Синтез олиголактозаминов-лигандов галектинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах.рукописи

Северов Вячеслав Викторович

СИНТЕЗ ОЛИГОЛАКТОЗАМИНОВ - ЛИГАНДОВ ГАЛЕКТИНОВ

Специальность 02.00.10 — Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

13 МАЙ 2015

Москва 2015

005569050

Работа выполнена в лаборатории углеводов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).

Научный руководитель:

Бовин Николай Владимирович, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией углеводов ИБХ РАН.

Официальные оппоненты:

Кононов Леонид Олегович, доктор химических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории хпмнп углеводов им. Н.К. Кочеткова Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук.

Земляков Александр Евгеньевич, доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой органической и биологической химии Таврической академии Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова НИЦ "Курчатовский институт".

Защита состоится « 24 » июня 2015 года в 10:00 ч на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганпческой химии им. академиков М.М. Шемякина п Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук и на сайте ИБХ РАН www.ibch.ru.

Автореферат разослан «¿2» 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Олнголактозаминовые и полилактозаммповые фрагменты - характерные структурные элементы гликопротеинов и глнколнпндов. Олигосахарнды, содержащие родственный лактозамнну (Са1(51-4С1сКАс) фрагмент Оа1р1 -301сЫАс (1-ес), найдены в составе глнкокопъюгатов клеток млекопитающих эндодермачыюго происхождения. Одной из функций олиголактозамннов является спеш1фическое взаимодействие с гатектинамн.

Гатектины — семейство Р-гатактозпдсвязывающих лектинов. Актуальность детального изучения углеводной специфичности галектпнов обусловлена их участием во МН0П1Х биологических процессах, таких как клеточная адгезия, пролиферация и апоптоз. Для исследования специфичности галектпнов ранее нспользоватнсь различные методические подходы, основным выводом этих исследований является то, что гатектииы узнают олнголактозаминовые цепи и 1_ес-содсржащис гликаны. В настоящее время известно 15 галскпшов (у человека). Для всех них определена углеводная специфичность, однако требуются дополнительные исследования, так как в опубликованных работах нет полного согласия. Кроме того, полученные результаты не дают представления о том, как клеточное окружение влияет на специфичность галектпнов и насколько адекватно моделирование взаимодействия в условиях ш гИго соответствует поведению гатектина в составе живой клетки.

Для дальнейшего изучения углеводной специфичности галектпнов необходимо наличие нх потенциальных лнгандов — олигосахаридов и молекулярных зондов на их основе. Олиголактозамнны и 1_ес-еодержащие олигосахарнды не могут быть выделены из природных источников в количествах, достаточных для фундаментальных исследований в области гликобиологин, по причине гетерогенности углеводной части природных глпкоконъюгатов и, как следствие, сложности их выделения в индивидуальном состоянии. Поэтому актуальна задача разработки эффективных химических путей их синтеза.

Целью работы являлся синтез следующих олигосахаридов в виде спейсер-гликозндов:

- двух линейных днлактозаминов, со связью р1-3 и р1-6 между лактозаминовыми фрагментами,

- разветвленного и линейного трилактозаминов,

- агатакто-аналогов олиголактозамннов.

- дисахарида 1_ес. тетрасахарида Ье°-1.ес и его агатакто-анатога,

- двух тетрасахаридов. в которых Ьес комбинируется с лактозаминовым фрагментом.

Кроме того, предполагалось синтезировать гликоконъюгаты этих олигосахаридов для цитофлуориметрических исследований, а именно флуоресцеин-меченые полиакриламидные гликоиолимеры для изучения углеводной специфичности галектинов в составе клеточной мембраны.

Научная новтна н практическая значимость работы. Впервые линейные и разветвленные олиголактозамины, а также Lec-coдержащие олигосахариды получены .методом блок-синтеза с использованием Лг-Тгос-защищённых гликозилбромндов в качестве гликозилдоноров. Изучено связывание галектинов-1, -2, -3, -4, -7, -8 и -9 с гликоконъюгатами синтезированных олигосахаридов в составе клеточной мембраны; показано, что, в целом, галектины предпочтительнее связываются с олиголактозаминами, чем с 1_ес-содержащими гликанами. Полученные данные в дальнейшем мопт быть использованы при разработке терапевтических блокаторов галектинов.

Личный вклад автора. Синтез олигосахаридов был выполнен лично автором. Синтез полиакриламидных конъюгатов выполнялся совместно с Е.А. Гордеевой (ИБХ РАН), а изучение специфичности галектинов с помощью гликопроб - совместно с Е.М. Рапопорт (ИБХ РАН).

