Синтез новых аналогов бета-казоморфина-5, DAla2, DLau5-энкефалина и исследование их биологической активности тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МИНИСТЕРСТВО НАРСЩЮГО ОБРАЗОВАНИЯ ТДОИКСКОЙ ССР ТАДЖИКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. В.И.ЛЕНИНА

На правах рукошси

СОБИРОВ МАРДОН МАВЛОНОВИЧ

УЖ 547.854+547.857+547.466

СИНТЕЗ НОШ АНАЛОГОВ Й-КА30ЮРЭДНА-5, DAla2, DLeu5 -ШКЕ-ФАЛИНА И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Специальность C2.GCi.I0 Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Душанбе - 1990

Работа выполнена на кафедре органической химии Таджикского Госунивереитета и кафедре химической эазимологои ИГУ имени М.Б.Ломоносова.

Научные руководители -

доктор химических наук,профессор кандидат химических наук,доцент

Официальные оппоненты:

доктор химических наук доктор химических наук

Ведущая организация -

Институт физиологически активных веществ АН СССР

С.Д.ВАРЮЛОМЕЕВ Ш.Х.ХАЛИКОБ

А.А.ЬАЙЮБ

ю.в.шин

Защита состоится " Ь " Ал /ЛЛ^1990 года в {Ш час, на заседании специализированного Ученого Совета К 013.02.01 -при Институте химии АН Таджикской ССР по адресу: г.Душанбе,ул.Айни 299 Институт химии.

Автореферат разослан

1990 г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО СОВЕТА

Г.С.САНШЗВИЧ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Опиоидные пептиды выполняют самые разнообразные, жизненно важные функции в живом организме. Они участвуют в процессах авторегуляции боли, изменения уровня кровяного давления, регуляции функции эндокринной системы, моторики и кислотной секреции кишечника, психического состояния, эмоционального поведения и т.д.

По характеру действия на организм эндогенные опиоидные пептиды очень сходны с наркотическими алкалоидами, но не обладают нежелательным побочньми действиями подавления дыхательного цент тра и эффектом привыкания.

Как опиоидные пептиды, так и наркотические алкалоиды действуют на организм посредством опиоидных рецепторов. Поэтому синтез и исследование структурно-функциональных взаимоотношений в ряду аналогов опиоидных пептидов, а также создание новых фармакологически активных препаратов на их основе является актуальном и важ-нш.

Цель работа. Целью настоящей работы является синтез и исследование Сиологаческой активности новых, модифицированных аналогов р -казоморфша-б и mía2 , DLeu5 -энкефалина, а также ликерных и химерных аналогов на их основе; исследование структурно-функциональных взаимоотношений в ряду синтезированных аналогов к оценка взаимоотношения и <Р - центров связывания опиоидных рецепторов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые синтезированы химерные, бивалентные лиганды опиоидных рецепторов вкяючашре J} -казоморфин-5 и DAla2 ,DXeu5 -энкефалин и модификации исходных опиоидных пептидов на основе этилендиами-нового мостика направленный на удлинение молекулы с одновременны« изменением кислотно-основных свойств. На основе структурно-функционального анализа показано, что аналогичные модификации ^5-ка-зоморфина-5 и DAla2 * DLeu5 ~ энкефалина приводят к п рота во положит изменениям в опиоидной активности пептидов. Оделено предположение о том, что $ -опиоидные центры связывания опиоидных рецепторов являются более компактнши и жесткими, в то время как структура JH -опиоидных рецепторов является более габкой.

Синтезированные новые аналоги опиоидных пептадов являются оригинальны® и обладают ярко выраженной опиоидной и аналъгетаче-ской активностью. Анальгешческая активность некоторых синтеэи-

рованных аналогов заметно превышает аналогичную активность исходных £ - казоморфина-5, М1а2 , йЬеи^ - энкефалина и широко известного наркотика - морена.

Результаты исследования могут быть использованы при разработке конкретных методик синтеза биологически активных опиоидных пептидов, а также химерных соединений.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых и специалистов посвященной 60 летию Таджикистана (г.Душанбе,1984г); республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 70 лети» Великого Октября (г.Душанбе, 1987); на 1-Международном конгрессе по терапии аминокислот и их аналогов (Австрия, Вена 1989г); Х-Обьединенном Симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент,1989г) и Всесоюзном пептидном симпозиуме (В)га, 1990г).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы посвященного исследованию опиоидных рецепторов и структурно-функциональному взаимоотношению опиоидных пептидов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов,списка литературы и приложения.

Работа содержит 166 страниц машинописного текста, включая 10 таблиц, 36 рисунков, 9 схем и ста;сок цитируемой литературы (130 ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Синтез глициновых производных этилендиамина.

