Синтез и свойства химерных мембрано-активных пептидов на основе грамицидина А тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Стоилова, Татьяна Борисовна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2008
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ им академиков М М. ШЕМЯКИНА И Ю А ОВЧИННИКОВА
На правах рукописи
СТОИЛОВА Татьяна Борисовна
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ХИМЕРНЫХ МЕМБРАНО-АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ НА ОСНОВЕ ГРАМИЦИДИНА А
Специальность: 02 00.10. - Биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2008
003454331
Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН
Научный руководитель:
Академик РАН Иванов Вадим Тихонович
Официальные оппоненты
Чизмаджев Юрий Александрович
член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией биоэлектрохимии Института физической химии и электрохимии им А Н. Фрумкина РАН
Вольпина Ольга Марковна
доктор химических наук, профессор, заведующая лабораторией синтетических вакцин ИБХ РАН
Ведущая организация:
НИИ физико-химической биологии им А.Н.Белозерского, МГУ им М.В Ломоносова
Защита состоится "03" декабря 2008 года в 4О часов на заседании диссертационного совета Д 002.019 01 при Институте биоорганической химии им академиков М.М Шемякина и Ю А.Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН
Автореферат разослан ".?/" 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук
—. В А Олейников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В последние десятилетия был разработан ряд подходов и методов, позволяющих транспортировать гидрофильные соединения через клеточную мембрану как в исследовательских целях, так и для терапевтического применения, в частности для лечения онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний. Однако методология белковой трансдукции на данный момент разработана в гораздо меньшей степени, чем, например, доставка нуклеиновых кислот. Среди прочих методов широкое распространение получило использование конъюгатов белков с пептидами, способными самопроизвольно пересекать клеточную мембрану и транспортировать присоединенную к ним молекулу. Основной недостаток данной системы заключается в трудоемкости создания подобных конъюгатов, для которого используются преимущественно генно-инженерные подходы. В последние годы была найдена возможность доставки белков в составе нековалентных комплексов с пептидом-транспортером, что позволяет значительно упростить методику белковой трансдукции. Подобное свойство показано для пептидов, обладающих амфипатичной структурой. При этом полагают, что гидрофобная последовательность обладает не только способностью взаимодействовать с мембраной, но также может принимать участие в процессе образования комплексов с белком за счет гидрофобных взаимодействий.
В связи с вышесказанным, актуальной задачей является оптимизация векторов для внутриклеточной доставки белков в составе нековалентных комплексов, направленная на повышение эффективности переноса и снижение токсичности для клеток-мишеней.
Цель работы. Целью данной работы являлись разработка и синтез серии химерных пептидов на основе грамицидина А, обладающих амфипатичной структурой, исследование способности этих пептидов формировать нековалентные комплексы с белками и осуществлять их доставку в эукариотические клетки с сохранением функциональной активности белков, а также изучение каналообразующих свойств полученных производных на модельных липидных бислоях.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены амфипатичные производные грамицидина А, способные транспортировать функционально активные белки через клеточную мембрану в составе нековалентных комплексов.
Простота формирования комплексов пептидного вектора и белка путем смешивания растворов этих двух компонентов позволяет значительно сократить временные и материальные затраты на получение комплексов и сделать метод белковой трансдукции более доступным для широкого использования. Наряду с этим, отсутствие токсичности в диапазоне рабочих концентраций пептида, а также возможность осуществлять эффективную доставку функционально активных белков в различные типы эукариотических клеток открывает широкие перспективы для практического применения химерных пептидов на основе грамицидина А как для исследовательских, так и для терапевтических целей.
Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на-29-м международном Европейском пептидном симпозиуме, Гданьск, Польша, 2006, 2-м международном симпозиуме по мембрано-активным пептидам, Лиссабон, Португалия, 2007 и 20-м международном американском пептидном симпозиуме, Монреаль, Канада, 2007. По материалам работы вышли 4 статьи в рецензируемых журналах.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста и включает введение, литературный обзор, обсуждение результатов, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы, включающий 168 ссылок. В работе содержится 31 рисунок и 7 таблиц
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Синтез химерных пептидов
Из литературных данных известно, что ряд пептидов, способных проникать в клетку (cell-penetrating peptides, СРР) обладает амфипатичной структурой и содержит в своем составе положительно заряженный домен. Амфипатичность характерна также для многих антимикробных пептидов. Помимо структурного сходства между этими двумя группами пептидов, имеет
место также и аналогия механизма их действия, и, следовательно, различие между этими двумя группами можно считать весьма условным.
В данной работе в основу идеи создания химерных пептидных векторов для доставки белков было положено комбинирование мембрано-активной аминокислотной последовательности, обеспечивающей «заякоривание» пептидов в гидрофобных участках мембран, с положительно заряженным фрагментом, необходимым для интернализации и трансдукционной активности. Именно такой принцип был успешно использован при конструировании одного из широко известных СРР, Рер-1. В настоящей работе в качестве гидрофобного домена выбрана аминокислотная последовательность грамицидина А, тогда как роль катионного фрагмента, как и в случае Рер-1, играет сигнал ядерной локализации вируса обезьян SV-40 - гексапептид KKKRKV (NLS). Ожидалось также, что, наряду с мембранной активностью, грамицидин А, содержащий в своем составе 4 остатка триптофана, будет участвовать в формировании нековалентных комплексов с белком за счет гидрофобных взаимодействий, как ранее было показано для Тгр-содержащего пептида Рер-1. Наличие заряженного домена в составе грамицидиновых производных способствовало улучшению растворимости их в водных средах. В табл 1 представлены пептиды, разработанные, синтезированные и исследованные в рамках данной работы.
Природный грамицидин А, использованный для синтеза первого производного (Р1С), был в дальнейшем заменен на синтетический, полученный последовательным наращиванием полипептидной цепи на твердой фазе (пептиды Р4С, Р5С, Р10С, Р11С, N1C, P1N, P3N, РЮС-Flu) Роль спейсера, разделяющего гидрофобную и катионную (в случае N1C -анионную) часть всех полученных пептидов играл конформационно подвижный сегмент GSG, обеспечивающий практически неограниченные возможности взаимной ориентации двух доменов химерных пептидов.
В работе были синтезированы и изучены свойства как производных с формилированной a-аминогруппой (Р1С, Р4С), характерной для природного грамицидина А, так и их аналоги, содержащие свободную (Р11С) и ацетилированную N-концевую аминогруппу (Р5С, Р10С, N1C) С целью изучения влияния N-концевых модификаций на трансдукционную активность
были также синтезированы производные, содержащие прямую и инвертированную последовательность сигнала ядерной локализации, присоединенную по N-концевой аминокислоте грамицидина A (P1N и P3N соответственно).
Таблица 1. Пептиды, синтезированные и изученные в рамках работы
Название Аминокислотная последовательность*
Р1С Form-V GAIAvVvWIWIWIW - ethanolamine-suc-GSGRRRRSQS
Р4С Form- VGAIAvVvWIWIWIWpA GSGPKKKRKVC
Р5С Ac- VGAIAvVvWIWIWIWpA GSGPKKKRKVG
Р10С Ac- VGAIAvVvWIWIWIWpA GSGPKKKRKVC
Р11С NH2-VGAIAvVVWIWI WIW PA GSGPKKKRKVC
N1C Ac- VGAIAvVvWIWIWIWpA GSGEEEESQS
P1N NH2-CPKKKRKVGSG VGAIAvVvWIWIWIWpA
P3N NH2-CVKRKKKPGSG VGAIAvVvWIWIWIWpA
Р10C-FIU Ac- VGAIAvVvWIWIWIW pA-GSGPKKKRKVCK-Flu
* строчными буквами обозначены D-аминокислоты
Для большинства СРР наличие положительно заряженного фрагмента считается необходимым условием обеспечения первичного взаимодействия с отрицательно-заряженной мембраной и накопления пептида на ее поверхности, за которым следует проникновение пептидов в клетку. Для подтверждения этого предположения был синтезирован аналог, содержащий отрицательно-заряженную последовательность, присоединенную по С-концевой аминокислоте грамицидина A (N1C), и исследована его трансдукционная активность.
Известно, что наличие сульфгидрильной группы в последовательности Рер-1 увеличивает его сродство к мембране, а также положительно сказывается на трансдукционной активности, поэтому большинство пептидов, исследованных в данной работе, содержало в своем составе остаток Cys. Производные Р1С и Р5С, не содержащие цистеина, были также синтезированы и изучены.
Кроме того, был получен флуоресцентно-меченный аналог (Р1 ОС-ЯШ) с целью прямого наблюдения за его поведением при взаимодействии с мембраной клетки.
Все пептиды после отщепления от полимера и деблокирования были выделены с помощью ВЭЖХ и охарактеризованы с использованием МАШ1 ТОЯ масс-спектрометрии. Выходы составляли 13-28%, в пересчете на присоединенную к смоле С-концевую аминокислоту, содержание основного пептида в образце после очистки составляло 88-95%.
В качестве примера на рис. 1 приведены результаты хроматографического выделения (А) и анализа выделенного продукта (Б) для производного Р10С.
о 25 50 75 100 1 25 150 175 200 225 i
■ ■■ I " Г ' 1' ' I ■■■!■" ' Г 1 'I ' ' I I " 1
О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 мл
Рис.1. Препаративная (А) и аналитическая (Б) хроматограммы производного Р10С. (А) Пептид элюировали используя линейный градиент этанола в 0,1% водной TFA (от 30 до 90% этанола за 120 мин; колонка Protein С4 250x8 мм, скорость потока составлял 2,5 мл/мин). Объединение фракций, содержавших целевой продукт, проводили по результатам аналитической ВЭЖХ (на рисунке отмечены *) с последующим анализом полученного пептида с помощью аналитической ВЭЖХ (колонка С4 Hi-Pore 250*4,6 мм) в градиенте этанола в 0,1% водной TFA от 0 до 90% за 90 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин (Б) и масс-спектрометрии. Профили элюции зарегистрированы при 226 нм.
