Новый тип водорастворимых комплексов белок-полиэлектролит тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

~5 ! О 3 1

МОСКОВСКИ!! ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОП РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Ш правах рукописи УДК 511 (49 +В 4): 547.96

ЗАЙЦЕВ Владимир Сергеевич

НОВЫП ТИП ВОДОРАСТВОРИМЫХ КОМПЛЕКСОВ Б ЕЛОК - ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТ

(02.00.06 — Химия высокомолекулярных соединений)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических паук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена d лаборатории полиалектролитов и биополимеров кафедры шсокомолскуляриых соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук В.А. Изумрудов

доктор химических наук профессор Ю.Э, Кирш

Ведущая организация:

доктор химических наук профессор U.M. Паписов

институт биохимии им.А.Н. Баха РАН

Защита состоится 21 октября 1902 года в 15 час. на заседании специа\изиромнного совета Д 1)53.05.43 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова но адресу: 119839, ГСП, Москва, Ленинские Горы, МП', Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд,501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ,

Автореферат разослан 10 сентября 1992 года.

Ученый секретарь совета кандидат химических наук

Т.К. Бронич

ТТГГ 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

|Т*?П I

- АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Комплексы белков с линейными природными полиионамя, к числу которых относятся хроматин, рибосомы, информасомы и другие компоненты клетки, а также вирусы, широко распространены в живой природе я выполняют важные функции. Можно считать установленным, что основной вклад в стабилизацию комплексов природных полиионов с белками вносит кооперативное электростатическое взаимодействие, в которое вовлекаются ионогенные группы белков, экспонированные аа поверхности глобул. Комплексы глобулярных белков с линейными синтетическими полиэлектролитами представляют собой удобные модели для изучения таких взаимодействий.

Замечательным свойством палвзлектролвт- белковых комплексов является их способность растворяться в воде при содержании в их частицах определенного избытка вескоыпенсированных заряженных звеньев синтетического полииона. Изучение этих растворимых комплексов, в которых роль лиофилизпрующих фрагментов играют участки цепей полиаоиа, позволило выявить принципы самосборки комплексных частиц, исследовать их структуру и некоторые важные свойства. Результаты такого рода исследований необходимы для осуществления направленного синтеза комплексов полиэлектролитов с белками и оптимизации применения синтетических полиионов в различных отраслях народного хозяйства в качестве высокоэффективных флокулянтов, стабилизаторов коллоидных дисперсий, ионообменных материалов, мембран, связующих, сорбентов, струкгурообразователей, физиологически активных соединений и т.д. Эта задача становится особенно актуальной в связи с перспективой использования поляэлектролитов и водорастворимых иитерполиэлектролитных комплексов в качестве носителей биологически активных веществ, в частности ферментов, и применения их в этом качестве в биотехнологии и медицине.

В данной работе, наряду с исследованием полиэлектролит-белковых комплексов, впервые изучен другой тип водорастворимых комплексов — белок- аолнэлектролптпые комплексы^ в которых функцию

лиофилизирующего компонента выполняет включенный в избытке белок. Исследование образованна, строения и свойств таких комплексов позволяет получить информацию, полезную для понимания самосборки и структуры вирусных частиц, механизмов физиологической активности синтетических полиионов и искусственных иммуногенов, для разработки новых высокочувствительных я экспрессных диагностических систем.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ заключается в выявлении общих принципов образования водорастворимых комплексов глобулярных белков с полиэлектролитами, изучении факторов, влияющих на этот процесс, а также исследовании структуры в свойств образующихся белок.-полиэлекгролитных и полиэлектролиг-белковых комплексов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. При исследовании взаимодействия бычьего сывороточного альбумина (БСА) и поликатиона поли--1Ч-этил-4-вивилпнрндиний бромида (ПЭВП) обнаружено и впервые изучено образование водорастворимого бело к- п оли электролитного комплекса, в котором функцию лиофилизирующего компонента выполняет белок. В частицу комплекса включена одна цепь высокомолекулярною ПЭВП и такое количество глобул БСА, которое обеспечивает ее растворимость и соответствует двукратному избытку отрицательно заряженных карбоксилатных групп БСА по отношению к положительно заряженным пиридиниевым группам ПЭВП. Существенно, что образование растворимого комплекса при добавлении БСА к нерастворимому стехиометричному комплексу БСА—ПЭВП приводит к сосуществованию растворимого комплекса и осадка, то есть сопровождается диспропорционироваяием комплексных частиц по составу. Установлены диапазоны изменения рН и концентрации вводимого низкомо — лекулярного электролита (NaCI), отвечающие существованию растворимых белок-полиэлектролитных комплексов, и выявлена их зависимость от длины цели полимера и состава смеси.

