Влияние катионов на структурные и электрические свойства липидного бислоя. Молекулярно-динамическое исследование тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.05 ВАК РФ

На правах рукописи.

Нестеренко Алексей Михайлович

ВЛИЯНИЕ КАТИОНОВ НА СТРУКТУРНЫЕ И ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ. МОЛЕКУЛЯРНО-ДИНАМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.

Специальность: 02.00.05 — Электрохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

2 Ь КАР 2014

Москва - 2014

005546158

005546158

Диссертация выполнена в лаборатории биоэлектрохимии ФГБУН Института Физической Химии и Электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН и на кафедре биофизики Биологического факультета ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор физ.-мат. наук, в.н.с., Ермаков Юрий Александрович кандидат физ.-мат. наук, доцент, Красильников Павел Михайлович

Официальные оппоненты:

Цирлина Галина Александровна

доктор хим. наук, профессор. Кафедра электрохимии химического факультета МГУ им. А.Н. Ломоносова, г. Москва.

Гуртовенко Андрей Алексеевич

доктор физ.-мат. наук, в.н.с. Лаборатория теории и моделирования полимерных систем, Институт высокомолекулярных соединений РАН, г. Санкт-Петербург.

Ведущая организация:

ФГБУН Институт Биоорганической Химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Защита состоится _8_ апреля 2014 г. в 14 час. 00 мин на заседании диссертационного совета Д 002.259.03 в корпусе электрохимии ИФХЭ РАН по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 31, корп. 5. email: natalianek@yandex.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФХЭ РАН.

Автореферат разослан сЫ&^УХл_. 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат хим. наук

Некрасова Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Электрическое поле на границах клеточных мембран является важным регулирующим фактором в процессах, сопровождающих транспорт гидрофобных катионов через мембрану, адсорбцию заряженных молекул на ее поверхности и разряд переносчиков электрона на специализированных мембранных акцепторах. Распределение электрического потенциала на границах мембран определяется их липидной фракцией и включает в себя падение потенциала в диффузной части двойного электрического слоя (поверхностный потенциал) и в плотной части ДЭС (диполь-ный потенциал). Изучение факторов, влияющих на эти компоненты граничного потенциала, обычно осуществляется с применением различных электрохимических методов на модельных липидных системах, таких как липосомы, липидные монослои и плоские бислойные липидные мембраны. Граница ли-пидного бислоя представляет собой частный случай границы раздела гидрофобной среды и воды, которую можно рассматривать как поверхность идеально поляризуемого электрода и использовать для ее описания известные электрохимические модели. Как следует из большого количества электрокинетических данных, распределение поля в диффузной части ДЭС достаточно хорошо описывается в рамках классической модели Гуи-Чепмена-Штерна. В то же время, изменения поля в плотной части ДЭС непосредственно связаны со структурными особенностями липидного бислоя и требуют для изучения совершенно иных экспериментальных и теоретических подходов.

К настоящему времени обнаружен целый ряд экспериментальных фактов, для интерпретации которых необходим детальный анализ молекулярных структур межфазной границы бислой-вода. В частности, плотность центров связывания катионов в мембране в терминах изотермы Ленгмюра оказывается меньшей, чем поверхностная плотность анионных фосфолипидов, обычно предполагаемых в этом качестве. Комбинирование электрокинетических данных с регистрацией суммарного граничного потенциала методом компенсации внутримембранного поля плоских БЛМ позволяет заметить значительное, более сотни милливольт, увеличение дипольного потенциала, вызванное адсорбцией многовалентных катионов. Адсорбция некоторых поликатионов в аналогичных экспериментах приводит к изменению дипольного потенциала отрицательного знака. Более того, в измерениях с липидными мо-

нослоями обнаружена корреляция механохимических характеристик монослоя и дипольной компоненты граничного потенциала, молекулярная природа которой, а также ее связь с фазовым состоянием липидов остается неясной. Для интерпретации подобных результатов, как правило, предполагается влияние ионного окружения на состояние гидратации полярной области фосфоли-пидов, доказать которое весьма сложно прямыми измерениями. Это означает, что для адекватного описания электрических и механохимических явлений в липидном бислое целесообразно обратиться к молекулярному моделированию и построению структурных моделей межфазной границы бислой-вода. В литературе имеется немало молекулярных моделей липидного бислоя, однако выполненные на их основе вычислительные эксперименты не дают возможности сопоставить эти модели с существующими представлениями о структуре ДЭС. При выполнении данного исследования целенаправленно варьировались условия такого рода экспериментов, чтобы провести подробное сравнение результатов с известными данными электрохимических измерений и теоретическими моделями.

Особенность молекулярных моделей границ раздела фаз состоит в неопределенности положения этой границы по отношению к расположению отдельных молекул каждой из фаз, а следовательно и в выводах о природе электрического потенциала за пределами диффузной части электрического двойного слоя. Поэтому при анализе МД симуляций первостепенное значение приобретает задача адекватной оценки положения границы раздела и расчета структурных факторов, влияющих на распределение потенциала в этой области. Этот выбор существенным образом влияет на сравнение результатов вычислительного и реального экспериментов, и следовательно, на вывод о достоверности полученных в МД молекулярных структур и движений на границе раздела липидный бислой-вода. С учетом возможностей молеку-лярно-динамического моделирования и доступного в литературе фактического материала нами были получены сведения о различных факторах, влияющих на заряд поверхности, на структурную организацию плотной части электрического двойного слоя, на степень гидратации и, в конечном итоге, на латеральное взаимодействие молекул заряженной поверхности.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является выяснение молекулярных механизмов заряжения межфазных границ липид-ных мембран с электролитами разного ионного состава по результатам вы-

числительных экспериментов, проведенных методами молекулярно-динами-ческого моделирования. При этом требуется внести поправки к силовому полю липидов и ионов, которые необходимы для воспроизведения известных характеристик липидного бислоя и диффузной части ДЭС. Поставленная в работе цель с учетом специфики используемых методов и подходов предполагает выполнение следующих задач исследования:

1) Сформировать молекулярно-динамические модели мембранных систем на основе силового поля (ОРЬБ-АА) с использованием липидов, различающихся типом углеводородных цепей и полярных групп, а также ионов различной валентности, определяя недостающие параметры силового поля.

2) Провести серию вычислительных экспериментов и сопоставить полученные результаты с данными реальных измерений и существующими представлениями о строении ДЭС. На основе данных МД рассчитать электрическое поле внутри полярной области бислоя и в пределах диффузной части ДЭС при варьировании условий эксперимента.

3) Определить положение внешней плоскости Гельмгольца на границе раздела мембрана-электролит, применимое ко всем исследованным системам. Оценить способность различных ионов проникать в полярную область бислоя и установить молекулярную природу адсорбционных мест, а также вызванные ионами изменения состояния гидратации полярных групп фосфолипидов.

4) Выделить вклад в дипольную компоненту граничного потенциала различных структурных факторов для бислоя в жидко-кристаллическом и гелевом состояниях в присутствии адсорбированных катионов.

5) Установить молекулярную природу взаимосвязи электрических и механических характеристик липидного бислоя и монослоя. Предложить наиболее вероятные молекулярные структуры комплексов катион-липид.

Новизна исследования и его научно-практическое значение. Впервые проведено подробное сопоставление результатов МД расчетов ли-пидных бислоев с известными данными реальных измерений различными электрохимическими методами. Найдены молекулярные структуры, ответственные за адсорбцию различных катионов. Выделены структурные факторы, влияющие как на дипольную, так и на диффузную компоненты граничного потенциала. Показана связь дипольной компоненты граничного потенциала со структурой самого липидного бислоя и составом ионного окружения.

Установлена роль молекул воды в изменении дипольного потенциала при адсорбции катионов и фазовом переходе в липидном бислое. Установлена линейная корреляция между глубиной проникновения неорганических катионов в полярную область бислоя с их ионным радиусом. Доказана способность вы-сокоафинных многовалентных катионов образовывать микрокластеры липи-дов, влияющие на их латеральную организацию в бислое и его механохими-ческие характеристики. В вычислительном эксперименте впервые реализован фазовый переход липидного бислоя при варьировании как температуры, так и латерального давления и ионного окружения. Впервые дана оценка параметров связывания катионов с липидным бислоем в гелевом состоянии.

Разработанные в работе способы анализа молекулярных структур межфазной границы и полученные результаты существенным образом дополняют известные модельные представления о строении такой границы и могут быть использованы специалистами, занимающихся изучением подобных электрохимических систем. Установленные в работе особенности распределения электрического поля на границе липидный бислой-вода должны учитываться при решении биомедицинских задач, связанных с адсорбцией на клеточной поверхности и трансмембранным переносом заряженных молекул, а также с переносом заряда в мембранных электрон-транспортных системах.

