Роль липидов в структурной организации мембран и взаимодействии с белками тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

»гз од

На правах рукописи

Чупин Владимир Викторович

Роль лппидов в структурной организация мембряп п взаимодействии с белками.

(02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ)

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой гтрпени доктора химических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на Кафедре химии и технологии тонких органических соединений Московской государственной академии тонкой химической технологии им.

М.В.Ломоносова; в Центре биомембран и липидной энзимологии Утрехтского государственного университета, Нидерланды.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Юлиан Георгиевич Молотковский

доктор химических наук Василий Иванович Куликов

доктор физико-математических наук, профессор Всеволод Александрович Твердислов

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится " 19 " ч-Л-^к ^ 1997 г. в 15.00 на заседании диссертационного совета Д 063.41.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора химических наук в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломовосова (117571, Москва, пр. Вернадского, 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова (119831, Москва, ул. Малая Пироговская, д.1). '

Автореферат разослан "/¿"Сил^М/1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.'

Актуальность проблемы. Исследование структуры и функций биологических мембран является актуальной задачей современной науки. К настоящему времени нет сомнений в том, что биологические мембраны играют ключевую роль в координации всех биохимических процессов, протекающих в клетках. В связи с этим неудивительно, что биологические мембраны активно изучаются специалистами в области биохимии, биофизики, биоорганической химии, физиологии, медицины а ряда других областей естествознания. В результате этих исследований сложилась самостоятельная отрасль знаний, которая получила название мембранологии. Вопросы структуры и функций мембран рассмотрены в многочисленных учебных пособиях и научных монографиях (Овчинников, 1987; Ивков И Берестовский, 1981, 1982). Вместе с тем, мембранология продолжает бурно развиваться й появляются все новые данные, расширяющие наши знания о мембранах.

Развитие мембранологии пално не только для понимания фундаментальных основ жизнедеятельности, но и д\я решения многих прикладных задач. Знание структурной организации и функционирования биологических мембран позволяет целенаправленно воздействовать на многие физиологические процессы, создавать новые мембранотропные медицинские препараты. Успехи, достигнутые в области модельных мембран, широко используются при создании биосенсоров, в наноэлектронике, получении новых биосовместимых материалов.

Возможность существования биологических мембран обусловлена уникальной способностью фосфолипидов формировать в воде стабильные бимолекулярные пленки. Считается, что биологическая мембрана представляет собой лттдный бнелой, в который погружены белки (Singer, 1972). Биологические мембраны различных клеток и внутриклеточных органелл построены по единым принципам и состоят из липидоп, белков и слоя мембрано-связанной воды. Межмолекулярные взаимодействия мембранных компонентов определяют особенности структурной организации мембран. Необходимым

' Сокращения: ФХ • фосфатидилхолин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, КЛ - кардиоляпин, П - пальмитоил, Г - гексадецил, О - олеоил, Гал - галактозил, Глю - глюкозил, ФАТ -липидный фактор активации тромбоцитов, Ду<з - квадрупольное расщепление, Ь, -ламеллярная жидкокристаллическая фаза, - ламеллярная гелевая фаза, Нп -инвертированная гексагональная фаза, Тф„ • температура фазового перехода.

условием понимания функционирования биологических мембран является знание молекулярных механизмов взаимодействия мембрано-связакной' воды, липидов и белков.

Липидный состав биологических мембран отличается чрезвычайной гетерогенностью и содержит сотни химически индивидуальных липидных молекул (van Deenen). Данный факт не согласуется с представлениями о пассивной роли липидов в функционировании мембран в качестве простой структурной матрицы, в которой растворены мембранные белки. Гетерогенность липидного состава биомембран, по-видимому, позволяет, с одной стороны, создать определенное микроокружение для оптимального функционирования различных мембранных белков, а с другой стороны, мембранные белки могут изменять свойства липидного бислоя на локальных участках мембраны. Многие вопросы взаимосвязи химической структуры липидов с особенностями строения мембран, специфичности липид-белховых взаимодействий и роли гидратной оболочки по-прежнему остаются невыясненными.

В качестве одного из наиболее эффективных методов в исследовании структуры мембран зарекомендовал себя ядерный магнитный резонанс (ЯМР) (Seelig, Oldfield, Smith, Cross). Метод ЯМР позволяет в принципе селективно проследить за взаимодействием, структурной организацией и динамикой всех компонентов биологических мембран; мембрано-связакной водой, ляпидньгм бислоем, мембранными белками. Исследование самих биологических мембран является чрезвычайно сложной задачей, поскольку в состав мембран входят тысячи различных химически индивидуальных соединений. Эта проблема отчасти решается за счет использования искусственных модельных мембран, которые получают из смесей липидов и белков. Тем не менее, даже в таких упрощенных моделях спектры ЯМР представляют собой суперпозицию сигналов от ра^.оякых соединений, которые входят в состав мембран. В связи с этим при изучении структурной организации мембран методами ЯМР широко используется подход, основанный на селективном введении изотопных меток в молекулы воды, липидов или белков. Введение таких изотопов как 3Н, "С и 15N дает возможность избирательно следить за поведением отдельных типор молекул или определенных молекулярных фрагментов даже в составе биологических мембран. Химический синтез изстопномеченых липидов и белков в сочетании с методами ЯМР является мощным инструментом в исследовании особенностей структурной организации мембран.

Данная работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТТОС МИТХТ им. М.В.Ломоносова по теме N 1Б-18-В65 "Получение липидов, биорегуляторов липидной природы и йх коньюгатов, изучение поведения в биологических системах, использование для создания физиологически активных липидных препаратов и липосомных форм" (номер государственной регистрации 01920018492).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось создание методологии исследования модельных и биологических мембран на основе целенаправленного химического синтеза дейтеромеченых и других модифицированных липидов и изучения свойств мембран методами ЯМР высокого разрешения и твердого тела. С помощью разработанных методологических подходов исследовать поведение в составе мембран липидов, белков, связанной с мембранами воды.

Выполнение работы включало решение следующих экспериментальных

задач:

1. Разработка методов синтеза и получение дейтеромеченых и модифицированных фосфо- и гликолипидов.

2. Изучение гидратной оболочки мембран, построенных из индивидуальных фосфо- и гликолипидов.

3. Сравнительное исследование свойств липидов в составе мембран.

4. Исследование липид-белковых взаимодействий.

а. Изучение влияния белков на структуру липидных мембран.

б. Изучение влияния липидного окружения на структуру мембранных белков. Научная новизна. Результаты работы формируют новое научное направление по исследованию свойств мембран с помощью комплексного подхода, включающего химический синтез модифицированных липидов, исследование мембран методами гН- и "Р-ЯМР твердого тела, изучение структуры белков в мембранном окружении с помощью двухмерной 'Н-ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.

Разработаны оригинальные методы синтеза модифицированных липидов, на основе которых получен ряд новых дейтеромеченых фосфо- и гликолипидов. Разработаны методы синтеза дейтерированных детергентов. Получены новые способные к полимеризации фосфатидилхолины. Изучены методы синтеза липидного фактора активации тромбоцитов (ФАТ).

Проведено сравнительное исследование свойств липидов с простой и сложной эфирной связью в составе мембран. Определен вклад карбонильных групп во внутренний дипольный потенциал липидного бислоя. Изучена конформация фосфохолинового фрагмента ФАТ в составе бислоя. Изучено фазовое поведение моногликозилдиглицеридов в составе модельных мембранных систем.

Изучено взаимодействие интегральных пептидов и белков с липидным бислоем. Показано, что белок-предшественник преферредоксин вызывает образование небислойных структур в бислоях, моделирующих мембраны хлоро пластов. Показана необходимость полиморфного регулирования в мембранах для обеспечения жизнедеятельности клеток Escherichia coli. Исследован ингибирующнй эффект полимерных бислоев и бислоев, содержащих липиды диалкильного типа, на активность фосфолипазы А].

. Проведено систематическое изучение влияния липидного окружения на вторичную структуру бактериальных и митохондриальных сигнальных последовательностей. Методами двухмерной 'Н-ЯМР-спектроскопии определена локализация элементов вторичной структуры в сигнальных последовательностях в различных окружениях, моделирующих свойства мембраны.

На 'основе полученных данных предложены модели, объясняющие особенности липид-белховых взаимодействий сигнальных последовательностей, фосфолипазы А] с мембранами различного липидного состава.

Практическая значимость. Полученные результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. Знание молекулярных механизмов процесса транслокации белковых молекул через липидный бислой имеет важное значение для биотехнологии, так как позволяет целенаправленно воздействовать на транспорт белков в клетках. Разработанные методы синтеза позволяют получать химически чистые препараты ФАТ, который является мощным биорегулятором, участвующим в клеточном ответе на воспалительные процессы. Особенности химического строения фосфатидилхолинов с простой эфирной связью позволили использовать эти соединения в качестве ингибиторов фосфолипазной активности, модуляторов естественного иммунитета. В Центральном институте травматологии и ортопедии, Москва, и Западно-Сибирском Центре экологических и медико-биологических исследований, Кемерово, показано, что экзогенное введение фосфолипидов диалкильного типа уменьшает тяжесть

течения воспалительных процессов и может бит), исиплмшымо для ч<|;кпплеиия р-)Н. В И «статут»« •»пидемиолопш и микробиологии им 11 Ф.Гачалеи, 1'ЛМИ.

|V'1 ос i\ Si'i, ЛИПИДМ С Простои '>фир|'ОН с 'ЛЯ НЛО НОПОЛЬ'ЮЛЛл.ИО. Д\И ПОШ.ППОНИН

естестчшого иммунитет.) Высокая стдбилыюгть полимерпт бислоев п бмелоеу из :■'■>; :о; л■ >i ]: гл и I ■ н использовались при < о to-; [ i и и

дяагпесткпуг» для г'гмутто.фермгнтмпго чна*.н*ч 0-ролкт»яного белкя, vm^im*«

,-.:!роблрг,",<и;мо;:) Го"ул ;р,:т!!!'Н1:о?! науяно-нсе \>'Довйто.\ъском институте

стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л .A. i «UtlCcDFl-14.

Основные положения, вьгаосимь:а ;:а защиту:

1. Методы синтеза дейтеромечрних и модифицированных липидон.

2. Изучение мембран с помощью ЯМР твердого тела и высокого разрешения.

3. Строение гидратной оболочки мембран из фосфо- и гликолипидов с простой и сложной эфирной связью.

1. Оссбснцост! попеде!!:!."! лгшидоз п составе мембран.

/>»Ч>:11!!Ч !* »4 Ч ПРГГГИДОЧ И'1 /;1HVK1 О. U fl II И'1,|.'Г KiO МСМбГМП.

0. Зависимость структуры енпильнъп; пептидов от мембранного окружения. 7 Модели цзкнмо/лчпмдоп и ^ллов » гостлпе мембран,

AngoG-inim p<i0oti-t. Результаты работы били предстаплены ¡¡р.: Всесоюзной конференции по биохимии линидов, Киев, 19ЯЗ; 4-м Всесоюзном симпозиуме "Лнпиды биологических .мембран", Пущино, 1904; 9-й конференции молодых ученых "Синтез н исо\сдоьаи::е биолог:лес.-л аятаспых соединений", 1ОД7, Рига г Всесоюзном совещания по физическим методам исследования мрмбран, Дубна, 1S87; 5-м Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзтмолопш, 1988, Вильнюс; Ш Всесоюзном совещании по химическим реактивам, Ашхабад 1989; 5-ой Московской конференции по органической химия и химической технологии, 1939; 2-й Всесоюзной школе "Лэшмюровские пленки: получение, структура п свойства", Звенигород, 1990; Международном семинаре "Investigation of the biological and lipid membranes, ampliiphiles by mean-, of neutron scattering", Дубна, 1992; конференции "Биологически Активные соединения, синтез и использование", Пенза , 1992; Международном семинаре "Biological membranes^ Sacley, France, 1992; XVlth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Veldhoven, The Netherlands, 1994;

Международной школе по бноорганической химии, Москва, 1996; 2-й Школе молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений, С.-Петербург, 1996 и других.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 51 статья, в том числе 2 обзора, получено 3 авторских свидетельства и I патент.

Ооъсм диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, материалов и методов исследования, выводов и литературы. Работа изложена н^^СЬтр., содержит Л-9рисунка,.?£5:хем,-2¿таблицу.

1. Синтез дейтернроашшых и модифицированных лшшдов, необходимых для проведения мембранных исследований.

1.1. Синтез дейтеромеченых лшшдов.

