Взаимодействие тионина Pyrularia pubera с биологическими и модельными мембранами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАЛШЫ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ 0Д шл. акад. САДЫКОВА А.С.

| 5 ДПР '¡ЗЗ'} 7 ка ппавах рукописи

КОЛУШЕВА Саш ОЛЕГОЕН.1

УДК 577.1:615.918:615.919:577.335:577:336

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТИОНИНА РХКЯ4В11 ?ЦБШ £ БИОЛОГИЧЕСКИМИ И )ЮД№~ ': ':'-Л (ЖЕРАНДШ

Споциа.": ;ость 02.00.10 - Сиоорганическая химия, химия птпфодных и физиологически активных вещаств

АВТОРЕФЕРАТ диссер?ки;т на соискание" ученой степени кандидата биологических наук ^

-

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. акад. САДИКОВ А А". С.

на правах рукописи

УДК 577.1:615.918:615.919:577.335-.577:336

Ш!УШЕВА СОФИЯ СУШГОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТИОНИНА PYKULARIA PUBERA С ВИОЛОГИЧЕСгСИМИ И МОДЕЛЬНШИ КЕШЗРАНАЮ

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

.'ВТОРЕ Ф^Ё PAT

л

диссертации на соискание, учвноЛ сг^к.ж! кандидата биологических наук

Ташкент - ! 1

Работа выполнена в Институте биоорганической химии

им.

академика, Садакова,!ä.C. ÄH Научные'руководители:. "''"'

Официальные оппоненты:

РУ.

.'Л.

.':■'■ - 'Доктор' биоло'гичеЬкйх, нйук.'^йрйфе ссор Т.фГАрипов "" * ' ■ доктор биологических наук Б.А. Салахутдинов

доктор биологических наук, профессор A.A. Ахунов

доктор биологических наук У.З. Мирходжаев

Ведущая организация:

Институт биохимии АН РУ

Защита состоится

" С?£ " Ct^yi^^w ' 199 ty г. в ~~ часов на заседании Специализированного совета Д 015.21.21 Института биоорганической^химии им. академика Садакова A.c. АН РУ по адресу: 700143, Ташкент, проспект академика X. Абдуллаева, 83. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

биоорганической химии

Автореферат

Ученый секретарь Специализированного сс г.г'ктгр логических наУ»

им. академика Садакова A.C. АН РУ.'

разослан " Л2 " £. g iGЛ СЪ 199 9 г.

вэта

.gbi/CVi.

Н.И. Кярлм

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность_п£Облемы. Интерес к низкомолекуляршм полнпепти-дам растительного происхождения вызван тем, что многие из них являются 'действующим антибактериальным, ;антда^р^ным,!|ка1щ9роста- • тическим й к'анцеропрофидактическим и ' T.n.j нач^ломЧв ".Укстрактох различных частей растений, используемых в качестве лечебных и профилактических средств. К данному классу веществ, обладающих также токсическим действием на животные и бактерии, относятся и полипептиды - тионины. Этот класс включает высокоосновниэ полипептиды с молекулярной массой от 5 до 6 кД, выделенные из различных растительных организмов и обладающие рядом общих свойств, как то: антибактериальные и антиканцерогенные; . вызывающие гемолиз эритроцитов, активизирующие эндогенные фосфолипазы и др. До настоящего времени остается неясным вопрос о роли указанных полипептидов в растительном организме. По молекулярной массе и аминокислотному составу их трудно отнести как к структурным, так и к Функциональным элементам _астительной клетки, однако, предполагается, что их роль заключается в регуляторных и защитных процессах [Vernon et al., 19851. Поэтому, актуальным является, с одной стороны, изучение механизма токсического действия тионинов на различные клетки и субклеточные структуры животных и бактерий и, с другой, - их возможная роль в функционировании растительного организма. В случае выполнения тионинами защитных функций эти задачи практически перекрываются. Реализация биологических Функций тионинов и подобных им белков происходит через действие их на биологические мембраны. В то ке в;.:мя мембранотропные сг""йстеэ растительных полипептидов данного класса остаются практически неизученными, хотя рчдача подобного исследования может 'ыть значительно облегчена при использовании большого экспериментального и теоретического материала, полученного при Лучении м;х';.чиг:м';

мембранотропного действия голипептидов из ядов змий. Это подтверждается и тем, что в ряде исследований показано схожесть мест связывания белков класса тиошшов и цитотоксинов на биологических мембранах ÍKarlsaon, 1979;0aorlo е Castro, Vernon, 1989].

Для выяснения механизма мембранотропного действия тионинов необходимо использование как биелогических мембран, так и модельных систем. Использование модельных систем является важным для .однозначной интерпретации данных, полученных на . биологических мембранах. Основным моментом является выбор состава модельных систем таким образом, чтобы они отражали состав липидного мйтрик-са. нативных систем с целью. выявления места и характера влияния тионинов в животном и бактериальном организмах.

