Разработка метода доставки в клетки пептидо-нуклеиновых кислот в составе их композитов с наночастицами диоксида титана тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

9 15-2/181

АМИРХАНОВ РИНАТ НАРИМАНОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ДОСТАВКИ В КЛЕТКИ ПЕПТИДО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В СОСТАВЕ ИХ КОМПОЗИТОВ С НАНОЧАСТИЦАМИ ДИОКСИДА ТИТАНА

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

д.х.н., профессор Зарытова Валентина Филипповна

Официальные оппоненты:

Потапов Виктор Кузьмич, д.х.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, в.н.с.

Загребельный Станислав Николаевич, д.б.н., профессор Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», зав. сектором химии отдела химии и биологии.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова"

Защита состоится «5» ноября 2015 года в 10:00 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте www.niboch.nsc.ru

0 <-1 С" -.п.

Автореферат разослан «сО^

Ученый секретарь диссертац к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Активный поиск новых лекарственных препаратов и их широкое распространение позволили увеличить продолжительность человеческой жизни и уменьшить смертность при целом ряде заболеваний. К числу перспективных лекарственных препаратов относят нуклеиновые кислоты и их синтетические аналоги [1л е1 а1., 2013; ,1агуег е1 а!., 2014]. Их важным преимуществом по отношению к другим препаратам является быстрая и легкая адаптация лекарственных препаратов на основе нуклеиновых кислот или их коротких фрагментов за счёт изменения последовательности нуклеотидов к постоянно изменяющимся заболеваниям, например, вирусным или генетическим.

Основным препятствием на пути широкого применения НК в биомедицинских целях является неэффективная доставка НК в клетки-мишени и к самим мишеням внутри клетки. Доля естественного транспорта НК внутрь клетки очень низка, поэтому для их доставки требуется создание эффективных транспортных систем. Одним из путей решения этой проблемы может быть использование вирусных систем доставки, обладающих высокой трансфекционной активностью [СоШо е1 а1., 2010]. Однако вирусные векторы представляют потенциальную опасность для организма, так как могут вызывать нежелательные побочные эффекты: иммунный ответ, воспалительные реакции и даже канцерогенный эффект.

Широкое распространение для транспорта НК получили менее эффективные невирусные системы доставки. Одной из таких систем является транспорт нуклеиновых кислот в клетки с помощью наночастиц [Ре1каг е! а1., 2011], которая получила распространение благодаря развитию нанотехнологии.

Одним из перспективных аналогов НК, используемых в качестве антисенс препаратов, являются их пептидные аналоги - пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), в которых межнуклеотидный углеводофосфатный остов заменен на псевдопептидный. Благодаря наличию незаряженного скелета ПНК формируют более стабильные дуплексы с нуклеиновыми кислотами, чем, например, ДНК. Кроме того, ПНК устойчивы к действию клеточных нуклеаз и пептидаз [ОН^Ьапп й а1., 2009]. В связи с этим пептидные аналоги нуклеиновых кислот (ПНК), являются перспективными соединениями для разработки лекарственных препаратов на основе синтетических НК и их аналогов. Однако в случае ПНК также, как и в случае других НК, остаётся проблема, связанная с их неэффективной доставкой в клетки.

Целью данного исследования является разработка эффективного метода доставки в эукариотические клетки пептидо-нуклеиновых кислот в составе их композитов с наночастицами диоксида титана для эффективного и селективного воздействия ПНК на внутриклеточные нуклеиновые кислоты-мишени.

В ходе исследования будут решаться следующие задачи:

1. создать ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозиты, в которых пептидо-нуклеиновые кислоты в виде ДНК/ПНК дуплексов будут нековалентно и обратимо иммобилизованы на наночастицы ТЮг, покрытые полилизином (ТЮз'РЬ);

2. исследовать физико-химические свойства полученных нанокомпозитов;

3. оценить токсичность полученных "ПСЬ'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов в культуре клеток МБСК;

4. оценить способность полученных "ПСЪ'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов проникать в эукариотические клетки;

5. исследовать ингибирующее действие ПНК, доставленных в МОСК клетки в составе "ПСЬ'РЬ^ДНК/ПНК нанокомпозитов, на репродукцию вируса гриппа А (НЗШ).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Основным препятствием использования олигонуклеотидов и их аналогов в медицинской практике является отсутствие эффективных и нетоксичных систем их транспорта в клетки. В рамках данного исследования предложена и разработана новая эффективная система доставки пептидо-нуклеиновых кислот в эукариотические клетки, основанная на использовании их композитов с наночастицами диоксида титана.

2. Для создания предлагаемых ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов был разработан метод обратимой и контролируемой иммобилизации ПНК в виде ДНК/ПНК дуплексов на ТЮг наночастицах, покрытых полилизином ("ПСЬ РЬ). Фиксация ДНК/ПНК дуплексов на ТЮг наночастицах осуществлена за счёт электростатических взаимодействий между отрицательно заряженным остовом ДНК и положительно заряженным полилизином. Связь ПНК с нанокомпозитом осуществлена за счет комплементарных Уотсон-Криковских взаимодействий с ДНК.

3. Изучены физико-химические свойства созданных ТЮг'РЬ-ДНК/ПНК нанокомпозитов, исследована роль полилизина при диссоциации ДНК/ПНК дуплекса в растворе и в составе нанокомпозита.

4. Разработанная обратимая фиксация ПНК на наночастицах диоксида титана обеспечивает диссоциацию ПНК из состава ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов. Время высвобождения ПНК из нанокомпозита зависит от числа перекрывающихся комплементарных пар оснований в дуплексе ДНК/ПНК.

5. Созданные ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозиты проявляют слабую цитотоксичность.

6. Созданные ТЮз'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозиты проникают в клетки без использования трансфекционных реагентов.

7. На примере подавления размножения вируса гриппа А/ Аю1п/2/68 /НЗШ в клетках МОСК с помощью нанокомпозитов ТЮз'РЬ'ДНК/ПНК показано, что доставленные в составе нанокомпозитов ПНК эффективно и селективно взаимодействуют с внутриклеточной нуклеиновой кислотой-мишенью.

Научная новизна. В данной работе впервые разработан метод эффективной доставки ПНК в виде ДНК/ПНК дуплексов, иммобилизованных на наночастицах диоксида титана, покрытых полилизином, не требующий использования трансфекционных агентов. Созданные ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозиты не проявляют токсичности на модели клеток МОСК. ПНК, доставленная в зараженные вирусом гриппа А клетки предложенным способом, может выходить из состава носителя и проявлять высокую биологическую активность, что выражается в снижении титра вируса гриппа А в 500 раз.