Для синтеза ФХ, содержащих дейтерневые метки в холиновом фрагменте молекул, использовались удобные в препаративном отношении подходы, основанные на фосфорилирооании растворимых о органических растсоршгелях солей холнна. С этой целью были получены п -толуолсульфо! ¡аты и тетрафенилбораты различных меченых холинов:

(а)Цг Цг(Р) р,(Г)

I I , I

НО-СН2-СН2-1^(СНз)з ТзО'. ИцВ"

Для получешш тозилата [у-2Нз)-холина предложен новый подход, основанный на алкилировании КМ-диметнламиноэтанола |2Н3]-метиловым эфиром п^голуолсульфокислоты, что позволило синтезировать целевой продукт с количестве!Шым выходом.

Синтез тетрафенилбората |а-2Н2]-холина осуществлялся по описанному методу восстановлением этилового эфира Ы.Ы-диметилглнщта алюмодейтеридом лития, последующим алкилнрованием иодистым метилом н осаждением [а-2Н2]-холина из водного раствори тетрафеннлборатом натрия.

Представлялось целесообразным использовать аналогичную схекг синтеза и Мя получения [Р-2Н2]-холина. Ранее, для получения [Р-'ЬЫ-яолшт использовалась многостадийная схема синтеза, которая включала конденсацию цианида натрия с формальдегидом, блокирование свободного гидроксила бензоилыюй группой, восстановление алюмодейтеридом лития и последующее

КСЧС'рПЫВакЛЦИе "JPl H MipofMHHe. IÍ.1M4 бил рл.ф^ГиППН МОИМИ МеТОД, OCHOIIÍHIHUÜ i-'a «ü-, ;íí;4ü рн-i f- n1;v~,r.тГт "'^ир N.V .yrirmmnnm.i

• ■ ¡• 11 ■ ¡ i" . .i ......... • ' ■ с; - ■ = f j Г.' N ,• H-'i-i ¡ !,М' м:: :,¡¡ ■t "Очг'пммк !, im д"»:"['»Г' "

в*еТ.эУО »Я~02Н; M " *?р'»СуТСТЧИЧ истнЦТ'' H^Tpwa Лял^ПРЙПТ we Ilpr-,!¡¡,J!,U'l¡Ii!¡ 'K-yilHTIH. И MCI» .•!!М\РГИЧНП тому, Krir '>!-., Гц'у) ч пугг г'Ч'Том WV? г ли-п»а ВМРГТП ЛЛЩМПЛАЙГРПнля

Полностью дейтерированный [2Нп]-холин в виде тетрафенилборатиой соли

OKI А ИПАХГЧНН ИСЧеОИЫН<1Н1|11Ит

алюмодейтеридом лития я последующим алкилировапиеч подпетым мгтилом-'Нз.

Построение |2-2Н2)-меченых гидрофобных синтопов осуществляли на основе ¡2-3Н2)-пальмитиновой кислоты, полученной в результате малонового синтеза, или реакцией изотопного обмена метилового эфира пальмитиновой кислоты и метанола-02Н|.

Для синтеза ¡11-2Н2)-олеиновой кислоты подвижные а-протоны октаналя

w1-;'.'":;::::г:.------- ■;т Arfrrrpr.?.:nrTi:.TÍt

':.■:'■:!' ¡ j " ■ " :¡ С ~фН И И V 1>огф< ¡1С noí¡ СОЛЫО ГООТТН "ТС T'V/TOIJ! Г ГО

'<ф«рп ьлрпо;;ог.оГ; ;;::слот;,г по Brrrnt-y. Модифч'^ц"!' условий пг<>чг>д<»пич pt'^KHrtJi Гш1|"чп-£1 эп <ч-1 использоманлг г, качестве остюплппя тргт-Оутплата лшии, нолученною взаимодействием грет-бутилояг-1 с спирта с бутилатом .«гпп и раствора ТГФ. позволила увеличить выход, стереочистоту н осуществтъ наработку J1l-'Hí!-олеиновой кислоты н количествах несколько десятков грамм.

Получение дейтеромеченых ФХ с простой и сложной эфирной связью показано на Схеме J. 1,2-Дизамещенные глицерины (1 a-d) синтезировали исходя кз глицерина и [2-2Н2]-меченых гидрофобных синтоиоп с использованием нэопропилиденоьой, бензилиденосой, дифеннлметплснлнлыюй л трнтилыюй защитных групп. Синтез ФХ с остатками полностью дейтерированных и [11-гН2|-олеинопой кислоты осуществляли путем ацилирования sn-глицерофосфохолина ангидридами плп импдазолидачп соотг-етстпующих кислот.

Для Сгпгг-лз<1 поногалактознлдпглнцорндоп (7 п.Ь) использовался подход, иозполчгощпй вводит!, любые дентеромеченые жирные кислоты п гогтав голакто.'Шлднглкцсрндоз на последних t гад и ti т си irre-i ч получать чистггё р апомер (Схема 2).

Схема 1.

РОСЬ

—ок, о*- ^а

(2 а-<1)

011, ОЯ; -—ОН (1 а-<1)

—О Я, —Оиг

—ОС^Н2К+(СНз)2СОЗ О** О" (3 а-а)

1ЮСН2СНг^(СН,)зС1>1 ТЮ'

к, =ахо:(СН;)цСНз Кг = СО(СН:)иСН,

ДПФХ

^ашмпувсн,! Кг = 00(СИ2)иСН3 Г '

1г, = а>1>2<с'н2)псн, Ь , ^(СНЬСН, г'

П1ФХ

я, = щсадснгьснд

иг = (СНгЬСНз

/

(41) ДГФХ

Схема 2.

Г^СВДОЩпСНз (а)

а^сту^^жада^ст, (ь)

Удалетше защитных ацетатных групп в присутствии сходных по реокциодшой способности сложноэфирных связей жирнокислотНых остатков является одной пз наиболее сложных проблем в синтезе гликознлдиглидеридов. Селективное удаление ацетильных групп в соединениях (6 а,Ь) с выходами 60-

80% достигалось при действии гидразина в смесях хлороформ-метанол-пода в присутствии триметилцетиламмоний бромида. Мы полагаем, что присутствие детергента вызывает образование смешанных мицелл, в которых жирнокяслотные сложноэфнрные группы защищены от взаимодействия с гидразином.

Для изучения влияния мшидного окружения на структуру мембранных белков были сшпезнрондны различные полностью дейтерированные детергенты (Схема 3).

Схема 3.

Полностью дейтерировачный додеканол фосфорилировали хлороксидом фосфора и получали дихлорфосфат (8) практически с количественным выходом. Омыление дихлорфосфата ¡8) водой приводило к додецилфосфату, структурному аналогу фосфатидной кислоты. При взаимодействии дихлорфосфата (8) с полностью дейтерированным этиленгликолем получали фосфолан (9). В кислой среде фосфолановый цикл омыляется до додецилфосфогляколя, который переводили в натриевую соль [^На^-додецнлфосфогликоля (10), близкого аналога фосфатидилглицерина. Фосфорилированием тетрафенибората холина был получен цвитгер-иоиный [2Нзв]-Аодецилфосфохолин (11).

1.2. Синтез фактора активации тромбоцитов (ФАТ).

Согласно литературным данным препараты ФАТ, синтезированные различными методами, характеризуются значительными расхождениями э оптической активности. Для объяснения причин этих расхождений была изучена реакция ацетилярования лиэо-ФАТ уксусным ангидридом в присутствии кислот и органических оснований (Схема 4).

Схема 4.

.ос^ауЛаУз

Ac2Q

наоГ

СН3С(

о^ (12 a,b)

Лс20 основание

(13 a,b) +

(CHj)3N+CH2C^O^i/ (14 в, b) O^

CHjCOO'

OCltCHjí^CCHjh

O' (13 a,b)

(CüjljNCHiCHjO^

O

"O-

R = q„H37 (a) R = q6H33 (b)

I-OR H

OCOCH3

(15 аД)>

Кислатнокатализируемое ацетилирование лизо-ФАТ (12 a,b) приводило к ФАТ (13 а,Ь). При ацетилировании лизо-ФАТ (12 а,Ь) в присутствии триэтиламшга или 4-диметилам1шопиридина получалась смесь ФАТ (13 а,Ь) и соединения, которое было идентифицировано методами ЯМР как изомер природного ФАТ (15 а,Ь). Содержание последнего достигало нескольких процентов. Соединения (13 а,Ъ) и (15 а,Ь) но удалось разделить с помощью хроматографических методов. В связи с этим структура и стереоконфигурация изомеров ФАТ (15 а,Ь) были установлены направленным сшггезом и анализом продуктов гидролиза смеси (13 а,Ь) и (15 а,Ь) фосфолипазой Aj. Так как значение |a]D изомера (15 а,Ь) примерно на порядок превосходит [a]D ФАТ (13 a,b), то присутствие изомера (15 а, Ь) приводит к увеличению наблюдаемого [ajo.

Образование изомера (15 а,Ь) обусловлено тем, что в присутствии избытка уксусного ангидрида наряду с реакцией ацетилирования гиДрокснлыюй группы происходит образовшше смешанного ангидрида, который в результате реакции внутримолекулярного пуклеофильного замещения превращается в фосфолан (14 а,Ь). Накапливающийся в результате развития реакции ацеггнлирования ацетат-анион выполняет роль нуклеофила и его действие на фосфолан (14 а,Ь) приводит к образованию изомера (15 а,Ь). При этом конфигурация хнралыюго ueirrpa в (15 а,Ь) не меняется, что соответствует экспериментальным данным.

1.3. Синтез полнмернзуемых фосфолнппдов. Синтез ФХ (17 а,Ь) с диеновыми группами на концах и в середине

углеводородных допой (Схема б) осуществляли путем ацилирования яп-глицеро-З-фосфохсшша ангидридом хлслоты в присутствии -Ьдиметиламииоииридина.

Схема 6.

1-Ю'

-ОН

(КС0)20

-------р. ^СОО-

ОСН2СИ2^(СН3)3

-ООЖ

«п

-0^[>^0СН2СИ2Н+(СНз)з

' г' N г

а={СНгЬСН=СНСН=Щ (а)

(С1<2)пСН=СНСН=ОДС^)тСНз 11=7-8, т=54 (Ъ)

Для получения кислоты с диеновой группой на конце цепи метиловый эфир 11-бромундекановой кислоты переводили . в (10-

метоксикарбонилдецил)трифенил-фосфоний бромид, который конденсировали

по В'.гттагу, используя трет-Зутилдт калчя как основание длч П0'\у»?енм '-<-"Н,к-<. и акролеин г. качестве :;лрбо!ц:лыюп компонент:,!. Щелочной гидролиз даппл М.'З-тетрвдмидиеиовую кислот/ которая, но данным ЯМР н ВЭЖХ. нредстарлепа на 95% цис- п на 5% транс-изомером.

2. Особешюста структурной организации липядныж мембран.

2.1. Методы ЯМР в исследовании мембран. *Н-ЯМР. Метод ?Н-ЯМР обладает двумя важными отличительными

чертами, делающими его особенно полезным при изучении мембран. 1. Биологические и модельные мембраны обладают анизотропией физических свойств. В спектрах гН-ЯМР это находит отражение в появлении широкого анизотропного сигнала с двум максимумами, частотное расстояние между которыми называется квадрупольным расщеплением (Дvo). Величина зависит от природы связи, которой атом дейтерия присоединен к молекуле, и от движений, совершаемых дейтероном вместе с молекулой или ее фрагментом. Понижение молекулярного порядка приводит к уменьшению наблюдаемого Луп' Ду0 =(3/4)(е3чО/Ь)3 (1)

где: е2яО/Ь - статическая константа квадрупольного расщепления, равная для связи 0-2Н 220 кГц и для связи С-2Н 170 кГц;

5 = <1/2(Зсоз20,-1)> - молекулярный параметр порядка, равный отношению наблюдаемого и максимально возможного квадрупольного расщепления; 0, - угол между 1-ой осью динамического усреднения и направлением связи 0-2Н или С-2Н, угловые скобки означают усреднение по I движениям.

2. В отличие от спектроскопии ЯМР на ядрах со спином 1=1/2 ('Н, 13С, 31Р) в случае_ 2Н-ЯМР основной вклад в спин-решеточную релаксацию вносит квадрупольная релаксация, что позволяет непосредственно из скорости? релаксации рассчитать время корреляции тс для движения дейтеронов. Для движений с частотами превышающими ларморову частоту тс прямо пропорционально скорости релаксации 1/Т[:

По физическому смыслу тс характеризует среднее время жизни метки в данном состоянии и по порядку величины разно времени, за которое метка повернется на 1 радиан или сместится на расстояние, сравнимое с ее размерами.