Ионофорные свойства химерных пептидов
Одним из наиболее изученных свойств грамицидина А является его каналоформерная активность, при этом даже незначительные модификации пептида могут существенно изменять свойства образуемых каналов. Поэтому
для понимания поведения синтезированных пептидов при взаимодействии их с липидным бислоем было целесообразно исследовать их каналообразующие свойства в стандартной модельной мембранной системе - плоской липидной мембране с использованием как формилированных (Р1С, Р4С), так и ацетилированных (Р10С, Р5С) производных. Кроме того, изучено влияние наличия цистеина на каналообразующие свойства грамицидина. Ионофорную активность химерных пептидов исследовали как на уровне одиночных каналов, так и интегрального тока.
Известно, что N-концевые модификации грамицидина А существенно влияют на его ионофорную активность, тогда как модификация по С-концевой аминокислоте грамицидина незначительно изменяет свойства ионных каналов. Это связано с тем, что канал грамицидина А образуется димером голова к голове. В настоящей работе было показано, что присоединение положительно заряженной аминокислотной последовательности к С-концевому этаноламину грамицидина А (пептид Р1С), как и ожидалось, не приводило к значительному изменению свойств образуемых им каналов (рис 2А). Присутствие в С-концевой последовательности пептида остатка Cys, который обеспечивает возможность образования в окислительных условиях ковалентных димеров, также не приводило к существенному изменению характеристик одиночных каналов. Так, средняя амплитуда одиночного канала Р4С составила примерно 10 пС, а время жизни канала 08 + 0,2 с в
ibi.Jj Ь JIlíJ 'LiLw.ia. ЛШАк^й' ¿чйь'ы^м«! ЫшмУш
I fff'r'PyW'lf'f V J Р W р WJIfTlWPW "fl^W^"" Ч W]
1пА
wJlUMill
Рис.2. Записи тока через плоскую бислойную мембрану в присутствии пептида Р4С (0.1 нМ) А -в восстановительных условиях (30 мкМ DTT), Б - в окислительных условиях (10 мМ Н2О2) при потенциале на мембране 80 мВ Состав среды: 1М KCI, 10mM Tris, 10 тМ MES, рН 7 Мембрана сформирована из раствора дифитаноил-фосфатидилхолина в декане
отсутствие Н202, и соответственно 10 пС и 1,0 с после инкубации с Н202, что сравнимо с данными, полученными для не-модифицированного грами-цидина А в аналогичныхых условиях (рис. 2). Создание окислительных условий не приводило к образованию двойных каналов, ожидаемому при димеризации пептида за счет сшивки С-концов двух мономеров, однако приводило к увеличению частоты образования каналов и, следовательно, росту интегрального тока через мембрану.
Добавление перекиси водорода оказывало значительное стимулирующее действие на интегральный ток, индуцированный Суэ-содержащими аналогами грамицидина А (Р4С и Р10С). В случае грамицидина А и пептида Р5С, лишенных сульфгидрильных групп (рис. ЗА и Б), перекись водорода не влияла на индуцированную проводимость мембран, тогда как добавление 1,4-дитио-Ю-треитола РТТ) снижало стимулирующее действие Н202 на макроскопический ток.
время, с время, с
Рис.3 Влияние Н2О2 (10 мМ, панель А и Б) и 1,4-дитио-01_-треитола (3 мМ, панель В) на ток через плоскую бислойную мембрану, индуцированный грамицидином и его производными (А) кривая 1, пептид Р4С, кривая 2, грамицидин А (Б) Пептид Р10С; на вставке пептид Р5С.
Окислительно-восстановительный потенциал среды также оказывал влияние на ионную селективность каналов, образованных Суэ-содержащими аналогами грамицидина А. Известно, что грамицидин А образует катион-селективные каналы. Аналог Р4С в отсутствие Н202, также обладает этим свойством, что определяется величиной потенциала при нулевом токе (Д\/о), измеренной в присутствии двукратного градиента КС1 (0.2 М КС1 и 0 1 М КС1 с цис- и транс-стороны мембраны), и равного 17,5 мВ. Полученный результат
100 -л^уЛУуУУууМ
41л,
0» 02 время, с
практически совпадает с теоретическим пределом Д\/0 для идеально-селективной мембраны, который следует из уравнения Нернста Л\/0=КТ/Р 1од([К+]1/[К+]2), и равен 17,7 мВ. Добавление перекиси водорода приводило к уменьшению величины ДУ0 с 17,5 мВ до 1,6 мВ, что может указывать на образование неселективных каналов большого размера практически в равной степени пропускающих как катионы калия, так и анионы хлора.
Метод фотодинамической инактивации с использованием три-(сульфо)-
алюмофталоцианина в качестве фотосенсибилизатора был использован для изучения поведения каналов, образованных пептидом Р10С, в окислительных и восстановительных условиях. Метод фотодинамической инактивации основан на повреждении триптофановых остатков, играющих важную роль в поддержании структуры канала, активными формами кислорода, образующимися в присутствии фотосенсибилизаторов под действием света.
На рис. 4 представлена кинетика подавления тока через дифитаноил-фосфатидилхолиновую мембрану,
индуцированного Р10С, в ответ на вспышку света в момент времени 1=0 Уменьшение тока вызвано сдвигом равновесия мономер-димер в сторону диссоциации проводящей димерной формы пептида, вследствие окисления остатков триптофана и выведения из системы части мономеров пептида (рис 4А). Согласно данным, представленным на рис. 4Б, добавление Н202 в буфер
время, с
Рис.4 Кинетика подавления тока через мембрану из
дифитаноилфосфатилхоина, индуцированного Р10С, в ответ на вспышку света в момент времени 1=0 в присутствии три-(сульфо)-алюмофталоцианина, в
восстановительных (А) и окислительных (Б) условиях Сила тока в момент времени 1=0 приблизительно 0,5 мкА Разность потенциала на мембране 30 мВ
приводило к снижению амплитуды фотоинактивации а=(1о-1°°)/1о с 24% до 1,6% и значительному замедлению кинетики подавления тока. При этом время фотоинактивации возросло с 31 мс до 3,1 с. Аналогичный эффект наблюдался в случае каналов, индуцированных формилиро-ванным аналогом Р4С. По-видимому, под действием Н2О2 происходит окисление остатков Суэ в составе пептидов Р10С и Р4С, приводящее к формированию ковалентных димеров. Скорее всего, эти димеры агрегируют с образованием олигомерных ассоциатов, которые характеризуются существенно более медленной кинетикой установления равновесия между проводящим и непроводящим состояниями в силу более стабильной структуры. Тем самым объясняется замедляющее действие Н202 на кинетику фотоинактивации Суэ-содержащих аналогов грамицидина А.
Таким образом, в экспериментах на модельных мембранах было показано, что добавление положительно заряженной последовательности с С-конца грамицидина А практически не влияло на свойства образуемых им одиночных каналов. В окислительных условиях при наличии остатка цистеина в С-концевой последовательности наблюдалась существенная стимуляция каналообразования и изменение ионной селективности каналов. Кроме того, с использованием ряда методов было показано, что под действием пероксида водорода Суэ-содержащие аналоги формировали трансмембранные структуры более стабильные, чем классические грамицидиновые каналы.
Взаимодействие флуоресцентного производного пептида Р10С с мембранами клеток
На модельных мембранах показано встраивание катионных Суэ-содержащих химерных пептидов (в т.ч. производного Р10С) в липидные бислои с образованием проводящих трансмембранных структур, обладающих рядом свойств, не характерных для природного грамицидина А. Перед тем как перейти к изучению трансдукционной активности этих пептидов на эукариотических клетках было изучено взаимодействие аналога Р10С с клеточной мембраной с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.
И
2 мин Б 60 мин
.■м 1 щ S* .^Ai-Vr/ а
фокус у стекла
фокус у поверхности клетки
При инкубации клеток с пептидом РЮС-Flu происходит быстрое (2 мин) встраивание его в мембрану (рис.5А). Сканирование клетки от поверхности стекла до клеточной мембраны показало, что пептид не проникает б цитоплазму, а остается связанным с мембраной (рис.5Б), причем увеличение времени инкубации пептида с клетками (до 1 часа) не приводит к изменению его локализации (рис.5А). При этом распределение пептида на мембране не было равномерным. На поверхности мембраны наблюдались яркие точки, указывающие на образование локальных скоплений пептида.
Эти данные согласуются с результатами, полученными на модельных мембранах, а также с высказанным выше
предположением о возможности формирования химерными Cys-содержащими пептидами олигомерных структур при встраивании их в мембрану, подобно катионным СРР Рер-1 и Tat.
Трансдукционная активность флуоресцентного производного РЮС-Flu, исследованного в этой главе, была также изучена (рис.6).
Доставка белков в клетки с помощью химерных пептидов
Основная часть работы заключалась в изучении возможности транспорта белков с использованием полученных производных. План работы включал установление факта такого транспорта на ряде модельных белков:
Рис.5. Взаимодействие положительно заряженного производного грамицидина А с мембранами клеток Не1_а. Представлены наложения изображений в проходящем свете (серый) и флуоресцентных изображений пептида Р1 ОС-Пи (зеленый) (концентрация пептида 7 мкМ). (А) Кинетика взаимодействия: изображения, полученные через 2 минуты и 60 минут инкубации с клетками. (Б) Распределение пептида Р10С (7 мкМ) в нескольких горизонтальных сечениях на различной на высоте после 10 мин инкубации с клетками.
Р-галактозидазе (P-Gal), пероксидазе хрена, родаминовом производном сывороточного альбумина быка (Rh-BSA) и зеленом флуоресцентном белке (GFP). Кроме того, было исследовано влияние различных модификаций на трансдукционную способность пептидов и выявлен наиболее активный аналог.
