Взаимодействие синтетического поликатиона поли-(N-этил-4-винилпиридиний бромида) с модельными белково-липидными мембранами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОК. РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗЬ. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСи

_ГГЕ Од

Химический факультет 7 ' 'РО

На правах рукописи УДК 541.183.24+541.64+577.150.4

КОЗЛОВА Наталия Олеговна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПОЛИКАТИОНА ПОЛИ-(1Ч-ЭТИЛ-4-ВИНИЛШ1РИДШШЙ БРОМИДА) С МОДЕЛЬНЫМИ БЕЛКОВО-ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ.

(02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2000

^РИГ выполнена в лаборатории полимеров для медицины и биотехнологии кафедры высокомолекулярных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

академик, профессор В.А.Кабанов кандидат химических наук Н.С. Мелик-Нубаров

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор A.B. Левашов доктор химических наук A.A. Литмановнч

Ведущая организация:

Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля

Защита диссертации состоится

2000 г. в /г ч на

заседании диссертационного совета Д 053.05.43 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу

119899, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

/Я

Автореферат разослан " " 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета я . /

кандидат химических наук А.А.Миронова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Синтетические полиэлектролиты широко исследуются в настоящее время как потенциальные эффекторы целого ряда биологических процессов и носители для доставки лекарственных веществ. Детальное изучение механизмов их влияния на клеточные | мембраны позволяет объяснять, а в ряде случаев - и предсказывать последствия взаимодействия полиэлектролитов с биологическими объектами. Использование модельных моноламеллярных везикул -липосом, состоящих из нейтральных и отрицательно заряженных липидных компонентов, позволило изучить структурные перестройки, вызываемые адсорбцией поликатионов на их поверхности. В частности, было обнаружено, что адсорбция поликатионов на отрицательно заряженных жидких липосомах вызывает образование липидных кластеров, обогащенных отрицательно заряженными липидами, и трансбислойную миграцию анионных липидов с внутренней стороны бислоя на внешнюю. Плазматические мембраны реальных клеток содержат существенное количество нелипидных компонентов, среди которых наибольшая доля принадлежит белкам. Однако, данные о закономерностях взаимодействия полнкатионов с мембранными белками в имеющейся литературе весьма отрывочны. Мало изучены проблемы обратимости такого взаимодействия, механизмов возникновения структурных изменений белок-липидной мембраны и влияния поликатиона на функциональную активность белка. Кроме того, практически неосвещенным остается вопрос о том, какие именно мембранные компоненты являются мишенью действия поликатионов при их адсорбции на мембранах реальных клеток. В связи с этим, следующим шагом в изучении взаимодействия поликатионов с модельными мембранами является встраивание в бислой липосом модельного мембранного белка и исследование закономерностей связывания поликатионов с такими белок-липидными везикулами.

Цель работы состояла в создании модельной белково-липидной системы на основе моноламеллярных липосом из фосфатидилхолина и искусственно гидрофобизованного белка - сс-химотрипсина и изучения взаимодействия синтетических поликатионов с такими протеолипосомами. В работе исследовали:

• изменения каталитических свойств и конформа'ции сс-химотрипсина, вызванные модификацией белка остатками стеариновой кислоты и последующем встраивании гидрофобизованных молекул в липидный бислой;

• закономерности адсорбции поликатиона поли-М-этил-4-винилпиридиний бромида на поверхности белково-липидных везикул;

• конкуренцию между встроенными в липосомальную мембрану отрицательно заряженным липидом - кардиолипином и гидрофобизованным а-химотрипсином за связывание с поликатионом;

• влияние адсорбции поликатиона на проницаемость отрицательно заряженных липидных и белок-липидных мембран по отношению к низкомолекулярному электролиту и незаряженным молекулам противоракового антибиотика - доксорубицина.

Научная новизна. В работе впервые показано, что связывание гидрофобизованного белка с липосомами резко ускоряется при обработке белково-липидной суспензии ультразвуком. На основании полученных данных можно полагать, что при встраивании модифицированных белков в липидную мембрану важную роль играют количество и взаимное расположение остатков жирной кислоты на их поверхности. Обнаружено, что активность модифицированного а-химотрипсина, сниженная в результате гидрофобизации, после его встраивания в липосомальную мембрану восстанавливается до уровня нативного белка. Показано, что поликатион - поли-Ы-этил-4-винилпиридиний бромид адсорбируется на поверхности белково-липидных везикул за счет электростатического взаимодействия с карбоксильными группами белка. Обратимость взаимодействия и вызываемая поликатионом латеральная агрегация белковых молекул определяются белок-липидным соотношением в мембране. Впервые обнаружено, что в случае, если в мембране присутствуют отрицательно заряженные липиды и белки, более предпочтительным оказывается связывание поликатиона с липидами. Показано, что адсорбция поликатионов на отрицательно заряженных липидных и белок-липидных мембранах приводит к изменению пассивной проницаемости бислоя по отношению к незаряженным молекулам доксорубицина. Этот эффект, по всей видимости, обусловлен структурными перестройками в мембране липосом и протеолипосом под действием поликатиона.

Практическая значимость. Полученные результаты имеют принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия синтетических поликатионов и био-активных веществ на их основе с клеточной мембраной.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной конференции студентов и аспирантов "Ломоносов-98" (Москва, Россия, 1998), Int. Seminar "'Liposomes and related structures" (Szklarska Poreba, Poland, 1999), Int. Conférence "Lipid and surfactant dispersed systems" (Москва, Россия, 1999), tnt Bunsen Discussion Meeting "Interactions of biopolymers vvith model membranes" (Halle. Germany, 2000). "

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных

работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, методической части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из ^/¡¡/ссылок. Диссертация изложена на /¿^страницах машинописного текста, содержит ./¿рисунка и ^таблицы.

Во введении дано обоснование актуальности работы и указаны ее цели и задачи.

В литературном обзоре проведен анализ имеющихся данных о структуре биологических мембран, влиянии полиэлектролитов на функционирование и структуру природных мембран и модельных систем. Обсуждаются факторы, определяющие устойчивость

интерполиэлектролитных комплексов, образующихся при взаимодействии линейных полиэлектролитов с противоположно заряженными нолиэлектролитами, белками и липидами, встроенными в состав твердых и жидких липидных бислоев.

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования.

Для получения модельного мембранного белка аминогруппы а-химотрипсина модифицировали Ы-гидроксисукцинимидным эфиром стеариновой кислоты в водном растворе дезоксихолата натрия в присутствии 10% диоксана, рН 8,5. Был получен ряд препаратов каталитически активного модифицированного белка с содержанием гидрофобных остатков от 2 до 12.

В работе были использованы следующие катионные полимеры: статистический сополимер Ы-этил-4-винилпиридиний бромида и 4-винилпиридина состава 95/5 мол.% (ПЭВП), степень полимеризации ПЭВП составляла 1000 и 2000, и поли-Ь-лизин, со степенью полимеризации 75.

Моноламеллярные липосомы из чистого яичного лецитина (фосфатидилхолина - ФХ-липосомы), смеси яичного лецитина и кардиолипина в различных соотношениях (КЛ-липосомы) получали обработкой ультразвуком суспензии мультиламеллярных липосом. Встраивание гидрофобизованного белка в ФХ-липосомы проводили, обрабатывая смесь липосом и гидрофобизованного сс-химотрипсина ультразвуком в мягких условиях, а также методом диализа детергента. Полученные белково-липидные везикулы - протеолипосомы - отделяли от невстроенного белка гель-фильтрацией. Средние размеры использованных в работе моноламеллярных везикул составляли: 50-70 нм для КЛ-липосом, 100 нм для ФХ-липосом и 130-180 нм для протеолипосом.

Размеры липосом и их агрегатов определяли методом квази-упругого рассеяния лазерного света. В работе также использовали методы флуоресцентной спектроскопии, потенциометрического титрования, гель-проникающей хроматографии, кондуктометрии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Получение протеолипосом.

В качестве модели мембранного белка нами был выбран водорастворимый фермент — а-химотрипсин, ковалентно модифицированный 1Ч-гидроксисукцинимидным эфиром стеариновой кислоты. Из данных литературы известно, что подобная модификация повышает сродство белка к бислою. В то же время, мало изучено влияние липидного окружения на каталитические свойства и конформацшо искусственно модифицированных белков, а также условия, определяющие прочное связывание таких белков с липидной мембраной. Недостаточно исследованным является также вопрос влияния степени модификации а-химотрипсина на его свойства в водном растворе.

1. 1. Влияние модификации а-химотрипсина остатками стеариновой кислоты на его свойства.

Ацилирование аминогрупп а-химотрипсина остатками стеариновой кислоты приводило к снижению значения изоэлектрической точки белка. При введении 5 молекул стеариновой кислоты на молекулу белка значение р1 сдвигалось до 4,5 (р1 нативного белка 8,3). Таким образом, при нейтральных значениях рН модифицированный белок имел отрицательный заряд.

С другой стороны, введение на гидрофильную поверхность белковой глобулы остатков жирной кислоты вызывало агрегацию молекул а-химотрипсина в водных растворах. Методом гель-проникающей хроматографии было показано, что эти агрегаты содержат в среднем 4-8 молекул белка.

Модификация а-химотрипсина приводила к снижению содержания активных центров модифицированного белка на 20-25% по сравнению нативным а-химотрипсином. Эта величина практически не зависела от количества присоединенных стеароильных остатков. В связи с этим, мы предполагаем, что уменьшение числа активных центров связано с денатурацией части молекул а-химотрипсина в процессе модификации, при инкубации белка в присутствии органического растворителя.

Изменения каталитических свойств белка в результате его гидрофобизации изучали по гидролизу низкомолекулярного специфического субстрата - этилового эфира И-ацетил-Ь-тирозина (АТЭЭ). Из кинетических кривых реакции исчерпывающего гидролиза АТЭЭ определяли каталитическую константу (к^О и константу Михаэлиса (Км) процесса.

Оказалось, что увеличение количества стеароильных групп (И) в модифицированном ферменте не приводило к значительным изменениям кса: (рис. 1а, кривая 1). Следовательно, несмотря на агрегацию, все активные центры стеароилированного белка, находящегося в агрегатах,

оставались доступными для молекул АТЭЭ, и принимали участие в катализе. В то же время, величина Км гидролиза АТЭЭ возрастала в результате гидрофобпзации почти на два порядка (рис.1б, кривая Г), что свидетельствовало о значительном ухудшении связывания субстрата с активным центром. Мы предположили, что причиной такого ухудшения может служить изменение пространственной структуры белковой глобулы вследствие введения гидрофобных остатков на поверхность гидрофильного белка.

Рнс.1 Изменение каталитической константы (А) и константы Михаэлиса (Б) модифицированного а-химотрипсина в зависимости от числа присоединенных стеароильных остатков Кривые 1 и Г описывают поведение белка в водном растворе, 2 и 2' - после встраивания в мембрану липосом.

Для того, чтобы подробнее изучить конформационные изменения, происходящие в а-химотрипсине при его модификации, были исследованы флуоресцентные свойства триптофановых остатков белка. Оказалось, что интенсивность флуоресценции образцов гидрофобизованного а-химотрипсина монотонно уменьшается до 40% от исходного уровня с ростом количества ковалентно присоединенных остатков стеариновой кислоты N от 0 до 12 (рис.2).

Можно было предположить, что это уменьшение являлось результатом денатурации часта белка в процессе модификации. Тогда снижение интенсивности триптофановой флуоресценции сопровождалось бы уменьшением доли активных центров в препаратах стеароилированного а-химотрипсина. Однако, как было описано ранее, значение N не оказывает влияния на количество активных центров. Следовательно, наблюдаемое уменьшение интенсивности флуоресценции с денатурацией белка не связано.

интенсивности флуоресценции а-химотрипсина (Р) в водном растворе от числа ковалентно присоединенных остатков стеариновой кислоты, N.

= 280 нм Хет = 335 нм

Рис.2

Зависимость

0.3-

0.2-

0 2 4 6 8 10 12

Число стеароильных остатков (Ы)

Известно, что тушение флуоресценции триптофановых остатков белка, находящихся близко к поверхности молекулы, может происходить благодаря их взаимодействию с растворенным в воде кислородом в синглетной форме. Исходя из этого, логично предположить, что наблюдаемый эффект обусловлен увеличением числа доступных для молекул кислорода остатков триптофана вследствие частичного разворачивания белковой глобулы. Причем повышение степени модификации а-химотрипсина приводит к увеличению степени разворачивания молекулы.