згР—ЯМР. Все фосфолипиды содержат по крайней мере один атом фосфора в полярной части липидной молекулы, что делает атом фосфора идеальной- природной 3|Р-ЯМР-меткой. Форма сигнала в спектрах 3|Р-ЯМР мембранных препаратов определяется анизотропией химического сдвига. В составе бислоя фосфолнпнды дают сигнал с пиком в сильном поле и плечом, направленным в сторону слабого поля, анизотропия химического сдвига До составляет 40-50 м.д. В гексагональных структурах До уменьшается в два раза и меняет знах. Дополнительные изотропные движения приводят к усреднению Дат.

1Н-ПМР в исследовании_структуры белков. В основе методов

определения пространственной структуры белков лежит принцип, основанный на измерении ядерного эффекта Оверхаузера между прогонами различных аминокислотных остатков и использовании его в качестве меры расстояния. Необходимым условием проведения таких исследований является возможность получения спектров 'Н-ЯМР, в которых сигналы всех (или по край эй мере большинства) протонов разрешены. Проблема перекрывания и отнесения сигналов решается за счет использования двухмерной ЯМР-спектроскопии. Для моделирования мембранного окружения белков используются небольшие по размеру мицеллы, что позволяет получать спектры ЯМР высокого разрешения.

2.2. CjiaBHiiieAbiioc изучение фосфатидилхолннов с простой и сложной

эфирной сянзыэ я составе мембран.

Глицсролнпиди с простой эфирной саязыо (ether lipids) наряду с лииидами ацильного тина широко распространены в природе и отличаются от последних способом присоединения гидрофобных остатков к глицериновой основе молекулы - простая ^рирнап связь вместо сложноэфирчои. Вопрос о функциональной роли лиипдсп с простой эфирной связью до сих пор остается открытым. Интерес к алкильным липидам стимулируется тем, что соединения С „. ^ 1 -.--^ —'— -.—.,. ^¿»ОЛО; u^UiuiiuCiijiu ¿10 v.,jiiinii.iini\/ с йл

ацилышмн аналогами.

Липнды с простой эфирной связью могут проявлять активность путем модификации свойств мембран. В связи с этим нами были проведены сравнительные исследования свойств липидов с простой и сложной эфирной связью в составе мембран.

2.2.». Iljyicrsia Пздзтисй оболо'иаз фосфагаднлхолипов с простой и сложной

зфпр.чом сепзыэ.

Гпдратипя оболочка лшшдных ламеллкрных структур, образующаяся за счст прочного связывания иолекул соды с полярным!; группами лппидоэ, играет па,™ную роль структурной организации и функционировании биомембрап.

С целью проведения сравнительного изучения, в качестве объектов исследования били выбраны ФХ (¡8-23). За поведением некбрано-спгсзанной воды следили методом 5Н-ЯМР, используя для гидратации липидов тяжелую воду (DjO). Содержание воды в гидратной оболочке липидного бислоя регистрировалось по анизотропному сигналу в спектрах и оказалось одинаковым для липидов (10-23) - 11-14 молекул воды на 1 молекулу липида.

Отличительной особенностью липидов (18-23) оказалось то, что Avq уменьшается по мере появления карбонильных групп в составе липидных молекул. Время релаксации мдаЯраио-связаштой воды для липидов (13-23) лежит к пределах 10-100 мс (на 1-2 порядка меньше по сравнению со свободной иодой) эллисит от температуры и степени заполнения гидратной оболочкя лтегодиого бислоя и оказалось практически одинаково липидов (18-21) и (22, 23).

[—01*1 —01^2

—о„

■•Чл-

ОСНЬСЦг^СНОз

<Г О" (18.23)

Я, =СХХСН2)нСН3 Из =(СН2),СН=СН(СН2),СНз

я, =(ощ15сн3

я2 = (шлаедш^снз

ПОФХ (22)

ГОФХ 123)

Я, =00(СН2)|4СН3 ДПФХ (10)

^ =00(013)14013 ^

,РЧ =(СН2)15СН3

^(ОЩиСНа

ДГФХ (21)

Определение локализации воды осуществлялось методом дифракции нейтронов*. Амплитуда рассеяния нейтронов протонами н дейтеронамн различна. В результате, после вьгштащм дптплг, полученных в Г^О и НгО, остается лишь структурная информация о молекулах воды (рнс.1).

Рнс.1. Плотность амплитуды рассеяния нейтронов для воды (сплошной лшша) и лшшдкого бнслоя (пунктир) мембран нз ГОФХ (23) (относительная влажность у=60%, 1«»28°С).

Вычисленные из фурье-профЕшй структурный параметры мембран приведены о табл. 1. Как следует из ?аб& I, параметры мембран из лшшдов с гидрофобными заместителями одинаковой д&шш, степени кенашщеппости п того же уровня гидратации совпадают о пределах экспериментальных ошибок. Различия в 1ь обусловлен! те»!, что в оггсутстснн карбонильного кислорода скачок плотности амплитуды рассеяния нейтронов вдоль нормали плоскости

* совместно с Горделяем В Л, ОИЯИ,, Дубна

бислоя находится в области атома кислорода простой эфирной связи, локализованного ближе к центру бислоя по сравнению с СО-группой.

Таблица 1. Структурные параметры для мембран из ПОФХ и ГОФХ (\у = 60%,

1 = 28°С) и ДПФХ и ДГФХ (у = 85%, 1 = 20°С; Ч< = 85%, 1 = 68°С).

Липид Фаза ё, А и, А п» 1ь. А

ПОФХ и 51,2 ±0.2 16.7 ±0.4 6.2 ±0.3 14.6

ГОФХ 1а 50.9 ±0.2 16.7 ±0.4 5.8 ±0.3 16.7

ДПФХ 1-в 50.0 ±0.2 15.4 ±0.4 3.3 14.3

ДГФХ ч 58.5 ±0.2 20.3 ±0.4 2.7 16.8

ДПФХ и 53.5 ±0.2 13.1 ±0.4 6.2 13.7

ДГФХ и 55.5 ±0.2 15.3 ±0.4 3.2 16.9

<1 - период повторяемости; - глубина проникновения молекул воды в мембрану; п„ - количество молекул воды на молекулу липида; !(, - граница гидрофобной области; 1, и 1ь были вычислены от центра бислоя.

2.2.2. Изучен»« п динамики фосфатидилхолшгоп с простой п

ыожпой эфирной связью в составе мембран методом 2Н-ЯМР.

Дш решения згой задачи были исследованы фосфатидллхолппы "И5-ДПФХ, :Н5-ГПФХ. гН5-ПГФХ и 2Н5-ДГФХ (3 а-с1), которые представляют все возможные комбинации присоединения гидрофобных заместителей к 1 и 2 положениям глицерина за счет простой или сложной эфирной связи. Дейтериевые пепси вводились строго селективно в структурно-соответствующие части молекул ФХ (3 а-й). Наличие двух меток, в лшшдпых молекулах позволило одновременно следить за изменениями в гидрофильной и гидрофобной частях бислоя.

Температурные зависимости спектров 2Н-ЯМР оказались качественно одинаковыми для ФХ (3 а-в) и представлены на примере 2Н5-ДГФХ (Зс1). В спектрах 2Н-ЯМР (рис. 2) сигнал с меньшим Луо. соответствует метке,

расположенной в М-метнлыюй группе холина. Быстрые внутримолекулярные вращения С2Нз группы вокруг С-С, С-Н С-О и Р-О связей приводят к значительному усреднению величины Дуд. Сигнал с большим Дуо соответствует [2-С2Н2]-группе, для которой число степеней свободы существенно меньше по сравнению с метальной группой холинового остатка. Переход бислоя из Ц, в Ьр

состояние сопровождается изменением Дуо и уишрением сигналов [2-СаНа] и >1-С'Нз-групп. Особешю сильное уширенне наблюдается для сигнала ^-С^Нг]-грушш. Зависимость параметров спектров от фазового состояния лшшдцого бкслоя была использована для определения температуры фазового перехода ФХ (3 а-<1).

«71 ^

М'С .

1

¿ГС ,

иввв V

мэоз в -гмх> 3%.

-и

гит

-гешт*

Рнс.2. Температурная зависимость спектров Н-ЯМР для мембран из Ш-ДГФХ (3 с1). а - полный ссактр; б - сигнал от Ы-СНз-грушпл; в • сштюл от [2-С2Нз]-группы. • "

Таблица 2. Параметры спектров 5Н-ЯМР бнслоез нз 'НгДПФХ, 'Нз-ГПФХ, ■ ПГФХ, 2Н4-ДГФХ. (3 а-сЦ.

| ЫС'Нз МСНз 2-С'Нг

Лшшд Тфш°С Температура 30иС Температура

1 Д'^о, £>о) т„ ДУО, §а> т,. ■Сс. Дуо. 8со т,. тс.

кГц мс ас кГц ШС ас кГц и: сс

^Нз-ДПФХ 41 1.40 0.011 за €3 1.00 0.000 83 29 25/23 0.20 14 0.23

■"НгПГФХ 41 2.71 0.00 33 ®3 1.17 0.009 ВО 29 25 0.20 22 0.15

'Нз-ГПФХ 49 1.56 0.012 за 63 2.15 0.009 60 23 25/26 6.20 0^23

"НгАГФХ 44 £.90 0.015 38 63 0.010 83 29 24 0.19 22 0.14

Значительное уширение сигнала -группы в гелевой фазе не

позволило определить величины Т, и Ау0 для данной группы. Как видно из табл. 2, подвижность Ы-С'Нз-груипы ФХ (3 а-с!) одинакова. Величина Ауо имеет тенденцию к незначительному увеличению по мере замены ацильных групп на алкильные.

Величины Лу0 для [2-С2Н2]-фупп ФХ (3 а-<3) име1от весьма близкое значение порядка 25 кГц, что указывает на перпендикулярную ориекгацшо углеводородных цепей 5П-1 относительно плоскости бислоя (БееИд). Наличие двух сигналов 01 ¡2-С?4Ь)-груш1 для 'Ш-ДПФХ и *1-Ь-ПГФХ обусловлено недостаточной эффективностью усреднения параметров этих сигналов за счет вращений меченого метиленового фрагмента вокруг С-С-связей. Это подтверждается также релаксационными измерениями (табл.2).

В целом конформационно-динамические свойства ФХ с простой и сложной эфирной связью в составе жидкокристаллического бислоя близки.

?.' Л ки^ы ш» шву * лйвпольиьгЛ Е5аТ£5«-шал Пнслод

1 ;. . ::1'' г ': О.'СГгН'е 1:'" ■ -:' ■ " :' \ '-'р^'",: "Я : т' г

'.»с;-, п..),.м,! р,|чд', м.цц I '•|1;яд.1 ч ггеспш

11.11,1;., .-ИЛГ! чпч'-п м <;('! ЧОЖОГ Ч\'Г-Н I'■'. .'."",''1'' : :; л? Г71Г1 \:гПТЛ:1!:ГО

Стс.хси

Полный :'л> чил:;..и-скпн ШЛПМЦМ! Л ':>;".■ 'чс-.т. <-- лгу.'.: пгтеч щ

р ¡',-'.\ Ил) ■! - ■ г- ■,• ■; д-,, • т ,г„:,,

потенциалов (рис. 3). Положительный внутренний дппольяый поте яд и ал \)<г>

углеводородной области.

Пнугрештй электрический иогсицв.ьг фссфсш^щлдул-пхечогр бнслоп

создают положительный электрический потенциал внутри бпслоп; диполей карбонильных фушт сложнозфирных связей (рнс.З).

8 О

Рис.3. Полный электростатический потенциал липидного бислоя.

Д\|/

Для определения вклада карбонильных групп во внутренний электрический потенциал фосфолипидного бислоя нами были проведены эксперименты по измерению скачка потенциала ДУ между водной фазой и терминальными метальными группами углеводородных цепей в монослоях'.

В качестве объектов исследования использовались ФХ (18-21), которые отличаются лишь способом присоединения гидрофобных заместителей к глицерину. Как показали исследования методами 'Н-ЯМР И нейтронографии, мембраны, полученные из утих фосфоляпидов, близки по структурной организации молекул воды и липидов. Это позволило для определения вклада отдельных карбонильных групп использовать простой подход, основанный на сравнении величины ДУ для ацильных и алкклышх липидов, полагая, что вклад мембрано-связанной воды и фосфохолнновых групп в детальный потенциал одинаков для ФХ с простой и сложной эфирной связью. Экспериментальные величины скачка потенциала для ФХ (18-21) в вычисленные вклады в величину ДУ карбонильных групп приведены в табл. 3.