Структура диссертации. Работа изложена на сто двадцати страницах, имеет стандартную структуру и состоит из «Введения» и нескольких глав, включающих «Обзор литературы», «Методы постановки и анализа вычислительного эксперимента», а также главы «Результаты вычислительных экспериментов с липидным бислоем и их анализ», несущей основное содержание работы. Диссертация завершается стандартными разделами «Заключение», «Основные результаты, выносимые на защиту», «Список литературы». Решение частных задач вынесено в «Приложение». Диссертация цитирует около ста источников, из которых около половины — работы, опубликованные за последние 10 лет.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методика проведения и анализа вычислительных экспериментов. Вычислительные эксперименты производились методом молекулярной динамики, хорошо зарекомендовавшим себя в различных физико-химических

исследованиях, в том числе, в исследованиях двойного электрического слоя. Расчет молекулярной динамики производился в полноатомном силовом поле OPLS-AA с явной заданной водой модели TIP4P или TIP3P. Начальные структуры липидных бислоев формировались из одиночных молекул липидов при помощи разработанной программы тетдеп1. Исследуемые в работе бислои обычно содержали 90 липидов в каждом монослое. В большинстве расчетов использовался шаг интегрирования 2 фс и «констрейны» (голономные ограничения) на длину всех связей, в которые вовлечены атомы водорода. Время уравновешивания и длительность финальных траекторий составляло не менее 100 не. Корректное моделирование протяженной диффузной части ДЭС требовало увеличенного слоя воды: не менее 5 нм с каждой стороны бислоя. Молекулярно-динамическая модель (топология) молекул липидов строилась по методике, подробно описанной нами в работе (Нестеренко и др., 2011). Построение топологий производилось в полуавтоматическом режиме по разработанному нами алгоритму (tppmktop) выбора наиболее подходящих потенциалов валентных и невалентных взаимодействий из силового поля. Параметры силового поля для атомов углеводородных цепей фосфолипидов были изменены таким образом, чтобы потенциалы двугранных углов в наших моделях соответствовали аналогичным потенциалам в силовом поле Бергера (Berger et al., 1990). Параметры невалентных взаимодействий для катиона Ве2+ были получены при воспроизведении литературных данных по сольватации бериллия в вычислительном эксперименте.

После достижения равновесия в системе при МД расчете, проводился анализ равновесных участков траекторий с использованием ряда скриптов, разработанных нами на основе библиотек MDAnalysis и OpenBabel. При построении распределения параметров вдоль нормали к поверхности бислоя в качестве точки отсчета принималось среднее положение центральных атомов глицериновых групп. Усреднение параметров проводилось по времени на равновесных участках и по отдельным монослоям. Распределение электрического потенциала вычислялось интегрированием усредненной зарядовой плотности по уравнению Пуассона. Анализ распределения потенциала и концентраций в диффузном слое проводился в рамках модели ГЧШ.

1 Подробное описание разработанных нами программ и сами программы приведены на сайте http://erg.biophys.msu.ru.

1. Основные характеристики молекулярно-динамической картины липидного бислоя

В работе использованы доработанные нами топологии липидов и протоколы вычислительного эксперимента. Для доказательства их адекватности проводилось сопоставление распределения электронной плотности вдоль нормали к бислою с данными по рассеянию рентгеновских фотонов и нейтронов. Геометрические характеристики бислоя (площадь на липид и толщина бислоя) были определены для моделей бислоев из БРРС, БРРБ и БОРБ и находятся в хорошем согласии с известными экспериментальными данными.

Относительное расположение молекулярных групп фосфолипидов в объеме бислоя было охарактеризовано через функции распределения их плотности относительно нормали к поверхности. В сформированных нами бисло-ях с различным соотношением липидов БРРЗ/БРРС локализация фосфатных и карбонильных групп жирных кислот остается постоянной по отношению к среднему положению центрального углерода глицериновой группы. Поэтому это положение в дальнейшем было использовано в качестве «условного нуля» при расчете всех распределений вдоль нормали к поверхности бислоя2.

Существование внутри мембраны большого положительного потенциала по отношению к объему водной фазы связано с поведением молекул воды, проникающих в полярную область мембраны (гидратной воды). Ориентация и подвижность этих молекул оценивалось в работе при помощи двух характеристик: параметра порядка и коэффициента латеральной самодиффузии. Анализ этих характеристик на разном удалении от поверхности бислоя проведен для мембран варьируемого состава и поверхностного потенциала (заряда). Величина этих параметров зависела от типа фосфолипидов в составе мембраны и принимала свое объемное значение на большом удалении от поверхности (от 0.5 до 1 нм). Область, где диффузия молекул воды заметно меньше объемной, оказывается на несколько ангстрем дальше от поверхности заряженной мембраны, по сравнению с нейтральной. Распределение параметра порядка также отличается для таких мембран, но его изменение происходит преимущественно в области полярных групп.

2 Измерение расстояний по отношению к центральному глицериновому атому использовалось ранее в работах группы Е. Lindahl (Aman et al., 2003).

2. Структура ДЭС на границе липидный бислой-вода

Электрическая граница липидного бислоя. Для определения поверхностного потенциала системы и последующего его сравнения с экспериментальными данными и предсказаниями теоретической модели двойного электрического слоя (ДЭС), в первую очередь необходимо было определить положение заряженной границы его диффузной части. Согласно обычным представлениям в диффузном слое ионы участвуют в броуновском движении и на их распределение влияет только электростатический потенциал, зависящий от расстояния до заряженной поверхности. Достаточно очевидно, что концентрация противоионов с наименьшей адсорбционной способностью (К < 1 М"1) должна быть максимальной на границе диффузного слоя. В работе рассмотрены три такие системы: ОРРС:ВеС12, ОМРБгВеСЬ и ОРР5:ТМАС1. В первых двух системах поверхность заряжена положительно адсорбированными катионами, в третьей - отрицательный заряд задан ионизованными группами ОРРБ. Для каждой системы найдено распределение противоионов (СГ в первых двух случаях и ТМА+ — в последнем) вдоль нормали к поверхности бислоя (рис. 1). Согласно нашим данным расстояние, на котором перестает расти концентрация противоионов во всех трех случаях, оказалось примерно одинаковым и равным 10 А от среднего положения глицериновых групп. Плоскость, параллельную поверхности бислоя и расположенную на этом расстоянии, можно принять в качестве условной электрической границы, если потенциал в этой плоскости соответствует описанию диффузной части ДЭС в рамках теории Гуи-Чепмена. Распределение противоионов в этом слое, найденные из данных МД, хорошо согласуются с предсказаниями теории Гуи-Чепмена, распределение коионов при этом несколько лучше согласуются с предсказаниями теории Гонсалеса-Санса, которая учитывает неидеальность раствора. Отметим, что значения потенциала, полученные при непосредственном интегрировании распределения зарядовой плотности в направлении нормали к бислою, имеют погрешность в выбранной нами плоскости, которая сопоставима с ожидаемыми значениями потенциала (порядка десятков милливольт). Более точная оценка потенциала получается при вычислении потенциала средней силы по формуле ^РМР = ЯТ/Р 1п С(х)/С(оо) , в которой используется отношение концентраций противоионов на границе и в объеме. В табл. 1 приведены значения потенциала средней силы, полученные

-5 0 5 10 15 20 25

Рис. 1: Распределение противоионов вблизи поверхности заряженных мембран заряд которых определяется адсорбированными катионами (а,б) или наличием в составе анионных липидов БРРБ (в). Жирными линиями на на рисунках показано распределение противоионов СГ (а,б) или ТМА+ (в). Тонкими линиями показано распределение плотности липидной (фиол.) и водной (голуб.) компонент.

no данным МД, а также значения поверхностного потенциала, рассчитанные по модели ГЧШ. Получено хорошее соответствие поверхностного заряда и потенциала в аналитической модели и вычислительном эксперименте для смешанных бислоев с различным соотношением DPPS/DPPC. Наблюдаемое соответствие убеждает нас в корректном выборе положения условной электрической границы диффузной части ДЭС.

Параметры связывания одновалентных катионов. Количественное описание адсорбции катионов на поверхности мембран разного состава было развито и экспериментально обосновано ранее в работах С.Маклафлина (S.McLaughlin, 1989). Предложенная им теоретическая модель включает в себя основные соотношения теории Гуи-Чепмена, дополненные изотермой связывания катионов, и названа в этих работах моделью Гуи-Чемпена-Штер-на (ГЧШ). Эта модель с хорошей точностью описывает многочисленные электрокинетические данные, полученные разными авторами для суспензий ли-посом различного состава. Тем не менее, способ определения параметров мо-

Система DPPS/DPPC:KCL Расчет по данным МД симуляций Расчет по модели ГЧШ при К = 1 М', а» = 20 цКл/см2

Доля DPPS [КС1], мМ Ч'рмр, мВ а, рКл/см2 lFs, мВ а, рКл/см2

20% 67 -54 -2.9 -50 -2.8

101 -43 -2.8 -41 -2.8

176 -31 -2.5 -31 -2.6

40% 58 -78 -4.7 -74 -4.4

88 -67 -4.6 -63 -4.4

151 -53 -4.4 -50 -4.2

60% 77 -80 -5.6 -77 -5.5

109 -72 -5.6 -69 -5.4

176 -58 -5.4 -56 -5.3

Таблица 1: Расчетные значения поверхностного потенциала, Ч^, и заряда, а, по данным распределения молекулярных групп в вычислительном эксперименте и по модели ГЧШ на мембранах разного состава и ионной силы.

