионами кобальта (флуктуационный анализ) Доклады Академии наук СССР, 1986, 286, 993-997

3 S М Bezrukov, A I Irkhm, and A I Sibilev An upper estimate for 1/f noise intensity m ionic conductors from experiments with a molecular microcontact Physics Letters A, 1987,123, 477^80

4 CM Безруков, P А Брутян Флуктуации электропроводности липидных бислоев при односторонней добавке полиеновых антибиотиков Биофизика, 1987,32, 526-528

5 СМ Безруков, В Г Покровский Флуктуационный анализ проницаемости натрия через апикальные мембраны кожи лягушки Биологические мембраны, 1989, 6, 67—75

6 В Г Покровский, С М Безруков Влияние катионов кобальта на натриевую проницаемость апикальных клеточных мембран кожи лягушки Биологические мембраны, 1989, б, 76-83

7. S М Bezrukov, М A Pustovoit, A I Sibilev, and G М Drabkin Large-scale conductance fluctuations in solutions of strong electrolytes Physica B, 1989, 159, 388-398 8 S M Bezrukov, M A Pustovoit, and A I Sibilev Conductance fluctuation spectroscopy of micellar solutions m flow Journal of Colloid and Interface Science, 1992,148, 375-381

9 S M Bezrukov and I Vodyanoy. Probing alamethicin channels with water-soluble polymers Effect on conductance of channel states Biophysical Journal, 1993, 64, 16-25

10 S M Bezrukov and J J Kasianowicz Fluctuations in current through a single open ion channel reveal titration kinetics of ionizable residues. Physical Review Letters, 1993, 70, 2352-2355

11 S L Keller, S M Bezrukov, S M Gruner, M W Tate, I Vodyanoy, and V A Parsegian Probability of alamethicin conductance states varies with nonlamellar tendency of bilayer phospholipids Biophysical Journal, 1993, 65,23-27

12 I Vodyanoy, S M Bezrukov, and V A Parsegian Probing alamethicin channels with water-soluble polymers Size-modulated osmotic action Biophysical Journal, 1993,65,2097-2105.

13 S M Bezrukov, I Vodyanoy, and V A. Parsegian Counting polymers moving through a single ion channel Nature (London), 1994, 370, 279281

14 J J Kasianowicz and S M Bezrukov Protonation dynamics of the alpha-toxin channel from spectral analysis of pH dependent current fluctuations Biophysical Journal, 1995,69,94-105

15 S. M Bezrukov and I Vodyanoy Noise-induced enhancement of signal transduction across voltage-dependent ion channels Nature (London), 1995, 378, 362-364

16 S M Bezrukov, I Vodyanoy, R A Brutyan, and J J Kasianowicz Dynamics and free energy of polymers partitioning into a nanoscale pore Macromolecules, 1996, 29, 8517-8522

17 S M Bezrukov and I Vodyanoy Stochastic resonance in non-dynamical systems without response thresholds Nature (London), 1997, 385, 319— 321

18 S M Bezrukov and I Vodyanoy Stochastic resonance at the single-cell level Nature (London), 1997,388,632-633.

19 S M Bezrukov and I Vodyanoy Signal transduction across alamethicin ion channels in the presence of noise Biophysical Journal, 1997, 73, 2456-2464

20 T. K Rostovtseva and S M Bezrukov. ATP transport through a single mitochondrial channel, VDAC, studied by current fluctuation analysis Biophysical Journal, 1998, 74, 2365-2373

21 S M Bezrukov and I Vodyanoy Stochastic resonance in thermally activated reactions. Application to biological ion channels Chaos, 1998, 8, 557-566

22. T K Rostovtseva, V. M Aguilella, I Vodyanoy, S. M Bezrukov, and V A. Parsegian Membrane surface-charge titration probed by gramicidin A channel conductance Biophysical Journal, 1998,75, 1783-1792

23 S M Bezrukov Stochastic resonance as an inherent property of rate-modulated random series of events Physics Letters A, 1998,248,29-36

24 S. M. Bezrukov, R P Rand, I Vodyanoy, and V A Parsegian Lipid packing stress and polypeptide aggregation Alamethicin channels probed by proton titration of lipid charge Faraday Discussions, 1998, 111, 173-183

25 P. G Merzlyak, L N Yuldasheva, C G. Rodrigues, C M M Carneiro, O V Krasilnikov, and S M Bezrukov. Polymeric nonelectrolytes to probe pore geometry Application to the alpha-toxin transmembrane channel Biophysical Journal, 1999,77,3023-3033