Набор полученных пептидов позволил изучить влияние на трансдукцию следующих факторов:
1) наличие положительно заряженного домена пептиды Р10С, N1C
2) наличие сульфгидрильной группы пептиды Р10С, Р5С
3) N-концевые модификации пептиды Р10С, Р11С, Р4С, P1N
4) инвертирование последовательности NLS пептиды P1N, P3N
На рис.6 представлены результаты доставки Р-галактозидазы с помощью положительно (Р10С, Р5С, Р10С, Р11С, P1N, P3N) и отрицательно (N1C) заряженных аналогов грамицидина А. Отрицательно заряженный аналог грамицидина (N1C) не проявлял трансдукционной активности (рис.бА), тогда как аналоги, содержащие в составе положительно заряженный фрагмент (Р5С, Р10С, Р11С, P1N, P3N), транспортировали P-Gal через мембрану (рис.бБ, В и Г). При этом как катионная последовательность NLS, так и грамицидин А сами по себе активными не были (данные не приведены). Формилированный положительно заряженный аналог Р4С оказался токсичным для клеток даже при низких концентрациях, поэтому он не был использован для дальнейших исследований.
Сопоставление результатов количественного анализа эффективности трансдукции, индуцированной положительно заряженными химерными пептидами, показало, что аналоги, содержащие в своем составе С-концевой остаток Cys, были более эффективными по сравнению с производным Р5С, лишенным цистеина. Так, в концентрационном диапазоне до 0,8 мкМ Р5С не был способен переносить белок через мембрану, тогда как Р10С в этих условиях проявлял заметную активность (рис.бБ). Мы предположили, что за счет димеризации Cys-содержащие аналоги более эффективно взаимодействуют с молекулой белка и, следовательно, способны транспортировать его через мембрану при более низких концентрациях пептида.
А РЮС
Г • г **
Í л«*
N1C
^ *.; II * -
.«AMI*
В
[пептид], мкМ [пептид], мкМ [пептид], мкМ
Рис.6. Доставка p-Gal амфипатичными производными грамицидина А в клетки HeLa. Комплексы, сформированные путем смешивания раствора [3—Gal (О.ОЗмг/мл) с пептидами, взятыми в различных концентрациях (от 0.082 до 10.5 мкМ), инкубировали с клетками в течение 2 часов при температуре 37°С. (А) Микрофотографии в проходящем свете, демонстрирующие результат окрашивания фиксированных клеток субстратом X-Gal в случае использования РЮС и N1C (концентрация пептидов 2.65 мкМ) для доставки p-Gal в клетки. (Б-Г) Количественная оценка интернализованного белка в клеточных пизатах и сравнение эффективности трансдукции с помощью пептидов РЮС, Р5С, РЮС-Flu, Р11С, P1N и P3N. В качестве субстрата был использован о-нитрофенип-[3-0-галактозид (oNPG) (4 мг/мл). Оптическая плотность была измерена при длине волны 405 нм после 30 мин инкубации с субстратом.
На этом же графике (рис.бБ) приведены результаты трансдукции (3-Gal, индуцированной флуоресцентно-меченным производным РЮС-Flu. Сравнение эффективности переноса белка с помощью РЮС и его флуоресцентного производного указывает на то, что введение метки практически не повлияло на трансдукционную активность пептида.
N-концевые модификации последовательности грамицидина А, а также инвертирование последовательности NLS не влияли на способность транспортировать белки. Таким образом, определяющими условиями для эффективной трансдукции в данном случае являлось наличие в составе химерного пептида положительно заряженной последовательности, тогда как относительное расположение грамицидиновой и заряженной частей, а также специфичность к определенному рецептору не имели существенного значения. Основываясь на
полученных данных, пептид Р10С был выбран для дальнейшего, более детального исследования как один из наиболее активных.
При сравнении эффективности доставки р-Са! с помощью Р10С на различных эукариотических клеточных линиях 1-929, Эр 2/0, Ы1Н ЗТЗ, Не1_а и СОЭ-1 было показано, что пептид проявлял близкую эффективность вне зависимости от типа клеток. При этом для всех исследованных клеточных линий максимальная трансдукция наблюдалась примерно в одном и том же
диапазоне концентраций Р10С: от
соотношение РЮС/пероксидаза 1:45 (М/М)
Б
0.9
0.0
п 0.7
= □.Б
0,5
и 0,4
£ 0,3
X 0,2
= 0,1
ас 0
1,3 мкМ до 3,1 мкМ.
Сравнение с описанным ранее пептидным вектором Рер-1 показало, что в случае использования Рер-1
эффективная белковая
трансдукция наблюдалась при соотношении пептид/белок 400:1, тогда как максимальная активность Р10С проявляется при
1 10 100 1000 соотношем|е Р ЮС белок. МЫ
Рис.7. Доставка пероксидазы с помощью пептида Р10С в клетки Не1.а. (А) Микрофотографии в проходящем свете, демонстрирующие окрашивание
фиксированных клеток субстратом диаминобензидин (Б) Сравнение эффективности переноса пероксидазы с помощью пептидов Р10С (черная кривая) и Рер-1 (серая кривая). В качестве субстрата был использован 3,3',5,5'-
тетраметилбензидин. Оптическая плотность измерена при 450 нм после 30 мин иню/бации с субстоатом.
более низком (70:1), что его как более вектор, результат был на примере
значительно соотношении характеризует эффективный Аналогичный получен и пероксидазы хрена (рис.7).
Микрофотографии, представ-ленные на рис. 8, демонстрируют распределение флуоресцентных белков КИ-ВЭА и СРР в клетках Не1_а через 2 часа инкубации с комплексами Р1 ОС/белок. Во избежание перехода белка, связанного с
мембраной, в цитоплазму и ядро при фиксации клеток и получения ложно
положительного результата наблюдения проводились на клетках без предварительной их фиксации. В экспериментах с использованием GFP было обнаружено, что часть клеток обладала интенсивной
флуоресценцией. Однако,
совмещение флуоресцентных микрофотографий с
изображениями, полученными в проходящем свете, показало, что наиболее интенсивный сигнал
Рис.8. Трансдукция белков Rh-BSA и GFP с флуоресценции был
помощью Р10С и их распределение в ассоциирован с клеточной клетках HeLa. После 2 часов инкубации с _
комплексами пептид/белок (соотношение мембраной и, очевидно, исходил
16:1) клетки интенсивно промывали от GFP, связанного с её фосфатным буфером и наблюдали
распределение белка в клетке с помощью поверхностью. В клетках же,
флуоресцентной микроскопии. обладающих менее выраженной
флуоресценцией, белок аналогично Rh-BSA распределялся равномерно
(рис.8). Дополнительное подтверждение внутриклеточной локализации белка
на примере GFP было получено с использованием сканирующей
конфокальной лазерной микроскопии.
Таким образом, была показана способность химерных пептидов доставлять функционально активные белки внутрь эукариотических клеток в составе нековалентных комплексов. Установлено, что только аналоги, содержащие положительно заряженную последовательность, обладают трансдукционной активностью, при этом инвертирование последовательности NLS не влияет на эффективность переноса. N-концевые модификации грамицидина А также не сказывались на способности транспортировать
Rh-BSA
эражение в проходящем свете GFP
флуоресценция
изображение в проходящем свете
флуоресценция
p-Gal 1:1 1:4 1:5 1:7 1:10 1:15 1:20 1:50
белки. Было показано положительное влияние наличия в последовательности остатков цистеина на эффективность трансдукции. Ранее аналогичное влияние было установлено для Рер-1. На основании полученных результатов был выбран один их наиболее активных аналогов (Р10С), для которого подобраны оптимальные условия трансдукции на различных клеточных линиях, а также показано его преимущество по сравнению с Рер-1.
Образование комплексов с белками
Естественно предположить, что одним из этапов переноса белков было комплексообразование. Мы исследовали такую возможность двумя методами
на примере Р10С. В качестве А модельных белков были
использованы р-галактозидаза, GFP и BSA, для которых показана внутриклеточная доставка.
Методом изучения
подвижности в геле было показано, что при смешивании раствора пептида Р10С с раствором белка происходило образование крупных агрегатов, которые задерживались гелем, тогда как свободный белок мигрировал в геле (рис.ЭА). С увеличением соотношения
пептид/белок от 1 до 20 доля последнего в растворе уменьшалась вплоть до полного исчезновения при 50-кратном избытке Р10С, что указывает на то, что весь белок находится в составе комплексов с пептидом
20 10 60 соотношение РЮСф-Gal, (М/М)
Рис.9. Контроль образования комплексов Р1 ОС-белок с помощью неденатурирующего электрофореза. Комплексы формировали путём смешивания 5,2 мкМ раствора 3-Gal с растворами пептида, взятого в соотношениях от 1:1 до 1:70, инкубировали 30 минут и анализировали с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриамидном геле. (А) Электрофореграмма, демонстрирующая
миграцию свободного белка в геле. (Б) Количественная оценка доли свободного белка в растворе, определенная по интенсивности полосы, соответствующей (3-Gal.
(рис. 9А и Б). Соотношение Р1 ОС/белок, необходимое для полного связывания последнего, оказалось близким для всех исследованных белков - (3-гапактозидазы, GFP, и BSA. Во всех случаях с увеличением соотношения пептид/белок полное связывание достигалось при 25-кратном избытке пептида для BSA и 50-кратном - для P-Gal и GFP.
Сравнение способности ряда производных грамицидина А образовывать нековалентные комплексы с р-галактозидазой показало, что такие N-концевые модификации, как перенос положительно-заряженной последовательности с С-концевого на N-концевой аминокислотный остаток грамицидина A (P3N), как и удаление N-концевой ацетильной группы (Р11С), как и ожидалось, не приводило к изменению способности пептида связывать белок, тогда как удаление остатка цистеина (Р5С) приводило к некоторому ее снижению. Полное связывание происходило только при 75-кратном избытке Р5С по отношению к белку. Очевидно, в случае Cys-содержащих производных происходит образование димерных структур за счёт дисульфидных связей, что позволяет пептиду более эффективно связывать белок.