дели и молекулярные структуры, ответственные за связывание катионов раз-

ной валентности, по-прежнему остаются предметом дискуссии (Ермаков, 2000).

При традиционном описании бинарного связывания катионов центрами адсорбции полагаются молекулы анионных липидов (в нашем случае, ВРРБ), а изотерма Ленгмюра может быть представлена в виде отношения поверхностной плотности заряда этих молекул, свободных от катиона, а, и максимальной плотности заряда, оь , которая отражает суммарную поверхностную концентрацию потенциально доступных центров связывания.

О _ 1

ст0 1+КС0 (1)

Здесь К — константа адсорбции, Со — концентрация катиона вблизи заряженной границы бислоя. Естественно, максимальная плотность заряда на этой границе, Оо, линейно связана с содержанием анионного липида в смеси, т.е.

в0= а<3,

где С? — плотность центров связывания на мембранах, состоящих только из БРРБ. Для определения параметров адсорбции изотерму связывания (1) удобно представить в виде:

Г —2-0—1.

0 а0 К К

Значения поверхностной плотности заряда и концентрации вблизи поверхности в этом уравнении могут быть получены из траекторий МД на плоскости, выбранной нами в качестве условной электрической границы бислоя. На рис. 2 представлены результаты вычислительного эксперимента, проведенного для систем с разным соотношением БРР5Я)РРС в составе бислоя. Параметры связывания, К и О, находятся по наклону и пересечению с ординатой прямой, построенной в координатах {С0, а/а0}. Полученные значения для различных одновалентных катионов приведены в таблице 2. Заметим, что необходимым условием для применимости такого подхода является отсутствие связывания исследуемого катиона с нейтральным липидом. Однако, как было показано нами, для некоторых катионов (многовалентные катионы и Ы+) это условие не выполняется.

Локализация катионов внутри бислоя. Полученные нами данные демонстрируют репрезентативность используемых модельных систем и до-

1.4

S 1-2 S

н u

0

1 1.0 CL

01 CD О

£ 0.8

x о;

s 0.6 та

P-

§ 0.4

x о

0.2

Рис. 2: Пример определения параметров связывания катионов К+ и на молекулах ЭРРБ в мембранах варьируемого состава (см. описание в тексте). Маркеры одинаковой формы относятся к мембранам одного состава при различных ионных силах.

Вычислительный эксперимент Литературные данные

катион К Q условия К Q условия

Na+ 2.6 -17 70 мМ, ж-к 0.8 -16 50 мМ, ж-к(А)

Na+ 0.4 -9 50 мМ, гель Нет данных

K+ 1 -21 70 мМ, ж-к 0.2 -16 50 мМ, ж-к(А)

K+ 2 -25 50 мМ, гель Нет данных

TMA+ 1.1 -24 ~100 мМ, ж-к 0.1 -21 100 мМ, ж-к(А)

Cs+ 0.2 -3 500 мМ, гель 0.05 -23 100 мМ, ж-к(Б)

Li+ адсорбция также на ОРРС 0.8 -23 100 мМ, ж-к(Б)

Таблица 2: Параметры адсорбции различных катионов, полученные из расчета и их литературные значения: (А) — [Егтакоу е1 а1., 1990]; <Б) — [ЕвепЬе^ е1:. а1, 1979], причем в последнем случае плотность центров связывания вычислялось как средняя плотность упаковки анионных липидов. Константы (К) приведены в М"1, плотности центров (О) — в рКл/см2. Экспериментальные данные получены только для жидко-кристаллических бислоев.

К=2.6 м 1 Q=-16,8 дКл/см2

.<=1.0 м

Q=-21.2 ,/Кл/см-'

К+. 20% PS

Na+, 20% PS

К+, 40% PS

Na + , 40% PS

K+, 60% PS

Na + , 60% PS

K+,аппроксимация

Na+,аппроксимация

-a ,

-0.20

-0.15 a/a. (//Кл/см- )

статочно хорошее согласие параметров модели ГЧШ с имеющимися в литературе данными. Это означает, что соответствующие траектории МД могут быть использованы для характеристики связывания катионов с бислоем на атомарном уровне. Как в модельных бислоях смешанного состава, так и в фосфолипидах мембран живых клеток имеются два типа отрицательно заряженных групп: фосфатная группа липидного остова и карбоксильная группа фосфатидилсерина. Именно эти группы естественно рассматривать как потенциальные центры связывания катионов. Для подтверждения и демонстрации этого факта были вычислены функции радиального распределения (ФРР) катионов относительно этих групп. На рис. 3 приведены ФРР для трех катионов с различной афинностью к ПРР^/ОРРС бислою — ТМА+, и Ве2+ — относительно углерода карбоксильной группы и фосфора фосфатной группы.

Рис. 3. Функции радиального распределения между углеродом карбоксильной группы (пунктир) и фосфором фосфатной (сплошная) для различных катионов на бислоях из БРРЗЛЭРРС.

Расчет ФРР обнаруживает два пика в распределении катионов относительно углерода карбоксильной группы, которые более выражены для катионов с высокой афинностью. Полученные результаты указывают на существование двух преимущественных положений катиона вблизи карбоксильной группы, схематично изображенных на рис. 4а,б. Напротив, ФРР катионов относительно атома фосфора имеет всегда один пик, что соответствует единственному положению (рис. 4в).

Все катионы, обладающие сродством к фосфолипидам, способны проникать в бислой и погружаться «под» условную электрическую границу.

си

* 08

0 5 10 15

Расстояние от С«, А

Ионный радиус, пм

Рис. 5. Распределение концентрации катионов в полярной области мембраны (слева) и зависимость положения плоскости адсорбции от ионного радиуса (справа), полученные для бислоев, содержащих 20% БРРБ.

Рис. 4. Наиболее вероятное расположение катиона относительно анионных групп фосфолипидов.

Распределение концентрации ряда одновалентных катионов вдоль нормали к бислою (рис. 5, левый) характеризуется различным положением максимума в пределах полярной области бислоя. Глубина проникновения, также как сродство катионов к фосфолипидам, определяется величиной их ионного радиуса (рис. 5, правый). Для неорганических катионов эта зависимость оказывается практически линейной, тогда как крупные органические катионы, например ТМА+, отклоняются от этой тенденции.

3. Гидратация межфазной границы и природа дипольного потенциала

Одна из основных задач нашего исследования предполагает оценку величины диффузной компоненты граничного потенциала, обусловленной распределением ионов вблизи поверхности бислоя, и потенциала, падающего в плотной части ДЭС, который непосредственно связан со структурой самого бислоя. Это падение потенциала прежде всего зависит от ориентации диполь-ных моментов молекул воды и липидов в полярной области. Поэтому такую компоненту граничного потенциала принято называть «дипольной». Однако в распределении электрического поля в этой области принимают участие и другие механизмы, такие как непосредственное проникновение ионов, изменение состояния гидратации липидов, их латеральная компактизация при образовании кластеров или при изменении фазового состояния бислоя. Анализ МД траекторий дает возможность рассмотреть каждый из перечисленных механизмов в отдельности.

Вклад отдельных структурных компонент системы мембрана-электролит в суммарный граничный потенциал приведен на рис. 6. При достаточно низкой ионной силе электролита большой по абсолютной величине поло-

0 тМ раствор

50 тМ раствор

100 тМ раствор

Суммарный потенциал Вклад липида Вклад воды Вклад иоков

-20 -10 0 10 20 30 40 -20 -10 0 10 20 30 40 -20 -10 0 10 20 30 40 Расстояние от С„, А Расстояние от С... А Расстояние от С... А

Рис. 6. Вклад в электростатический потенциал различных компонент в системе БРРС:КС1 при разных концентрациях электролита.

(2)

жительный потенциал воды почти полностью компенсируется отрицательным потенциалом липидной компоненты. В растворах с высокой ионной силой соотношение и распределение этих вкладов несколько меняется. Однако это не отражается на суммарной величине граничного потенциала, который остается практически неизменным. Иными словами, система липид-вода-ионы самосогласованна таким образом, что небольшие изменения одной из компонент вызывают компенсацию за счет изменения вкладов других компонент.

