СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ГРАМИЦИДИНА А И ЕГО АНАЛОГОВ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

л ^ <3 /Х-ЛЛЕАДШИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ БИООРГАШЧЕСКОЙ ШИК вн. М.М.ШЕМЯКИНА

На правах рукоцжсг

НЕДЕЛЬ Елена Някодаевкв

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ГРАЫИВДШНА. А И ЕГО АНАЛОГОВ

(02.00.10 Химия прирадшшс в физиологическЕ актЕванз. веществ) '

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учевоЁ степени каядЕдата хюдоескгх наук

Москва - 1976

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИООРҐАНИЧБСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

Ш В П Е Л Ь Елена Николаевна

синтез и ИЗУЧЕНИЕ ГРАМИЦИДИНА Л И ЕГО АНАЛОГОВ

<02.00.10 Химия природных я физиологически активных вешеств)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

сУ?

Москва - 1576

Работа шполнена в ¡'Інституте биооргаиической химии ли. И.М.Шешіеина Академии парс ССОР

Научный руководитель:

академик Ю.Овчинников

Офшша&хнш оппонеїшп

доктор ханическиж наук» проф. Ю.ГТ.Швачкин кандидат хишчеекнх наук,

ст. ц. с. К,С»Ефреаоэ

Бекудей предприятии - Институт молекулярной бяолоіящ

МІ ссе?

Защита да ос еу твій и состоится ^ І^иичі- !9*/6 і> з |^час на заседании Ученого Созата Института Окооргашчаской хашн им. М.М,Шемякина АН СССР по адресу: Цоскез, ул. Ваиилета ОЙ

С! диссертацией шжко оэкакоьяи-ъсн и йншш отеке Института бисорранычеокоЗ хпша им» Й.Н„Я!Єімк;ана АН С0№

Автореферат равоитп ¿3 197Г> г

Учешй ауіфетерь Института доктор хинкчееїшх ішук

В.А.Вавер

Актуальность пройдеш, 8 результате развития физнко-хіши-ческой биологии становится see более очевидным, что мвмброшшэ структуры играют важнейшую роль в жизнедеятельности клетка и субклеточных органелл. С их помощь» до с гага е тел онлхроцнзапая в пространственная организация огромного числа реакций и процессов в клетке. Поддержание химического состава внутриклеточное среды, преобразование энергии, регуляция п рецепдал, проведение нервного импульса и фотосинтез - таков неполный перечень многообразных функций мембранных систем. В любом из этих процессов очень валкую роль играет перенос через мембраны нейтральных или заряденних частиц, ионов или электронов. Лспмметрня полного состава мекду средой и клеткой и постоянство минерального состава клетки имеют важное функциональное значение. Поэтому возможность направленно изменять трансмеУбранные ионные потоки открывает широкие возможности для 'дальнейшего углубленного изучения самых разнообразных процессов, протекающих в клетках, а также играет существенную роль в ликвидации многих патологических состояние. Среди соединений, обладающих способностью регулировать трансмембранний транспорт ионов, особое место занимают пептидные антибиотики грамицидина А* В и С, поскольку они могут служить уникальной моделью нервного канала. Эта антибиотики при очень низкой концентрации (начиная с ІСГ*'" моль/л) способны увеличивать проницаемость мембран душ протонов и иовов одновалентних металлов, не проявляя, однако, при этом ионной специфичности. В настоящее время очевидно, что способность грамицидина А увеличивать ионную проницаемость связана с особенностью его вторичной структуры. Существует две гипотезы о пространст-

веииои отроения грачадндинов в непсдярной среде, поскольку именно эта ореда хорошо иодедшрует гидрофобную чаоть биолой-ншс мембран.

С одной стороны, йсходя из лранципа максимального числа водородных связей и образования на мембране устойчивого димера с линовальной иалекулярной поверхностью данной 30-50 А {равное толщине бислойвой мембрани), Урри предложил для функционирующего в мембране грамицидина приндашгалыю ноше структуры, названные ТС^^-спиралями (рис. I). - . ■

Рно, I.. Схематическое изображение димера "голова к голове" грамицидина А в коиформащш ТГб ^^-спнрцлн

Ооновная пептидная цепь в этих структурах принимает оиирадьную кокфоршцис, однако» в отличив от других спиральных структур

