Взаимодействие синтетических полиэлектролитов с частицами, имитирующими клетки: Физико-химический аспект тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

од

химический факультет

На правах рукописи УДК 541.183.24+541.64

ЯРОСЛАВОВ Александр Анатольевич

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ С ЧАСТИЦАМИ, ИМИТИРУЮЩИМИ КЛЕТКИ: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЙ АСПЕКТ

02.00.06- химия высокомолекулярных соединений

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 1995

Официальные оппоненты: академик, доктор

биологических наук, профессор В.П.Скулачев

доктор химических наук, профессор Л.И.Валуев

доктор химических наук, . профессор В.А.Огарев

Ведущая организация - Российский химико-технологический

университет им.Д.И.Менделеева

Защита состоится "31" мая 1995 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 053.05.43 по химическим наукам при МГУ им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Диссертация в виде научного доклада разослана "«2/" апреля 1995 г.

Ученый; секретарь совета кандидат химических наук

Т.К.Бронич

I.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Состояние проблемы. В последнее время синтетические водорастворимые полимеры, в том числе полиэлектролиты, находят все большее применение в различных областях медицины и биологии. Так, например, на их основе были разработаны новые высокоэффективные лекарственные вещества [K.Retrak, British Polyn.J., 22, 213 (1990)], вакцинирующие препараты [V.A.Kabanov, Makromol. -hem.,Macromol.Symp., 1,101 (1986)] И СреДСТВЭ ДОСТЭВКИ ГвНетИт ieCKOro материала В клетки [A.V.Kabanov and V.Yu.Alakhov, Т.Controlled .Release, 28, 15 (1994)]. В ТЭКИХ соединениях

Зиологически активное вещество (БАВ) образует с молекулой синтетического полимера комплекс, стабилизированный за счет электростатического или гидрофобного взаимодействия, либо ;вязывается с полимерной матрицей коваленгно. Описанный прием юзволяет решить несколько проблем: I увеличить локальную :онцентрацив БАВ вблизи клеточной поверхности, 2)повысить •стойчивость комплекса БАВ с клеткой, 3)првдать растворимость в юде плохо растворимым в ней БАВ и 4)защитить БАВ от неблаго-риятного действия окружающей среды, что, в конечном итоге, риводит к значительному увеличению эффективности действия БАВ.

Особый интерес водорастворимые конъюгаты полимеров с БАВ редставляют в связи с возможностью их адресации клеткам пределенного типа. Принципиальный подход к получению иологически активных полимеров направленного действия первые был изложен почти двадцать лет назад в статье

■РИНГСДОрфа [Н.Ringsdorf, J.Polym.Sei., 51, 135 (1977)] И

эстоит в модификации полимерного носителя молекулой-вектором тособной специфически взаимодействовать с ' соответствующим зцептором на поверхности клетки-мишени . С' тех пор правильность сложенного подхода была подтверждена многочисленными приме-зми. В некоторых случаях, например, при активации определенных -юнов иммунокомпетентшх клеток ■ [Р.В.Петров и Р.М.Хаитов, 1скусственные антигены и вакцины", М., Медицина, 1988], избирз-¡льность действия оказывалась практически ЮОЯ-ной.

Что касается механизма поиска и узнавания полимерными 'Нъюгатами клеток-мишеней в биологической жидкости, а .также

поведения полимера на поверхности клетки и реакции клеточной мембраны на адсорбированный полимер,, то этот круг вопросов остается практически неисследованным.- Предполагается, что конъюгата способны перемещаться по поверхности клетки и переходить с клетки на клетку в поисках наиболее термодинамически выгодного контакта молекулы-вектора, входящего в состав конъю-гата, СО СВОИМ рецептором [V.A.Kabanov et.al., Sov.Sci.Rew., Biochemistry, 5, 227 (1984)]. Однако предположения эти далеко неочевидны. Во-первых, результаты многочисленных исследований адсорбции полимеров на различных поверхностях показали, что процесс этот практически необратим. Поэтому естественно ожидать, что адсорбция полимерных конъюгатов на поверхности клетки также будет необратимой. Во-вторых, белки, в значительных количествах присутствующие в любой биологической жидкости, способны серьезно осложнить и даже полностью подавить связывание полимерного конъюгата с клеточной поверхностью.

Адсорбция полимерного конъюгата на поверхности клетки может сопровождаться встраиванием макромолекулы в Селково-липидную мембрану, появлением . асимметрии в распределении липидов в пределах каждого монослоя и между слоями, возрастанием проницаемости мембраны, а также агрегацией, слиянием и даже разрушением клеток. Все эти последствия могут повлиять на биологические функции клетки и потому должны быть приняты во внимание при описании поведения полимеров в контакте с клетками.

Стратегия исследования. Сформулированные выше проблемы относятся к области физшсо-химии и не касаются исследования поведения' клетки как биологического объекта. Биологическую жидкость при этом правомерно рассматривать как суспензию отрицательно заряженных частиц в водно-солевом растворе белка. Это дает возможность проводить исследования, используя вместо клеток модельные системы - суспензии отрицательно заряженных латексных частиц или сферических бислойных липидных везикул (липосом). Первая из этих систем может быть использована для изучения миграции синтетических полимеров между частицами дисперсной фазы, к числу которых относятся и.клетки, и селективной адсорбции полимеров на определенных частицах. Вторая система

позволяет изучать те изменения, которые может вызвать адсорбированный полимер в клеточной мембране. Достоинства обеих моделей состоят в том, что размеры частиц латекса и липосом сопоставимы с клеточными. Их поверхность, так же как и поверхность клетки, монет нести отрицательный заряд, но, в отличие от живых клеток, модельные частицы стабильны и их поверхности могут быть полностью охарактеризованы.

Цель работы состояла в создании единого физико-химического подхода к описании важнейших стадий взаимодействия биологически активных полимеров с клетками - поиску полимерами целевых клеток и реакции клеточной мембраны на адсорбированный полимер. Для этого были использованы модельные объекты (отрицательно заряженные латексные частицы и липосомы), а также синтетические и природные полиэлектролиты.

Научная новизна. В работе впервые обнаружены и изучены реакции между разноименно заряженными коллоидными (латексными) частицами и синтетическими полиэлектролитами, сопровождающиеся переносом полиионов между частицами. В случае однокомпонентной суспензии отрицательно заряженных латексных частиц миграция поликатионов и их конъюгатов с белком (а-химотрипсином) приводит к равномерному распределению макромолекул между всеми частицами в системе. В смеси латексных частиц разного сорта конъюгаг селективно взаимодействует с теми частицами, которые несут на своей поверхности ковалентно иммобилизованные молекулы соевого ингибитора трипсина - центры специфического связывания с а-химотрипсином. Предложен и обоснован механизм перехода цепей поликатионов с одной латексной частицы на другую. Показано, что избыточные количества белков не препятствуют адсорбции поликатионов на поверхности латексных частиц.

Впервые проведено систематическое изучение состава и строения мешфазных комплексов, образующихся при адсорбции синтетических поликатионов на поверхности смешанных липосом, состоящих из смеси нейтрального и отрицательно заряженного липидов. Показано, что состав и строение комплексов критическим образом зависят от фазового состояния липосомальной мембраны,

доли отрицательно заряженного лшшда в ней и химической природы поликатиона. Ниже температуры фазового перехода (в случае так называемых твердых липосом) в образовании комплекса с поликатионом участвуют лишь отрицательно заряженные липидные молекулы, расположенные на внешней стороне мембраны. Выше температуры фазового перехода, когда мембрана переходит в жидкокристаллическое состояние, адсорбция поликатиона индуцирует переход отрицательно заряженных липидных молекул с внутренней на внешнюю сторону мембраны и латеральную сегрегацию липидов. Поликатионы, адсорбированные на поверхности жидких липосом, могут быть десорбированы в раствор в результате образования нестехиометричннх интерполиэлектролитных комплексов с синтетическими и природными полианионами. Модификация поликатиона боковыми алифатическими фрагментами приводит к стабилизации его комплекса с жидкими липосомами благодаря встраиванию алифатических радикалов в гидрофобную часть липосомальной мембраны. Липосомы в контакте с поликатионами сохраняют свою целостность в том случае, если доля отрицательно заряженного липида в липосомальной мембране не превышает 0,5. Адсорбция поликатгонов на поверхности липосом с большим содержанием отрицательно заряженного липида вызывает необратимое разрушение липосомальной мембраны.

Впервые проведено сравнительное изучение взаимодействия ДНК, связанной в комплекс с положительно заряженными низкомолекулярными поверхностно-активными веществами (ПАВ) и поликатионами, с отрицательно заряженными липосомами. Показано, что в присутствии липосом комплекс ДНК с низкомолекулярным ПАВ полностью диссоциирует. При этом ПАВ встраивается в липосо-мальную мембрану, а ДНК остается в растворе. Комплекс ДНК с линейным пояикатюном вообще не реагирует с липосомами. Комплекс ДНК с поликатионом, содержащим боковые алифатические фрагменты, связывается с поверхностью липосом без разрушения.

Практическая значимость состоит в том, что полученные в работе результаты имеют принципиальное значение для понимания механизма поиска и узнавания белково-полимерными конъюгатами клеток-мшеней" в биологической жидкости. Эти результаты позво-

ляют прогнозировать поведение конъюгатов, адсорбированных на клеточной мембране, и реакцию клеточкой мембраны на адсорбированный конъюгат.

Полученные в работе доказательства'способности полиионов, адсорбированных на частицах дисперсной фазы, переходить с одной частицы. на другую являются существенным аргументом в пользу возможности применения аппарата статистической термодинамики для описания адсорбции макромолекул.

Подробно изученный в работе механизм селективной адсорбции полиионов на- частицах дисперсной фазы является теоретической основой для разработки селективных флокулянтов и стабилизаторов коллоидных дисперсий.

Проведенная в работе сравнительная оценка способности • ДНК-содержащих полшсоиплексов взаимодействовать с поверхностью отрицательно заряженных липосом позволяет предложить эффективный способ повышения аффинности ДНК ж клеточной мембране.