Изменения дипольного потенциала бислоя. Если рассматривать каждый липид как носитель некоторого «элементарного диполя» (Ц), направленного внутрь поверхности, то дипольный потенциал мембраны согласно известному соотношению Гельмгольца зависит от плотности упаковки диполей и обратно пропорционален площади на липид (5):

12 лц Б

Литературные данные демонстрируют именно такую зависимость Вольта-потенциала монослоев нейтральных фосфолипидов в жидко-кристаллическом состоянии. В этом случае изменение Вольта-потенциала численно равно изменению дипольного потенциала липидных бислойных структур (Вгосктап, 1994). Однако экспериментальные данные, полученные в широком диапазоне плотности монослоя, включая область фазового перехода в ге-левое состояние, обнаруживают нарушение этой закономерности (Егшакоу е! а1, 2010; БЬароуаЬу, 1998). Более того, связывание высокоафинных катионов существенным образом увеличивает дипольную компоненту граничного потенциала (Егтакоу е1 а1, 2001), вероятно, изменяя природу элементарного диполя. Молекулярное моделирование позволило нам подробно рассмотреть эти процессы.

Одна из возможностей использования вычислительного эксперимента состоит в расчете значений дипольного потенциала бислоя в присутствии различных катионов. Результаты такого расчета для некоторых катионов приведены в таблице 3. Согласно этим данным, величина дипольного потенциала зависит от типа противоиона и оказывается больше для катионов с большей эффективностью связывания. Следует обратить внимание, что значения моментов элементарного диполя были вычислены по формуле (2) и оказываются примерно вдвое выше, чем в реальных экспериментах с липидными моно-

слоями. Понятно, что расчет абсолютных значений потенциала между двумя плоскостями по формуле Пуассона справедлив с точностью до некоторой по-

катион мВ Ч'ь, мВ мВ Б, А2 м. Дб

К+ -77 650 727 62 1.195

Иа+ -70 750 820 59 1.283

Ве2+ +40 950 910 56 1.351

Таблица 3. Оценка потенциалов и "элементарного диполя" по формуле (2) для бислоя ОРРЭЮРРС (3:1) и ионной силе 50 мМ при разном ионном составе среды.

стоянной величины, которая зависит от положения плоскости внутри мембраны, а также от выбранного набора парциальных зарядов, модели воды и других особенностей построения молекулярно динамических моделей. С учетом этих обстоятельств в следующем разделе мы приводим альтернативный подход и рассматриваем ряд симуляций бислоя БМРБ с заданной, но различной площадью на молекулу липида при анализе влияния многовалентных катионов на механохимические характеристики монослоя.

Гидратация бислоя и диполъный потенциал. Молекулярная природа «элементарного диполя» обусловлена наличием молекул воды и их гиперполяризацией в полярной области бислоя. Естественно, адсорбция многова-

Катион \ доля БРРБ .20% 40% 60%

К+ 5.36 6.38 7.28

ТМА+ 5.34 6.36 7.33

СБ+ 5.03 6.02 7.00

N3* 5.15 5.82 6.54

м§2+ 4.34 4.83 5.09

ьг - 4.09 -

Ве2+ 3.80 3.82 3.78

Таблица 4. Количество Н-связей липид-вода в бислоях ВРРБЯЗРРС в присутствии различных катионов.

лентных катионов меняет значение дипольного потенциала и влияет на состояние и ориентацию гидратной воды. Парциальный вклад молекул воды, адсорбированных ионов и, собственно, молекул липида в распределение электрического потенциала был рассчитан нами для анионных бислоев в присутствии Na+, К+ и Ве2+ (рис. 7). Как уже отмечалось выше (рис. 6), вклад молекул воды и липидов имеет разные знаки и в значительной степени компенсирует друг друга. При связывании многовалентных катионов положительный дипольный потенциал формируется липид-катионной подсистемой. В этом случае ориентированные молекулы воды создают потенциал отрицательного знака и частично компенсируют этот дипольный потенциал. Напротив, адсорбция ионов Na+ и К+ создает большой положительный дипольный потенциал именно благодаря присутствию «положительно» ориентированной воды, а липидно-ионная подсистема его частично компенсирует. Таким образом, связывание многовалентных катионов меняет природу дипольного скачка благодаря глубокому расположению их плоскости адсорбции. Она находится даже глубже плоскости среднего расположения анионных групп фосфолипи-дов. В этом случае эффективный «элементарный диполь» может быть условно отождествлен с парой «катион»-«анионная группа фосфолипида», тогда как в случае низкоафинных катионов в качестве такого диполя выступает частично ориентированная молекула гидратной воды.

Хорошо известно, что ориентация молекул воды (гиперполяризация) в полярной области вызывается образованием Н-связей с электроотрицательными атомами липидов, а именно с С=0 группами жирных кислот и РО4" группами остова (Diaz et al., 1999; 2001). Следовательно, изменение дипольного потенциала в присутствии многовалентных катионов может отражать вытеснение воды, участвовавшей в образовании этих Н-связей. Этот вывод подтверждается данными таблицы 4. Количество Н-связей, которые образует с молекулами воды каждая полярная группа липида, оказывается зависящим от типа катиона, присутствующего в системе. В случае Ве2+ количество этих связей становится значительно меньшим по сравнению с одновалентными катионами. Увеличение числа Н-связей с ростом доли DPPS в смеси соответствует увеличению числа карбоксильных групп в составе липидов, при этом содержание фосфатных групп остается неизменным. Сравнение данных таблиц 2 и 4 показывает, что способность катионов вытеснять воду, образующую Н-связи с полярными группами, коррелирует со сродством этих катио-

Рис. 7. Вклад воды (слева) и липидов с ионами (справа) в распределение электрического поля в бислоях БРРЗ/БРРС в присутствии различных катионов.

нов к фосфолипидам. Таким образом, можно предполагать, что наблюдаемые дипольные эффекты связаны с вытеснением катионами молекул воды, ориентированных Н-связями с полярными группами. Мы провели подробный анализ дипольных эффектов в присутствии лизина и бериллия в вычислительном эксперименте и смогли подтвердить данное предположение.

Связывание лизина с отрицательно заряженной БЛМ. Сравнительно недавно были проведены электрокинетические измерения подвижности липосом из фосфатидилсерина при адсорбции лизина. Поверхностный потенциал в этих измерениях становится существенно более положительным при концентрации лизина более 0.1 мМ. Эксперименты с плоскими БЛМ, проведенные в тех же условиях методом КВП, регистрируют изменения граничного потенциала при концентрациях лизина на два порядка более высоких, >10 мМ (МашкоУ1сИ е1 а1., 2013). Эти факты косвенно указывают на изменение дипольного потенциала отрицательного знака, вызванные адсорбцией лизина. Более того, кинетика изменения граничного потенциала, зарегистрированная при адсорбции полилизина обнаруживает отрицательные изменения этого потенциала до 40 мВ. Есть основания полагать, что адсорбция полимерного и мономерного лизина приводит к изменениям в структуре липидного бислоя. Для изучения этого вопроса мы провели ряд МД симуляций.

Описанные выше опыты с лизином были воспроизведены нами в вычислительном эксперименте при варьировании соотношения К'/Ьуэ' в двой-

ном электрическом слое на поверхности бислоя Г_ЮР5. По результатом этого эксперимента были рассчитаны изменения поверхностного и граничного потенциалов при адсорбции лизина (рис. 8, вверху). Можно видеть, что изменение поверхностного потенциала превышает изменение граничного потенциала как в реальном, так и в вычислительном экспериментах примерно в одинаковом диапазоне концентраций. Как и предполагалось, адсорбция лизина влияет на дипольную компоненту: ее уменьшение сопровождается вытеснением ориентированной воды из полярной области бислоя.

Детальный анализ молекулярной структуры полярной части мембраны позволил нам указать конкретные молекулы воды, которые вытесняются в ходе адсорбции лизина и тем самым могут приводить к уменьшению дипольного потенциала. Предполагается, что молекулы воды, ответственные за этот эффект, должны вести себя в том диапазоне концентраций, где наблюдается компенсация, иначе, чем при других концентрациях. На рис. 8 (внизу) выделен вклад в дипольный потенциал молекул воды, образующих Н-связи с фосфатными и карбоксильными группами фосфолипидов, который для этих групп существенно различен. Вклад молекул воды, образующих Н-связи с фосфатами, меняется только в указанном диапазоне, в то время как для молекул воды, связанных с карбоксильными группами, он линейно меняется при всех концентрациях лизина. Это означает, что за дипольный эффект в присутствии лизина отвечают именно фосфатные группы. Тем самым, полученные в вычислительном эксперименте результаты позволяют объяснить появление отрицательного знака в кинетике изменения граничного потенциала при адсорбции полилизинов на поверхности липидных мембран (МагикоУ1сЬ е1 а1., 2013).

Связывание катионов Ве2* с бислоем ЭРРС в гелевом состоянии.