Для синтеза димерных,химерных и модифицированных по С-кон-цевому карбоксиду аналогов ^-казоморфина-5 и ВА1а2 , СЬеи5 -энкефалина необходимо было иметь в распоряжении монозамещенное производное бифункционального органического соединения.В качестве такого соединения был выбран эталендаамин, а в качестве реагента для монозамещения аминогруппы этилендиамина широко распространенный а пептидной химии бенэилоксикарбонилхлорид:

г-с1+н;?ы-сн2-сн2-кн2 —»■ г-кн-сн2-сн2-нн2 (I)

Поскольку для синтеза новых аналогов опиоидных пептидов, особенно химерных аналогов, было необходимо наличие двух селективно удаляемых защитных групп, к полученному монокарбобензокси-"

этилендиамину (I) был присоединен Вос-глицин. Полупенное, в результате соединение -вое-С1у-е^а-г Ш) имеет два избирательно удаляемых N - защитных групп, которые дают возможность наращивать пептидную цепь с любого конца. Используя такую возможность были синтезированы симметричные и несимметричные мостики на основе этилендиамина с одним или несколькими остатками глицина.

2. Ожтез новых аналогов уЗ- казомор&ина - 5.

Р -казомор$ин является устойчивым действию эндогенных про-теаз у-селективным лигандом опиоидных рецепторов и впервые был' выделен из состава & -казеина коровьего молока. Его укороченный аналог уЗ - казомор4ин-5 является более устойчивым и селективным препаратом.

С целью изучения структурно-функциональных взаимоотношений, на основе да- и три глициновых производных были синтезированы новые аналоги уЗ -казоморфина-5, в соответствии со схемами I и 2.

Схема I.

Туг

ъ г

г

г

н

Гго

РЬе Рго

Вг1 )Нр Н.

(vii)

Вй1

Ч

Вв1

Ъ.

г.

м гон н

В1у

-т н-

г г

р н-

01у

1т.

(VIII)

(II)

(X)

Ш1

-Вое

-Вое

-вое

-Вое _Воо

-Вов

"я

г

Туг

г 2

г н

Рго РЬе

Рго

(VII)

"Вг!

•ОН Н-

Ъ

■ОН н-

ЕЪЪА 01 у С1у

(XIII)

(XIV)

(XV)

(XVI)

(XVII)

(XVIII)

(XIX)

(XX)

■Вое ■Н рО}Й-Вос

-Вое

-Вое -Вое

-Вое

-Вое

-Н

-Н

Схема 2.

Пептид XII после очистки был использован для определения опиоидной и анальгетической активности. Пептид XIX после снятия Вос-защитной группы был модифицирован моноацеталированием и мо-носунцинилированием в соответствии со схемами 3 и 4.

Схема 3. .

(сн3соо)2о

г-Туг(Вг1)-Рго-РЬе-Рго-СХу-С1у-Н (XIX)

2-Туг(Вг1)-Рго-РЬе-Рго-й1у-Е1;1)А-01у«-С11у-С0-СН^ (ЗОЛ) Н-Туг-Рго-РЬв-Рго-01у-Ег1)А»01у-С1у-С0-СН3 (XXII)

Н2,М

Схема 4.

2-Хуг(Вв1)-Рго-РЬе-Рго-01у-ЕгПА-а1у-01у-Н+СН2-С^ -►

¿н2<°

г-Туг(Ва1)-Рго-РЬе-Рго-а1у-Е*СА-01у^01у-С0-СН2-СН2-С00Н+Н2 -►

Рй/С

- Н-Туг-Рго-РЬе-Рго-01у-ЕгБА^а1у»(}1у-С0-СН2~СН2-С00Н (XXIV)

Таким образом, были получены аналогу уз-каэомор^ина-5, обладающие разной степень» кислотно-основных свойств:

H-Tyr-Prtwhe-Pro-Gly-EtDA*.Gly-K (XII)

Н-Гуг-Pro-Phe-Pro-aiy-EtDAwGlyvGly-H (XX)

H-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-E tDA-G1y-Gly-C 0-GH, (XXII)

H-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-StDA-Gly-Gly-CO-GHg-CHgCOOH (ХХ1У)

Основные свойства в ряду этих пептидов меняется следующим образом:

(XII) ^ (XX) > (XXII) > (ХХ1У)

Пептиды после деблокирования были очищены методом ВЭКХ и применены для изучения опиоидной и анальгеточеской актавности."

2

3. Синтез новых, ыоди^цированных аналогов DAla.DLeu - энкефалина.

Одним из широко используемых лигандов опиоидных рецепторов обладающей высоной специфичностью и устойчивостью является SAULE. Его природный аналог лей-энкефалин был впервые ввделен Хьосом из экстракта головного мозга.