• Вклад карбонильной группы яп-1 углеводородной цепи заметно превосходит вклад карбонильной группы в положении яп-2. Это находится в соответствии с результатами работы, в. которой было показано, что карбонильные группы в обеих цепях ориентированы практически одинаково под углом ¿60° относительно плоскости бислоя. Так как карбонильная группа в

' совместно с Геводоы В.С., Днепропетровский о-технологический иди шут

составе углеводородной цепи в положении л л -1 более глубоко погружена в углеводородную область бислоя, то ее окружение менее полярно, а вклад в мембранный дипольный потенциал увеличен по сравнению с карбонильной группой в положении 5Л-2.

Таблица 3. Скачок потенциала АУ в монослоях из ФХ (18-21) и вычисленные вклады карбонильных групп в дипольный потенциал.

Липид ДУ суммарный, мВ ДУ, мВ ДУ, мВ

вклад С = О в ял-1 вклад С = О в яп-2

ДПФХ (18) 590 120 50

ГПФХ (19) 470 - 80

ПГФХ (20) 540 150 -

ДГФХ (21) 390 - -

2.3. Изучение фазовых переходов глнкозилдяглицерпдоп.

Содержание гликозилднглицеридов п составе мембран растений, бактерий II микоплазм достигает десятков процентов. Однако биологическая роль гликознлдиглицеридов не совсем ясна. Нами было исследовано фазовое поведение глюкозилдиглнцеридов диацилыюго (24), алкилацилыгого (25), ацилалкилыюго (26) и дналкильного (27) типов методом 2Н-ЯМР, используя в качество метки 1}20 в составе гидратной оболочки липидов (24-27).

ГО.

01! (24-Т7)

Д, =ССУГН.)ПСН,

Пз =(СИ2)|<СИ,

Я1 =(С'Нз)|5СН5

Из =(С1Ь)|5С1Ь

ШТл» (26)

ДГГлм (ТТ)

При повышении температуры в спектрах 2Н-ЯМР происходят характерные ддя фазовых переходов скачкообразные изменения двух типов (рис.4). Уменьшение интегральной интенсивности изотропного сигнала при фазовом переходе связано с различной гидратной емкостью липидного бислоя глкжозилдиглицеридов (24-27) в и Ц фазах. Уменьшение Дуо анизотропного сигнала обусловлено образованием инвертированной Нц-фазы и появлением дополнительных движений молекул вокруг оси цилиндров Нп-фазы. Термодинамические параметры этих переходов были определены калориметрически (табл.4).

Таблица 4. Данные по фазовым переходам глюколмпидов (24-27).

Липид Температура перехода, °С Энтальпия перехода, ккал/моль

Ьр -» Ц, I«-* Нп Ьр Ц,->Н„

ДПГлю (24) 60±0,5 72±0,5 9±1 1,2±0,2

ГПГлю (25) 65,4±0,5 72,8±0,5 8±1 1,3±0,2

ПГГлю (26) 63,5±0,5 72,510,5 10±1 1,4±0,2

ДГГлю (27) 67,0±0,5 67,0±0,5 8±1

В спектрах 'Н-ЯМР исследованных глкжозилдиглицеридов (24-27) в диапазоне соотношений липид/ОаО от 1:5 до 1:50 (моль/моль) наблюдается сигнал, представляющий суперпозицию широкого анизотропного и узкого изотропного сигналов.

Как и в случае ФХ (18-21), Дуо мембрано-связанной воды уменьшается с появлением карбонильных групп в составе гликолипидов (24-27). Это может быть объяснено тем, что карбонильные группы являются центрами связывания молекул воды, и появление таких центров приводит к усреднению Ду0 за счет быстрого обмена внутри популяции мембраяо-связаниой воды.

Замена ацнлышх групп на алкильные в гликозилдиглицеридах (24-27) приводит к некоторому увеличению Тф„ гель-жидкий кристалл и уменьшению Тфп бислой-гексагональная фаза. Такая зависимость имеет общий характер для фосфо- и гликолипидов и отражает несколько более плотную упаковку углеводородных цепей в бислоях из алкильных липидов.

ПГГлю (26) ПГФХ (20)

1X0 I -¡к» Г)

Рис. 4. Температурная Рис- 5- Спектры аН-ЯМГ в составе Ц-

зависимость спектров 'Н-ЯМР Ф43" ПГГлю (26), 40°С, и ПГФХ (20), ДГГлю (27). Лмпид:рзО, 1:5. 25°С, при разном содержания 'НаО.

I

Отличительной особенностью свойств гидратной оболочки шокозилдиглицсридов является отсутствие усрегу^еимя анизотропного сигнала связанной зоды п спектрах 2Н-ЯМР, что может быть объяснен© образованием про'нмя водородных связей г'ожду гадроксильнымн грушиму глнколчпвдов и ысмбрано-связашюй водой. Возможно, что прочная гндратная Зислоя

глюк03:£лднгл1:церцд01) обеспечивает повышенную стабильность мембран шютплазм, простейших прокариот, лшпепных клеточной смии. Это свойство глюйознлдиглкцеридов было использовано нами при ыодафкяацып поверхности плмаек для яимунофермеатного анализа С-реактшшого балла.

Фазовое поведение дейтеромеченых галактознлдиглицерпда (7а) п его 5-глкхозядиога аналога, а такхсе 1,2-дп-[2-гНз]-пальмптопл-5-глюкоз::АДШ'лкцер11дов, отличающихся конфигурацией глмцерзшозога фрашептз и кх диастереоиерной снеся существенно не отличается от фазового повглегиг! глжоляпядоз (24-27).

Тенденция гликоззглдиглкцерядов органи.-ог.яг.-т;, небкелойиыа структур;? обусловлена высокой плотностью упаковки углеводородньгг цепей о «Зпслоо.

Введение цис-двойной связи в углеводородные цепи увеличивает эту тенденцию и резко понижает температуру фазового перехода гликозилдиглицеридов. По данным 2Н-ЯМР температура фазового перехода бислой-гексагональная фаза ненасыщенного галактозилдиглицерида (7Ъ) более чем на 75°С Ш1же температуры фазового перехода соответствующего насыщенного липнда.

2.4. Структурообразоваине ФАТ и производных лизофосфатнднлголыиа.

Высокая биологическая активность ФАТ, лизо-ФХ алкильного типа и его производных обусловлена наличием в клеточных мембранах специфических рецепторов, взаимодействующих с данными липидами. В связи с этим особенно актуальной является задача изучения конформации алкильных фосфолшшдов, лизофосфолнпидов и их производных в составе липидного бислоя.

Нами было изучено поведете в составе мембран ФХ (19), лизо-ФАТ (12Ь), ФАТ (13Ь) и 1,2-0-гексадецилиден-5П-глицерофосфохолина (28). Для исключения эффекта мицеллообразования на спеотры 31Р-ЯМР эксперименты проводили в условиях неполной гидратации липидов.

В составе бислоя анизотропия химического сдвига лизо-ФХ йначвтелыго меньше анизотропии химического сдвига ФХ, что, как было предположено (Jain), обусловлено быстрым вращением фосфатной группы вокруг связи С1-С2 глицеринового остатка. Для выяснения роли вращения вокруг С1-С2 связи глицеринового остатка был исследован ацетальный аналог лизо-ФХ (28). Как и лизо-ФХ (12Ь), фосфолипид (28) имеет один гидрофобный заместитель. Однако в случае фосфолипида (28) гидрофобный заместитель присоединен к глицерину за счет ацетальной связи, что исключает вращение вокруг связи С1-С2 глицерина.

^ОСЦгСНгК^СНзЬ

Параметры сигнала 31Р-ЯМР-спектров ФАТ в составе бислоя оказались близки к параметрам сигналов ФХ (19) и ацетального аналога лизо-ФХ (28) (табл. 5). Это указывает на отсутствие вращения фосфохолинового фрагмента молекул ФАТ вокруг связи С1-С2 глицеринового остатка. Наличие даже такого

небольшого остатка как ацетильная группа при 2-ОН глицерина препятствует вращению вокруг С1-С2 связи глицерина молекул ФЛТ п составе бислоя.

Таблица 5. Параметры спектров 3|Р-ЯМР фосфолипидов (19), (12Ъ), (28) и (!ЗЬ) в составе бислоя. Мольное соотношение вода:лнпил, 10:1.

1 Липид Т,*,п, с Температура, "С Фаза До, м.д. 1 Л-л Гц

ДПФХ •!6 30 и 59 0,31 770

(19) 50 48 0,06 320

« лязо-ФЛТ 30 26 0,24 ■100

I (12Ь) 50 15 0,11 200

| ацеталышй -8 -13 и 54 0,34 740

ФХ (28) 27 и 45 0,05 450

ФАТ -8 -13 и, 52 0,23 770

(13Ь) 27 и • 47 0,02 250

5 ¡рнмоч-якс. - гпкзстреяя!: ^::т::г:есг.ого сдгягг: г; параметр псяммгтртг

с.чп'члй; Л« - линч!!.

ззяим!»действия и их вослелспшя Д".п мембрап г'ожно классифицировать следующим образом:

5. Б?дан могут изменять структурную организацию лпичдного бислоя: и. при физцч^скон взаимодействии с линидным Сислоем« б. путем ло«л»«-»»ого изменения лчпиднпго гостяпя тд фермв«ггятч»«»ов .1;хшпт>сти, испроилеипой па ллппдные молекулы г. госгапе г.гппбрпг:1! 2. Днниды могут влиять па биологическую активность мембранных белков за счет изменений:

а. вторичной и третичной структуры мембранных белков;

б. актияности лнпмд-завнскмых ферментов.

Одной дз задач Данной работ явилось исследосапио дшшд-Ссдкш&и

вадимодействий а изученно влияния этих пяанмодгйстрнй на структур» лнт«дн!>1Т> бислоч п мембранных белков.

3.1. Влияние белков на структуру липидного бнслоя.

3.1.1. Влияние нреферредокснна на структуру липидного бислоя.

Белки, которые выполняют функции внутри хлоропластов, митохондрий или на внешней оболочке бактерий, синтезируются в цитозоле в виде предшественников, которые содержат в своем составе на Ы-конце сигнальную последовательность, и переносятся через бислой. После транслокации белка-предшественника через зоны контакта между наружной и внутренней мембранами органеллы или бактериальной клетки сигнальная последовательность удаляется протеазами. Сигнальные последовательности бактерий, митохондрий и хлоропластов не имеют гомологии в первичной структуре, но одинаково и специфически взаимодействуют с мембраной и белками аппарата транслокации. Это предполагает, что узнавание сигнальных последовательностей происходит на уровне вторичной или третичной структуры последних в липидном бислое. Гидрофобность и наличие положительных зарядов в сигнальных последовательностях определяют их высокое сродство к липидным мембранам

При проведении модельных экспериментов с гидрофобным полипептидом грамицидином А нами было показано, что последний вызывает образование гексагональной фазы даже в стабильном фосфатидилхолиновом бислое. Имеются указания на то, что гидрофобные бактериальные и мктохондриальные сигнальные последовательности также нарушают структуру бислоя. Нами было исследовано взаимодействие одного из белков-предшественников хлоропластов с липидным бислоем. Так как мембраны хлоропластов содержат значительные количества гаЛактозйЛдигЛНцеридов, то было Изучено влияние предшественника ферредоксииа (РгеГс!)' на мембраны из смесей . 1,2-111-'Н^-диолеоил-«!-' глицерофосфохолина (29) и моногвлактозилдиглицерида (7Ь), содержащих структурно эквивалентные дейтерневые метки. Транзитный пептид РгеГй: ЫН3-МА5ТЬ5Т15УЗАЗШ'КООРМУА55ЬРтМСОА1Л:СиСАС5КСКУТАМ-

Селектявное наблюдение за лнпидами достигалось при использовании смесей из дейтерированного ФХ и нсдейтерированного галактозилдигли .(ерида и/или наоборот. Увеличение концентрации моногалактозилдиглицерида в бислое приводит к появлению в спектрах 2Н-ЯМР сигнала, соответствующего сигналу

' РгеМ был получен М.РИоп (ШгесМ ипгёегеНу) генно-инженерными методами

Нп-фазы (рис.6). Состояния, предшествующие переходу бислоя в Нн-фазу, сопровождаются увеличением плотности упаковки углеводородных цепей, которая возрастает по мере увел|ргения концентрации галактознлднглицсрида в мембране. Величина Л\'о метки как в составе ФХ (29), так и в составе галактознлдиглицерида (7Ь) увеличивается в одинаковой мере. Однако, Ду« метки в составе галактознлднглицерида (7Ъ) всегда меньше по сравнению с ФХ (29), указывая на то, что метки находятся в среде с разной упорядоченностью углеводородных цепей.