Теоретическая и практическая значимость. В данном исследовании разработан новый эффективный метод доставки пептидо-нуклеиновых кислот в эукариотические клетки, основанный на использовании их композитов с наночастицами диоксида титана. Создание предлагаемых ТЮг'РЬ* ДНК/ПНК нанокомпозитов осуществлено благодаря разработке метода обратимой и контролируемой иммобилизации ПНК в виде ДНК/ПНК дуплексов на TiCh наночастицах, покрытых полилизином (TiCb'PL). Фиксация ДНК/ПНК дуплексов на ТЮ2 наночастицах осуществлена за счёт электростатических взаимодействий между отрицательно заряженным остовом ДНК (в составе ДНК/ПНК дуплексов) и положительно заряженным полилизином (в составе TiCh'PL).

Полученные результаты демонстрируют, что созданные ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозиты без использования трансфекционных реагентов и физических методов воздействия проникают в клетки и накапливаются в них; ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозиты не проявляют токсичности на модели клеток MDCK; ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозиты проявляют биологическое действие, выраженное в эффективном подавлении размножения вируса гриппа А/ Aichi/2/68 /H3N2 в клетках MDCK. Таким образом, показано, что ПНК, доставленная в клетки в составе ТЮг'РЬ* ДНК/ПНК нанокомпозитов, эффективно и селективно взаимодействуют с внутриклеточной мишенью.

Созданный метод доставки ПНК в клетки ранее не был описан в литературе и имеет широкую практическую значимость, поскольку может использоваться для подавления размножения не только вируса гриппа, но и других вирусов. Кроме того, разработанная методология может пригодиться при создании препаратов для лечения не только вирусных, но также других заболеваний, обусловленных наличием в организме измененных НК.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи в журнале «Биоорганическая химия». Материалы диссертации были представлены на российских конференциях с международным участием: Химическая биология - фундаментальные проблемы бионанотехнологии (Россия, Новосибирск, 2009), Rusnanotech. Международный форум по нанотехнологиям (Россия, Москва, 2009), Нанотехнологии в онкологии (Россия, Москва, 2009), XLVIII Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Россия, Новосибирск, 2010), Физико-химическая биология (Россия, Новосибирск, 2011), 50-я юбилейная международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Россия, Новосибирск, 2012), Международная конференция «Биология - наука XXI века» (Россия, Москва, 2012), Postgenomic Technology for Biomedicine (Россия, Новосибирск, 2012).

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 110 страницах, содержит 35 рисунков, 10 таблиц. Библиография включает 172 литературных источника.

Вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных выполнены лично автором. Исключение составили: анализ образцов методом конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопии выполнен совместно с Байбородиным С.И. (ИЦиГ СО РАН), работа с вирусом проведена совместно с Мазурковой Н.А.

(ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), анализ наночастиц диоксида титана методом малоуглового рентгеновского рассеяния выполнен Шикиной Н.В. (ИК СО РАН).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Иммобилизация ПНК в составе дуплекса ДНК/ПНК на наночастицах ТЮз, покрытых полилизином

Известно, что электрокинетический потенциал (^-потенциал) ТЮг наночастиц отрицателен при нейтральных или физиологических значениях рН 7-8 [Ко15окесЬа§!а й а1., 2008]. В нашем случае, среднее значение этой величины составило -34 мВ при рН 7.5. Это свойство наночастиц ТЮг позволяет эффективно иммобилизовать на их поверхности положительно заряженные поликатионы, например, полилизин, с образованием ТЮг'РЬ композита [Ьеуша е1 а1., 2012]. Связывание РЬ с ТЮз при этом нековалентное, но достаточно прочное. В литературе показано, что размер ТЮз'РЬ-ДНК композита (связь между РЬ и ДНК ковалентная) увеличивается по сравнению с размером свободных наночастиц ТЮг, диаметром ~ 5 нм, всего на 1-2 нм [Ьеуша й а1., 2012]. В нашем случае исходный размер наночастиц составил 5.4 нм по данным метода малоуглового рентгеновского рассеяния. Формируемый, таким образом, ТЮг'РЬ композит в нейтральных условиях содержит положительно заряженные аминогруппы лизина и может быть использован для электростатических взаимодействий с отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот.

Рис. 1. Схема иммобилизации ПНК в * + рь виде гибридного ДНК/ПНК дуплекса на

наночастицах ТЮг, покрытых полилизином РЬ. Знаком "+" I гк>- • • + + + + и обозначены положительные заряды на

+ - полилизине. Знаком "-" обозначены

I ■ г ■! I I отрицательные заряды на поверхности

днк наночастиц "ПО? и межнуклеотидных

■ I < ■ ■ г фосфатов ДНК.

к ,; во,!' + % ; I ткуръджпик 1 '

4

I

Поскольку молекулы ПНК не имеют заряда и не могут быть иммобилизованы на композите ТЮ2'РЬ напрямую, мы предложили проводить связывание ПНК с ТЮз'РЬ опосредованно, используя предформированный гибридный ДНК/ПНК дуплекс (Рис. 1). В данном случае присоединение ДНК/ПНК дуплекса к композиту ТЮз'РЬ осуществляли за счет электростатических взаимодействий отрицательно заряженных фосфатных групп ДНК (в составе дуплекса ДНК/ПНК) и положительно заряженных аминогрупп полилизина (в составе ТЮ2*РЬ). Прочность фиксации ПНК в составе полученного ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозита должна зависеть от числа перекрывающихся комплементарных пар в гибридном ДНК/ПНК дуплексе (или от термостабильности используемого ДНК/ПНК дуплекса) и при конструировании может легко регулироваться

изменением длины этого перекрывания. Чтобы проверить такое предположение были сконструированы 4 типа ДНК/ПНК дуплексов Р,, Рг, Рз, Р4 с числом перекрывания комплементарных пар оснований равным 10, 12, 14 и 16, соответственно (Таблица 1). Также в работе использовали ДНК/ДНК дуплексы 02, Оз, Э4 (Таблица 1) для экспериментов в растворе.

Таблица 1. Структуры ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов, использованных в заботе.