Личный вклад автора. В цикле исследований, составляющих диссертацию, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных' подходов и обобщейия полученных результатов. Лично 'автором предложена методика 'ковалентной иммобилизации белков на поверхности латексных -частиц,, обосновано применение метода лазерного микроэлектрофореза для исследования миграции поликатионов мевду отрицательно заряженными частицами дисперсной фазы и индуцированного поликагионом трансбислойного перехода отрицательно' заряженных липидных молекул в липосомах, а также разработаны экспериментальные приемы работы. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии на всех этапах исследования - от постановки задачи; синтеза полимеров, белково-полимерных конъюатов и латексов; приготовления образцов; проведения физико-химических экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

Публикации. По материалам исследований, обобщенных в

диссертации, опубликованы 34 работы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 3 Макромолекулярном симпозиуме СССР-ФРГ "Специфические свойства полимерных систем как результат их макромолекулярной структуры" (СССР, Алма-Ата, 1988); Ломоносовских чтениях (СССР, Москва, 1988); 2 Всесоюзной конференции "Интерполиэлектролитные комплексы" (СССР, Рига, 1989); I Полимерном симпозиуме СССР-Италия (Италия, Гарьяно, 1989); Международной конференции- по поверх-ностннм силам (СССР, Москва, 1990); Всесоюзной конференции "Фундаментальные проблемы современной науки о полимерах" (СССР, Ленинград, 1990); 3 Международной конференции "Мембраны и межфазные явления в полимерах" (Япония, Нагоя, 1990); 4 Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры к их применение" (СССР, Иркутск, 1991); 9 Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (СССР, Звенигород, 1991); I Симпозиуме Китай-Япония-СССР по полимерам (СССР, Москва, 1991); 5 Конференции Российской Федерации "Новые направления в биотехнологии" (Россия, Пущино, 1992); 1 Симпозиуме Россия-Германия по полимерам (Россия, Москва, 1993); 6 Международной конференции "Органические -реакции с участием полимеров" (Италия, Венеция, 1994); 35 Симпозиуме ИШАК по макромолекулам (США, Акрон, 1994); 7 Международном симпозиуме "Системы направленной доставки лекарств" (США, Солт Лейк Сити, 1995) и Каргинских чтениях (Россия, Москва, 1986 и 1995).

Тезисы защиты. На защиту выносятся следующие положения:

- создание и развитие теоретических и экспериментальных подходов к исследованию взаимодействия синтетических и природных полиионов с противоположно заряженными частицами дисперсной фазы - латексными частицами и лигосомами;

- кооперативный характер адсорбции полиионов на поверхности латексных частиц;

- миграция полиионов меящу частицами в латексной суспензии;

- селективная адсорбция белков и их конъюгатов с полигонами на латексных частицах;

- механизм конкурентных реакций в тройной, системе латекс-

полиион-белок;

- состав и строение комплексов полиионов с липосомами;

- индуцированная полиионом трансмембранная миграция ли-пидов;

- механизм взаимодействия ДНК-содержащих поликомплексов с липосомами;

- совокупность идей, теоретических подходов, экспериментальных методов и результатов, которую можно сформулировать как новое научное направление "Физико-химия взаимодействия синтетических и природных полиионов с частицами, имитирующими клетки", способствующее выяснению природы биологической активности

ПОЛИИОНОВ in vitro И in vivo.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 49 страницах и включает общую характеристику работы, экспериментальную часть, описание основных результатов и выводы. Работа содержит 27 рисунков.

2.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1.Материалы

Получение поли-4-винилпиридина и его кватернизацию галоидными алкилами и бромуксусной кислотой проводили по методикам, описанным соответственно В работах [R.M.Fuoss and U.P.Strauss,

J.Polymer Sei., 3, 246 (1948)] И [Yu.E.Kirsh et.al., Eur.

Poiym.j., io, 393 (1974)]. В работе использованы следующие сополимеры: 4-винилпиридин/н-этил-4-винилпиридиш1й бромид, 7/93 (ПЭВП); 4-ви1шлпиридин/и-этил-4-винилпиридиний бромид/ы-цетил-4-винилпиридшшй бромид, 16/80/4 (ПЭЦВП) и 4-винилпиридин/ N-э тил-4-винилпириднний бромид/н-карбоксиме тил-4-винилпиридиний бромид, 15/65/20 (ПЭУВП). Состав сополимеров был определен методом ик-спектроскопии на приборе Specord М80 (Karl Zeiss, Германия) [S.G.Sr.arodubtsev et.al., Eur.Polym.J., 10, 739 (1977)]. Степень полимеризации сополимеров составляла 1000. Ковалентный конъюгат а-химотрипсина с ПЭУВП, содержащий одну белковую глобулу на одну молекулу полимера (ХТ-ПЭУВП), был

получен по методу, описанному в статье [А.В.Кабанов и др., Доклады АН СССР, 302, 735 (1988)]. В работе использована полиакриловая кислота (ПАК) степени полимеризации 70 (Aidrich, США).

Латекс, содержащий на поверхности карбоксильные группы (Л-МАК), получали эмульсионной радикальной сополимеризацией стирола и метакриловой кислоты с использованием в качестве инициатора персульфата калия [Р.И.Миркина и др., Ж.Прикл.химии, 50, 1185 (1977)]. Латекс очищали от непрореагировавших мономеров и растворимого полимера методом непрерывной ультрафильтрации до исчезновения в промывной воде следов этих веществ, что определяли по отсутствию поглощения в области 200-350 им. Полихлорэтил-метакрилатный латекс (Л-ПХЭМА) был получен эмульсионной полимеризацией хлорэтилметакрилата по указанной 'выше методике. На основе Л-ПХЭМА были приготовлены латексы, на поверхности которых были ковалентно иммобилизованы белки - бычий сывороточный альбумин (ЕСА) и соевый ингибитор трипсина (СИТ). Для этого 0,5 мл водного раствора ЕСА концентрации 0,4 г/мл или 0,5 мл водного раствора СИ концентрации 0,45 г/мл были добавлены к 9,5 мл 1,2%-пой суспензии Л-ПХЭМА в буферном растворе с рн 8,5. Смеси инкубировались при 20°С в течение 10 часов. Латексы, модифицированные БСА (Л-БСА) и СИТ (Л-СИТ), очищали от непрореагировавших белков многократным центрифугированием и последующим ресуспенди-рование,м в 10 мл буферного раствора до исчезновения в надосадоч-ной жидкости следов белков, что контролировали по отсутствия флуоресценции при ¿^^=340 НМ (Лвоз0=285 HM) [C.C.Goodnc

et.al. , Anal. Biochem., 115, 203 (1981)]. ФлуореСЦвНТНЫЙ MeTOJ

был использован также для оценки степени заполнения поверхноси обоих латексов белковыми глобулами, г. Предварительно латексь обрабатывали смесью меркаптоэтанола и o-фталевого альдегида дл5 образования ■ флуоресцирующих производных с аминогруппам! белков. Для количественного определения белковых молекул, иммобилизованных на поверхности латексов, использовали соответствующие калибровочные кривые, полученные для флуоресцентнс меченых белков в водных растворах (АфЛу0р=450 ™> лвозб=340 Величины а рассчитывали, полагая, что связанная с латексно! поверхностью Молекула бежа занимает площадь s=nd2, где d ■

наибольший диаметр белковой глобулы. Определенные таким образом величины s составили 0,7-0,8 для Л-ЕСА и 0,9-1,0 для JI-СИТ.

Все полученные латексы были практически монодисперсными. Средний гидродинамический диаметр частиц Л-МАК был равен 0,5 мкм, частиц Л-БСА и Л-СИТ - 0,37 мкм.

В работе использовали XT, БСА, СИТ и флуоресцеин-изо-тиоцианат (ФИТЦ) фирмы signa, США; н-бензилоксикарбонил-L-тирозин-р-нитрофениловый эфир (БТНФЭ) фирмы bdh, Англия, и цетилпиридиний бромид (ШГБ) фирмы chemapoi, Чехословакия.

БСА, меченый ФИТЦ (БСА*), был- получен по методике-, описанной В [K.G.Mann and W.W.Fish, Methods Enzymol., 26, 28 (1972)], затем . очищен пропусканием через хроматографическую колонку, заполненную sephadex 25, и последовательно диализовэн в 6 M растворе мочевины, 0,5 M растворе Nací и дистиллированной воде. Очищенный продукт был лиофильно высушен.

I-Аминогексаметиленфлуоресцеин (АГМФ), реагент для получения флуоресцентно меченой ДНК, синтезировали, смешивая равные объемы 0,2 M 1,6-гександиамина (Aidrich, США) и 0,01 M ФИТЦ в буферном растворе с рн 9. Реакционную смесь инкубировали I час при 20°С. Продукт очшцали методом ТСХ на силикагеле.

ДНК куриного эмбриона (Reanal, Венгрия) фрагментировали обработкой ультразвуком, используя генератор ультразвука модели 4710 (cole-Parmer, США), и фракционировали в градиенте сахарозы (5-20%). В работе была использована ©акция ДНК, содержащая от 50 до 100 пар оснований, что было оценено по данным электрофореза ДНК в агарозном геле. Получение флуоресцентно меченой ДНК (ДНК*) проводили следующим образом. 50 мг ДНК растворяли в 4 мл воды, затем добавляли 0,2 мл 0,5 M раствора ЭДТА и I мл I M NaOH. Смесь инкубировали в течение 15 минут, затем осаждали ДНК, добавляя 1,5 мл 2 M раствора lício4 и 20 мл ацетона. Выпавшую ДНК отделяли от раствора центрифугированием в течение 10 минут при скорости 8000 об/мин и затем растворяли в 4 мл 0,1 M Nacio3. К раствору добавляли 0,2 мл 0,5 M раствора ЭДТА и I мл ОД M раствора N-бромсукцшшмида. После инкубирования смеси в течение •10 минут при 0°С к ней добавляли 1,3 мл 0,15 M водного раствора АГМФ и нагревали Г час при 50°С. Флуоресцентно меченую ДНК

отделяли от раствора по описанной выше методике, промывали ацетоном и сушили в вакууме.

В работе использованы меганольные растворы ь-а-фосфатидил-холина (L-a-лецитина, ФХ), ь-а-дапальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ), кардиолипина (дифосфатидилглицерола, КЛ) и N-флуорес-цеин-изо-тиоцианил-ь-а-дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (ФИТЦ-ФЭ) фирмы Sigma (США).

2.2.Метода

В работе использовали смешанные ДПФХ/КЛ и ФХ/КЛ липосомы, которые получали по следующей методике. Соответствующие количества метанольных растворов липидов смешивали, тщательно удаляли растворитель под вакуумом, образующуюся тонкую пленку липидов диспергировали в 2 мл боратного буфера с рн 9. Взвесь обрабатывали на ультразвуковом диспергаторе модели 4710 в течение 400 с "(2x200 с) при 0 и 55°С для ФХ/КЛ и ДПФХ/КЛ смесей, соответственно. Полученные липосомы отделяли от титановой пыли 5-минутным центрифугированием при скорости 12000 об/мин и использовали в течение суток. Размер липосом был равен 40-60 нм. Липосомы со встроенной в бислой флуоресцентной меткой получали добавлением к липидной смеси 0,2 мг ФИТЦ-ФЭ, что составляло 1% от общего количества липидов.

Средний гидродинамический диаметр, d, латексных частиц и липосом определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии на приборе Autosizer 2с, электрофоретическую подвижность (ЗФП) на приборе zetasizer 2с (Maivern, Англия). Фазовые переходы в липосомах исследовали методом микрокалориметрии на адиабатном сканирующем микрокалоримегре ДАСМ-4 (Экспериментальное КБ РАН, Россия). Образцы прогревали со скоростью 1°С/мин в температурном интервале 20-55°С. Интенсивность флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре F-4000, спектры поглощения на спектрофотометре 150/20 (Hitachi, Япония), рн растворов и концентрацию бромид-ионов измеряли на потенциометре рнм-вз, используя стандартный стеклянный 2040с или бромселективный поггвг электроды; электропроводность растворов измеряли на кондуктометре cdm83 с платиновым электродом PP1042 (Radiometer, Дания).