Настоящая работа представляет собой, часть фундаментальных исследований, проводимых в лаборатории физико-химических методов исследования Института биоорганической химии им. академика Садыкова A.C. АН, РУ в соответствии с постановлением ГКНТ. РУ по проблеме 2.28.8. "Структура и функция биологических мембран"-1991-1995 гг., Г.Р. 0I9I(j)023228. . .

• Цвль_и_задачи_иссле5ования. Целью настоящей работы явилось

изучение функциональных и структурных'изменений в биологических и

i

исскуственных мембранах, вызываемых тионином, выделенным из Pyruïarla púbera (Г тионином). В ходе исследования решались следующие задачи:•

. - анализ структуры полийептидов класса тионинов и построение их Филогенетического древа;

- исследование влияния Р тконина на энергетические параметры к/,отек животных, электрофизиолбгическую и Са^-АТФазную активности;

- установление и рыявлшпю'зависимости меморяггмэдифицируще-

--Г'?г>ил тигнина от лгатадно^о состава модельных систем;

I

--лрл-?m:<» кндуштровянного Г тионином п;\п"--<">!'и.ого ттпевра-

щения лшидного матрикса и изучение происходящих при этом функциональных нарушений биологических момбран (проницаемость, мек-мембранные взаимодействия); , . - изучение влияния Р тйонина на процессы'/фосфодипазноя .актив'-' нойта й пврекисного окисления -йипидйв;; ' ■'/■,•' ' » ' ■ исследование схожести механизмов мембранотропного действия Р тионина и цитотоксинов из яда среднеазиатской кобры.

Для решения поставленных задач были использованы методы ЭПР спиновых зондов и меток, ЯМР на ядрах 1Н и 31Р, дифференциальной сканирущей микрокалориметрии, полярографомвтрии, а также различные методы биохимического анализа.

Научная__новизна__я___практическая___значимость___

доследования^ Впервые проведен сравнительный структурный анализ мембраноактивных полипептидов двух классов - тионинов и цитотоксинов. Найдены уникальные аминокислотные последовательности в полипептидной цепии тиокинов, ответственные за присущие им функции. Построено эволюционное древо белков класса тионинов с уточнением их филогенетического родства, что позволит в дальнейшем прогнозировать свойства различных представителей этого класса, в случае, если будет изучен хотя бы один, например, Р тионин. Предложены модели вторичной укладки полщгаптидной цепи молекулы Р тионина и ее внедрения в липидный матрикс биомембран^, Впэрше получены данные по влиянию Р тионина на энергетические плраметрн клеток, на

о.

электрофизиологическую и Са -АТФэзную активности, что позволило более полно охватить эффекты биологического д^Яптння данного полипептида. Показано, что необходимым условием рзаимодойс.^ия Р тионина с мембранами является присутствие кислых липид'л, й'что в данных системах Р тионин индуцирует проницаемость мембран для ионов феррицианида, образование небислойных структур, ме'кмембранннй обмен липидным материалом. Впервые установлено, что при слроде-

б

леншх условиях тионин является синергистом действия экзогенных фосфолипаз и индукторов перекисного окисления липидов. Получены прямые доказательства схожести механизма действия растительного .тфсюй'тио'нина.- й> 1датЬток;синов1 :Ус1, 'jí,-.Vc5.'йэ ^да ¡ ср^дйёазиатской кобры. :;..' ■ i. ...'■.. '. j -ГГ"1"

Результаты работы позволяют выявить некоторые структурно-

С

функциональные аспекты механизма мембранотропного действия токсина растительного происхождения тионина, выделенного из Pyrularia púbera, и дополняют наши знания о роли полипептидов класса тао-нинов в растительном организме, а так же способствуют более эффективному использованию копмонентов растительных экстрактов е 'научной и медицинской практике.

Апробация работа. Материалы диссертации докладывались на Пэр-вой коьференции биохимиков Таджикистана, (сентябрь 1993), на 2-е» симпозиуме по биохимии клеточных- мембран, (Италия, сентябрь-октябрь, 1993), на Второй конференции биохимиков Узбекистан; (ноябрь 1993), на семинаре лаборатории физико-химических методо! исследования ИБОХ АН РУ (1990, 1993).

Публикации^ По теме диссертации опубликованы 4 статьи i научных журналах и тезисы 3 докладов.

Структура и об'ем работы. Диссертация состоит из введения

трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы

i

приложения. Диссертация представляет собой рукопись н 130 страницах, включает 31 рисунок, 4 таблицы. Список цитируемо литературы содержит 129 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В данной 4 главе проведен анализ работ, посвященш

Гиологичесгаш эффектам, ., вызываемым полипептидами груш

i

гпстпт^лышх токсгнсв - тионинов, и ерпвнительному авали:

действия тионинов и широко известных цитотоксинов из ядов змей семейства Elapieciae. В обзоре приведены также данные о порвичных аминокислотных последовательностях, данных-. лолипдптидов, их' вторичнпх • структурах и ос^от'гостяг'.<kpo¿mm. * рдаг 'й?* разделов литературного обзора включает - работы, - -посвященные' изучен;:*)

•г

биологических эффектов Р тионина, выделенного из Fyrularta púbera, в частности, его влиянии на мембранные функции различных клеточных систем.' В конце литературного обзора даотся обосновать перспективы и актуальности исследования токсинов различного происхождения и их специфичности.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Тионин, выделенный из Pyrularla pjbera, и его иодированная форма были любезно предоставлены профессором Л.Верноном из Brlgham Young University (США).