%рдгос)

' ■ • .....X '

Рис.б. Спектры 'Н-ЯМР смесей ФХ (29) а ГалДГ (7Ь) как функция состава мембран.

ФХ

Рис.7. Модель лнпидного бислоя из ФХ (29)и мопогалактознлдш'лицеркдд (7Ь).

По-видимому, метки С-'Нз в состава ФХ (29) п галлкгозплдвглацерада (7Ь) погружены па разную глубину в лншгдный бнслоЗ. Так как метки прясос^гдаепи К одному и тому *се положению углеводородный цепей, то это предполагает смещение липидиых молекул относительно поверхности бислоя (рис.7). Такая

структура поверхности бислоя объясняет легкость его взаимодействия с сигнальными последовательностями, что было показано в экспериментах с ыонослоями.

По данным 2Н- и 3,Р-ЯМР присутствие Рге1с1 вызывает нарушение бислойиой упаковки липидов (рис.8) также, как это происходит при увеличении концентрации галактозилдиглицерида в мембране. Аро-форма ферредоксина, т.е. белка без сигнальной последовательности, не оказывает влияния па бислойаую организацию липидов в мембране.

control 2н

pr*Fd: Upld 1 : 4S0 iH

%(ыооа>

Sip

60

29

10

-t

-i-

кия nan

Рис.0. Влияние Prefd на структуру бислои из ФХ (29) и ГадДГ (7Ь)

Предполагаемый деездкшм взаимодействия Preid с мембран ой гаожет быть описал следуюцрш образом. МоЕогалактозилдотлйцеркдьа изменяют свойства поверхности ливндкого бксадя ы облегчают внедрение гидрофобной транзитной последозаталыюста в лашадшй бислой. Транзитная последовательность содержит большое количество гндрохсшшровашшх емшоягслот (Sei). За счет образования водородных связей иеяаду транзиткой Еоследозатолькоскло а молекулами мокоташстозаидш'Аачерида концентрация Еоследшк увеличивается в места локализации транзитного веитцда. Локальное увг&ичепкз кощентрацип моаогалактознлдыглацсрида приводит к дестабализацгш лападкого бкслоа, что спосеЗстаузт слиянию внутренней и наружной мембран хлоропластоа и образованию контактных зон. -

ЗЛ.2. Полнморфпое регулирование лппидного состава в мембранах Е. coli.

Рассмотренный выше механизм образования небислойпых участков п мембране может реализовываться, если в составе бислоп присутствуют липнды склонные к образованию небнслойных структур.

При изучении процессов транспорта нуклеиновых кислот в клетки Е. coli нами было покачано, что сочдание условий необходимых для транспорта (Ся2+, температурный или электрический шок) приводит к нарушению бислойной организации мембраны. Легкость образования небнслойных структур в Г. с~'.1 ебгдсиастса высоким содержанием фосфатидилэтлноламина (ФО), который самоорганизуется в Нц-фазу. Конструирование мутантного штамма Е. coli (AD93), который не способен синтезировать ФЭ, позволило нам проверить необходимость полиморфного регулирования липидного состава для жизнедеятельности клеток. Е. coli.' Мутантный штамм не способен выживать, если в питательной среде отсутствуют такие катионы, как Мд2+, Са2+ и Sr2* . При этом, фосфолипидный состав мембраны адаптируется в зависимости от того, какие катионы присутствуют н питательно« среде. Отсутствие ФЭ компенсируется увеличением содержания кардиолииина (КЛ).

В отсутствии ФЭ роль небислойного липида выполняет КА. КЛ формирует Нц-фазу только в присутствии некоторых двухвалентных катионов, поэтому клетки мутантного штамма AD93 могут выживать лишь з присутствии таких катионов, как Мд2 + , Са2+ или Sr2 + . Ионы Са2+ являются более сильными промоторами Нц-фазы КЛ н в нх присутствии требуются меньшее количество КА в составе бактериальной мембраны по сравнению с Мд"+ н Sr2+.

Нами были выделены суммарные липядные экстракты из клеток выращенных в разных условиях на питателышх средах с [ И-2Нг]-олеиновой кислотой и изучено их фазовое поведение. В отсутствии двухвалентных катионов (условия, при которых клетки не выживают) Avq метки [ll-JHj] составляет величину порядка 5-6 кГц, что соответствует ФХ, то есть такому липиду. который образует бислой практически вне зависимости от внешних условий. Добавление в среду катионов вызывает увеличение Avq до 8-9 кГц. Зтс отражает увеличение плотности упаковки углеводородных цепей и создает предпосылки для перехода бислон-гексагональкая фаза. При повышении температуры до 50-60°С происходит переход в Нц-фазу, т.е. в условиях

' эксперименты по выращиванию бактерий проводились ARietveld (Utrecht University)

жизнедеятельности мембрана находится в таком - состоянии. когда незначительные внешние воздействия могут индуцировать образование небислойных структур. Ионы Ва2> ингибируют как переход бислой-гексагоиалышя фаза,' так и рост клеток мутанп1ого штамма АП93.

3.1.3. Взаимодействие фосфолипазы Л2 с мембранами.

Установлено, что внутриклеточные фосфолипазы А2 участвуют в биосинтезе таких медиаторов воспалительных процессов, как ФАТ и эйкозаноиды. Учитывая то, что объектом атаки фосфолипазы Аг являются мембранные липиды, можно ожидать наличия корреляции между степенью повреждения мембранных структур и тяжестью течения многих заболеваний.

Из веществ, ингибирующих фосфолипазу А2, особый интерес представляют липиды с простой эфирной связью, которые не гидролизуются фосфолипдзами А], а по поведению в составе мембран не отличаются от диацильных аналогов.

Нами было изучено взаимодействие фосфолипазы Аг с мембранами, содержащими ФХ с простой эфирной связью (19) и (21), а также полимерными бислоями из ФХ (17а). Полимерный бислой из липида (17а) отличается исключительно высокой стабильностью, не разрушается под действием детергентов, органических растворителей, ультразвука, что позволило использовать его в качестве модели неразрушаемой мембраны.

В результате гидролиза ФХ образуется лизо-ФХ, который обладает ярко выраженными детергентными свойствами. В спектрах "Р-ЯМР это приводит к появлению изотропного сигнала (рис.9). Введение в состав бислоя ФХ диалкилыюго типа (21) или добавление к липосомам из яичного ФХ липосом, построенных из диалкильного ФХ (21), полностью ингибировало действие фосфолипазы

Роль структурной целостности бислоя в механизме действия фосфолипазы Аз исследовалась с помощью полимерных липосом. В отличие от многих других полимгризуемых липидоа ФХ (17а) распознается и гидролизуется фосфолипазой Аз (рис.9). После проведения полимеризации ФХ (17а) в составе липосом последние приобретают устойчивость к действию фосфолипазы А2. Добавление полимерных липосом из ФХ (17а) полностью ингибирует процесс разрушения липосом из яичного ФХ под действием фосфолипазы А2 (рис.9).

Оч

Врат

0,5 ч

Зч

Л—_I_I_

I I I I I _[_ * ГГЦ 13

1—I_I_I_■ I ■ '

ГШ и

Рнс. 9. Спектры Э,Р-ЯМР лнпосом из яичного ФХ (а-в), мономерных лыпосои пз • ФХ (17а) (г-е), смесь полимерных лнпосом из ФХ (17 а) и липосок и* яичного ФХ 1:1, как функпия врем?ни инкубации с фосфолипазой Аз из змеиного яда.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

1. схязцватше с нешдролнзуемым субстратом препятствует диссоциации фермент-субстратного комплекса н ннгнбпрует (¡юсфолняазу Л2;

2. отсутствие структурных дефектов в бпслоа препятствует диссоциации фермента с поверхности мембраны и также ныгнбнрует фосфолнпазу Аз.

Возможность ингпбнровашш фосфолкпазы Аз путем экзогенного введения лнпосом представляет прахтпч'=сетш шггерес с точки зрения защиты организма при воспалениях. Отек тканей является одним из проявлений местной воспалительной реакции п был пспользоппн как модель для изучения действия ГПФХ (19) и ДГФХ (21) после шпщнгщин отека стопы кркс формальдегидом*. Введение липосом, содержащих ДГФХ (21), позволило значительно уменьшить степень гяпергидратацни тканей (табл.6).

Прсгт воотр - ни й -»ффекгт ДГФХ (211 спгзгш, по-вядгякягу, с пнгнбнрозаинем фосфолнпазной актпвяоега н предохранением структурной целостности нембрап. Способность ГПФХ (19) усиливать развитие отека

* эксперименты проводились совместно с Шальиевым А.Н., ЦИТО, Москва, и Крейнесом В.М., Кемеровский мединститут

объясняется тем, что экзогенный ГПФХ служит дополнительным источником в биосинтезе ФАТ и, тем самым, способствует разви тию воспалительной реакции.

Таблица б. Антиэкссудативное действие липосом различного состава через два часа после введения флагогенного агента (формальдегида).

Состав липосом Увеличение объема стопы крысы, мл

Контроль 0,322 ±0,022

Яичный ФХ: холестерин, 7:5 0,180 ±0,042

Яичный ФХ:холестерин:ГПФХ, 7:5:0,8 0,400 ±0,037

Яичный ФХ:холестерин:ДГФХ, 7:5:0,8 0,090 ±0,050

Тот факт, что алкильные липиды являются биогенетическими предшественниками многих медиаторов клеточного ответа, обуславливает их иммунную активность. Эксперименты по изучению иммуностимулирующей активности* показали, что фосфолипиды с простой эфирной связью увеличивают неспецифическую резистентность организма к инфекциям в 2-3 раза.

3.2. Влияние липндоз на структуру сигнальных последовательностей.

Из биохимических экспериментов известны требования к свойствам липидного бислоя, выполнение которых необходимо для эффективной транслокации белков-предшественников (с1е КгиЩГ):

1. бислой должен содержать липиды, формирующие небислойные структуры;

2. бислой должен содержать анионные липиды, создающие отрицательный поверхностный электрический потенциал;

3. через бислой должен быть приложен трансбислойный электрический потенциал.

Механизм и • роль полиморфных перестроек липидного бислоя рассмотрены в предыдущем разделе. В данном разделе представлены результаты по изучению влияния липидного окружения на вторичную структуру бактериальных и митохондриальных сигнальных пептидов, а также

_) '

' совместно с Туманян М.А., Институт эпидемиологии и микробиологии, Москва

трансмембранного потенциала на взаимодействие бислоя с гидрофобными-ионами.

3.2.1. Влияние трансмембранного потенциала на свойства лнпидного бислоя.

Влияние трансмембранного потенциала на особенности структуры липидного бислоя и на его взаимодействие с гидрофобными веществами изучалось на упрощенной модели, в которой в роли гидрофобных ионов использовались тетрафенилборат и тетрафенилфосфоний. Действие "».егтрпчсского поля на липидный бислой определялось путем измерения реличины Ду0 а- и |3-дейтериевых меток в холине 1,2-диолеоил-«л-Глицерофосфохолинов, которая зависит от ориентации фосфохолниового диполя относительно поверхности бислоя. С целью создания трансмембранного потенциала монобислошше везикулы получали в среде К230«, а затем катионы К+ снаружи везикул обменивали на катионы Ма+. Добавление валиномицина приводило к тому, что ионы К+ вытекали из везикул создавая отрицательный потенциал внутри везикул

По данным 2Н-ЯМР трансмембранный потенциал не оказывает заметного эффекта на конформацню фосфохолиновой группы ФХ. Вместе с тем, трансмембранный потенциал существенно влияет на взаимодействие лнпидного бислоя с гидрофобными ионами. Увеличение концентрации катионов тетрафенилфосфония в бислое вызывает уменьшении Ду0 метки в а-положении холина п увеличепие Дуо метки в р-положении. Наличие отрицательного потенциала внутри везикул усиливает этот эффект. Данный факт объясняется Тем, что отрицательный внутри везикул потенциал увеличивает концентрацию тетрафепнлфосфония по сравнешно с общим объемом системы. Для тетрафепилборат-аниона эффект был протИйоаоложным.

Спектры гН-ЯМР, полученные в присутствии трансмембранного потенциала, асимметричны (рис.10), что указывает на неравномерное распредэленяе катионов тетрафенилфосфония в поперечном сечении липидного бислоя в присутствий внешпего электрического поля. Сигнал с большим Дуо соответствует липидным молекулам на внешнем монослое, а сигнал с меньшим Ду0 - липндным молекулам на внутреннем монослое, где концентрация катионов тетрафенилфосфония повышена. Удаление трансмембранного потенциала при добавлении грамицидина А приводит к однокомпонентному спектру.