Вода для приготовления растворов очищали двойной перегонкой с последующим пропусканием через систему Mi.iii.-q (мпИ-роге, США), включающую ионообменные, адсорбционные колонки и фильтр для удаления крупных частиц.

Каталитическая активность ХТ и ХТ-ПЭУВП коньюгата определяли спектрофотометрически, измеряя скорость гидролиза специфического субстрата (БТНФЭ) по накоплению в растворе нитрофенолят-ионов при \=400 нм. Для измерения количеств ПЭВП, ПЭЦВП, ХТ и ХТ-ПЭУВП коньюгата, не связавшихся с латексными частицами и липосомами, использовали следующую процедуру. Смеси этих веществ с латексными частицами и липосомами центрифугировали в течение 30-60 минут со скоростью 18000 об/мин. Осадки отделяли и в супернатанте измеряли поглощение ПЭВП и ПЭЦВП при \=257 нм, или интенсивность флуоресценции при ^^^=340 нм (авоз6=285 нм) и каталитическую активность свободного и конъюгированного ХТ. Концентрации поликатионов, белка и коньюгата определяли, используя соответствующие калибровочные кривые.

3.ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИКАТИОНОВ С ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫМИ ЛАТЕКСНЫМИ ЧАСТИЦАМИ

3.1.Состав и строение комплексов поликатион-латекс

На поверхности частиц Л-МАК присутствуют ионогенные группы двух типов: карбоксильные группы метакриловой кислоты и сульфо-группы, возникшие при распаде инициатора - персульфата калия. Первые находятся в кислотной, вторые - в солевой форме. Для оценки доли тех и других был использован метод кондуктометричес-кого титрования. Перед титрованием сульфогруппы были переведены в кислотную форму обработкой латекса ЮМ раствором соляной кислоты и последующим диализом в дистиллированной воде. Кривая кондуктометрического титрования приготовленного таким образом латекса раствором кон состояла из трех, участков, соответствовавших титрованию сульфогрупп (I), карбоксильных групп (2) и накоплению свободной щелочи в растворе (3) (рис.1). Очевидно, что доля сульфогрупп была равна у^/у^о,!, а доля карбоксильных

2 г-

^0,02М КОН» мл

Рис♦ I. Кондуктометричвское титрование Л-МАК.

13 — X

Концентрация латексаф4,1x1О л . •

Рис. Z . По*?екциометриче ское титрование Л-МАК (X) и его комплекса с ПЭВП (2). Концентрация латекса 4,1хЮ13л"1; [ПЭВП] Ю~3М.

Рис.3. Зависимость концентрации не связанного с Л-МАК ПЭВП (а) и ЭФП латексных частиц (б) от соотношения Р.

12 —I

Концентрация латекса 5,4x10 л рН 5(1), 6(2), 7(3), 8 (4), 9(5). 10(6), 11(7).

групп (у2-у1)/у2=0,9. Площадь, в среднем занимаемая одно! ионогенной группой на поверхности латексной частицы, был; рассчитана по уравнению бо=сч/ргш2, где с, V, и р- соответственно концентрация, объем и плотность латекса, б - диамет] латексных частиц и N - концентрация титранта, и составила 25 X2 Характеристическая константа диссоциации карбоксильных групп рн0, рассчитанная по результатам потенциометрического титрованю (рис.2, кривая I), оказалась равной 6,8 и значительно превышал; соответствующее значение для полиметакриловой кислоты ■ (рн0=4,8) что, очевидно, являлось следствием гидрофобного окруженш карбоксильных групп в поверхностиом слое латексных частиц.

Адсорбция линейного поликатиона, ПЭВП, на частицах Л-МА1 была исследована в интервале рн 5-11 и представлена на рис.3-,а I координатах [ПЭВП]р - р, где [ПЭВП]р - концентрация полжатиона, не связанного в комплекс с латексом, и р=[ПЭВП]/[А] - отношение концентрации добавленного поликатиона к обшей концентрата ионизующихся групп на поверхности латексных части! [А]=[-соо_]+. Каждой величине рН на этом рисунке соответствует область значений р., при которых практически весь добав-

а,со

Рис.4.

Зависимость относительной адсорбции ПЭВП, ш (I), и степени ионизации поверхностных групп Л-МАК, а, в отсутствии (2) и б присутствии ПЭВП (3) от рн.

энный поликатион связывается с латексными частицами. При жотором значении р, которое можно обозначить р =[ПЭВП] / [А], зстигается предельное заполнение латексной поверхности полика-гоном, после чего его адсорбция прекращается. По мере роста рн эличество ионизованных групп (адсорбционных центров) на оверхности латексных частиц увеличивается, величина р также эзрастает и становится максимальной, р*акс=[ПЭВП]макс/[А] при н 10. Зависимость относительной адсорбции поликатиона =р*/р*акс=[ПЭВП]*/[ПЭВП]*акс от рн представлена на рис.4, ривая I.

Адсорбция ПЭВП сопровождается нейтрализацией заряда атексных частиц, а в избытке поликатиона и перезарядкой атексной поверхности (рис.3,6). Как известно, адсорбция оликатионов приводит к появлению экспонированных в водную фазу петель" и "хвостов", в которых накапливается избыточный эложигельный заряд. При определенной величине этого заряда эзникает электростатический барьер, который молекула полика-иона преодолеть уже не может, и адсорбция прекращается ср.рис.3,6 и рис.3,а). Как и следовало ожидать, величина этого арьера оказывается одной и той же для всего интервала рН. днако количество поликатиона, которое необходимо адсорбировать а латексной частице, чтобы сформировать этот барьер, [ПЭВП]*, величивается с ростом поверхностного заряда частицы.

Количественно взаимосвязь между [ПЭВП]* и зарядом частиц ж, что то же самое, между о и степенью ионизации поверхностных рупп а, можно описать, сравнивая две зависимости: и от рн и =[А~]/[А] от рн (рис.4, кривые I и 2). Как следует из рисунка, о всем интервале рн количество адсорбированного поликатгона ущественно превышает число ионизованных групп • на поверхности атекса. Это заставляет предположить, что адсорбция ПЭВП ызывает дополнительную ионизации карбоксильных поверхностных рупп аналогично тому, как это происходит при связывании оликатионов с линейными поликислотами. Кривая погенциометричес-ого титрования латекса с адсорбированным ПЭВП оказывается двинутой в сторону больших концентраций кон (рис.2, кривая 2), рассчитанная на основе этой кривой зависимость а„=[А~]г„/[А] от

л К

Н полностью совпадает с полученной ранее зависимостью и от рн

(рис.4, кривые 3 и I). Иными словами,

ы=[ГОВП]*/[ПЭВП]*акс=ак=[А"]к/[А] или

[А-]к/[ПЭБП]*=[А]/[ПЭВП]*акс=1/Р*акс. Величина, стоящая в левой части последнего уравнения, предста вляет собой глубину завершения интерполиэлектролитной реакции между кватернизованными звеньями поликатиона и ионогенным; группами поверхности, в. Расчет по данным рисунка 4 дае1 значение е=[А~]„/[ГОВП]*=1/р* .=0,7, которое остается неизмен-

ХЧ МОА-Ь

ным во всем исследованном интервале рн 5-1I.

Таким образом, адсорбция ПЭВП на частицах Л-МАК представляет собой кооперативный процесс, характеризующийся высоко} константой образования комплекса поликатион-лагекс и болыно! глубиной завершения реакции образования ионных связей межд: звеньями ПЭВП и ионогенными группами латекса.

3.2.Миграция поликатиона между латексными частицами

Для исследования способности адсорбированного поликатион; мигрировать между латексными частицами был использован мето; лазерного микроэлектрофореза. Этот метод позволяет не толькс измерять средние величины ЭФП частиц, но и анализировать распределение частиц по величинам'ЭФП. Эксперименты проводились следующим образом. К исходньш латексным частицам с ЭФП -4,] (мкы/ОЛВ/см) (рис.5,а) добавляли раствор ПЭВП, после чего ЭФ1 частщ смещалась в область положительных значений и становиласг равной +1,25 (мкм/с)/(В/см) (рис.5,б). К сформированному такт образом комплексу добавляли порцию исходных латексных частш вдвое меньшей концентрации, сразу после смешения в системе мошс было-зарегистрировать частицы трех типов с различными величинам! ЭФП (рис.5,в). ЭФП двух из них соответствовали ЭФП исходные компонентов - латекса и его комплекса с ПЭВП, частицы третьегс типа имели промежуточное значение ЭФП. С течением времени пики, относящиеся ■ к исходным компонентам, исчезали, сливаясь сс средним пиком. В конечном итоге в системе оставались частиць только одного типа с ЭФП -1,6 (мкм/с)/(В/см), размер которых бьи равен размеру исходных липосом (рис.5,г). Описанная картинг

О, мкм

ШШ

О 1

Рис.5. Изменение ЭФП и размеров частиц Л-МАК■ в ходе перераспределения ЛЭВЛ между ними. а - латекс; <5 - латекс^ПЭВП; в и г - (а+б) через 7 (в) и 40 минут (г) после смешения. Описание эксперимента см, в тексте.

соответствовала переходу адсорбированных молекул поликатиона на свободные' латексные частипы.

Изменение соотношения обоих компонентов - исходного латекса и его комплекса с ПЭВП, приводило в результате перераспределения поликэгиона к ■ появлению частиц с различными -значениями ЗФП. Однако в каждом случае установившееся значение было равно ЭФП комплекса латекс-ПЭВП, состав которого совпадал с конечным соотношением латекс/ПЭВП в обменивающейся поликатионом системе. Это означает, что миграция поликатиона приводила к установлению равномерного распределения молекул ПЭВП между всеми латексными частицами в суспензии.

Переход макромолекул с одной латексной частицы на другую

ЭФП, (мкм/с|/(8/см)'

А

3 0-3-6

а

б

в

мог протекать по двум механизмам: при непосредственном контакте частиц или в результате десорбции макромолекул с одной частицы, диффузии их через раствор и адсорбции на другой частице. Установленный ранее факт практически количественного связывания ПЭВП на поверхности латексных частиц позволяет сделать выбор в пользу контактного механизма обмена.

3.3. Механизм узнавания частиц-мишеней поликатионом, конъюгированным с белковым вектором

Для исследования селективной адсорбции белок-полимерного конъюгата была использована суспензия, содержащая два сорта латексных частиц. Поверхность одних была ковалентно модифицирована соевым ингибитором трипсина (СИТ), поверхность других -бычьим сывороточным альбумином (БСА). Первые частицы (Л-СИТ) имитировали клетки-мишени, вторые (Л-БСА) - прочие нецелевые клетки в реальной биологической жидкости. Поскольку СИТ является специфическим ингибитором фермента а-химотрипсина(ХТ), пара СИТ/ХТ была использована для моделирования взаимодействия клеточного рецептора с векторной группировкой полимерного конъюгата. Образование контакта СИГ с ХТ сопровождалось ингиби-рованием каталитической активности фермента, что регистрировалось по уменьшению скорости гидролиза .БТНФЭ - специфического субстрата ХТ.