Адсорбция бериллия на липидном бислое БРРС была изучена методами КВП на плоских БЛМ и в электрокинетических измерениях суспензии липосом (Ермаков и др., 1993). В случае бислоя в жидко-кристаллическом состоянии адсорбция бериллия приводит к изменению поверхностного потенциала положительного знака в суспензии липосом, также как и граничного потенциала плоских БЛМ. Однако, в твердой, гелевой, фазе добавление Ве2+ приводит к положительному изменению поверхностного потенциала, но к отрицательному изменению граничного. Эта различие эффектов может отражать разное влияние адсорбированного бериллия на дипольный потенциал бислоя в жид-

Рис. 8. Изменение поверхностного и граничного потенциалов, вызванное адсорбцией лизина на бислоях из БОРБ в опыте и вычислительном эксперименте (верхняя панель). Вклад в суммарный граничный потенциал молекул воды, образующих Н-связи с анионными группами липида (нижняя панель). Вертикальным штрихами указаны ошибки средних значений.

ком и гелевом фазовых состояниях. Результаты этих опытов были воспроизведены нами в вычислительном эксперименте для системы ОРРС:ВеС12 при температуре выше и ниже точки фазового перехода. Изменение дипольного потенциала в этих экспериментах зависело от фазового состояния бислоя и состава электролита качественно так, как и в реальных опытах. Как следует из полученной молекулярной структуры этих состояний, при «замерзании» бислоя количество гидратной воды на липид значительно уменьшается (на 23 молекулы). В то же время в присутствии бериллия количество гидратной воды не зависит от фазового состояния мембраны, так как катионы Ве2+ удер-

живают молекулы воды в полярной области (Нестеренко и др., 2011). Из данных, приведенных на рис. 7, следует, что адсорбция бериллия меняет вклад в дипольный потенциал различных структурных компонент бислоя. Это означает, что дипольный эффект в системе ОРРС:ВеС12 обусловлен как изменением состояния гидратации, так и перераспределением заряженных молекулярных групп в плотной части ДЭС.

4. Адсорбция многовалентных катионов и механические свойства

Связывание катионов с фосфолипидным бислоем изменяет его поверхностный заряд, что должно отражаться на величине его поверхностного натяжения по аналогии с электрокапиллярными явлениями на жидких электродах. Такие явления удобно изучать при помощи техники липидных монослоев Ленгмюра, которые в явном виде демонстрируют изменения механических свойств монослоя при адсорбции многовалентных катионов (Егшакоу е1 а1., 2010). Мы воспроизвели результаты некоторых таких опытов в вычислительном эксперименте, что позволило сформулировать структурную модель центра связывания многовалентных катионов и предложить механизм их влияния на механические свойства бислоя.

Изменения механических характеристик бислоя. В наших вычислительных экспериментах мы используем модель липидного бислоя, механические характеристики которого отличаются от таковых для монослоя. Однако после уравновешивания бислоя при постоянной площади, латеральное давление в каждом монослое можно вычислить по формуле:

где ом — поверхностное натяжение воды, РтРуу — соответствующие компоненты тензора давления в МД, И — высота бислоя. Диаграммы сжатия монослоя представляют собой зависимость латерального давления от площади на липид. Соответствующие кривые, полученные по данным вычислительного эксперимента в присутствии К+ и всР, приведены на рис. 9. Расчетные кривые качественно согласуются с литературными данными (Егтакоу е1 а!., 2010; 2001). Так же, как и в реальных измерениях фазовый переход из жидко-

бислоя

(3)

кристаллического (большие площади) в гелевое (меньшие площади) состояние происходит в области 50-55 А2. Этот факт иллюстрирует изменение относительного расположения центров масс жирных кислот на плоскости монослоя, приведенное на рис. 11. При малой площади на липид жирные кислоты «упакованы» в двумерную гексагональную решетку (рис. 11, 43 А2). При большой площади липиды расположены разупорядочено (рис.11, 75 А2), а в области фазового перехода заметно сосуществование областей «твердой» и «жидкой» упаковки (рис. 11, 52 А2).

В вычислительном эксперименте при связывании гадолиния латеральное давление спадает быстрее, чем в его отсутствие (рис. 9). Изменение формы лА-диаграммы сжатия монослоя при добавлении многовалентных катионов металлов соответствует наблюдаемому в реальном эксперименте (Ermakov et al., 2010). Этот факт может отражать координирующее действие гадолиния на полярные группы липидов. Сопоставляя данные, приведенные на рис. 11 и 9, можно видеть, что при определенном фиксированном поверхностном давлении добавление в систему многовалентного катиона индуцирует фазовый переход. Такое поведение характерно для монослоев из заряженных липидов в присутствии многовалентных катионов, однако в реальном эксперименте с катионами гадолиния зависимость давления от площади на липид для монослоя идет заметно круче. Это может быть связано с тем, что координирующий («скрепляющий липиды») эффект гадолиния оказывается недооцененным в молекулярно-динамическом расчете, где взаимодействие катиона с липидами определяется только параметрами потенциала Jle-нарда-Джонса и зарядом. Строго говоря, взаимодействие гадолиния с липид-ными головками должно быть обусловлено более сильными координационными взаимодействиями.

Опыты с липидными монослоями и наши вычислительные эксперименты позволяют анализировать зависимость межфазного скачка потенциала от площади монослоя. Для жидко-кристаллических монослоев между ди-польным потенциалом и плотностью упаковки заряженных групп существует линейная зависимость (2) и коэффициент пропорциональности определяется величиной элементарного диполя. Эта зависимость найденная нами в вычислительном эксперименте для системы DMPS:KC1 и измеренная в работе (Ermakov et al., 2010) приведены на рис. 10. При этом литературные значения Вольта-потенциала монослоя и граничный потенциал в МД симуляциях сме-

й 50 | 45 8 40 I 35 4 30

о о

з 25

1.20 К

,2 15 Ю,

1

> V

\

5 50 55 00 05 70 75 Площадь на липид, А

Рис. 9. Зависимость латерального давления на монослой БМРЗ от площади на липид в вычислительном эксперименте.

щены в шкале потенциалов примерно на 200 мВ. Однако в обоих случаях имеется линейный участок кривых с одинаковым наклоном. Этот наклон позволяет оценить величину «элементарного диполя», которая оказывается равной 0.48 Д в присутствии калия и 0.68 Д в присутствии гадолиния, что согласуется с литературными данными. В присутствии катионов Сс13+ элементарный диполь имеет больший момент, как

{

результат их влияния на структуру полярной области липидного бислоя.

Особенности связывания

многовалентных катионов. Описанная выше процедура анализа результатов вычислительного эксперимента позволяет оценивать параметры адсорбции одновалентных катионов в рамках простой модели бинарного связывания ГЧШ, но оказывается неприменимой к многовалентным катионам по двум причинам. Во-первых, нельзя считать эти катионы адсорбирующимися только на анионных липидах бислоя. Во-вторых, сродство многовалентных катионов к липидам намного выше, чем одновалентных, что накладывает технические ограничения на необходимое время уравновешивания и размер модельной системы. Тем не менее результаты вычислительного эксперимента могут быть сопоставлены с данными реальными реальных измерений и дают возможность детализировать структурные изменения в бислое, вызванные многовалентными катионами.

Связывание многовалентных катионов с нейтральным бислоем из фосфатидилхолина наблюдается как в реальном эксперименте, так и в вычислительном. Среднее количество катионов вблизи фосфатных групп было определено для липидных смесей с разным содержанием фосфатидилсерина (карбоксильных групп) и приведено на рис. 12. Как и следовало ожидать, все катионы накапливаются в бислое с повышением содержания анионных липи-дов. В отсутствие анионных липидов среднее количество одновалентных катионов вблизи фосфатных групп близко к нулю. В то же время бериллий накапливается вблизи фосфатных групп фосфолипидов в бислое, не содержа-

Рис. 11. Относительное расположения центров масс жирных кислот на плоскости монослоя в мембране из ОМРБ при различной площади на липид (указаны на рис. в

А2).

щем анионных липидов. Такое поведение многовалентных катионов хорошо известно и характеризует независимое связывание с фосфатными и карбоксильными группами липидов. Аналитически такое связывание описывается в рамках моделей, предполагающих два типа центров связывания с разными константами для каждого из них.

Из литературных данных известно, что эффективность связывания некоторых многовалентных валентных катионов (лантаниды и бериллий) настолько высока, что в обычных условиях равновесие в системе сильно смеще-

Рисунок 10. Зависимость дипольного потенциала от обратной площади на липид. Расчет производился при постоянной площади. Поверхностный потенциал в ходе сжатия изменялся несущественно.

' 0.4

£ 0.3

■ ■ Ве2н • •

т т 1<2+

0.2 0.4 0.6 0.8

Доля ОРРЬ в липцдной СМ(ТИ

Рис. 12. Среднее количество катионов в координационной сфере фосфата при варьировании доли БРРБ в составе бислоя.