Для количественной оценки числа экспонированных в воду триптофановых остатков исследовали тушение флуоресценции белка низкомолекулярным ионным тушителем - иодидом калия при постоянной ионной силе. Представление кривой тушения в модифицированных координатах Штерна-Фольмера позволило оценить количество доступных ионному тушителю флуорофоров. Мы установили, что доля триптофановых остатков, доступных для иодид-иона, возрастает с 38% для нативного белка до 60% для а-химотрипсина, модифицированного шестью стеароильными остатками. Поскольку молекула а-химотрипсина содержит 8 триптофановых остатков, можно сказать, что гидрофобизация белка приводит к экспонированию двух дополнительных остатков триптофана.

Таким образом, гидрофобизация а-химотрипсина приводит к частичному разворачиванию белковой глобулы. Следует, однако, отметить, что конформационные изменения, наблюдаемые методом флуоресценции, только частично затрагивают пространственную структуру гидрофобизованного белка. Действительно, структура каталитического центра белка, по-видимому, не изменяется, поскольку величина к^; остается практически постоянной. В противоположность этому, субстрат-связывающий участок активного центра может быть затронут подобными структурными перестройками, что, возможно, и

является причиной значительного увеличения Км ферментативного гидролиза АТЭЭ.

1.2. Получение белково-липидных везикул методом озвучивания.

Инкубация раствора модифицированного белка с суспензией моноламеллярных ФХ-липосом не приводила к его встраиванию в липидную мембрану. Даже после 40 часов инкубации не более 2% гидрофобизованного белка связывалось с липосомами. По всей видимости, встраиванию а-химотрипсина препятствовал высокий энергетический барьер перехода белковых молекул из устойчивых агрегатов в липидный бислой, в процессе которого гидрофобные остатки белка должны контактировать с водой.

Обработка ультразвуком смеси раствора гидрофобизованного а-чимотрипсина и предварительно полученной суспензии липосом позволяла преодолеть этот барьер и резко ускоряла процесс связывания белка с липосомальной мембраной. Протеолипосомы отделяли от невстроенного белка гель-фильтрацией на сефарозе СЬ-4В. Обработка ультразвуком раствора а-химотрипсина в подобранных нами условиях не влияла на его каталитические свойства, поэтому долю связанного с липосомами белка определяли из измерений ферментативной активности протеолипосом.

1.3. Локализация белка в липосомах.

При встраивании гидрофобизованного белка в липосомы, его молекулы могут адсорбироваться на липосомальной поверхности, встраиваться во внутреннюю и/или внешнюю сторону мембраны или быть захваченными во внутреннюю полость везикул. Для того чтобы определить, как именно локализованы молекулы а-химотрипсина в протеолипосомах, мы титровали активные центры белка соевым ингибитором трипсина (СИТ). Известно, что липидный бислой непроницаем для гидрофильных белков, следовательно, СИТ может взаимодействовать только с каталитически активными белковыми молекулами, адсорбированными на поверхности липосом и/или встроенными во внешнюю часть липидного бислоя. Затем протеолипосомы разрушали добавлением 1% Тритона Х-100 и определяли каталитическую активность белка по гидролизу АТЭЭ, и общее количество активных центров, способных взаимодействовать с СИТ.

Было обнаружено, что разрушение липосом приводит к двукратному возрастанию количества активных центров, доступных для СИТ (рис.3). Кроме того, наблюдается приблизительно двукратное увеличение активности связанного с липосомами белка, определяемое по гидролизу АТЭЭ (рис.3). Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы. Во-первых, в протеолипосомах половина белковых молекул локализована на внешней стороне мембраны (и, следовательно, доступна для взаимодействия с СИТ).

Рнс.З Определение числа активных центров белка, встроенного в лнпосомы, с помощью титрования СИТ. По оси ординат отложены относительные активности протеолипосом, А« активность протеолипосом до разрушения. ▼ - протеолипосомы • - протеолипосомы после разрушения Тритоном Х-100

Общая концентрация белка в обоих случаях составляла 1,6 мкМ.

Во-вторых, только молекулы, связанные с внешней стороной липидного бислоя, вносят свой вклад в каталитическую активность протеолипосом, измеряемую с помощью АТЭЭ. Таким образом, чтобы определить общее количество белка, встроенного в липидный бислой, необходимо удвоить значение, рассчитанное из определения каталитической активности протеолипосом.

/.4. Факторы, определяющие эффективность взаимодействия модифицированного белка с мембраной липосом.

Обработка ультразвуком смеси раствора нативного а-химотрипсина и суспензии ФХ-липосом при выбранных экспериментальных условиях (10 мМ боратный буферный раствор, рН 8,5) не приводила к связыванию белка с внешней мембраной липосом (рис.4).

Измеримое связывание модифицированного белка было зарегистрировано только в тех случаях, когда среднее число остатков стеариновой кислоты на белковой молекуле, N, превышало 2 (рис.4). В работах Эпанда (R.Epand, John Wiley & Son.у, Inc.Btnpoly 43:15-24. 199'') изучался вопрос о том, какое количество гидрофобных остатков необходимо ввести на молекулу пептида для придания ей способности эффективно встраиваться в липидный бислой. Было показано, что для многих пептидных молекул такая способность приобретается после присоединения двух остатков жирной кислоты. В случае а-химотрипсина введения в среднем двух стеароильных остатков оказывается недостаточным для его заякоривания на липидной мембране. Видимо, количество гидрофобных остатков, которое необходимо присоединить на поверхность гидрофильной молекулы, чтобы она прочно удерживалась на липосомальной мембране, существенно зависит от свойств этой молекулы.

Г

200 400 600 800 1000 [СИТ], нМ

о

-Т-'-!-"-■-1-■-1-'-1-'-1-'

О 2 4 6 8 10 Число стеароильных остатков (14)

Рис.4 Зависимость доли модифицированного а-хи-мотрипсина, встроенного в липосомы, от количества стеароильных остатков,

ковалентно присоединенных к белку (К).

остатков,

о

Увеличение средней степени гидрофобизации а-химотрипсина, как и ожидалось, приводит к росту количества белка, встроенного в липосомы (рис.4). Однако даже в случае сильно модифицированных белковых молекул, (N=10), эта величина не превышала 60%. На эффективность связывания не влияло ни десятикратное увеличение мольного соотношения липид/белок в образце, ни изменение метода встраивания белка (использование диализа детергента). Следовательно, не все молекулы модифицированного а-химотрипсина обладают способностью связываться с липидным бислоем. Известно, что ацилирование аминогрупп белка активированными производными жирных кислот носит статистический характер. По всей видимости, лишь часть гидрофобизованных молекул, характеризующихся определенным расположением жирнокислотных остатков, способна прочно удерживаться на липосомальной мембране.

1 5. Модуляция каталитической активности модифицированного а-химотрипсина при его встраивании в липидный бислой.

Встраивание а-химотрипсина, модифицированного различным количеством стеароильных остатков, в липосомальнуто мембрану не приводило к существенным изменениям в кса(, ее величина сохранялась практически равной ксЛ нативного белка (рис. 1а). В то же время величина Км реакции уменьшалась почти на два порядка (рис 16), приближаясь по значению к Км нативного белка. Подобное изменение могло быть связано либо с концентрированием молекул субстрата вблизи поверхности липосом. либо с локальными конформационными перестройками в с;, бстрат-связывающем участке активного центра, приводящими к восстановлению его структуры, измененной после модификации. Используя метод равновесной гель-проникающей хроматографии, мы показали, что не происходит концентрирования молекул АТЭЭ вблизи поверхности липосом. Таким образом, за улучшение связывания субстрата

с активным центром белка могут быть ответственны конформационные изменения в субстрат-связывающем участке.

Важно отметить, что встраивание а-химотрипсина в липосомы не приводило к восстановлению интенсивности триптофановой флуоресценции белка до уровня нативного, то есть количество остатков триптофана, экспонированых в воду, не изменялось.

Следовательно, конформационные изменения, наблюдаемые методом флуоресценции, не связаны ни с увеличением Км, ни с ее уменьшением. По всей видимости, снижение константы Михаэлиса может происходить вследствие локальных структурных изменений вблизи поверхности субстрат-связывающего участка, не затрагивающих триптофановые остатки. В качестве одного из возможных объяснений можно выдвинуть следующее предположение. Остаток стеариновой кислоты, введенный на молекулу а-химотрипсина, может заглубляться в гидрофобную полость субстрат-связывающего участка той же или другой, близко расположенной молекулы, приводя к ингибированию фермента. При встраивании белка в липосомальную мембрану связывание этого остатка с областью ацильных цепей бислоя оказывается более предпочтительным, и доступность субстрат-связывающего участка активного центра для молекул АТЭЭ восстанавливается.

2. Взаимодействие липосом, содержащих модифицированный а-химотрипсин, с синтетическим поликатноном поли-(1Ч-этнл-4-вннилпиридинин бромидом) (ПЭВП).

В предыдущем разделе были описаны изученные в работе закономерности встраивания искусственно гидрофобизованного и-химотрипсина в липидные везикулы. Полученные протеолипосомы содержали 14-20 белковых молекул на каждую липосомальную частицу, причем половина белка располагалась на внешней поверхности липосом, а половина находилась на внутренней липосомальной мембране. В этом случае а-химотрипсин занимал не более 0,6-1,0 % от поверхности липосом. Проведенные нами контрольные эксперименты показали, что ни препарат белка, ни препарат липида (фосфатидилхолина), не содержат существенных примесей отрицательно заряженных поверхностно активных веществ. Таким образом, заряд протеолипосом определялся карбоксильными группами встроенного в мембрану модифицированного белка. Молекула а-химотрипсина, согласно анализу его аминокислотной последовательности, содержит 17 карбоксильных групп. Исходя из этого, мы рассчитали, что концентрация отрицательно заряженных групп белка составляла около 0,5 % (мол.) от концентрации молекул липида.

Исследование взаимодействия поли-(Н-этил-4-винилпиридиний бромида) с белково-яипидными везикулами проводили при рН 8.5. В этих условиях молекулы гидрофобизованного а-химотрипсина несут

избыточный отрицательный заряд, поскольку, как упоминалось выше, модификация белка сдвигает его ИЭТ по сравнению с нативным а-химотрипсином (р! 8.3) в кислую область.

2.-1. Связывание ПЭВП с белковыми молекулами, встроенными в липидную

бислойную мембрану.

Известно, что ПЭВП эффективно тушит флуоресценцию по статическому механизму при непосредственном контакте с флуорофором. Поэтому связывание а-химотрипсина с ПЭВП исследовали по тушению флуоресценции остатков триптофана в молекуле белка.

Взаимодействие как нативного, так и гидрофобизованного а-химотрипсина с ПЭВП в водном растворе сопровождалось уменьшением интенсивности флуоресценции белка, вследствие образования белок-полиэлектролитных комплексов в водном растворе. Добавление ПЭВП к протеолипосомам, содержащим модифицированный а-химотрипсин, также приводило к тушению флуоресценции триптофановых остатков белка (рис.5).

[ПЭВП], осново-М*105

Рис.5 Тушение флуоресценции триптофановых остатков гидрофобизованного а-химотрипсина (N=10), встроенного в ФХ липо-сомы, раствором ПЭВП. Кони, белка 1 мкМ, конц. липида 1 мг/мл.

0.01 М боратный буферный раствор, рН=8.5.

Возникает вопрос, остается ли белок, взаимодействующий с поликатионом, в липидном бислое, или образование комплекса белка с ПЭВП способствует «вырыванию» белка из мембраны и его миграции в водный раствор? Для того, чтобы ответить на этот вопрос мы получили протеолипосомьг, содержащие флуоресцентный зонд перилен, нековалентно включенный в липидный бислой. Добавление ПЭВП к нейтральным липосомам, не содержащим встроенный белок, практически не влияло на интенсивность флуоресценции перилена (кривая 1, рис.6).

[ПЭВП], осново-МЧО6

Рис.6 Тушение флуоресценции перилена, встроенного в мембрану ФХ-липосом (1) и протеолипосом. (2), под действием ПЭВП Конц. липида в обоих случаях составляла 1 мг/мл, концентрация белка на внешней мембране липосом 1 мкМ,

0 01 N1 боратный буферный раствор, рН=8 5.