26 S M Bezrukov Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport Journal of Membrane Biology, 2000,174,1-13

27 S M Bezrukov and M Winterhalter Examining noise sources at the single-molecule level. 1/f noise of an open maltoporin channel. Physical Review Letters, 2000, 85, 202-205

28 T K Rostovtseva, T -T Liu, M Colombini, V A Parsegian, and S. M. Bezrukov. Positive cooperativity without domains or subunits in a monomeric membrane channel Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97, 7819-7822

29 S. M. Bezrukov, L Kullman, and M Winterhalter Probing sugar translocation through maltoporin at the single channel level FEBS Letters, 2000, 476, 224-228

30 S A. Desai, S M Bezrukov, and J Zimmerberg A voltage-dependent channel involved m nutrient uptake by red blood cells infected with malaria parasite Nature (London), 2000,406,1001-1005

31 S M. Bezrukov Functional consequences of lipid packing stress Current Opinion m Colloid and Interface Science, 2000,5,237-243

32. S M. Bezrukov, A. M Berezhkovskn, M A Pustovoit, and A Szabo. Particle number fluctuations in a membrane channel. Journal of Chemical Physics, 2000,113, 8206-8211

33 В В Малев, Ю А Каулин, Ф А Гурьнев, С М Безруков, J Y Такемото, JI В Щагина Эффект распределения заряда на проводимость одиночных каналов образуемых сирингомицином Е в липидных бислоях Биологические мембраны, 2001,18, 145-153

34 V М Aguilella and S М Bezrukov Alamethicm channel conductance modified by lipid charge European Biophysics Journal, 2001, 30, 233241

35 P S Ruszczynski, L. В Kish, and S M Bezrukov Noise-assisted traffic of spikes through neuronal junctions Chaos, 2001, 11, 581-586

36 С M Безруков и Дж Дж Касьянович Нейтральные полимеры в нанопорах аламетицина и альфа-гемолизина Биологические мембраны, 2001,18, 453-457

37 Т К Rostovtseva, Е М Nestorovich, and S М Bezrukov Partitioning of differently sized poly(ethylene glycol)s into OmpF ponn Biophysical Journal, 2002, 82, 160-169

38 L Kullman, M Winterhalter, and S M Bezrukov Transport of maltodextrins through maltoporin A single-channel study Biophysical Journal, 2002, 82, 803-812

39 V V Malev, L V Schagma, P A Gurnev, J Y Takemoto, E M Nestorovich, and S M Bezrukov Syringomycm E channel A lipidic pore stabilized by lipopeptide7 Biophysical Journal, 2002, 82, 1985-1994

40 A M Berezhkovskn, M A Pustovoit, and S M Bezrukov Effect of binding on particle number fluctuations in a membrane channel Journal of Chemical Physics, 2002,116, 6216-6220

41 AM Berezhkovskn", M A Pustovoit, and S M Bezrukov Channel-facilitated membrane transport Transit probability and interaction with the channel Journal of Chemical Physics, 2002,116, 9952-9956

42 T К Rostovtseva, A Komarov, S M Bezrukov, and M Colombini VDAC channels differentiate between natural metabolites and synthetic molecules Journal of Membrane Biology, 2002,187, 147-156

43 S M Bezrukov and L В Kish How much power does neural signal propagation need"? Smart Materials and Structures, 2002,11, 800-803

44 E M Nestorovich, С Danelon, M Winterhalter, and S M Bezrukov Designed to penetrate Time-resolved interaction of single antibiotic

molecules with bacterial pores Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99, 9789-9794.

45 A M Berezhkovskn, M A Pustovoit, and S M Bezrukov Channel-facilitated membrane transport Average lifetimes in the channel Journal of Chemical Physics, 2003,119, 3943-3951

46 К S Stojilkovic, A M Berezhkovskn, V. Yu Zitserman, and S M Bezrukov Conductivity and microviscosity of electrolyte solutions containing polyethylene glycols Journal of Chemical Physics, 2003, 119,6973-6978

47 E M Nestorovich, T К Rostovtseva, and S M Bezrukov Residue ionization and ion transport through OmpF channels Biophysical Journal, 2003, 85, 3718-3729.

48 О V Krasilmkov and S M Bezrukov Polymer partitioning from nonideal solutions into protein voids Macromolecules, 2004,37, 2650-2657.