(СІ-« р-. У» или ТТ-опиралой) . где амядпые карбондлышэ группы ориеатироваїш в одном направлении вдольоси симметрии» в ТІ^^-коиформацпях грашциданов карболшш расположены вдоль цепи антипараллелъно, т.о. СО-грушш ь-амянокисл отпых остатков орке втировацы вдоль оси спирали по направлению к С-концу, а о оотпататвувщие грущш в-остатков - к н-концу. Такой принцип Построения спирали необходим ио-ва чередования Ь в п-коыфи-гурвдіИ аьовдокис лотшд остатков в молекуле грамицидина, дм того чтобн йзбеяать стеричеоких ватруднепий, воэтщапвдх при включении в обычные спирали остатки о-аминокислот. Теоретически возмовш'четкрв типа спиралей« ТС4^^, ТЕб(Ь(1)), ТХ8(1, ■ и ТТ?°(1, о) 0 числом остатков на виток 4, 6, 8 и 10 соответственно. При этом изменяется длина и диаметр внутренней полости дкмера. Наиболее вероятна структура"П:^Ь(І)) -спирали (рис. I), так' как длшга этого дамера (25-30 Л), соответствует толщине гякбргщы, а дааметр внутренней полости (~4 А) достаточен для ефективного взаимодействия с конами. Система внутримолекулярних водородных связей построена по типу параллельной /3-ч;трун-туры. Противоположная ориентация соседних омиднах фрагментов ооэдает предпосылки к эффективной ассоциации типа "голова к голове" или "хвост к хвосту" в результате образования нескольких ыезшолекуляргагс водородных связей, построеных по типу антигцэраллелъной £3-структури.

В 1974 году была выдвинута новая гипотеза о возможности существования грамицидина в неполярної) сред« в в»де двойной

спнраля, где две молекулы антибиотика располагаются вдоль общеИ оси, будучи скреЕленншш не»молекулярной параллельной влв а непараллельной /З-водорсщиой связью типа "окладчатыЯ лиот" (рво. 2).

врЯ двойной спирали грамицидина А.

Иа^ь рабо^д. Экспериментальные доказательства в пользу вжв против предложенных моделер7_^хорые в значительной кере остаютоя гипотетическими, можно получить путем

направленного .синтеза и ^яэико - химических исследований модельных аналогов природного антибиотика, поскольку параметры соответотвуыцих пространственных форм (длина "кана- . ла", число амінокислотних остатков в одном витка упирали и т.д.) определяются природой и конфигурацией аминокислотных остатков его псшшептндной цепи. С «той целью был осуществлен синтез грамицидина А и ряда его аналогов, в которых намеренно были нарушены структурные особенности, присущие природной молекуле, а именно, чередование конфигураций и нечетное число аминокислотных остатков. Как было установлено ранее (в со- . . »местной роботе со Ст. Иордановим), тринадцати- и одинадцати-члешшо аналог)! обладам; сравнимой с природным антибиотиком биологической актиініоотью, Поэтому интересно было узнать, будут ли активны дЬвнадр;ати->, Четырнадцати, шестнадцати- а семнадщагичлендае пептиды. Тп'к, в аналогах (2) и (3) (табл. I) пропущено по одной аминокислоте. а у аналога (4) - три. Такая

Таблица I

ГТдмйцмнн А и его «налог«

t ї з « ї е т в 9-ю и іг tj м і».

L bDLDt.BLDI.B tOL

1. tlC6-V.l-01j-Al»-b»»-Al»-Y»l-T«l-V»l -TJTP-Uu- Ггр-Ь» V- ТГр-Ыи-ТГР-КН {CHjJjOH

2. HCO-T. 1-01j-Al »і і Al .~V«i-»»!-*• l-Trf-b*v-Trt~Ltv-Trt-t, u-tTP-NH <CHj )2olt

3. nio-iti-aij-їли- и.»-*«w»l-*»i-tr s*u«- ti-p- и<>-тт р-кн <снг)E«t -

i. BCO-TnI-Hy . .. . T«l-V«]-T» l-Tfp-L.u-Trp-L.u-rrp-b.il- ffР-ШГ ()?Oil

g, HCO-Va 1-01 jr-$tl-b*ii-JCil-igK.Tel-titt-ert>-I*u-Trp-I*«-Tr P- L«u-rrp-BH (СИг ) гШ HCO-f.l-OIj-Al.-L.u-Al.-t.i-t.l-V.l-Trp-L. u-Trp-L.n-ftt.-t*u-Trfr-lW ( CH£ ) jQH

7. JCO-Ul-Ql T-AI»-L.n-AI«-Tal-T«l-V»l-Cl ^-Ттп-Тш-Ідц-Іги-Іди-ТГО-ИВ ( ЄН. ) .ОН

і ■ 'S

8. HGO-rel-air-А1е-І*и-Л1»-Vtl-ЗД-ТеІ-ОД-Ттр- Іли-їгр-1..и-*гр-1.и-*»т-1ш (СКг) гОН

„ t

9 , MCa-L.u-T»l-aiT-AIiL-l<u-Al«-t«l-T.l -Т. 1-Ti-f—1.и-їгр-Ь»и-Тгі>.1«и-Тгі>-КН tOBj)jO<(

10. MC0-T»l-01y-Al»-Le>>-M«-Tal-y.l-V.l-T3'P-Leu-trp-b.u-Tri-Leu-TrC~L« u-^p-ifHi CM , ),OH

модификация привела к нарушении чередования Ь а р-оотвтков аминокислот. В аналогах (В) и (9) пептидная цепь увеличена на один остаток в середине молекулы н о Ы-конца. что привело к образование гексадекапептадов, причем в аналоге (8) произошло нарушение чередования конфигураций, а в аналоге (9) . - нет.