С целью изучения структурно-функциональных взаимоотношений нами произведена модификация EAla2. DLeu5-энкефалина с С-конца группой состоящей из этилендиамина и остатков глицина:

H-Tyr-DAla-Gly-Phe-DLeu-Gly-01y-KtDA*Gly-H (хххуп)

H-Tyi^DAla-Gly-Phe-DLeu-Qly-01y-EtDA»Gly-C0-GH3 (XXXIX)

H-Tyr-DAla-Gly-Phe-DLeu-G ly-G ly-KtDA*01y-C O-CHg-CHg-C ООН (xll)

Основные свойства пептидов в ряду новых аналогов меняется следуодем образом:

(ХХХУП) > (XXIX) > (ХЫ)

Сйнтез пептида ХХХУП был осуществлен методом активированных эфиров.с использованием селективно снимающихся завдатеых групп в соответствии со схемой 5.Дальнейшая модификация,как и в случае синтеза новых аналогов р -казоморфина-5 была направлена на удлинение молекулы энкефалина с одновременным моноацетилированием и моносукцинилированием (Схемы 6 и 7).

Схема 5.

Туг ПА 1а Иу РЬе ВЬеи й1у а1у EtDA 01у

Ве1

Г

Вг1

г-ртрн-ъ.

Я-уОНр н-

г г

г-^оир г-

Шр5

«р н

«ос

"Вое (XXV)

■Воо (XXVI)

"Воо (XXVII)

-Вос(ХХУ111) ■Воо (XXIX) "Вое (XXX)

Зое (XXXI) -Воо(ХХХН)

■Воо (XXXIII)

Воо (XXXIV)

«оо (XXXV) -Н (XXXVI)

Н (XXXVII)

Схема 6.

2-Tyr(Bвl)-DAla-Gly-Phв-DLвц-GXy-Gly-EtDA•Gly-H+CH3-C^

(XXXVI)

уО

снэ~Ч

Z-Tyг(Bгг)-DAla-Gly-Phв-DIвu-Gly-Gly-.БtDA-GXy-CO-CH3+H2 (XXXVIII)

РЙ/С

Н~Ту1^БА1а-01у-РЬе-ВЬеи-С1у-й1у^БА^1у-СО-ОН3 (XXXIX)

Z-Tyr(3zl)-DAla-Gly-?he-DLeu-Gly-Gly-EtSA-Gly-H+CH -С^ — ■> (XXXVI) I /°

сн2-с%

Z-Tyr(BzX)-DAla-Gly-?he-DLeu-Gly-Gly-EtDA^Gly-CO-CH--CH!)-COOH (XL)

H2,?d/C

—• ■■■ >ü-?yr-DAla-GXy-^he-DLeu-Gly-Gly-EtBA»-Gly-CO-CH2-CH2-COOH (XLI)

4. Синтез димерных и химерных аналогов DAla2,DLeu^ эн кефали на и - казоморфина - 5.

Ь последнее время растет интерес к бифункциональным опиоид-нш пептидьм-Сивалентным лигандам опиоидных рецепторов, которые обладают потенциальной возможностью одновременного взаимодействия с двумя центрами связывания опиоидньгх рецепторов и могут быть использованы как для изучения структурно-функционального взаимоотношения в ряду опиоидных пептидов,так и в качестве инструмента исследования некоторых биохимических процессов,в частности для оценки расстояния между центрами связывания опиоидных рецепторов. Классическими представителями бивалентных лигандов являются бис-опиЯнь-е холинергетические блокаторы-известные в фармакологии.

До последнего времени, по нашим данньм,в литературе отсутствуют сведения о бивалентных лигандах опиоидных рецепторов,состоящих из разных опиоидных пептидов связанных между собой соединительной цепочкой по С-карбоксильному концу.Такие пептиды можно называть химерными бифункциональны« лигандами опиоидных рецепторов или же химерными бифункциональными аналогами опиоидных пептидов.

Б следствии меньших энтропийных потерь,в процессе связывания, бивалентные лиганды должны обладать большей активностью по сравнению с их моновзлентньл аналогом,при условии, если длина связывающей цепи достаточна для одновременного связывания с двумя центрами.Таким образом сравнивая активность бивалентного ли-ганда с длиной связующего мостика можно оценить расстояние между двумя центрами связывания.

Исходя из этого нами синтезированы четыре новых бивалентных лигандов опиоидных рецепторов (XLII-XLV) .включаюодх ^-казомор-<{ИН-5 И DADLE

Два из этих аналога (хыу,хьу) состоят из одинаковых пептидов, два других аналога включают•одновременно,как р -казомор^ина - 5, так и ОАСЬБ или его укороченный, активный аналог: туа>ва1в-б1у-рьв (хы1,хы11):

Н-Туг-ВА1а-а1у-РНв-ВЬви-01у-01у-ЕгВА»01у*Рго»РЬв«Рго-Туг-Н (ХШ) Н-Туг-ПА1а-01у-РЬв-01у-Е*1)А-а1у«Рго^РЬв»-Рго^Туг-Н (XH.il)

(xi.iv)

Н-Туз>-Рго-РЬв-Рго-0ау-01у-ЕгГ)А^01у^Рг(>.РЬв~Рго».Туг-Н (XIV)