Публикации н апробация работы. По результатам работы опубликовано 7 статей в рецензируемых журналах. Часть работы была представлена на Международном симпозиуме 10lh European Course on Carbohydrates (Нидерланды, Вагенинген, 2008).

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 страницах и состоит из введения, обзора литературы, посвященного структуре олиголактозамннов н £.ес-содержащнх олигосахаридов в составе глнканов человека, а также методам синтеза олиголактозамннов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 190 ссылок.

Автор выражает глубокую признательность кандидату химических наук, старшему научному сотруднику лаборатории углеводов ИБХ РАН Пазыниной Гачине Валентиновне за внимание и помощь, оказанные при выполнении работы; а также Г.-П. Габиусу Университет Людвига-Маскимилиана, Мюнхен, Германия) за предоставленные галектины.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Синтез олиголактозаминов

В данной работе были синтезированы следующие олигосахариды 1 - 14:

вк^ср 1 -ЗСаф1-4С1сЫАсР-0(СН2)2ЫН2 1

йкЫАср 1 -6Саф1-401сЫАср-0(СН2)2МН2 2

о'сЫАфЙ Са|(!|-4С1сНАс(!-0(СН2)2ЫН2 3

0а1р|-401сЫАср1-6

01сЫАср1-3 1 1

Galpl-4GIcNAcP 1 -30аф1-401сЫЛср-0(СН2)2ЫН2 6

ваф! -4С1сКАсР 1 -6С.а1р|-4С.1сЫЛс(!-0(СН2)2ЫН2 7

Саф1ЖИсКАсР1-ЗСаф1ЖНсЫАср1-ЗСафЫС1сЫАср-0(СН2Хч>Ш2 9

Са1р1-ЗС1сЫАср-0(СН2),ЫН2 10

С1сЫАср 1 -ЗСаф 1 -ЗС1сЫАср-0(СН2)3КН2 11

Оаф 1 -ЗасЫАсР 1 -ЗСа1р 1 -ЗС1сЫАср-0(СН2),ЫН2 12

Саф 1 -ЗС1сЫ АсР 1 -ЗСа1р 1 -4С1сЫАсР-0(СН2),ЫН2 13

Саф 1 -ЗС1сЫАсР 1 -6Са1р 1 -401сЫАсР-0(СН2)2МН2 14

Все эти олигосахариды содержат спейсерный аглнкон (5р = 0(СН2)2ЫН2 или 0(СИ2)>,ЫН2) для иммобилизации их на полиакрнламнде и изучения с помощью полученных макромолекулярных форм углеводной специфичности галектинов-1, -2, -3, -4, -7, -8 и -9 в составе клеточной мембраны.

Ключевой стадией синтеза является глнкозилирование при помощи N-(2,2.2-трнхлорэтокси)карбонилы1ых (Л'-Тгос) производных: 1) лактозамина. 2) глюкозамииа. 3) дисахарида Lec, - во всех случаях методом Кенигса-Кнорра, который позволил проводить реакцию стереонаправленно и с высоким выходом. Следует также отметить, что превращение Тгос,\7/-фрагмента в АсД7/- не затрагивает другие защитные группы.

Исходным соедипетшем хтя синтеза коровой части олнгосахаридов 1 - 8 и 14 служил лактозамнн с 2-азидоэтнлы1ым спенсером 15 (Схема 1). Гидрогенолиз азидпоп группы приводил к амину, который защищали с помощью Л'-трифторацетамндной группы и получали дисахарид 16. Перезащиту 2-азндоэтильного спенсера проводили на начальном этапе в связи с тем, что М-трнфторацетамидная защита устойчива в последующих процедурах синтеза, в частности при гидрогенолнзе, и в то же время может быть количественно удалена действием водного основания на конечной стадии.

Из двух возможных стратегий создания разветвления при остатке галактозы была выбрана такая, где в начале проводили гликозилирование лактозамина по третьему положению галактозного остатка, а затем по шестому, так как первичный гндроксил более реакционноспособен, чем вторичный, и его эффективное гликозилирование возможно при наличии уже введенного объемистого заместителя прн С-ЗЬ.