49 S M Bezrukov Noise analysis in studies of protein dynamics and molecular transport Fluctuation and Noise Letters, 2004, 4, L23-L31

50 A Alcaraz, E M Nestorovich, M Aguilella-Arzo, V M Aguilella, and S M Bezrukov Salting out the ionic selectivity of a wide channel The asymmetry of OmpF Biophysical Journal, 2004,87,943-957

51 S M Bezrukov, О V Krasilmkov, L. N Yuldasheva,A M Berezhkovskii, and С G Rodrigues Field-dependent effect of crown ether (18-crown-6) on ionic conductance of alpha-hemolysm channels Biophysical Journal, 2004,87,3162-171

52 A M Berezhkovskn and S M Bezrukov Optimizing transport of metabolites through large channels Molecular sieves with and without binding Biophysical Journal, 2005, 88, L17-L19

53 В Ю Зицерман, К С Стожилкович, А М Бережковский и С М Безруков Электропроводность водных растворов полиэтиленгликоля Журнал физической химии, 2005, 79, 1245-1252

54 А. М Berezhkovskn and S М Bezrukov Channel-facilitated membrane transport Constructive role of particle attraction to the channel pore Chemical Physics, 2005, 319, 342-349

55 V Yu Zitserman, A M Berezhkovskn, V A Parsegian, and S. M Bezrukov Non-ideality of polymer solutions in the pore and concentration-dependent partitioning Journal of Chemical Physics, 2005, 123, 146101-146102

56 V A. Karginov, E M Nestorovich, M Moayen, S H Leppla, and S M Bezrukov Blocking anthrax lethal toxin at the protective antigen channel by using structure-inspired drug design Proc Natl Acad Set USA, 2005, 102, 15075-15080

57 L Kullman, P A Gurnev, M Winterhalter, and S M Bezrukov Functional sub-conformations m protein folding Evidence from singlechannel experiments Physical Review Letters, 2006, 96, 038101

58 C Danelon, E M Nestorovich, M Winterhalter, M Ceccarelli, and S M. Bezrukov Interaction of zwitterionic penicillins with the OmpF channel facilitates their translocation Biophysical Journal, 2006, 90, 1617-1627

59 E M Nestorovich, E Sugawara, H Nikaido, and S M Bezrukov Pseudomonas aeruginosa ponn OprF Properties of the channel Journal of Biological Chemistry, 2006, 281, 16230-16237

60 P A Gurnev, A B Oppenheim, M Winterhalter, and S M Bezrukov Docking of a single phage lambda to its membrane receptor maltoponn as a time-resolved event Journal of Molecular Biology, 2006, 359, 14471455

61 O V Krasilnikov, C G Rodrigues, and S M Bezrukov Single polymer molecules in a protein nanopore m the limit of a strong polymer-pore attraction Physical Review Letters, 2006, 97,018301

62 A M Berezhkovskn, G Hummer, and S M Bezrukov Identity of distributions of direct uphill and downhill translocation times for particles traversing membrane channels Physical Review Letters, 2006, 97, 020601

63. T K Rostovtseva, N Kazemi, M Weinrich, and S. M Bezrukov Voltage gating of VDAC is regulated by non-lamellar lipids of mitochondrial membranes Journal of Biological Chemistry, 2006, 281, 37496-37506

64 A M Berezhkovskn and S M Bezrukov Site model for channel-facilitated membrane transport Invariance of translocation-time distribution with respect to direction of passage Journal of Physics, Condensed Matter, 2007, 19, 065148

65 O S Ostroumova, P A Gurnev, L V Schagina, and S. M Bezrukov Asymmetry of syringomycm E channel studied by polymer partitioning. FEBS Letters, 2007, 581, 804-808.

\

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН 188300, Гатчина Ленинградской обл , Орлова роща Зак 282, тир 120, уч -изд л 2, 28 08 2007 г

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Основная цель работы

Научная новизна

Практическая значимость работы

Апробация работы

ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ 9 Физическая природа биологических мембран и липидных бислоёв

Ионные каналы

Реконструкция ионных каналов в липидные бислои

Краткая характеристика объектов исследования

ГЛАВА I. ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ

В ПРОВОДИМОСТИ И СЕЛЕКТИВНОСТИ КАНАЛОВ

Грамицидиновый канал как датчик потенциала поверхности 32

Аламетициновый канал в мембранах из заряженного липида 43

Электростатические эффекты в транспортных свойствах ОтрБ 47

ГЛАВА II. ФЛУКТУАЦИОННЫЕ ЯВЛЕНИЯ В ИОННЫХ

ПРОВОДНИКАХ 59

Введение 59

Шум Джонсона 63

Дробовый шум 67

Шум проводимости 71

1/1-шум 99

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа посвящена систематическому изучению ионных каналов как наноскопических систем. Одной из главных целей работы являлись развитие, оптимизация и создание новых методов физики конденсированного состояния для проведения исследований на уровне одиночных молекул. Основные результаты работы состоят в следующем.