Синтез проводили классическими методами пептидной химии в растворе, наращивая пептидную цепь,как степунчато.так и блочной конденсацией. Для синтеза соединений хьп и хин использовали комбинацию избирательно удаляемых (Вое- иг-),а для синтеза соединений ХЫУ и XIV только- г-защитную группу. Пептиды хыу и XIV синтезировали ступенчатьы наращиванием цепи,методом активированных эмиров (схемы 6 и 9).Синтез пептидов ХЫ1 и хин был осуществлен методом блочной конденсации в соответствии со схемами 12 и 13. Дал этого первоначально были получены пептиды ХЬУ1 и ш по схемам 10 и II, а«затем конденсированы с пептидом XII, карбодиимиднш методом с добавкой 1-гидроксибензтриазола:

Схема II

ОД1а 0].у 2

г-

г4-шр а-

г

2-М»р Н'

ВвГ Схема 10

р)\е

«р н ШШ

Ш

(ьх>

(1X1)

он

ОН

ОН

он он

он

Туг ИА1а

Н

г - -оыр;

Вг1

ВаГ

й}.у СЬви в1у

2 -{«ИрМ211 %

г -рнр н г

Ъ СШр Н"

г

г-рыр' %

н.

Ш

(ь)

(Ы)

Шт).

Ш1)

(ЫУ)

(ЬУ)

■он

т

т

ш

(ЬУ1)

от)

ш т>н

он

■в.Ч

г

Туг СА1а 01у РЬе ВЬеи

>Ярг

г г.

I _|-Шр н,

г

-•ОНр »

г -г -•ОЫр а-

ЙХу ЕгИА й!у ВЬви РЬе

Воо Воо ■

Воо

Вое

Д-ОКр

н

■ОКр н-

г •г •н Р:

да-

•г ■г ■г

■г

•Н рЖ>'

■г

•г

■Нря^г •г .н

р№

Ш.а Туг

■г

■г

-Н рИО_|-2 Л

-Н рНС

О»

i M

о

fe

i-

гЧ О

3

4»

H

ri О

S

О

i'

S

fe ы

Ni ь С Й a к

tí M 1 A "c 3 t.

M 1 О S3 D 4 3

N t 4 M Q. j

N í Э.

вое P > о i S t s 3. s

1 N N 5 ' O. 9 i - ЧУ

N « a f

NN iE • Í 1.

C4 t. » P î * 1 '

M . w

Вос-Туг(Ва1)-1)А1а-01у-РЬе-В1еи-01у-0Н (Х1ЛГ1)-

РСС/НСИН.

2-Туг(3г1)-Рго-гЬе-?го-С1у-ЕгПА*С1у-Н (XI)___

Boc-Tyr(Bzl)-DA^a-Gly-fhв-DLeu-Gly-Gly-KtDA•-Gly♦■Pтo■Phв«•Pгo^

(хыпи с?3соон г-туг(В21)-1

17ЛЛ111) Н2,Р<1/С 2-Туг(Вг1)-1

Н-?уг-ПА1а-С1у-РЬв-Б1ли-а1у-а1у-йгСА»<51у-Рго-РЬе«-Рго»Туг-Н (хьи)

Схема 13.

Всо-Туг(Вг1)-0А1а-а1у-РЬв-0г^ (ЬХ1)_

1 рсс/нсш

1_I

2-Туг(В21)-Рго-РЬе-Рго-С1у-Е«А»01у-Н (XI). Вос-Туг(Ва1)-ВА1а-01у-Й1е-С1у-Е*ВА»<«1у»Рго«-РЬв»Рго*Туг(Ва1)«2 (шя) 1+ ср3сосн

Н-туг(Вв1)-1»А1в-01у-РЬв-01у-вгюа»01у-Р1ч>.РЬе-Рго»Тут(Вг1)-2 (ьхш) и н2,р<1/с

Н-Туг-ПА1в-в1у-РЬв-а 1у-ЬЧБА»0 1у-Рго-Р1ге-Рго-Туг-Н ( ШИ )

Целевые пептиды, после деблокирования, очищали методом ВЭКХ и использовали для изучения биологической активности.

5. Исследование опиоидной активности пептидов.

Опиоидную активность синтезированных пептидов определяли радиорецепторнш методой анализа на препаратах лиофилизованных иембран головного ыоэга крыс+.

Сродство пептадов к у- и (Г -центрам связывания огшоидных рецепторов определяли по концентрации исследуемых соединений вызывающие 50£-ное ингибирование меченного лиганда.

Для определения агокист антагонистического характера синтезированных соединений, изучение опиоидной активности проводили в двух буферные средах: буферная срсда с ионами натрия и буферная среда без ионов натрия. В буферном растворе без ионов натрия.нат-рий ааменен соответствующей соль» калия.

^Исследования проводили на кафедре химической энзимологии МГУ.

5,1. Опиоидная активность новых аналогов ^ -казомор<}ина-5.

Опиоидная активность новых аналогов Д-казоморфина-5 показана в таблице I.