он он он он

15

OH ОАс OR1

АсО[

16(70%)

NHAc 3 ОАс NHAc 3

20 (69%)

17, R' * R* = CHPh (87%)

18. R" = Bn, R' = Ao (84%)

f, g, d, h

OBn AcO

NHCOCF, NHAC 3

19 (70%)

Схема 1. a: Hz. 10% Pd 1С. МеОН/НгО; b: CF3COOCH3, NEt3, MeOH; c: PhCH(OCH3)z, TsOH. MeCN; d Ac20/Py; e: NaCNBH3, THF. HCI/Et20, f: MeONa/MeOH; g: CH3C(OEt)3, TsOH. MeCN; h: 80% води. AcOH.

Для защиты гндроксила при C-6b была выбрана бензильная группа, которую удобно получать раскрытием бензнлиденового цикла. Введением бензилиденовой защиты в лактозамин 16 с последующим ацетилированием получали производное 17. Использование цпанборгидрида натрия позволило селективно раскрыть бензилнденовый цикл в сторону образования производного с бензилыюй защитой при С-6Ь. После ацетнлирования получали производное 18.

Соединение 18 дезацетнлировачи по Земилену, затем введением ортоэфирной защиты с последующим ацетилированием и раскрытием ортоэфнрного цикла получали производное 19. Основным побочным продуктом этого превращения было производное лактозамина с свободной гидроксильной группой в положении С-4Ь н ацетатом прн С-ЗЬ, которое, по-видимому, образу ется в процессе хроматографии на силикагеле в результате миграции ацетильной группы (в реакционной смеси но данным ТСХ оно не

обнаруживалось). Количество 4-ОН-производного снижали, добавляя в элюент для хроматографии 0.5% пиридина.

Для получения производных лактозамина 2, 7 и 14, не содержащих заместителей в третьем положении галактозного остатка, из лактозаминового производного 18 гидрогенолнзом был получен дисахарпд 20 со свободной гидроксильной группой при С-6Ь.

Акцептор 19 гликозилировали бромидом Тгос-производного глюкозамина 21 или лактозамина 22 (Схема 2), и получали трисахарнд 23 или тетрасахарнд 24, соответственно. В реакции с глюкозаминовым донором 21 образовывался побочный продукт а-гликозилирования в количестве 6%, а при гликозилнрованни лактозаминовым производным 22 побочный продукт реакции гликозилнрования (предположительно а-аномер) не выделялся, его количество по ТСХ не превышало 5% от основного продукта реакции. Далее в продуктах реакций гликозилнрования заменяли Тгос-защиту на № ацетильную, получив соединения 25 и 26, последующий гидрогенолиз которых приводил к образованию производных 27 и 28 с одной ОН-группой при С-6Ь. Их ацетилирование приводило к перацетатам 29 и 30. Необходимость данной сташш обосновывается тем, что олигосахариды в виде перацетатов удобны для дополнительной хроматографической очистки, а их 'Н-ЯМР-спектры, как правило, более информативны, чем спектры частично защищенных углеводов. Далее дезацетилированием и удалением Д'-трифторацетамидной защиты были получены целевые трисахарнд 1 и тетрасахарнд 6.

д.ОАс О Ас

ОАо ТгосНМ вг

АсО АсО

АсО АсО

N№»0 ОАс МН !•

ОАО 9й1 ОАО

ОАО ?Н ОА°

»Ас НН

ОАс ?*0 ОАс ^О^о^

Ас1

~ННСОСР, АсО-

Ас)

^«НСОСГ, Ас0

2$ (74%)

ИНСОСР, АсО-

27 (85%)

^ННСОСР, Ас0.

29 (85%)

ОВп ОАв ИНТгос^ ОАс "НА 1-

ОВп ОАс

ОН ОАО

ОАо ОАе

^ЫНСОСР,

24 (59%)

^ЫНСОСР,

28(73%)

^МНСОСР,

30 (90%)

в1сМАср1-30а|р1-4в1сМАср-0(СН2)2ЫН1 1(99%) Са|р1-4С1сЫАср1-ЗВа|р1-4в1сЫАср-0(СН2)2МН, 6(96%)

Схема 2. а: АдОЛ. ТММ. М5-4Д. СН2С12; Ь: Т.п. АсОН. Ас20. с: Н2, 10% Ра/С.

МеОН; <* АсгО/Ру: е: МеО№/МеОН. затем ЫаОН. Н20.