Обнаружено, что степень полимеризации поликатиона может оказывать определяющее влияние на образование и свойства водорастворимых полвэлектролиг-белковых комплексов ПЭВП—БСА, в которых роль лиофилизирующего компонента играет ПЭВП. Показано,

что поли-М-этил-4-винилпиридиний бромид с Рп<50 ве способен образовывать с БСА растворимых полиэлекгролит-белковых комплексов.

Выявлены общие структурно-термодинамические принципы образования водорастворимых белок-полиэлектролитных и полиэлектролит-белковых комплексов.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Полученные в работе результаты могут иметь важное значение при использовании полиэлектролитов для разделения смесей биополимеров, разработке новых эффективных лекарственных веществ, вакцин и диагностических средств. Саму возможность образования водорастворимых белок-полиэлекггролитаых комплексов следует иметь в виду при использовании синтетических полиионов в качестве флокулянтов в процессах утилизации ценных белковых веществ из отходов пищевой и фармацевтической промышленности и при производстве кормового белка.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены па I международной школе—семинаре "Нетрадиционные методы синтеза полимеров" (Алма-Ата, 1990), на IV Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1991), на международной школе—семинаре "Современные проблемы физической химии макромолекул" (Пущино, 1991), на II Всесоюзной научно—технической конференции "Свойства и применение водорастворимых полимеров" (Ярославль, 1991), на IX Всесоюзном Симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Звенигород, 1991).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( названия). Работа изложена на страницах, содержит рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулирована цель исследования и отражена ее научная новизна.

Раздел 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В этой главе проведен анализ современного состояния ис — следований взаимодействия глобулярных белков с противоположно заряженными природными в синтетическими полиэлектролитами. Сделан вывод, что большинство опубликованных по этой теме работ ограничено изучением образования и свойств нерастворимых продуктов такого взаимодействия — стехиометричпых комплексов, которые включают эквп— мольные количества заряженных групп белка и полииова. Работ, посвященных растворимым нестехиометричным поляэлекгролит-белковым комплексам, меньше, однако полученные в них результаты позволили существенно продвинуться в понимании структуры и принципов самосборки комплексов белков с полииоыама. Водорастворимые белок-поли— электролитные комплексы, образующиеся при большом избытке белка, практически не изучены. Это предопределяет необходимость исследования растворимых комплексов обоих типов с целью выявления общих принципов их образования, строения и свойств их частиц.

Раздел 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

В этой главе приведены методики синтеза ПЭВП, который получали исчерпывающим алкилыровавием фракций поли-4-винил— пиридина (ПВП) бромистым этилом. Использовали фракции ПВП со среднечасовыми степенями полимеризации Рп=10-30, измеренными эбуллиоскопией, и фракции ПВП со средневесовыми степенями полимеризации Ру,= 120 - 4 ООО, измеренными светорассеянием. Описаны методы исследования: спектрофотометрия, аналитическая скоростная седиментация, квазиупругое рассеяние лазерного света (КУРЛС) и др.

Эксперименты, за исключением специально оговоревных случаев, проводили при рН 10 в 0,01 М трас—буфере, содержащем 0,01 М N301. В этих условиях БСА находится в нативном состоянии и имеет отрицательный заряд за счет карбоксилатных групп, находящихся на поверхности белковой глобулы в количестве, близком к 55.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Раздел 3. Водорастворимые белок-полиэлектролитные комплексы.

Глава 3.1. Образование растворимых комплексов БСА—ПЭВПи структура их частиц.

Результаты турбидиметрического титрования раствора ПЭВП раствором БСА приведены на рис.1 в виде зависимости относительной оптической плотности раствора А/Аии от состава смеси О, который выражали в виде отношения количества отрицательных зарядов на белковых глобулах [ —] к количеству положительных зарядов поликатионов [+] в смеси. Величина О связана с весовыми концентрациями компонентов С (г/л) соотношением

О = [-!/[+! = 55 к (С^/ М^) / (С^/ М^) (1)

в которое входят молекулярпые массы БСА (М=6,7x10*) и звена ПЭВП (М=214), а 55 — количество отрицательно заряженных карбоксилатных групп на поверхности одной глобулы БСА, способных образовывать солевые связи с поликатионами. Состав комплекса <р можно определить аналогичным соотношением, в котором [ — ] и [+] относятся к частицам комплекса. На рис.1 можно выделить три области составов реакционных смесей: в области I, характеризующейся недостатком БСА (0<0,33), в системе образуются водорастворимые комплексы ПЭВП—БСА, в которых роль лиофилизпрующего компонента играют линейные поликатионы; последующее добавление БСА приводит к фазовому разделению и нарастанию мутности раствора (область П), максимальное значение мутности достигается при эквивалентном соотношении противоположно заряженных групп белка и поликатиона (0=1); добавление белка сверх этого эквивалентного соотношения сопровождается уменьшением мутности раствора н при 0>2,3 (область Ш) система вновь становится гомогенной. Можно предположить, что при 0>1 существуют водорастворимые отрицательно заряженные частицы комплекса БСА—ПЭВП, в которых лиофилизирующим компонентом служит белок.