ПЕПТИД "Изд. ! г н.Моль -' 7- • ВС5 -|Н.М0ЛЬ/МЫВЬ

Туг-Рго-Р1ге-Рго-С1у-Е*ОА*<}1у (XII) 900 '->10000 43,12

Туг-Рго-РЬе-Рго-С1у-Е1М.»Ю1у (XX) 1000 «►10000 36,а

Туг-Рго-РЬе-Рго-аХу-ЕгПАл СН3-СО-С1у-С1уЛ (XXII) 1200 10000 54,4

Туг-Рго-РЬе-Рго-й1у-Е 1 БА*п ноос-сн2-сн2-со-а1у-о1у-1 (XXIV) 48 200 51,5

Туг-Рго-РЬе-Рго-01у ( & -казоморфин-б) 191 >10000 4,03

Ыорфш 5,6

Как видно из данных, приведенных а таблице, удлинение молекулы / -каэоморфша-5 с С-конца модификатором на основе этилен-диамина и остатков глицине (XII,XX) приводит к некоторому понижение сродства пептида с сохранением уровня селективности. Дальнейшая модификация пептида ХХХУ1 моноацетилированием не оказывает заметного влияния на опиьидную активность, однако удлинение молекулы с последуювдш моносукцинилированием приводит к резкому повышению сродства как к у/- , так и к ¿Г -центрам связывания опиоидных рецепторов, причем это сродство заметно выше сродства исходного £ -казоморфина-5. Такое резкое повышение сродства по сравнение с другими модифицированными аналогами может объясняться возникновением квазициклической структуры данного пептида,которая по видимому является более гибкой (поскольку обладает одновременно заметной и Р -активность») и более комплементарной к соответствующем центрам связывания опиоидных рецепторов.

Как видно из приведенных в таблице I данных, во всех синтезированных новых аналогах уЗ -казоморфина-5 сохраняется высокая степень селективности, хотя в соединении ХХ1У уровень селективности несколько остается, наряду с сильным ростом сродства к центрам связывания опиоидных рецепторов. Наличие натриевого сдвига свидетельствует об агонистаческом характере опиоидной активности пептидов.

5.2. Опиоидная активность новых модифицированных аналогов DAXag , DLeu5 - энкефалина.

Опиоидная активность новых аналогов DADLE представлены в таблице 2.

Таблица 2.

! ИК^п.н.Ноль ! Щ-л ПЕПТИД_7- 1 <Г- 1н.мо5л°ь/мшь

Tyr-DA Ia-GIy~Phe-DLeu-G Xy-Gly-* (mlI) ^ 1Q0 4 „

Gly-EtDA-l

] (xxxix) 150 450 2,38

Gly-EtDA.

Г уг-DA 1 a-G 1 y-Phe -D Le u-G X y-G 1 y.

CH^-CO-GIy-EtDA' Гуг-DaIa-GXy-Phe-DLeu-GXy-GIy-)

HOOC-CH2-CH2-CO-GIy-2tDAJ (Xbl) '>1000° »1000°

ryr-DAXa-CXy-Phe-DLeu (DADLE 18 3,5 0,95

Морфин 5,6

Из данных приведенных в таблице видно, что изменение структу-ы молекулы dadle удлинением и изменением вклада функциональных рупп приводит к изменению сродства и селективности пептидов. Все овые аналоги, за исключением пептида xxi обладают опиоидной ак-ивностью агонистического характера. Удлинение молекулы DADLE эдификатором в виде -Gly-GXy-EtDA-Giy-H- приводит к некоторому энижению сродства пептида ХХХУН к о -центрам связывания опио-цных рецепторов. Дальнейшие изменения в модифицированной части эптида приводящие к понижению основности пептидов повлекли за со-)й снижение сродства этих пептидов к центрам связывания опиоидных гцепторов, вплоть до полного исчезновения. Кроме того, во всех ■учаях,когда модифицированные пептиды обладают опиоидной актив->стью происходит инверсия селективности и пептид из <Г -селектив-iro превращается в jv -селективный. Это происходит за счет поженил у -активности и еще более сильного понижения J* -активно-и пептидов,что свидетельствует в пользу того,что структура <Р -нтров связывания опиоидных рецепторов являются более жесткими по авнению с f -центрами, поскольку не очень сильное изменение руктуры лиганда поводит к значительному изменению активности.

вплоть до полного исчезновения.

5.3. Опиоидная активность димерных и химерных аналогов уз-казоморфина-5 и РА1а^ ДЕец-* -энкефалина-бивалентных лигандов опиоид-ных рецепторов.

Исследование димернкх и химерных аналогов опиоидных пептидов радиорецепторным методом анализа показало,что все синтезированные пептиды обладают опиоидной активностью агонистического характера. Как видно из приведенных в таблице 3 данных, привитие к молекуле уЗ -казоморфина-5 посредством соединительного мостика ЭАХа2 , ВЬец5 -энкефалина (ХЫ1) приводит к уменьшению сродства новой молекулы к д -центрам связывания опиоидных рецепторов г.о сравнению с таковой эабье входящего в состав данной молекулы.Одновременно с понижением о -активности наблюдается некоторое повышение сродства к у -центрам связывания опиоидных рецепторов по сравнению с ^ -каэомор<{ином-5. Это можно объяснить вкладом "дадлиево-го" конца молекулы обладающего одновременно и достаточно высокой Н -активностью.