Гликозилирование продукта гидрирования 27 гликозилбромидом Тгос-производного глюкозамина 21 или лактозамина 22 (Схема 3) приводило к тетрасахариду 31 или пентасахариду 32, соответственно. Побочные продукты реакции (предположительно а-аномеры) в обоих случаях не выделялись, их количество по ТСХ не превышало 5% от основного продукта реакции. Далее проводили замену Тгос-защиты на Л'-ацетил, затем дезацетилированнем и удалением Д'-трифторацета.мидной защиты были получены целевые тетрасахарид 3 и пентасахарид 4.

АсО?

сНЧЛ

АсНМ ОАс АсО'

АсО-АсО-

ОАс АС"! Г „

ЫНАс

о!сМАср11зСа,Р1-4<3,СМАСР-°(СН'ЬМН2

Схема 3. а: АдСШ, ТММ. М5-4Д, затем ЫаОН, Н20.

-у ОАС

ТгосННЛ

АсР ОАс

Ас0-ЬЬго

АсО«.г

---МНСОСР,

МНАс '

32 (65".1)

АсНЫ

АсО АсО

Са1р1-4С1сМАс|1-6<5а,р1^С1сМдсрЮ(СН2)гМНг 4(95.,, СН2С12; Ь: гп, АсОН, АсгО. с: МеОЫа/МеОН,

Аналогично, гликознлирование производного 28 гликозилбромидом Тгос-производного глюкозамина 21 или лактозамкна 22 (Схема 4) приводило к пентасахариду 35 гаи гекеасахариду 36, соответственно. Побочные продуют,! реакции (предположительно а-аномеры) в обоих случаях не выделялись, их количество по ТСХ не превышало 5% от основного продукта реакции. Далее проводили замену Тгос-зашиты на Л'-ацстил, затем дезацетилированием и удалением /У-трифторацетамидной защиты были получены целевые пентасахарнд 5 и гексасахарид 8.

ОАс

АсО

А'^оас TrocHNX

АсО

AcHN\° ОАс АсОР

NHAc

NHCOCF,

Зв (50%)

Аср?А< ОАс АсОР ОАс

ОАс ^^ NHAc °Ас NH

0^ NHAc

NHCOCF,

37 (58%)

GIcNAcßl 6

GalßMGIcNAcß^3Galß1_4GlcNAcß -0{CH2)aNH2 6 (92%)

Схема 4. * AgOTf, TMM. MS-4Â, CH2CI2; b: Zn. АсОН. АсгО. N£t3;

/. OAc AC°Aco°

TrocHN ч

АсОрАс ОАс AcO? OAc

ОДс ^ NHAr OAc NH

^O -^^AcO^tJi^ NHCOCF, NHAc OAc NHAc 3

36 (53%)

ЖГ

АсОд.г?-

'АСОЧ 0Ac

AcHN

>

OAc ^^ NHAc 0Ac NHAc s

38 (65%)

Galß1-4GlcNAcß1-6„

GalßMGIcNAcß1-3Ga,,31'4G'cNAcß-0(CHJ)2NHJ em%) MeONa/MeOH, затем NaOH, HгО.

Для получения производных лактозамииа 2 и 7. не содержащих заместителей в третьем положении галактозного остатка, производное лактозамииа 20 глнкозилировали глнкозилбромндом Тгос-пронзводного глюкозамина 21 или лактозамииа 22 (Схема 5). Далее проводили замену Тгос-защиты на Л'-ацетил. затем дезацетилнрованпем и удалением Л'-трифторацетамидной защ!ггы были получены целевые трисахарнд 2 и тетрасахарид 7. Стоит отметить, что при гликозилировании глюкозамнновым донором 21, смесь аномерных трисахаридов З9(а+Р) не удалось разделить хроматографией, аномеры в чистом виде были выделены в виде перацетатов после замены Тгос-защиты на Л-ацетнл (выход продукта а-гликозилирования 12% в пересчете на исходную смесь аномерных трисахарндов 39(а+р». При гликозилировании лактозаминовым донором 22, побочный а-аномер образовывался в количестве 12%.

АсО

Ас°\ „ОАс

ТгосМН ^

асо9 т -

ОАс

ОАс

З9(а+Р) (79%)

АсО

Д°

^^^ ОЛе^ ИНАс

ИНСОСР,

41 (59%)

^АСОЧ ОАс ТгосНМ^

АсО

Ас! АсО

„О ОАс

ОАс

Ас/) ОАс АсО

^О

-АС0\ 0АС

н>

ЫНАс

40 (57%)

АсНМ <

Ас!