"З/ЗмдХ

О 1 2 3 у Рис.1. Кривая турбидиметричес-кого титрования раствора ПЭВП раствором БСА; Рпзвгт=1 300.

Г 2 3 0

Рис.2, Определенные из седимен — тограмм зависимости относитель— пых площадей пиков БСА

(1) и комплекса (2) от состава смеси

О-Р,

ПЭВП

= 1 300, Сгош=0,2 г/л.

Для проверки этого предположения мы провели иследоьаиия с использованием метода скоростной седиментации в обычном (шлирен-оптикой) и в сканирующем вариантах. Седимеотационный анализ показывает, что в надосадочной жидкости смеси, содержащей эквивалентные количества БСА и ПЭВП (0 = 1), отсутствуют полимерные компоненты (белок, поликатиои и их растворимые комплексы). Это означает образование нерастворимого стехиометричного комплекса белок-поли — катион состава <р= I с количественным выходом. На седиментограммах надосадочных жидкостей в смесях, содержащих белок сверх эквивалентного количества (С?>1), обнаруживаются два пика. Медленная компонента имеет практически такой же коэффициент седиментации, что и БСА (8=4,33), а коэффициент седиментации быстрой компоненты зс возрастает с ростом степени полимеризации ПЭВП (см.табл.1). Таким образом при 0>1 в надосадочной жидкости сосуществуют свободный белок и частицы водорастворимого комплекса БСА—ПЭВП. С этим выводом согласуются результаты исследования методом скоростной седиментации

в сканирующем варианте растворов смесей БСА с меченым хромофорной метиленантрильной группой ПЭВП (Хет=336нм). В надосадочной

жидкости таких смесей составов 0>1 весь поликатион обнаруживается в быстро седимеятирующих частицах.

На рис.2 приведены зависимости относительных площадей седиментационных пиков БСА (кривая 1) и комплекса (кривая 2) от состава смеси О ( — площадь пика комплекса при составе смеси

0=3,2). Видно, что добавление белка вплоть до растворения осадка (0^2,3) сопровождается одновременным увеличением площадей обоих пиков, причем площадь пика комплекса значительно превышает площадь пика белка. После полного растворения осадка (0>2,3) площадь пика комплекса практически перестает меняться, а темп увеличения площади пика белка возрастает. Во всей области составов при 0>1 коэффициент седиментации зс растворимого комплекса меняется слабо. Из этих данных

следует, что состав комплексных частиц ср, образующихся уже при незначительном избытке белка и сосуществующих с осадком {рис.1, область П), близок к. составу частиц в гомогенной системе, содержащей большой избыток белка (рис.1, область III), и осадок растворяется путем образования комплекса, значительно (приблизительно двукратно) обогащенного белком. Таким образом, растворение сопряжет с даспропор — цвоняровааием комплексных часгтг по составу. Критический состав <р* растворимого комплекса определяется минимальным количеством белка, достаточным для придания частице необходимой для растворения гидрофильное™. Понятно, что при 0= 1 все доступные для взаимодействия положительно заряженные звенья поликатиона уже участвуют в образовании ионных связей с белком. С ростом О в области 0>1 общее число солевых связей в расчете на поликатион остается неизменным: уменьшается лишь их число, приходящееся на одну белковую глобулу. Поэтому включение дополнительного числа глобул в растворимый комплекс критического состава (р* практически не происходит, так как это привело бы к энтропийно невыгодному уменьшению общего числа частиц, нескомпенсированному уменьшением энтальпии системы.

Мс*10"6

Рис.3. Зависимость молекулярной массы Мс комплекса БСА—

4 •

/

ПЭВП от степени полимеризации полимера Р^^- О=2,3,

СпЭвгт=0-2г/л.