1. Анализ электростатических эффектов в транспортных свойствах каналов позволил выяснить пределы применимости теоретических подходов, основанных на приближении среднего поля. В частности, для бактериального порина OmpF обнаружено, что ионная селективность и асимметрия его транспортных свойств связаны с распределением заряда во всей белковой молекуле, а не только с зарядом зоны ограничения, как считалось ранее.

2. Всестороннее исследование флуктуаций проводимости на уровне одиночных каналов позволяет утверждать, что: (а) основными источниками шумов ионных токов, протекающих через каналы, являются равновесная конформационная динамика каналообразующих молекул и обратимое протонирование их аминокислотных остатков; (б) l/f-шум не является фундаментальным свойством ионного транспорта и во всех проанализированных нами случаях объясняется равновесными флуктуациями проводимости.

3. Флуктуационный анализ натриевой проницаемости апикальных мембран клеток эпителия Rana temporaria продемонстрировал возможности этого метода в исследовании биологических мембран. В частности, обнаружен ранее неизвестный регуляторный участок натриевых каналов на внешней поверхности апикальной мембраны.

4. Установлено, что стохастический резонанс - индуцированный шумом эффект увеличения степени порядка - можно наблюдать уже на молекулярном уровне потенциалозависимых ионных каналов. Более того, показано, что его существование не обязательно связано с динамическими или пороговыми системами, как считалось ранее.

252

5. Предложена экспериментально и обоснована теоретически идея использования мезоскопических ионных каналов в качестве сенсорных элементов "молекулярных счётчиков Коултера". Показано, что чувствительность таких сенсорных элементов позволяет детектировать и анализировать одиночные молекулы различной природы.

6. Установлены основные физические принципы взаимодействий водорастворимых полимеров с каналами. Показана роль конфигурационных ограничений в общем балансе свободной энергии полимерных молекул в окружающем растворе и в канале, в том числе с учётом эффектов неидеальности полимерных растворов.

7. В части работы, посвящённой проблемам молекулярной упаковки белковых молекул, установлено, что так называемая "оптимальная упаковка" является в действительности набором полностью функциональных, но различающихся структур, сохраняющих свои индивидуальные свойства во временных масштабах сотен секунд.

8. В рамках диффузионного описания динамики частиц в канале построена физическая теория, объясняющая катализирующий эффект взаимодействий между проникающими частицами и каналом.

9. В качестве потенциальных практических применений показана важность взаимодействий молекул антибиотиков пенициллиновой группы с бактериальными каналами; установлен механизм блокирования токсинов сибирской язвы производными циклодекстрина; выявлены причины низкой проницаемости мембран бактерии Pseudomonas aeruginosa для антибиотиков.

253

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор глубоко благодарен многим коллегам, с которыми ему посчастливилось работать и которые оказали на него огромное влияние:

В первую очередь, Гильяри Моисеевичу Драбкину, предложившему автору в 1973 году должность стажера-исследователя в Секторе исследования конденсированного состояния ЛИЯФ АН СССР и направившему его в сторону физики биологических объектов;

Августину Ивановичу Сибилёву, Игорю Дмитриевичу Лузянину и Владимиру Петровичу Хавронину за их многотерпение при обучении автора премудростям экспериментальной физики и Аркадию Гиршевичу Аронову за многочисленные обсуждения и помощь в теоретических изысканиях;

Александру Михайловичу Бережковскому, Матиасу Винтерхалтеру, Игорю Яковлевичу Водяному, Филиппу Алексеевичу Гурьневу, Джошуа Зиммербергу, Джону Касьяновичу, Ласло Кишу, Марко Коломбини, Олегу Владимировичу Красильникову, Лизен Куллман, Валерию Вениаминовичу Малеву, Екатерине Михайловне Несторович, Ольге Сергеевне Остроумовой, Адриану Парсегяну, Марку Алексеевичу Пустовойту, Питеру Ранду, Татьяне Кировне Ростовцевой и Людмиле Владимировне Щагиной за удовольствие, полученное от работы над совместными проектами.

Автор также благодарен многим замечательным сотрудникам ЛИЯФ/ПИЯФ за их неизменную психологическую поддержку на протяжении многих лет. Среди тех, кто не является непосредственным соавтором научных трудов, хотелось бы особенно отметить Владимира Андреевича Назаренко, Иосифа Моисеевича Лазебника, Алексея Ивановича Окорокова, Диану Николаевну Орлову, Анатолия Васильевича Ковалёва, Эрнеста Григорьевича Таровика, Игоря Викторовича Голосовского, Леонида Абрамовича Аксельрода и Геннадия Петровича Гордеева.