но и поверхность мембран заполняется катионами при их чрезвычайно низких концентрациях в объеме раствора (Егтакоу, е1. а1., 2001). Применительно к вычислительному эксперименту это обстоятельство не дает возможности в доступном временном интервале достигать равновесия между катионами в диффузном слое и катионами в полярной области бислоя. При этом практически все катионы оказываются в связанном состоянии, из-за чего в модельной системе вдали от поверхности отсутствует электронейтральность. Например, в модельной системе ОРРС:ВеС12, включающей 50 молекул лииида и 8 катионов Ве2+, абсолютно все катионы оказывались связанными с бислоем, а все анионы С1 находились в диффузной части ДЭС. По этой причине обычное для модели ГЧШ описание диффузной части ДЭС здесь не применимо. Для описания распределения потенциала в нашей системе было получено аналитическое решение соответствующих уравнений Пуассона-Больцмана для условий вычислительного эксперимента. Это решение приведено нами в (Нестеренко, Ермаков, 2012) и в диссертации. Оно хорошо описывает распределение потенциала и концентрации ионов в диффузном слое для случая параллельных заряженных плоскостей3, между которыми раствор заполнен только противоионами.

Способность многовалентных катионов локализовываться вблизи как фосфатных, так и карбоксильных групп означает, что эти катионы могут координировать два или более липидов в латеральном направлении в пределах каждого монослоя. На такую возможность косвенно указывают экспериментальные данные о латеральной конденсации монослоев из фосфатидилсе-

3 Вычислительная сцена, включающая бислой и два слоя воды по обе стороны, в рамках используемых методов расчета МД имитирует бесконечное количество параллельных бесконечных липидных бислоев.

Система DPPS/DPPC:Be2+ DMPS:Gd3+

Доля D(P/M)PS 20% 40% 60% 100%

Р04- 0.74 0.95 1.32 1.18

СОО" 1.40 1.09 1.04 1.82

I 2.14 2.06 2.36 3.00

Таблица 5: Среднее количество отрицательно заряженных групп (Р04"и СОО и их сума, I) в координационной сфере адсорбированного многовалентного катиона. Данные для Gd3+ приведены для бислоя с площадью на липид 56 А2.

(через 60 не)

Рис. 13. Координационная сфера катиона Ве2+ при адсорбции этих катионов на бислое состава ОРРЗЮРРС (1:3). (А) — типичное устройство трилипидного кластера, координируемого катионом бериллия. (Б) — расположение трилипидных кластеров на плоскости монослоя; липиды и катион, входящие в кластер отмечены одним цветом; снимки монослоя вверху и внизу отличаются на 60 не, за это время кластеры сохранили целостность.

рина в присутствии высокоафинных катионов С<13+, Ве2+ (Егшакоу е1 а1., 2001). Это предположение было проверено нами при анализе молекулярной структуры. Для этого было рассчитано среднее количество отрицательных групп ли-пидов вблизи адсорбированного катиона и результаты такого расчета приведены в табл. 5. Из этих данных следует, что каждый из катионов связан более чем с двумя отрицательными группами при содержании фосфатидилсерина в смеси свыше 40%. В частности, катионы вс13+ в бислое из БМРБ координируют в среднем по три отрицательно заряженные липидные группы. Примеры структуры таких кластеров, образуемых катионами Ве2+, приведены на рис. 13. Визуальный анализ траекторий показывает, что все три отрицательных группы в координационной сфере катиона, как правило, принадлежат различным липидам. Образованные этим катионом «кластеры» оказываются достаточно стабильными и не распадаются на протяжении достаточно длинной МД-траектории, до сотни наносекунд (рис. 13, Б). Таким образом, можно говорить о «3-х молекулярных липидных кластерах», координируемых высо-коафинным катионом, которые диффундируют в плоскости монослоя как единый фрагмент. Координация соседних молекул липидов оказывается характерным свойством всех исследованных многовалентных катионов металлов (]У^2+, Са2+, Ве2+, СсР+). В вычислительных экспериментах эти катионы действуют на бислой качественно подобным образом, координируя липиды и различаясь при этом в эффективности такой координации.

Выводы

1. Сформированы молекулярно-динамические (МД) модели бислойных мембранных систем, адаптированных под универсальное полноатомное силовое поле (ОРЬБ-АА). На их основе получены равновесные конфигурации межфазной границы бислой-вода, использованные для сопоставления с известными данными реальных измерений.

2. Для определения положения плоскости Гельмгольца у межфазной границы предложено использовать распределение концентрации непроникающих противоионов. Показано, что для всех исследованных липидных систем эта плоскость находится на расстоянии 1 нм от внутренней границы полярной области бислоя. Определены феноменологические значения констант адсорбции ряда катионов (№+, К+, ТМА+, Сэ+) и плотности центров связыва-

ния, близкие к известным в литературе.

3. Установлено три вероятных типа локализации одновалентных катионов в полярной области бислоя из анионных липидов: два - вблизи карбоксильной и одно - вблизи фосфатной группы. В случае высокоафинных многовалентных катионов обнаружена координация трех анионных групп фосфоли-пидов.

4. Показано, что катионы щелочных металлов в полярной области бислоя имеют локальный максимум на различной глубине, которая линейно связана с ионным радиусом катионов.

5. Доказано влияние катионов на состояние гидратации полярных групп фосфолипидов. Найдены распределения параметра порядка, коэффициента самодиффузии и количество гидратной воды на липид в разном фазовом состоянии.

6. Установлен молекулярный механизм влияния катионов на дипольную компоненту граничного потенциала. Этот механизм включает в себя два противоположных эффекта: увеличение дипольного потенциала при погружении катионов в полярную область бислоя и его понижение в результате вытеснения катионом ориентированной воды из Н-связей с фосфатными группами.

7. Предложена молекулярная модель, объясняющая изменение электрических и механохимических характеристик монослоя при адсорбции многовалентных катионов и учитывающая образование микрокластеров.

Список использованной литературы

1. Aman, К. Structure and dynamics of interfacial water in an Lalpha phase lipid bilayer from molecular dynamics simulations / K. Aman, E. Lindahl, O. Edholm, P. Häkansson, P.-O. Westlund // Biophysical journal. — 2003. — Vol. 84, No. 1. — P. 102-15. — doi: 10.1016/S0006-3495(03)74835-8.

2. Berger, О. Molecular dynamics simulations of a fluid bilayer of dipalmitoylphosphatidylcholine at full hydration, constant pressure, and constant temperature / O. Berger, О. Edholm, F. Jahnig // Biophysical Journal.

— 1997. — Vol. 72, No. 5. — P. 2002-2013. — doi: 10.1016/S0006-3495(97)78845-3.

3. Brockman, H. Dipole potential of lipid membranes. Chemistry and physics of lipids. —1994. — Vol. 73, No. 1-2. — P. 57-79.

4. Diaz, S. Effect of Water Polarized at the Carbonyl Groups of Phosphatidylcholines on the Dipole Potential of Lipid Bilayers / S. Diaz, F. Amalfa, A.C. Biondi de Lopez, E.A. Disalvo // Langmuir. — 1999. —Vol. 15, No. 15. — P. 5179-5182. — doi:10.1021/la981235f.

5. Diaz, S. Contribution of Phosphate Groups to the Dipole Potential of Dimyristoylphosphatidylcholine Membranes / S. Diaz, F. Lairio, J. Arroyo, E.A. Disalvo // Langmuir. — 2001. — Vol. 17, No. 3. — P. 852-855. —

doi: 10.102 l/la000683w.

6. Ermakov, Yu.A. The determination of binding site density and association constants for monovalent cation adsorption onto liposomes made from mixtures of zwitterionic and charged lipids // Biochimica et Biophysica Acta. — 1990. — Vol. 1023, No. 1. — P. 91-97. — doi:10.1016/0005-2736(90)90013-E.

7. Ermakov, Yu.A. Dipole potentials indicate restructuring of the membrane interface induced by gadolinium and beryllium ions / Yu. Ermakov, A. Averbakh, A. Yusipovich, S. Sukharev // Biophysical journal. — 2001. — Vol. 80, No. 4. — P. 1851-62. — 10.1016/S0006-3495(01)76155-3.

8. Ermakov, Yu.A. Gadolinium ions block mechanosensitive channels by altering the packing and lateral pressure of anionic lipids / Yu. Ermakov, K. Kamaraju, K. Sengupta, S. Sukharev // Biophysical journal. — 2010. — Vol. 98, No. 6. — P. 1018-27. — doi:10.1016/j.bpj.2009.11.044.

9. Eisenberg, M. Adsorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids / M. Eisenberg, T. Gresalfi, T. Riccio, S. McLaughlin // Biochemistry. — 1979. — Vol. 18, No. 23. — P. 5213-23. — doi:10.1021/bi00590a028.

10. McLaughlin, S. The electrostatic properties of membranes // Annual review of biophysics and biophysical chemistry. — 1989. — Vol. 18. — P. 113-136.

11. Shapovalov, V. L. Interaction of DPPC monolayer at air-water interface with hydrophobic ions // Thin Solid Films. — 1998. — Vol. 329. — P. 599-602.

12. Ермаков, Ю. А. Влияние бериллия на электростатические и термодинамические свойства мембран из дипальмитоиллецитина / Ю.А. Ермаков, С.С. Махмудова, Е.В. Шевченко, В.И. Лобышев // Биологические Мембраны. — 1993. — Т. 10, №2. — С. 212-224.