В работе использованы структурообразующие липиди: яичный фоефтгидилхолин (ФХ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилинозитол (ФИ) и кпрдиолипин (КЛ, - производства завода бактериальных препаратов (г.Харьков); димиристоилфосфтагдилхолин (ДШОС)', дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), и фосфатиднэя 'кислота (ФК) фирмы "Sigma" (США).

В качестве спиновых зондоц были пепользоклии 5-, 12- и 16-доксилстеариновые кислота (ДС), .и потенц^лл'.ур.ствителышй зонд. САТп производства фжфмы "Sigma"

Образцы озвученных" липосом и мульглт-лртллярних дисперсий готовили по стандартным методикам.

Определение термодинами" л ских параметров фазовых преср .¡опий гндратсгропшшых липидов проведены на дифференциальном ' •щглругщец мякрокаяориметре ДАСМ-4 при скорости записи 10C/i.nn¡. Спектры ЯУР рогдатр-.тювтли на спектрометре ХХ-?СО "VARÍ/."" «CUA». Сггектpi "ПТ* регистр;трорпга fin рздапепектр^'лтрпг Fó-í'C' 'ОТГ-i v

(ФРГ).

Биологические объекты выделяли по стандартным методикам. Перекисное окисление липидов индуцировали добавлением в образца. .•: ДР7?Ы 1-^Од.к2.зо|4м аскорбатш>• ■ О1, / ' глава з. Исследование' йаимодейстёия' тйонша \с '%ологи4хзкимй ■ и модельными мембранами

С .

Раз,дел_ЗЛ. посвящен анализу общих и уникальных фрагментов в первичной структуре полипептидов класса тионинов, определению их структурно-функциональной близости и построению их эволюционного древа, а также определению вторичной структуры Р тионина. (Работа проводилась совместно с лабораторией молекулярной биологии ИБХ АН РУП При анализе первичной аминокислотной последовательности белков семейства тионинов были обнаружены два фрагмента, характерный для большинства белков данного семейства - К5СС, наличие которого не является уникальным для белков только этого класса; и СКГК -являющегося детектором для отнесения полипептидов к классу тиони-' нов и отвественного за какое-либо свойство данных белков. .

С использованием "эвклидовых" расстояний [Парилис и др., 1991] между белками класса тионинов было построено эволюционное дрово данного семейства (рис.1), отображающее эволюционные взаимоотношения между отдельными белками. Видно, что наиболее

I

обособленными являются белки лиготоксин А и Р тионин, а остальные белки формируют три ¡эволюционные группы: 1-я -. злаковые белки, выделенные из растений; 2-я - злаковые белки, выделенные из культур тканей растений; 3-я - белки белой омелы - вискотоксины. Кроме структурного родства белки в каждой из.отдельных групп объединяет сходство сЬологичесгап эффектов.

Проведенный в данном разделе расчет вторичной структуры поли-

поптидной цепи молекулы Р тионина, проведенный по методу Чоу-

\

Тчсчяча с использованием компьютерной программы, показал, что она

f?i,oi и. It t> iiriix

■" A,or-ct roarijx

¿.tstxto-e . ,"'

V^iDOlf'.^¿i I ' < U oiDrtrtrt.

Xjisrar, ("Dioixe JDC43^

j^sar ("оготгв JDJ&-& i3, i/j-ion-irv

p7-*i-n, /7 ОЭТЛ-ЭТ, jr

jP-LbT D-iA-iprviil. «X-Я

Рис. I. Эволюционное древо белков^семейслтя типнтпв.

имеет тенденцию к образованию р-структурн. Н'( оснопо отого опали--за предложена модель упаковки, молекулы Р тионина и схема его возможного внедрения в липидный матрикс биомембран. Полученный в дальнейшем экспериментальный материал. По взаимодействию тиотша с природными и модельными биологическими мембранами подтверждает данную модель внедрения.

Р литературе предполагается. [Vernon et al.,' 19851, что токсический эффект действия тионина.связан с ого взаимодействием с мембранами клеток. Этот' фак? может носить двоякий характер, т.е. включать в себя .как белок-белковые,<>.так и белок-лшшошо взаимодействия. . Исследования, проведешшо на тимоцитах и •митохондриях по выявлении и:с функциональной

активности иод влиянием' тиотша показали, что полжтелтид в высоких концентрациях (I0~4-I0'JM) является ингиб. :ором дыхательной цепи и окислительного фосфорилирсвшгля и - мс-кбрпня митохондрий. Анпллз полученных данных ук'1знг,г1.,т ко яг,мук неспецифичность взаимодействия тионина с тимоцитлг/и и митохондриями, что монет гтроявляться только в случ'1>:

взаимодействия тионина не с мембранными белками, а с липидным матриксом мембран. Т.е. в данном случае мы имеем дело именно с белок-липидньм, а не с белок-белковым взаимодействием." По всей видимости доля каждого из типов взаимодействия зависит в большой степони от типа мембраны.