АсО

-у ими

Н-С^н

ЫНАс

ИНСОСР,

С1сМАср1-6Са1р1-4С1сМАср-0(СН2)2МН2 г (99%)

42 (68%)

Са1р1-4С1сМАср1-6Са1р1-4С1сЫАср-0(СН2)2МН2 7(95%)

Схема 5. о: АдОТ{, ТММ, М5-4Д. СНгС12; Ь: Тп, АсОН. Ас20. ЫЕГ3: с: МеОЫа/МеОИ. затем ЫаОН, Н20.

При синтезе линейного трилактозамина 9 дилактозаминовый фрагмент получали последовательным наращиванием по одному моносахаридному остатку, а затем использовали блок-синтез по схеме (2+4). Исходным соединением для синтеза являлось глюкозамнновое производное 43. Его гликозилированием гликозилбромидом 44, синтезированным из соответствующего р-этнлтногликозида, был получен дисахарнд 45 (Схема 6). Побочный продукт реакции (предположительно а-аномер) не выделялся, его количество по ТСХ не превышаю 5% от основного продукта реакции.

Лактозаминовое производное 45 дезацетилировали, затем введением ортоэфирной защиты, ацетилированием и раскрытием ортоэфирного цикла был получен дисахарнд 46.

Гликозилированием дисахарида 46 бромидом 21 был получен трисахарид 47. При этом наблюдаюсь образование 15% побочного а-аномера. Далее проводили замену Тгос-защиты на Л'-ацетнл, затем дезацетилированием полученного трисахарида 48, введением бензилиденовой защиты и ацетилированием было получаю производное 49. Использованием цианборгндрида натрия селективно раскрывали бензилиденовый цикл и получали трисахарид 50.

Гликозилированием трисахарида 50 гликозилбромидом 44 был получен тетрасахарид 51. Побочный а-аномер был выделен в количестве 2%.

Последовательным дезацетилированием, введением ортоэфирной защиты, ацетилированием и раскрытием ортоэфнрпого цикла из дилактозаминового производного 51 было получено производное 52 с одной ОН-группой в терминальном галактозном остатке. Гликознлнрование последнего гликозилбромидом 22 приводило к гексасахариду 53. Побочный продукт (предположительно а-аномер) не выделялся, его количество по ТСХ не превышало 5% от основного продукта реакции. Заменой Тгос-защиты на Аг-ацетил. затем гидрогенолизом с последующим ацетилированием и финальным дезацетилированием и удалением Л'-трифторацетамидной защиты был получен целевой трилактозачин 9.

cQOBn OBn

+ »¿Mr.

AcO Br

„O^^NHCOCF, NHAc

43

AcO| AcO

OBn OBn

OBn AcO[

0_^,NHCOCF, NHAc

45 (61%)

Ь, c, d, e OBn

OBn AcOl

AcO-AeOJ

NHR

b, g. d

O^^NHCOCF, NHAc

46 (59%)

д rnii^-0 N НС OC F, OAc NHAc

I-47. R = Troc (65%)

- 48. R = Ac (77%)

OBn

OR1 OBn OBn

O^-NHAc

d

49, R1 + R2 = CHPh (70%)

50, R' = Bn, R? = H (91%)

«OBn OBn дс0| I

O^^NHCOCF, NHAc

51 (47%)

b, c, d, e

c(pOBn OBn Ac0l I

O^^NHCOCF, NHAc

52 (48%)

OBn OBn

O^^NHCOCF, NHAc

- 53, R = Troc (47%) ■ 54. R = Ac (70%)

AcoA^ài..^^ 0ACACU^ NHAc ^ OAc NH

O^^NHCOCF, NHAc

55 (80%)

Galf}1-4GlcNAcpi-3Gaipi-4GlcNAcpi-3Gaipi-4GlcNAc|3-0(CH2)3NH2 9(89%)

Схема 6. a: AgOTf, TMM, М5-4Д, CH2CI2; b- MeONa/MeOH; c: MeC(OEt)3. TsOH. MeCN; d: Ac20/Py; e: 80% водн. AcOH; f: Zn, AcOH. АсгО, NEt3; g. PhCH(OMe)2, TsOH, MeCN; h: NaCNBHs, THF, HCI/EtzO; i: Нг, 10% Pd 1С, MeOH: j: MeONa/MeOH, затем NaOH, H20.