При добавлении ПЭВП к протеолипосомам наблюдалось заметное тушение флуоресценции перилена (кривая 2, рис.6), что свидетельствовало об адсорбции поликатиона на поверхности протеолипосом.

2.2. Взаимодействие поликатиона со встроенным в липосомальную мембрану белком носит электростатический характер.

Определяется ли адсорбция поликатиона на поверхности протеолипосом только электростатическими силами, или дополнительный вклад вносят гидрофобные взаимодействия между основной цепью ПЭВП и липидным бислоем и/или белковыми молекулами ? Для выяснения этого вопроса мы исследовали влияние ионной силы на разрушение комплекса поликатион-протеолипосома. За диссоциацией комплекса следили по изменениям в интенсивности флуоресценции триптофановых остатков.

Р/Р. %

100 80 60 4020 0

Рнс.7 Разрушение комплекса протеолипосомы-ПЭВП при

увеличении ионной силы раствора

1 - протсо.тноигты

2 - протео нтосоиы - ПЭВП (концентрация положительно заряженных групп ПЭВП равна концентрации карбоксильных групп белка на внешней мембране липосом)

3 - протеолипосомы +-ПЭВП после добавления 0.2М ЫаС1

0 01 М боратный буфер, рН=8.5.

Добавление поликатиона к протеолипосомам, приводило к уменьшению интенсивности флуоресценции белка на 56% (рис 7, кол 1 и 2). При внесении в раствор хлорида натрия в концентрации 0.2 М наблюдалось возгорание флуоресценции до исходного значения (рис.7, колонка 3), то есть комплекс протеолипосомы-поликатион полностью диссоциировал.

1

3

2

Таким образом, связывание ПЭВП с протеолипосомами обусловлено только электростатическими взаимодействиями. Следует отметить, что аналогичное поведение наблюдается и для чисто липидных везикул, в которых отрицательные заряды создавались кардиолипином.

2 3. Влияние ПЭВП на каталитическую активность гидрофобизованного а-химотрипсина. встроенного в липидную бислойную мембрану.

.Адсорбция поликатиона на поверхности протеолипосом не влияла на каталитическую активность встроенного в липидную мембрану гидрофобпзованного а-химотрипсина. Мы не наблюдали изменений как в каталитической константе, так и в константе Михаэлиса ферментативного пиролиза АТЭЭ. Обратившись к третичной структуре а-химотрипсина, можно видеть, что вблизи активного центра белка отсутствуют отрицательно заряженные группы. Видимо, это и является причиной того, что электростатическое связывание поликатиона не влияет на каталитические свойства белка.

2.4, Встраивание белка в отрицательно заряженные липосомы под действием поликатиона.

Как было показано ранее, инкубация гидрофобизованного а-химотрипсина с предварительно сформированными нейтральными ФХ-липосомами не приводит к существенному встраиванию белка в липидные везикулы. Аналогичная ситуация наблюдается и при использовании отрицательно заряженных липосом, состоящих из ФХ и КЛ, при этом дополнительным фактором, затрудняющим встраивание белка, служит электростатическое отталкивание между отрицательно заряженными группами КЛ и белка. Известно, что добавление ПЭВП к КЛ-липосомам приводит к перезарядке липосомальной поверхности при условии, что концентрация положительно заряженных групп поликатиона превышает концентрацию отрицательно заряженных групп липида. В этом случае возможна адсорбция белка, несущего избыточный отрицательный заряд, на поверхности липосом за счет электростатических сил. Можно ожидать, что адсорбция гидрофобизованного а-химотрипсина на поверхности таких липосом будет сопровождаться встраиванием гидрофобных остатков белка в липидный бислой. Для проверки этого предположения к раствору ФХ-КЛ липосом (ФХ/'КЛ = 80/20 вес.) добавляли раствор ПЭВП, и, затем, концентрированный раствор гидрофобизованного а-химотрипсина (N=5). Затем ионную силу раствора повышали добавлением хлорида натрия до концентрации 0.5 М, и отделяли липидные везикулы от белка и поликатиона с помощью гель-фильтрации. Оказалось, что полученные таким образом препараты липосом содержали существенные количества связанного гидрофобизованного а-химотрипсина (рис.8). Доля белка, встроенного во внешнюю мембрану липосом, составляла 25%' от добавленного(см. рис. 4 на стр. 9). То есть достигалось максимально

возможное для данной степени модификации связывание белковых молекул с внешней липосомальной мембраной. Поскольку электростатические контакты разрушаются при повышении ионной силы раствора, наиболее вероятно, что в этом случае связывание белка с липосомами осуществляется за счет встраивания стеароильных остатков модифицированного белка в гидрофобную часть липидного бислоя.

25-

Я

с 20-

ю

о 15-

о

пз 1П-

с

с.

(т 5-

а

л:

с о 0-

С1

Ж*

Рис. 8 Усиление связывания гидрофобизованного а-химотрипсина с отрицательно заряженными липосомами под действием поликагиона

ШШ1

без ПЭВП

после обработки ПЭВП

2.5. Латеральная агрегация молекул белка на поверхности протеолипосом

при адсорбции ПЭВП.

Известно, что адсорбция полиэлектролитов на противоположно заряженных клеточных мембранах может приводить к латератьной агрегации заряженных мембранных белков. Однако используемый обычно для изучения этого явления метод флуоресцентной микроскопии не позволяет оценить размеры образующихся белковых кластеров. Мы разработали другой подход для изучения образования белковых агрегатов при адсорбции ПЭВП на поверхности протеолипосом и оценки размеров таких агрегатов. Белковые кластеры фиксировали сшиванием глутаровым альдегидом и затем анализировали их размер с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (ДСН-ПААГЭ). Расстояние между двумя альдегидными группами в глутаровом альдегиде составляет около 4,5 А, таким образом, лишь в случае, когда две молекулы белка расположены на расстоянии не больше 4,5 А, они могут быть ковалентно связаны друг с другом. В каждом эксперименте мы подбирали такую концентрацию глутарового альдегида и время обработки исследуемых образцов, чтобы избежать сшивания молекул белка, случайным образом встроенных в липидную мембрану. В качестве контроля использовали протеолипосомы, не обработанные поликатионом (рис.9, дорожка 1). Мы исследовали протеолипосомы .двух типов, полученные разными методами. Первые из них были получены обработкой ультразвуком, соотношение белок-липид ' в них составляло 1.3000 (содержание белка на внешней мембране липосом было равно 5-7 молекул на липосому). Вторые получали методом диализа детергента, они характеризовались соотношением белок/липид 1/300 (50-70 молекул белка на липосому).

Рис. 9 Агрегация белковых молекул, встроенных в мембрану протеолипосом под действием ПЭВП. . О- стандарты;

1 - протеолипосомы без ПЭВП;

2 - протеолипосомы (соотношение белок/липид 1/300) после добавления ПЭВП

3 - протеолипосомы (соотношение белок/липид 1/3000) после добавления ПЭВП

0 12 3

Как оказалось, обработка протеолипосом обоих типов раствором ПЭВП со средней степенью полимеризации 2000 при одинаковых экспериментальных условиях (10 мМ боратный буфер, рН 8,5) приводит к различным результатам. Для протеолипосом с низким содержанием а-хи.мотрипсина образования белковых агрегатов практически не наблюдалось (рис.9, дорожка 3). Связывание ПЭВП с протеолипосомами, содержащими большое количество белка, приводило к образованию больших белковых кластеров со средним молекулярным весом 1500-2000 Ша (рис. 9, дорожка 2), что соответствует 60-80 молекул белка на один кластер.

Образование белковых агрегатов может иметь две причины. Во-первых, агрегация молекул модифицированного белка может быть следствием агрегации протеолипосом в растворе под действием поликатиона. Добавление поликатиона вызывает увеличение среднего гидродинамического диаметра частиц в растворе с 150 нм до 800 нм. Следовательно, агрегаты протеолипосом образуются, однако, на наш взгляд, в таких агрегатах только небольшая часть белковых молекул может находиться на расстоянии достаточно близком для сшивания глутаровым альдегидом. И при этом невозможно объяснить образование белковых кластеров, содержащих 60-80 молекул. Поэтому наиболее вероятным представляется предположение, • что при адсорбции поликатиона происходит не только агрегация протеолипосом, но и латеральная агрегация белковых молекул на поверхности одной липосомы

Уменьшение плотности белковых молекул на поверхности липосом, видимо, приводит к резкому снижению доли белка, включенного в этот процесс.

2.6. Обратимость взаимодействия.

Известно, что образование интерполиэлектролитных комплексов характеризуется обычно высоким значением константы связывания, которую зачастую невозможно измерить. В таких случаях процесс рассматривается как необратимый. Однако, мы предположили, что при низкой плотности заряда на липосомальной поверхности адсорбция поликатиона может носить обратимый характер. Это предположение подтвердилось для протеолипосом с содержанием белка 5-7 молекул на липосому и концентрацией заряженных групп 0,5 % (мол.) по отношению к липидным молекулам. Разбавление раствора комплекса ПЭВП-протеолипосомы в два раза приводило к диссоциации (19 х 8) % связей между поликатионом и а-химотрипсином.

2.7. Конкуренция встроенного в липосомы белка и отрицательно заряженных липидов за связывание с поликатионом

В общем случае адсорбция поликатионов на клеточной поверхности может происходить за счет взаимодействия положительно заряженных групп полимера с отрицательно заряженными, как белковыми, так и липидными компонентами мембраны. Известно, что эффективность связывания поликатионов зависит от природы заряженных объектов, принимающих участие в образовании электростатического комплекса. Используя созданную в нашей работе модельную систему, мы исследовали, какой тип отрицательно заряженных компонентов биологической мембраны предпочтительно связывается с ПЭВП. Для этого мы получили два типа везикул, несущих отрицательный заряд: протеолипосомы и фосфолипидные липосомы, состоящие из ФХ и КЛ (КЛ-липосомы). Содержание отрицательно заряженных групп относительно нейтрального липида поддерживали равным 0,2-0,3 % (мол.) для везикул обоих типов. Мы изучали взаимодействие поликатиона с чистыми протеолипосомами и с протеолипосомами в присутствии равного количества КЛ-липосом методом тушения флуоресценции.

о

12 3 4

[ПЭВП], осново-МЧО3

2

Рис.10 Тушение протеолипосом (1) и смеси протеолипосом и липосом, содержащих отрицательно заряженный кардиолипин, (2) раствором ПЭВП о 0.01 М боратном буфере, рН=3.5 Концентрации карбоксильных групп а-химотрипсина на поверхности протеолипосом и отрицательных зарядов кардиолипина равны 2 8 мкМ. концентрация липида в обоих случаях 1 мг/.мл

Добавление поликатиона к протеолипосомам приводило к эффективному тушению триптофановой флуоресценции (рис.10, кривая 1). В случае смеси липосом двух типов, эффективность тушения белка поликатионом существенно снижалась (рис.10 кривая 2). На основании этого факта можно сделать вывод, что связывание ПЭВП с кардиолипином происходит более эффективно, чем со встроенным в бислой белком.

Сравнение кривых тушения позволяет количественно оценить соотношение констант равновесия процессов взаимодействия ПЭВП с отрицательно заряженными протеолипосомами и КЛ-липосомами. Как мы показали ранее, для липосом с низкой плотностью заряда, адсорбция поликатиона носит обратимый характер. Положительно заряженное звено поликатиона (П) может взаимодействовать либо с карбоксильной группой белка (Б), либо с отрицательно заряженной группой кардиолипина (Л), и в системе существуют следующие равновесия:

П+Б = ПБ П+Л = ПЛ

Если рассматривать начальные участки кривых титрования, когда концентрация добавленного тушителя [П]0 много меньше концентрации отрицательно заряженных групп белка [Б]0 и кардиолипина [Л]0, то соотношение общей концентрации заряженных групп белка [Б]0 к равновесной концентрации комплекса ПЭВП-химотрипсин, [ПБ], будет иметь вид:

[Б]о _ КБ | [Б]- | КБ [Л]О

[ПБ] [П]о [П]о Кл [П]о ' где Кг, и Кд - константы диссоциации комплексов ПЭВП с белком и кардиолипином соответственно, [ПЛ] - равновесная концентрация комплекса ПЭВП с кардиолипином. Соотношение [Б]0 / [ПБ] можно заменить на экспериментально измеряемую величину 1„/Д1:

— = — *ГКе+[Б]о + — [Л]. Д[ [П]о I. Кл

Обозначив вырал<ение в скобках Б, получим

^2.-А.