1. S. М. Bezrukov, G. М. Drabkin, and A. I. Sibilev. Conductance fluctuations in the laminar flow of a colloid. Journal of Colloid and Interface Science, 1986,113: 194-202.

2. С. M. Безруков, В. Г. Покровский и Ю. И. Наточин. Механизм стимуляции ионами кобальта натриевых каналов апикальной мембраны клеток кожи лягушки (флуктуационный анализ). Доклады Академии наук СССР, 1986, 286: 993-997.

3. S. М. Bezrukov, A. I. Irkhin, and A. I. Sibilev. An upper estimate for 1/f noise intensity in ionic conductors from experiments with a molecular microcontact. Physics Letters A, 1987,123: 477-480.

4. С. M. Безруков и P. А. Брутян. Флуктуации электропроводности липидных бислоев при односторонней добавке полиеновых антибиотиков. Биофизика, 1987, 32: 526-528.

5. С.М.Безруков и В.Г.Покровский. Флуктуационный анализ проницаемости натрия через апикальные мембраны кожи лягушки. Биологические мембраны, 1989, 6:67-75.

6. В. Г. Покровский и С. М. Безруков. Влияние катионов кобальта на натриевую проницаемость апикальных клеточных мембран кожи лягушки. Биологические мембраны, 1989, 6: 76-83.

7. S. М. Bezrukov, М. A. Pustovoit, A. I. Sibilev, and G. М. Drabkin. Large-scale conductance fluctuations in solutions of strong electrolytes. Physica B, 1989,159: 388-398.

8. S. M. Bezrukov, M. A. Pustovoit, and A. I. Sibilev. Conductance fluctuation spectroscopy of micellar solutions in flow. Journal of Colloid and Interface Science, 1992, 148: 375-381.

9. S. M. Bezrukov and I. Vodyanoy. Probing alamethicin channels with water-soluble polymers. Effect on conductance of channel states. Biophysical Journal, 1993, 64: 16-25.

10. S. M. Bezrukov and J. J. Kasianowicz. Fluctuations in current through a single open ion channel reveal titration kinetics of ionizable residues. Physical Review Letters, 1993, 70: 2352-2355.

11. S. L. Keller, S. M. Bezrukov, S. M. Gruner, M. W. Tate, I. Vodyanoy, and V. A. Parsegian. Probability of alamethicin conductance states varies with nonlamellar tendency of bilayer phospholipids. Biophysical Journal, 1993,65:23-27.

12. Vodyanoy, S. M. Bezrukov, and V. A. Parsegian. Probing alamethicin channels with water-soluble polymers. Size-modulated osmotic action. Biophysical Journal, 1993, 65: 2097-2105.

13. S. M. Bezrukov, I. Vodyanoy, and V. A. Parsegian. Counting polymers moving through a single ion channel. Nature (London), 1994, 370: 279-281.

14. J. J. Kasianowicz and S. M. Bezrukov. Protonation dynamics of the alpha-toxin channel from spectral analysis of pH dependent current fluctuations. Biophysical Journal, 1995, 69: 94-105.

15. S. M. Bezrukov and I. Vodyanoy. Noise-induced enhancement of signal transduction across voltage-dependent ion channels. Nature (London), 1995, 378: 362-364.

16. S. M. Bezrukov, I. Vodyanoy, R. A. Brutyan, and J. J. Kasianowicz. Dynamics and free energy of polymers partitioning into a nanoscale pore. Macromolecules, 1996, 29: 8517-8522.

17. S. M. Bezrukov and I. Vodyanoy. Stochastic resonance in non-dynamical systems without response thresholds. Nature (London), 1997,385:319-321.

18. S. M. Bezrukov and I. Vodyanoy. Stochastic resonance at the single-cell level. Nature (London), 1997, 388: 632-633.

19. S. M. Bezrukov and I. Vodyanoy. Signal transduction across alamethicin ion channels in the presence of noise. Biophysical Journal, 1997, 73: 2456-2464.

20. T. K. Rostovtseva and S. M. Bezrukov. ATP transport through a single mitochondrial channel, VDAC, studied by current fluctuation analysis. Biophysical Journal, 1998, 74: 2365-2373.

21. S. M. Bezrukov and I. Vodyanoy. Stochastic resonance in thermally activated reactions: Application to biological ion channels. Chaos, 1998, 8: 557-566.

22. T. K. Rostovtseva, V. M. Aguilella, I. Vodyanoy, S. M. Bezrukov, and V. A. Parsegian. Membrane surface-charge titration probed by gramicidin A channel conductance. Biophysical Journal, 1998, 75: 1783-1792.