Олиго-мер Структура дуплекса Дуплекс Длина перекрывания, п.о. Tm, °С

ПНК, ДНК2 ncaactcca tatgccat= у77777с7 agttgaggta Г5' P, 10 51.0

ДНК, Днк2 5 caactccata7gcca71' '77777c7 agttgaggta p D, 10 34.3

ПНК, ДНКз ncaactcca ta tgcca7c y77777c7 agttgaggta tac5 P2 12 60.5

ДНК, ДНКз ycaactcca ta tgccAT3' y77777c7agttgaggta tac5 d2 12 42.8

ПНК, днк4 ncaactcca ta tgcca7c y77777c7 agttgaggta tacggp Рз 14 72.2

ДНК, ДНК4 5 caactccatatgccav y77777c7 agttgaggta tacgg5 d3 14 55.4

ПНК, ДНКз s caactcca ta tgcc at1 v agttgaggta tacggtac a75 p4 16 73.8

ДНК, днк5 5 caactcca ta tgcca ty yc7 agttgaggta tacggtacav d4 16 57.9

пнк2 ДНКб n gcaaaa gca GGGTAG Ac y77777cgttttcgtc5 p5 10 64.5

пнк2 ДНК7 sgcaaaa gca gggta ga c 3 77gcgttttcgtccca tcta775 p6 16 83.4

Жирным курсивом обозначены комплементарные перекрывания в дуплексах. Значения температур плавления Тт получены при концентрации дуплексов 2 мкМ в PBS (0.01 М КН2Р04, 0.14 М NaCl, рН 7.5). Ошибка измерений Тга составляет ± 0.5 °С. N- и С-концы цепей ПНК эквивалентны 5'- и З'-концам ДНК, соответственно. Дуплекс Р5 использовали в ходе экспериментов с вирусом гриппа А.

1.2. Оптимизация условий иммобилизации ДНК на наночастицах ТЮ2, покрытых полилизином

Эффективность иммобилизации НК напрямую связана с количеством аминогрупп полилизина в TiO:*PL композите. С целью выяснить какой вклад вносит этот параметр было изучено влияние мольного соотношения наночастиц ТЮ2 и полилизина PL на эффективность иммобилизации ДНК. Исследование

проводили в различных буферных системах при фиксированном 10-кратном мольном избытке ДНК относительно наночастиц TiCb, варьируя мольное соотношение PL/TiCb. Для оценки эффективности иммобилизации ДНК использовали соотношение количества суммарной ДНК и ДНК, не связавшейся с TiCb'PL композитом. Для того, чтобы определить количество не связавшейся ДНК, проводили осаждение сформированного "ПСЬ'РЬ'ДНК композита, затем отделяли супернатант и проводили измерение его оптической плотности.

Выяснили, что максимальная степень иммобилизации ДНК олигомера достигается при мольном соотношении PL/TiCb, равном 2:1, и составляет 8-9 нмоль/мг в PBS (0.01 М КН2Р04, 0.14 М NaCl, рН 7.5) или 27-30 нмоль/мг в TBS (0.01 М Tris-HCl, 0.14 М NaCl, рН 7.5) или в воде. Дальнейшее увеличение доли PL в TiCb'PL композите не приводит к увеличению степени иммобилизации. Вероятно, значительно меньшая ёмкость иммобилизации ДНК в PBS обусловлена наличием в растворе бидентантных лигандов, в роли которых выступают фосфат-анионы. Такие лиганды конкурируют с ДНК за сайты связывания с полилизином и из-за своего меньшего размера и большей степени свободы способны вытеснять ДНК.

Известно, что 1 мг наночастиц размером 5 нм содержит 8.3 нмоль [Rajh et al., 2004], т.е. исходя из полученных значений ёмкости иммобилизации следует, что в PBS на одну частицу приходится 1 молекула ДНК, а в TBS или Н2О 3-4 молекулы. Учитывая, что диаметр двойной спирали ДНК/ДНК или ДНК/ПНК дуплекса равен примерно 2.5 нм, что в 2 раза меньше диаметра наночастицы, тогда площадь поверхности дуплекса и наночастиц различается в 4 раза, следовательно, на одну частицу возможна посадка максимум четырёх дуплексов или эквивалентного (либо большего) количества молекул одноцепочечного олигонуклеотида.

Таким образом, на данном этапе работы был разработан метод эффективной иммобилизации молекул ДНК на TiCb'PL композите, а экспериментальная ёмкость созданного композита не превышает максимальную теоретическую ёмкость. Иммобилизация ДНК/ПНК дуплекса должна проходить аналогично, поскольку сформированный дуплекс также обладает отрицательным зарядом и способен взаимодействовать с полилизином.

2. Влияние полилизина на диссоциацию ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов в физиологическом растворе

Конструкция системы доставки в виде TiCb'PLVJHK/nHK композита предполагает свободный выход ПНК в раствор. Однако неизвестно какое влияние будет оказывать полилизин PL на диссоциацию ДНК/ПНК дуплекса в составе композита. В связи с этим важно было изучить и сравнить между собой влияние полилизина на диссоциацию ДНК/ПНК дуплексов в растворе и в составе Ti02'PL»flHK/nHK композита.

Сначала исследовали возможность термической денатурации ДНК/ПНК и, для сравнения, ДНК/ДНК дуплексов в растворе в присутствии PL (Рис. 2). Перед началом эксперимента получали ДНК/ДНК или ДНК/ПНК дуплексы, а затем добавляли PL. За процессом следили по изменению оптического поглощения соответствующих растворов.

О 20 40 60 80 200 0 20 40 60 80 100

Т, ®С Т, гС

Рис. 2. Кривые изменения оптического поглощения смеси ДНК/ДНК (а) и ДНК/ПНК олигомеров (б) в отсутствии (кривые 1) и в присутствии (кривые 2) полилизина РЬ в зависимости от температуры. Сплошные кривые получены при увеличении, а пунктирные - при уменьшении температуры. ДНК/ДНК (Б) и ДНК/ПНК (Р) дуплексы О4, Р4 с числом перекрывания комплементарных пар оснований равным 16. Аналогичные кривые были получены также для дуплексов 01, Рь Ог, Р2, Оз, Рз с числом перекрывания комплементарных пар оснований равным 10, 12 и 14.