Д/ [П]9

Таким образом, тангенс угла наклона зависимости 1о/Д1 от обратной концентрации звеньев поликатиона 1/[П]0 дает величину Б. При этом для чистых протеолипосом Б = Бв = Кб + [Б]0, в случае смешанной системы

Ке

Б = Бс = Кб + [Б]0 + —[Л]-. Тогда, принимая во внимание, что

Кл

концентрация [Б]0 была одинаковой в обеих системах, разность между Бс и Бб позволяет рассчитать соотношение констант диссоциации комплексов ПЭВП с белком и кардиолипином (Кб/Кл) в соответствии с уравнением:

К5

К, [Л]о

(Бс-Б.)

Перестроив данные по тушению триптофановой флуоресценции поликатионом в новых координатах (рис. 11), мы определили значение

К.'

соотношения констант диссоциации —г = .

1 2 1/[П]„, мкМ

Рис. 11 Определение соотношения констант

дисссоциацин комплексов ГТЭВП с протеолипосомами и КЛ-липосомами методом тушения флуоресценции.

Прямая 1 описывает тушение флуоресценции чистых

протеолипосом поликатионом, прямая 2 соответствует тушению смешанной системы.

Из величины 5б и Бс рассчитали значение констант диссоциации К„ = 48 мкМ, и Кл = 1,5 мкМ. Таким образом, липидная мембрана, отрицательный заряд которой определяется кардиолипином имеет сродство к поликатиону приблизительно в 30 раз выше, чем мембрана, содержащая встроенный а-химотрипсин.

С чем же связана более высокая эффективность взаимодействия ПЭВП с кардиолипином, чем с молекулами белка? Известно, что одним из ключевых факторов, обеспечивающих стабильность полиэлектролитных комплексов, является комплементарность зарядов взаимодействующих между собой анионного и катионного компонентов. При взаимодействии поликатиона с жидкой липидной мембраной КЛ-липосом молекулы отрицательно заряженного липида могут легко подстраиваться под адсорбировавшуюся на поверхности полимерную цепь, и полимер реализует максимальное количество ионных контактов с поверхностью мембраны. Иная ситуация наблюдается для протеолипосом. По всей видимости, при условии низкого содержания белка, поликатион взаимодействует с карбоксильными группами отдельных белковых молекул, причем отрицательные заряды жестко фиксированы на поверхности белковой глобулы. Можно предположить, что несоответствие расстояний между противоположно заряженными группами а-химотрипсина и ПЭВП приводит к тому, что поликатион оказывается неспособным реализовать все возможные контакты. Вследствие этого комплексы поликатион-протеолипома обладают более низкой устойчивостью.

Отсутствие латеральной агрегации белковых молекул при наличии агрегации липидных молекул под действием поликатиона может моделировать ситуацию, наблюдаемую для реальных клеток, поскольку

известно, что для многих биологических мембран латеральная подвижность мембранных белков в тысячи раз ниже, чем липидов. В связи с этим, вклад агрегации белковых молекул в устойчивость белок-полиэлектролитных комплексов может быть невелик.

Полученные результаты показывают, что адсорбция поликатиона на моделях биологических мембран - липосомах, состоящих из отрицательно заряженных липидов и кислых белков - происходит в основном за счет взаимодействия поликатиона с липидной компонентой. Использование системы с низкими плотностями заряда позволило не только количественно оценить, с каким отрицательно заряженным компонентом мембраны преимущественно взаимодействует ПЭВП, но и рассчитать значения констант диссоциации для каждого типа комплексов.

3. Влияние поликатиона на проницаемость мембраны КЛ-липосом и

протеолипосом.

3. / Влияние синтетических поликатионов на транспорт противоракового антибиотика доксорубицина черех бислои, состоящие из ФХи КЛ.

Как следует из литературных данных, синтетические и природные поликатионы зачастую оказывают влияние на проницаемость клеточных мембран относительно как малых ионов, так и крупных молекул.

Как было показано выше, адсорбция поликатиона на поверхности мембран, содержащих отрицательно заряженные липиды и белки, происходит в основном за счет взаимодействия с липидной компонентой. В связи с этим в первую очередь представлялось интересным изучить влияние адсорбции ПЭВП на проницаемость липидной мембраны, построенной из ФХ и КЛ. Известно, что взаимодействие ПЭВП с ФХ-КЛ везикулами не влияет на проницаемость липидного бислоя по отношению к матым ионам.

В нашей работе мы изучили влияние адсорбции ПЭВП на проникновение молекул противоракового антибиотика доксорубицина (БОХ) через отрицательно заряженные липидные мембраны, состоящие из ФХ и КЛ. Для этих целей использовали метод измерения необратимого рН-индуцированного транспорта незаряженной формы доксорубицина из внешнего раствора с рН 7,5 во внутреннюю полость липосом, содержащую буферный раствор с рН 4,0. За накоплением доксорубицина внутри липосом следили по изменению интенсивности его флуоресценции. При добавлении липосом доксорубицин накапливался внутри них выше концентрации самотушеиия, и в процессе транспорта ООХ внутрь липосом интенсивность флуоресценции раствора монотонно уменьшалась. Транспорт ООХ внутрь липосом является процессом первого порядка, и по изменению константы скорости этого процесса {к) можно судить об изменении проницаемости бислоя. '

Мы изучили зависимость величины к от количества добавленного поликатиона для липосом с разным содержанием отрицательно заряженного липида: 1%, 10% и 20%. Как видно из рис. 12, увеличение концентрации ПЭВП приводит к ускорению проникновения доксорубицина внутрь липосом до тех пор, пока концентрация положительно заряженных звеньев поликатиона не станет равной концентрации отрицательно заряженных групп липосом. При дальнейшем повышении концентрации ПЭВП происходит замедление транспорта ЭОХ Однако, величина эффекта существенно зависит от состава липосом и возрастает при увеличении содержания отрицательно заряженного липида.

Рис.12 Ускорение транспорта доксорубицина внутрь

отрицательно заряженных

липосом под действием

поликатиона.

9 - степень компенсации отрицательного заряда липосом, определятся соотношением

положительно заряженных групп ПЭВП и отрицательно заряженных групп КЛ, к0 -константа транспорта ЭОХ в отсутствии поликатиона.

Добавление поликатиона вызывало агрегацию липосом, содержащих 10% и 20% зарядов кардиолипина вплоть до точки эквивалентности, дальнейшее увеличение количества поликатиона приводило к снижению размера агрегатов, вследствие перезарядки поверхности липосом (рис 13)

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

1 - 1 % кл;

2 - 10% КЛ |

ш : \ 3 - 20% КЛ I

/ • п / : 2

I ; / :

1 • я: 1 ■ 2 .... 1 3

—-._____-—« о

А -------

0 12 3 4 5 6 0

(3, нм

2000150010005000-

Рис. 13. Изменение гидродинамического диаметра КЛ-липосом под действием ПЭВП.

1-1% (вес) КЛ

2- 10% (вес) КЛ 3 - 20% (вес) КЛ

0 1 2 3 4 5 6 7 6

В то же время для липосом, содержащих 1% отрицательных, зарядов не наблюдалось практически никакого увеличения размера частиц (рис.13).

Сопоставляя данные по изменению проницаемости бислоя и размерам агрегатов липосом в зависимости от концентрации ПЭВП можно было бы предположить, что изменения в константе транспорта доксорубицина обусловлены агрегацией липосом. Однако, в этом случае не наблюдалось бы столь существенных различий между липосомами, содержащими 10% и 20% КЛ, поскольку размеры образующихся агрегатов практически одинаковы.

Эффект ускорения транспорта доксорубицина при адсорбции поликатиона не является специфическим эффектом ПЭВП. Аналогичная зависимость эффекта поликатиона от содержания отрицательно заряженного кардиолипина в липосомах наблюдались и для другого хорошо изученного поликатиона - поли-Ь-лизина (рис. 14).

Наиболее вероятным нам кажется следующее объяснение наблюдаемых явлений. Известно, что адсорбция поликатионов вызывает латеральную сегрегацию молекул отрицательно заряженного липида. По всей видимости, на границах кластеров, обогащенных отрицательно заряженным липидом, и остальным бислоем возникают дефекты структуры. Эти нарушения могут возникать как в области гидрофильных липидных головок, так и в упаковке ацильных цепей. Можно предположить, что именно такие области и ответственны за изменения проницаемости мембраны по отношению к молекулам доксорубицина. Повышение содержания кардиолипина приводит к возрастанию доли дефектных участков бислоя и как результат, к увеличению эффекта ускорения транспорта зонда.

3 2 Влияние поли-Ы-этил-4-винилпиридиний бромида на транспорт низкомолекулярных электролитов и доксорубицина через белково-липидную мембрану.

Добавление поликатиона не влияло на проницаемость протеолипосом по отношению к низкомолекулярным электролитам. Этот результат свидетельствует о сохранении целостности липосом, и совпадает

Рис. 14 Зависимость максимального эффекта ускорения транспорта доксорубицина под действием поли -Ь-лизина от содержания отрицательно заряженного липида в составе

липосом

О 10 20 30 40

КЛ, вес. %

с результатами по влиянию поликатиона на отрицательно заряженные липидные везикулы, полученными ранее.

Адсорбция поликатиона на поверхности протеолипосом также вызывала ускорение транспорта доксорубицина. Этот эффект наблюдался только в случае протеолипосом с высоким содержанием белка (50-70 молекул на липосому). При введении 5-7 молекул белка на одну липосомальную частицу адсорбция поликатиона не вызывала никаких изменений скорости проникновения ЭОХ в липосомы. Можно предполагать, что повышение количества белка в липосомальной мембране приводит к образованию белковых кластеров под действием поликатиона. При этом, в белково-липидной мембране могут возникать дефекты структуры, через которые ускоряется транспорт антибиотика.

О 1 2 3 4 5 6 7

е

Рис. 15 Влияние ПЭВП на константу скорости проникновения доксорубицина через липосо-мальную мембрану, заряд которой формируется встроенным белком:

• - протеолипосомы с соотношением белок/липид 1/300

■ - протеолипосомы с соотношением белок/липид 1/3000

ВЫВОДЫ.

1. Ацилирование а-химотрипсина остатками стеариновой кислоты придает ферменту способность прочно связываться с липидным бислоем. Эффективность связывания белка с липосомами определяется средним количеством остатков стеариновой кислоты, введенных на молекулу белка, и их взаимным расположением на поверхности белковой глобулы.

2. Модификация а-химотрипсина остатками стеариновой кислоты приводит к значительному увеличению константы Михаэлиса гидролиза низкомолекулярного специфического субстрата АТЕЕ в водном растворе Встраивание гидрофобизованного фермента в липосомальную мембрану, построенную из электронейтрального липида приводит к повышению константы Михаэлиса вплоть до уровня, характерного для нативного белка в водном окружении.

3. Поли-(Ы-этил-4-винилпиридиний бромид) способен адсорбироваться на поверхности белково-липидных везикул за счет электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными группами белка. Взаимодействие поликатиона с модифицированным а-химотрипсином, встроенным в липидный бислой вызывает агрегацию

белковых молекул на поверхности мембраны. Снижение содержания белка приводит к исчезновению этого эффекта. Адсорбция поликатиона не оказывает влияния на функциональные свойства белка.

4. Взаимодействие ПЭВП с отрицательно заряженными липидами на поверхности липосом существенно более эффективно, чем его взаимодействие с молекулами сс-химотрипсина, встроенными в состав липосомальной мембраны.

5. Адсорбция поликатионов - поли-(>1-этил-4-винилпиридиний бромида) и поли-Ь-лизина на поверхности двухкомпонентных липосом из нейтрального фосфатидилхолина и отрицательно заряженного кардиолипина, а также на поверхности протеолипосом, приводит к увеличению пассивной проницаемости мембраны по отношению к нейтральной форме доксорубицина за счет структурных изменений липидного бислоя. Этот эффект увеличивается с увеличением концентрации отрицательных зарядов на поверхности липидного бислоя.

Основные результаты работы Н О Козловой (Коробовой) изложены в следующих публикациях:

1. N.O Kozlova, I.B.Bruskovskaya, N.S.Melik-Nubarov, A.A.Yaroslavov and V.A.Kabanov "Catalytic properties and conformation of hydrophobized a-chymotrypsin incorporated into a bilayer lipid membrane", FEBS Letters (1999), v. 461, pp.141-144.