Рис. 10. Спектры 2Н-ЯМР везикул смеси [а-2Н2]-1,2-диолеоил-зл-глнцероФХ (85%) а 1,2-диолеонл-зл-глицерофосфоглицершха (15%) ' в отсутствии (а) и присутствии (Ь, с) тетрафенилфосфоняя. а, Ь • через бнслой приложен трансмембрашшй потенциал; с -после удаления потенцшуш.

Таким образом, внешнее электрическое ноле не оказывает заметного

эффекта на полярную область липидного бнелоя и существенно влияет на

гидрофобную часть мембраны. Этот экспериментальный вывод согласуется с

теорией (McLaughlin). Если учитывать толщину xj различных областей бнелоя п

соответствующие этим областям константы диэлектрической прошщаемостп

ергдд £, то падение трансмембрашюго потенциала dyi на различных участках

t

мембраны можно вычислить нз следующих соотношений:

i еА-еД т^) О); = (4)

ах, их J t

Если трансыембрашшй потенциал равен 200 мВ, то на долю углеводородной области приходится падение потенциала порядка 190 ыВ, а на полярную часть Спслоя всего 3 мВ. Поэтому внешнее элсстрнч&скоо цела оказывает наиболее сильное влияние па молекулы логаушзопахшыо в пгпелярной углеводородной области липидного бнелоя, а в области полярных групп этот эффект уменьшен из-за высокой полярности среды.

3.2.2. Влияние лшадвего о&рузкяша на вторз-гяую структуру бз&хгг-взлхззго епшальпого пгдтпда I'lir:?.

Мегод 'Н-ЯМ? позволяет определить вторичную и трот-щуп структуру белковой молекулы по всей полкпептадпой цокочке маияули. Одихя, для моделирования мембранного скругхеыия необходимо непользовтгь оргазшчсспзо растворители нли мицеллы, что позволяет получать спектры 'Н-ЯМР высокого

разрешения. Обычно в качестве детергента используют коммерчески доступный дейтерированный додецилсульфат натрия. Для более адекватного моделирования

липидиого окружения белков нами использовались также такие детергенты, как додецилфосфохолин (Н) и додецилэтиленгликоль (10).

Белок PhoE синтезируется в виде предшественника внутри клеток Е. coli и после транслокацин через бислой формирует фосфатные каналы во внешней мебране. Для изучения влиянии мембранного окружения на структуру

сигнального пептида белка PhoE (MK.KSTLALVVMGIVASASVQA)* использовались следующие модрлЫ:ио системы:

1. (2-Н2]-трифторэтанол (TFE)- создает гомогенное гидрофобное окружение;

2. додецилсульфат натрия (SDS)- образует мицеллы с отрицательно заряженной поверхностью;

3. додецелфосфохолнн (11) (DPC) - образует мицеллы с электрически нейтральной поверхностью.

Выбор таких модельных систем позволил оценить влияние границы раздела фаз и поверхностного мембранного потенциала на вторичную структуру

сигнального пептида.

Общее содержание различных элементов вторичной структуры в белковых молекулах можно оценить из спектров кругового дихроизма (КД) (Greeniield&Fasman, 1969). Данные КД показывают, что в гидрофобном окружении сигнальный пептид белка PhoE имеет вторичную структуру с высоким содержанием а-егшрали, которое зависит от окружения и уменьшается Р ряду TFE>SDS>DPC.

Определение вторичной структуры сигнального пептида методами двухмерной 'Н-ЯМР спектроскопии осуществлялось с помощью стандартом рроцедуры, предложенной Wuthrich. Идентификация спиновых систем отдельных аминокислотных остатков проводилась по данным спектров TOCSY, а определение последовательности по наличию в спектрах NOESY хпрвктсрпстпчних кросс-пнко.ч между СОСРДППТП! ПЧПЯО~1ГС\ОТ1ПЛ.ГГ1 остатками.

Вторичная структура сигнального пептида определялась на основе измерений ядерных' эффектов Оверхаузера между различными аминокислотными остатками, изменениям химического сдвига На протонов, а также по скорости преггон-дейтериевого обмена NH протопоа пептида в среде

' получен твердофазным синтезом D.Olshevsky (San Dipgo, CA, USA)

подвижных дейтеронов. Из сравнения спектров полученных в присутствии и в отсутствии 12-доксилстеарата (уширяющий реагент) следовало, что сппмльпый пептид погружен в гидрофобную область мицеллы, а" М- и С-копцевые аминокислотные остатки находятся на поверхности мицеллы.

На рис.11 показаны данные по протон-дейтерневому обмену, ш которых видно, что стабильность а-спирали сигнального пептида в состава мицелл понижена на С-коцце по сравнению с М-концом и вторичной структурой сигнального пептида в трифторэтаноле в целом.

15.

и)

в

и

1И1 (III

ш ц щ

ЧII в/10 IV10

»«И и/и )уМ

¿г

в «

Рас. 11. ЫН-На область 'Н-ЯМР МОЕБУ спектра сигнальной цоследрпательиостп РЬоЕ после инкубации в течение 28 часов в трифторэтаноле-Оз (А) в мицеллах додецвлфосфохолнЕаЯЬО (С).

Суммируя экспериментальные данные, можно сделать следующие «идтдц?

1. в мембранном окружении сигнальный пептид образует а-спнраль;

2. в отсутствии границы раздела между водной фазой и мембраной а-спираль начинается с И-конца и без разрыва простирается до С-конца;

8

9/12

3. в присутствии границы раздела между водной фазой н мембранным

окружением имеется разрыв в а-спирали, совпадающий с положением Glyl2; стабильность а-спирали на N-конце выше стабильности а-спирали на С-конце.

Разрыв а-сгшрали в середине сигнальной последовательности имеет, по-видимому, общий характер для бактериальных сигнальных последовательностей. Dee бактериальные сигнальные последовательности имеют п середине полиггептидной цепи такие аминокислотные остатки, как Gly или Pro (Gierasch, 1989), которые способствуют разрыву а-спирали. Положение этих ^"ино^нслотнму остатке" соотртстчурт центру липидиопг» бислоя.

'не. 12. Взаимодействия сигнальной последовательности с лнпндным бислоем.

Нами предложена следующая модель взаимодействия сигнальных юследовательностей с лкпндным бнелоем (рис. 12). Известно (Hol, 1981), что а-пираль имеет собственный электрический дипольный момент, который оответствуст разделению элементарного заряда тагкм образом, что N-конец аряжен положительно, а С-конец отрицательно (рис. 12). Лшшдш.ш бислой меет положительный дипольный потенциал с максимальным значением в ентре углеводородной области бислоя. Нетрудно видеть, что взаимодействие (игольных потенциалов я-спяраля и липидного бислоя энергетически выгодно ля N-конца и невыгодно для С-кокца полипептидной цепн, организованной в а-[траль. Это приводят к тому, что в центре бислоя а-снираль имеет1 разрыв, а габильность а-сшгралн fia N-когще выше по сравнению с С-концом. >собенности такого взаимодействия сигнальных последовательностей имеют 1Жное биологическое значение. В экспериментах с рядом мутантных

бактериальных сигнальных последовательностей было показано, что для обеспечения эффективной транслокации белков-предшественников а-спираль на С-конце должна быть конформационно подвижна и сохранять возможность конформационных перестроек вокруг аминокислотного остатка в центре сигнальной последовательньности (Nouwen, 1994). Наши данные показывают, каким образом липидный бислой способствует созданию таких условий.

Последовательность событий в процессе транслокации белка-предшественника можно представить следующим образом. Отрицательно заряженная поверхность мембраны за счет кулоновского взаимодействий притягивает N-конец сигнальной последовательности. Наличие гидрофобных аминокислот в сигнальной последовательности обеспечивает ее включение В углеводородную область липидного бнслоя. Этот процесс сопровождается формированием а-спирали. Внутренний дипольный потенциал липидного бнслоя способствуют разрыву а-спирали в центре сигнальной последовательности, соответствующему месту локализации Pro или Gly, и уменьшению ее стабильности па С-конце (рис. 12, левая панель). Конформациошшя подвижность С-конца позволяет сигнальным пептидам эффективно взаимодействовать с другими белками транслокациогаюго аппарата бактериальной мекбрань!. Внешний трансбнслойний потенциал (рис. 12, правая панель) стабилизирует а-спираль по всей полипептидной цепи сигнальной последовательности. Сигнальный пептид в виде ct-спиралп пронизывает лппидный бислой таким образом, что С-конец и присоединенная часть переносимого белка оказываются на внешней стороне мембраны. Природа канала, по которому транслоцнруетсй полипептидная цепь, пока еще не выявлена. По-видимому, канал образуется за счет нарушения бислойиой организации линндов, а также участия других белков.

3.Z3. Влшшие липидного окружения на вторичную структуру мптохопдрпальаой сигнальной последовательности.

Митохондриалыше сигнальные последовательности характеризуются большим содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков,

чередующихся по всей полипептадной цепочке. На основе анализа первичной структуры и данных КД было высказано предположение, что при контакта с лштдкым бислоем митохоидриальные шшальше последовательности образуют амфифильную сс-спираль (Von Heijne, 1986).

Митохондрналыше мембраны содержат уникальный фосфолнпнд -кардиолншш, который отсутствует в составе других мембран. Имеются основания считать, что КЛ специфически взаимодействует с жтс^елдриальнь^ш сигнальными последовательностякш (de KruijiJQ.

Аля выявления поли липилпп ПП ВЧЯИМОЛеЙСТПИМ С МЧТОТГОЯЛЛИПАЬИММП

сигнальной последовательности субъедшшцы IV цнтохромоксндазы (рге25) к еа локализация в различных лшшдных окружениях. Аминокислотная последовательность рге25 представлена в табл.7* . В качества модельных мембранных систем использовались следующие мицеллы:

1. из отрицательно заряженного додецплфосфогликоля (10);

2. кз цвнттер-ионного додецилфосфохолина (11);

3. '.'л додгццлфссфохолнна (И), содоргланщо КЛ.

Б гсд'зс?! окружения рге25 существует в виде неупорядоченной подпппяшдйой цопп. В пр.чсутспшн мицелл рге25 формирует укорядочоыиую структуру, спктгр ¡<Д которой указиЕсат на образованны с-спиргли ¡рис.13).

15

10

5

0

-5

10100 200 210 220 230 240 2 50

WAVSLENSTH (пп)

1 i .....

5 1 \

• 1

M

4, M

Рве. 13. Саектры КД сигнальной последователыгоеш рге25 в различных

окружениях. Сплошная шл ■ вода; ......— ■ ■ ^ .

точки - додецклфосфохслии (11) л- КЛ

' получен твердофазным синтезом А. de Kroon (Utrecht yniversity)

Согласно данным КД, в случае мицелл из додецилфосфогликоля и смеси додецилфосфохолин-КЛ вторичная структура рге25 характеризуется несколько большим содержанием а-спиральных участков по сравнению с мицеллами из цвиттер-ионного додецилфосфохолина.

Полное отнесение сигналов в спектрах "Н-ЯМР рге25 в составе мицелл из додецилфосфогликоля (11) представлено в табл. 7.

Таблица 7. Химические сдвига протонов рге25 в мицеллах из додецилфосфогликоля (11).