Сравнение данных по трансдукции (рис.6) и по комлексообразованию (рис.9) показало, что при 40-кратном избытке пептида в случае Р10С, Р11С и P3N весь белок находится в составе комплексов с пептидом (рис.9), что соответствует максимуму на кривой эффективности трансдукции (рис.6, концентрация пептида 2мкМ). Тогда как при взаимодействии с Р5С в этом соотношении лишь 74% белка находится в связанном состоянии и эффективность трансдукции в этом диапазоне тоже значительно ниже по сравнению с Р10С. Найденная корреляция подтверждает участие комплексообразования в процессе трансдукции.
Оценку функциональной активности р-галактозидазы при взаимодействии ее с Р10С проводили по измерению количества продукта ферментативной реакции с oNPG после инкубации белка с пептидом в различных соотношениях (рис.10). Было показано, что белок сохраняет свою функциональную активность в интервале соотношений от 1:1 до 1:150. При достижении 300-кратного избытка пептида по отношению к белку наблюдалось некоторое падение ферментативной активности, которое
достигало 90% при увеличении соотношения до 30000. что, по-видимому, связано с экранированием активных центров фермента пептидом.
Важно отметить, что в интервале соотношений
пептид/белок от 10 до 100, при которых наблюдается
максимальная трансдукция (рис.6), ферментативная активность смеси не отличалась от активности свободного белка (рис.10)
Таким образом, была показана способность одного из наиболее активных химерных пептидов (Р10С) образовывать нековалентные комплексы с белками Сравнение данных по трансдукции с результатами по комплексообразованию указывает на корреляцию между этими процессами. Кроме того, в пределах эффективных соотношений пептид/белок ферментативная активность ß-Gal соответствовала активности свободного белка, что говорит о возможности доставки белка в клетку без потери его функциональных свойств.
Цитотоксическое действие химерных пептидов
Для практического использования пептидов в качестве вектора для доставки макромолекул m vivo необходимо учитывать возможное токсическое действие на клетки, обусловленное нарушением целостности мембран или другими механизмами. Цитотоксичность была изучена с использованием двух методик: МТТ теста и по выходу фермента лактатдегидрогеназы (LDH) из клетки МТТ тест основан на измерении оптической плотности МТТ-формазана, образующегося в результате внутриклеточного восстановления 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолиум бромида (МТТ) с
03
08
3 07
m
06
о 05
* 04
с
2 03
02
01
0
1 10 100 1000 10000 10000 соошошенме пепгцц белоц <м М)
Рис.10. Изменение ферментативной активности Р-галактозидазы при
взаимодействии ее с пептидом РЮС Пептид Р10С добавляли к раствору р-галактозидазы в соотношениях от 11 до 1:30000 и инкубировали в течение 40 минут при 37оС. Ферментативную активность оценивали по выходу продукта ферментативной реакции с оЫРСЗ при 405 нм
О 0,36 0.7 1.4 2,9 5,7 11.5 23 46 {пептид], мкМ
Рис.11. Сравнение цитотоксического действия на клетки Не1_а
формилированного (серый цвет) и ацетилированного (черный цвет) производных грамицидина А с использованием метода МТТ. Результаты представлены в виде средних значений с указанием стандартного отклонения.
0,36 1,8 Э 45
[Р10С], мкМ
Рис.12. Снижение токсического действия на клетки, вызванного пептидом Р10С, при добавлении белков. Раствор пептида в различных концентрациях (0,36-45мкМ) добавляли к клеткам и инкубировали в течение 10 мин. Раствор белка (0,1 мкМ) добавляли к клеткам после удаления пептида. Количество LDH измеряли через 2 часа. Результаты представлены в виде средних значений с указанием стандартного отклонения.
участием МАОН и ЫАйРН и, следовательно, позволяет
оценить жизнеспособность клеток [Вегпс1де М\/, 1993]. Измерение выхода внутриклеточного
фермента лактатдегидрогеназы позволяет судить о целостности клеточной мембраны.
Исследование цитотоксического действия пептида Р10С показало отсутствие токсического эффекта в интервале 0-10 мкМ (рис.11 черная гистограмма), что полностью перекрывало интервал концентраций, обеспечивающих эффективную белковую
трансдукцию (1,5 - 6 мкМ - рис.6).
В экспериментах по трансдукции было установлено, что Р4С, отличающийся от Р10С только ГМ-концевой защитной группой, был высоко токсичным для клеток. Сравнение цитотоксического
действия этих двух пептидов показало, что последний был в 4 раза менее токсичен для клеток (рис.11). Этот эффект, вероятно, связан с повышенной
каналообразующей активностью формилированного производного грамицидина А по отношению к ацетилированному производному. Поэтому формили-рованные
производные грамицидина не могут быть использованы в качестве векторов для доставки белков в клетки
Нарушение целостности клеточной мембраны приводит к выходу из цитоплазмы лактатдегидрогеназы, количество которой может быть измерено. В данной работе этот метод был использован для исследования изменения цитотоксического эффекта пептида Р10С при добавлении белков. Данные, приведенные на рис. 12, демонстрируют снижение токсического эффекта, вызываемого Р10С, при добавлении белков (p-Gal и BSA) к клеткам, после инкубации их с пептидом. Было предположено, что наблюдаемое снижение цитотоксичности Р10С может быть связано с взаимодействием белков с пептидом, интегрированным в мембрану клетки, и пространственным экранированием некоторой части образующихся ионопроводящих каналов, вызывающих гибель клетки.
Таким образом, было показано отсутствие цитотоксичности для пептида Р10С в диапазоне концентраций, обеспечивающих эффективную трансдукцию.
ВЫВОДЫ:
1. Синтезирована серия новых химерных пептидов на основе антибиотика грамицидина А и сигнала ядерной локализации вируса в\/40.
2. Показана способность полученных пептидов образовывать проводящие структуры в модельных липидных бислоях.
3. Показана способность химерных пептидов образовывать комплексы с различными белками за счет нековалентных взаимодействий. На примере р-галактозидазы продемонстрировано сохранение функциональной (ферментативной) активности белка при образовании нековалентных комплексов с пептидом.
4. На ряде белков показана способность химерных пептидов доставлять белки внутрь эукариотических клеток в составе нековалентных комплексов, с сохранением при этом функциональной активности белков.
5. Исследовано влияние на трансдукцию таких факторов, как наличие в последовательности пептида положительно заряженного домена, сульфгидрильной группы, Ы-концевых модификаций, а также инвертирование последовательности ЫЬЭ. Для одного из наиболее активных пептидов полученной серии подобраны оптимальные условия трансдукции на различных линиях эукариотических клеток, показано отсутствие токсичности в диапазоне рабочих концентраций, а также показана его более высокая эффективность по сравнению с описанным в литературе пептидным вектором Рер-1.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Antonenko Y.N., Stoilova Т.В., Kovalchuk S.I., Egorova N.S., Pashkovskaya A.A., Sobko A.A., Kotova E.A., Sychev S.V., Surovoy A.Y. Large unselective pore in lipid bilayer membrane formed by positively charged peptides containing a sequence of gramicidin A. FEBS Lett. 2005, v. 579, p. 5247-5252.
2. Antonenko Y N , Stoilova T.B., Kovalchuk S I., Egorova N.S., Pashkovskaya A.A., Sobko A.A., Kotova E.A., Surovoy A.Y. Redox-regulated ion channel activity of a cysteine-containing gramicidin A analogue. Biochim Biophys Acta. 2006 v. 1758, p. 493-498
3. Стоилова Т.Е., Дуцева E.A., Пашковская А А., Сычев С В., Ковальчук С.И., Собко А.А, Котова Е.А., Антоненко Ю.Н , Суровой А.Ю., Иванов В.Т. Различные типы ионных каналов, индуцированные в липидных мембранах производными грамицидина А, несущими на С-конце катионную последовательность. Биоорганическая химия, 2007, т. 33, с. 511-519.
4. Stoilova Т.В , Kovalchuk S.I, Egorova N S., Surovoy A.Y., Ivanov V.T. Gramicidin A-based peptide vector for intracellular protein delivery Biochim Biophys Acta 2008, v. 1778, p 2026-31.
Тезисы докладов:
1. Stoilova Т.В., Kovalchuk S.I., Egorova N S., Antonenko Y N , Surovoy A.Y. A novel peptide vector for efficient intracellular delivery of proteins. 29th European peptide symposium September 3-8, 2006, Gdansk, Poland.
2. Stoilova T.B., Kovalchuk S.I., Egorova N S , Antonenko Y.N., Surovoy A.Y., Ivanov V.T. Cationic motif linked to gramicidin A induces protein delivery into cells. 2nd workshop on Biophysics of membrane-active peptides. April 1-4, 2007, Lisbon, Portugal.
3. Kovalchuk S I., Kotova E A, Stoilova T.B., Sychev S.V., Egorova N.S., Surovoy AY., Antonenko Y.N., Ivanov V.T. Positively charged gramicidin A based peptides form two types of membrane channels. 20th American peptide symposium, June 26-30, 2007, Montreal, Canada.
Заказ №275/10/08 Подписано в печать 29 10 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,5
/ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ^Ь1 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru
Список сокращений
Введение
Часть I. Литературный обзор
Глава 1. Грамицидин А
1.1 Биосинтез и биологическая роль грамицидина А
1.2 Пространственная структура грамицидина А
1.2.1 Многообразие структур грамицидина А в растворах
1.2.2 Структура грамицидина А в фосфолипидной мембране
1.3 Ионофорные свойства грамицидина А
1.4 Применение грамицидина А в качестве антибиотика
Глава 2. Пептиды, способные пересекать плазматическую мембрану
2.1 Краткая характеристика основных известных СРР
2.1.1 HIV-1 Tat
2.1.2 Пенетратин
2.1.3 HSV-VP
2.1.4 Транспортан
2.1.5 Поликатионные пептиды и другие СРР
2.1.6 Антимикробные пептиды
2.2 Перспективы практического использования СРР
2.2.1 Лечение онкологических заболеваний
2.2.2 Лечение сердечно-сосудистых заболеваний
2.3 Механизм проникновения пептидов в клетку 35 Часть II. Результаты и обсуждения.