Перед получением конъюгата ХТ с поликатионом следовало убедиться в том, что сами молекулы фермента способны селективно взаимодействовать с частицами Л-СИТ в смешанной Л-СИТ/Л-БСА суспензии.'Прежде всего мы оценили эффективность связывания ХТ на частицах обоих модифицированных белком латексов. Как известно, изоионная точка фермента р1=8,8 [N.111, Biochira.Biophys.Acta, 229, 582 (1971)], поэтому исследование проводили при рн 7, когда молекулы ХТ заряжены положительно. В этих условиях ХТ практи--чески полностью связывался с частицами Л-БСА и Л-СИТ вплоть до концентрации 5,5хЮ~7 М и 3,8хЮ-7 М, соответственно (рис.6).-Максимальное количество молекул ХТ, которое могло связаться с одной латексной частицей, Иф, составило 3,3x10^ для Л-БСА и 2,ЗхЮ4 для Л-СИТ.

Рис■6.

Зависимость концентрации ХТ, не связанного с Л-БСА (I) и Л-СИГ (3), от общей концентрации ХТ. Концентрация латексов Ю1гл-1; рН 7.

12-1

бавления Л-СИГ (1,3x10 л ) к комплексу Л-БСА-ХТ (Л-БСА I ,3х1012л-1 , [ХТ] 1,ВхЮ~ВЫ; точка А).

Адсорбированный на частицах Л-БСА фермент 'сохранял около Ь0% исходной каталитической активности (рис.7, кривая I). Потеря активности была, очевидно, связана с экранированием активных центров части молекул фермента при их иммобилизации на поверхности частиц. В то же время, связывание ХТ с частицами Л-СИТ приводило к практически полному исчезновению каталитической активности фермента вследствие образования специфических контактов с иммобилизованными на поверхности Л-СИТ молекулам

—Я

ингибитора (рис.7, кривая 2). Полное жнгибирование 1,8x10 М раствора ХТ достигалось при концентрации Л-СИТ равной

Рис.7.

Зависимость относительной каталитической активности ХТ от концентрации Л-БСА

(I) и л-сит <г).

[ХТ] I ,8хЮ~®М; рН 7 . Точка В соответствует активности ХТ после до-

1,3х1012 л-1. Это означало, что каждая частица Л-СИТ несла на поверхности Ыф=8,5хЮ3 центров ингибирования ХТ. Отношение (8,5х103/2, 3x104 )х100£=36Я представляло собой долю молекул XI, образовавших специфические контакты с поверхностью Л-СИТ. Остальные молекулы ХТ (их доля составляет 64%) адсорбировались на поверхности Л-СИТ в результате неспецифического, главным образом, электростатического взаимодействия. Их активность, как это следует из данных рис.7 (кривая 2), равнялась 30% активности ХТ в растворе. Схематически строение поверхности Л-СИТ с адсорбированным ХТ представлено на рис.8.

Рис.8. Строение поверхности Л-СИТ с адсорбированным ХТ.

Ответ на вопрос, способен ли ХТ узнавать частицы Л-СИТ в смеси Л-^БСА/Л-СИТ, был получен следующим образом. ХТ адсорбировали на Л-БСА в таком количестве, чтобы заполнить около' 30% поверхности частиц (точка А на рис.7). Затем к полученному комплексу- добавили равное количество Л-СИТ, после чего каталитическая активность ХТ стала уменьшаться и через 10 минут после смешения практически полностью исчезла (точка Б на рис.7). В то же время в ходе всего эксперимента размер частиц в системе оставался равным исходному. Б совокупности эти факты однозначно свидетельствовали о том, что молекулы ХТ, изначально адсорбированные' на поверхности Л-БСА, переходили на частицы Л-СИТ и закреплялись на их поверхности благодаря специфическому взаимодействию с молекулами ингибитора.

Выше упоминалось о том, что молекулы линейного поликатиона, ПЭВП, электростатически взаимодействуют с отрицательно заряжен-

ными латексными частицами и образуют с ними прочные комплексы. Однако несмотря на это, частицы способны обмениваться адсорбированным поликатионом, в результате чего устанавливается равномерное распределение молекул поликатиона по всем частицам в системе. Может ли модификация поликатиона относительно небольшим белковым вектором, ХТ, обеспечить селективное связывание всей молекулы белок-полимерного конъюгата с частицами Л-СИТ в смеси Л-БСА/Л-СИТ?

В качестве коныогата нами был использован ХТ-ЛЭУВП, содержавший одну молекулу фермента на цепь полиэлектролита. Как следует из данных, приведенных на рис.9, конъюгат практически полностью связывался с обоими модифицированными лагексами вплоть до концентрации 1,7х10~8 макромоль/л, что соответствовало адсорбции нК0Н=5,ЗхЮ3 молекул ХТ-ПЭУВП на каждой частице Л-БСА и Л-СИТ. Принимая во внимание состав конъюгата, этот результат означал, что одна частица модифицированного латекса была способна адсорбировать 5,3x10 молекул ХТ, ковалентно связанных с молекулами ПЭУВП, или Ккон^ф=(5-,3х103/2,3х104)х100^=23% от максимально связывающегося с латексом количества ХТ. Очевидно,

Рис■9.

Зависимость концентрации конъюгата ХГ-ПЭУВП-, нэ связанного с Л-БСА (I) и Л-СИТ (2), от общей концентрации конъюгата. Концентрация латексов I ,9х1012л-1; рН 8.5 .

коньюгат ХТ-ПЭУВП

Рис.!□. Строение поверхности Л-СИТ с адсорбированным ХТ-ПЭУВП

остальная поверхность была занята ' цепями адсорбированно1 полналектролита (рис.10).

Адсорбция коныогата на частицах Л-БСА практически I сказывалась на каталитической активности ХТ (рис.II, кривая I Напротив, добавление возрастающих Количеств Л-СИТ к раство] конъюгата приводило к линейному понижению активности ХТ щ образовании специфических контактов с ингибитором, иммобилизс ванным на поверхности Л-СИТ (рис.11, кривая 2). ' Минимальнс

Л-БСА.

12 —I

Концентрация Л-БСА 4,8x10 л ; [ХТ-ПЭУВП] Г.5хГО~8м»кромоль/л ; рН 8.5.

Г3) Влияние Л-СИТ на активгость конъюгата, адсорбированного на

[ХТ-ПЭУВП] 1,5x10 8макромоль/л; рН 8.5.

литической активности конъюгата ХТ-ПЭУВП от концентрации Л-БСА (I ) и Л-СИТ (2).

Рис.IX.

Зависимость относительной ката-

С,

10-12 , Л-'

ачение активности достигалось при концентрации Л-СИТ 4,8x10

при этом на поверхности одной частицы Л-СИТ было адсорбиро-1НО м?-„=1,9x10^ молекул голйзлектролита, каждая из которых

КОИ

¡ела по одной молекуле ХТ. Эта величина составляла лишь !он/иф=(Г,9х103/2,Зх104)хПШ=8% от того количества молекул ¡модифицированного ХТ, которое могло адсорбироваться на частице -СИТ. Остальные молекулы коныогага связывались с поверхностью -СИТ в результате неспецифического электростатического взаимо-зйствия. Их активность, рассчитанная по данным рис.11 (кривая ), была равна 80% активности исходного ХТ.

Способность ХГ-ПЭУВП конъюгата узнавать частицы Л-СИТ в лешанной Л-БСА/Л-СИТ суспензии была продемонстрирована следую-зл образом. Конъюгат был добавлен к частицам Л-БСА с таким зсчетом, чтобы заполнить 30% латексной поверхности. Последующее збавление в систему возрастающих количеств Л-СИТ приводило к меньшению каталитической активности включенного в конъюгат ХТ рис.11, кривая 3). Полученная зависимость активности фермента т концентрации Л-СИТ в тройной системе конъюгат-(Л-БСА)-(Л-СИТ) олностью совпала с описанной ранее зависимостью активности онъюгата от концентрации Л-СИТ, измеренной в отсутствии Л-БСА рис.11, кривые 3 и 2). Это означало, что добавление Л-СИТ к омплексу конъюгата с Л-БСА приводило к формированию всех ■озмонных специфических контактов ХТ с СИТ.

Описанное уменьшение каталитической активности конъюгата югло быть следствием либо перехода молекул конъюгата с частиц [-БСА на частицы Л-СИТ, либо образования смешанных агрегатов, юсгоящих из частиц обоих типов, скрепленных друг с другом юлекулами адсорбированного конъюгата. Чтобы различить эти ;лучаи, был измерен размер частиц в системе после достижения юнъюгатом минимума каталитической активности, то есть при гонцентрации Л-СИТ равной или большей 4,8хЮ12 л-1. Оказалось, но этот размер был равен размеру исходных латексных частиц. Этот факт однозначно свидетельствовал о том, что молекулы сонъюгата, исходно связанные с частицами Л-ЕСА, полностью тереходили на частицы Л-СИТ и фиксировались на них благодаря шецифическим взаимодействиям ХТ с СИТ.

3.4. Конкурентные реакции в'системе белок-поликатион-латекс

В реальных биологических жидкостях, крови, лимфе и др., биологически активные полимерные конъюгаты взаимодействуют с клетками в присутствии различных белков, причем концентрация этих бежов во много раз превышает концентрацию вводимого полимера. В связи с этим, нами была исследована адсорбция линейного поликагиона, ЦЭВП, на отрицательно заряженных частицах карбоксилатного латекса в условиях конкуренции со стороны положительно и отрицательно заряженных белков.

Положительно заряженные белки способны адсорбироваться на отрицательно заряженной поверхности и тем самым затруднять адсорбцию поликатиона. В качестве такого белка в работе был использован ХГ. Его связывание на частицах Л-МАК было изучено при рн 7, когда глобулы белка были заряжены положительно. Как и -следовало ожидать, адсорбция ХТ понижала заряд латексных частиц, однако полной нейтрализации щи этом не происходило. Даже в

-4

2

2

2

[ХТ]х107, М

[ХТ]х106, М

Рис.12.

Рис.13■

Зависимость ЭФ1Х частиц Л-МАК от концентрации ХТ . Концентрация латекса

Зависимость концентрации не

общей концентрации ХГ.

связанного с Л-МАК ХТ от

1.8X1012л рН 7.

Концентрация латекса

5 ,4хЮ12Л 1 ; рН 7.

избытке бежа заряд частиц оставался отрицательным (рис.12). Весь добавляемый ХТ адсорбировался на поверхности частиц вплоть до концентрации 6,6х10~7 М, соответствовавшей максимальному заполнению поверхности частиц молекулам ХТ. Лишь при больших концентрациях белок накапливался в растворе (рис.13).

Для ответа на вопрос, может ли ХТ противодействовать адсорбции поликатиона на латексной поверхности, были поставлены две серии экспериментов. В первой из них к латексным частицам, поверхность которых была полностью покрыта глобулами ХТ, добавляли различные количества ПЭВП. Оказалось, что вытеснение белка в раствор начиналось сразу же после добавления первых порций поликатиона. В конечном итоге происходило полное замеще-

Рис.14.