2. N.O.Korobova, I.B.Bruskovskaya, N.S.Melik-Nubarov and A.A.Yaroslavov "Effect of synthetic polycation on the catalytic activity of the model membrane protein" 25th FEBS Meeting, Copenhagen (Denmark), 1998, Abstracts, P7.41.

3. N.O.Korobova, I.B.Bruskovskaya, N.S. Melik-Nubarov, A.A.Yaroslavov "Modulation of functional properties of artificially hydrophobized a-chymotrypsin by incorporation into lipid bilayer.", Cellular&Molecular biology letters (1999), v.4 (2), Abstracts of the Seminar "Liposomes and Related Structures" (Szklarska Poreba, 1999, June 10-12), p.281.

4. N.O.Korobova, I.B.Bruskovskaya, N.S.Melik-Nubarov and A.A.Yaroslavov "The interaction of polycations with protein-containing liposomes" Proc.Symposium on "Lipid and surfactant dispersed systems", Москва (Россия), 1999, сб. тезисов, стр.75-76.

5. N.O.Kozlova, I.B.Bruskovskaya, I.B.Okuneva, N.S.Melik-Nubarov, A.A.Yaroslavov "'Adsorption of the synthetic polycation onto protein-containing and protein-free liposomes", Int. Bunsen Discussion Meeting "Interactions of biopolymers with model membranes" Halle (Germany) 2000, Abstracts, P 48.

1.ВВЕДЕНИЕ

2.ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Структура и состав биологических мембран.

2.1.1. Состав биологических мембран.

2.1.2. Мембранные липиды.

2.1.3. Структурная организация липидов в смесях с водой

2.1.4. Мембранные белки.

2.1.5. Структура биологических мембран.

2.1.6. Латеральная диффузия липидов и белков в мембранах

2.1.7. Трансбислойная миграция липидов (флип-флоп).

2.1.8. Проницаемость липидных бислойных мембран.

2.1.9. Модельные мембранные системы.

2.1.10. Встраивание белков в липосомы.

2.2. Взаимодействие поликатионов с биологическими мембранами.

2.2.1. Биологические эфффекты поликатионов.

2.2.2.Влияние поликатионов на структуру отрицательно заряженных 29 липидных бислоев.

2.2.3. Изучение влияния поликатионов на структуру белок-содержащих 32 мембран.

2.2.4. Какие отрицательно заряженные компоненты клеточной 34 мембраны являются мишенью действия поликатиона?

2.3. Интерполиэлектролитные компексы.

2.3.1.Интерполиэлектролитные комплексы, образуемые 36 водорастворимыми белками и линейными полиэлектролитами

2.3.2. Комплексы, образованные полиэлектролитами и противоположно 39 заряженными липидными мембранами

2.4. Постановка задачи

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы

3.2. Методы

3.2.1 Объекты исследования

3.2.1.1. Получение гидрофобизованного а-химотрипсина.

3.2.1.2 Липосомы. 49 3.2.2. Методы исследования

3.2.2.1. Изучение ферментативной активности модифицированного 54 белка в водном растворе и при встраивании в бислой липосом.

3.2.2.2. Равновесная гель-проникающая хроматография.

3.2.2.3 Флуоресцентные методы исследования

3.2.2.4.Изучение транспорта доксорубициначерез липосомальную 57 мембрану

3.2.2.5. Изучение транспорта малых ионов через мембрану липосом

3.2.2.6. Изучение латеральной сегрегации молекул белка на поверхности 59 протеолипосом при адсорбции поликатиона.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ 61 4.1.Получение белково-липидных везикул.

4.1.1. Модификация а-химотрипсина Ы-гидроксисукцинимидным эфиром стеариновой кислоты.

4.1.2. Влияние модификации а-химотрипсина стеароилъными 63 остатками на его свойства в водном растворе.

4.1.3. Получение белково-липидных везикул методом обработки 68 ультразвуком.

4.1.4. Локализация белка в протеолипосомах.

4.1.5. Влияние степени гидрофобизации белка на его встраивание в 71 мембрану липосом.

4.1. б. Модуляция каталитической активности модифицированного а- 72 химотрипсина при его встраивании в липидный бислой.

4.2. Взаимодействие липосом, содержащих модифицированный ОС- 76 химотрипсин, с синтетическим поликатионом поли-]Ч-этил-4-винилпиридиний бромидом (ПЭВП).

4.2.1. Связывание ПЭВП с белковыми молекулами, встроенными в 76 липидную бислойную мембрану.

4.2.2. Взаимодействие поликатиона со встроенным в липосомалъную 79 мембрану белком носит электростатический характер.

4.2.3. Влияние ПЭВП на каталитическую активность 80 гидрофобизованного а-химотрипсина, встроенного в липидную бислойную мембрану.

4.2.4. Встраивание стеароилированного а-химотрипсина в 81 отрицательно заряженные липосомы под действием ПЭВП.

4.2.5. Латеральная агрегация молекул белка на поверхности липосом 83 при адсорбции ПЭВП

4.2.6. Обратимость взаимодействия.

4.2.7. Конкуренция встроенного в липосомы белка и отрицательно 88 заряженных липидов за связывание с поликатионом.

4.3. Влияние поликатиона на проницаемость мембраны КЛ-липосом и 92 ротеолипосом.

4.3.1. Влияние синтетических поликатионов на транспорт 92 противоракового антибиотика доксорубицина через бислои, состоящие из ФХ и КЛ.

4.3.2. Влияние поли-(Ы-этил-4-винилпиридиний бромида) на транспорт 97 низкомолекулярных электролитов и доксорубицина через белково-липидную мембрану.

5.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1 .Факторы, определяющие эффективность взаимодействия модифицированного белка с мембраной липосом.

5.2. Модуляция каталитической активности модифицированного а- ЮЗ химотрипсина при его встраивании в липидный бислой.

5.3. Влияние поликатиона на функциональные свойства модифицированного а- Ю5 химотрипсина в водном растворе и после встраивания в мембрану липосом.

5.4. Конкуренция отрицательно заряженых белковых и липидных молекул, 107 встроенных в липосомалъную мембрану, за связывание с ПЭВП.

5.5. Влияние поликатионов на проницаемость отрицательно заряженных ц 0 липидных мембран.

6. ВЫВОДЫ.

Изучение взаимодействия синтетических и природных полиэлектролитов с биологическими объектами привлекает большое внимание исследователей на протяжении уже 30 лет.

В первой половине 70-х годов был обнаружен эффект иммуномодулирующего действия синтетических полиэлектролитов. Совместное введение антигенов и макромолекул, способных к многоточечным кооперативным взаимодействиям с компонентами клеточной мембраны, приводило к усилению иммунного ответа клеток [1,2]. В связи с этим, был предложен принцип создания нового класса высокоэффективных искусственных иммуногенов и вакцин, представляющих собой конъюгаты белковых антигенов, гаптенов и полисахаридов с синтетическими линейными полиэлектролитами [2,3,4].

В последнее десятилетие повышенный интерес к биоактивности поликатионов вызван возможностью их использования для доставки генетического материала в клетки. В целом ряде работ было показано, что интерполиэлектролитные комплексы, образованные поликатионами и плазмидной ДНК (или олигонуклеотидами) эффективно проникают в клетки путем эндоцитоза как in vivo, так и in vitro [5-26]. При этом были использованы природные поликатионы, например, протамин [6]; и синтетические поликатионы различной природы: линейные гидрофильные (полилизин [6-9], полиэтиленимин [10-12], поли-М-этил-4-винилпиридиний бромид [13,14]), и имеющие боковые гидрофобные остатки (в частности, статистический сополимер поли-1Ч-этил-4-винилпиридиний бромида и поли-М-цетил-4-винилпиридиний бромида [13] и липополиамины [10,11]). Высокая трансфецирующая активность была обнаружена для дендримеров [15,16].

Одним из важных аспектов, исследуемых при изучении взаимодействия синтетических молекул с биологическими объектами, является цитотоксичность. В работе [12] изучали воздействие комплекса гена люциферазы с полиэтиленимином на клетки нескольких линий. Было показано, что заметная цитотоксичность таких комплексов проявлялась только при концентрациях, много превышающих концентрации, необходимые для оптимальной трансфекции.

С целью направленной доставки генетического материала в клетки, к поликатионам ковалентно присоединяют лиганд рецептора, расположенного на поверхности мембраны и специфического для данного типа клеток. В качестве таких лигандов могут выступать трансферрин, иммуноглобулины, лектины [6,7,17-21]. Так, конъюгат полилизина и инсулина был успешно использован для рецептор-опосредованного транспорта плазмид в эпителиальные клетки молочной железы овцы [21], на поверхности которых присутствуют инсулиновые рецепторы. При этом присутствие продукта экспрессии репортерного гена - люциферазы - регистрировали в молоке подопытных животных.

Существенно повышать эффективность трансфекции может конъюгирование поликатионов с вирусами и белковыми токсинами [22, 23].

В ряде случаев серьезной проблемой, возникающей при доставке олигонуклеотидов в клетки с помощью поликатионов, является невысокая растворимость образующихся интерполиэлектролитных комплексов в водных растворах. В качестве одного из способов решения этой проблемы было предложено использовать блок-сополимеры поликатионов с неионными водорастворимыми полимерами - полиэтиленоксидом (или блок сополимерами полиэтиленоксида и полипропиленоксида), обеспечивающими растворимость комплекса [24-26].

Активность поликатионов в качестве агентов для трансфекции клеток различается в зависимости от природы поликатионов. Причины этой зависимости в настоящее время дискутируются в литературе, однако пока не найдено убедительных доказательств гипотез, предлагаемых разными авторами [14, 27 ].

Таким образом, изучение поведения поликатионов при их контакте с биологическими объектами, в частности, с клеточными мембранами, представляется актуальной задачей. Адсорбция поликатионов на поверхности клеточных мембран приводит в ряде случаев к сильным физиологическим 5 эффектам. В связи с этим, не ослабевает интерес к исследованию закономерностей взаимодействия синтетических и природных полиэлектролитов с модельными мембранами. Моделирование различных аспектов взаимодействия полиэлектролитов с клетками при помощи простых систем может прояснить некоторые основные принципы взаимодействия поликатионов и полианионов с мембранами реальных клеток.

6. выводы.

1. Ацилирование а-химотрипсина остатками стеариновой кислоты придает ферменту способность прочно связываться с липидным бислоем. Эффективность связывания белка с липосомами определяется средним количеством остатков стеариновой кислоты, введенных на молекулу белка, и их взаимным расположением на поверхности белковой глобулы.

2. Модификация а-химотрипсина остатками стеариновой кислоты приводит к значительному увеличению константы Михаэлиса гидролиза низкомолекулярного специфического субстрата АТЕЕ в водном растворе. Встраивание гидрофобизованного фермента в липосомальную мембрану, построенную из электронейтрального липида приводит к повышению константы Михаэлиса вплоть до уровня, характерного для нативного белка в водном окружении.

3. Поли-(ТМ-этил-4-винилпиридиний бромид) способен адсорбироваться на поверхности белково-липидных везикул за счет электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными группами белка. Взаимодействие поликатиона с модифицированным а-химотрипсином, встроенным в липидный бислой вызывает агрегацию белковых молекул на поверхности мембраны. Снижение содержания белка приводит к исчезновению этого эффекта. Адсорбция поликатиона не оказывает влияния на функциональные свойства белка.

4. Взаимодействие ПЭВП с отрицательно заряженными липидами на поверхности липосом существенно более эффективно, чем его взаимодействие с молекулами а-химотрипсина, встроенными в состав липосомальной мембраны.

5. Адсорбция поликатионов - поли-(Ы-этил-4-винилпиридиний бромида) и поли-Ь-лизина на поверхности двухкомпонентных липосом из нейтрального фосфатидилхолина и отрицательно заряженного кардиолипина, а также на поверхности протеолипосом, приводит к увеличению пассивной проницаемости мембраны по отношению к нейтральной форме доксорубицина за счет структурных изменений липидного бислоя. Этот эффект увеличивается с увеличением концентрации отрицательных зарядов на поверхности липидного бислоя.