Глава 3. Синтез химерных пептидов
Глава 4. Ионофорные свойства химерных пептидов.
4.1 Образование одиночных каналов
4.2 Макроскопический ток через мембрану
4.3 Исследование свойств ионных каналов, образованных пептидами Р4С и PI ОС, методом фотодинамической инактивации
Глава 5. Взаимодействие флуоресцентного производного пептида Р1 ОС с мембранами клеток
Глава 6. Доставка белков в клетки с помощью химерных пептидов
6.1 Трансдукция (З-галактозидазы
6.2 Трансдукция пероксидазы хрена
6.3 Трансдукция флуоресцентных белков
Глава 7. Образование комплексов с белками
7.1 Метод электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях
7.2 Изменение ферментативной активности (3-галактозидазы
Глава 8. Цитотоксическое действие химерных пептидов
Глава 9. Материалы и методы
9.1 Материалы
9.2 Методы
9.2.1. Синтез пептидов
9.2.2. Ионная проводимость бислойных мембран 88 9.2.3 Клетки и клеточные культуры
9.2.4. Трансдукция белков
9.2.5. Взаимодействие РЮС-Пи с клеточной мембраной
9.2.6 Цитотоксический эффект
9.2.7 Связывание пептидов с белками 96 Выводы 97 Литература
Список сокращений
БЛМ - бислойная липидная мембрана
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография
ДС1 -параллельная левозакрученная двойная спираль с симметричным выравниванием мономеров
ДС2 - параллельная левозакрученная двойная спираль с несимметричным выравниванием мономеров
ДСЗ - антипараллельная левозакрученная двойная спираль
ДС4 - параллельная правозакрученная двойная спираль
ДМСО - диметисульфоксид
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИК - инфракрасная спектроскопия
КД - круговой дихроизм
РНК - рибонуклеиновая кислота
СД - спиральный димер
ЯМР - спектроскопия ядерного магнитного резонанса ß-Gal - ß-галактозидаза
BSA - бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin)
СРР - cell penetrating peptide (пептид, способный проникать в клетку)
СМЕ - клатрин-опосредованный эндоцитоз (clathrin-mediated endocytosis)
DAB - диаминобензидин
DCM - дихлорметан
DIC - 1чГ,М-диизопропил-карбодиимид
DIPEA - N-этилдиизопропиламин
DMEM - питательная среда (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)
DMF - диметилформамид
DMSO - диметилсульфоксид
DTT - дитиотреитол
EtOH - этанол
GFP - зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein) FBS - фетальная бычья сыворотка (fetal bovine serum) Fmoc - флуоренилметоксикарбонил
HIV - вирус иммунодефицита человека (human immunodeficiency virus)
HOBt -1 -гидрокси-бензтриазол
HRP - пероксидаза хрена (horse radish peroxidase)
HSV - вирус герпеса (herpes simplex virus)
LDH - лактатдегидрогеназа
MTT - (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолиум бромид) Mtt - 4-метилтритил
NLS - сигнал ядерной локализации (nuclear localization sequence)
THF - тетрагидрофуран
TFA - трифторуксусная кислота
ТМВ - 3,3\5,5'-тетраметилбензидин
X-Gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-р-0-галакгозид
Гидрофобная природа мембран делает их непроницаемыми для большинства гидрофильных молекул в отсутствие дополнительных внешних факторов. В последние десятилетия был разработан ряд подходов и методов, таких как микроинъекция, электр опорация, липосомальные и вирусные системы доставки, позволяющих транспортировать подобные соединения через клеточную мембрану, как в исследовательских целях, так и для терапевтического применения. Однако на данный момент методология белковой трансдукции разработана в гораздо меньшей степени, чем, например, доставка нуклеиновых кислот. Среди прочих методов получило широкое распространение ковалентное присоединение белков к пептидам, способным самопроизвольно пересекать клеточную мембрану, в основном с использованием генно-инженерных подходов. Основным недостатком этой системы является сложность получения подобных конъюгатов. В последние годы была найдена возможность доставки белков в составе нековалентных комплексов с пептидами-транспортерами, что значительно упрощает методику белковой трансдукции. Подобное свойство показано для пептидов, обладающих амфипатичной структурой. При этом полагают, что гидрофобная последовательность обладает не только способностью взаимодействовать с мембраной, но также может принимать участие в процессе образования комплексов с белком за счет гидрофобных взаимодействий.
В связи с вышесказанным, актуальной задачей является оптимизация векторов для внутриклеточной доставки белков в составе нековалентных комплексов, направленная на повышение эффективности переноса и снижения токсичности для клеток-мишеней.
Целью данной работы являлся синтез и исследование свойств серии пептидов на основе грамицидина А и сигнала ядерной локализации вируса обезьян 8У40. Предполагалось, что полученные пептиды, обладающие амфипатичной структурой, будут способны доставлять функционально-активные белки в эукариотические клетки в составе нековалентных комплексов. Кроме того, предполагалось исследовать каналообразующие свойства полученных производных на модельных липидных бислоях.
Таким образом, первой задачей данной работы являлся синтез серии химерных пептидов. Грамицидиновая последовательность была выбрана в качестве гидрофобного домена в силу ее высокого сродства к мембране. Кроме того, предполагалось, участие грамицидинового фрагмента в образовании нековалентных комплексов с белками засчет гидрофобных взаимодействий [1]. Вторым компонентом полученных производных был положительно заряженный пептидный сегмент с аминокислотной последовательностью сигнала ядерной локализации вируса SV40 (NLS SV-40), присоединенный как по N-, так и по С-концу. Высокое содержание основных аминокислот в составе NLS SV-40 предположительно способствует первоначальному взаимдоействию пептида с клеточной мембраной и накоплению его на поверхности бислоя, что ранее было показано как для антимикробного пептида меллитина, так и для пептидов, способных проникать в клетку (cell penetrating peptide, СРР), пенетратина и Рер-1 [1-3]. Кроме того, не исключено участие положительно заряженной последовательности в процессе комплексообразования с белками за счет ионных взаимодействий. Наряду с катионными производными был получен анионный аналог, а также производные с модифицированным N-концом последовательности грамицидина А с целью изучения влияния подобных изменений на способность транспортировать белки в клетку. Для изучения взаимодействия пептида с клеточной мембраной был синтезирован флуоресцентно-меченный положительно заряженный аналог.
Во второй части были исследованы инофорные свойства новых производных грамицидина А и формирование положительно заряженными Cys-содержащими производными олигомерных трансмембранных проводящих структур, отличающихся от классических димеров голова-к-голове, характерных для природного грамицидина А.
В заключительной части была изучена способность полученных аналогов транспортировать функционально активные белки через клеточную мембрану. В качестве модельных белков были использованы как флуоресцентные (GFP, родамин-меченный BSA), так и белки, обладающие ферментативной активностью (р-галактозидаза, пероксидаза). На основе количественной оценки трансдукции р-галактозидазы из всего ряда производных грамицидина А был выбран один из наиболее активных аналогов (Р10С) и проведено его сравнение с известным из литературных данных пептидом Рер-1. Был также исследован токсический эффект, оказываемый на клетки несколькими химерными пептидами и показано, что Р10С нетоксичен в интервале концентраций, применяемых для трансмембранного переноса белков. Для наиболее активных аналогов было исследовано также взаимодействие пептид/белок, приводящее к комплексообразованию.
Часть /. Литературный обзор Глава 1. Грамицидин А
Выводы
1) Синтезирована серия химерных пептидов на основе антибиотика грамицидина А и сигнала ядерной локализации вируса БУ40.
2) Показана способность полученных пептидов образовывать проводящие структуры в модельных липидных бислоях.
3) Показана способность химерных пептидов образовывать комплексы с различными белками за счет нековалентных взаимодействий. На примере белка р-галактозидазы продемонстрировано сохранение функциональной (ферментативной) активности белка при образовании нековалентных комплексов с пептидом.
4) На ряде белков показана способность химерных пептидов доставлять белки внутрь эукариотических клеток в составе нековалентных комплексов, с сохранением при этом функциональной активности белков.
5) Исследовано влияние на трансдукцию таких факторов, как наличие в последовательности пептида положительно заряженного домена, сульфгидрильной группы, И-концевых модификаций, а также инвертирование последовательности N1^. Для одного из наиболее активных пептидов полученной серии подобраны оптимальные условия трансдукции на различных линиях эукариотических клеток, показано отсутствие токсичности в диапазоне рабочих концентраций, а также показана его более высокая эффективность по сравнению с описанным в литературе пептидным вектором Рер-1.
1. Weller, K., Lauber, S., Lerch, M., Renaud, A., Merkle, H.P., Zerbe, O. (2005) Biophysical and biological studies of end-group-modified derivatives of Pep-1. Biochemistry. 44, 15799-15811.
2. Mozsolits, H., Wirth, H.J., Werkmeister, J., Aquilar, M.I. (2001) Analysis of antimicrobial peptide interactions with hybrid bylayer membrane systems using surface plasmon resonance, Biochim. Biophys. Acta. 1512, 64-76.
3. Wallace, B.A. (1990) Gramicidin channels and pores. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 127-157.
4. Myers, V.B., Haydon, D.A. (1972) Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A. II. The ion selectivity. Biochim. Biophys. Acta. 274, 313-322.