(а) Зависимость концентрации ХТ. вытесненного с поверхности частиц Л-МАК в раствор, от концентрации ПЭВП (поверхность частиц полностью занята адсорбированным ХТ) ; (О) Зависимость концентрации ХТ. оставшегося в растворе после его добавления к комплексу Л-МАК-ХТ. от концентрации ХТ (поверхность частиц полностью занята адсорбированным ПЭВП).

Концентрация латекса 5,4x10*^ рН 7.

ше. молекул Селка цепями поликатиона на поверхности латексных частиц (рис.14,а). Во второй серии экспериментов поверхность латексных частиц предварительно покрывали плотным слоем молекул ГОВП и затем добавляли различные количества ХТ. В этом случае никакого вытеснения ПЭВП с поверхности частиц зарегистрировано не было. Наоборот, весь добавляемый белок оставался в растворе (рис.14,0). Приведенные данные свидетельствовали о том, что молекула ПЭВП является более сильным конкурентом за связывание с латексной поверхностью, чем молекула ХТ. Причина этого, очевидно, состояла в способности линейного поликатиона образовывать множественные ионные контакты с противоположно заряженной поверхностью. Этого в силу своего строения не могли сделать глобулы белка.

Отрицательно заряженные белки выступают в другой роли - они конкурируют с отрицательно заряженной поверхностью за связывание с поликатионом. Известно, что изоионная точка р! БСА равна

4,7-4,9 [О.Ма1аши(1 апс! а.И.ОгуэааХе, Апа1уЪ.Вл.осЬет., 86, 620

(1978)]. Поэтому при рн вше, чем 4,9 этот белок заряжен отрицательно и может образовывать комплексы с поликатионом. Степень полимеризации использованного в работе ЦЭВП была равна 1000. Размер частиц комплекса БСА-ПЭВП в зависимости от соотношения о равного числу глобул БСА, приходящегося в среднем на одну цепь ПЭВП, представлен на рис.15,а. Наиболее крупные частицы .образовывались при значении 0=20-25, что находилось в хорошем соответствии с данными, полученными ранее в работах [В.А.Кабанов и др., Молек.биол., II, 582 (1977); В.А.Кабанов и др., Биофизика, 23, 789 (1978)]. В избытке белка размер частиц комплекса был около 0,1 мкм.

Возможность взаимодействия комплекса БСА-ПЭВП с заряженной поверхностью' во многом должна была определяться величиной и знаком заряда' частиц комплекса. Как следует из рис.15,б, при малых, соотношениях о заряд частиц определялся зарядом поликатиона. Заряд частиц становился близким к нулю при <2=20-25, то есть именно, там, где размер частиц был максимальным. Если учесть, что кавдая глобула БСА несла 55 отрицательных зарядов, а степень полимеризации использованного ПЭВП составляла 1000,

О, мкм б

РИС.15■

Зависимость размера (а> и ЭФП (С) частиц комплекса ЕСА-ПЭВП через 15 минут после смешения компонентов от соотношения <2. [ИаС1] ю М; рН 9,2.

указанное соотношение соответствовало полной компенсации заряда поликатиона зарядом, привносимым молекулами белка. При больших соотношениях й поверхность частиц комплекса была покрыта глобулами белка и имела поэтому отрицательный заряд.

Для регистрации взаимодействия частиц комплекса БСА-ПЭБП с отрицательно заряженной поверхностью был использован белок, модифицированный ЛИТЦ (БСА*). Образование комплекса БСА* с ПЭВП приводило к тушению флуоресценции метки. Взаимодействие комплекса с латексной поверхностью, сопровождающееся заменой контактов белок-поликатион на контакты латекс-поликатион, должно было привести к высвобождению БСА* из комплекса. 00-этом можно было судить по возгоранию флуоресценции в системе.

Наименьшее восстановление флуоресценции происходило при соотношениях о=20, когда размер частиц комплекса был максимальным (рис.16). Основная часть поликатиона скрытого внутри крупных частиц не могла связаться с поверхностью латекса. В наибольшей степени флуоресценция восстанавливалась при малых соотношениях

Г

Рис.16.

Зависимость степени восстановления флуоресценции БСА , Г, от соотношения 0 при адсорбции комплекса ЕСА*-ПЭВП на поверхности частиц Л-МАК.

II —X —9

Концентрации латекса 1,8x10 л ; [ПЭВП] 3.3x10

макромоль/л; [МаС1] ТО'2", рН 9,2.

О, когда размеры частиц комплекса были существенно меньше. В избытке белка комплекс был заряжен отрицательно, но, несмотря на это, взаимодействовал с одноименно заряженным латексом. При этом часть белка высвобождалась в раствор в результате замены контактов белок-полимер на контакты полимер-поверхность.

Таким образом, поликатионы были способны взаимодействовать с противоположно заряженной поверхностью даже в присутствии больших избытков положительно и отрицательно заряженных белков.

4.ЮММ0ДЕЙСТВИЕ ШЛШОНОВ И ИНТЕРПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ С ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫМИ ЛИПОСОМАШ

4.1.Состав и строение комплекса поликатиона с твердыми липосомаш

Для изучения поведения поликатиона на поверхности клетки и реакции клеточной мембраны на адсорбированный поликатион были использованы модельные частицы - ляпосомы, построенные из смеси двух липидов: нейтрального дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и отрицательно заряженного кардиолипина (КЛ). Изменением температуры задавалось различное фазовое состояние липосомальной мембраны: оно могло быть твердым (состояние геля) или жидкокристаллическим. Это позволило проследить за тем, как фазовое состояние мембраны сказывалось на составе и структуре ее комплекса с толикатионом.

Микрокалориметрическое исследование смешанных ДДФХ-КЛ липосом (90/10 вес.!£) показало, .что они характеризовались широким фазовым переходом с двумя максимумами, расположенными при 34,6°С и Т2=38,8°С (рис.17), которые, по-видимому,

Г(°С)

3?ис.17. Калориметрическая кривая фазового перехода ДПФХ-КЛ (90/10) липосом.

О, мкм 6

(ПЭВГЧхЮ4, М

Рис.18.

(а) Зависимость ЭФП частиц комплекса ПЭВП- (ДПФХ-КЛ липосомы)

. от концентрации ПЭВП, 20 (I) и 55°С (2); (С)'Зависимость размера частиц комплекса пэвп - (ДПФХ-КЛ липосомы) от концентрации ПЭВП до (Г,2) и после добавления ПАК (3), 20 (I) и 55°С (2.3). [ПАК]/[ПЭВП]= 3/1. Концентрация липосоы I мг/мл, рН 9,2.

отвечали плавлению двух областей мембраны с большим и меньшим содержанием КЛ, соответственно. Ниже, температуры Т1 липидный бислой формировал твердую фазу с резко ограниченной подвижностью липидов в нем, при температуре выше Т2 бислой становился жидким, при этом подвижность липидов в нем-значительно возрастала.

Для регистрации взаимодействия ПЭВП с липосомами ' был использован метод лазерного микроэлекгрофореза. Зависимость изменения ЭФП твердых ДПФХ-КЛ липосом ог концентрации ПЭВП, измеренная при 20°, приведена на рис.18,а (кривая I). Добавление поликатиона вначале приводило к уменьшению ЭФП липосом до нуля.. Затем поверхность перезаряжалась, и ЭФП достигала своего, предельного положительного значения. Параллельные измерения размеров частиц, присутствовавших в системе, свидетельствовали о -том, что адсорбция ПЭВП на поверхности липосом сопровождалась их агрегацией (рис. 18,6, кривая I'). Агрегаты максимального размера збразовывались при полной нейтрализации поверхностного заряда пипосом, го есть когда ЭФП частиц становилась равной нулю. 1альнейшее увеличение концентрации ПЭВП вызывало уменьшение эазмера агрегатов до размера исходных липосом. В этой области сонцентраций ПЭВП стабилизация липосом была связана'с появлением 1а их поверхности избыточного положительного заряда, привнесен-юго адсорбированным ПЭВП.

Весь добавленный к липосомам ПЭВП адсорбировался на поверх-гости липосом, если его .концентрация в системе не превышала ;,5хЮ"4 М (рис.19, кривая I). При больших концентрациях ПЭВП [акапливался в растворе. Адсорбция поликатиона полностью' (рекращалась,' когда ЭФП липосом достигал своего предельного галожителыюго значения, что следовало из сравнения результатов, [риведенных на рис.19 (кривая 1)и 18,а (кривая I). Результатом ¡дсорбции было появление на границе раздела вод'а-липосомзльная 1ембрана поликатион-липидаого комплекса, ' стабилизированного ножественными ионными контактами между положительно заряженными веньями ПЭВП и отрицательно заряженными полярными группами КЛ.

Для определения доли звеньев- поликатиона, образовавших олевйе связи с молекулам! КЛ, /з, использовали следующую роцедуру. Липосомы с адсорбированным ПЭВП отделяли от водного аствора центрифугированием. Затем в надосадочной жидкости с

Рис.19. Зависимость концентрации не связанного с липосо-мами ПЭВП, от его общей концентрации, 20 (I) и 55°С (2 ) .

Концентрация липосом I мг/мл. pH 9,2.

2 4

[ПЭВП]х104, М

помощью бромоелективного электрода определяли концентрацию бромид-ионов, [вг~] (рис.20, кривая I)). Очевидно, эта концентрация была равна концентрации кватернизованных звеньев поликатиона, образовавших солевые связи с молекулами КЛ, [ГОВП]к. Величина, э, определенная по данным рис.20 из соотношения :

р=[ПЭВП]к/[ПЭВП]=[вг~]р/[вг~], где [ПЭВП)=[Вг-] - общая концентрация кватернизованных звеньев ПЭВП, оказалась равной 0,85.

рис.20. Зависимость концентрации Оромид-ионов в надосадоч-ной жидкости после отделения комплекса ПЭВП- (ЛПФХ-КЛ липосомы) от общей концентрации Оромид-ионов,20' (I) и 55°С (2). Концентрация липосом I мг/мл, рН 9,2.

Полученные результаты позволили определить состав комплекса, образующегося при адсорбции ПЭВП на поверхности твердых липосом. Поскольку весь добавленный ПЭВП связывался с липосо-мальной мембраной, то в точке ЭФП=0 привносимый им заряд был численно равен поверхностному заряду липосомы. Иными словами, при ЗФП=0 концентрация положительно заряженных звеньев поликатиона, образовавших солевые связи с молекулами КЛ, [ПЭВП]К , была равна концентрации отрицательно заряженных молекул КЛ, сосредоточенных во внешнем слое лшшдной мембраны, [КЛ]внеш. Доля молекул КЛ, образовавших комплекс с поликатионом, г, определялась соотношением:

'=[КЛ]ввви/[КЛ] = [ГОВП]В1(/[1Ш]1

где [КЛ] - общая концентрация КЛ в растворе. С учетом того, что [ПЗВП]„ =[ПЭВП] „хз, где [ПЗВП1 - общая концентрация кватерни-

Л, О и и

зованных звеньев ПЭВП в растворе в точке ЭФП=0, расчет, проведенный по данным рис.18,а (кривая I), дал т=0,5.