Гептадекапептид (10) шіеет в шестнадцатой о семнадцатом положениях еще одну пару аминокислот р-Ьви-Ь-ігр. Соедияе-іия (5)« (6) н (7) представляют собой пентадевапевтида, в структурах которых произведена ваыепа одних аминокислотных остатков на другие о нарушением чередования конфигураций (7) я'без нарушения - (Б) и (6). Аналог (5) шіевт более сгаадвт-рнчное отроение* что било доотигцуто заменой остатков Ь -ада—, шна в пололсекиях три и пять на остатки ь -валпна, и остатков в-валина в положениях шесть в воседо на п-лейдан* Другой пентадекапептнд (6) отличается от молекулы природного антибиотика одной ашшоклслотов в тринадцатом положения.

СИНТЕЗ ГРАМЩИДИНА. А И ЕГО АНАЛОГОВ

Синтез пентадекапептида грамицидина А (I), представленные на схемах I и 2, сил осуществлен конденсацией н-концевого н-форшлпентапептида (ІЗ) я С-концевого зтанодамвда декапептида (18) дициклогексилкарбодоиыадшш методом в присутствии трех эквивалентов н-оксисукщшимида при киекой температуре* Из реакционной массы антибиотик выделяли по-

следовательной хрома тогрвфиеЯ на ионообменных смолах Вопег

(Н+) и 1x2 (НСО-) в 9С£-ном водном метаноле, па оефадоксе ш-?о о абсолютном ыетеноле, отбирали высокомолекулярную фракцию, рехродотогра$провали на колонках с окись» кремния и окисью атошния в системе растворителей хлороформ-втімацетат-отанол (градиентное вотирование). В связи с тем, что грамицидин А в неполярних средах присутствует в виде ассо-цщатов, очиатка на окиси кремния и окиси алюминия в втеука-&акной системе била недостаточна. Поэтому окончательную очиот-IV препарата проводили при хроматогр афнровз нии на окиси іїрем-ния в системе белэол-уксуснад кислота (градиентное элюирова-ние), в которой грамицидин А присутствует в виде мономера*

Синтез С-коицевого декапептида (18) (схема I) осуществлялся нос ле довательным нараадтагаїєм пептидной цепи о помощь» л-океисукпинимндішк э^яров н-Оензилоксикарбокиламинокислот. Однако, образование а?.гадной связи на стадиях нона- (15) и декапептида (17) проходило с трудом, а гидрсгенслпз бензил-оксикарбоннльноіі группы в соединениях (14) в (15) протекал с низкой скоростью. Поэтому дскаиентид (28) бил также получен конденсацией геПтопептида (19) и трипептида (20) (схема 2) ДИЦИКЛОГСКСШПСарбОДИЕШДНЫМ методом в присутствии її—оке ¡1с у к— цииимида при низкой температуре, и оказалоя полностью идентичным пептиду, полученному ступенчатым методом. В процессе -синтеза С-кокцевого этаясламида делапоитяда (17) грамицидина (схема I), после каждой стадии конденсация защищенные пептиды промывали 10^-цым раствором лимонной кислот», на-

Cxeua I

Чіт 1 t

U*la . » » »

tvil uni l-bt Р-И U14 Hw Uli» H* ІЛ| * 1 • t » 11 11 1» ti »

P-I'J)

mo^ljoi «(ta,),«

•un, І,«

•HiOUt/m

ama, >2« «(«її,» ■Мн,^»

■(HfljMal «мсцУНШ Wd^lJlMitl

«MU.^BMItl

Схема 2

UM ■>) L'Ut I.IM Ulla Mal ІЛЦ Mal Mit Ни W« blitlMH UH|)p

««21 1

ГТТ

MU^ljOI

м^и rnvm^jm

"»Vi"

""»"ffis

сшценлнм раствором бикарбонат* натрия, водой л хроматографи-ровади на оклсц кремния и оклей алюминия в системе хлороформ-э*влацегат-етанол (градиентное злдоравзняе). Такой метод очистка бил выбран ввиду того» что все трнпто$вн-содеркадое вептады оказались аморфишми и не поддавались кристаллизации. Дополнительной очистке подвергались также пептида со свободной аминогруппой (после удаления бензилоксикарбовильпой группы гидроге-волизои в метаноле над паллалиевым катализатор»)) на смоле Ооп*х 50^x2 (н+) • Со оменш пептида элшровали I и. в метаноле.