NH aH PH другие

Meti 4.17 2.19, 2.13 уСН2 2.74, 2.74; еСН32.12

Leuj 8.41 4.41 1.69, 1.69 уН 1.63, 6СН3 0.91, 0.91

Ser3 8.41 4.73 4.15, 3.90

Leu« 9.16 4.15 1.81, 1.81 уН 1.69, БСН3 0.98, 0.91

Args 8.88 3.91 1.88, 1.88 уСН3 1.72, 1.64; 6СН2 3.23, 3.23; с!^Н7.73; чИН 6.87

Gins 7.88 4.17 2.18, 2.15 уСН2 2.43, 2.43; Б!МН2 7.62, 6.91

Ser7 8.11 4.33 4.06, 3.95

ilea 7.72 3.89 1.99 уСН2 1.32, 1.32; уСН3 0.97; бСНз 0.88

Arg9 7.70 4.10 1.77, 1.77 уСН2 1.45, 1.32; 5СН2 3.09, 3.09; еЫН 7.38; ^ЫН 6.85

Phe10 7.81 4.46 3.14, 2.99 2,6Н 7.11; 3,5Н, 4Н 7.26

Phe„ 7.82 4.40 3.23, 3.13 2,6Н, 4Н 7.26; 3,5Н 7.15

Lysi2 8.61 4.30 1.95, 1.95 уСН2 1.59, 1.46; 6СН2 1.78, 1.78; ЕСН2 2.99, 2.99; 6ЫН3+ 7.82

PlOl3 4.36 2.37, 1.94 уСН2 2.17, 2.02; 6СН2 3.69, 3.69

Alau 8.21 4.23 1,48

Thr,j 8.08 4.26 4.12 уСНз 1.24

Aigie 8.12 4.14 1.95, 1.95 уСН2 1.71, 1.64; 6СН2 3.21, 3.21; ЕЫН 7.49; 6.85

Thri7 8.07 4.24 3.98 уСН3 1.18

Leun 8.25 4.17 1.84, 1.76 уН 1.70, 5СНз 0.92, 0.90

¡Cys„ j 8.25 | 4.3ñl~Ü)T?mí

! 8егл, ¡ Ü.16 I 'i.-15 ; 4.07, 3.08

SorTTI 8.09 4.44 I 3.99, 3.95

Ai g г: l 0.07

-i. 10 1 1.49, 1.49

yCH.i 1.38, 1.36; 5CHj 3.08, 3.08; r.N'117.43; i)Nl-¡ 6.85

2.bH 7.14; 3,'>í ¡ t>.

Leu24 7.78 4.22 I 1.73, 1.73

YH 1.55; ÔCH3 0.93, O.títí

/ ta 1 a

"» II t.r¿i

vri l.uj, WII.1 w..

CON Ha /.2U, 7.00

На формирование а-спнральных участков в полипептидной цепи рге25 указывали типичные для данной вторичной структуры связи между протонами Ha(iJ-HP(i+3J, Ha((J-NHfi+3J в спектрах NOESY. Кроме того, для рге25 были получены и полностью отнесены 'Н-ЯМР спектры в воде, что позволило

"."г гдп;;г:; Не: гг ;.-•_*'» о îjf-« prr'/л ;; подпсу. и т.т

,ifi-i j .ir-(H4iсд!'Д::';:'. <.'.;м",'оч ! lu протопоп по 'ui".:ï п ;K'y!:ujj:ï,v"r->niL '"тру кт yp о- отра;"щет распределение ,r,r,A структуры ао нолниетн ндио& цени. Пслн вяля'гпиа прслышасг 0,1 м.д., то это полет слутч.'пь доказательство;> участия аминокислотного остатка в формировании а-спирали.

--п.." í ! О '.О

.-..t-if .,,.) С, 1 "i b' 'Oí ЮЛЬ,!ОГ!,

I I

"0,2 +0.11

°'°ГП ВЩВВГШПГ I

: lirri'ir

Рис. 14. Зависимость изменения химических сдвигов "0 2 lííj'14 || Ц lj , Исс-протопов píe25 с мицеллах

-0 3 ■ П " ^ i их додецилфосфогликоля по

[1 сравнению с водой.

-0,4 ¡__________________________|

5 10 15 20 25 Номер аминокислотного остатка

Как видно из рис. 14, в рге25 стабильная а-спираль присутствует на N-конце пептида. В центре пептида, в месте локализации Pro 13, а-спираль разрывается и на С-конце стабильность а-спиралн понижена по сравнению с N-кокдом. Эти данные соответствуют наблюдаемым контактам между протонами Haf/;-Hpfi+3j и Kafij-NHfi+З; в спектрах NOESY.

Ддя исследования эффекта КЛ ца вторичную структуру рге25 было проведен сравнительный анализ вторичной структуры рге25 в мицеллах из додецилфосфохолина в присутствии и в отсутствии КЛ. Надейтерировашшй КЛ вводился в систему из расчета две молекулы 1$Л на одну мицеллу. Введение "в состав мицелл КЛ увеличивает содержание a-спиральиых участков в рге25. Причем, этот эффект в большей степени затрагивает участок вокруг Рго13 а С-конец пептида.

На основании полученных /./чютлг были предложены следующие структуры рхе25 в различных лшшдвых окружениях (рис. 15}. При взаимодействии с мицеллами рге25 образует структуру, для которой характерно высокое содержание a-сыарали. Ошралшость поляпептидаой цеш нарушена в районе локализации Pro 13 и Ser20. Это позволяет рге25 пркшггь такую коиформацвдо (рис. ISA), когда всеволожительно заряженные остатка находится по одну сторону пашвеящдной цепи, а гвдрофобпые заместители по другую. Введеииа КЛ стабилизирует a-сдираль, главным образом на С-копце, и одзлГйет рашогесиз в сторону образования структуры, изображенной па рис. S5B. Даикся структура, характеризуется изгибом в месте локализации Рто13, который обусловлен химической структурой пролива.

Рис.15. Вторичная структура рте23 в мембранном окружении в отсутствии (А) и присутствии (В) КЛ.

Образование амфифильной структуры разлившими шггохоцдрцаштмн сигнальными последовательностями било предположено ранее. Однаг.о, экспериментальные дашше по наблюдению таких структур в мембранах отсутствуют. Нами било проведено сравнение спектров 1Н-ЯМР рге25 в составе »щцслл а присутствии и отсутствии 12-докснлстеарата. Введение в углег.'одорол1Г/ю об\асть мицеллы уширяющего агента не оказывает заметного зффекп» па Met!. Arg5, Gln6 Лгд9, Lys 12, Лхц1б, Arg22. В тоже время, сигналы от остатков, локализованных на противоположной стороне поляпептидной цепи, пплппт-п утпипонм. В лшЬферешшаЛьЫМ СШКЦМг присутствуют енгаада ст этих остатков, которые погружены в гидрофобную область мицелл.

Известно, что транспорт белков а митохондрии проходит через зоны контакта между внутренней н наружной мембранами митохондрии. При контакте с мембраной сигнальная последовательность образует амфифнльную а-пшраль, расположенную на поверхности лшшдного бислоя (рис. 15А). Ззанмодейсгвие с КЛ, который присутствует во внутренней митохондриальной •••гмбраие. »ызыпдэт еднфоргоцнекиые вэкгишшя " структуре сигнальной '.оог'.'доаа-гсльпосп! (рнс.15В). CsenaTzriecrai эта ситуация показана на рис. 16.

ас. 16. Взаимодействие рге25 с мембранами митохондрий. Точками отмечены злогштельно заряженные аминокислотные остатки.

В результата, С-коисд опазивается обращенным гидрофобной стороной в >днун> фазу. Для исключения взаимодействия с водой С-хонсц енгашгтой

[дуцпрует образование вытянутой а-спиралп за счет взаимодействия с со

о

(следоватальностн погружштся в углеводородную область наружной пембрмгы, :особстпуя образованию контактных зон. Трапотембранпый потенциал

электрическим диполем, а также электрофоретическому движению положительно заряженной сигнальной последовательности (рис. 16, правая часть). Межмембранные контакты при этом нарушаются, что было показано в модельных экспериментах с моноламеллярными везикулами и рге25. Образованию контактных зон способствуют также особые свойства КЛ, который в присутствии положительно заряженных ионов образует небнслойные структуры (Cullis, 1979), что вызывает слияние мембран.

Выводы.

1. Разработаны методы синтеза и прлучены новые дейтерированные фосфо-, глнколипиды и детергенты. Изучены методы синтеза ФАТ и предложен подход позволяющий получать чистые препараты ФАТ. Разработаны методы синтеза новых полимеризуемых липидов, образующих высокостабильные полимерные мембраны.

2. Изучена гндратная оболочка мембран, построенных из фосфатндилхолинов и гликозилдиглнцеридов. Показано, что вода в составе гидратной оболочки гликозилдиглицеридов прочно связана с молекулами последних за счет водородных связей.

3. Проведено сравнительное исследование свойств фосфо- и гликолипидов с простой и сложной эфирной связью в составе мембран. Показано, что замена сложноэфирной связи на простую эфирную приводит к незначительному повышению температуры перехода Lp->La и понижению температуры перехода Ц,->Нц. Определен вклад карбонильных групп во внутренний дипольный потенциал липидного бислоя (порядка 100 мВ на одну С=»0 группу). Изучена конформация ФАТ в составе липидного бислоя н структура полимерных бислоев.

4. Изучено влияние интегральных мембранных белков на структуру липидного бислоя. Показано, что сигнальная последовательность вызывает переход бяслой-гексагональная фаза в мембранах. Необходимость полиморфного регулирования структуры мембран показана на примере Е. со//.

5. Действие фосфолнпаэы Aj на мембрану приводит к нарушению структурной целостности липидного бислоя, что увеличивает активность фосфолииазы. Активность фосфолипазы Aj может эффективно ингабирооаться липидамн с простой эфирной связью.

о. Методами ЛМР о п редела ¡¡и ЕТоричнаЯ структура бактериальных п

М1:т')лпндг:.11,-)Л1,11> гу ' ипм v.ri],:"". послед^огмтельнос той н мембранном flc.;cSaito, 'lio »> wtfjp 'Ином окружении зги пептиды образуют :; г; i;. урм. г.'.','.-. ери е сяючч'ч г.ыгог.нм содержанием rt-ешфа ibHUX ___i сгру/гура '-¡п •• : м. п.гх последовательностей зависит от

■ -.. < г 1 • 1 ■ í:^ ■ .'(Г ¡ •>:■'■ ■ i 5TÍьт";

последовательностей с мембранами. Нарушение бнслойной организации

м*-мии<1н ей» пстлпш.-чи »twwiww"« i ..........Г.

контактных зон, через которые происходит транслокацин белковых молекул. Липид-зависимые копформационные изменения а структуре сигнальных последовательностей способствуют их взаимодействию с другими белками транслокациоиного аппарата.

Автор выражает искреннюю благодарность проф. Серебренниковой Г.А.,

. " -г-гру,-' "■ с :'" "TI ГУ ,'. !!ГГХТ

....... , • ' г- ......,-, Г'- 'é : ;!1Г'"гс\1у! т»

......."'rr'írií'r're г д.чм.к-ч ¡>-iCí-п«*

¡с; -::!.■(■ pi'jyve,диссерл'ацик ujj,'.i;;;e/ii.i a следующих пу'мчклчп/'х:

1. Чушш В.В., Углсг.о'тп И.П., Бондаронко C.B., Василенко И.Д., Серебренников-.! Г.Л., Евстигнеева Р.П., Розсиберг Г.Я., Кольцова Г.Н. Изучение взаимодействия метгемоглобина с модельными мембранами ■методом спектроскопии 3|Р-ЯМР. // Бноорган. химия. - 3982. ■ Т. 0. ■ N 9. -С. ¡275-1280.

Ï. Озеришгаа О.В., Гейко Н.С., Нечаев АП., Чупин В.В., Серебренникова ГА., Евстигнеева Р.П. Модифицнровашшй метод стереоспецифтеского анализа триацилглнцеринов. // Химия природных соединений. - 1983. - С. 139-142.

!. Кольцова Г.Н., Морозом Г.М., Чупин В.В., Серебренникова Г.А., Розеиберг Г.Я. Водорастворимые производные декстрана для снижения сродства внеэритроцитарного гемоглобина к кислороду при сохранении кооператнвности связывания кислорода и способ их получения. // Авт. спид - 1983. - N 1047909.

«

4. Чупин В.В., Озсринина О.В., Нечаев А.П.. Гсйко Н.С., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П. Способ определения структуры триглицеридов природных и модифицированных жиров. // Авт. сайд. - 1983. - N 1024833.

5. Хабарова Е.И., Звонкова П.Н., Евстигнеева Р.П., Чупин В.В., Кулиш М.А. Синтез и свойства гидрофобных трипептидов. // ЖОХ. - 1984. - Т. 54. -Вып.4. - С. 938-945.

6. Чупин В.В., Малина Е.В., Ревенко И.В., Василенко И.А., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П. Синтез и использование тиофосфатидилхолина в исследовании мембран методом Э1Р-ЯМР. // Биоорган. химия. - 1984. - Т. 10.

- N 7. - С. 970-974.

7. Сабельников А.Г., Ильяшенко В.Н., Чупин В.В., Василенко И.А., Евстигнеева Р.П. Механизм CaJ+ зависимой компетентности бактерий: образование небислойных сгруктур липндов в клетках. // Докл. АН СССР. - 1985. - Т. 282. - С. 724-727.

8. Чупин В.В., Аникин М.В., Бондаренко С.В., Ушакова И.П., Серебренникоаа Г.А., Евстигнеева Р.П. Изучение взаимодействия фосфолипидных везикул с сывороткой крови методом 'Н-ЯМР // Виол, мембраны. - 1934. - Т.1. - N П.