1. Kabanov V.A., Petrov R.V., and Khaitov R.M. / Artificial antigenes and vaccines based on non-natural polyelectrolytes // Sov. Sci. Rev. D, Physicochemical Biology, 1984, v.5, p. 277-322.

2. Петров P.B., Хаитов P.M. / Исскуствениые антигены и вакцины // М., Медицина, 1988.

3. Kabanov V.A. / Synthetic membrane active polyelectrolytes in design of artificial immunogenes and vaccines // Makromol. Chem., Macromol Symp. 1986, v.l, p.101-124.

4. Кабанов B.A., Петров P.В., Хаитов P.M. / Новый принцип создания искусственных иммуногенов // Журн. Всесоюз. Хим. об-ва им. Д.И.Менделеева, 1982, т. 27, №4, с. 417-424.

5. Thurnher М., Wagner Е., Clausen Н., Mechtler К., Rusconi S., Dinter А., Birnstiel M.L., Berger E.G., and Cotten M. / Carbohydrate receptor-mediated gene transfer to human T leukaemic cells // Glycobiology, 1994, v. 4, p. 429-435.

6. Wagner E., Zenke M., Cotten M., Beug H., Birnstiel M.L. / Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells // Proc. Natl. Acad. Sci., 1990, v. 89, p. 3410-3414.

7. Wu G.Y. and Wu C.H. / Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carrier system // J. Biol. Chem., 1987, v. 262, p. 4429-4432.

8. Wu G.Y. and Wu C.H. / Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo //J. Biol. Chem. 1988, v.263, p. 14621-14624.

9. Behr J.P. / Gene transfer with amino lipids and aminopolymers // С R Seances Soc. Biol. Fil., 1996, v. 190, p. 33-38.

10. Behr J.P., Demenix В., Loeffer J.-P., and J.Perez-Mutul / Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1989, v. 86, p. 6982-6986.

11. Kabanov A. V. / Taking polycation gene delivery systems from in vitro to in vivo // PSTT, 1999, v. 2, p.365-372.

12. Haensler J., Szoka F.C. Jr. / Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient -transfection of cells in culture // Bioconjug. Chem., 1993, v. 4, p. 372-379.

13. Wagner E., Cotten M., Foisner R., and Birstein M.L. / Transferrin-polycation-DNA complexes: the effect of polycation on the structure of the complex and DNA delivery to cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, p.4255-4259.

14. Perales J.C., Ferkol T., Molas M., and Hanson R.W. / An evaluation of receptor-mediated gene transfer using synthetic DNA-ligand complexes // Eur. J. Biochem., 1994, v. 226, p. 255-266.

15. Midoux P., Mendes C., Legrand A., Raimond J., Mayer R., Monsigny M., and Roche A.C. / Specific gene transfer mediated by lactosylated poly-L-lysine into hepatoma cells // Nucleic Acids Res., 1993, v.21, p. 871-878.

16. Rosenkranz A.A., Yachmenev S.V., Jans D.A., Serebryakova N.V., Muravev V.I., Peters R., Sobolev A.S. / Receptor-mediated endocytosis and nuclear transport of a transfecting DNA construct // Exp. Cell. Res., 1992, v. 199, p. 323-329.

17. Sobolev A.S., Rosenkranz A.A., Smirnova O.A., Nikitin V.A., Neugodova V.A., Naroditsky B.S., Shilov I.N., Shatski I.N., Ernst L.K. / Receptor-mediated transfection of murine and ovine mammary glands in vivo // J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p.7928-7933.

18. Ivanova M.M., Rosenkranz A.A., Smirnova OA., Nikitin V.A., Sobolev A.S., Landa V., Naroditsky B.S., Ernst L.K. / Receptor-mediated transport of foreign DNA into preimplantation mammalian embrios // Mol. Reprod. Dev., 1999, v. 54, p. 112-120.

19. Zauner W., Blaas D., Kuechler E., Wagner E. / Rhinovirus-mediated endosomal release of transfection complexes // J. Virol., 1995, v. 69, p. 1085-1092.

20. Nguyen H.-K., Lemieux P., Vinogradov S., Gebhart C.L., Guerin N., Paradis G., Bronich T.K., Alakhov V., and Kabanov A. / Evaluation of polyether-polyethyleneimine graft copolymers as gene transfer agents // Gene Therapy, 1999, v.6, p. 1-13.

21. Choi Y.H., Liu F., Kim J.S., Choi Y.K. / Polyethylene glycol-grafted poly-l-lysine as polymeric gene carrier // J. Control. Release, 1998, v. 54, p. 39-48.

22. Ogris M., Steinlein P., Kursa M., Mechtler K., Kircheis R., and Wagner E. / The size of DNA/transferrin-PEI complexes is an important factor for gene expression in cultured cells // Gene Ther., 1998, v. 5, p. 1425-1433.

23. Gennis R.B. Biomembranes: Molecular Structure and Functions. New York, Springer-Verlag, 1989.

24. Marsh D. / General features of phospholipid phase transitions // Chem. Phys. Lipids, 1991, v. 57:2-3, p. 109-120.

25. Laggner P. and Kriechbaum M. / Phospholipid phase transitions: kinetics and structural mechanisms // Chem. Phys. Lipids, 1991, v. 57:2-3, p. 121-146.

26. Cevc G. / Isothermal lipid phase transitions // Chem. Phys. Lipids, 1991, v. 57:23, p. 293-308.

27. Knoll W., Schmidt G„ Rotzer H„ Henkel T., Pfeiffer W„ Sackmann E., MittlerNeher S., and Spinke J. / Lateral order in binary lipid alloys and its coupling to membrane functions. // Chem. Phys. Lipids, 1991, v. 57:2-3, p. 363-374.

28. New R.R. Liposomes: a practical approach. New-York, Oxford University Press, 1990.

29. Buldt G., Wohlgemuth R. / The headgroup conformation of phospholipids in membranes // J. Mernbr. Biol., 1981, v. 58, p. 81-100.

30. Marsh D. / Studies of membrane dynamics using nitroxide spin labels // Pure Appl. Chem., 1990, v. 62, p. 265-270.

31. Флори П. Статистическая механика цепных молекул. М., Мир, 1971, с. 25

32. Ferrarini A., Nordio P.L., Moro G.J., Crepeau R.H., Freed J.H. / A theoretical model of phospholipid dynamics in membranes // J. Chem. Phys., 1989, v. 91, p. 5707-5721.

33. Jariiak M.J., Small D.M., Shipley G.G. / Nature of the thermal pretransition of synthetic phospholipids: dimyristolyl- and dipalmitoyllecithin // Biochemistry, 1976, v. 15, p. 4575-4580.

34. Berde C.B., Andersen H.C., and Hudson B.S. / A theory of the effects of head-group structure and chain unsaturation on the chain melting transition of phospholipid dispersions // Biochemistry, 1980, v. 19, p. 4279-4293.

35. Dluhy R., Chowdhry В., Cannron. D. / Infrared characterization of conformational differences in the lamellar phases of l,3-dipalmitoyl-sn-glycero-2-phosphocholine. // Biochim. Biophys. Acta, 1985, v. 821, p. 437-444.

36. Hoppe J., Sebald W. / The proton conducting F0-part of bacterial ATP synthases // Biochim. Biophys. Acta, 1984, v. 768, p. 1-27.

37. Hall T.G., Bennet V. / Regulatory domains of erythrocyte ankyrin // J. Biol. Chem., 1987, v.262, p. 10537-10545.

38. Anderson R.A., Lovrien R.E. / Glycophorin is linked by band 4.1 protein to the human erythrocyte membrane skeleton // Nature, 1984, v.307, p.655-658.

39. Cheifetz S., Boggs J.M. Moskarello M.A. / Increase in vesicle permeability mediated by myelin basic protein: effect of phosphorylation of basic protein // Biochemistry, 1985, v.24, p. 5170-5175.

40. Takagaki Y., Radhakrishnam R., Wirtz K.W.A., and Khorana H.G. / The membrane-embedded segment of cytochrome b5 as studied by cross-linking with photoactivatable phospholipids. II. The nontransferable form. // J. Biol. Chem., 1983,258, p. 9136-9142.

41. Segrest J.P., Kahane T., Jackson R.L., and Marchesi V.T. / Major glycoprotein of the human erythrocyte membrane: evidence for an amphipathic molecular structure//Arch. Biochem. Biophys., 1973, v. 155, p. 167-183.

42. Fluhrer E., Burnham V.G., and Loew L.M. / Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. // Biochemistry, 1985, v. 24:21, p. 5749-5755.

43. Henderson R., Unwin P.N.T. / Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy // Nature, 1975, v. 257, p. 28-32.

44. Hantke K., and Braun V. / Covalent binding of lipid to protein: diglyceride and amide-linked fatty acid at the N-terminal end of the murein-lipoprotein of the E.coli outer membrane // Eur. J. Bioch., 1973, v.34, p.284-296.

45. Ferguson M.A.J., Low M.G., Cross G.A.M. / Glycosyl-sn-1,2-dimyristylphosphatidylinositol is covalently linked to Trypanosoma bracei variant surface glycoprotein. // J. Biol. Chem., 1985, v. 260, p. 1457414555.

46. Wieslander A., Rilfors L., Lindblom G. / Metabolic changes of membrane lipid composition in Acholeplasma laidlawii by hydrocarbons, alcohols, and detergents: arguments for effects on lipid packing// Biochemistry, 1986, 25, p. 7511-7517.

47. Caras I.W., Weddell G.N., Davitz M.A., Nussenzweig V., Martin D.W. / Signal for attachment of a phospholipid membrane anchor in decay accelerating factor // Science, 1987, v. 238, p. 1280-1283.

48. Epand R.M. / Biophysical studies of lipopeptide-membrane interactions // Biopolymers, 1997, v. 43, p. 15-24.

49. Sefton B.M., Buss J.E. / The covalent modification of eukaryotic proteins with lipid // J. Cell. Biol., 1987, v. 104, p. 1449-1453.

50. Masamoto K. / Dependence on surface pH and surface concentration of activity of microsime-bound arylsulfatase С and the surface charge density in the vicinity of the enzyme // J. Biochem., 1984, v.95, p.715-719.

51. Nelecz M.J., Zborowski J., Famulski K.S., Wojtczak L. / Effect of phospholipid composition of the surface potential of liposomes and the activity of enzymes incorporated into liposomes // Eur. J. Bioch., 1980, v. 112, p. 75-80.

52. Clancy R.M., Wissenberg A.R., Glasser M. / Use of phospholipase D to alter the surface charge of membranes and its effect on the enzymatic activity of D-{3-hydroxybutyrate dehydrogenase // Biochemistry, 1981, v.20, p.6060-6065.

53. Clancy R.M., McPherson L.H., Glasser M. / Effect of change in the phospholipid composition on the enzyme activity of D-P-hydroxybutyrate dehydrogenase in rat hepatocytes // Biochemistry, 1983, v.22, p.2358-2364.

54. Singer S.J. and Nicolson G.L. / The fluid mosaic model of the structure of cell membranes // Science, 1972, v. 175, p. 720-731.

55. Jacobson K. / Lateral diffusion in membranes // Cell motility, 1983, v.3, p.367-373.

56. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М., Наука, 1981, с. 8-40.

57. Edidin M. Molecular motions and membrane organization as function of membrane structure. (J.B.Finean and R.H.Mishell, Eds.). New-York, Elsevier, 1981, p.37-82.

58. Saffman P.G. and Delbruk M. / Brownian motion in biological membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, v. 72, p. 3111-3113.

59. Jacobson К., Ishihara A., and Inman R. / Lateral diffusion of proteins in membranes // Annu. Rev. Physiol., 1987, v. 49, p. 163-175.

60. Saxton M.J. and Jaeobson K. / Single particle tracking application to membrane dinamics //Annu. Rev. Biophys. Biomolec. Struc., 1997, v. 26, p.373-99.

61. Sako Y. and Kusumi A. / Barriers for lateral diffusion of transferrin receptor in the plasma membrane as characterized by receptor dragging by laser tweezers: fence virus tether // J. Cell. Biol., 1995, v. 129, p. 1559-1574.

62. Kucik D.F., Elson E.L., and Sheetz M.P. / Weak Dependence of mobility of membrane proteins aggregates on aggregate size supports a viscous model of retardation of diffusion // Biophysical J., 1999, v. 76, p. 314-322.

63. Komberg R.D., McConnel H.M. / Inside-outside transitions of phospholipids in vesicle membranes//Biochemistry, 1971, 10, p. 1111-1120.