Тркпептид (30) (схема 2) бкл получен при ступенчатом наращивании пептидной цепи методом активированных а$йров. Для защити аминогруппы пепользовшш И-Зеязилоксикарбонвлъпую группировку* а карбоксильную группу защищали образованием трет.-бутилового в$яра, который легко гаяродвзовзли трифгор-улсусной кислотой, Удаление н-защитной группы с промежуточных соединенна проводит ¡гадрогенолязоы в метаноле над палладиевым катализатором, добавляя I моль уксусной кислоты для избежания образования дикстоштаераэяног. Защищенные пептиды очищала хроматографией на окиси кремния в системе гексан-бензол-уксусвая кислота (градиентное елгоирование).

в-Форшлпеятапептид (13) (схема X) бил получен конденсацией Ы-оксисукцишшидного эфира к-формил-ь—валил-глицпна (II) с трипептидом (12). В отличие от схемы, предложенной ранее Виткопом, в которой М-концевая формальная груша вводилась на последней стадии синтеза форми лпровшстем дезформид-

грамицядина уксусным ангидридои в цуравьаной кяслоте с после-дуишш ошлением з£ира, образовавшегося на спиртовой гадрок-силе этанолашдноЙ группы, мы вводили формальную группу, ио-пользуя ее в качестве к-Эащнтной грушш остатка Ь -валинз. Дипептид (II) (схема I) был получен конденсацией н-оксисук-цишмидногб эфира формил-ь-валина с глицином, карбоксильная группа которого била защищена солеобраэоваыаем (натриевая соль), Трипептид (12} (схема I) бил первоначально получен, исходя из метилового эфира аланина и Ы-оксисукцинимидных эмиров трет, -бутллоксикарбошлашнокислот. На стадии трипеп-тида метиловый эфир омыляяся I н.-растворои щелочи в метаноле. К сожалению, эта стадия не давала воспроизводимых результатов, и, кроме того, все промежуточные защищенные*пептиды необходимо было кристаллизовать или очищать колоночной хроматографией* Поэтому, пептид (12) (схема 2) был синтезирован о использованием с еле обра з ования для защиты карбоксильной группы второго компонента, что позволяло получить на каждой стадии образования пептидной связи хршатографычески чистые пептиды и избежать стадии омылении.

Для получения аналогов (2), (3) и (9), отличашщхся от природного антибиотика строением н-концевого фрагмента, был осуществлен синтез двух тетрапептидов (35) и (21) и гексапеп-тида (22) (схема 3)» Тетрапептиды (35) и (21) были получены конденсацией Ы-окоисукцинимидного эфзра н-форкплдкпептида (II) с дипепгидами (23) и (24). Последние были получены, исходя из Ы-окоисукцикимидных аваров трет.-бутклокоикарбонил-аминокислот; карбоксильную группу второго компонента защищали

Схема 3

О-Ыи^

нсо нее

Вк Вое ОЗи И ОЭч Н он он ОН Вес ови (25) И Во« Вое 03ц К ОЗи И »»■II У

НСО »СО всо нсо

<09иП1) м -—

ссявоблаэованяем о бикарбонатом натрия или пиридином. Гекса-пептид (22) получали конденсацией Ы **окся су иди шшидшого эфира Ы-формилтряпептида (25) о трипептидом (12) в пиридине. Синтез тряпептяда (25) проводили, нехода из .Н-охсисукцанямидных эфиров тре т.-бутилокси карбониламинокис лот или Ы-^ормилакино-кислот, о использованием ссяеобразования дая защиты карбоксильной группа второго компонента. Все пептиды со свободной карбоксильной группой выделяли из реакционной массы, после проведения реакции конденсации, применяя ионообменную смолу Юсигезс 1x2 (Исоу).Со смолы пептиды елшровали I н. муравьиной кислотой.

Аналоги (4) и (5) получали, исходя из Н-оксясукцтщмид-ного эфира 11-форшлдипептида (II) и атанодамяда декапенткда (18) или этаноламида тридекапептида (26) (схема 4). Реакцию

проводили а абсолютном диме тилфор&а ми де при коиіштной теиаера-■¿•уре в течение 411 часоі). Нз реакционной шссы конечные продукту выделяли последова тельнсй хроматографией через ивнообмеп-шіе сиолн 5№г2 (в+), 1x2 (исо^") а 9С$-яом метаноле,

гель-фкльтрацией через с ефа де тсс Ш-20 к метаноле а колоночной хроматографії ей иа окиси кремния и овне и алжминия з системах хлороформ-зтилацетат-этамол и бензол-уксусная кислота (градиентное элаироаание). Этяисламид тршдекйиептидэ (26) бил получав ступенчатым наравдіваияем пептидной цепи с Ы-кокца