Процесс диссоциации дуплекса обычно является обратимым. Доказательством обратимости служит совпадение формы кривых плавления дуплексной системы при повышении температуры, а затем при ее охлаждении. В отсутствие РЬ наблюдается обратимый процесс термической денатурации О и Р дуплексов, с одинаковым температурным переходом как на кривых, полученных при повышении температуры (диссоциация дуплексов) (Рис. 2, сплошные кривые 1), так и на кривых, полученных при снижении температуры (ассоциация дуплексов) (Рис. 2, пунктирные кривые 1). Однако при добавлении РЬ к растворам сформированных О или Р дуплексов наблюдается различный характер кривых в зависимости от типа дуплексов. В случае О дуплексов наличие РЬ приводит к постоянному уменьшению оптического поглощения, независимо от повышения (Рис. 2а, сплошная кривая 2) или понижения температуры (Рис. 2а, пунктирная кривая 2). В случае Р дуплексов добавление РЬ приводит к небольшому увеличению оптического поглощения с ростом температуры (Рис. 26, сплошная кривая 2), которое возвращается к своему исходному значению при уменьшении температуры (Рис. 26, пунктирная кривая 2). Однако в присутствии РЬ формы кривых зависимости оптического поглощения Р дуплексов при повышении и при понижении температуры не имеют четкого температурного перехода, характеризующего плавление дуплекса. Кривые не совпадают друг с другом и с кривыми плавления Р дуплексов в отсутствие полилизина.

Таким образом, показано, что полилизин в растворе препятствует нормальной диссоциации как О, так и Р дуплексов при изменении температуры.

Аномальный характер изменения оптического поглощения для О дуплексов в присутствии РЬ наблюдается не только для зависимости от температуры, но и для временной зависимости (Рис. 3).

16 п.н.

1.01

0.97

0.93

2

Р4. 16 п.н.

100 200 I, М1Ш

300

О

100 200 1, мин

Рис. 3. Кривые изменения оптического поглощения смеси ДНК/ДНК (а) и ДНК/ПНК олигомеров (б) в отсутствии (кривые 1) и в присутствии (кривые 2) полилизина РЬ в зависимости от времени при 37 °С. ДНК/ДНК (О) и ДНК/ПНК (Р) дуплексы Э4, Р4 с числом перекрывания комплементарных пар оснований равным 16. Аналогичные кривые были получены также для дуплексов Ок Рь Оз, Рз, Оз, Рз с числом перекрывания комплементарных пар оснований равным 10, 12 и 14.

В отсутствии РЬ значения оптического поглощения раствора Г) дуплексов практически не изменяются во времени (Рис. За, кривая 1), тогда как присутствие РЬ приводит к существенному уменьшению значений оптического поглощения (Рис. За, кривая 2). Добавление РЬ к Р дуплексам не приводит к существенному изменению значений оптического поглощения (Рис. 36, кривая 2).

3. Диссоциация ДНК/ПНК дуплексов, иммобилизованных на наночастицах ТЮг, покрытых полилизином. Зависимость от температуры

Для исследования влияния полилизина в составе нанокомпозитов на диссоциацию дуплексов были сконструированы модельные нанокомпозиты ТЮ2«РЬ*ДНК/ПНК, содержащие дуплексы Рь Р2, Рз и Р4 (Таблица 1) с числом перекрывания комплементарных пар оснований равным 10, 12, 14 и 16.

За процессом диссоциации ДНК/ПНК дуплексов наблюдали по десорбции ПНК из нанокомпозита ТЮз'РЬ'ДНК/ПНК в РВБ или ТВБ. Для этой цели использовали ДНК/"иПНК дуплекс, в котором ПиПНК содержит флуоресцентную метку. В процессе эксперимента проводили нагревание суспензии нанокомпозита в течение 10 мин при разных температурах в интервале от 20 до 90 °С, после чего образцы разбавляли соответствующим буфером, охлажденным до 0 °С, центрифугировали, при этом нанокомпозит выпадал в осадок, а диссоциировавшая ПНК оставалась в растворе. Проводили разделение осадка и супернатанта и оценивали содержание десорбированной от носителя н"ПНК в супернатанте. Степень десорбции ПНК определяли путем соотношения количества ПиПНК в супернатанте к общему количеству ПиПНК, использованной изначально для иммобилизации. По полученным данным строили кривые зависимости десорбции р|иПНК из нанокомпозита ТЮз'РЬ'Д! 1К/ПНК от температуры.

Получили кривую термической десорбции ИиПНК1 из состава нанокомпозита ТЮ2'РЬ-ДНК2/П11ПНК,. (Рис. 4, кривая 1). Видно, что кривая термической десорбции ПНК имеет характерный Б-образный вид, типичный для кривых плавления дуплексов в растворе (Рис. 2, кривые 1) с характерным температурным перегибом, соответствующим значению температуры плавления дуплекса.

Полученный вид кривой десорбции ИиГ1НК| свидетельствует, что осуществлена диссоциация ПиПНК| из состава нанокомпозита за счет денатурации иммобилизованного на нем дуплекса ДНКУ^ПНКь

£ so

üf &

^ I 70

s- Ь

0 га

2 а-

3 5 60

Ar а

1 I 50

о ^ 2> Р.

|40

•3-20 40 60 80 т.,°е

Рис. 4. Кривая десорбции ПиПНК] из нанокомпозита Ti02'PL«flHK2/FlunHKi (кривая 1) в зависимости от температуры, контроль с ИиПНК2, некомплементарной ДНКз (кривая 2). Образцы приготовлены в PBS. Мольное соотношение ТЮг/PL = 1:2.

Для дополнительного подтверждения характера десорбции (именно за счет диссоциации дуплекса), был проведён аналогичный эксперимент, в котором вместо последовательности ПНК1 была использована ПНК2 с некомплементарной последовательностью ^ссаааа оса ссс/ та с ас (Рис. 4, кривая 2). В этом случае зависимость интенсивности флуоресценции от температуры получена в виде прямой линии, то есть значения интенсивности флуоресценции не меняются с ростом температуры.

Кривые десорбции ИиПНК из нанокомпозитов в зависимости от температуры были получены для всех исследованных ДНК/ПНК дуплексов Р|, Р2, Рз и Р4 с числом перекрывания комплементарных пар оснований, равных 10, 12, 14 и 16, соответственно, иммобилизованных на ТЮг'РЬ композите (Рис. 5). Видно, что все кривые, независимо от числа перекрываний комплементарных пар оснований, имеют типичный вид кривых плавления с характерным температурным переходом в точке перегиба, соответствующей температуре плавления Тш дуплекса.

Как и в растворе величина Тш исследованных дуплексов в составе нанокомпозитов закономерно увеличивается с возрастанием числа перекрываний комплементарных пар оснований (Рис. 6), что коррелирует с данными полученными в растворе. Другими словами, чем прочнее дуплекс в растворе, тем стабильнее он в составе ТЮ2*РЬ*ДНК/ПНК нанокомпозита.

s*

S 5

0

1 л

О

О

g

к

ж.