23. S. M. Bezrukov. Stochastic resonance as an inherent property of rate-modulated random series of events. Physics Letters A, 1998, 248: 29-36.

24. S. M. Bezrukov, R. P. Rand, I. Vodyanoy, and V. A. Parsegian. Lipid packing stress and polypeptide aggregation: Alamethicin channels probed by proton titration of lipid charge. Faraday Discussions, 1998,111: 173-183.

25. S. M. Bezrukov. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. Journal of Membrane Biology, 2000,174: 1-13.

26. S. M. Bezrukov and M. Winterhalter. Examining noise sources at the single-molecule level: 1/f noise of an open maltoporin channel. Physical Review Letters, 2000, 85: 202-205.

27. T. K. Rostovtseva, T.-T. Liu, M. Colombini, V. A. Parsegian, and S. M. Bezrukov. Positive cooperativity without domains or subunits in a monomeric membrane channel. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2000, 97: 7819-7822.

28. S. M. Bezrukov, L. Kullman, and M. Winterhalter. Probing sugar translocation through maltoporin at the single channel level. FEBSLetters, 2000, 476: 224-228.

29. S. A. Desai, S. M. Bezrukov, and J. Zimmerberg. A voltage-dependent channel involved in nutrient uptake by red blood cells infected with malaria parasite. Nature (London), 2000, 406: 1001-1005.

30. S. M. Bezrukov. Functional consequences of lipid packing stress. Current Opinion in Colloid and Interface Science, 2000, 5: 237-243.

31. S. M. Bezrukov, A. M. Berezhkovskii, M. A. Pustovoit, and A. Szabo. Particle number fluctuations in a membrane channel. Journal of Chemical Physics, 2000, 113: 8206-8211.

32. В. В. Малев, Ю. А. Каулин, Ф. А. Гурьнев, С.М.Безруков, Дж. Я. Такемото и JI. В. Щагина. Эффект распределения заряда на проводимость одиночных каналов, образуемых сирингомицином Е в липидных бислоях. Биологические мембраны, 2001,18: 145-153.

33. V. M. Aguilella and S. M. Bezrukov. Alamethicin channel conductance modified by lipid charge. European Biophysics Journal, 2001, 30: 233-241.

34. P. S. Ruszczynski, L. B. Kish, and S. M. Bezrukov. Noise-assisted traffic of spikes through neuronal junctions. Chaos, 2001,11: 581-586.

35. С. M. Безруков и Дж. Дж. Касьянович. Нейтральные полимеры в нанопорах аламетицина и альфа-гемолизина. Биологические мембраны, 2001,18: 453-457.

36. Т. К. Rostovtseva, Е. М. Nestorovich, and S. М. Bezrukov. Partitioning of differently sized poly(ethylene glycol)s into OmpF porin. Biophysical Journal, 2002, 82: 160-169.

37. L. Kullman, M. Winterhalter, and S. M. Bezrukov. Transport of maltodextrins through maltoporin: A single-channel study. Biophysical Journal, 2002, 82: 803-812.

38. V. V. Malev, L. V. Schagina, P. A. Gurnev, J. Y. Takemoto, E. M. Nestorovich, and S. M. Bezrukov. Syringomycin E channel: A lipidic pore stabilized by lipopeptide? Biophysical Journal, 2002, 82: 1985-1994.

39. A. M. Berezhkovskii, M. A. Pustovoit, and S. M. Bezrukov. Effect of binding on particle number fluctuations in a membrane channel. Journal of Chemical Physics, 2002,116: 6216-6220.

40. A. M. Berezhkovskii, M. A. Pustovoit, and S. M. Bezrukov. Channel-facilitated membrane transport: Transit probability and interaction with the channel. Journal of Chemical Physics, 2002,116: 9952-9956.

41. Т. K. Rostovtseva, A. Komarov, S. M. Bezrukov, and M. Colombini. VDAC channels differentiate between natural metabolites and synthetic molecules. Journal of Membrane Biology, 2002,187: 147-156.

42. S. M. Bezrukov and L. B. Kish. How much power does neural signal propagation need? Smart Materials and Structures, 2002,11: 800-803.

43. E. M. Nestorovich, C. Danelon, M. Winterhalter, and S. M. Bezrukov. Designed to penetrate: Time-resolved interaction of single antibiotic molecules with bacterial pores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 9789-9794.

44. A. M. Berezhkovskii, M. A. Pustovoit, and S. M. Bezrukov. Channel-facilitated membrane transport: Average lifetimes in the channel. Journal of Chemical Physics, 2003,119: 3943-3951.