ьієтодом ы-оксисукш!щмндньпс эфиров м~б внзмд окс ц кар б о ш1л-

амииокислот. В качестве С-защатной группи второго компонента использовали остаток зтанолашна, как и в молекуле природного а яти сій етика, ЛІ з ялсксшшро шил ы і ую группу удаляли гядро-ї-енолааем п метаноле над па.иадиевьи каталязаторок в течение 12—10 чаоов при комнатной температуре. Пептида со свободной аминогрунпоВ-подвергались догюлїштельиоіі очистке на ионообменной скопе г'оигех 50іух2 (Цч)« Со смолы пептиди сьїіівз.ш ін. аммиаком в метаноле. В процессе получения этаноламяда трид»зкапе пти да (26) после ка-здой стадія конденсации пептида из реак-даониой массы выделяли- каяолочзюй ;фгш<іїоі'рв;ііїеь! на окиси кремнші я окиси алтщвт в окстеш* гл о о оформ-э т ил а цз т а т-э г а -нол (градиентное вотирование).

¿налог (й) отличается от природного антибиотика даменоіі триптофана а тринадцатом Ш'шсййнйй на фе-шлалышк а спязн с этим бил осуществлен синтез гептапептида .(27) (схема '4), который Зате« КОНДеНСИрОГШЛСЛ <*, '¡фИПШТЯДОМ (20) , '!Т0 привело

-ІЗ-

Охгш 4

L-Ttl lilf

11-L.u)^ l-lrp (D-ltu t-Trp),

IKO ■ ICC'

ОЄц(11J

*H(OTj JjjOff rnKCHjljOfl

ra'c"; (HliCIfjJjW

Схема І)

1 - чі 'Пт V/It г ; *

3V

-. 'it í£h-l«U t-Ттрї-

t t

: С*» «

t -■о»! П -

І ЇЛі' -

- ît|uT

- Є ви1 ' СВч*

■ taut) H.

я» в=о

w«citI)Ian*>i

W(Cltj>?Ot

Схема Є

t-'J» ' «r L-ДД* 1>-I»i Л1» 1 l.-Vel tvv*l C"W 1тр? L-frjO-,

!

I * "

írjo(1i)4 -

-------кщ<згги«і

я образованию декапептида (28). После удаления Н-защитноЗ грухшн с декапептида (28) к койденоации с аентапептидрм (13) дациклогехсилкарбодаишдашы методом в присутствии избытка Ы-оксисукцйнзмида при низкой температуре бил получен аггалог (6). Выделение аналога проводили аналогично выделению грашца— дава А. Схема синтеза гептапептида (27), а также метода выделения промежуточных продуктов из реакционной массы те же, что и при синтезе гептапептпда (29), отвечающего последовательности грамицидине А,

Структуры аналогов (7) я (8) сильно отличатся ст структуры природного антибиотика. Алалог (7) ішеет и середине пеп-

глдяоЙ ценя нарушение чередования конягу рации и замену амино-

9 10 11

кислотных остатков ~аіу-і~з>гр-і#-Ггр; у аналога (8) тоже проведено нарушение структуры введением в девятом положения остатка глицина. Для получения этих аналогов йил осуществлен синтез тетрапентида (31) (схема 5), который конденсировали с гекеа-. пептядбм (32) (схема 6) в случае аналога (7) и о гептапептидом (30) (схема 5) в случае аналога (Ей, Синтез те трапе стида (ЗІ) проводили методой активированных Н-окс и су кцшдамядных э$аров, В качестве JM-заіадтной группы использовали бензалоксиїшрбанзль-ную группировку, а О-эещнтноЙ группой был выбран трет.-бу-тлловый эфирj последний расщепляли абосидатноЯ трифторуксус-но2 киолотой при комнатное температуре в течение 30 минут. Защищенные пептиды из реакционной массы выделяла хроматографией на окиок кремния в системе гекоан-бензол-втилацетат (градиентное элюирование). Снятие бенэилоксякарбонильной группы

проводили. гидрогеяолявом над палладиевым катализатором в метаноле в присутствии X моля уїзусноЙ кислоти в течение 6-12 часов при комнатной температуре.

Пептидная цепь гептадекапептида (10) увеличена на одну пару аминокислот -В-Ьеи-Ь-Тгр- с С-кокца, поэтому ДОЯ получения этого аналога бил проведен синтез нонапептида (33) (схема 2), который после последовательной конденсации о трипептидом (20) и с пентапеитидом (ІЗ) бші превращен в гептадекапептид (10). При синтезе нонапептида (33) била использованы метода , образования пептидной связи, выделения промежуточных продуктов из реакционной массы к снятия заидатшос групп те же, что и при синтеза аналогичного пептида, отвечающего С-коицевой последовательности грамицидина А. Конденсацию фрагментов проводили дицдклогексшгкарбодиймадо« о избытком Ы-оксяоукцини-ыэда в абсолютном даметилформашде при низкой температуре. Выделение чистих пептидов из реакционной массы проводили последовательной хроматографией через ионообменные смолы Вояех 50их2 (н+), 1x2 (ноо^"*) ,оефадеко ш-20, окись кремния и окись алюминия в системах хлороформ-зтилацетат-этанол и бензол-уксусная кислота (градиентное злшрование).