т. -с

Рис. 5. Кривые десорбции р,иПНК из ТЮ2'РЬ»ДНК/р1иПНК нанокомпозитов в зависимости от температуры в TBS. Tm - значения температур плавления для ДНК/ПНК дуплексов в составе нанокомпозитов. Мольное соотношение TiCb/PL = 1:2.

Таким образом, несмотря на заметное ингибирование полилизином диссоциации ДНК/ПНК дуплексов в растворе, будучи нековалентно иммобилизованным на твердой фазе, он очень слабо влияет на диссоциацию ДНК/ПНК дуплекса в составе исследуемого ТЮ:*РЬ*ДНК/ПНК нанокомпозита, который способен «отпускать» ПНК в раствор в зависимости от Тт, то есть от прочности исходного ДНК/ПНК дуплекса.

□ ДНК ДНК в растворе ¡3 ДНК1ШК в растворе

ТГО^РЬДНКТШК

и

н

10 12 14 16 Число комплементарных пар оснований

Рис. 6. Сравнение температур плавления Тт для ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов, полученных в растворе и на твёрдой фазе в составе нанокомпозитов ТЮ2'РЬ«ДНК/ПНК в

зависимости от различного числа перекрывания

комплементарных пар

оснований в дуплексе.

4. Диссоциация ДНК/ПНК дуплексов, иммобилизованных на наночастицах ТЮ2, покрытых полилизином. Зависимость от времени

Контроль скорости высвобождения препарата необходим для доставки терапевтического препарата к мишени в составе композита и последующего эффективного его воздействия на мишень. Преждевременная диссоциация препарата может отрицательно сказаться на общей эффективности доставки нуклеотидного материала в клетки, а чрезмерная стабильность его фиксации на носителе - на эффективности его воздействия на внутриклеточную мишень. Для обеспечения необходимого баланса между двумя состояниями препарата требуется определенная (оптимальная) прочность фиксации препарата на носителе.

В связи с этим была исследована кинетика десорбции ПНК из состава ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов и оценка величин наблюдаемых констант скоростей диссоциации и времени полудиссоциации ПНК в составе нанокомпозитов в зависимости от числа комплементарных пар оснований в иммобилизованном ДНК/ПНК дуплексе.

Для исследования кинетики десорбции ПНК из ТЮз'РЬ'ДНК/ТШК нанокомпозита использовали содержащий флуоресцентную метку ДНК/ПиПНК дуплекс. Для того чтобы одновременно следить за поведением ДНК в составе нанокомпозита, на 5'-конец ДНК олигомера вводили фосфатную группу,

Рис. 7. Зависимость интенсивности флуоресценции (кривая 1) и радиоактивности (2) от времени при выдерживании нанокомпозита ТЮ2'РЬ'[32Р]ДНК/1иПНК, во времени при 35°С в PBS. Кривая 1 отображает десорбцию FlunHKi, кривая 2 - десорбцию радиоактивно меченой [32Р]ДНК2. Мольное соотношение TiCb/PL -1:2.

X

В процессе экспериментов аликвоты, содержащие суспензию нанокомпозита, выдерживали при фиксированной температуре в течение различного времени. После чего осаждали нанокомпозит и проводили измерение флуоресценции и радиоактивности в супернатанте. Степень десорбции ПНК определяли как отношение количества ИиПНК в супернатанте к общему количеству Р1иПНК, использованной изначально для иммобилизации. Степень десорбции ДНК определяли по соотношению количества радиоактивности в супернатанте к суммарному количеству радиоактивности в супернатанте и в осадке. По полученным данным строили кривые зависимости десорбции Г1иПНК и [32Р]ДНК из ТЮ2'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозита от времени. Из рис. 7 видно, что с течением

11

содержащую радиоактивныи г.

5

s . ^ а ^

f * ? и

О |

40 30

- 1 1

- J

2

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 10 20 3© 40 30 <К

времени происходит десорбция р|иПНКь а радиоактивность в растворе остаётся постоянной. Это свидетельствует о том, что в основном в раствор уходит р1иПНКь а радиоактивная [32Р]ДНК2 остаётся на твёрдой фазе.

Таким образом, полученные кинетические данные свидетельствуют, что десорбция ПНК из состава нанокомпозита происходит не за счет десорбции ДНК/ПНК дуплекса, иммобилизованного на наночастицах ТЮ2, а за счет денатурации этого дуплекса, с высвобождением в раствор ПНК.

Для того чтобы определить скорость десорбции ПНК из нанокомпозитов в зависимости от числа перекрывающихся комплементарных оснований в ДНК/ПНК дуплексе, иммобилизованном на наночастицах, была исследована кинетика десорбции ПНК из модельных нанокомпозитов Ti02*PL*Pi, ТЮг'РЬ'Рг, ТЮг'РЬ'Рэ и Ti02'PL,P4. Аналогично описанному выше методу были получены кривые десорбции р|иПНК из нанокомпозитов (Рис. 8), а затем рассчитаны константы скорости и времена полудиссоциации р|иПНК (результаты представлены на рис. 8). Расчёты проводили на основании уравнения (3.1), где к-кажущаяся (наблюдаемая) константа скорости диссоциации:

ТЮ2-РЬ»ДНК/ПНК —ПНК + ТЮ2»РЬ*ДНК (3 1)

Далее, полагая, что ТЮ2-РЬ-ДНК/ПНК = ав, ТЮ2»РЬ-ДНК = в, ПНК = а, уравнение (3.1) может быть переписано в виде (3.2):

ав—а + в (3 2)

Принимая во внимание принятую схему процесса десорбции (3.2), кинетическое уравнение накопления продукта а (ПНК) в растворе может быть выражено в нелинейном (экспоненциальном) (3.3) или линейном (3.4) относительно времени t видах:

НН-М^Н«]:*"* (3 3)

^ ^ J (3.4)

где [А]о и [АВ]о начальные концентрации ПНК в растворе и суспензии ТЮ2'РЬДНК/ПНК.

время полудиссоциации ПНК (t¡¿) в составе нанокомпозита в этом случае может быть вычислено по уравнению:

Ti/2 = f (3-5)

Путём аппроксимации экспериментальных значений к теоретической кривой, построенной с использованием уравнения (3.4), варьируя параметры [а]о и [ав]о, определяли кажущиеся константы скорости диссоциации к и далее по уравнению (3.5) определяли времена полудиссоциации п\2 ПНК в составе нанокомпозита. За время полудиссоциации ПНК мы принимали время, за которое половина ПНК-препарата остается в составе нанокомпозита, а другая половина уходит в раствор.