- С. 1191-1194.

9. Sabelnikov A.G., Iliashenko В., Chupin V.V., Vasilenko I.A. The in vivo formation of nonbllaer lipid structure in E. coli membrane during the development at CaJ + dependence competence. // BBRC. - 1985. - V. 127. - P. 464-472.

10. Chupin V.V., Killian J.A., De Kruiff B. JH-NMR InvesUgallon phospholipid acyl chain order and dynamics in the gramicidin Induced hexagonal Hn-phase. // Biophysical J. - 1987. - V. 51. - N 3. - P. 395-407.

11. Чупин B.B., Серебренникова ГА., Туманян М.А., Синилова Н.Г., Дуплищева А.П., Аникин М.В. Способ получения липосом, содержащих сальмозан. // Авт. свид. N 1474938. - 1988.

12. Остапенко О.В., Чупин В.В., Серебренникова ПА., Евстигнеева Р.П. Иммобилизация змеиного яда на эпоксидированных силохромах. // Химия природных соединений. - 1989. * N 1. - С. 126-129.

13. Аникин А.В., Чупин В.В., Чудинов М.В., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П. Синтез фосфатидилхолинов с остатками способных к полимеризпции жирных кислот. // Биоорган, химия. - 1990. - Т. 16. - N 2. - С. 254-261.

4. Аникин А.В., Чупин В.В., Серебренникова Г.А. Синтез нейтральных липидов с акрилоильными остатками. Депонированная рукопись в ОНИИТЭХим. - 1990. ■ 565 ХМ-90.

5. Синилова Н.Г., Дуплищева А.П., Кирилличева Г.Б., Чупин В.В., Серебренникова Г.А., Туманян М.А. Изучение нммуномодулирующих свойств фосфолипидов. // Вопросы медицинской химии. • 1990. - Т. 36. - N 3. - С. 34-36.

6. Чупин В.В., Аникин М.В., Гусев Д.Г., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П. Сравнительное изучение динимики гидратного слоя мембран из фосфатидилхолинов диацильного, алкилацильного и диалкильного типа методом 'Н-ЯМР. // Биол. мембра!Ш. - 1990. - Т. 7. - N 7. - С. 770-778.

7. Шеманова Г.Ф., Постникова Т.М., Евстратова Н.Г., Чупин В.В., Аникин А.В., Морозова Н.Г., Серебренникова ГЛ. - Новый метод определения белков, специфичных к фосфорилхолину. // Ревматология. - 1990. - N 3. - С. U-14.

3. Чупин В.В., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П. Изучение фазовых переходов гликозилдиглицерндов с простой и сложной эфирной связью методами ДСК и 2Н-ЯМР. // Биол. мембраны. - 1991. - Т. 7. - N б. - С. 638-647.

). Аникин А.В., Чупин В.В., Аникин М.В., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П. Высокостабильные полимерные липосомы, полученные на основе диенсодержащего фосфатидилхолина. // Докл. АН СССР. - 1991. - Т. 321. -N 5. - С. 1103-1105.

I. Чупин В.В., Аникин А.В., Чудинов М.В., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П. Изучение взаимодействия фосфолипазы Аз с полимерными липосомами. Докл. РАН. - 1992. - Т. 326. - N 4. - С. 730-734.

. Чупин В.В., Аникин М.В., Серебренникова Г.А., Марголин Я.М., Крейнес В.М., Устьянцева И.М., Булгаков В.Г., Шальнев А.Н. Взаимодействие фосфолипазы Ai с мембранами. Влияние фосфатидилхолинов с простой эфирной связью на стабильность мембран и протекание фомпалятелыпяс процессов. // Биол. мембраны. - 1992. - Т. 9. - N 4. - С. 349-358.

. Anlkln M.V., Gordeliy V.I., Islamov A.Kh., Chupin V.V. 1 -Palmitoll-2-oleoyl-tnc-glycero-3-phosphocholine and l-0-hexadecyl-2-oleoyl-rac-glycero-3-phosphocholine membranes. Structural studles using neutron diffraction. // Communication of the Joint Institute for NucTear Research. - 1992. - E14-92-30.

23. Морозова Н.Г., Андронова И.Д., Новичков И.Д., Чупин В.В., Аникин М.В., Серебренникова ГА Синтез S-гликозилдиглицеридов с простой и сложно эфирной связью. // Биоорган, химия. - 1993. - Т. 19. • N 2. - С. 236-242.

24. Чудинова В.В., Захарова Е.И., Алексеев С.М., Чупин В.В., Евстигнеева Р.П. Изучение взаимодействия а-токоферола с фосфолипидами, жирными кислотами и их оксигенированными производными методом 3|Р-ЯМР-спектроскопии. Биоорган, химия. - 1993. - Т. 19. - N 2. - С. 243-249.

25. Чудинов М.В., Аникин М.В., Аникин М.В., Брагина НА, Чупин В.В., Серебренникова Г А Синтез фосфатидилхолинов, селективно меченных дейтерием. // Биоорган, химия. - 1993. - Т. 19. - N 2. - С. 250-261.

26. Чупин В.В., Клыков B.H.i Серебренникова ГА. Исследование методом 3,Р-ЯМР структурообраэования фосфатидилхолина алкильного типа и производных лизофосфатидилхолина. // Биол. мембраны. - 1993. - Т. 10. -N 2. - С. 204-211.

27. Чупин В.В., Аникин АВ., Серебренникова ГА Полимерные липидные мембраны: получение, свойства и использование, (обзор) // Биол. мембраны. - 1993. - Т. 10. - N 3. - С. 229-254.

28. Чупин В.В., Остапенко О.В., Клыков В.Н., Аникин М.В., Серебренникова ГА Образование структурного изомера фактора активации тромбоцитов при ацетилировании 1-алкил-5л-глицеро-3-фосфохолина. // Бяоорган. химия. - 1993. - Т. 19.-N 11. - С. 1111-1121.

29. Anikln A., Chupin V., Anikln М„ Serebrennikova G. Polymeric liposomes formed /гот a new phosphatidylcholine with terminal diene groups. // Makromol.Chem. - 1993. - V. 194. - P. 2663-2673. -

30. Аникин M.B., Дубовская С.И., Чупин B.B., Серебренникова Г.А. Удобный подход к синтезу тиогликозидных аналогов галактозилдиглицеридов. // Биоорган, химия. - 1993. - Т. 19. - N И. - С. 1102-1110.

31. Leenhouts J.M., Chupin V., de Gier J., de Kruijfi B. The membrane potential has no detectable effect on the phosphocholine headgroup conformation in large unilamellar phospatifylcholine vesicles as determined by 'H-NMR. // Biochim. Biophis. Acta. - 1993. - V. 1153. - P. 257-261.

32. Шеманова Г.Ф., Постникова T.M., Евсгратова Н.Г., Чупин В.В., Аникин А.В Морозова Н.Г., Серебренникова ГА Способ определения белков, специфичных к фосфорилхолину. // Патент Российской Федерации RU

20t4609 CI. - 15.06.94. - Бюл. N11. Положительное решение по заявке N 4943605/14 047951 от 06.07.1991.

33. Chupin V., Smirnova S., de Kruijff B. Synthesis and polymorphism of deuterium labeled unsaturated monogalactosyl diglyceride as studied by 2H-NMR. // Reel. Trav. Chim. Pays-Bas. - 1994. - V. 113. - P. 237-240.

34. Kitlian J.A., Trouard T.P., Creathouse D.V., Chupin V., Undblom G. A general method lor preparation of mixed micelles of hydrophobic peptides and sodium dodecyl sulphate. U FEBS Letters. - 1994. - V. 318. - P. 161-165.

35. Chupin V., van 4 Hof R., de Kruijlf B. The transit sequence of a chloroplast precursor protein reorients the lipids In monogalactosyl diglyceride containing bilayers. // FEBS Letters. - 1994. - V. 350. - P. 104-108.

36. Rietveld A.G., Chupin V., Koorengevel M.C., VVienk H.L.J., Dowhan W., de Kruijff B. Regulation of lipid polymorphism is essential for the viability of phosphatidylethanolamine-deficient Escherichia coif cells. // J. Biol. Chem. -1994. - V. 269. - N 46. - P. 28670-28675.

37. Морозова Н.Г., Коробова Т.Е., Аникин М.В., Чупин В.В., Серебренникова Г.А Синтез целлобиозилдиглицерндов с простой и сложной эфирной связью. // Биоорган, химия. - 1994. - Т. 20. - N 6. - С. 697-700.

38. Дубовская С.И., Аннкнн М.В., Чупин В.В., Серебренникова Г.А. Синтез дейтеромеченых диастереомеров глюкознлдиглицеридов. // Биоорган, химия. - 1994. - Т. 20. - N И. - С. 1242-1248.

39. Чупин В.В., Аникпн М.В., Чудинов М.В., Серебренникова Г.А Исследование мембран из фосфатиднлхолинов диацильного, алкилацильного, ацилалкмльного и диалхильиого типов методом спектроскопии 2Н-ЯМР. // Биол. мембраны. - 1994. - Т. 11. - N 1. - С. 89-98

40. De Kruijff В:, KiUian J.A., Vogt T.C.B., Rietvefd A.G., Chupin V. Plenary Lecture: Membrane organization and protein insertion. // XVlth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems. Veldboven. The Netherlands. - 1994. - P. 92.

41. Killian J.A., Trouard T.P., Greathouse D.V., Chupin V., Undblom G. A general method for preparation of mixed micelles of sodium dodecyl sulphate "With , hydrophobic peptides. // XVlth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems. Veldhoven. The Netherlands. - 1994. - P. . 146.

42. Chupin V., Killian J.A., Breg J., de Kruijff B. 2D NMR on the structure of PhoE signal peptide in micellar systems. // XVlth International Cohference on

Magnetic Resonance in Biological Systems. Veldhoven. The Netherlands. -1994. - P. 234.

'. Chupin V., Killian J.A., Breg J., de Jongh H.HJ., Boelens R„ Kaptein R., de Kruijff B. PhoE signal peptides inserts into micelles as a dynamic helix-break-faelix structure, which is modulated by the environment. A two-dimensional 1H NMR study. // Biochemistry. - 1995. - V. 34. - P. 11617-11624.

44. Sabelnikov A.G., Berjezkina N.E., Chupin V.V., Gongladze G.M., Borovjagin V.L. Structural changes in Escherichia coll membranes during bacterial conjunction. // Membr. and Cell Biol. - 1995. - V. 8. - P. 405-414.

45. Дубовский П.В., Аникин МЖ Дубовская С.И., Чунин В.В., Василенко И.А., Серебренникова Г.А. Сравнительное изучение методом 2Н-ЯМР свойств мембран, сформированных из О- и S-гликозилдиглицеридов. // Биол. мембраны. - 1995. - Т. 12. - N 3. - С. 310-320.

46. Chupin V., Leenhouts J.M., de Kroon A.I.P.M., de Kruijff B. Cardiolipin modulates the secondary structure of the presequence peptide of cytochrome oxidase subunit IV: a 2D 'H-NMR study. // FEBS Lett. - 1995. - V. 373. - P. 239-244.

47. Keukens E.AJ., de Vrije T.. van den Boom C„ de Waatd P., Plasman H.H., Thiel F., Chupin V., Jongen W.M.F., de Kruijff B. Molecular basis of glycoalkaloid Induced membrane disruption. // Biochim. Biophys. Acta. - 1995. - V. 1240. - P. 216-228.

48. Leenhouts J.M., Torok Z., Chupin V., de Kruijff B. A molecular model for the specific cardiolipin-presequence interactions (review). // Biochem. Soc. Transactions, - 1995. - V. 23. - P. - 273-282.

49. Chupin V., Leenthouts J.M., de Kroon A.I.P.M., de Kruijff B. Secondary structure and topology of a mitochondrial presequence peptide associated with negatively charged micelles. A 2D 'H-NMR study. // Biochemistry. - 1996. - V. 35. - N 10. -P. 3141-3146.

50. Gordeliy V.I., Cherezov V.G., Anikln A.V., Anikin M.V., Chupin V.V., Teixeira J. Evidence of entropie contribution to hydration forces between membranes. // Progr. Colloid Polym. Sci. - 1996. - V. 100. - P. 338-344.

51. Chupin V.V., Ostapenko O.V., Klykov V.N., Anikin M.V., Serebrennikova G.A. Or the synthesis of platelet-activating factor via acetylation of l-alkyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Formation of structural isomer of PAF in the presence of bases. // Chem. Phys. Upids. - 1996. - V. 81. - P. 25-43.