13. Ермаков, Ю.А. Равновесие ионов вблизи липидных мембран - эмпирический анализ простейшей модели // Коллоидный журнал. — 2000. — Т. 6, вып. 4. — С. 437-449.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

14. Marukovich, N. (2013). Interaction of Polylysines with the Surface of Lipid Membranes: The Electrostatic and Structural Aspects / N. Marukovich, M. McMurray, O. Finogenova, A. Nesterenko. O. Batischev, Y. Ermakov // Advances in Planar Lipid Bilayers and Liposomes. — 2013. —Vol. 17, No. 29. — P. 139—166. — doi:10.1016/B978-0-12-411516-3.00006-l.

15. Нестеренко. A.M. Молекулярно динамическая симуляция бислоя DPPC в разных фазовых состояниях: гидратация и распределение электрического поля в присутствии катионов Ве2+/ А.М. Нестеренко, П.М. Красильников, Ю.А. Ермаков // Биологические Мембраны. — 2011. — Т. 28, №5. — С. 397-407.

16. Нестеренко. A.M. Молекулярная динамика фосфолипидных мембран: распределение ионов вблизи границы нейтрального и заряженного жидкокристаллического бислоя / A.M. Нестеренко, Ю.А. Ермаков // Биологические Мембраны. — 2012. — Т. 29, №5. — С. 374-384.

Тезисы конференций

17. Нестеренко. A.M. Подвижность ионов в примембранном слое воды / A.M. Нестеренко, П.М. Красильников // Тезисы XV международной конференции «Математика. Компьютер. Образование» (28.01-2.02, 2008 г.). — г. Дубна. — 2008. — С. 123.

18. Нестеренко A.M. Изменение параметров двойного электрического слоя

на поверхности фосфолипидной мембраны при вариации его ионного состава / A.M. Нестеренко, П.М. Красильников // Тезисы XIX международная конференция «Математика. Компьютер. Образование» (30.01-4.02, 2012 г.). — г. Дубна. — 2012. — С. 268.

19. Нестеренко. A.M. Строение двойного электрического слоя и адсорбция катионов металлов на поверхности бислойных фосфолипидных мембран в молекулярной динамике / A.M. Нестеренко, П.М. Красильников, Ю.А. Ермаков // Тезисы IV съезда биофизиков России. — г. Нижний Новгород. — 2012, — С. 218.

20. Nesterenko. A.M. Effect of cations on structural and electrical properties of lipid bilayer studied with molecular-dynamics / A. Nesterenko // International Symposium «Frontiers In Electronic Structure Theory And Multi Scale Modeling». — MIS&S, Moscow. — 2013. — P. 37.

Заказ № 93-Р/02/2014 Подписано в печать 25.02.2014 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,6

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

ФГБОУ ВПО Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, ФГБУН Институт физической химии и электрохимии имени А.Н.Фрумкина РАН

На правах рукописи

04201456910

Влияние катионов на структурные и электрические свойства липидного бислоя. Молекулярно-динамическое исследование.

Специальность: электрохимия (02.00.05) Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научные руководители:

доктор физико-математических наук, Ермаков Юрий Александрович, кандидат физико-математических наук, доцент, Красильников Павел Михайлович

Москва — 2014

Содержание

Список сокращений.................................... .........................4

Введение......................................................................................................5

1 Обзор литературы....................................................................................8

1.1. Распределение электрического поля в двойном электрическом слое..............8

1.1.1. Классическая модель распределения электрического поля и ионов вблизи поверхности..............................................................................................9

1.1.2.Адсорбция ионов на поверхности ................................................................12

1.1.3.Развитие моделей ДЗС ..................................................................................14

1.2.Экспериментальные подходы в изучении границы раздела мембрана-вода ... 17

1.2.1. Граничный потенциал бислоя и его компоненты........................................17

1.2.2. Регистрация электростатических эффектов на поверхности липидных мембран..........................................................................................................19

1.2.3. Регистрация и анализ неэкранируемой компоненты граничного потенциала бислоя..................................................................................................22

1.2.4. Природа дипольного потенциала липидного бислоя ..................................23

1.2.5. Биологические эффекты катионов и изменения дипольного потенциала . 25

1.2.6. Суммирование основных экспериментальных явлений, требующих молекулярной интерпретации ..............................................................................26

1.3.Вычислительная химия в моделирование мембран ..............................................29

1.3.1. Моделирование липидных бислоев................................................................29

1.3.2. Технические аспекты молекулярной динамики............................................30

1.3.3.Известные подходы к описанию детальной молекулярной картины липидного бислоя..,................................................................................................32

1.3.4.Техники вычислительного эксперимента для исследования межфазной границы липидного бислоя............................................................................36

1.4. Цели и задачи исследования................................................................................38

2 Методы постановки и анализа вычислительных экспериментов ................39

2.1. Конструирование молекулярных моделей липидного бислоя..............................39

2.1.1. Начальная геометрия системы липидный бислой-вода................................39

2.1.2. Расчет и подбор параметров силового поля..............................................40

2.2.Техника молекулярно-динамического моделирования липидных бислоев ..........43

2.3.Методы обработки траекторий ..............................................................................46

2.3.1. Привязка к относительным координатам......................................................46

2.3.2. Вычисление коэффициентов диффузии ..........................................................47

2.3.3. Вычисление электростатического потенциала............................................48

2.3.4.Расчет различных параметров молекулярной структуры растворителя и

липидного бислоя ..........................................................................................49

2.4.Теоретические оценки ..........................................................................................51

2.4.1.Решение уравнения Пуассона-Больцмана в периодической системе в отсутствие коионов..........................................................................................51

2.4.2.Оценка параметров адсорбции ионов ..........................................................52

2.4.3.Модель Гуи-Чепмена-Штерна в системе с двумя типами одновалентных

катионов........................................................................................................53

' 2.5.Использованные программные пакеты ....................................................54

3 Результаты вычислительных экспериментов с липидным бислоем и их

анализ..............................................56

3.1. Основные характеристики молекулярно-динамической картины липидного бислоя ..........................................................................................................................57

3.1.1.Сопоставление структуры липидного бислоя по данным рентгенострук-турного анализа и МД-расчетов ..................................................................58

3.1.2.Важные детали структурной организации липидного бислоя ....................59

3.2. Структура ДЭС на границе липидный бислой-вода ............................................62

3.2.1. Условная электрическая граница бислоя....................................................63

3.2.2.Параметры связывания одновалентных катионов в вычислительном эксперименте ......................................................................................................66

3.2.3. Локализация одновалентных катионов внутри бислоя................................69

3.2.4.Структурная модель ДЭС липидного бислоя в сравнении с классической моделью..........................................................................................................74

3.3. Гидратация межфазной границы и природа дипольного потенциала..................76

3.3.1. Граница бислой-вода с учетом эффектов гидратации................................76

3.3.2.Дипольный потенциал как объект исследования........................................79

3.3.3.Дипольный потенциал с учетом эффектов гидратации бислоя..................82

3.3.4. Связывание лизина с отрицательно заряженной БЛМ...................85

3.3.5.Структурная модель влияния ионов на дипольный потенциал бислоя... 87

3.4. Адсорбция многовалентных катионов и механические свойства бислоя..........90

3.4.1.Механические характеристики бислоя и монослоя ....................................90

3.4.2.Изменение дипольного потенциала при латеральной конденсации липидов 92 3.4.3.Особенности связывания многовалентных катионов ..................................94

Заключение................................................100

Основные результаты, выносимые на защиту.......................101

Благодарности..............................................102

Список литературы .......................................... 103

Приложение................................................114

А.1.Распределение концентрации ионов в диффузной части ДЭС в вычислительном

эксперименте и моделях ГЧ и ГС.................................... 114

А.2. Энергия ионов в диффузном слое с учетом эффектов гидратации.......... 115

А.3.Взаимодействие квадрупольного момента гидратной оболочки катиона с

электрическим полем .............................................. 117

Список сокращений

В стандартном представлении структуры фосфолипидов название имеет вид "[Т][Т][НН]" или D[Т][НН], где [T] — наименования жирной кислоты (однобуквен-ное), [НН] — наименование липидной головки (двухбуквенное), «D» обозначает «ди». Наименования жирных кислот: Р — пальмитиновая, О — олеиновая, М — миристоиловая. Наименования липидных головок: PS — фосфатидилсерин, PC — фосфатидилхолин, РЕ — фосфатидилэтаноламин, PG - фосфатидилглицерол, РА — фосфатидная кислота, PI -фосфатидилиннозитол. Примеры названий: DPPS - дипальмитоилфосфатидилсерин, POPS

- пальмитоилолеилфосфатидилхолин.

Различные органические соединения: TMA - тетраметиламмоний; ПЯЛ — поли-L-лизин; CL — кардиолипин; SDS — «sodium dodecyl sulphate» (додецилсульфат натрия).