Результаты экспериментов, .гроводенных в работе методом ЭПР спиновых зондов • на эритроцитарной мембране показали что тионин вызывает возмущение мембраны эритроцитов только в приповерхностной области. Причина такого возмущения молекулами тионина липидного остова мембран эритроцитов может быть связана во-первых, с тем, что не все молекулы токсина из их оЛцого'количества связываются только с липидными компонентами; во-вторых, основная зона кислых липидов в эритроцитах (например, ФС) сосредоточена во внутреннем • монослое мембраны, что также уменьшает' количество мест связывания на поверхности мембраны за счет электростатических сил притяжения. Кроме этого, исходная структурная организация липидного матрикса мембран эритроцитов в значительной степени определяется большим количеством белковых

I

молекул и может значительно отличаться от липидного бислоя, сформированного из суммарных липидов, структура которого не "возмущена" присутствием белков.,На фоне этих "возмущений", вносимые молекулами тионина искажения в динамику и ориентацию молекул липида оказаться незначительными, что не позволяет э ¡годом-ЭПР.'-.у-

0:',цё*ы4, срайкенм..м$Ьт рецепции ■дионада ;и.1Щ1тр1?окс11нов' на оритронит'прной мембране были проведены эксперименты с питотоксинами Ус! и 7с5, показавшие, что данные полипептида также лгаь лрилфверхностную область мембраны, но с большей м/г.ногты". Различие в степени эффективности объясняется тем, ,. ,.,..-..^.1...,^ рддае лрэтяхзншю пуфоФсбнне участки

по их профилю могут регистрировать- их Ме

полипептидной цепи и это дает им возможность глубже проникать в липидный бислой.

Интерпретация результатов, полученных на биологичегасих мембранах, достаточно затруднена из-за наличия в мембране большого количества белковых комплексов и неоднородности липидного состава. В связи с этим целесообразно изучить действие тионина на модельные мембраны: липосомы и мультиламеллярные дисперсии, химический состав и физические параметры которых легко контролировать. В работе были сформированы модельные системы из основного структурообразующего липида ФХ с добавлением кислых липидов: ФС, ФИ, ФК и КЛ, которые встречаются в различных биологических мембранах.

На основании данных, полученных методом ЭПР спиновых зондов

Храздел_3^3.1), можно заключить", что молекулы тионина обладают на

всех исследованных образцах модельных систем разупорядачиванцим

действием на ориентаиуюнный порядок углеводородных цепей

фосфолипидов на уровне локализации нитроксильного фрагмента

спинового зонда 5- (приповерхностная область мембраны), 12-

(область середины ацильных цепей фосфолипидов) и 16-ДС (область

терминальных участков липидов монослоя) (рис.2 а, Ь, с). Степень

и характер возмущающего действия полкпептида зависят от липидного

С-

состава модельных систем. Кроме этого, во всех модельных системах при добавлении тионина наблюдается падении поверхностного заряда мембраны,- ,(рис:-2 (1). Полученные данные свидетельствуют q том, что пог^ужёниё гидрофобных участков погчпбПтиднОй цепи молекул; тио-нйна в липидный матрикс происходит на такую Шубину, что воимущч-ние pacrrç- страняется до терминальных участков ацильных цен«Я липидпп.

Результаты исследований, проведенных i.» данном рщде./:, СРП.-. •T'MbCTF.yiiT, О ТОМ ЧТО ÏH. JWKVJli 7Й0НИНЯ EWVjfcX'Zt.'SbZ :

1.50

1.30

1.10

0.90

0.70

2.00

°'^.ю'''Ш''''Ш''''Ш'"оЖ'"6Ло ......o.ôi......6.Ô2......о.бз......о.'бл

ct/ci Q

2.00

2.00

/ """»KL.

1.50; Z/3* «О«

^ я^ 3---a

1.00<$Г

.60 o'.iô.....' o.io

Ct/CI

-, Рис, ;2.' 'Зав

n.Jo O.05 0.(0 ;оЖ" aio'" оЪ

ct/ci

d

мсимор,ть изменения относительной величины упорядоченности'. зонда! 5гЛС.\:(а)';, . .величины ,*(,'Р.)-'С>.1АВЬ. зонда 12-ДС '<ь|; величины времени '"'вращательной корреляции хс/тсо, ¡зонда 16-ДС (с); величины зонда САТи (¡1) ^т ч.ч5Ц"нтрмщга тис|нина в липосомах различного состава. ; " ■■ 1! Те характеризуют степень подвижности

•.(•••» ь "'.иг.-лноЬ мембране; параметр к - распределение ■ -¡•••:\;,лд-?у!1Ств1пе.«-него ?оНда САТи между лшшдной и водной • -в ^»игккегги от заряда м мембране.