7 Таблица 3. •

ПЕПТИД

! ИКзд.н.Моль! 2D50 j yV- I ;H. моль/мыль

Tyr-DAla-Gly-Phe-DLeu-Oly-Gly-EtDA*.

Tyr-DAla-Gly-Pho-DLeu-Gly- ÍJ£iIV) 84

Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Gly-StDA.—

Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-J 191 >10000

Tyr-DAla-Gly-Phe-DLsu-G ly-G ly-StDA.,

Tyr-Pro-Phe-Pro-GlyJ (XLII) 50 20 Tyr-DAla-Gly-Phe-Gly-EtDA»,

(хых1) 41 67

Tyr-Pro-Phe-Pro-G ly-J

DADLE

jb -казомор^ин-5 Морфин

18 3,5 296 >10000

4,95

4,03

0,47

0,072

0,95

43,12 5,6

В случае соединения xliii включающего вместо молекулы dadle его укороченный аналог Tyr-DAla-Gly-rhe-, ft -активность химерной молекулы еще ниже и если соединение xlii имеет большее сродство к $ -рецепторам,го химерный аналог щи обладает более

высоким сродством к jt -рецепторам,поскольку и молекула j3 -ка-эоморф<на-5 и укороченного аналога ;.dadxe являются J4-селективными, с той разницей, что /3 -казоиорфин-б является более селективным Д'-лигаццом.

Димерные аналоги xliv и xlv составлены из одинаковых пептидов являющихся либо у- (xlv), либо ¿Г- селективным лигандами (xliv) опиоидных рецепторов. В данном случае наблюдается интересное, неожиданное явление: соединение xliv несмотря на то,что состоит только из S-селективных составляющих приобретает большую л -активность, и таким образом становится f -селективным лигандом. Это происходит за счет понижения у -активности и еще большего понижедоя S-активности в результате "сшивания" двух молекул dable . Димерный аналог xlv подученный в результате сливания двух молекул Ji -казоморфина-5 сохраняет исходный уровень f -селективности присущей já -казомор5ину-5. При этом наблюдается усиление сродства в 1,6 раза.

Поскольку опиоидная активность димерных и химерных аналогов не превышает активности исходных соединений,составляюдох эти соединения, можно сделать предположение о недостаточности длины свя эующего мостка для одновременного взаимодействия этих молекул обейт концами с соответствующими определенному типу центров связывания опиоидиых рецепторов (табл.3)«поскольку при достаточности длины твких молекул возможно их связывание одновременно с двумя центрами, которое должно привести к росту сродства примерно на порядок.

б.Исследование анальгетической активности пептидов.

Одной из важнейших задач преследуемых химиками синтетиками является создание эффективного фармакологически активного препарата, обладающего активностью, которая дает возможность заменить широко используемые наркотические анальгетики группы морфина.

С этой целью синтезированные нами пептида были проверены на анальгетаческую активность.

Анальгетаческую активность пептидов определяли тестами "tail pinch" (прижатие хвоста) и "Hot plate" (горячая пластина) на мышах линии "В1аск" интрацистеральнм* введением препаратов?

Исследования проводились на кафедре фармакологии I ШИ им.И.И. Сеченова совместно с О.Н.Чиченковш.

бЛ.Анальгетическая активность аналогов ^3-каэомор<?ина-5.

Изменение структуры В -каэоморфша-5 по карбоксильному концу модификатором - im-CHg-CHg-NH-Gly-H не ведет к существенному изменения анальгетической активности. Соединения XX и XXII обладают почти одинаковой анальгетической активностью. Однако появление карбоксильной группы на модифицированном конце удлиненной молекулы резко повышает анальгетаческую активность (табл.1)

Таким образом соединение ХХ1У обладает анальгетической активностью превьшающую в 200 раз активность р -казоморфина-б и почти в 30 раз анальгетаческую активность морфина.

6,2 Анальгетаческая активность аналогов рА1а2,РЪец-' -энкефалина.

Хотя новые модифицированные.аналоги DAla2 »DLeu^ -энкефали-на обладают анальгетической активностью на уровне морфина, они обладают меньшей анальгетической активность» по сравнению с исход-huí DADLE (табл.2). Если в случае аналогов -каэоморфина-б, аналог с удлиненной молекулой имеющий на конце -ОЗОН группу проявляет повышенную, анальгетическую активность, то аналогичная модификация DAla2 ,DLeu^ -энкефалина приводит к противоположному результату - потере биологической активности.

б.З.Анальгетаческая активность димерных и химерных аналогов опиоидных пептидов.