Из полученного результата следовали два важных вывода. Во-первых, в мембране исходных (твердых) липосом отрицательно заряженные молекулы КЛ равномерно были распределены между обеими сторонами бислоя, и во-вторых, только молекулы КЛ, расположенные на внешней стороне мембраны, участвовали в образовании комплекса с адсорбированным поликатионом.

4.2.Состав и строение комплекса поликатиона с жидкими лжюсомами

Выше температуры фазового перехода лишдные молекулы приобретали способность перемещаться вдоль каждого из монослоев липосомальной мембраны и переходить из одного монослоя в другой. Оба этих процесса могли существенно повлиять на структуру и свойства комплексов поликатионов с жидкими лжюсомами.

На первый взгляд взаимодействие ПЭВП с жидкими ДПФХ-КЛ лилосомами, исследованное при 55°С, подчинялось тем же закономерностям, что и поведение системы ПЭВП-твердые липосомы. Поликатион практически полностью адсорбировался на поверхности липосом (рис.19, кривая 2) и основная часть его звеньев образо-

вывала ионные связи с молекулами И '(рис.20, кривая 2). Адсорбция ПЭВП сопровождалась нейтрализацией заряда липосом (рис. 18,а, кривая 2) и образованием крупных агрегатов (рис.18,б, кривая 2). Однако при"этом количество ПЭВП необходимое для полной нейтрализации заряда липосом и формирования частиц максимального размера оказывалось вдвое большим, чей количество ПЭВП, вызывавшее аналогичные эффекты при добавлении к твердым липосомам.

Одной из причин этого могло быть разрушение адсорбированным поликатионом мембраны жидких липосом. При этом все КЛ молекулы как с внешней, так и с внутренней стороны мембраны могли участвовать в образовании ионных связей с ПЭВП. Для проверки справедливости этого предположения мы воспользовались свойством полиакриловой кислоты (ПАК) образовывать прочные интерполиэлек-тролитше комплексы (ИПК) с ПЭВП и, следовательно, выступать в качестве эффективного конкурента отрицательно заряженным молекулам КЛ за связывание ПЭВП. Оказалось, что добавление ПАК к предварительно сформированным крупным частицам, включающим жидкие липосомы и ПЭВП, в соотношении [ПАК]/[ПЭВП]=3/1 приводило к их полной диссоциации и появлению липосом исходного размера (рис.18,6, кривая 3). Полученный результат однозначно свидетель-сгвал о том, что целостность липосомальной мембраны в комплексе с поликатионом не нарушалась.

Это, в свою очередь, позволяло утверждать, что упомянутый ранее едвиг кривых на рис.18,а и 18,6 в сторону больших концентраций ПЭВП при нагревании липидной мембраны выше температуры фазового перехода являлся следствием индуцированного адсорбированным . поликатионом трансбислойного перехода (флип-флопа) молекул КЛ с внутренней стороны липидного бислоя на внешний. Сохранение мембраной целостности означало, что этот процесс сопровождался переходом равного количества молекул нейтрального лшщда из внутреннего слоя' мембраны на внешний. В литературе описаны случаи значительного ускорения скорости флип-флопа при ХИМИЧеСКОЙ модификации ЛИПИДНОЙ мембраны [B.de Kruijff and P.Baken, Biochim.Biophys.Acta, 507, 38 (1978)] И ВСТРЗИВЭНИИ В нее белков [B.de Kruijff et.al.Biochim.Biophys. Acta, 509, 537 (1978); L.I.Barsukov et.al., FEBS Lett., 144, 337 (1982)].

Полученные нами результаты говорили о том, что адсорбция линей-

ного полиэлектролита оказывала на липидную мембрану аналогичное действие.

Увеличение содержания КЛ в жидких липосомах приводило к прямо пропорциональному возрастанию количества ПЭВП необходимого для нейтрализации всех зарядов липосомальной мембраны (рис.21, а и б), и формирования частиц максимального размера (рис.22, а и б). Это указывало на то, что во всех случаях в образовании комплексов с поликатионом принимали участие все молекулы КЛ, расположенные на обеих' сторонах мембраны.

Вместе -с тем совершенно очевидно, что в лшосомах-, в которых доля молекул КЛ, к=[КЛ]/([КЛ]+[ФХ}), превышает 0,5," индуцированная поликатионом трансбислойная миграция молекул КЛ должна приводить к существенному обеднению внутренней стороны, мембраны и, в конечном итоге, к ее разрушению. Это, в свою очередь, должно сопровождаться появлением различного рода небислойных структур и их последующей агрегацией с образованием крупных частиц, состоящих из фрагментов разрушенной мембраны, скрепленных вместе молекулами шшпсатиона. Различие в структуре образующихся агрегатов должно отражаться на их способности восстанавливать свой размер при добавлении в раствор избытка ПАК. '

Как следует из данных рис,23, добавление ПАК к агрегатам, образованным ПЭВП и липосомами с к=0,3 и менее, приводило к диссоциации агрегатов до исходных липосом. Частицы, сформированные ПЭВП и липосомами с к=0,5 и выше, сохраняли свой размер .в присутствии ПАК. Промежуточный случай соответствовал липосомам; у которых величина к находилась в интервале 0,3-0,5. Под действием ПАК размер агрегатов этих липосом и ПЭВП уменьшался лишь частично.

Параллельно за поведением комплексов ПЭВП• с липосомами в присутствии ПАК следили по изменению флуоресценции метки, встроенной в липосомальную мембрану (рис.24). Как и следовало ожидать, комплексы, образованные липосомами с малым содержанием КЛ (к=0-0,3), полностью диссоциировали на исходные компоненты, при этом флуоресценция метки восстанавливалась до исходного уровня (рис.24). Комплексы, образованные липосомами с высоким

Рис.31.

(а) Зависимость ЭФП част яд комплекса ПЭВП-(М-КЛ липосомы) от концентрации ПЭВП. к О,2 (I); 0.45 12); 0,75 (3)1 I (4); (б.) Зависимость концентрации ПЭВП необходимой для полной нейтрализации заряда 6Х-КЛ липосом от соотношения к. Концентрация липосом I мг/мл, 9,2.

[ПЭВП]хЮ3, м

Рис■22 ■

(а) Зависимость размера частиц комплекса ПЭВД-(ФХ-КЛ липосомы) от концентрации ПЭВП. к 0.2 (I).; 0,45 (2); 0,75 (3)', 1(4);' (О) Зависимость концентрации ПЭВП необходимой для Сформирования частиц максимального размера от соотношения к. Концентрация липосом I мг/мл, рН 9,2.

Б

Г

о-о

\

0,5 к

-о

Рис.23.

Рис.24.

Зависимость степени вое

Зависимость степени вое

добавления ПАК от соотношения к.

становления размера час

КЛ липосомы), Э, после

тиц комплекса 11ЭВЛ- СФХ —

становления флуоресценции ФХ-ЬСЛ липосом, Р. пос.ле добавления ПАК к комплексу ПЗВИ-(ФХ-КЛ линосомы) от соотношения к.

Концентрация липосом I мг/мл; [ПАК]/[ПЭВП)= 3/1; рН 9.2.

содержанием КЛ (к=0,5-1), не диссоциировал! в избытке ПАК, что следовало из отсутствия возгорания флуоресценции метки. Что касается комплексов, образованных при адсорбции ПЭВП на поверхности липосом с промежуточным содержанием КЛ (к-0,3-0,5), то добавление ПАК практически не сказывалось на устойчивости таких комплексов и приводило лишь к незначительному восстановлению интенсивности флуоресценции в системе. Остающийся на поверхности липосом полякагион удерживал их рядом друг с другом, не позволяя агрегатам разрушаться до конца.

Результаты этих экспериментов подтвердили прогноз о том, что строение комплексов, образующихся при взаимодействии поликатиона с жидкими липосомами, состоящими из смеси нейтрального и отрицательно заряженного липида, должно в значительной степени определяться содержанием последнего в лиюсомальной мембране.

4.3.Механизм взаимодействия поликатионов с липосомами

Совокупность полученных . различными методами результатов позволяет предложить следующий механизм взаимодействия синтетического линейного поликатиона, ПЭВП, с липосомами, мембрана которых состоит из смеси нейтрального, ДПФХ или ФХ, и отрицательно заряженного, КЛ, липчдов.

Исходная мембрана характеризуется симметричным распределением молекул отрицательно заряженного липида между внешней и внутренней сторонами мембраны. Адсорбция поликатиона сопровождается образованием комплекса, стабилизированного множественными ионными контактами между звеньями поликатиона и молекулами КЛ. Нейтрализация заряда липосом приводит к утрате ими стабильности и последующей агрегации.

Если мембрана находится в твердом состоянии, то взаимодействие ПЭВП с липосомами развивается как адсорбция полииона на Поверхности с фиксированным положением отрицателных зарядов. При этом только молекулы КЛ, расположенные на внешней стороне мембраны, участвуют в образовании комплекса с ПЭВП.

В мембране, находящейся в 'жидкокристаллическом состоянии, подвижность липидов приводит к резкому изменению состава и структуры комплекса поликатион-липосома. Адсорбция поликатиона сонровЗвдается образованием максимального количества ионных связей мевду звеньями ПЭВП и полярными группами КЛ. Формированию комплекса такого строения способствует индуцированный поликатионом переход молекул КЛ с внутренней на внешнюю сторону липосо-мальной мембранн (фдип-фдоп).

Если-доля молекул КЛ в мембране к составляет 0,3 и менее, то флип-флоп молекул КЛ сопровождается переходом равного количества молекул незаряженного липида из внешнего слоя во внутренний, при этом бислбйная структура липосомальной мембраны сохраняется. В этих условиях адсорбция ПЭВП обратима: поликатион может быть' полностью удален с поверхности липосом добавлением избытка полианиона.

При содержании КЛ в мембране от 0,3 до 0,5 переход молекул КЛ из внутреннего слоя во внешний уже не сопровождается переме-

щением соответствующего количества нейтрального липида в обратном направлении. Возникающая асимметрия в распределении липидов, по-видимому, компенсируется встраиванием части молекул КЛ, связанных в комплекс с ПЭВП, внутрь бисло'я и образования в нем складок или других дефектов. При' этом одна и та же молекула ПЭВП может быть причиной появления дефектов в мембранах соседних липосом. Следствием этого является невозможность полного разрушения агрегатов ПЭВП с липосомами указанного состава добавлением в раствор избыточных количеств поликислоты.

Если же доля КЛ в мембране превышает 0,5, то индуцированный поликатионом флип-фпоп молекул КЛ вызывает столь значительной обеднение внутреннего слоя мембраны, которое приводит к полному ее разрушению'и Образованию небислойных структур с включенным в них поликатионом.

4.4.Взаимодействие ДНК-содержащих интерполиэлектролитных комплексов с липосомами

Отрицательно заряженные липосомы были также использованы в качестве модельных объектов для исследования движущих сил и механизма взаимодействия ДНК-содержащих ЛПК с клетками. Выше отмечалось, что включение ДНК в состав растворимых ШЖ приводит к ее стабилизации против расщепления нуклеазами и резко повышает ее трансформирующую способность. В работе исследованы три типа ДНК-содержащих комплексов: с низкомолекулярным катионом, ЦПБ; .с линейным'поликатионом, ПЭВП; и с поликатионом, модифицированным боковыми детальными группами, ПЭЦВП.