ЕИОДОГМЧЕСКИЁ ИСПЫТАНИЯ АНАЛОГОВ ГРАШВДЩЩА А

Сравнение антимикробной активности синтезированные - аналогов и природного грамицидина позволило еде раз подтвердить важность фиксированной длины полипептидной цени >; необходимость строгого чередования ь,в-кон$йіураций аминокислот-

них остатка.' в лянсйншс грамццндшшх. Оказалось, что четырнадцати- и двшгадцатцчленше аналоги неактивны, пентадекапеп-тид (5), который имеет модификацвю центральной части молеку-чы, потерял активность на два-три порядка. Небольшой активностью обладают гоксздекапелтнды (8) и (9) (табл. 2), причем, если в аналоге (8) произошло грубое нарушение последовательности, то в аналоге (9) пептидная цепь.увеличена на один аминокислот-

Таблица 2

Днтнмйкробкая активность греюгцидана Л и его еня-юго^

Соединение 51орН. года Мявизйш.яая котщеятрення Загс1пА ИХсг.Ьуво- ГввевНо нягйбярушад рост (у/да) Бас! Пив ИтеоЬ. Е, №. в«ЪШ1в рЫе! ео11 В

Грамицидин А О.ОО.1 0,0007- 0.0007- 0.0007- 1-2 г 10 10

СИНТ. -0.0015 -0.0015 -0.0015

ГрЭММЩИП Л 0.05-0.1 0,0007- 0.0007- 0,0007- 1-г г 10 ш

(Э^рия) -0.0015 -0.0015

15 ) го го О.Н 0.4-0.Я го го го

(В ) го г-4 2-4 4—а 20 го го

(9 ) го г г 1-г 20 20 го

1ШЙ остаток с Н-лоада без }щгут$}жя чередования кон^йгурчдаГ. Синтетический препарат грамицидина Л и образец природного грз-ггацидика (укртш "31(^8", США) обладают идентичном спектром антимикробного действия.

Параду с измерением антимцкроС»!;1]! активности ш приег'.'л сравнительное исследование гракмкдиаа Л к его аналогов ня

Таблица З

і^емолитичесная активность грамицидина А и что аналогов

Соединение Доза % ге- їШч^лл мнг/мл молиза ^ Соединение Доуа мкг/мд % гемолиза

Грашца-- Аналог

дш А (I) I 100 (5) 5

0,5 94,8 2,5 03,2

1 * 0,25 Э3.1 0,02 1,25 67,5 '0,3

0,125 75,9 0,625 О 1 il І к

0,0325 75,9, 0,313 £7,9

0,0312 62,0 Аналої1 40,0 ■:*ñ !

Ü.0I5G 6.? (9) 20,0 ■13,3

0,0078 4,5 10,0 40,0

Контроль 2,5 3,9 5,0 :г)» fï

(0,9{f 2,5 н, у

НаСП

.'ко. З, Графики зависимости % ге моля sa от концентраш. ; м

тлкз ( І—грашцвдіш Л, If-аналог 5, Ш-аналог Ö)

-І&-

гемолнтическую активность. В таблице 3 и на рис. З приведеш данные но гемолитической активности исследованных пептидов. При стандартном проведении опытов (время инкубации 2 часа) грамицидин А проявляет слабое гемолитическое действие по сравнению с действием грамицидина 5 , сапонина и воды {выход гемоглобина составляет 20$). Однако при увеличении времени инкубации до 16 часов антибиотик показывает высокую гемолитическую активность при очень низких концентрациях. Как видно из таблицу 3,активными оказались только два аналога« причем активность пентадекапептнда (5) равна 0,1 активности грамицидина А, а активность гексадекапептида (9) упала на три порядка. Как уае отмечалось во введеная" биологическая активность антибиотика тесно связана с его гонформациошшм соотояниеы. Поэтому, дня того чтобы объяснят: биологические свойства синтезированных аналогов мы предприняли их $язико-химическиє исследования.