5. Doebler, J.A. (1999) Gramicidin toxicity in NG108-15 cells: protective effects of acetamidine and guanidine. Cell Biology and Toxicology. 15, 279-289.
6. Mukherjee, P.K., Paulus, H. (1977) Biological function of gramicidin: studies on gramicidin-negative mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 780-784.
7. Sarkar, N., Langley, D., Paulus, H. (1977) Biological function of gramicidin: Selective inhibition of RNA polymerase. PNAS. 74, 1478-1482.
8. Veatch, W.R., Fossel, E.T., Blout, E.R. (1974) The Conformation of Gramicidin A. Biochemistry.13, 5249-5256.
9. Duax, W.L., Pletnev, V., Burkhart, B. M. (2003) Mechanism of ion transport and gating in gramicidin nanotubes. J.Mol.Struc. 647, 97-111.
10. Veatch, W. R., Blout, E.R. (1974) The aggregation of gramicidin A in solution. Biochemistry. 13, 5257-5263.
11. Wallace, B.A. (1986) Structure of Gramicidin A. Biophys. J. 49, 295-306.
12. Mondal, S., Ghosh, S. (2001) Gramicidin A and its complexes with Cs+ and T1+ ions in organic solvents A study by steady state and time resolved emission spectroscopy. J.Photochem. Photobiol. B. 60, 12-24.
13. Fossel, E.T., Veatch, W.R., Ovchinnikov, Y.A., Blout, E.R. (1974) A 13C Nuclear Magnetic Resonance study of gramicidin A in monomer and Dimer Forms. Biochemistry. 13, 5264-5275.
14. Galbraith, T.P., Wallace, B.A. (1998) Phospholipid chain length alters the equilibrium between pore and channel forms of gramicidin. Faraday Discuss. Ill, 159-164.
15. Braco, L., Abad, C., Campos, A., Figueruelo, J.E. (1986) Time-Dependent monomerization of gramicidin A, enhanced by phosphatidylcholine in non-polar solvents. A HPLC and spectro-fluorometric study. J.Chromatogr. 353,181-192.
16. Salom, D., Abad, C (1996) Chromatographic purification and characterization of the synthetic tryptophan-substituted gramicidin A analogs. J. Chromatogr. A. 725,315-322.
17. Chen, Y., Wallace, B.A. (1997) The effects of calcium ions on double helical forms of gramicidin. Eur.Biophys.J. 26, 299-306.
18. Nekrasov, A.N., Stepanov, A.V., Timofeev, V.P. (1995) The features of the spatial structure of the gramicidin A-cesium complex. FEBS Lett. 371, 35-38.
19. Sychev, S.V., Sukhanov, S.V., Barsukov, L.I., Ivanov, V.T. (1996) Structural
20. Polymorphism of Gramicidin A Channels: Ion Conductivity and Spectral
21. Studies. J.Pept.Sci. 2, 141-156.
22. Burkhart, B.M., Li, N., Langs, D.A., Pangborn, W.A., Duax, W.L. (1998) The conducting form of gramicidin A is a right-handed double-straned double helix. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 12950-12955.
23. Pascal SM, Cross TA. (1992) Structure of an isolated gramicidin A double helical species by high-resolution nuclear magnetic resonance. J Mol Biol. 226, 1101-1109.
24. Pascal SM, Cross TA. (1993) High-resolution structure and dynamic implications for a double-helical gramicidin A conformer. J Biomol NMR. 3, 495-513.
25. Urry, D.W. (1971) The gramicidin A transmembrane channel: a proposed <L,D) helix. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 68, 672-676.
26. Arseniev, A.S., Barsukov, I.L., Bystrov, V.F., Lomize, A.L., Ovchinnikov Yu.A. (1985) H-NMR study of gramicidin A transmembrane ion channel. FEBS Lett. 186, 168-174.
27. Ketchem, R.R., Hu, W., Cross, T.A. (1993) High-resolution conformation of gramicidin A in a lipid bilayer by solid state NMR. Science. 261, 1457-1460.
28. Nachliel, E., Gutman, M., Even Zohar, L. (1995) Time resolved measurements of a single proton diffusing in the Gramicidin A channel. Solid State Ionics. 77, 79-83.
29. Suchyna, T.M., Tape, S.E., Koeppe, R.E., Andersen, O.S., Sachs, F., Gottlieb, P.A. (2004) Bilayer-dependent inhibition of mechanosensitive channels by neuroactive peptide enantiomers. Nature. 430, 235-240.
30. Sychev, S.V., Barsukov, L.I., Ivanov, V.T. (1993) The double 7i7i5,6 helix of gramicidin A predominates in unsaturated lipid membranes. Eur Biophys J. 22, 279-288.
31. Kota, Z., Pali, T., Marsh, D. (2004) Orientation and lipid-peptide interactions of gramicidin A in lipid membranes: polarized attenuated total reflection infrared spectroscopy and spin-label electron spin resonance. Biophys. J. 86, 1521-1531.
32. Greathouse, D.V., Hinton, J.F., Kim, K.S., Koeppe, R.E. (1994) II Gramicidin A/Short-chain phospholipids dispersions: chain length dependence of gramicidin conformation and lipid organization. Biochemistry. 33, 4291-4299.
33. Salom, D., Perez-Paya, E., Pascal, J., Abad C. (1998) Environment- and sequence-dependent modulation of the double-stranded to single-stranded confonnational transition of gramicidin A in membranes. Biochemistry. 37, 14279-14291.
34. Killian, J. A., de Kruijff, B. (1985) Thermodynamic, motional, and structural aspects of gramicidin-induced hexagonal HII phase formation in phosphatidyletanolamine. Biochemistry. 24, 7881-7890.
35. Killian, J.A., Timmermans, J.W., Keur, S., de Kruijff, B. (1985) The tryptophans of gramicidin are essential for the lipid structure modulating effect of the peptide. Biochim Biophys Acta. 820, 154-156.
36. Hladky, S.B., Haydon, D.A. (1972) Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A. I. Studies of the unit conductance channel.Biochim Biophys Acta. 274, 294-312.
37. Woolley, G.A., Wallace, B.A. (1992) Model ion channels: gramicidin and alamethicin. J Membr Biol. 129, 109-136.
38. Allen, T.W., Andersen, O.S., Roux, B. (2004) On the importance of atomic fluctuations, protein flexibility, and solvent in ion permeation. J Gen Physiol. 124, 679-690.
39. Andersen, O.S. (1983) Ion movement through gramicidin A channels. Interfacial polarization effects on single-channel current measurements. Biophys J. 41, 135-146.
40. Bechinger, B. (1997) Structure and functions of channel-forming peptides: Magainins, Cecropins, Melittin and Alamethicin. J. Membrane Biol. 156, 197211.
41. Bamberg, E., Lauger, P. (1973) Channel formation kinetics of gramicidin A in lipid bilayer membranes. J Membr Biol. 11,177-194.
42. Bamberg, E., Lauger, P. (1974) Temperature-dependent properties of gramicidin A channels. Biochim Biophys Acta. 367, 127-133.
43. Andersen, O.S., Koeppe, R.E. (2007) Bilayer thickness and membrane protein function: an energetic perspective. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 107130.
44. Rudnev, V.S., Ermishkin, L.N., Fonina, L.A., Rovin, Yu.G. (1981) The dependence of the conductance and lifetime of gramicidin channels on the thickness and tension of lipid bilayers. Biochim Biophys Acta. 642, 196-202.
45. Mobashery, N., Nielsen, C., Andersen, O.S. (1997) The conformational preference of gramicidin channels is a function of lipid bilayer thickness .FEBS Lett. 412, 15-20.
46. Purrucker, O., Hillebrandt, H., Adlkofer, K.} Tanaka, M. (2001) Deposition of highly resistive lipid bilayer on silicon-silicon dioxide electrode and incorporation of gramicidin studied by an impedance spectroscopy. Electrochim. Acta. 47, 791-798.
47. Bosscha, M.I., van Dissel, J.T., Kuijper, E.J., Swart, W., Jager, M.J. (2004) The efficacy and safety of topical polymyxin B, neomycin and gramicidin for treatment of presumed bacterial corneal ulceration Br. J. Ophthalmol. 88, 25-28.
48. Couzos, S., Lea, T., Mueller, R., Murray, R., Culbong, M. (2003) Effectiveness of ototopical antibiotics for chronic suppurative otitis media in Aboriginal children: a community-based, multicentre, double-randomised controlled trial. MJA. 179,185-190
49. Bourinbaiar, A.S., Coleman, C.F. (1997) The effect of gramicidin, a topical contraceptive and antimicrobial agent with anti-HIV activity, against herpes simplex viruses type 1 and 2 in vitro. Arch. Virol. 142, 2225-2235.
50. Vives, E. (2005) Present and future of cell-penetrating peptide mediated deliveiy systems: "is the Trojan horse too wild to go only to Troj?" J.Control.Release. 109, 77-85.
51. Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. (1997) A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J.Biol.Chem. 272, 16010-16017.
52. Derossi, D, Joliot, A.H., Chassaing, G., Prochiantz, A. (1994) The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444 10450.
53. Elliott, G., O'Hare P. (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by a herpes virus structural protein. Cell. 88, 223-233.
54. Elmquist, A., Lindgren, M., Bartfai, T., Langel, U. (2001) VE-cadherinderived cell-penetrating peptide, pVEC, with carrier functions. Exp.Cell Res. 269, 237244.
55. Pooga, M., Hallbrink, M., Zorko, M., Langel, U. (1998) Cell penetration by transportan. FASEB J. 15, 1451-1453.
56. Wyman, T.B., Nicol, F., Zelphati, O., caria, P.V., Plank, C., Szoka, F.C.J. (1997) Design, synthesis and characterization of a cationic peptide that binds to nucleic acids and permeabilizes bilayers. Biochemistry. 36, 3008-3017.
57. Morris, M.C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. (2001) A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nature Biotechn. 19, 1173-1176.