пэвп"

2

/

О

О 500 1000 1500 Р,

ПЭВП

На рис.3 приведена зависимость средней молекулярной массы Мс комплексов БСА—ПЭВП от степени полимеризации образующих их поликатионов. Значения Мс рассчитывали по формуле Сведберга:

где Я — универсальная газовая постоянная, Т — температура (293° К), р — плотность растворителя, Б и бс — соответственно коэффициенты

диффузии и седиментации комплексных частиц, измеренные при концентрации БСА в системе 3 г/л. Удельные парциальные объемы V комплексов БСА—ПЭВП и свободного БСА практически совпадают и составляют 0,?5±0,03. Значения вс определяли из седиментограмм

растворов БСА—ПЭВП состава 0=2,3, а величины Б — из результатов исследования тех же растворов методом КУРЛС. Измеренное методом светорассеяния среднее значение Б [Т>2) для растворов, которые помимо частиц поликомплекса содержат также свободный белок, характеризует в основном крупные комплексные частицы. Из линейного вида этой зависимости следует, что наращивание длины полимерной цепи приводит к соответствующему росту числа глобул в комплексе, а его состав ¡р* в пределах ошибки определения остается практически неизменным. Рассчитанное из тангенса угла наклона прямой на рис.3 среднее значение состава комплекса составляет ^Р* = 1,9+0,3. Зная величины Мс, <р* и

Мс= ИТ х (зс/Б) / [\-рр)

(2)

молекулярные массы компонентов, можно рассчитать количество молекул белка ]ЧБСД и поликатиова КГГЭЕГТ в комплексе. Из этих данных (табл.1)

следует важный вывод: в частице растворимого белок-полиэлектролит— него комплекса с относительно высокомолекулярными поликатионами (Рпэш^250) содержится только одна цепь поликатиона.

р ГТЭЕП ±5% 8схЮ'3 ±10% Мсх10"э ±15% N пэвгт ^ьел

1300 0,92 33 3 300 1 46

640 1,5 29 1 800 1 25

370 1,9 22 1 000 1 14

250 2,3 18 720 1 10

120 3,0 14 430 1.5 6

30 3,6 10 260 3 3

20 3,8 8,6 210 4 3

10 5,1 6,6 125 5 2

Таблица 1. Результаты седиментационного анализа растворов белок-полпэлектролптпьгх комплексов БСА—ПЭВП.

С уменьшением степени полимеризации ПЭВП число глобул БСА в растворимом комплексе снижается, однако получить растворимый комплекс, содержащий одну белковую глобулу, не удается. Как следует из нижней строки табл.1, даже в случае олигомера с Рпэвп=10 частица

комплекса, имея тот же состав <?* = 1,9±0,3, включает в себя две молекулы белка. Можно полагать, что такая ассоциация молекул белка является следствием неполярных взаимодействий. Известно, что молекулы БСА в водных растворах склонны к самопроизвольному образованию димеров. Комплексообразование белка с олигокатиовами, сопровождающееся уменьшением суммарного отрицательного заряда поверхности белковых глобул, может способствовать этому процессу. Очевидно, именно этим,

наряду с необходимостью соблюдения в комплексе соотношения заряженных групп у*, определяется структура образующихся растворимых комплексов, которые включают в себя более одной глобулы БСА и соответствующее количество молекул олигокатионов. С ростом степени полимеризации ПЭВП, а значит, и числа глобул БСА в комплексе, вклад этого фактора в изменение свободной эпергии системы снижается, и самосборка растворимых комплексных частиц начинает осуществляться в соответствии с требованием энтропийно выгодного образования максимально возможного числа частиц растворимого комплекса состава что реализуется при включении в их состав только одной цепи ПЭВП,

Ранее описанные растворимые комплексы, образующиеся при избытке линейных поликатионов, представляют собой конгломераты глобул БСА, каждый из которых опоясан одной молекулой ПЭВП. Гидрофильность таких частиц обусловлена некомпенсированными зарядами звеньев линейных цепей, находящихся в петлях и в концевых фрагментах. (Рис.4а). Можно предположить, что обнаруженные нами водорастворимые белок-полиэлекгролитные комплексы, формирующиеся в избытке белка, устроены так, что практически все заряженные группы поликатиона участвуют в образовании ионных связей с глобулами БСА и поэтому находятся в гидрофобном ядре комплексной частицы. В данном случае растворимость комплексных частиц обусловлена заряженными группами, находящимися на поверхности белка (Рис.4б).

Процесс образования и структура полученных нами водорастворимых белок-полиэлектролитных комплексов в какой—то мерс имитируют самосборку и структуру вирусных частиц.

Глава 3,2. Влияние ионной силы и рН среды на образование растворимых белок-полиэлектролптных комплексов.

Описанные выше исследования проводились в условиях (рН, ионная сила), соответствующих оптимуму стабильности продуктов взаимодействия поликатионов с белком. Вместе с тем для доказательства механизма комплексообразомния, установления природы связи белок-поликатион, а также для выявления способности поликатиона достаточно прочно связывать белки в заданных условиях (например, в среде живого организма), важно исследовать особенности образования белок-поли— электролитных комплексов в достаточно широком интервале изменения ионной силы и рН растворов.