Добавление растворов катионных реагентов (КР) к раствору ДНК приводило к нейтрализации заряда молекул ДНК (рис.25,а), и появлению крупных частиц комплексов ДНК с КР (рис.25,6). Во всех случаях нулевой заряд и максимальный размер частиц достигался при сгехиомегрическом соотношении компонентов (в=[КР]/[ЛНК]-1). При зчачениях в больших I происходила перезарядка частиц комплекса и уменьшение его размера , Эти факты свидетельствовали о практически количественном связывании ДНК в комплекс со всеми тремя КР.

Рис.25■

Зависимость ЭФП (а) и размера СО) частиц комплексов ДНК-ЦЛБ (I), ДНК-ПЭВП (2) и ДНК-ПЭЦВП (3) от соотношения е. [днк] ю-4 м; рн 7.

Для последующих экспериментов были выбраны комплексы состава е=0,1. Комплексы именно такого состава были успешно использованы для трансформации ДНК в клетки Bacillus subtilis. Добавление ЦПБ и его комплекса с ДНК к липосомам вызывало понижение ЭФП липосом до значений близким к нулевому (рис.26,а, кривые I и 2) и описывалось одной и той же кривой. Параметр ip на этом рисунке представляет собой отношение концентрации ЦПБ, свободного или связанного в комплекс с ДНК, к концентрации КЛ, включенного в состав липосомальной мембраны. Размер липосом при их взаимодействии с ЦПБ не изменялся при всех исследованных значениях параметра г> (рис.26,б, кривая I). Добавление комплекса ДНК-ЦПН к липосомам не вызывало изменения размера последних лишь при условии, если значение параметра <р не превышало 0,8. При больших значениях' <р в системе появлялись агрегаты (рис.26,б, кривая 2). На основании этих результатов можно было заключить, что при контакте с липосомами комплекс ДНК-ЦПБ полностью

а о, мкм б

Рис.26.

(а) Зависимость ЭФП ФХ-КЛ липосом' в присутствии ЦПБ (I) к комплексов ДНК-ЦПБ (2). ДНК-ПЭВП (3) и ДНК-ПЭЦВП (4) от соотношения (О) Зависимость размера ФХ-КЛ липосом в присутствии ЦПБ (I) и комплекса ДНК-ЦПБ (2) от соотношения <р. Концентрация липосом I мг/мл; рК 7.

диссоциировал. При этом цетилпиридиотевые катионы, по-видимому, встраивались в липосомальную мембрану, нейтрализуя ее заряд, а молекулы ДНК оставались в растворе.

Добавление комплекса ДНК-ПЭВП к лшюсомам никак не влияло на ЭФП липосом (рис.26,а, кривая 3) и не приводило к тушению флуоресценции меченого липида, ФИТЦ-ФЭ, встроеного в липосомальную мембрану (рис.27, кривая I). Эти факты указывали на отсутствие взаимодействия комплекса ДНК-ГОВП с липосомэльной мембраной. В этом случае комплекс сохранялся в растворе в недиссоциированном виде. Последний вывод следовал из результатов эксперимента, в котором комплекс ПЭВП с флуоресцентно меченой ДНК* был добавлен к суспензии липосом. Флуоресценция ДНК*, частично

Ф1

рис.г?. Зависимость интенсивности флуоресценции ФХ-КЛ лидосом в присутствии комплексов

днк-пэвп (I) и днк-пэцвп(г)

от соотношения р. Концентрация'липосом I мг/мл; рН 7.

затушенная звеньями поликатиона, в присутствии липосом не восстанавливалась.

Таким образом, включение ДНК в комплекс с низкомолекулярным катионом, ЩБ, и линейным поликатиоком, ПЗВП, не привело к связыванию ДНК с лилосомальной мембраной.

Отрицательно заряженный комплекс ДНК-ГОЦВП с е=ОД и ЭШ=-1,5 (мкм/с)/(В/см) при добавлении к липосомам понижал их ЭФП (рис.26,а, кривая 4) и частично тушил флуоресценцию включенной в Лиюсомальную мембрану метки (рис.27, кривая 2). Эти изменения могли быть результатом адсорбции на поверхности липосом' не диссоциированного ДНК-ГОЦВП комплекса или только одного из его компонентов - ПЭЦВП. Чтобы различить эти случаи, был приготовлен комплекс флуоресцентно меченой ДНК* и ПЭЦВП. Добавление -этого комплекса к липосомам не вызывало возгорания флуоресценции метки. Это доказывало, что комплекс ДНК-ПЭЦВП, в отличие от комплексов ДНК с ЦПБ и ПЭВП, при взаимодействии с липосомами не диссоциирует на компоненты, а адсорбируется на поверхности липосом как целое, по-видимому, за счет встраивания цетильных фрагментов в гидрофобную часть липидного бислоя.

Ранее в экспериментах с нативными клетками было показано, что включение _ кольцевых молекул ДНК в комплекс с любым из поликатионов, ПЭБП и ПЭЦВП, приводило к значительному повышению

эффективности связывания ДНК на клеточной поверхности. Такое зазличие в поведении ДНК-содержащих комплексов по отношению к гативным клеткам и модельным объектам - липосомам может быть следствием, по крайней мере, двух причин. Одна из них заключайся в том, что использованные в рйботе малые липосомы диаметром жоло 50 мкм обладают значительной жесткостью. Мембрана' таких шпосом не может изгибаться с образованием складок и других 1ефектов: подобные возмущения мембраны приводят к ее необрати-юму разрушению. Это делает невозможным встраивание в мембрану шпосом поликомплексов, содержащих . достаточно протяженные гидрофобные блоки, образованные противоположно заряженными ¡веньями ДНК.и линейного ПЭВП. В отличие от лилосом поверхность слетки способна менять свою кривизну без разрушения. Это гозволяег клеточной мембране взаимодействовать с упомянутыми комплексами. Кроме того, мембрана клетки содержит значительные :оличества разнообразных белков. Их присутствие может играть ¡аметную роль во взаимодействии мембраны с макромолекулярными >бъектами, в том числе с ДНК-содержащими ИНК. Включение ДНК в :омплекс с поликатионом, несущим боковые алкильные радикалы, Юеспечивало прочное связывание всей комплексной частицы как с [ипосомальной, так и с клеточной мембраной.

5.ВЫВОДЫ

1.На основе результатов, полученных при исследовании ¡заимодействия синтетических и природных полигонов с объектами, матирующими клетки - латексными частицами и липосомами, разра-¡отан единый физико-химический подход к описанию механизма юиска биологически активным полимерами клеток-мишеней в биоло-ической жидкости и реакции клеточной мембраны на адсорбирований полимер.

2.Показано, что адсорбция линейных поликатионов на противо-:оложно заряженных латексных частицах представляет собой »оперативный процесс, характеризующийся высокой константой 'бразования комплекса поликатион-латекс и большой глубиной ■авершения реакции образования ионных связей между звеньями

поликатиона и ионогеншми группами латекса.

3.Впервые обнаружены и изучены .реакции между линейным поликатионаш! и латексными частицами, сопровождающиеся переносоь молекул поликатиона между частицами. В однокомпонентной латексной суспензии миграция поликатионов приводят к равномерна распределению макромолекул по всем частицам в системе.

4.Установлено, что в смеси латексных частиц разного сорте белково-полвдерный конъюгаг селективно адсорбируется на теп частицах, которые несут на своей поверхности центры специфического связывания входящего в состав конъюгата белка. Предложен I обоснован механизм перехода молекул поликатионов и коныогатов с одной латексной частицы на другую.

5.Исследован механизм конкурентных реакций в тройно! системе латекс-поликагион-белок. Показано, что избыточные количества белков не препятствуют адсорбции поликатионов нг поверхности отрицательно заряженных латексных частиц. Положительно заряженные белки полностью вытесняются поликатионом с латексной поверхности. Отрицательно заряженные белки образуют ( шликатионом комплексы, которые сохраняют способность взаимодействовать с латексными частицами, при этом контакты Селок-полиме: заменяются на контакты лате.кс-полимер и часть бежа-высвобождается в раствор.

6.Впервые проведено систематическое изучение состава I строения комплексов, образующихся при адсорбции синтетически поликатионов на поверхности смешанных липосом, состоящих и: смеси нейтрального и отрицательно заряженного липидов. Показано что состав и строение комплексов критическим образом зависят о: фазового состояния липосомальной мембраны, доли отрицатель® заряженного липида в ней и химической природы поликатиона.

7.Показано, что ниже температуры фазового переход; лшшдаого бислоя (в случае твердых . липосом) в образовйнш комплекса с поликатионом участвуют лишь отрицательно заряженные лишщные молекулы, расположенные на внешней стороне мембраны Выше температуры фазового перехода, когда мембрана переходит I жидкокристаллическое состояние, адсорбция поликатиона индуцируе: переход отрицательно заряженных липидных молекул с внутренней нг внешнюю сторону мембраны.

8.Установлено, что поликагионы, адсорбированные на поверх-ости жидких липосом, могут быть десорбированы в раствор в езультате образования нестехиометричных интерполиэлектролитных омплексов с синтетическими и природными полианионами. Модйфика-ия поликатиона боковыми алифатическими фрагментами приводит к табилизации его комплекса с жидкими липосомами благодаря страиванию алифатических радикалов в гидрофобную часть липосо-эльной мембраны.

Э. Показано, что адсорбция поликэтиошв на поверхности вешанных липосом, доля отрицательно заряженного липида в эторых превышает 0,5, вызывает необратимое разрушение липосо-эльной мембраны.

10.Впервые проведено сравнительное изучение взаимодействия ПС, связанной в комплекс с положительно заряженными низкомоле-'лярными поверхностно-активными веществами (ПАВ) и поликатио-1ми, с отрицательно заряженными липосомами. Показано, что в отсутствии липосом комплекс ДНК с низкомолекулярным ПАВ 1лностыо диссоциирует, при этом ПАВ встраивается в липосомаль-гю мембрану, а ДНК остается в растворе. Комплекс ДНК с линейным >ликатионом вообще не реагирует с липосомами, а комплекс ДНК с >ликатионом, содержащим Соковые алифатические фрагменты, жзывается с поверхностью липосом без разрушения.

6.СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. В.А.Кабанов, А.С .Полянский, А.А.Ярославов, О.СЛечик. О миграции полиионов, связанных с поверхностью противоположно заряженных латексных частиц. Доклады АН СССР, т.283, N6, с.1409-1411 (1985).

2. А.А.Демина, И.М.Самсонова, А.М.Блинковский, Г.В.Журавлева,

A.С.Полянский, А.А.Ярославов. Микроаналитические методы (латекс-агглютинационный тест и иммуноферментный анализ) в диагностике мешшгококковой инфекции. Ж.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., N9, с.94-98 (1987).