На рис. 8 представлены кинетические кривые десорбции р1иПНК из ТЮ2»РЬ»ДНК/р|иПНК нанокомпозитов для всех исследованных ДНК/ПНК дуплексов Pi, Р2, Рз и р4 (Таблица 1) с числом комплементарных пар оснований равным 10, 12, 14 и 16, соответственно. На кривых зависимости десорбции от

12

времени видно, что с ростом числа комплементарных пар в дуплексе наклон кривых в начальный момент времени и, следовательно, константы скорости диссоциации понижаются, а времена полудиссоциации соответственно увеличиваются. Таким образом, чем выше термостабильность ДНК/ПНК дуплекса в составе нанокомпозита, тем меньше скорость десорбции ПНК и тем больше время удерживания ПНК в составе нанокомпозита.

ТЮ;'РЬР3 к = 0.07 мшг3 Т| л = 11 мин

и т м г м I I | щ и

50 100 150 200

Т10;-Р1-Р; к = 0.05 мин": Тю = М мнн

ТЮ:-Р1-Р3 к =0.03 мшг1

50 100 150 200

1 М1Ш

50 100 150 200

1, МИН

Ш>;-Р1*Р4 ♦ к = 0.01 мин"1 ти = 71 мин

50 100 150 200

{- МИН

Рис. 8. Кинетические кривые десорбции ПиПНК из ТЮ2»РЬ'ДНК/ПиПНК-нанокомпозитов: ТЮг'РЬ'Рь ТЮг'РЬ'Рг, ТЮг'РЬ'Рз и ТЮг^РЬ'Р,», выраженные в экспоненциальной форме (а-г), в соответствии с кинетическим уравнением (3.3) (3.4). Приведены вычисленные значения времён полудиссоциации (тщ) и кажущихся (наблюдаемых) констант скорости диссоциации (к) ПНК из состава соответствующих ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов (а-г). Мольное соотношение ТЮ2/РЬ =1:2.

Таким образом, можно заключить, что, меняя длину комплементарного перекрывания в ДНК/ПНК дуплексе, можно регулировать не только прочность связывания ПНК в составе нанокомпозита ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК, но и скорость отщепления ПНК от ТЮг-носителя, что в дальнейшем позволит конструировать и создавать нанокомпозиты с оптимальным временем удерживания ПНК-препарата в составе нанокомпозита при его доставке в клетку.

5. Исследование влияния наиокомпозитов ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК на жизнеснособность эукариотических клеток

Одной из важных характеристик лекарственного препарата является его цитотоксичность, которая для клеточных культур может быть определена как концентрация или доза препарата, под воздействием которой погибает или теряет свою жизнеспособность половина клеток (50%-ная цитотоксическая концентрация, ТС50). Значение 50%-ной цитотоксической концентрации препарата может быть получено из соответствующей кривых зависимости жизнеспособности клеток от концентрации препарата, находящегося в культуральной среде.

Было проведено исследование влияния ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов, а также наночастиц ТЮ2 и свободного полилизина, на жизнеспособность клеток МОСК (Рис. 9).

Рис. 9. Жизнеспособность клеток МОСК в присутствии наночастиц ТЮ2 (а, б), полилизина РЬ (а, б), ТЮ2*РЬ (а, б) и ТЮ2'РЬДНК/ПНК (б) композитов. Концентрация 0.1 мг/мл по ТЮ2 соответствует 2 мкМ концентрации по ПНК, изменение концентрации ТЮ2 пропорционально изменению концентрации по ПНК, мольное соотношение ТЮ2:РЬ = 1:2. Инкубировали 4 ч в среде 1МБМ без сыворотки, затем внесли сыворотку и инкубировали сутки. Данные приведены в логарифмической шкале (а).

Из Рис. 9 видно, что жизнеспособность клеток уменьшается с ростом концентрации внесённых образцов. Влияние на жизнеспособность клеток ТЮ2 наночастиц и ТЮ2»РЬ композита практически не отличается друг от друга и не оказывает существенного влияния на выживаемость клеток, в том числе и в области планируемой рабочей концентрации (0.1 мг/мл). Аналогичные выводы можно сделать и при сравнении цитотоксичности ТЮ2 наночастиц и ТЮ2'РЬ композита с цитотоксичностью ТЮ2»Р1>ДНК/ПНК нанокомпозита (Рис. 96).

Полилизин РЬ напротив оказывает значительное влияние на выживаемость клеток, уменьшая количество живых клеток вплоть до нуля, в то время как в присутствии наночастиц и нанокомпозита доля живых клеток составляет 80-90%.

Низкая токсичность "ПСЬ'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозита не позволила определить точное значение 50%-ной цитотоксической концентрации ТС50 с помощью МТТ. Мазурковой H.A. (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») с помощью окраски клеток трипановым синим было получено значение ТС50 для "ПСЬ'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозита, которое составило 1200 мкг/мл в расчёте на наночастицы TiCb.

6. Способность ТЮ2*РЬ*ДНК/ПНК нанокомпозитов проникать в эукариотические клетки

Известно, что TiCb наночастицы проникают в клетки млекопитающих [Suzuki et al., 2007]. Предстояло выяснить, сохранят ли они эту способность после иммобилизации на них ДНК/ПНК дуплекса с образованием нековалентного ТЮз'РЬДНК/ПНК нанокомпозита.

Для наблюдения за поведением в клетке ПНК в составе ТЮ2'РЬ*ДНК/ПНК нанокомпозита была использована ПНК, содержащая флуоресцентную метку (п"ПНК). Транспорт полученных нанокомпозитов в клетки исследовали с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Рис. 10а-г).

В о а в >. a >уЬ

D в о В

Рис. 10. Конфокальная лазерная флуоресцентная микроскопия клеток HeLa, обработанных TiCb*PL%D,HK5/n"nHKi нанокомпозитом (2 мкМ по ПНК, 0.2 мг/мл по ТЮ2, мольное соотношение TiCb/PL = 1:2) (а-г) или свободной FlunHKi(2 мкМ) (д-з). Инкубация 24 ч в среде IMDM без сыворотки, промывка, инкубация 24 ч в среде IMDM с сывороткой. Ядра клеток окрашены синим красителем Hoechst33342 (а, д); цитозоль клеток окрашена красным красителем CellTracker Red СМТРХ (в, ж), ПиПНК, содержащая FITC, отображена зелёным цветом (б, е); г, з - наложение а, б, в или д, е, ж соответственно. Масштаб - 20 мкм.