липосомами таким образом, что заряженные аминокислотные остатки мо-.екулы . полипептида электростатически . взаимодействуют с 'полярными фрагментами кислых липидбв, а гидрофобные участки полипептидной цепи внедряются в приповерхностный гидрофобный слой одного монослоя. Такая локализация молекулы тионина в мембране подтверждается и данными эксперимента с-использованием спинмечен-ного аналога тионина. ° • ■

Взаимодействие тионина с кислыми лигшдами приводит к нарушению 1 их распределения в.- ламеллярной фазе. Убедительные доказательства перераспределения "кислых липидов в толще мембраны под действием тионина получены методом ДСК. В разделе__3Л3^3Л про, демонстрировано влияние тионина на термодинамические параметры мультиламеллярных дисперсий состава: ДМФХ + гмол.^ФС,' ДМФХ + 2мол.%ФИ и ДМФХ + 2мол.:%КЛ. В "данных экспериментах контролировались: величина общей энтальпии плавления ДН, характеризующая ко-лич-|Ство липидов, участвующих в процессе плавления, величина полуширины основного фазового перехода ДТ1/г, харктеризующая коопэ-ративность плавления липидов, и форма линии плавления'.'

Анализ формы термограмм (рис. 3, 4) и изменения величины общей энтальпии плавления АН (рис. 5) показал, что в присутствии молекул ФС, при добавлении тионина наблюдается ярко выраженное образование кластеров, т.е. мембрана представляет собой участки липидов свободные от действия белка и у-частки, состоящие из мрле^ул • тионина,•.'•• обогащенных- молекулами . ФС. В . системах, молвкулЦ-'' тио'ййна в.;, кластерах;,', -обогащены как молекулами 'КЛ, так и молйкуло;ли'ФХ. "

Иодирование тиснина по тирозиновым остаткам .фиводит к потере данным белком всех свойственных ему токсических эйчктсв Г0эог1о е Гя??гго, Уэгпоп, 1989]. Кодированная молекула тионкнй в нзхих экспериментах также не вырывала образования к.-астор^в, Что указы-

а, 5 • 'с

Рис. 3.

Термограммы плавления мульти-ламеллярной дисперсии ДМФХ+ . Змол.ЖКЛ в присутствии возрастающих концентраций тионина

2.4,2

Рис. 4.

Термограммы плавления мульти-ламеллярной дисперсии ДМФХ+ ймол.ЖФС в присутствии возрастающих концентраций тионина

Рис. 5. Изменение относительной величины общей энтальпии плавления ДН/ЛНо от концентрации тионина в различных липидных системах

оч%,5о "'¿¡.'¿И'' -о.Чо'"'¿>.'15''"¿.'¿о" ..

■ Ь; к. .: С1/с( л .

-.»"¡клэстёрйзащф -д-ух; ^^^«лрт^шх-^ствхнов ти-

чр^зит.1; Эксперименты с иодированной- формой тионина, но выявили • нарушений в функционировании тимоцитов и митохондрий, что моют объясняться такжь и отсутствием способности полипептида к лшид-ной кластеризации. Следовательно, модель ьзаимчдействии тионина с липидннм матриксом, предложенная нами в разделе 3.1., не рас-

пространяется на его иодированную форму.

На основании полученных данных можно сказать, что специфичность взаимодействия тионийа с различными кислыми' липйдами,проявляется в характере возмущений лишцного, матрикса. Возможно различие в микроокружении связанного с липидами белка определяет различный отклик биологических систем на присутствие тионина. В дан-

ч

ном процессе, по-видимому, активное участие принимают аминокислотные остатки тирозина.

Перераспределение кислых липидов, в особенности тех, которые

с

способны образовывать в чистом виде небислойные структуры, может приводить к полиморфным превращениям с образованием 1 макроструктур, отличных по своим свойствам от бислойной упаковки. При этом образующиеся структуры могут отвечать •за большое количество биологических эффектов, таких как: барьерные свойства мембраны, процессы межклеточных взаимодействий, а также изменения субстратной специфичности для. различных эндогенных ферментов, в частности, фосфолипаз (Зиятдинова, 1991I.

Индуцированные полиморфные превращения в работе изучены методом 31Р-ЯМР - спктроскопии (раздел 3.3.4.).