При проведении экспериментов в 0,01 М NaCl при рН 10 критический состав Q* смеси БСА—ПЭВП, при котором происходит полное растворение осадка комплекса в избытке белка, сохраняется практически неизменным для всех изученных фракций ПЭВП и составляет По—другому ведет себя эта система при увеличении концентрации NaC!, где степень полимеризации поликатиона оказывает существенное влияние на О*. Это следует из приведенной на рис.5 зависимости состава смеси О*, определенного из кривых турбидиметрического титрования водно-солевого раствора RCA раствором соответствующей фракции ПЭВП при

Рис.5. Зависимость состава Q* от концентрации С№а в смесях БСА

и ПЭВП с различными степенями

полимеризации Рпэвп: 20 (1), 120 (2),

350 (3), 650 (4), 1 300 (5) и 4 000 (6);

се.са=3 г/л"

рН 10, от концентрации соли CN

О'

20

10

0-2 С^с. М

Видно, что в случае относительно высокомолекулярных катионов при СЬЬ<Л>0,05 М величина О* становится функцией как ионной силы раствора, так и степени полимеризации ПЭВП и возрастает с их ростом. Можно полагать, что это обусловлено более эффективным 'экранированием катионами карбоксилатных групп БСА., и, как следствие, ослаблением электростатического взаимодействия между белком и поликатиоаом. На седиментограммах водно-солевых растворов смесей БСА,—ПЭВП состава О* сохраняется деление на два пика, однако площадь пика БСА возрастает. По мере увеличения ионной силы раствора она становится сравнимой с площадью пика комплекса, а затем и превышает ее. Увеличение доли свободного белка, находящегося в равновесии с частицами растворимого комплекса, вносит существенный вклад в наблюдаемый рост критического состава смеси О* с ростом ионной силы раствора. Наращивание длины цепи ПЭВП при фиксированной ионной силе раствора также приводит к возрастанию О*, которое, как следует из анализа седиментограмм, и в этом случае обусловлено ростом доли свободного белка, сосуществующего с комплексными частицами.

О* , СноС! М

20

10

7 9 рН

Рис.б.Зависимость состава О* от рН в смесях БСА и ПЭВП.

Ршш=1 30°. Сьсл=3 г'л-

500 1000 1500 ртовп

Рис.7. Зависимость С№а, при которой происходит растворение (1) и разрушение (2) комплекса БСА.—ПЭВП, от степени полимеризации ПЭВП Рпэвп.

о=

1.^=0,2 г/л.

К аналогичному результату приводит нейтрализация заряда глобулы БСА при подкислении раствора реакционной смеси. Как следует из рис.6, с уменьшением рН величина (У* растет. В интервале рН 9—6 происходит протонирование имидазольных групп гистидиновых аминокислотных остатков БСА и образование цвитгер-ионных пар с карбоксилатпымн группами белка, приводящее к снижению суммарного отрицательного заряда белковой глобулы. При рН<7 растворимые белок-полиэлектролитные комплексы не образуются.

Низкомолекулярный электролит оказывает наиболее сильное влияние на комплексы белков с олигокатионамн: уже при достаточно невысоких концентрациях соли происходит разрушение нерастворимых комплексов. Это следует из данных, приведенных на рис.7. Из кривых турбидиметрического титрования суспензии стехиометричного комплекса ПЭВП—БСА состава <р — 1 раствором ЫаС1 находили концентрацию соли С5)1аа, соответствующую полному растворению осадка. Кривая 1 на рис.7

представляет собой зависимость найденных таким образом значений С3М от степени полимеризации полнкатионов, включенных в комплекс.

Видно, что в случае олигокатпоиов с увеличением их длины устойчивость нерастворимых комплексов к действию соли резко повышается. При переходе к комплексам БСА с относительно высокомолекулярными поликатионами значение С3№а практически перестает зависеть от

Рпэвп> Растворение осадка, наблюдающееся при достижении С3[М, означает лишь частичное разрушение комплекса. В случае длинноцепочечных ПЭВП (РПЭМ1£350) на седиментограммах таких растворов обнаруживается только один пик, соответствующий растворимому комплексу. В случае относительно коротких цепей ПЭВП (РПЭВП<350) при С3ша на седимен — тограммах наряду с пиком комплекса присутствует пик медленно седиментирующих свободных олнгокатионов. Данные седиментационного анализа приведены на рис.8. Видно, что с уменьшением РГГЭЕГГ доля свободного ПЭВП в растворе растет (кривая 1), а его доля в комплексе соответственно падает (кривая 2).