адЗЖО-ОСИМЙЧВСКИЕ ШУШДОВДНШ' АНАЛОГОБ ГРАШЩДША к

В 1974 году в кашей совместной работе с Елаутоы была выдвинута гипотеза о том, что грг;шцидин А в неполярних средах находится в состоянии равное* сия между мономером и даме-ром, а не мономером, дамером, тримером и тетрамером, как это предполагали ранее. Было установ; єно, что четыре хроматограф— чеекде пятна, обнаруживаемые при тої послойной хроматографии на силикагеле в диоксане с небольшой доЗавкой води, являются четырьмя разными конформациями димера. Этот вывод был

сделан на' основании проведенных исследований методами КД-, Ш-, ЯМР-спектроскопии, намерения молекулярного веса выделенных препаративно в индивидуальном состоянии всех четырех димеров,грамицидина. Было проведено исследование кинетики агрегация» и тот факт, что скорости реагрегации индивидуальных димеров в равновесную смесь достаточно велики, позволил сделать вывод, что все водородные связи, участвующие в образовании дамера, являются межмолекулярними, В спектрах ИК была обнаружена интенсивная полоса связанных N11-груш при 3280 ом"1 и слабая полоса свободных групп при 3420 см-'1. Спектры КД димеров, снятые в диоксане, представлены на рис. 4 и количественное соотношение этих форм в равновесной смеси в таблице 4. Таблица 4

МЕТОД г —,— ФОРШ

I 2 3 4

Тонкослойная 16* 23% 46$ 14$

хроматография

I + 2 3 4

КД-спектры 200-250 нм - 46$ 42$ 13$

Спектры КД димеров (I) и (2) имеют очень близкие кривые, а спектр димера (4) является почти зеркальным отражением спектров димеров (I) и (2). Спектр КД димера (3) принципиально отличается от спектров других димеров, но он имеет ТОТ ЕЄ вид, что и спектр кристаллизованного из этанола грамивдяпна. ИК-спектры выделенных в индивидуальном состоянии димеров имеют

в области амид X сильную полосу около 1633 см"1» а дамер (3)» кроме того, имеет разрешенную компоненту при 1680 см™*. Из проведенных исследований авторы сделали оледуадие выгоды о конформавдошшх состояниях димеров. Димеры (X), (2) и (4) находятся в спиральной конформации с преобладанием межмолеку- ! лярвой параллельной /З-водородноЙ связи. Конформации димеров * (X) и (2) очень близки, в то время как у димера (4) спираль.

Рис. 4. Спектры КД четырех конформациоиных состояний грамицидина д, выделенных хроматографичееки.

вероятво, имеет противоподснгаое вращение. Дамари <1},(2) и (4) скорее всего находятся в конформации параллельной двойной опирали или ТЇ^^-спиралн.Димер (3], как полагают авторы, ■ находится в конформации антипараллельной двойней спирали. Этот вывод подтвервдаетоя полосой при 1680 см-* в ИК-спектрах, характерной ддя подобной структуры.

В нашей работе мы использовали большой набор аналогов Грамицидина А., из которых некоторые показали смещение равновесия в сторону образования отдельных даыеров грамицидина А. Это явление позволило научить концентрационную зависимость отдельных динаров, найти их константы дишризации. Была принята оледуидан схема исследования. Вое измерения спектров КД а поляризации флюоресценции проводились в широком диапазоне концентраций, который определялся о одной стороны ограничением по оптической плотности, накладываемым приборами а раствора-местью пептида, а о другой стороны - чувствительность» прибора. Даапааон концентраций обычно составлял КГ3 - Ю-5 и ддя даокеана, а для этанола . КГ2 - ІСГ5 М, Область намерений спектров КД 200 - 250 ни. Все приводимые спектри бши получены в равновесных условиях., *

В большинстве случаев при переходе от разбавленных растворов к более концентрированным набдгдаются существенные изменения кривых КД, связанные с ассоциацией пептидов. Анализ концентрационной зависимости позволяет судить о характере ассоциации, а параметры соответствующих кривых КД - о конформации как мономерных состояний, так и ассоциатор. Из всех

рессмотрекїчгс по вышеописанной схеме пептидов наибольший интерес представляет аналог (5), которые отличается от молекулы природного антибиотика измененной аминокислотной последовательностью в центральной части молекули. Этот аналог содеряпт -70^ дамера (4) и имеет константу дзмеривациа в даокоане такую же. как п грамицидин А (10®). До мнению Елаута и остр,« вероятными пространственными структурами даиера (4) грЩдяцнда-:іа А являются ТТ ^ ^-спираль или двойная спираль, в которых максимально воомокнос число межмолекулярннх водородных связей равно соответственно 6 я ~30, Высокое значение конотантида-»деривации, а также полученные наш следящие шгопервментальные дашше свидетельствуют в пользу реализации двойней спирали (рис. 5): антиподный характер кривых КД дамеров (3) и (4) согласуется с конформацией параллельной правой двойной ^-спи-рали; спектры КД аналога (5Ї (рио. 6-8) при низких концентрациях* отвечающих доминированию в растворе мономера» сильно отличагтея от спектров димера, преобладающего в области высоких концентраций; и, наконец, малые скорости превращения индивидуальных дилеров в их равновесную смесь свидетельствуют о протекании слояных конформацнонных переотроек мономер я^димер, необходимых дат образования двойной спирали.