Выло исследовано влияние симметрично распределенного тионина на мультиламеллярные дисперсии состава: 80мол.%ФХ + 20мол.И>С, 80мол.ЖФХ + 20мол.56ФИ, 80мол.ЖФХ +' 20молХФК. 70мол.Ж + ЗОмолЛКЛ. Концентрация тионина в образцах составляла, по отношению к общему/липиду,. 1мол.. : БОмол. Во всех системах тионин

erintàÀà; при. О ^¡ сбиде'тельствует 0Й'\Ьбраз0ва№ ЛишДами' "небислойвых";! (изотропных) структур. ЯМР исследования данных образцов с использованием методики DANTE показали, что тионин не проявляет определенной специфичности, q точки зрения полиморфизма, к какому-либо определенном^ кислому литшду.

Как-отмечалось Еыше, образование изотропных структур Б толще Сислойной фазы может приводить к изменению таких процессов как проницаемость мембран и их слияние. -Изучению влияния тионина на эти процессы посвящен следующий раздел работы (раздел 3.3.5.).

Метод 'Н-ЯМР, с использованием ионов парамагнитных металлов, в качестве сдвигающих агентов," позволяет '.исследовать проницаемость мембран для парамагнитных ионов, при «видении которых наблюдается сдвиг сигнала тршетапамыониевой группы молокул ФХ внешнего монослоя в сторону высоких полей. Изменение параметра Д5, характеризующего разницу химических сдвигов сигналов лссНзэ3-групп ФХ внешнего и внутреннего монослоев, показало (рис. 6), .что наиболее устойчивой к тионлну, с точки зрения проницаемости, является система, содержащая Бмол.ЯФИ. А .липосомы, содержащие БмолЛКЛ, 'становятся полностью проницаемыми для ионов феррицианида под действием тионина.

Ри'с. 6. Временная зависимость изменения относительного значения величины хим.сдвига Д6/Дбо в образцах различного состава 95мол.ЖФХ+5мсл.Я СС

(□); ФИ(*); клю). Стио/Слип

1мол : БОмол. Сдвигающий реагент - К,Р«сСЫ:>в.

.чШсокйе^мембраноакхив'ше ''свойства тионина и характц ого локализации в лилидном матриксе может приводить к изменению межмнмЗрпшшх взаимодействий. Эти взаимодействия включают сближение момбран, обмен липидами. с последующим возможным слиянием двух мембранных систем. В работе проведены

эксперименты с целью обнаружения. двух первых эффектов, которые можно наблюдать в рамках метода ДСК.

'• Для регистрации процесса-''обмена липидными молекулами между двумя бислойными системами были проведены эксперименты на двух популяциях липосом: ДМФХ + 2мол.ЖФС и ДПФХ +■ 2мол.ЖФС. Каждая популяция липосом имеет различную температуру фазового перехода й, при механической ' их смеси, °на- термограмме плавления регистрируются два пика фазового перехода с Тп1 = 24,15°С и Тп2 = 39,35°С. При неоднократном повторном сканировании положение максимумов, пиков практически не меняется. Однако, добавление тионина в молекулярном соотношении токсин : липид = 1:50 (рис. 7) ,приводит к сдвигу значения Тп2, высокотемпературный популяции липосом, в область низких температур, что свидетельствует о межмембранном обмене липидным материалом.

4

3 • 2 V

• . ¿¿' ■ ■ ■ . ъо ~Ш : 1 Г '

Рис. 7. Термограммы плавления популяций липосом состава

ДМФХ+2МОЛ. *ФС И ДПФХ+2МОЛ.ЖФС В ' присутствии тионина Стио/Слип

1мол : БОмол. I, 2, 3, 4 - первое, второе, третье и четвертое

сканирование ,• соотвественно.

Такко же результаты были получены и на системах, содержащих 2мол.Ж ФИ и КЛ. Таким образом, можно заключить, что тионин проявляет способность вызывать в образцах двух популяций липосом меж-мембраккый обман липидными молекулами,который является необходимым этапом процесса слияния мембран.

В клетке роль мембранных модификаторов принадлежит, в основном, фосфолипазам и перекисному окислению липидов ( ПОЛ). В свою очередь, наиболее удобным субстратом для эндогенных фосолипаз, в отличие от исходной бислойной упаковки, являются небислойные структуры лшшдного матрикса. Экспериментальные данные, получен-ше методами биохимии и 31Р-ЯМР-спектроскопии (р§ЭДеле_3.4. >» однозначно демонстрируют взаимосвязь между белковыми ( тионин и цитотоксины Ус1, Ус5) мембранными модификаторами и природными мамбраномодифицирущими процессами. Также методом 31Р-ЯМР спектроскопии показаны ■синергетические, по деструкции бислойной фазы, свойства тионина по отношению к фосфолипазе кг и индукторам ПОД. Эффективность фосфолипазной активности как экзогенных, так л эндогенных фосфолипаз в присутствии тионина, как установлено в работе, зависит от типа кислого липида. Этим фактом, по всей видимости, можно объяснить, что фосфолипазная активность на клетках сильно различается от типа последних.