58. Rousselle, C., Clair, P., Temsamani, J., Scherrmann, J.M. (2002) Improved brain delivery of benzylpenicillin with a peptide-vector-mediated strategy. J. Drug Targeting. 10, 309-315.
59. Mazel, M., Clair, P., Rousselle, C., Vidal, P., Scherrmann, J.M., Mathieu, D., Temsamani, J. (2001) Doxorubicin-peptide conjugates overcome multidrug resistance. Anticancer Drugs. 12, 107-116.
60. Morris, M.C., Vidal, P., Chaloin, L., Heitz, F., Divita, G. (1997) A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 25, 2730-2736.
61. Chaloin, L., Morris, M.C., Van Mau, N., Mery, J., Divita, G., Heitz, F. (1999) Synthetic primary amphipathic peptides as tools for the cellular import of drugs and nucleic acids. Curr.Topics Pept. Protein Res. 3, 153-162.
62. Soomets, U., Lindgren, M., Gallet, X., Hallbrink, M., Elmquist, A., Balaspiri, L., Zorko, M., Pooga, M., Brasseur, R., Langel, U. (2000) Deletion analogues of transportan. Biochim.Biophys. Acta. 1467, 165-176.
63. Rittner, K., Benavente, A., Bompard-Sorlet, A., Heitz, F., Divita, G., Brasseur, R. (2002) New basic membrane-destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in-vitro and in-vivo. Mol.Ther. 5, 104-114.
64. Sheldon, K., Liu, D., Ferguson, J., Gariepy, J. (1995) Loligomers: design of de novo peptide-based intracellular vehicles. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 92, 20562060.
65. Fernandez-Carneado, J., Kogan, M.J., Castel, S., Giralt, E. (2004) Potential peptide carriers: amphipathic proline-rich peptides derived from the N-terminal domain of gamma-zein. Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 43, 1811-1814.
66. Takeshima, K., Chikushi, A., Lee, K-K., Yonehara, S., Matsuzaki, K. (2003) Translocation of analogues of the antimicrobial peptides Magainin and Buforin across human cell membranes. J.Biol.Chem. 278, 1310-1315.
67. Lindgren, M, Hallbrink, M, Prochiantz, A., Langel, U. (2000) Cell-penetrating peptides. Trends Pharmacol Sci. 21, 99-103.
68. Deshayes, S., Morris, M.C., Divita, G., Heitz, F. (2005) Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell.Mol.Life Sci. 62, 1839-1849.
69. Dietz, G.P.H., Bahr, M. (2004) Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach. Mol. Cell. Neurosci. 27, 85-131.
70. Frankel, A., Pabo, C. (1988) Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193.
71. Green, M., Loewenstein, P. (1988) Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus Tat trans-activator protein. Cell. 55, 1179-1188.
72. Fawell, S., Seery, J., Daikh, Y., Moore, C., Chen, L.L., Pepinsky, B., Barsoum, J. (1994) Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc.Natl.Acad.Sci. 91, 664-668.
73. Torchilin, V.P., Levchenko, T.S., Rammohan, R., Volodina, N., Papahadjopoulos-Sternberg, B., D'Souza, G.G.M. (2003) Cell transfection in vitro and in vivo with nontoxic TAT peptide-liposome-DNA complexes. PNAS. 100, 1972-1977.
74. Jo Hot, A.H., Triller, A., Volovitch, M., Pernelle, C., Prochiantz, A. (1991) Alpha-2,8-polysialic acid is the neuronal surface receptor of antennapedia homeobox peptide. New Biol. 3, 1121-1134.
75. Prochiantz, A. (1999) Homeodomain-derived peptides. Ann. N Y Acad. Sci. 886, 172-179.
76. Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G., Prochiantz, A. (1996) Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent. J.Biol.Chem. 271, 18188-18193.
77. Derossi, D., Chassaing, G., Prochiantz, A. (1998) Trojan peptides: The penetratin system for intracellular delivery. Trends Cell Biol. 8, 84-87.
78. Allinquant, B., Hantraye, P., Mailleux, P., Moya, K., Bouillot, C., Prochiantz, A. (1995) Down regulation of amyloid precursor protein inhibits neurite outgrowth in vitro. J.Cell.Biol. 128, 919-927.
79. Pooga, M., Soomets, U., Hallbrink, M., Valkna, A., Saar, K., Rezaei, K. ect. (1998) Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo. Nat.Biotechnol. 16, 857-861.
80. Villa, R., Folini, M., Lualdi, S., Veronese, S., Daidone, M.G., Zaffaroni, N.2000) Inhibition of telomerase activity by a cell-penetrating peptide nucleic acid construct in human melanoma cells. FEBS Lett. 473, 241-248.
81. Ford, K., Darling, D., Souberbielle, B., Farzaneh, F. (2000) Protein transduction: a new tool for the study of cellular ageing and sequence. Mech. Ageing Dev. 121, 113-121.
82. Phelan, A., Elliot, G., O'Hare, P. (1998) Intercellular delivery of functional p53 by the herpesvirus protein VP22. Nat.Biotech. 16, 440-443.
83. Dilber, M.S., Phelan, A., Aints, A., Mohamed, AJ., Elliot, G., Smith, C.I., O'Hare, P. (1999) Intercellular delivery of thymidine kinase prodrug activating enzyme by the herpes simplex virus protein, VP22. Gene Ther. 6, 12-21.
84. Liu, X.H., Castelli, J.C., Youle, R.J. (1999) Receptor-mediated uptake of an extracellular Bcl-x(L) fusion protein inhibits apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 9563-9567.
85. Ye, D., Xu, D., Singer, A.U. Juliano, R.L. (2002) Evaluation for the intracellular delivery of proteins. Pharm.Res. 19, 1302-1309.
86. Richard, J.P., Melikov, K., Vives, E., Ramos, C., Verbeure, B., Gait, M.J., Chernomordik, L.V., Lebleu, B. (2003) Cell-penetrating peptides. J.Biol.Chem. 278, 585-590.
87. Lindgren, M.E., Hallbrink, M., Elmquist, A.M., Langel, U. (2003) Passage of cell-penetrating peptides across a human epithelial cell layer in vitro. Biochem.J. 377, 69-76.
88. Hallbrink, M., Floren, A., Elmquist, A., Pooga, M., Bartfai, T., Langel, U.2001) Cargo delivery kinetics of cell-penetrating peptides. Biochim.Biophys.Acta. 1515, 101-109.
89. Pooga, M., Kut, C., Kihlmark, M., Hallbrink, M., Fernaeus, S., Raid, R., Land, T., Hallberg, E., Bartfai, T., Langel, U. (2001) Cellular translocation of proteins by transportan. FASEB J. 15, 1451-1453.
90. Ryser, H.J., Shen, W.C. (1980) Conjugation of methotrexate to poly (Llysine) as a potential way to overcome drug resistance. Cancer. 45, 1207-1211.
91. Wolfert, M.A., Seymour, L.W. (1996) Atomic force microscopic analysis of the influence of the molecular weight of poly(L)lysine on the size of poly electrolyte complexes formed with DNA. Gene Ther. 3, 269-273.
92. Shen, W.C., Ryser, H.J. (1978) Conjugation of poly-L-lysine to albumin and horseradish peroxidase: a novel method of enhancing the cellular uptake of proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 1872-1876.
93. Midoux, P., Mendes, C., Legrand, A., Raimond, J., Mayer, R., Monsigny, M., Roche, A.C. (1993) Specific gene transfer mediated by lactosylated poly-L-lysine into hepatoma cells. Nucleic Acids Res. 21, 871-878.
94. Mitchell, D.J., Kim, D., Steinman, L., Fathman, C.G., Rotbard, J.B. (2000) Polyarginine enters cells more efficiently than other polycationic homopolymers. J.Pep.Res. 56,318-325.
95. Suzuki, T., Futaki, S., Niwa, M., Tanaka, S., Ueda, K., Sugiura, Y. (2002) Possible existence of common internalization mechanisms among arginine-rich peptides. J.Biol.Chem. 277, 2437-2443.
96. Emi, N., Kidoaki, S., Yoshikawa, K., Saito H. (1997) Gene transfer mediated by polyarginine requires a formation of big carrier-complex of DNA aggregate. Biochem.Biophys.Res.Commun. 231, 421-424.
97. Singh D., Bisland S. K., Kawamura K. and Gariepy J. (1999) Peptide-based intracellular shuttle able to facilitate gene transfer in mammalian cells. Bioconjug. Chem. 10, 745-754.
98. Fischer, R., Fotin-Mleczek, M., Hu&agel, H., Brock, R. (2005) Break on through to the other side biophysics and cell biology shed light on cell penetrating peptides. ChemBioChem. 6, 2126-2142.
99. Borghouts, C., Kunz, C., Groner, B. (2005) Current strategies for the development of peptide-based anti-cancer therapeutics. J.Pept.Sci. 11, 713-726.
100. Schwarze, SR., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S.F. (1999) In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285, 1569-1572.
101. Harada, H., Kizaka-Kondoh, S., Hiraoka, M. (2006) Antitumor protein therapy; application of the protein transduction domain to the development of a protein drug for cancer treatment. Breast Cancer. 13, 16-26.
102. Harbour, J.W., Worley, L., Ma, D., Cohen, M. (2002) Transducible peptide therapy for uveal melanoma and retinoblastoma. Arch.Ophtalmol. 120, 713-720.
103. Phelan, A., Elliot, G., O'Hare, P. (1998) Intracellular delivery of functional p53 by the herpesvirus protein VP22. Nat.Biotechnol. 16, 440-443.
104. Datta, K., Sundberg, C., Karumanchi, S.A., Mukhopadhyay, D. (2001) The 104-123 amino acid sequence of the beta-domain of von Hippel-Lindau gene product is sufficient to inhibit renal tumor growth and invasion. Cancer Res. 61, 1768-1775.