Для синтеза олнгосахарндов. содержащих фрагмент 1_ес, необходим был 1_ес-гликозилдонор. Во время его синтеза в качестве временной защиты аномерного центра остатка глюкозамина использовали р-триметилсилилэтильную фуппу. Для этого гликозилбромидом 21 гликозилировали р-триметилсилнлэтиловый спирт (Схема 7). При дезацетилировании полученного производного 56 метилатом натрия в метаноле образовывалась многокомпонентная смесь продуктов, из-за того, что Л'-Тгос защитная группа оказалась неустойчивой в данных условиях. Поэтому для реакции дезацетилироваши производного 56 подобрали более мягкие условия, не приводящие к разрушению Л-Тгос защитной группы: в качестве растворителя использовали смесь метанола и хлористого метилена, реакцию проводили при пониженной температуре (4°С). Последовательным дезацетилированием в мягких условиях и бензилиденированием получали производное 57 с одной свободной гидроксильной группой при С-3. Гликозилирование соединения 57 гликозилбромидом 58 приводило к образованию дисахарнда 59. Побочный продукт (предположительно а-аномер) не выделялся, его количество по ТСХ не превышало 5% от основного продукта реакции. Удаление бензилнденовой защитной группы и последующее ацетилнрование диола давало производное 60, далее удаляли ТМБЕ^группу, а полученное 1а-ОН производное ацетилировали и выделяли а-ацетат 61.

Гликозилирование 3-трифторацетамидопропанола гликозилбромидом 62 с последующей заменой Тгос-защнты па Л'-ацстил приводило к р-аномеру 63. Побочный продукт (предположительно а-аномер) не выделялся, его количество по ТСХ не превышало 5% от основного продукта реакции. Дезацетилированием и удалением IV-трифторацетамидной защиты нз продукта 63 был получен целевой дисахарид 10.

21 + tmsboh

OAc Acol

АсОвг

AcO AcO

OAc

NHTroc

SiMe,

Ph

56 (82%)

b, с

V

nU * MLfl

NHTroc

SiMe,

57 (71%)

Ph

OAc \ AcO| V0-

AcO

NHTroc

SiMe,

AcO

d. e

59 (75%)

OAc OAc

АсОДх^^^^^ NK1 AcO

NHTroc

60 (89%)

SiMe,

f, e OAc

HO(CH2)3NHCOCF3

OAc VAC

AcO

+ AcO

TrocNH R

61: R = OAC (72%) 62: R = Br

Ai AcO

OAc ?Ac

NH

OAc

O^^NHCOCF3 NHAc

63 (59%)

Galßl-SGIcNAc^-OfCHjJjNHj ю(9б%)

Схема 7. a: AgOTf. TMM. М5-4Д, CH2CI2; b: MeONo. MeOH. CH2CI2. 4°С; с: PhCH(OMe)2, TsOH, MeCN; d: 80% водн. АсОН. 80°С; е: Ас20. Ру; f : CF3COOH, СН2С1г; ЛсВг. МеОН. СН2С12. АсОН; h: Zn. АсОН. Ас20. NEt3: i- MeONo/MeOH. затем NaOH, Н20.

Гликозилированне производного лактозамнна 46 гликозилбромидом 62 (Схема 8) проходило нестереоизбирателыю, р/а ~ 1:1. Такая разница в стереоселективности гликозилирования бромидами глюкозамина 21 или лактозамина 22 с одной стороны, и 1-ес-гликознлдонором 62 — с другой, была неожиданной. Для улучшения (!-стереоселективности реакции гликозилирования Ьес-гликозилдонором был опробован трнхлорацетимидатный метод (катализ триметилснлилтрнфлатом), однако в результате реакции основным продуктом являлся а-аномер, тогда как целевой р-аномер образовывался в количестве, не превышающем 5% (относительно продукта а-гликозилирования). Далее в соединении 64 заменяли Тгос-защиту на Д'-ацстил, затем гидрогенолпзом с последующим ацетилированнем и финальным дезацетнлированием и удалением УУ-трифторацетамндной защиты был получен целевой тетрасахарид 13.

62 46

Ч + /

Схема 8. а: AgOTf. ТММ, М5-4Л. СН2С12: Ь: Тп, АсОН. АсгО, с: Н2. 10% Рв/С. МеОН: (¡'- Ас20/Ру; е: МеОЫа/МеОН, затем ЫаОН, Н20.

Гликозилированне (Схема 9) производного лактозамина 20 с одной ОН-группой при С-6Ь бромидом 62 также протекало нестереоизбирателыю: р/а = 1.6. Далее проводили

замену Тгос-защнты на Л'-ацетнл, затем дезацетилированием и удалением № трнфторацетамиднои защиты получали целевой тетрасахарид 14.