Таким образом, анализ экспериментальных данных, полученных в работе, показывает, что тионин способен вызывать образование .¡кла'с^ерэн ки.&лых'.^липидов ИТ полиморфных структур, изменагь бврйсте^-'.' ;Ы9мбраш;'=' увеличивая • ее' "-щюшщавйэсть, актиыровать экзогенные, фосфолип_зу Аг и индукторы перекисного окисления . лш-Шов. Все эти эффекты свидетельствуют о сольсом вкладе ,6йлок-липидных взаимодействий в реализацию биологического :чК<-кта растительного полипептида Р тионкпа.

Б ЗДКдаЧгЖЛ представлена взаимоеЕ.л31. а результате:-:

диссертационной работа, показывающих регуляторную роль мембрано-_активных полипептидов в зависимости от липидного состава, с некоторыми биологическими эффектами полипептида растительного происхождения тионина, выделенного из Pyrulanta púbera. ВЫВОДЫ •

1. Впервые проведен сравнительный анализ первичных последовательностей полипептидной'цепи тиониг.ов и цитотоксинов. Полученные данные позволили построить более полное эволюционное древо растительных токсинов. Предложена модель пространственной укладки по-лзшептидной цепи тионина", выделенного из Pyrularla púbera.

2. Впервые показано, что тионин в концентрациях Ю-3 - Ю-л М

ингибирует энергетические параметры тимоцитов и митохондрий; не

р.

влияет на функциональную активность Са -АТФазы саркоплазматичес-кого ретикулума и -резко снижает до О, в концентрациях Ю-9 -10"®, мембранный потенциал нервно-мышечного препарата лягупки.

3. Тионин в системах, содержащих кислые липиды, индуцирует ионную проницаемость за счет образования дефектов в липидном матриксе. Кроме того, наблюдается образование неб'ислойных. структур, ответственных за многие биологические процессы. Необходимым

условием взаимодействия тионина с мембранами является присутствие

»

кислых липидов.

4. Впервые показано, что в модельных системах, содержащих кислые липиды, молекулы тионина способствуют межмембранному обмену^ л^дов,-являющемуся необходимым этапом в процессе слияния

j';. tó^Cpamrojc Систем.' ' . 'VJ■"•'."■'■ - . ■<'-'б. Тионий является синергистом действия экзогенных фосфолипаз и индукторов перекисного окисления липидов, способных приводить к полной деградации липидного бислоя, с образованием различных по характеру неоислойных структур.

в. Продемонстрирована схожесть механизма действия раститель-

ного токсина тионина и цитотоксинов Vcl и Vc5 из яда среднеазиатской кобры. Различная эффективность мембранотропного дейстеия ¿: ч. ■ • ' ■ 1 •• • ¡ ■ 1

исследуемых:токсинов связана с протяженностью гидрофобных участков полипептидной цепи,.способных проникать в гидрофобную область мембраны. ¿ » ~ ,

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Гасанов С.Э., Колушева С.О., Салахутдинов Б.А., Бекназаров У.М. ¿ Арипов Т.Ф. О механизме совместного мембранотропного действия цитотоксина Vo5 и фосфолипазы кг// ДАН УзССР. 1991.- N 9.- С. 44-46.

2. Гасанов С.Э., Колушева С.О., Арипов Т.Ф. 'Перекисное окисление липидов в мембранах, модифицированных фосфолипазой кг

■ и цитртоксином из яда кобры// ДАН РУ. 1991.- N 10. с.41-43.

3. Колушева С.О.,' Салахутдинов Б.А., Арапов Т.Ф., Верной Л.П. Исследование мембранотропных свойртв растительного токсина тионина, выделенного из p'yrularia púbera// Химия природ, сое дин. 1993-.- Ы 4. с. 594-598.

4. Колушева С.О., Салахутдинов Б.А., Арипов Т.Ф., Верной Л.П. Влияние тионина на структуру бислоя и межмембранный обмен липидным материалом// Химия природ, соедин. 1994.- N I.- с. 78-82.

Б. Колушева С.О., Камаев Ф.Г., Салахутдинов Б.А., Арипов Т.Ф., Вернон Л.П. Влияние тионина на активность фосфолипазы'кг// -Нарвой '"..конференции . биохимиков Таджикистана, ^ : '■ •ií'f'.^j---' V ;

г. s.o. Kolusheva,, F.G. Ka..aev,' в.A. Salachutdinov, Т.F. Arlpov, L.p. Vernon Membraneactlve properties of P thlonin // Тезисы .^докладов 4-го сипозиума по биологии клеточных мембран, Бари'(Италия), сентябрь-октябрь, 1993.

7. Парилис И.И., Колушева С.О., Салахутдинов Б.А., Арипов

Т.Ф. Компьютерный анализ белков семейства тионинов// Тезисы докладов конференции биохимиков Узбекистана, Ташкент, ноябрь 1993. Ташкент. 1993.- С. 161.

Pyrularia púbera тиониннинг биологик ва моде, иембраналари билан У зеро таъсири

Спектроскопия ва микрокалориметрия усуллари ёрдамида Pyrularia púbera усимлигидан олинган тионин номли полипептиднинг биологик ва модел систеглаларининг липид матрикси билан' таъсирлашуви Урганилди.