Как видно из рис. Юг, вся зеленая окраска, соответствующая Р|"ПНК, перекрывается с красной окраской цитозоля и не перекрывается с синей окраской ядер, что свидетельствует о том, что молекулы ПНК сосредоточены внутри клеток (и/или на поверхности мембран), но при этом не фиксируются в ядрах клеток. Параллельно в контрольных экспериментах с клетками, использовали свободную ПиПНК без ее фиксации на наночастицах TiCb (Рис. 10д-з). Показано, что такая

ПиПНК, не иммобилизованная на наночастицах ТЮ2 (Рис. 10д-з), не проникает через клеточные мембраны (Рис. 10е). Полученные данные свидетельствуют, что молекулы ПНК сами по себе или за счет флуоресцентного красителя не способны проникать в клетки. Они проникают только в составе ТЮ-!'РЬ'ДНК/р|иПНК нанокомпозита и в таком виде накапливаются внутри клеток.

Чтобы подтвердить количественно возможность ПНК, иммобилизованной в составе нанокомпозита, накапливаться и удерживаться в эукариотических клетках нами был проведён эксперимент с использованием метода проточной цитофлуорометрии.

Показано, что более 90% ТЮ2'РЬ'ДНК5/Р1иПНК| нанокомпозита накапливается в клетках МЭСК, при этом наблюдается концентрационная зависимость накопления нанокомпозита. При уменьшении концентрации нанокомпозита в 10 раз интенсивность флуоресценции падает приблизительно в два раза. Свободная р|иПНКь не связанная с наночастицами ТЮт, как и ожидалось не проникает в клетки. Полученные результаты свидетельствуют, что созданные ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозиты без использования трансфекционных реагентов и физических методов воздействия проникают в клетки и накапливаются в них.

7. Испытание биологической активности ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов на примере клеток МБСК, инфицированных вирусом гриппа А/АиМ/2/68 (НЗГО)

В качестве модели для проведения биологических испытаний был выбран вирус гриппа А/АюЫ/2/68 (Н3№).

Ранее для подавления вирусной активности в литературе был использован 22-звенный антисенс морфолиновый олигомер с последовательностью 5'- АССААААССАСССТАОАТААТС -3', комплементарный З'-некодирующему участку уРНК сегмента 5, кодирующей нуклеопротеин (ЫР) [ве е1 а1., 2006]. Олигодезоксинуклеотид со схожей последовательностью

ОСААААОСАСССТАСА, электростатически и нековалентно иммобилизованный на ТТО2'РЬ наночастицы, показал хорошие результаты при подавлении размножения вируса гриппа А и снизил его титр на 3 ^(ТСГО5о/мл) [Левина и др., 2014]. Поэтому на основе этой последовательности был сконструирован и синтезирован 16-звенный ПНК-олигомер ПНК2 с последовательностью ^СААААОСАОООТАСАс. Следует отметить, что длина выбранного нами для этой цели ПНК олигомера несколько короче, чем длина аналогичного морфолинового олигомера, поскольку 16-мерный данный ПНК олигомер образует довольно прочный дуплекс (Тт = 83.4 °С) достаточный и сравнимый по термостабильности с более протяженным аналогичным 22-звенным морфолиновым олигомером. В качестве контрольного фрагмента использовали олигомер ПНК] со случайной последовательностью.

Длина ПНК и структура ДНК/ПНК гетеродуплекса была выбрана таким образом, чтобы перекрывание комплементарных пар оснований в составе "ПОг'РЬ»ДНК/ПНК нанокомпозита было минимальным (10 п.о.), что способствует более легкому высвобождению ПНК. С другой стороны, длина перекрывания ПНК с комплементарной цепью уРНК максимальна и составляет 16 п.о., что, в свою

очередь, обеспечивает прочную связь ПНК с vPHK в клеточной среде. Действительно, температура плавления дуплексов ПНКг/ДНКб (Р5) и ПНК2/ДНК7 (P«) с числом перекрывания 10 и 16 п.о. составляла 64.5 и 83.4 °С соответственно.

В качестве контрольного образца, не содержащего наночастицы ТЮг, использовали конъюгат FIHK2-Tat, содержащий пептидный фрагмент транспортного белка Tat, обеспечивающий доставку молекул ПНК в клетки [Bendifallah et al., 2006]. Другим контрольным образцом, содержащим комплементарную ПНК-последовательность ПНК2, но не содержащим в своем составе наночастицы ТЮг, был фрагмент нанокомпозита - комплекс РЬ'ДНК6/ПНК2.

Олигомер ПНКг, комплементарный vPHK, в составе нанокомпозита ТЮг'РЬ'ДНКб/ПНКг подавляет размножение вируса на 2.7 Ig(ТС 1D50/мл) или в 500 раз (Рис. 11). Нанокомпозит ТЮг'РЬ'ДНКг/ПНК], несущий олигонуклеотид со случайной последовательностью, не проявил заметной активности. Заметного влияния на титр вируса не оказал и ПНКг олигомер, доставленный в клетки в виде конъюгата с белком-транспортёром Tat (ПНКг-Tat) или с помощью тройного комплекса РЬ'ДНКб/ПНКг, значения титра вируса, полученные для данных образцов, практически не отличаются от контроля (необработанные клетки).

0.1 0.05 0.01 0.005 0.001

Концентрация образцов по ТЮ2. мг/мл О контроль п ТЮ2-PL• ДНК6 ТИК2 0ГЮ2'РЬДНК2/1ШК1

■ PL •ДНК6ТЖК2 ВЩЖ2-Та1 Рис. 11. Ингибирование роста вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в клетках MDCK в присутствии различных образцов. Заражение вирусом 1 ч, затем после промывки обработка образцами 4 ч и, наконец, после промывки дальнейшая инкубация в течение 48 ч. Титр вируса определён по реакции гемагглютинации. Контроль -клетки MDCK без добавления образцов. Концентрация 0.1 мг/мл по наночастицами ТЮ2 соответствовала концентрации 2 мкМ по ПНК, мольное соотношение Ti02/PL = 1:2.

Следует отметить, что конъюгат ПНК с белком Tat способен эффективно проникать в эукариотические клетки [Lee et al., 2013]. Эти данные были подтверждены нами с помощью проточной цитофлуорометрии, практически 100%

17

клеток содержали ПНК2-Та1 при концентрации образца 1 мкМ после инкубации в течение 4 ч. В связи с этим низкая биологическая активность данного конъюгата может быть связан с низкой эффективностью выхода из эндосом [8Ыга1БЫ е1 а!., 2006]. Отсутствие заметной противовирусной активности в случае РЬ*ДНКб/ПНК: комплекса, не содержащего в своем составе ТЮ2 наночастиц, вероятно, также связано с недостаточной эффективностью доставки ПНК в клетки с помощью РЬ. Также отсутствие видимого эффекта может быть объяснено более прочным связыванием ДНК/ПНК дуплекса со свободным полилизином, следовательно, выход ПНК из такого комплекса затруднён и эффективного связывания с уРНК не происходит.