^ПЭВП

Рис.8. Зависимость доли свободного (!) и включенного в комплекс (2) поликатиона от степени полимеризации

^ПЭВГГ С-МасГ^Ыаа'

100

г1

ч

ь

50

пэвп'

^=0,2 г/л.

'пэви

о

Полная диссоциация комплексов ПЭВП—БСА на исходные компоненты происходит при С,>[15а>С31,ьа. Это следует из результатов

измерения коэффициента диффузии частиц в водно-солевых растворах. Средний рассчитанный радиус БСА. (СЬСА=Зг/л) составил 3,5 нм.

Оказалось, что в области С№а>С3Наа радиус комплексных частиц уменьшается с ростом ионной силы раствора и при С[|аа=С°№1а достигает

величины Я, свободного БСА. Зависимость найденных таким способом значений Ср№а, соответствующих полной диссоциации комплекса, ог

пэвп приведены на рис.7 (кривая 2). Видно, что ход кривой 2 аналогичен

ходу кривой 1.

Описанные выше различия в поведении водно-солевых растворов комплексов БСА с поликатиовами и с олигокатионами можно объяснить влиянием энтропийного фактора. Конкурентное связывание низкомолекулярных вонов компонентами комплекса приводит к экранированию зарядов на макромолекулах, т.е. к разрушению интерполимерных солевых связей. В случае комплексов БСА с длинными поликатионами это приводит к образованию дефектов типа петель или хвостов, не связанных с глобулами БСА. В случае комплексов БСА с оли — гокатионами образование петель и хвостов энтропийно менее выгодно, чем полный переход эквивалентного числа олигокатионов в раствор. Ясно, что чем короче цепи ПЭВП, тем меньше концентрация соли, достаточная для их полного освобождения из комплекса.

Раздел 4. Влияние степени полимеризации ПЭВП на растворимость полиэлекгролят-балковых комплексов ПЭВП—БСА.

Рассмотрим особенности получения и свойства растворимых комплексов. ПЭВП—БСА, образующихся в избытке поликатиопа. Оказалось, что в этих условиях степень полимеризации ПЭВП может быть фактором, определяющим не только свойства, по и саму возможность образования таких растворимых полиэлекгролит-белковых комплексов.

А/А

МАХ

5 6 7

Рис.9. Кривые турбидиметрического титрования раствором БСА растворов ПЭВП различной степени полимеризации Р^^: 10 (1), 30 (2), 120 (3), 350 (4), 650 (5), 1 300 (6), 4 000

.0,2 г/л.

На рис. 9 приведены зависимости А/А,^ от состава О смесей растворов БСА и ПЭВП различных степеней полимеризации, которые получали таким же образом, как и зависимость, изображенная на рис.1. Видно, что введение белка в растворы относительно высокомолекулярных поликатионов ПЭВП с Рпэвп^1 300 (кривые 6, 7) вплоть до достижения

критического состава смеси О*"0,33 не приводит к нарастанию мутности, т.е. не сопровождается фазовым разделением. На седиментограммах растворов состава О* обнаруживается один пик, соответствующий осаждению частиц комплекса, состав которых <р*, следовательно, совпадает с составом смеси. Это означает, что в области составов 0*<0,33 в исследуемой системе существуют водорастворимые полиэлектролиг-бел— ковые комплексы ПЭВП—БСА, в которых роль лиофилизирующего компонента играет поликатиоп, включенный в частицы комплекса в избытке. Приведенные результаты согласуются с данными, полученными ранее

при исследовании комплексообразованая между теми же компонентами в нейтральных: средах, и свидетельствуют о том, что закономерности образования водорастворимых: комплексов БСА с введенными в избытке высокомолекулярными ПЭВП-катионами остаются теми же.

Совершенно иначе протекает комплексообразование в смесях БСА и олигокатионов (Рпэвп£30). Ход кривых 1 и 2 на рис.9 показывает, что введение уже первых порций БСА в раствор олигокатиона влечет за собой фазовое разделение. Из результатов исследования таких растворов методом аналитической скоростной седиментации в сканирующем варианте следует, что в них присутствуют быстро седиментирующие частицы (s>50S), представляющие собой нерастворимый стехиометрияыыö комплекс ПЭВП-БСА состава <р=1, который сосуществует с не связанными в комплекс олигокатионами. Последние в условиях опытов не седиментируюг и остаются на мениске.