Тиониннинг зах,арловчи таъсири унинг липиди бор системаларга киладиган куйидаги галаёнли таъсири билан богликлиги курсатилди.

ФС, ФИ, ФК ва КЛ каби нордон липидлардан ташкил топган мембраналарда тионин иштирокида эндо- ва экзоген фосфолипазалар учун субстрат булиб хиЪмат килувчи турли бикатламли булмаган структуралар (угирилган'мицеллалар) х,осил булиши мумкин. !

тионин бикатламли булмагач структуралардан ташкари л'амелляр фазада х,ам дефектлар найдо булишини тезлаштирлди. Бунинг натижасида липидли бикатламнинг турли иоиларни утказиш кобилияти Усади, бу эса, уз навбатида, эритроцит ва бопща хужэйралар.да кальций гомеостазининг бузилишига сабаб булиши мумкин.

Тионин нордон липидлар поляр "богачаси"нинг кандайлигига караб турли таркибли кластерларни х,осил булишига олиб келади, яъни мембрана бу - ок,сил таъсиротидан х,оли бул^ан жойлар хамда ануляр' липидлардир. ь

Тионин молекулалари мембраналарнинг кушилиши жараёнида зарур боскич хисобланган мембраналнларо липид алмашиниши ишга туширади.

Олинган натижалар мажмуаси тиониннинг зах,арлови таъсирини тушинтйриб беришга хизмат килади, бу эса, полипептидглнг усимлик танасидаги вазифаси усимликни х;имоялашдан иборат- дейишга асос булади. х

Elapledae оиласига мансуб илснларнинг заг,зридан олинган цитотоксин вя тиониннинг богловчи кисмининг ухшашлиги хамда тионин молекуласининг бирламчи ва иккилемчи отруктурасини |{о?.1П1.«5терда анализ килиш натижаси асосидя полипептиднинг липид мэтриксида жойлагжш - модели . таклиф килади. Тиочин мемсряманинг

сиртга якин гидрофоб кисмини сезиларли даражада узгартириши мумкин, бунда хилма хиг мусбат зарядланган аминокислота цолдиклари ,бирламчи липидли каватда. бузилишларга олиб келувчи поликатионлар ролини уйнайди.-.

Биологик мембраналарнин хар хил ф^сфолипиддан ташкил тонган таркиби мембранага нисбатан фаол псишептидлар билан таъсирлашида куда куп липид структураЛарнинг мовжуд булиши мумкинлигини аниклайди.

Бу ишнинг башррилиши натижасида липидларнинг шундай мух,им хусусиятлари аникландики, уларнинг, мембранага нисбатан фаол полипептидларнинг таъсири остида биологик мембраналарнинг ишЛоЛида намоён булиши эх,тимолда.. холи эмас.

The interaction oX the thionin Pyrularia pubera with biological and model membranes

By spectroscopy-and mikrocalorimetry methods various aspects •of the interraction of the plant polypeptide thlonln from Pyrularia pubera with lipid matrix of biological and model systems have been studied. The charactor of puberant action of thionin on the membranes depending on their lipid content was observed.

It was shown that mechanism of thionin toxic action 3s connected with the following puberant actions of polypeptide on lipid system.

In membranes, containing acid lipids: PS, PI, PA and KL in the presence of thionin various nonbylayer structures (Inverti]ed mycells), which are substrates for the action of endo- and exogen phosphollpa3e3 could be formed.

Besides nonbylayer structures thionin induces the formation in lanellar phase de.'icts, as a result of which the penetration of LJpid'bylayer for varions ions Increases, which coould be the ijSS^çij.Ôf, Ça1?;- homeostasis -disturbance in erythrocytes,.and other

In the presence of '.-'.eicl lipids, depending on the type of polar "head", thionin causes the formation of the various by the content olasten , that Is, membrane presents the zone:-, froe form the action of the protein arid anular lipids.

Thlonln molecules induce Intenneubrane exchange! by lipid material, which Is the necessary step In the procv№. of membranes

fusion.

Combination of the given data is the basis of thionin tone action, which, evidently, determines the protective role of polypeptide in the plant organism. ; : f

Owing to the similarity of the places of binding of thionine and cytotexlns from the venonjs ol the- snakeB Elaptedae family, and also computer analysis of the primary and-secondary structures of thionine molecules, the model of the polypeptide localisation in lipid mitr}x hat been suggested and the proposal was made that thionin could essentially change nearsurface hydrophobic area of the membrane, and numerous positively charged aminoacid residues play the role of polycationes, leading to the dramatic changes of the initial lipid ^cover. ,

"ather numerous phospholipid content of biological membranes predetermines the possibility of the existence of the wide number of lipid structures during interraction with membranoactive polypeptides, n .

As a result of the present work the important properties of the lipids them selves have been determined, welch, probabiy, ary developed at the functioning of biological membranes, under the action of membranoactive polypeptides.