45. К. S. Stojilkovic, A. M. Berezhkovskii, V. Yu. Zitserman, and S. M. Bezrukov. Conductivity and microviscosity of electrolyte solutions containing polyethylene glycols. Journal of Chemical Physics, 2003,119: 6973-6978.

46. E. M. Nestorovich, Т. K. Rostovtseva, and S. M. Bezrukov. Residue ionization and ion transport through OmpF channels. Biophysical Journal, 2003, 85: 3718-3729.

47. V. Krasilnikov and S. M. Bezrukov. Polymer partitioning from non-ideal solutions into protein voids. Macromolecules, 2004, 37: 2650-2657.

48. S. M. Bezrukov. Noise analysis in studies of protein dynamics and molecular transport. Fluctuation and Noise Letters, 2004, 4: L23-L31.

49. A. Alcaraz, E. M. Nestorovich, M. Aguilella-Arzo, V. M. Aguilella, and S. M. Bezrukov. Salting out the ionic selectivity of a wide channel: The asymmetry of OmpF. Biophysical Journal, 2004, 87: 943-957.

50. S. M. Bezrukov, О. V. Krasilnikov, L. N. Yuldasheva, A. M. Berezhkovskii, and C. G. Rodrigues. Field-dependent effect of crown ether (18-crown-6) on ionic conductance of alpha-hemolysin channels. Biophysical Journal, 2004, 87: 3162-3171.

51. A. M. Berezhkovskii and S. M. Bezrukov. Optimizing transport of metabolites through large channels: Molecular sieves with and without binding. Biophysical Journal, 2005, 88: L17-L19.

52. B. Ю. Зицерман, К. С. Стожилкович, А.М.Бережковский и С.М.Безруков. Электропроводность водных растворов полиэтиленгликоля. Журнал физической химии, 2005, 79: 1245-1252.

53. А. М. Berezhkovskii and S. М. Bezrukov. Channel-facilitated membrane transport: Constructive role of particle attraction to the channel pore. Chemical Physics, 2005, 319: 342-349.

54. V. Yu. Zitserman, A. M. Berezhkovskii, V. A. Parsegian, and S. M. Bezrukov. Non-ideality of polymer solutions in the pore and concentration-dependent partitioning. Journal of Chemical Physics, 2005,123: 146101-146102.

55. V. A. Karginov, E. M. Nestorovich, M. Moayeri, S. H. Leppla, and S. M. Bezrukov. Blocking anthrax lethal toxin at the protective antigen channel by using structure-inspired drug design. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005,102: 15075-15080.

56. L. Kullman, P. A. Gurnev, M. Winterhalter, and S. M. Bezrukov. Functional subconformations in protein folding: Evidence from single-channel experiments. Physical Review Letters, 2006, 96: 038101.

57. C. Danelon, E. M. Nestorovich, M. Winterhalter, M. Ceccarelli, and S. M. Bezrukov. Interaction of zwitterionic penicillins with the OmpF channel facilitates their translocation. Biophysical Journal, 2006,90: 1617-1627.

58. E. M. Nestorovich, E. Sugawara, H. Nikaido, and S. M. Bezrukov. Pseudomonas aeruginosa porin OprF: Properties of the channel. Journal of Biological Chemistry, 2006,281:16230-16237.

59. P. A. Gurnev, A. B. Oppenheim, M. Winterhalter, and S. M. Bezrukov. Docking of a single phage lambda to its membrane receptor maltoporin as a time-resolved event. Journal of Molecular Biology, 2006, 359: 1447-1455.

60. V. Krasilnikov, C. G. Rodrigues, and S. M. Bezrukov. Single polymer molecules in a protein nanopore in the limit of a strong polymer-pore attraction. Physical Review Letters, 2006, 97:018301.

61. A. M. Berezhkovskii, G. Hummer, and S. M. Bezrukov. Identity of distributions of direct uphill and downhill translocation times for particles traversing membrane channels. Physical Review Letters, 2006, 97: 020601.

62. T. K. Rostovtseva, N. Kazemi, M. Weinrich, and S. M. Bezrukov. Voltage gating of VDAC is regulated by non-lamellar lipids of mitochondrial membranes. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281: 37496-37506.

63. A. M. Berezhkovskii and S. M. Bezrukov. Site model for channel-facilitated membrane transport: Invariance of translocation-time distribution with respect to direction of passage. Journal of Physics: Condensed Matter, 2007,19: 065148.