Бифункциональные аналоги опиоидных пептидов проявили достаточно высокую анальгетаческую активность (табл.3). Все модификации направленные на димеризацию с участием jb -казомор<|ина-5 ведут к усилению анальгетической активности по сравнению с исходит р -каэомор$ином-5 и даже по сравнению с морфином (xlii.xliii, Такого однозначного изменения анальгетической активности не наблюдается с участием DAla2 ,DLeu^ -энкефалина: если химерные аналоги ХЫ1 и тт.ттг обладают поваленной активностью, то димер состоящий только из аминокислотной последовательности входящей в состав dadle обладает анальгетической активностью примерно в 5 раз меньше активности dadle.

Самши активнши среди бивалентных лигандов оказались химерные аналоги. По тесту "tail pinch" соединение XLIII обладает анальгетической активностью примерно в 80 раз превышающую актив-

нОсть морфина, более чем в 10 раз dadle и в 600 раз анальгетичес-кую активность ^3-каэоморЗина-5, в мольных отношениях. Соединение Xiii, соответственно обладает активностью превышающую таковую морфша, dadle и J3 -казоморфша-э в 12; 2 и 90 раз.

Следует отметить, что химерный аналог xliii в 6 раз активнее другого химерного аналога (xxii).

Б результате изучения анальгетической и опиоидной активности, синтезированных нами пептидов, и их сопоставлении в лагри^мичес -ких координатах была обнаружена хорошая корреляция между f -опиоидной и анальгетической активностью.Корреляция между <Р-активностью и способностью пептидов к анальгезии отсутствует. Данные корреляционного анализа свидетельствуют, о том,что анальгетичес-кий ответ в ряду синтезированнътс нами соединений,опосредуется через у^-опиоидные рецепторы.

6.4.Исследование кинетической закономерности изменения анальгетической активности препаратов.

Важнъм этапом в исследовании новых препаратов является анализ их формакодинамических свойств, т.е. изменение их фармакологической активности во времени. В связи с этом нами была'изучена фармакодинамика анальгетической активности пептидов, проявивших достаточно высокую анальгутическую активность.Фармакологический анализ проводили по тесту "горячая пластинка"«используя уравнение: а

щ -А™* - - t + Skk.

1-гт- т J-

где AJnax -максимальный анальгетический эффект; J- -параметр,соответствующий концентрации дающей половину максимального ответа;

Мо -исходная концентрация веиества; f-параметр,характеризующий скорость биодеградации или выделения вещества из организма.

Поскольку наиболее яркими и интересндак анальгетическими препаратами оказались химерные аналоги xlii ихыи , они били выбраны в качестве объекта изучения фармакодинамики препаратов. В качестве сравнения изучали динамику изменения анальгетической активности димерных аналогов xliv и xlv ,а также исходных dadle и В -казоморфина-5 (ítoc.I).

Анализ кинетических кривых показывает,что синтезированные нами пептиды обладают пролонгированной анальгетической активностью по.сравнению с исходными пептидами,составляющими данные аналоги-.

параметр т для пептида ХЫ1 составляет 15,6 мин, для щи 14 мин, а для ваоье всего 6,6 мин, т.е. пептиды хьи и ШП более чем в два раза медленнее выводятся из организма.

Поскольку препараты тт.тт и хин оказались значительно активнее исходных соединений, были поставлены опыты по выявлению аддитивности вклада исходных соединений на анальгетическую активность последних и показано, что вксокая активность и пролонгированное» действия синтезированных нами пептидов хых и хыи не является следствием аддитивности вклада исходных составляющих, а главны* образом, является следствием структурных особенностей пептидов.

20 40 60 80 100 120 .140

t, мин

Btc.I. Фармакодинатка анальгетической активности. —о— -смесь dadle + 0 -каэоморфш-Ь доза (2-»40) мкг/мыпь

—•--jJ -казоморфин-5, доза 40 мкг/мышь

—Ó--DADLE » Д°за 2 мкг/мышь

—&--пептид хтлтг » Дозе 2 мкг/мышь

—о--пептид (XLV) . доза 40 мкг/мышь

ВЫВОДЫ:

1. Разработана методика избирательного синтеза н:,1г' -глициновых производных этилендиамина.

2. На основе эталендааминовых производных глицина классическими методами синтезированы:

- новые модифицированные аналоги р -казоморфина-5 и ВА1а2, ВЬеи-5 - энкефалина;

- химерные аналоги р, -казоморфина-5 и СА1аг,Меи5 -энкефалина;

- новые химерные аналоги опиоидных пептидов, состояпдах одновременно из р -казоморфина-5 и БА1а2. БЬви5 -энкефалина.