Таким образом, в смесях олигокатионов и БСА водорастворимые комплексы практически не образуются, т.е. относительно короткие цепочки, в отличие от длинных, не способны выполнять функцию лиофилизирующего компонента. Причина наблюдаемого различия, по-видимому, заключается в следующем. Естественно, что для достижения достаточной для растворения шдрофильности число положительно заряженных звеньев ПЭВП в комплексной частице должно существенно (по крайней мере в 3 раза, если кр1*"=0,33) превысить число отрицательно заряженных карбоксилатных групп на поверхности глобулы БСА, равное 55, Простой расчет показывает, что, например, в случае олигокатиона с Ргг?егт= 10 для образования комплекса, содержащего трехкратный избыток винилпиридиниевых звеньев, одна комплексная частица с <р—\ должна иммобилизовать еще 11 олигокатионов, что привело бы к резкому уменьшению числа частиц в системе. В случае малых Рпэвп изменение энтропии в результате такой реакции приводит к тому, что образование раствори — мых комплексов термодинамически невыгодно. Понятно, что с ростом РГТЭВГ1 вклад энтропийной составляющей в изменение свободной энергии системы уменьшается. Так, <р* при Рпэвп= 160 может быть достигнуто

уже при связывании с глобулой БСА только одной молекулы ПЭВГТ. Поэтому в случае длинноцепочечных ноликатионоа энтропийный запрет на образование водорастворимых комплексов перестает действовать. Это следует из хода кривых 3—5 рис.9, на которых стрелками отмечены составы СЛ ограничивающие справа область существования растворимых комплексов. Видно, что в интервале 120^РПЭВП^650 величина О* зависит от Р[Т^ЕГ1 и увеличивается с ее ростом.

Результаты седимептационпого анализа растворов смесей БСА а поликатионов различной степени полимеризации, взятых в соотношениях О*, приведены в таблице 2. Седиментограммы свидетельствуют о существовании в таких растворах двух типов частиц, различающихся скоростями седиментации. В условиях опытов весь белок связан в комплекс и находится в относительно быстро седиментирукзщих частицах с коэффициентом седиментации эс. Медленная компонента имеет коэффициент седиментации зр практически такой же, что и ПЭВП соответствующей степени полимеризации. Количество не связанного в комплекс полпкати— она определяли из данных сканирующей седиментации. Рассчитанные из седиментограмм критические составы растворимых комплексов <?* практически одинаковы для всех смесей и близки к величине (¡/"""О.ЗЗ для комплексов БСА с высокомолекулярными поликатионамн. Таким образом, определяется минимальным количеством ПЭВП, достаточным для придания частице необходимой д\я растворення гидрофильности.

р 1 пэвп о- ±10« 8с ♦ 10% 3р 415%

свободного в комплексе

1 300 <10 >90 0,34 0,33 7,5 2,3

650 25 75 0,28 0,34 7,2 1,8

350 30 70 0,23 0,31 6,5 1,5

250 45 55 0,18 0,31 6,0 1,3

120 85 15 0,05 0,35 5,5 1,0

Таблица 2. Результаты седиментационного анализа полнэлектролит-белковых комплексов ПЭВП—БСА.

В согласии с приведенными выше соображениями вклад энтропийного фактора определяет положение равновесия в изученной нами реакции макромолекулярного обмена:

Комплекс(олигокатион-БСА)р=1 +- поликатион (3)

Комплекс(поликатион-БСА)р=0,-3 + олигокатион

Были проведены две серии опытов, различающиеся порядком смешения компонентов. При добавлении раствора поликатиона (РПЭЕГ1=650) к. суспензии нерастворимого стехиометрияного комплекса. олигокатион-БСА (¡р= 1) осадок растворялся, т.е. реакция (3) протекала слева направо. Добавление к раствору комплекса поликатион-БСА (р=0,33) раствора олигокатиона (Рпэш=30) не сопровождалось видимыми изменениями в системе. Седиментационный анализ такой смеси проводили с использованием меченного антрильной меткой поликатиона (Рпэвп=750, 1 метка на 140 звеньев, характеристическое поглощение при А=336 нм). Весь меченый ПЭВП (длина волны измерения 336 нм) находился в быстро седименгирутощих комплексных частицах, а оптическое поглощение медленно седиментирующей фракции при 25? нм совпадало с таковым для раствора свободного олигокатиона. Таким образом, независимо от пути смешения компонентов, практически весь поликатион связан с белком и находится в относительно быстро седиментирующих частицах растворимого комплекса, а олигокатион присутствует в растворе в свободном состоянии. Следовательно, равновесие реакции (3) практически полностью сдвинуто вправо. Вытеснение коротких цепей олигокатиона в раствор приводит к энтропийно выгодному росту числа частиц, что, по—видимому, и служит движущей силой для протекания реакции (3) слева направо.

Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что в основе процессов образования как растворимых белок-полиэлектролитных комплексов, так и растворимых полиэлекгролит-белковых комплексов лежат одни и те же структурно-термодинамические принципы.