64. S. Ostroumova, P. A. Gurnev, L. V. Schagina, and S. M. Bezrukov. Asymmetry of syringomycin E channel studied by polymer partitioning. FEBS Letters, 2007, 581: 804-808.1. ЛИТЕРАТУРА

65. Jiang, Y. X., et al., X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature, 2003. 423(6935): p. 33-41.

66. Ивков, В. Г. and Г. H. Берестовский, Динамическая структура липидного бислоя. 1981, М.: Наука. 293 с.

67. Overton, Е., Über die osmotischen Eigenschaften der lebenden Pflanzen- und Tierzelle. Vierteljahresschrift der Naturforschenden Gesellschaft in Zürich, 1895. 30: p. 159-201.

68. Gorter, E. and F.Grendel, On bimolecular layers of lipid on the chromacytes of the blood. Journal of Experimental Medicine, 1925. 41: p. 439-443.

69. Антонов, В. Ф., Липиды и ионная проницаемость мембран. 1982, М.: Наука. 150 с.

70. Mueller, Р., et al., Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature, 1962.194: p. 979-980.

71. Montal, M. and P. Mueller, Formation of biomolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1972. 69: p. 3561-3566.

72. Parsegian, V. A., Energy of an ion crossing a low dielectric membrane: Solutions to four relevant electrostatic problems. Nature, 1969. 221: p. 844-846.

73. Luzzati, V. and F. Husson, The structure of the liquid-crystalline phases of lipid-water systems. Journal of Cell Biology, 1962.12: p. 207-219.

74. Gennis, R. В., Biomembranes: Molecular Structure and Function. 1989, N. Y.: Springer-Verlag. 622 p.

75. Cullis, P. R., et al., Structural properties of lipids and their functional roles in biological membranes, in Membrane Fluidity in Biology, R.C. Aloia, Editor. 1983, N. Y.: Academic Press, p. 39-81.

76. Cullis, P. R. and B. de Kruijff, Lipid polymorphism and the functional roles of lipids in biological membranes. Biochimica et Biophysica Acta, 1979. 559: p. 399-420.

77. Rand, R. P. and N. L. Fuller, Structural Dimensions and Their Changes in a Reentrant Hexagonal-Lamellar Transition of Phospholipids. Biophysical Journal, 1994. 66(6): p. 2127-2138.

78. Fuller, N., C. R. Benatti, and R. P. Rand, Curvature and bending constants for phosphatidylserine-containing membranes. Biophysical Journal, 2003. 85(3): p. 1667-1674.

79. Shears, S. B., The versatility of inositol phosphates as cellular signals. Biochimica et Biophysica Acta Molecular and Cell Biology of Lipids, 1998.1436(1-2): p. 49-67.

80. Marsh, D. and L. I. Horvath, Structure, dynamics and composition of the lipid-protein interface. Perspectives from spin-labelling. Biochimica et Biophysica Acta -Reviews on Biomembranes, 1998.1376(3): p. 267-296.

81. Bogdanov, M. and W. Dowhan, Lipid-assisted proteinfolding. Journal of Biological Chemistry, 1999. 274(52): p. 36827-36830.

82. Balla, T., T. Bondeva, and P. Varnai, How accurately can we image inositol lipids in living cells? Trends in Pharmacological Sciences, 2000. 21(7): p. 238-241.

83. Gruner, S. M. and E. Shyamsunder, Is the Mechanism of General-Anesthesia Related to Lipid-Membrane Spontaneous Curvature. Annals of the New York Academy of Sciences, 1991. 625: p. 685-697.

84. Gruner, S. M., Relations between Curvature Elasticity, Nonlamellar Phases, and Biomembrane Function. Biophysical Journal, 1990. 57(2): p. A20-A20.

85. Gruner, S. M., Intrinsic Curvature Hypothesis for Biomembrane Lipid-Composition a Role for Nonbilayer Lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1985. 82(11): p. 3665-3669.

86. Cantor, R. S., Lipid composition and the lateral pressure profile in membranes. Biophysical Journal, 1999. 76(1): p. A58-A58.

87. Templer, R. H., et al., Sensing isothermal changes in the lateral pressure in model membranes using di-pyrenylphosphatidylcholine. Faraday Discussions, 1998. Ill: p. 41-53.

88. Cantor, R. S., The lateral pressure profile in membranes: A physical mechanism of general anesthesia. Biochemistry, 1997. 36(9): p. 2339-2344.

89. Cantor, R. S., Lateral pressures in cell membranes: A mechanism for modulation of protein function. Journal of Physical Chemistry B, 1997.101(10): p. 1723-1725.

90. Harries, D. and A. BenShaul, Conformational chain statistics in a model lipid bilayer: Comparison between mean field and Monte Carlo calculations. Journal of Chemical Physics, 1997. 106(4): p. 1609-1619.27,28