105. Du, C., Fang, M., Li, Y., Li, L., Wang, X. (2000) Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-depepndent casapase activation by eliminating IAP inhibition. Cell. 102, 33-42.
106. Snyder, E.L., Dowdy, S.F. (2004) Cell penetrating peptides in drug delivery. Pharm.Res. 21,389-393.
107. Fluda, S., Wick, W., Weller, M., Debatin, K.M. (2002) Smac agonists sensitize for Apo2L/TRAIL- or anticancer drug-induced apoptosis and induce regression of malignant glioma in vivo. Nat.Med. 8, 808-815.
108. Mai, J.C., Mi, Z., Kim, S-H., Ng, B., Robbins, P.D. (2001) A pro-apoptotic peptide for the treatment of solid tumors. Cancer Res. 61, 7709-7712.
109. Hareda, H., Hiraoka, M., Kizaka-Kondoh, S. (2002) Antitumor effectof TAT-oxigen-dependent degradation-caspase-3 fusion protein specifically stabilized and activated in hypoxic tumor cells. Cancer Res. 62, 2013-2018.
110. Kilic, E., Dietz, G.P.H., Hermann, D.M., Bhr, M. (2002) Intravenous TAT-Bcl-xL is protective after middle cerebral artery occlusion in mice. Ann.Neurol. 52,617-622.
111. Asoh, S., Ohtsu, T., Ohta, S. (2000) The super anti-apoptotic factor BclxFNK constructed by disturbing intramolecular polar interactions in rat Bcl-xL. J.Biol.Chem. 275, 37240-37245.
112. Aarts, M., Liu, Y., Liu, L., Besshoh, S., Arundine, M., Gurd, J.W., Wang, Y.T., Salter, M.W., Tymianski, M. (2002) Treatment of ischemic brain damage by perturbing NMDA receptor-PSD-95 protein interactions. Science. 298, 846850.
113. Kilic, U., Kilic, E., Dietz, G.P.H., Bahr, M. (2003) Intravenous TAT-GDNF is protective after focal cerebral ischemia in mice. Stroke. 34, 1304-1310.
114. El-Andaloussi, S., Holm, T., Langel, U. (2005) Cell-penetrating peptides: mechanisms and applications. Current Pharm. Design. 11, 3697-3611.
115. Futaki S, Suzuki T, Ohashi W, Yagami T, Tanaka S, Ueda K, Sugiura Y. (2001) Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem. 276, 5836-5840.
116. Oren, Z., Shai, Y. (1998) Mode of action of linear amphipaphic alpha-helical antimicrobial peptides. Biopolymers. 47, 451-463.
117. Matsuzaki, K., Yoneyama, S., Miyajima, K. (1997) Pore formation and translocation of melittin. Biophys. J. 73, 831-838.
118. Zhang, W., Smith, S.O. (2005) Mechanism of penetration of Antp(43-58) into membrane bilayers. Biochemistry. 44, 10110-10118.
119. Fotin-Mleczek, M., Fischer, R., Brock, R. (2005) Endocytosis and Cationic Cell-Penetrating Peptides A Merger of Concepts and Methods. Current Pharmaceutical Design. 11, 3613-3628.
120. Ferrari, A., Pellegrini, V., Arcangeli, C., Fittipaldi, A., Giacca, M., Beltram, F. (2003) Caveolae-mediated internalization of extracellular HIV-1 tat fusion proteins visualized in real time. Mol.Ther. 8, 284-294.
121. Waida, J. S., Stan, R. V., Dowdy, S. F. (2004) Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-iusion proteins after lipidraft macropinocytosis. Nat. Med. 10, 310-315.
122. Drin, G., Cottin, S., Blanc, E., Rees, A.R., Temsamani, J. (2003) Studies on the internalization mechanism of cationic cell-penetrating peptides. J.Biol.Chem. 278,31192-31201.
123. Fittipaldi, A., Ferrari, A., Zoppe, M., Arcangeli, C., Pellegrini, V., Beltram, F., Giacca, M. (2003) Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J.Biol.Chem. 275, 34141-34149.
124. Orlandi, P.A., Fishman, P.H. (1998) Filipin-dependent inhibition of cholera toxin: evidence for toxin internalization and activation through caveolae-like domains. J.Cell.Biol. 141, 905-915.
125. Wang, L. H., Rothberg, K. G., Anderson, R. G. (1993) Miss-assembly of clathrin lattices on endosomes reveals a regulatory switch for coated pit formation. J. Cell. Biol. 123,1107-1117.
126. Clague MJ, Urbe S, Aniento F, Gruenberg J. (1994) Vacuolar ATPase activity is required for endosomal carrier vesicle formation. J.Biol.Chem. 269,21-4.
127. Araki, N., Johnson, M.T., Swanson, J.A. (1996) A role for phosphoinositide 3-kinasein the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. J.Cell Biol. 135, 1249-1260.
128. West, M.A., Bretscher, M.S., Watts, C. (1989) Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. J.Cell.Biol. 109, 2731-2739.
129. Silhol, M., Tyagi, M., Giacca, M., Lebleu, B., Vives, E. (2002) Different mechanisms for cellular internalization of the HIV-1 Tat-derived cell penetrating peptide and recombinant proteins fused to Tat. Eur.J.Biochem. 269, 494-501.
130. Tyagi, M., Rusnati, M., Presta, M, Gíacca, M. (2001) Internalization of HIV-1 Tat requires cell surface heparin sulfate proteoglicans. J.Biol.Chem. 276, 32543261.
131. Deshayes, S„ Heitz, A., Morris, M. C., Charnet, P., Divita, G., Heitz, F. (2004) Insight into the mechanism of internalization of the cell-penetrating carrier peptide Pep-1 through conformational analysis. Biochemistry. 43, 1449-1457.
132. Henriques S.T., Castanho, M.A.R.B. (2004) Consequences of nonlytic membrane perturbation to the translocation of the cell penetrating peptide Pep-1 in lipidie vesicles. Biochemistry. 43, 9716-9724.
133. Rothbard, J.B., Jessop, T.C., Lewis, R.S., Murray, B.A., Wender, P.A. (2004) Role of membrane potential and hydrogen bonding in the mechanism of translocation of guanidinium-rich peptides into cells. J.Am.Chem.Soc. 126, 9506-9507.
134. Herce, H.D., Garcia, A.E. (2007) Molecular dynamics simulation suggest a mechanism for translocation of the HIV-1 TAT peptide across lipid membranes. PNAS. 104, 20805-20810.
135. Henriques, S. T., Meló, M. N., Castagnho, M. A. R. B. (2006) Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399, 17.
136. Palm, C., Netzereab, S. and Hallbrink, M. (2006) Quantitatively determined uptake of cell-penetrating peptides in non-mammalian cells with an evaluation of degradation and antimicrobial effects. Peptides. 27, 1710-1716
137. Davies, M.J. (2004) Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochem. Photobiol. Sci. 3, 17-25.
138. Szabo, G., Urry, D.W. (1979) N-acetyl gramicidin: single-channel properties and implications for channel structure. Science. 203, 55-57.
139. Pujáis, S., Fernandez-Carneado, J., Lopez-Iglesias, C., Kogan, M.J., Giralt, E. (2006) Mechanistic aspects of CPP-mediated intracellular drug delivery: relevance of CPP self-assembly. Biochim. Biophys. Acta. 1758, 264-279.
140. Apell, H.J., Bamberg, E., Alpes, H., Lauger, P. (1977) Formation of ion channels by a negatively charged analog of gramicidin A. J. Membr. Biol. 31, 171-188.
141. Rokitskaya, T.I., Kotova, E.A., Antonenko, Y.N. (2003) Tandem gramicidin channels cross-linked by streptavidin. J. Gen. Physiol. 121, 463-476.
142. Antonenko, A.Y., Rokitskaya, T.I., Kotova, E.A., Reznik, G.O., Sano, Т., Cantor, C.R. (2004) Effect of streptavidins with varying biotin binding affinities on the properties of biotinylated gramicidin channels. Biochemistry. 43, 45754582.
143. Hladky, S.B., Haydon, D.A. (1984) Ion movements in gramicidin channels. Curr. Top. Membr. Transport. 21, 327-372.
144. Антоненко, Ю.Н., Котова, E.A., Рокицкая, Т.Н. (2005) Фотодинамическое воздействие как основа релаксационного метода изучения грамицидиновых каналов. Биол. Мембраны. 22, 275-289.
145. Vives, Е., Richard, J.-P., Rispal, С., Lebleu, В. (2003) Tat peptide internalization: seeking the mechanism of entry. Current Prot. Pept. Sci. 4,1-8.
146. Henriques, S.T., Costa, J., Castanho M.A.R.B. (2005) Translocation of galactosides mediated by the cell-penetrating peptide Pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44, 10189-10198.
147. Carey, J. (1991) Gel retardation. Methods Enzymol. 208, 103-117.
148. Park, S., Raines, R.T. (1997) Green fluorescent protein as a signal for proteinprotein interactions. Prorein Science. 6, 2344-2349.
149. Wagstaff, K.M., Dias, M.M., Alvisi, G., Jans, D.A. (2005) Quantitative Analysis of protein-protein interactions by native Page/Fluorimaging. J. Fluoresc. 15, 469-73.
150. Muller, P., Rudin, D.O., Tien, H.T., Wescott, W.C. (1963) Methods for the formation of single biomolecular lipid membranes in aqueous solution. J.Phys.Chem. 67, 534-535.
151. Huamin, J., Ci, Z., Hui, S.,Yong, L., Huijun, Q., Bingyan, Z. (2002) Determination of pretransplant viability of leydig cells by MTT colorimetric assay. Transplantation Proceedings. 34, 3419-3421.
152. Abe, K., Matsuki, N. (2000) Measurement of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction activity and lactate dehydrogenase release using MTT. Neurosci.Res. 38, 325-329.