62 , 20

ОАс

АсОД—АС°х ОАс АсО

ТгосК..

АсО'

ТгосНЫ/Цп ОАс

ОАс МНАс

67 (46%)

|Ь

АсО,ОАс АсО

АсО О ,^-ОАс

Ас НИ

АсО0 0АС

ОАс МНАс

68 (52%)

Са1р1-ЗС1сМАср1-6Са1р1-4С1сМАср-0(СН2)2МН2 14(92%)

Схема 9. а: АдСШ. ТММ. Мв-4Д. СН2С1г: Ь: Тп. АсОН, АсгО. ЫЕТ3; с: МеОЫа/МеОН. затем ЫаОН. НгО.

Производное Ьес 70 с одной ОН-группой при С-ЗЬ получили из дисахарида 69 (Схема 10) ведением ортоэфирной защиты с последующим апеллированием и раскрытием ортоэфирного цикла.

ОВп 9е3" ОВп ?Вп

Л.О НОГ-^^^О^^МНСОСР, _г^с_„ АсОГ^С^-О-^-МНСОСР,

ННАс НОАХ^---'0-^ МНАс

^ ОН кч ОАс

63 70 (57%)

Схема 10. а: МеС(ОЕТ)3. ТзОН, МеСЫ; Ь: АсгО/Ру; с: 80% водн. АсОН.

Гликозилирование производного 70 гликозилбромидом Тгос-производного глюкозамнна 21 или Ьес 62 (Схема 11) приводило к трисахариду 71 или тетрасахариду 72, соответственно. Побочный а-аномер в случае гликозилирования Ьес-донором образовывался в количестве 35%. Далее проводили замену Тгос-защиты на Д'-ацетил. затем гидрогенолизом с последующим ацетилированием заменяли бензильные защиты на ацетильные и финальным дезацетилированием и удалением А'-трифторацетамидной защиты были получены целевые трисахарид 11 и тетрасахарнд 12.

Схема 11. a: AgOTf, TMM. MS-AX, СИгС\г: Ь: Zn, АсОН, АсгО, NEt3; с: Нг, 10% Pd/C, ДЛеОН; d: АсгО/Ру; е: МеОЫа/МеОН, затем NaOH, НгО.

Строение полненных соединений подтверждено данными масс-спектрометрии и 'Н-ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, их чистота согласно данным ТСХ и 'Н-ЯМР составляла не менее 95%. Полное отнесение сигналов с помощью эксперимента 2D 'Н.'Н COSY проводилось для перацетатов всех синтезированных олигосахаридов.

Подводя итоги синтеза олигосахаридов I - 14. необходимо отметить, что для всех используемых гликозилакцепторов p-стереоселективность гликозилирования [eL-гликозилдонором 62 была значительно ниже, чем глюкозаминовым (21) или лактозаминовым (22) гликозилдонорами Причина подобного явления неизвестна, для его изучения необходимы дополнительные (в том числе кинетические) исследования.

Строение гликозилакцепторов также влияет на стереохимию образующихся гликозидных связей. Так, при гликозилировании глюкозаминовым или лактозаминовым гликозилдонорамн 21 и 22 первичного гидрокснла при С-6Ь акцептора 20 наблюдалось образование 10 - 15% а-аномера, тогда как при гликозилировании вторичного гидроксила при С-ЗЬ акцептора 19 или при наличии объемистых заместителей при С-ЗЬ (в случае акцепторов 27 и 28) р-стереоселективность возрастала. При гликозилировании 1-ес-гликозилдонором 62, наоборот, наибольшая Р-стереоселектпвность реакшш наблюдалась при гликозилировании первичного гидроксила при С-6Ь акцептора 20 (Р'а = 1.6), тогда как при гликозилировании вторичного гидроксила при С-ЗЬ акцепторов 46 и 70, она уменьшалась (р/а ~ 0.9).

Следует также отметить, что при гликозилировании производным 1_ес полнота конверсии гликозилакцепторов была заметно ниже. Этот факт, а также отмеченная ранее более высокая стереоселективность в случае акцепторов с первичной ОН-группой, указывают на более низкую реакционную способность гликозил-катиона, сформированного в случае 1_ес-допора, чем в случае лакгозаминового или глюкозамннового донора. Поэтому для улучшения эффективности гликозилировапия производными днсахарида 1_ес представляется необходимым использовать другую комбинацию защитных групп, делающую молекулу более активным донором в реакции гликозилировапия.