3. С.А.Сухишвили, А.С.Полинский, А.А.Ярославов, О.С.Чечик,

B.А.Кабанов. 00 обратимости адсорбции поликагиона на противоположно заряженных латексных частицах. Доклады АН СССР, т.302, N2, с.381-384 (Г988).

1. С.А.Сухишвили, А.С.Полинский, А.А.Ярославов, В.А.Кабанов. Экстремальная температурная зависимость скорости адсорбции

поликатиона на поверхности отрицательно заряженного латекса. Доклады АН СССР, т.302, N3, с.640-643 (1988).

5. А.В.КаСанов, В.Ю.Алахов, Е.Ю.Клинский, М.М.Хруцкая,

A.А.Рахнянская, А.С.Полянский, А.А.Ярославов, Е.С.Северин,

B.А.Кабанов, А.В.Левашов. Конструирование конъюгатов природных и синтетических макромолекул при использовании обращенных мицелл как микрореакторов. Доклады АН СССР, Т.302, N3, с.735-738 (1988).

6. A.A.Yaroslavov, A.S.Polynsky, S.A.Sukhishvili, O.L.Pospe-lova. The interaction between artificial antigenes based on synthetic polyelectrolytes with immune system cells: physico-chemical aspects. 3rd USSR-BRD Macromolecular syiaposium "Polyner systems with specific properties as consequence of their macromolecular structure": Abstracts. -Alma-Ata, 1988, p.40.

7. С.А.Сухишвили, Д.В.Николайчик, A.С.Полянский, А.А.Ярославов, О.С.Чечик, В.А.Кабанов. Конкурентные взаимодействия

■ в системе поли-м-эгил-4-вириллиридиний • бромид - бычий сывороточный альбумин - карбоксилатный латекс. Иммунология, N2, с.82-84 (1989).

8. А.А.Ярославов. Адсорбция полиэлектролитов на заряженных поверхностях и реакции обмена в таких системах. 2 Всесоюзная конференция '•Интерполиэлектролитные комплексы": Тезисы докладов.- Рига, 1989, с.240.

9. А.А.Ярославов, С.А.Сухишвили, О.С.Чечик. Перераспределение поликатиона между частицами отрицательно заряженного латекса. 2 Всесоюзная конференция "Интерполиэлектролитные комплексы": Тезисы докладов.-. Рига, 1989, с.274-277.

10. С.А.Сухишвили, О.С.Чечик, А.А.Ярославов. Кооперативная адсорбция поликатиона на поверхности карбоксилатного латекса. 2 Всесоюзная конференция "Интерполиэлектролитные комплексы": Тезисы докладов.- Рига, 1989, с.278-281.

11. О.Н.Зефирова, А.А.Ярославов. Неравномерное распределение поликатиона между отрицательно заряженными липосомами. 2 'Всесоюзная конференция "Интерполиэлектролитные комплексы": Тезисы докладов.- Рига, 1989, с.282-284.

12. А.М.Блинковский, О.С.Чечик, А.С.Полинский, А.А.Ярославов. Полистирольные карбоксилированные латексы как носители иммуносорбентов. Ж. Все с.хим.о-ва им.Д.И.Менделеева, т.34, N1, С.122-123 (1989).

13. A.A.Yaroslavov, A.S.Polynsky, S.A.Sukhishvili, V.A.Kabanov. The interaction between artificial antigenes based on synthetic polyelectrolytes with immune system cells: physico-chemical aspects. Makromol.Chem.,Macromol.Symp., v.26, p.265-280 (1989).

14. A.A.Yaroslavov, S.A.Sukhishvili, V.A.Kabanov. Interaction of polyions with cell-mimetic species. 1st USSR-Italy Polymer meeting: Abstracts.- Gargnano, 1989, p.13.

15. А.А-.Ярославов, С.А.Сухишвили, В.А.Кабанов. Взаимодействие

синтетических поликатионов с противоположно заряженными коллоидными частицами. Международная конфзренция по поверхностным силам: Тезисы докладов.- Москва, 1990, с.105.

6. V.A.Kabanov, А.А.Yaroslavov, S.A.Sukhishvili, A.S.Polyhsky, O.S.Chechik. Recognition of target colloid species by conjugates of a linear polyelectrolyte with a vector protein. FEBS Lett., v.275, No.1-2, p.231-234 (1990).

7. С.A.Сухишвили, 0.В.Воронина, А.А.Ярославов, О.С.Чечик. Физико-химические аспекты взаимодействия конъюгатов полиэлектролит-белок с клетками: модельное исследование. Всесоюзная конференция "Фундаментальные проблемы современной науки о полимерах": Тезисы докладов.- Ленинград, 1990, с.94.

8. В.Е.Кульков, А.А.Ярославов. Комплексы линейных синтети-' ческих поликатионов с противоположно заряженными липо-сомами. Всесоюзная конференция "Фундаментальные проблемы современной -науки о полимерах": Тезисы докладов.- Ленинград, 1990, с.82.

9. A.A.Yaroslavov, S.A.Sukhishvili, V.A.Kabanov. Interaction of polyions with oppositely charged liophilic colloid species. 3rd SPSJ International polymer conference "Membranes and interfacial phenomena of polymeres": Abstracts.- Nagoya, 1990, p.119.

Ю. С.А.Сухишвили, А.А.Ярославов. Конкурентные реакции поликатиона с белками при его адсорбщш на поверхности отрицательно заряженных латексных частиц. 4 Всесоюзная конференция "Водорастворимые полимеры и их применение": Тезисы докладов. - Иркутск, 1991, с.150.

'Л. А.А.Ярославов, С.А.Сухипвияи, 0.В.Воронина, О.С.Чечик. Реакции обмена и "узнавания" в системе полиэлектролит-коллоид. 4 Всесоюзная конференция "Водорастворимые полимеры и их применение": Тезисы докладов.- Иркутск, 1991, с.160.

12. В.А.Кабанов, А.Б.Зезин, В.А.Касаикин, А.А.Ярославов, Д.А.Топчиев. Болиэлектролиты в решении экологических Проблем. Успехи химии, т.60, N3, с.595-601 (1991).

й. 0.В.Воронина, С.А.Сухишвили, А.А.Ярославов, О.С.Чечик, Л.В.Голина. Оптимизация условий проведения латекс-агглютинационного теста. 9 Всесоюзный научный симпозиум "Синтетические полимеры медицинского назначения": Тезисы докладов.- Звенигород, 1991, с.Ю2.

J4. S.A.Sukhishvili, О.V.Boronina, A.A.Varoslavov, V.A.Kabanov. Interchange reactions in polyelectrolyte-colloid system. 1st China-Japan-USSR Joint symposium on advanced polymers: Abstracts.- Moscow, 1991, p.A-31.

25. V.V.Tertov, I.A.Sobenin, Z.A.Gabbasov, E.G.Popov, A.A.Yaroslavov, V.N.Smirnov, A.N.Orekhov. Three types of naturally occurring modified lipoproteins induce intracellular lipid accumulation due to lipoprotein aggregation. Circ.Res., V.71, No.l, p.218-228 (1992).

26. В.А.Кабанов, А.А.Ярославов, С.А.Сухипвили. Механизм узнавания клеток-мишеней линейным полиэлектролигом, конъюгиро-ванным с белковым вектором. 5 Конференция Российской Федерации "Новые направления в биотехнологии": Тезисы ■докладов.- Пущино, 1992, с.55.

27. С.А.Сухшвили, О.Л.Обольский, И.В.Астафьева, А.В.Кабанов, А.А.Ярославов. Интерполизлектролитнне комплексы, содержащие ДНК: взаимодействие с липосомами. Высокомолек.соед., Т.35А, Nil, 1895-1899 (1993).

28. S.A.Sukhishvili, O.L.Obolsky, I.V.Astafieva, A.V.Kabanov, A.A.Yaroslavov. DNA-containing interpolyelectrolyte complexes: interaction with liposomes. 1st German-Kus'sian Joint symposium on polymers: Abstracts.- Moscow, 1993, p.A-17.

29. А.А.Ярославов, А.А.Ефимова, В.E.Кульков, В.А.Кабанов. Адсорбция поликатиона на поверхности отрицательно заряженных липосом. Влияние фазового состояния липидного бислоя на строение комплекса полякатион-липосома. высокомолек. соед., T.36A, N2, С.264-270 (1994).

30. A.A.Yaroslavov, V.Ye.Kul'kov, A.S.Polinsky, B.A.Baibakov, V.A.Kabanov. A polycation causes migration of charged phospholipids from the inner to outer leaflet of liposomal membrane. FEBS Lett., v.340, Noll-2, p.121-123 (1994).

31. A.A.Yaroslavov, A.A.Efimova, M.O.Ignatiev, E.A.Kiseliova, V.A.Kabanov. Complexation of synthetic polyelectrolytes with lipid bilayer membranes. 6th International conference on polymer supported reactions in organic chemistry: Abstracts.- Venice, 1994, p.299-300.

32. Yu.A.Ermakov, A.A.Yaroslavov and A.A.Efimova. Polycation adsorption on the surface of liquid membranes studied by electrokinetic and thermodynamic methods. Biophys J., v.68, No.2 (part 2), p.A302 (19Э5).

33. V.A.Kabanov, A.A.Yaroslavov, о.V.Boronina, S.A.Sukhishvili, I.R.Nazarova. Modelling of search and recognition of target cells by protein-linear polyelectrolyte conjugates. J.Bioactive and Compatible Polym., v.10, No.l, p.41-50 (1995).

34. V.A.Kabanov, A.A.Yaroslavov, S.A.Sukhishvili. Interaction of polyions with cell-mimetic species: physico-chemical approach. 7th International symposium on recent advances in drug delivery systems: Abstracts.- Salt Lake City, 1995, p.39-42.

7.ОГЛАВЛЕНИЕ

.Общая характеристика работы...............................................I

.Экспериментальная часть..........'..............................................7

2.1.Материал ы......................................................................................7

2.2.Метод ы............................................................................................Ю

.Взаимодействие поликатионов с отрицательно

заряженными латексными частицами................................................II

3.1.Состав и строение комплексов поликатион-латекс............II. 1

3.2.Миграция поликагиона между латексными частицами..........16

3.3.Механизм узнавания частиц-мишеней поликатионом, конъюгированным с белковым вектором..................................18*

3.4.Конкурентные реакции в системе белок-поликатион- . латекс.................'.........................................................24

Взаимодействие полиионов и интерполиэлектролитные

комплексов с отрицательно заряженными липосомами................29

4.1.Состав и строение комплекса поликатион-твердые

лило сомы........................................................................................29

4.2.Состав и строение комплекса поликатион-жидкие

липосомы........................................................................................33

4.3.Механизм взаимодействия поликатионов с липосомами... 38

4.4.Взаимодействие ДНК-содержащих интерполиэлектро-

литных комплексов с липосомами............................................39

Вывода!....................................................................................................43

Список публикаций..............................................................................45

)дписано к печати К.ОА-.ЙЬ

)рмат 60x84 1/16 3 печ. л.

гр. ПО экз. Зак. 66

2,90 уч.-изд.л АО "НЙИГЭЖМ"