64. Ganong B.R., Bell R.M. / Transmembrane movement of phosphatidylglycerol and diacylglycerol sulfhydryl analogues // Biochemistry, 1984, v. 23, p. 4977-4983.

65. Barsukov L.I., Kulikov V.I., Bachmanova G.I. / Cytochrome P-450 facilitates phosphatidylcholine flip-flop in proteoliposomes // FEBS Lett., 1982, v. 144, p. 337-340.

66. Op den Kamp J.A. / Lipid asymmetry in membranes // Aim. Rev. Biochem., 1979, v. 48, p. 47-71.

67. Rothman J.E., Kennedy E.P. / Rapid transmembrane movement of newly synthesized phospholipids during membrane assembly // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, p. 1820-1825.

68. Cullis P.R., de Kruijff B. / The polymorphic phase behaviour of phosphatidylethanolamines of natural and synthetic origin. A 31P NMR study. // Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 513, p. 31-42.

69. Котык А., ЯначекК. Мембранный транспорт. M., Мир, 1980, с. 188-197.

70. Miller D.M. / Evidence that interfacial transport is rate-limiting during passive cell membrane permeation. // Biochim. Biophys. Acta, 1991, v. 1065, p.75-81.

71. Diamond J.M., Katz Y. / Interpretation of nonelectrolyte partition coefficients between dimyristoyl lecithin and water // J. Membrane Biol., 1974, v. 17, p. 121154.

72. McDonald R.C. / Energetics of permeation of thin lipid membranes by ions // Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 448, p. 193-98.

73. Wilson M.A. and Pohorille A. / Mechanism of unassisted ion transport across membrane bilayers // J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, p.6580-6587.

74. Hauser H., Oldany D., Phillips M.C. / Mechanisms of ion escape from phosphatidylcholine and phosphatidylserine single bilayer vesicles // Biochemistry, 1973, v. 12, p. 4507-4517.

75. Gutknecht J. / Proton/hydroxide conductance through lipid bilayer membranes // J. Membrane Biol., 1984, v.82, p. 105-112.

76. Perkins W.R., Cafiso D.S. / Characterization of H+/OH- currents in phospholipid vesicles // J. Bioenerg. Biomembr., 1987, v. 19, p.443-455.

77. Nagle J.F. / Theory of passive proton conductance in lipid bilayers // J. Bioenerg. Biomembr., 1987, v. 19, p.413-426.

78. Deamer D.W. / Proton permeation of lipid bilayers // J. Bioenerg. Biomembr., 1987, v,19,p.457-479.

79. Gutknecht J. Proton conductance through phospholipid bilayers: water wires or weak acids? // J. Bioenerg. Biomembr., 1987, v. 19, p.427-442

80. M.J.Jackson. Weak electrolyte transport across Biological membranes, General principles. In: Membrane physiology (ed.by Thomas Andreoli), New York and London, Plenum Medical Book, 1987, p.235-236.

81. Paola S., Volkov A.G., Van Hoek A.N., Haines T.H., and Deamer D.W. / Permeation of protones, Potassium Ions and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness // Biophys J., 1996, v. 70, p. 339-348.

82. Berclaz T., McConnel H.M. / Phase Equilibria in binary mixtures of dimyristoylphosphatidylcholine and cardiolipin // Biochemistry, 1981, v. 20, p. 6635-6640.

83. Marassi F., Djukic S., and Macdonald P. / Influence of lipid lateral distribution on the surface charge response of the phosphatidylcholine headgroup as detected using 2H nuclear magnetic resonance. // Biochim. Biophys. Acta, 1993, v. 1146, p. 219-228.

84. Huang C.-H. / Studies of phosphatidylcholine vesicles. Formation and physical characteristics // Biochemistry, 1969, v.8, p.344-351.

85. Takagaki Y., Radhakrishnan R., Cupta C.M., Wirtz K.W.A., and Khorana H.G. / The membrane-embedded segment of cytochrome b5 as studied by cross-linking with photoactivatable phospholipids // J. Biol. Chem., 1983, v.258, p.9128-9142.

86. Scotto A.W., Zakim D. / Reconstitution of membrane proteins: catalysis by cholesterol of insertion of integral membrane proteins into preformed lipid bilayers // Biochemistry, 1986, v.25, p. 1555-1561.

87. Dencher N.A. / Spontaneous transmembrane insertion of membrane proteins into lipid vesicles facilitated by short-chain lecithins // Biochemistry, 1986, v.25, p. 1195-1200.

88. Scotto A.W., Zakim D. / Reconstitution of membrane proteins. Spontaneous association of integral membrane proteins with preformed unilamellar lipid bilayers // Biochemistry, 1985, v.24, p.4066-4075.

89. Eytan G.D. / Use of liposomes for reconstitution of biological functions // Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 694, p. 185-202.

90. Casey R.P. / Membrane reconstitution of the energy-conserving enzymes of oxidative phosphorylation // Biochim. Biophys. Acta, 1984, v.768, p.319-347.

91. Sweet L.J., Wildren P.A., Spector A. A., and Pessin J.E. / Incorporation of the purified human placental insulin receptor into phospholipid vesicles. // Biochemistry, 1985, 24, p. 6571-6580.

92. Almog S., Kushnir T., Nir S., and Lichtenberg D. / Kinetic and structural aspects of reconstitution of phosphatidylcholine vesicles by dilution of phosphatidylcholine-sodium cholate mixed micelles // Biochemistry, 1986, v.25, p.2597-2605.

93. Ueno M., Tanford C., and Reynolds J.A. / Phospholipid vesicle formation using nonionic detergents with low monomer solubility. Kinetic factors determine vesicle size and permeability // Biochemistry, 1984, v.23, p.3070-3076.

94. Enoch H.G. and Stritmatter P. / Formation and properties of 1000-A-diameter, single-bilayer phospholipid vesicles // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, v. 76, p. 145-149.

95. Allen T.M., Romans A.Y., Kercret H., and Segrest J.P. / Detergent removal during membrane reconstitution // Biochim. Biophys. Acta, 1980, v. 601, p. 328342.

96. Aimer B.M. / Interaction of (Na+ + K+)-ATPase with artificial membranes. I. Formation and structure of (Na+ + K+)-ATPase-liposomes. // Biochim. Biophys. Acta, 1985, v. 822, p. 319-334.

97. Carroll R.C. and Racker E. / Preparation and characterization of cytochrome c oxidase vesicles with high respiratory control // J. Biol. Chem., 1977, v. 252, p. 6981-6990.

98. Grover A.K., Slotboom A.J., de Haas G.H., and Hammes G.G. / Lipid specificity of beta-hydroxybutyrate dehydrogenase activation // J. Biol. Chem., 1975, v. 250, p. 31-38.

99. Coakley W.T., Heweison L.A., and Tilley D. / Interfacial instability and the agglutination of erythrocytes by polylysine // Eur. Biophys. J., 1985, 13, p. 123130. •

100. Hewison L.A., Coakley W.T., and Meyer H.W. / Spatially periodic discrete contact regions in polylysine-induced erythrocyte-yeast adhesion. // Cell Biophys., 1988, v. 13, p. 151-157.

101. Dwyer D.M. / Cell surface saccharides of Trypanosoma lewisi. I. Polycation-induced cell agglutination and fine-structure cytochemistry. // J. Cell Sci., 1975, 19, p. 621-644.

102. Yaroslavov A.A., Koulkov V.Ye., Yaroslavova E.G., Ignatiev M.O., Kabanov V.A., and Menger F.M. / Competitive interactions in negatively charged liposome-polycation-polyanion ternary system // Langmuir, 1998, 14, p. 59996004.

103. Kabanov V.A., Yaroslavov A.A., Sukhishvili S.A. // J. Controlled Release, 1996, v. 39, p. 173-182.

104. Yaroslavov A.A., Koulkov V.Ye., Polynsky A.S., Baibakov B.A., and Kabanov V.A. / A polycation causes migration of negatively charged phospholipids from the inner to outer leaflet of the liposomal membrane. // FEBS Lett., 1994, v. 340, p. 121-126.

105. Hancock R.E. / The bacterial outer membrane as a drug barrier. // Trends Microbiol., 1997, v. 5, p. 37-42.

106. Santini M.T., Cametti £., Indovina P.L., Morelli G., and Donelli G. / Polylysine induces changes in membrane electrical properties of K562 cells. // J. Biomed. Mater. Res., 1997, v. 35, p. 165-174.

107. Schneeman R., Krogmann D.W. / Polycation interactions with spinach ferredoxin-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reductase // J. Biol. Chem., 1975, v. 250, p. 4965-4971.

108. Rink T., Bartel H., Jung G., Bannwarth W., and Boheim G. / Effects of polycations on ion channels formed by neutral and negatively charged alamethicins. // Eur. Biophys. J., 1994, v. 23, p. 155-165.

109. Sachs J.R. / Soluble polycations and cationic amphiphiles inhibit volumesensitive K-Cl cotransport in human red cell ghosts // Am. J. Physiol., 1994, v.266, p. C997-C1005.

110. McEwan G.T.A., Jepson M.A., Hirst B.H., Simmons N.L. / Polycation-induced enhancement of epithelial paracellular permeability is independent of toghtjunctional characteristics// Biochim. Biophys. Acta, 1993, v. 1148, p.51-60.

111. Peterson M.W., Gruenhaupt D. / Protamine increases the permeability of cultured epithelial monolayers // J. Appl. Physiol., 1990, v.68, p.220-227.

112. Peterson M.W., Gruenhaupt D. / Protamine interaction with the epithelial cell surface //J.Appl. Physiol., 1992, v.72, p.236-241.

113. Uchida D.A., Irvin C.G., Ballowe C., Larsen G., Cott G.R. / Cationic proteins increase the permeability of cultured rabbit tracheal epithelial cells: modification by heparin and extracellular calcium // Exp. Lung. Res., 1996, v.22, p.85-99.

114. Elferink J.G., Deierkauf M. / Permeabilization and calcium-dependent activation of rabbit polymorphonuclear leukocytes by poly-L-arginine. // Inflammation, 1989, v. 13, p. 285-294

115. Katsu T., Yoshimura S., and Fujita Y. / Increases in permeability of Escherichia coli outer membrane induced by polycations // FEBS Lett., 1984, v. 166, p. 175-178.

116. Vaara M. / Agents that increase the permeability of the outer membrane // Microbiol. Rev., 1992, v. 56:3, pp.395-411.

117. Hammes M., Singh A. / Effect of polycations on permeability of glomerular epithelial cell monolayers to albumin // J. Lab. Clin. Med., 1994, v. 123, p. 437446.

118. Vehaskari V.M., Root E.R, Germuth F.G. Jr., and Robson A.M. / Glomerular charge and urinary protein excretion: effects of systemic and intrarenal polycation infusion in the rat // Kidney Int., 1982, v. 22, p. 127-135.

119. Hunsicker L.G., Bertolatus J. A. / Charged compounds of the glomerular filter and their role in normal and disordered permselectivity. // Artif. Organs, 1987, v. 11, p. 468-477.

120. Hunsicker L.G., Shearer T.P., Shaffer S.J. / Acute reversible proteinuria induced by infusion of the polycation hexadimethrine // Kidney Int., 1981, v. 20, p. 7-17.

121. Andrews P.M., Bates S.B. / Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. // Anat. Rec., 1985, v.212, p. 223-231.

122. Bertolatus J.A., Abuyousef M., Hunsicker L.G. / Glomerular sieving of high molecular weight proteins in proteinuric rats. // Kidney Int., 1987, v. 31, p. 12571266.

123. Wang Z., Liu Z., Zhang X., Tan J. / Changes in glomerular polyanions and ultrastructure induced by protamine in rats // Hua Hsi I Ko Ta Hsueh Hsueh Pao, 1992, v. 23, p. 272-275.

124. Ярославов А.А., Кученкова О.Е., Ярославова Е.Г., Кабанов В.А./ О кардинальном различии во взаимодействии отрицательно заряженных липосом с полилизином и поли-Ы-этил-4-винилпиридиний бромидом // Доклады Акад.Наук, 1997, 354, с. 350-352

125. Ikeda Т., Yamaguchi Н., Tazuke S. / Phase separation in phospholipid bilayers induced by biologically active polycations // Biochim. Biophys. Acta, 1990, v. 1026, p. 105-112.

126. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev Y.I., Ermakov Y.A., and Kabanov V.A. / Reversibility of structural rearrangements in lipid membranes induced by adsorption-desorption of a polycation // Membr. Cell. Biol., 1997, v. 10, p. 683688.

127. Galla H.-J., Sackmann E. / Chemically induced lipid phase separation in model membranes containing charged lipids: a spin label study. // Biochim. Biophys. Acta, 1975, v. 401, p. 509-529.

128. Carrier D., Dufourcq J., Faucon J.-F., Pezolet M. // Biochim. Biophys. Acta, 1985, v. 820, p. 131-139.

129. Carrier D., Pezolet M. / Investigation of polylysine-dipalmitoylphosphatidylglycerol interactions in model membranes. // Biochemistry, 1986, v. 25, p. 4167-4174.

130. V.A.Kabanov, A.A.Yaroslavov, S.A.Sukhishvili / Interaction of polyions with cell-mimetic species: physico-chemical and biomedical aspects // .Controlled Release, 1996, 39, p. 173-189.

131. Clague M.J., Cherry R.J. / A comparative study of band 3 aggregation in erythrocyte membranes by melittin and other cationic agents. // Biochim. Biophys. Acta, 1989, v. 980, p. 93-99.

132. Schindler M., Koppel D.E., Sheetz M.P. / Modulation of membrane protein lateral mobility by polyphosphates and polyamines // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1980, v.77, p. 1457-1461.

133. Elgsaeter A., Shotton D.M., Branton D. / Intramembrane particle aggregation in erythrocyte ghosts. II. The influence of spectrin aggregation // Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 426, p. 101-122.

134. Ohno H., Shimidzu N., Tsuchida E., Sasakawa S., Honda K. / Fluorescence polarization study of membrane fluidity of human erithrocyte ghosts indused by synthetic water-soluble polymers // Biochim. Biophys. Acta, 1981, v. 649, p. 221-228.

135. Morgan D.M., LarvinV.L., Pearson J.D. / Biochemical characterisation of polycation-induced cytotoxicity to human vascular endothelial cells // J. Cell. Sei., 1989, v. 94, p. 553-559.

136. Needham L„ Hellewell P.G., Williams T.J., Gordon J.L. / Endothelial functional responses and increased vascular permeability induced by polycations. // Lab. Invest., 1988, v. 59, p. 538-548.

137. Mislick K.A., Baldeschwieler J.D. / Evidence for the role of proteoglicanes in cation-mediated gene transfer// Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, v. 93, p. 1234912354.

138. Philipp B., Dautzenberg H., Linow K.-J., Kotz J., Dawidoff W. / Polyectrolyte Complexes Recent Developments and Open Problems // Prog. Polym. Sei., 1989, v. 14, p. 91-172.

139. Кабанов В.А. / Фнзикохимические основы и перспективы использования растворимых интерполиэлектролитных комплексов // Высокомолек. Соед., 1994, т. 36, с. 183-197.

140. Koetz J., Koepke Н., Schmidt-Naake G., Zarras P., and Vogl O. / Polyanion-polycation complex formation as a function of the position of the functional groups // Polymer, 1996, v.37, p.2775-2781.

141. Schubert.M, Franklin E.G. / Interaction in Solution of Lysozyme with Chondrotin Sulfate and its Parent Proteinpolysaccharide // J. Am. Chem. Soc., 1961, v. 83, p. 2920.

142. Dubin P.L., Ross T.D., Sharma I., Yegerlehner B.E. // ASC symposium, 1987, v. 342, c. 162-169.

143. Кабанов B.A., Мустафев М.И., Гончаров В.В. / Растворимые комплексы бычьего сывороточного альбумина с поли-4-винилпиридиниевыми поликатионами, содержащими N-цетильные боковые радикалы // Высокомолек. Соед., 1981, т. А23, с. 255-260.

144. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. / Кинетика макромолекулярного обмена в растворах комплексов белков с полиэлектролитами//ДАН СССР, 1986, т.291, с. 1150-1154.

145. Изумрудов В.А., Бакеев К.Н., Зезин А.Б., Кабанов В.А. / О влиянии плотности заряда полигона на скорость интерполиэлектролитных реакций.// ДАН СССР, 1986, т. 286, с. 1442-1445.

146. Стрельцова 3.А. Дисс. канд. хим. наук, М., 1975, с. 143.

147. Мустафев М.И., Царева А.Е., Евдаков В.П. / Взаимодействие поли-4-винилпиридина с сывороточным альбумином в кислых средах // Высокомолек. Соед., 1975, т. А17, с. 2226-2230.

148. Сухишвили С.А., Николайчик Д.В., Полинский А.С., Ярославов А.А., Чечик О.С., Кабанов В.А. //Иммунология, 1989, №2, с.82-84.

149. Кабанов В.А., Евдаков В.П., Мустафаев М.И., Антипина А.Д. / Кооперативное связывание сывороточного альбумина с кватернизованными поли-4-винилпиридинами и структура образующихся комплексов.// Молек. биол., 1977, т. 11, с. 582-597

150. Kabanov V.A., Zezin A.B., Rogacheva V.B., Grishina N.V., and Goethals E.J / Properties of polyelectrolyte complexes containing poly(N-tret-butylaziridine). // Macromol. Chem., 1986, v. 187, p. 1151-1158.

151. Tsang Y., Thompson Т.Е. / The use of Combined Schlieren and Adsorption Optics in an Electrophoretic Study of the Reversibly Interacting System Dextran Sulfate Carboxyhemoglobin // J. Phys. Chem., 1965, v. 69, p. 4242-4249.

152. Hofstee B.H. / Solubility and Composition of Protein-Deoxiribonucleic Acid Complexes // Biochim. Biophys. Acta, 1964, v.91, p. 340-343.

153. Изумрудов B.A., Зезин А.Б., Кабанов B.A. / Макромолекулярный обмен в растворах комплексов глобулярных белков с неприродными полиэлектролитами // ДАН СССР (физ. химия), 1984, т.275, с. 1120-1123.

154. Гладилин А.К., Левашов А.В. / Катализ надмолекулярными фермент-полимерными комплексами (ассоциатами) в органических средах // Успехи биологической химии, 1996, т.36, с. 141-161.

155. Margolin A.L., Izumrudov V.A., Svedas V.K., Zezin A.B., Kabanov V.A., Berezin I.V. / Preparation and properties of penicillin amidase immobilized in polyelectrolyte complexes. // Biochim. Biophys. Acta, 1981, v. 660, p. 359-365.

156. Изумрудов B.A., Марголин А.Л., Шерстюк С.Ф., Швядас В.К., Зезин А.Б., Кабанов В.А. / Свойства нестехиометричных полиэлектролитных комплексов, содержащих ферменты // ДАН СССР СССР (физ. химия), 1983, т.269, с. 631-634.

157. Margolin A.L., Sherstjuk S.F., Izuimudov V.A., Svedas V.K., Zezin A.B., Kabanov V.A. / Enzymes in polyelectrolyte complexes. The effect of phase transition on thermal stability // Eur. J. Biochem., 1985, v. 146, p. 625-632.

158. Кабанов B.A., Зезин А.Б., Изумрудов B.A. / Синтетические полиэлектролиты как регуляторы ферментативных реакций // Итоги науки и техники, сер. Биотехнология, 1987, т. 4, с. 159-198.

159. Zezin А.В., Izumrudov V.A., Kabanov V.A. / Interpolyelectrolyte Complexes as a New Family of Enzyme Carriers // Makromol. Chem. Makromol. Symp., 1989, v. 26, p. 249-264.

160. Linse P. / Adsorption of weakly charged polyelectrolytes at oppositely charged surfaces // Macromolecules, 1996, v.29, p.326-336.

161. Borukhov 1., Andelman D., and Orland H. / Scaling laws of polyelectrolyte adsorption // Macromolecules, 1998, v.31, p. 1665-1671.

162. Vermeer A.W.P., Leermakers F.A.M., Koopal L.K. / Adsorption of weak polyelectrolytes on surfaces with a variable charge. Self-consistent-field calculations // Langmuir, 1997, v. 13, p.4413-4421.

163. Talingting M.R., Ma Y., Simmons C., and Webber S.E./ Adsorption of cationic polymer micelles on polyelectrolyte-modified surfaces // Langmuir, 2000, v. 16, p.862-865.

164. Yaroslavov A.A., Koulkov V.Ye., Yaroslavova E.G., Ignatiev M.O., Kabanov V.A. / Competitive interactions in negatively charged liposomes polycation - polyanion ternary systems // Langmuir, 1998, 14, p.5999-6004.

165. V.Vigneaud, C.E.Meyer / The racemization of aminoacids in aqueous solution by acetic anhydride // J. Biol. Chem., 1932, v. 98, p. 305.

166. Торчшшн В.П., Клибанов А.Л. / Способ улучшения связывания гидрофильного белка с липосомами // Биоорган. Химия, 1980, т.6, с.791-793.

167. Huang A., Tsao Y.-S., Kennel S.J., and Huang L. / Characterization of antibody covalently coupled to liposomes // Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 716, p. 140-150.

168. Birktoft J.J. and Blow D.M. / Structure of crystalline -chymotrypsin. V. The atomic structure of tosyl-chymotrypsin at 2 A resolution // J. Mol. Biol., 1972, v. 68, p. 187-240.

169. Fields R. / The measurement of amino groups in proteins and peptides. // Biochem. J., 1971, v. 124, p. 581-590.

170. Schombaum G.R., Zerner В., Bender M. / The Spectrophotometric Determination of the Operational Normality of an a-Chymotrypsin Solution // J. Biol. Chem., 1961, v. 236, p. 2930-2938.

171. Levilliers, N., Peron-Renner, M. and Pudles, J. (1974) In: Bayer-Symposium V «Proteinase Inhibitors», Springer-Verlag, p. 432-444.

172. Hummel J.P., Dreyer W.J. / Measurement of Protein-binding Phenomena by Gel Filtration // Biochim Biophys. Acta, 1962, v. 63, p. 530.

173. Lehrer S.S. / Solute perturbation of protein fluorescence. The quenching of the tryptophyl fluorescence of model compounds and of lysozyme by iodide ion. // Biochemistry, 1971, v. 10, p. 3254-3262.

174. Aiyer R.A. / Structural characterization of insulin receptors. II. Subunit composition of receptors from turkey erythrocytes // J. Biol. Chem., 1983, v. 25, p. 15000-15003.

175. Damerval C. // Electrophoresis, 1987, v. 8, p. 158-159.

176. Torchilin, V.P., OmePyanenko, V.G., Klibanov, A.L., Mikhailov, A.I., Gol'danskii, V.I. and Smirnov, V.N. / Incorporation of hydrophilic protein modified with hydrophobic agent into liposome membrane // Biochim. Biophys. Acta, 1980, v. 602, p. 511-521.

177. Ando Y., Inoue M., Utsumi T., Morino Y., and Araki S. / Synthesis of acylated SOD derivatives which bind to the biomembrane lipid surface and dismutate extracellular superoxide radicals // FEBS Lett., 1988, v. 240, p. 216220.

178. Means G. E. and Feeney R.E. Chemical Modification of Proteins. San Francisco, Holden-Day, 1971.

179. Kabanov A.V., Levashov, A.V. and Martinek, K. (1986) Vestnik MGU, Ser. Chimiya (in Russian) v. 27, 591-594.

180. Pshezhetsky, A.V., Kabanov, A.V., Klyachko , N.L., Berezin , I.V , Martinek, K. and Levashov, A.V. // Doklady Biochemistry (English edition), 1988, v. 328, p. 44-46.

181. Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. New-York, Plenum Press, 1983.

182. Kabanov A.V., Nametkin S.N., Levashov A.V. and Martinek K. // Biol. Membr. (in Russian), 1985, v. 2, c. 985-995.

183. Peitzsch R.M., McLaughlin S. / Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins // Biochemistry, 1993, v. 32, p. 10436-10443.

184. Shahinian S., Silvius J.R. / Doubly-lipid-modified protein sequence motifs exhibit long-lived anchorage to lipid bilayer membranes // Biochemistry, 1995, v. 34, p. 3813-3822.

185. Takahashi D., Kubota Yu., Kokai K., Izumi T., Hirata M., Kokufuta E. / Effects of surface charge distribution of proteins in their complexation with polyelectrolytes in an aqueous salt-free system // Langmuir, 2000, v. 16, p.3133-3140.