Спектра КД аналога (9) напоминают спектры форм (її й (2)» но имеют приблизительно в два раза меньшую амплитуду (ряс. 9) и не могут бить описаны линейной комбинацией спектров димеров (1-4) грамицидина. Спектри этого аналога мало изменяются при разведении, однако в том же диапазоне концентраций с ее ростом

Рис. 5* Схематическое двобралеаиа даыера параллельной ■ двойное спирали грамицидина Л*

зависимости мономер ^дамер Лєот lg fj .,

і»

гур гад>

Ржо. 7. Спектри КД аналога (5) в етаноле и кривая зависямости мономера диме р Дє от І9Св

Рис. 8. Спектри КД аналога (5) в диок-сане [— найлппаемнй (100$ димер) и ---

раоочитаашв (форма 1+2 - 3 - 23£ я 4 - 77%)]

гю

220

230

240

-s ■ -г -І fací)

Рис. 9. Спектры КД аналога (9) в этаноле и кривая зависимости мономер ^димвр ДЄ от lg О.

о»а -

0,9

-5 -4 -3 -Z -1 гв с»

Рис, 10. Кривая зависимости мономсрт^ддиер d от îgC0 аналога

(9) в этаноле (о) и в дааксане (д)

воэрастает полярявощщ флюоресценция (рис. 10). Это явление говорит, о том, что дкмеравадая имеет место, но не проявляется по спектрам КД» т.е. кривые КД димера и мономера имеют один л тот же вид, или конформациошиа состояния мономера не претерпевают больших изменений при образовании димера. При измерении поляризация флюоресценция аналога (9)» начиная о концентрация КГ3 М происходит падение значений ПФ, что, по-видимому, свидетельствует об агрегати более выоокого порядка* Константа димериэащя этого аналоги на два порядка ниже, чем у грамицидина Л, Остальные аналоги имеют спектры КД, амплитуда которых

100% димера) и аналога (9) (нижняя кривая, 'С=1»1б,Ю"®М, 66% димера) в диокоане

Это можно объяснить тем, что произошло принципиальное разрушение структура природного антибиотика в этих аналогах.

Из ИН-спектров аналогов (5) и (9)» показанных на рис. II, видно, что они не имеют полосы 1680 см-1, характерной для формы (3), а в области амид П обнаруживается полоса (^1545 см-1), характерная дня спектров всех форм грамицидина.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен сиытёз природного антибиотика пеитадека-пеатвда грашщидина А и девяти его аналогов, отличающихся длиной пептидной цепи, составом аминокислот! а также чередованием конфигураций аминокислотных остатков.

2. Изучена антимикробная и гемолитическая активность синтезированного грамицидина А и его аналогов. Синтетический препарат антибиотика грамицидина А и образец природного грамицидина (фирма "З!^*", США) обладают идентичным опектром антимикробного действия. Из расоыотретшх аналогов сравнимой о грамицидином активность« обладают только аналога (5) я (9), активность остальных аналогов па несколько порядков ниже активности природного антибиотика.

3. На основании проведенных физико-химических исследований аналогов грамицидина А методами ИХ-, КД- и Пф-спектроскопии, измерения констант двмериаацаи аналогов, юсевцих повышенное содержание отдельных форм грамицидина л, бил сделан вывод о реализации у димера (4) грамицидина Л конформации параллельной 3~дбойной спирали.

t *

Основные результата диссертации изложены в следу$лг<их

статьях:

1. Hiroshuitov A.Z., lordanov St., Stiepel B.W., Ivßüo» V.S., Qvühinnikov Yu.A» Proo. 12th Europ. Peptide Syrapoelrwi, ODS, 1972, ofp.341. .

s. Щепель E.H., Йорданов Ст., Иирсшников А.И., Иванов В.Т., Овчинников ß.A. Tessc^ 3-ero Всесоюзного скшсзнуиз гто хтгад пептидов и белков, 1974, стр. 171,

3. Sychev S.V., Sfcepel Е.Ч. , Sogan G.A., Iiti4?3ftri±lrov A*I. , Ivaaov V.'J., Qvehlnniteov Yu.A. Abstrects Sjrai>ß«.iuiii an physical chemiatry of protelna and pe-ptidea, ОЗЗП-Pranco, 1975, стр. 29.

4. Шепапь E.H., Ii орда nos Ст., Рябова И. Д., Мьгропшяхов АЛ!., Иванов В, Т., Овчинников Ю.А. Бш органа часка и хкыйя,

501 (1976).

5. Сачев С.В., Шзпелъ E.H., Йорданов Ст., Мзроашиков А.И., Когап Г.А., Иванов В.Т., Овчинников Ю.А, Тсааеы Iго симпозиума СССР-ФН* по 2ШЙ пептидов и белков, Х976, стр.72.

T-li6355 от 15/1У-76г. Зая.Г? 565-250 БРД станкозавода км.Сеpro Ордагениккдэе