3. Исследована опиоидная акговность синтезированных пептидов и показано, что:

-опиоидная активность синтезированных пептидов имеет агонисти-ческий характер;

- увеличение длины молекулы р -казоморфина-5 с одновременна« усилением основности не приводит к заметному изменению сродства и селективности, но удлинение молекулы с сохранением кислотно-основных свойств приводит к резкому увеличению сродства;

- аналогичное модификации ЮАХа2, ВЬеи5 -энкефалина влекут за собой обращение селективности и понижение сродства к центрам связывания;

- димеризация лальз посредством триглицинового производного этилендиамина приводит к обращению селективности и понижению степени сродства к центрам связывания;

- аналогичная димеризация р -казоморфина-5 влечет за собой усиление сродства при сохранении селективности;

- соединение молекулы р -казоморфина-5 с молекулой САБЫ посредством аналогичного мостика приводит к усилению у/ -селективности и потере <? -селективности по сравнении с исходными соединениями.

1. На основании опиоидных свойств бифункциональных аналогов сделано заключение о том, что расстояние между у- и центрами связывания больше длины синтезированных аналогов. ). Изучена анальгетическяя активность синтезированных аналогов - казоморфина - 5 и иальз и показано, что:

- удлинение молекулы р -казоморфина-5 с сохранением кислотно-основных свойств, а также его димеризация приводит к рез-

кому у сияете аившыпетической активности;

- аналоппиыв шцшфщироваюш молекул» DADLE приводят к обра тноцу реаушлящу — ¡понижению анальгетической активности;

- соедакше шшзаязрк ß -казоморфкна-5 с молекулой DADLE , а также с его дшццщинным аналогом резко усиливает анальге-тичесяув ажхмшжзпь химерных молекул.

6. На основе жатшввш ф^рмакодинамики анальгетической активности показано, чш> юигегезированные аналогу ß - казоморфина-5 и ВАШ обшщ—г ядяихонгорованной анальгетической активностью.

О снова« везвашягаты работы отражены в следующих публикациях:

1. Со Си ров EJL СЬипрря ША1а2 * DLeu^ ~ энкефадина и его поликон-денсацшя.//11е»4цтаи!Республиканской научно-теоретической кон-фереарш ютшвдгг ученых и специалистов, посвященная 60 летаю Тадоижставш,ч^£_ Душанбе ,1964.-с.64.

2. Coóipss HJSLjDassmoB <С.С. Синтез гадразидного производного

ß -вцимцфчц ,#?Гез.докл.Республиканской научно-практическое пффащрш ншлодых ученых и специалистов.-Душанбе, IS87.-c.S7.

3. Саидав С.С.„СМвдяш Щ.Н. Синтез [д2а2] . ¡Ala5]» [Arg6] -энкефа-лина.Теэ^вжжЛЪгад^ИликенскоЙ научно-практаческоЯ конференции «В]» jwiiim л специалистов. Посвященная 70 летаю Великого 0**я0ри_-Д5шюнбе,Т9в7.-с.Ъ4.

4. Khalümr аЬ.П.уЭДгГМтоу lí.U.,Zalteev S.V.,Yarfoloneev S.D., Chldwto> OJU ftrttrm aoid eeguene influence In analgetis neuropeptides ecttäseLty.//Ia Therapy «Ith emtno ecida and analoge: 1-«t ТвЬчтпщЦ;Ьопа1 Congress.-Viena,August 7-12 th,1989,

5. Собирав HJLДавпвшв UD.X. .Сеидов C.C. Исследование отоидной активное» сшганшнеских аналогов DAlo2 , DLeu** -знкефалина. //Тез.дожж. X СИшадиненного симпозиума биохимических обществ СССР-ГДР Ъшш ¡регуляции клеточной активности".-Ташкент. I909.-c.7I.

6. Собиров И.И. /¡няшт С.С. .Халиков В.Х. Синтез и анальгетичес-кие цваям втиг (бифункциональных аналогов опиоидных септа-дов//Тп дал НЬютшюзного симпозиума по химии пептидов.-Bjra. I990.-c.73.

7. Собиров М.М..Халиков Ш.Х.»Зайцев С.В.,Саидов С.С.«Варфоломеев С.Д. Синтез и исследование опиоидной активности модифицированных аналогов рА1а2 • ЗЬец5 -энкефалина//Химия природных соединений.1989.У6.-с.858-859.

8. Собиров М.М.,Халиков 13.X. .Зайцев С.В.,Саидов С.С.,Варфоломеев С.Д. Синтез и исследование опиоидной активном* аналогов

£ -каэомор^ина-5 //Химия природных соединений.1990.У4.

9. Собиров М.М.,Халиков Ш.Х.«Зайцев С.В.,Саидов С.С.,Варфоломеев С.Д. Синтез и исследование опиоидной активности бифункциональных аналогов нейропептидов вктачаюпих у- и <Г -лигандн. //Вестник МГУ,серия: химия.-1990.т.31,к3.-с.321-323.

Подписано в печать 23/ЛЫ990 г. Заказ 120. КЛ 02156. Тира« 100 экэ. Печ.Л.$.60x84/16-1,5* Уч.чиэд.л. 1,0..

Ротапринт НУ им,В.ИЛшща,Дуааяде*увЛавути,2