Такие комплексы представляют собой системы с отчетливо выраженной кооперативностью я склонностью к самоорганизации. Структура частиц комплекса определяется выполнением по меньшей мере двух условий: включением в состав комплекса определенного количества лиофилизи — рующего компонента (белка или поликатвона), которое обеспечивает необходимую для растворения комплексных частиц гндрофильность, и реализацией в системе максимально возможпого числа интерполимерных солевых связей между белком и поликатионом. Самосборка комплексных частиц управляется действием термодинамических факторов, при этом значительный вклад в изменение свободной энергии системы при комплексообразовании может вносить изменение энтропии макромо — лекулярных компонентов. В системах, в которых лиофилизирующий компонент (белок или олигокатион) несет существенно меньше заряженных групп, чем его партнер, изменение числа макромолекул при комплексообразовании может определять саму возможность образования растворимых комплексов.

ВЫВОДЫ.

1. На примере системы бычий сывороточный альбумин—полн--М-этил-4-винилпиридиний бромид обнаружен и изучен новый тип водорастворимых белок-полиэлектролитных комплексов, в которых лиофилизирующим компонентом является белок. Показано, что частица комплекса включает в себя одну цепь высокомолекулярного поликатиона и такое количество глобул белка, которое обеспечивает двукратный избыток отрицательно заряженных групп белка по отношению к положительно заряженным группам поликатиона, Частицы комплекса такого состава образуются уже при небольшом избытке белка и накапливаются в растворе при дальнейшем его добавлении, то есть растворение сгехиометричного белок-полиэлектролитного комплекса сопровождается диспропорционированием комплексных частиц по составу. Предложена структурная модель белох-полиэлектролитного комплекса.

2. Определены диапазоны изменения рН и концентрации вводи —

мого низкомолекулярного электролита (NaCI), отвечающие существованию растворимых белок-полиэлектролитных комплексов, и выявлена их зависимость от степени полимеризации поликатиона и состава смеси,

3. Показано, что степень полимеризации поликатиона может оказывать определяющее влияние на свойства и саму возможность образования водорастворимых полиэлектролит-белковых комплексов, в которых роль лиофилизирующего компонента играет поликатаон. Обнаружено, что олигокатионы не способны образовывать с белком растворимых полиэлектролит-белковых комплексов.

4. Выявлены и обсуждены общие структурно-термодинамические принципы образования водорастворимых белок-полиэлектролитных и поли электролит-белковых комплексов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Зайцев B.C., Изумрудов В.А., Зезин А.Б. Новый тип водорастворимых белок-полиэлектролитных комплексов // Высокомол. соед. - 1992.- Т.34, N 1,- С.138-139.

2. Зайцев B.C., Изумрудов ВА, Зезин А.Б., Кабанов В.А. Водорастворимые белок-полиэлектролитные комплексы, содержащие избыток белка в качестве лиофилизирующего компонента // ДоклАН СССР.- 1992.- Т.322, N 2. — С.318 - 323,

3. Зайцев B.C., Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Определяющее влияние степени полимеризации поли-И-этил-Д--винилпиридиниевых катионов на растворимость и равновесные превращения кх комплексов с бычьим сывороточным альбумином // ДоклАН СССР. — 1992.- Т.323, N5.- С.890- 894.

4. Zaitsev V.S., Listova O.V. Competitive reactions in solution of interpolyelectrolyte complexes // I International school—seminar "Non — traditional methods of polymer synthesis". - Alma-Ata, 1990. P.177-178.

5. Зайцев B.C. Зезин А.Б. Использование комплексообразования белков с поликатионами невысокой степени полимеризации для решения экологических задач // IV Всесоюзная конференция "Водорастворимые

полимеры и их применение": Тез.докл.— Иркутск. 1991. С. 189.

6. Zaitsev V.S. I'olyelectrolyte complexes betv/een linenr polyions and globular proteins as a synthetic models of nucleoprotein complexes // international school— seminar "Modern problems of physical chemistry of macromolecules". — Puschino, 1991. P. 175.

7. Зайцев R.C., Изумрудов В.Л. Использование водорастворимых полнкатионов невысокой степени полимрризапии д\я выделения и концентрирования белковых веществ // II Всесоюзная научно-техническая конференция "Свойства и применение водорастворимых полимеров": Тез.докл. — Ярославль, 1991, С, 160.

3. Зайцев B.C., Изумрудов В.А. Исследование полиэлектролитных комплексов белков с поликатионами для создания полимерных диагностпкумов // IX Всесоюзный симпозиум "Синтетические полимеры медицинского назначения": Тез.докл. — Звенигород, 1991. С. 108.