Таким образом, эти данные свидетельствуют о существенной роли ТЮ2*РЬ композитов как транспортеров ПНК в эукариотические клетки. Только ПНК, комплементарная вирусной РНК и иммобилизованная на наночастицах в составе ТЮз'РЬ^ДНКб/ПНКг нанокомпозита, способна эффективно и сайт-специфично подавлять репродукцию вируса гриппа А. Олигонуклеотид ДНКб может вносить вклад в противовирусную активность, однако, в силу того, что этот фрагмент направлен на другие мишени (матричная тРНК и комплементарная сРНК), его активность не очень высока, как это следует изданных работы [Левина и др., 2014]. Таким образом, эффективность препарата в основном определяется наличием ПНК.

100

ТЮ2'РЬДШШНК 1С;® < 3 мкг мл

-1-1-1-1

0 2.5 50 75 100 Концентрация по ТЮ2, мкг/мп

Рис. 12. Зависимость степени ингибирования размножения вируса гриппа АМдсЫ/2/68 (НЗЫ2) в клетках ГуГОСК от концентрации

ТЮ2*РЬ*ДНКб/ПНК2 нанокомпозита.

Одной из количественных характеристик биологической активности лекарственного препарата является его 50%-ная ингибирующая концентрация (IC50), т.е. такая концентрация препарата, при которой проявляется 50%-ное подавление биологической активности. Из полученных данных по подавлению размножения вируса гриппа нами было получено значение IC50 для ТЮг'РЬ'ДНКб/ПНКз нанокомпозита (Рис. 12), которое составило в пересчете на концентрацию ТЮ2 наночастиц менее 3 мкг/мл или в эквиваленте ПНК 0.03 мкМ с учётом, что ёмкость нанокомпозита по ДНК или ДНК/ПНК дуплексу равна приблизительно 10 нмоль/мг в PBS или в клеточной среде. Значение индекса селективности (SI) для нанобиокомпозита ТЮ2«РЬ«ДНКб/ПНК2, определяемое как отношение величины ТС5о к 1С5о, равно 400 (SI = ТС50/1С5о > 1200/3 = 400).

Таким образом, сконструированные нами ТЮ2'РЬ\ЦНК/ПНК-нанобиокомпозиты на основе наночастиц диоксида титана, несущие фрагменты ПНК, способны не только проникать через клеточные мембраны, но и проявлять высокую специфическую антисенс-активность, не вызывая при используемых концентрациях токсического воздействия на живые клетки.

ВЫВОДЫ

1. Предложена и разработана новая и эффективная система доставки пептидо-нуклеиновых кислот (ПНК) в эукариотические клетки, основанная на использовании их композитов с наночастицами диоксида титана. Для создания предлагаемых ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов был разработан метод обратимой и контролируемой иммобилизации ПНК в виде ДНК/ПНК дуплексов на ТЮ2 наночастицы, покрытые полилизином (ТЮ2«РЬ).

2. Изучены физико-химические свойства созданных ТЮ2*РЬ»ДНК/ПНК нанокомпозитов. Показано, что полилизин не оказывает заметного влияния на диссоциацию ДНК/ПНК дуплекса в составе ТЮ2»РЬ»ДНК/ПНК нанокомпозита, что позволяет осуществлять регулируемую и обратимую диссоциацию ПНК из состава ТЮ2«РЬ\ЦНК/ПНК нанокомпозита.

3. Продемонстрирована низкая цитотоксичность созданных ТЮ2*РЬ*ДНК/ПНК нанокомпозитов, их ТС50, определенная с помощью окраски клеток трипановым синим, составляет 1200 мкг/мл в расчёте на наночастицы ТЮ2.

4. С помощью конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопии показано, что ТЮг'РЬ'ДНК/'ТШК нанокомпозиты способны проникать в клетки НеЬа без использования трансфекционных реагентов. Методом проточной цитофлуорометрии показана концентрационная зависимость накопления ТЮ2-РЬДНК/р,иПНК нанокомпозитов в клетках МОСК.

5. На примере подавления размножения вируса гриппа А/ А1сЫ/2/68 /НЗЫ2 в клетках МОСК продемонстрирована высокая биологическая активность созданных ТЮз'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов. Титр вируса был снижен на 2.7 ^(ТСЮ5о/мл) или в 500 раз. ГС50 - эффективная концентрация используемого нанокомпозита - составила менее 3 мкг/мл, индекс селективности > 400. Разработанная система доставки ПНК в клетки с использованием ТЮг'РЬ'ДНК/ПНК нанокомпозитов, обеспечивает эффективное и селективно взаимодействие ПНК с внутриклеточной нуклеиновой кислотой-мишенью.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Амирханов Н.В., Амирханов Р.Н., Зарытова В.Ф. Композиты пептидо-нуклеиновых кислот с наночастицами диоксида титана. I. Создание нанокомпозитов, содержащих ДНК/ПНК дуплексы, и доставка их в клетки НеЬа. Биоорганическая химия, 2012, Т. 38, №6, С. 692-705.

2. Амирханов Р.Н., Зарытова В.Ф., Амирханов Н.В. Композиты пептидо-нуклеиновых кислот с наночастицами диоксида титана. II. диссоциация ДНК/ПНК дуплексов в составе нанокомпозитов ТЮ2»полилизин»ДНК/ПНК и в растворе. Влияние полилизина. Биоорганическая химия, 2013, Т. 39, №6, С. 705-717.

3. Амирханов Р.Н., Зарытова В.Ф., Амирханов Н.В. Композиты пептидо-нуклеиновых кислот с наночастицами диоксида титана. III. Кинетика диссоциации ПНК из нанокомпозитов, содержащих ДНЮТШК дуплексы. Биоорганическая химия, 2014, Т. 40, №3, С. 286-292.

4. Амирханов Р.Н., Мазуркова H.A., Амирханов Н.В., Зарытова В.Ф. Композиты пептидо-нуклеиновых кислот с наночастицами диоксида титана. IV. Противовирусная активность нанокомпозитов, содержащих ДНК/ПНК дуплексы. Биоорганическая химия, 2015, Т. 41, №2, С. 162-169.

15-1091В

2015809532

2015809532