Наименования физических методов: МД — молекулярная динамика; KX/QM — квантовая химия; ЭПР - электронный парамагнитный резонанс; КВП — компенсация внутреннего поля; ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние; ЯМР — ядерный магнитный резонанс.

Аббревиатуры вычислительной химии: РМЕ — «particle-mesh Ewald», разновидность суммирования по Эвальду в обратном Фурье-пространстве, не имеет русской аббревиатуры; OPLS - Optimized Potentials for Liquid Simulatioons; АКФ - автокорреляционная функция; ФРР — функция радиального распределения (RDF); DFT — «density functional theory», теория функционала плотности; ПП — параметр порядка; PMF — «Potential of Mean Force» (потенциал средней силы); УВ-цепи — углеводородные цепи (липидные хвосты); ж/к - жидко-кристаллический; рА-диаграма

- диаграма «давление-площадь»; ПБ — Пуассона-Больцмана.

Прочие аббревиатуры: СГС — сантиметр-грам-секунда; ГЧ — Гуи-Чепмена; ГС -Гонсалеса-Санса; ГЧШ — Гуи-Чепмена-Штерна; ДЭС — двойной электрический слой;

- поверхностный потенциал; 4>d — дипольный потенциал; 4>ь — граничный потенциал; Ф^ — электрокинетический или ^-потенциал; БЛМ — бислойная липидная мембрана;

Введение

Электрическое поле на границах клеточных мембран является важным регулирующим фактором в процессах, сопровождающих транспорт гидрофобных катионов через мембрану, адсорбцию заряженных молекул на ее поверхности и разряд переносчиков электрона на специализированных мембранных акцепторах. Распределение электрического потенциала на границах мембран определяется их липидной фракцией и включает в себя падение потенциала в диффузной части двойного электрического слоя (поверхностный потенциал) и в плотной части ДЭС (дипольный потенциал). Изучение факторов, влияющих на эти компоненты граничного потенциала, целесообразно проводить на модельных липидных системах (липосомы, липидные монослои, плоские бислойные липидные мембраны) с применением различных электрохимических методов. Липидный бислой формируется амфифильными молекулами фосфолипидов, каждая из которых состоит из ионизованной полярной группы, экспонированной в окружающий водный раствор сложного ионного состава, и гидрофобных углеводородных цепей, недоступных для ионов электролита. Граница липидного бислоя представляет собой частный случай границы раздела гидрофобной среды и воды, которую можно рассматривать как поверхность идеально поляризуемого электрода и использовать для ее описания известные электрохимические модели. Как следует из большого количества электрокинетических данных, распределение поля в диффузной части ДЭС достаточно хорошо описывается в рамках классической модели Гуи-Чепмена-Штерна. В то же время, изменения поля в плотной части ДЭС непосредственно связаны со структурными особенностями липидного бислоя и требуют для изучения совершенно иных экспериментальных и теоретических подходов.

К настоящему времени обнаружен целый ряд экспериментальных фактов, для интерпретации которых необходим детальный анализ молекулярных структур межфазной границы бислой-вода. В частности, плотность центров связывания катионов в мембране в терминах изотермы Ленгмюра оказывается меньшей, чем поверхностная плотность анионных фосфолипидов, обычно предполагаемых в этом качестве. Комбинирование электрокинетических данных с регистрацией суммарного граничного потенциала методом компенсации внутримембранного поля плоских БЛМ позволяет заметить значительное, более сотни милливольт, увеличение дипольного потенциала, вызванное адсорбцией многовалентных катионов. Адсорбция некоторых поликатионов в аналогичных экспериментах приводит к изменению дипольного потенциала отрицательного знака. Более того, в измерениях с липидными монослоями обнаружена корреляция механохимических характеристик монослоя и дипольной компоненты гра-

ничного потенциала, молекулярная природа которой, а также ее связь с фазовым состоянием липидов остается неясной. Для интерпретации подобных результатов, как правило, предполагается влияние ионного окружения на состояние гидратации полярной области фосфолипидов, доказать которое весьма сложно прямыми измерениями. Это означает, что для адекватного описания электрических и механохимических явлений в липидном бислое целесообразно обратиться к молекулярному моделированию и построению структурных моделей межфазной границы бислой-вода. В литературе имеется немало молекулярных моделей липидного бислоя, однако проведенные на их основе вычислительные эксперименты не позволяют сопоставить эти модели с существующими представлениями о структуре ДЭС. При выполнении данного исследования целенаправленно варьировались условия такого рода экспериментов, что позволило провести подробное сравнение результатов с известными данными электрохимических измерений и теоретическими моделями.

Благодаря появлению суперкомпьютеров большой мощности в приложении к электрохимическим задачам интенсивно развиваются методы вычислительного эксперимента. Методы вычислительной квантовой химии (ab initio) успешно позволяют исследовать процессы переноса заряда, тогда как методы молекулярной динамики применимы к исследованию процессов массопереноса и адсорбции в двойном слое. В то время как методы ab initio получили широкое распространение в электрохимических исследованиях, методы молекулярной динамики (МД) находят применение в задачах электрохимии несколько реже. Тем не менее МД-модели различной сложности успешно применялись для описания строения двойного электрического слоя на поверхности «классических» электродов (например, [1]). В исследовании липидных мембран методы МД, напротив, чрезвычайно популярны. Множество работ, описывающих электростатические характеристики и структуру межфазной границы липидного бислоя, было опубликовано (см., например, [1-5]). Однако практически все эти исследования проводились без подробного сопоставления с теоретическими моделями, разработанными в электрохимии и коллоидной химии. В настоящем исследовании, чтобы устранить этот пробел, приведен анализ ряда вычислительных экспериментов, результаты которых сопоставлены с классической моделью двойного электрического слоя Гуи-Чепмена-Штерна.

В данной работе техника молекулярной динамики используется как инструмент, для проведения серии вычислительных экспериментов. Исследование содержит четыре логических этапа. В первую очередь строятся молекулярно-динамические модели липидных бислоев смешанного состава с различным начальным поверхностным зарядом и различным составом омывающего электролита. С помощью этих моделей определяется

область применимости макроскопической теории Гуи-Чепмена-Штерна. На втором этапе работы выясняется молекулярная природа центров связывания различных катионов на поверхности мембраны и состояние гидратации полярных групп фосфолипидов. На следующем этапе выявляются молекулярные структуры, ответственные за дипольную компоненту граничного потенциала. И наконец, в последней части работы анализируются возможные механизмы взаимосвязи дипольного потенциала, состояния гидратации и механических характеристик мембраны.

Часть 1

Обзор литературы

Адсорбция поверхностно-активных органических молекул на поверхности раздела электрод-раствор способна существенным образом изменять равновесный потенциал электрода, а также его потенциал нулевого заряда. Такой монослой можно рассматривать как отдельную фазу, на одной из границ которой образуется двойной электрический слой. Границу липидного монослоя с водой можно рассматривать как частным случай границы такой системы. Биоэлектрохимические методы позволяют изучать характеристики такого монослоя как часть более сложной бислойной системы, которая в известной мере моделирует липидный матрикс биологических мембран. Структура вида «мембрана-вода» представляет собой двухфазную систему, состоящую из двух таких монослоев, обращенных друг к другу гидрофобными поверхностями. Поверхность гидрофобной «фазы» оказывается покрыта полярными группами, которые несут заряд. Распределение электрического поля вокруг этой поверхности со стороны неполярной и полярной фазы сильно отличается, и для его описания необходимы различные теоретические инструменты. Ниже будут рассмотрены наиболее развитые теоретические представления электрохимии о распределении электрического поля на границах раздела фаз.

1.1. Распределение электрического поля в двойном электрическом слое

Теоретическое описание электрических явлений вблизи заряженной поверхности со стороны полярной фазы широко обсуждаются в литературе, посвященной коллоидной химии и электрохимии. Тем или иным образом упрощая строение самой поверхности, оказывается возможным учесть связывание ионов электролита и описать его в рамках феноменологических параметров связывания. В работе используется хорошо известная теория Гуи-Чепмена-Штерна для описания взаимосвязи поверхностных потенциала и заряда, а также для выражения распределения потенциала в диффузном слое. Ниже мы кратко продемонстрируем вывод основных уравнений этой теории, чтобы указать (здесь и в последующих главах), в каких местах допущения теории могут расходиться с молекулярной картиной.

1.1.1. Классическая модель распределения электрического поля и ионов вблизи поверхности

При исследовании распределения электрического поля вблизи поверхности мембраны в самом общем случае используют ряд приближений:

• плоскость предполагается равномерно заряженной; на поверхностную плотность заряда молекулы растворителя напрямую влиять не могут 1;

• энергия ионов на различном удалении от поверхности определяется только электрическим взаимодействием;

• подвижные заряды пребывают в термодинамическом равновесии, то есть подчиняются распределению Больцмана;

• обе фазы электронейтральны на бесконечном