3.2. Синтез флуоресцеип-меченых полнакрнла.мндных гликокоиыогатов

В лаборатории химии углеводов ИБХ РАН разработан и в течение более 20 лет используется подход к синтезу разнообразных полиакриламидных неогликоконъюгатов. позволяющий получать их с количественным выходом. Этот подход был использован и в данной работе. Из олнгосахарндов 1 — 14 были синтезированы флуоресценн-меченые гликоконъюгаты (гликопробы) на основе полнакриламида.

Синтез гликоконъюгатов представлен на Схеме 12. Конденсацию аминоалкнлгликозидов 1 — 14 (20 мольн. %) и флуоресцеинкадавернна (1 мольн. %) с полн(4-ннтрофеннлакрилатом) (М ~ 30 кДа) проводили в ДМСО в присутствии триэтиламина при 40°С. Избыточные сложноэфирные группы превращали в амидные действием этаноламина. Коныогаты очищали гель-фильтрацией на Сефадексе и1-20 и лиофилизовачн, выходы составляли 90 — 95%.

•V

О о 0 0 о о ф ф ф

1

$иамн2

Пидер-Ш}

ОМ50,Е1зГ1,40*С

"Гут >61«

О Г1Н ¡р

Р1ио

о нн

I

вид

носнгснзнн.

ф п.

^ И02

НН2

р|имрЛН2

° »н ° "н о НСН2СН20Н

1р ¿ид

Схема 12. Синтез флуоресцеин-меченых гликоконъюгатов. 5ид - углеводный остаток. р1ио - остаток флуоресцеина.

3.3. Изучение углеводной специфичности галектинов в составе клеточной мембраны

Галектины — класс р-галактозидсвязывающих лектинов, насчитывающий в настоящее время 15 белков (у человека), гомологичных по аминокислотной последовательности углеводсвязывающего сайта. О специфичности галектинов, входящих в состав клеточной мембраны, известно мало, а искусственные тест-системы не отражают реальную клеточную ситуацию, когда на взаимодействия галектина оказывает влияние гликановое окружение (гликокалнкс).

В нашей лабораторш! ранее был разработан подход, позволяющий изучать взаимодействие галектинов с гликанами в клеточной системе: галектин сорбировали на клетки, на которых не экспрессируются собственные галектины. Далее изучали взаимодействие клеток, нагруженных галектинами, с полиакриламидными флуоресцентными гликоконъюгатами методом проточной цитофлуориметрии. В данной работе этим методом исследовалось связывание галектинов с синтезированными олиголактозаминами и 1_ес-содержащими олигосахаридами, которые структурно близки олиголактозаминам.

Связывание галектинов с олиголактозаминами.

За исключением галектина-9, исследованные белки не связывались с дисахаридом 1.М. В тоже время они проявляли сродство к линейным и разветвленным олигомерам со связью Р1-3 между дисахаридными фрагментами, а именно к (ЬЫЬ, 1_Ю'1-М, (ЬЫ^З'.б'ЬЫ и LNЗ'(GlcNAc6')LN (Рисунок 1). Увеличение числа лактозаминовых звеньев в цепи приводило к усилению связывания галектинов прото- и химерного типов -1, -2, -7 и -3, соответственно, и не влияло на взаимодействие с ними галектинов тандемного типа -4, -8 и -9. Галектин-9 показал нетипичное для лектинов этого семейства связывание с 6'-замещенными олиголактозаминами ЬЫбТЫ и ЬЫ6'(С1сЫАсЗ')ЬЫ.

Рисунок 1. Изучение связывания галектинов человека, нагруженных на клетки йа^, с олиголактозаминами методом проточной цитометрии. На оси абсцисс приведены исследуемые гликаны 8 составе гликоконъюгатов. Относительную флуоресценцию подсчитывали по формуле [(р;/Ро)жЮО]-ЮО, где - интенсивность флуоресценции клеток, нагруженных галектином, после инкубации с 5ид-РАА-р1ио, Ро - интенсивность флуоресценции клеток после инкубации с 5ид-РАА-Р1ио в отсутствие галектина. За отсутствие связывания принимали величину флуоресценции <20.

Связывание галектинов с 1ес -содержащими олигосахаридами

Из галектинов прототипа с дисахаридом Ьес слабо связывался только галектин-7 (Рисунок 2). В то же время, галектины-2 и -7 проявляли сродство к тетрасахаридам, содержащим терминальный р1-3-связанный 1_ес, а именно к 1_есЗ'1-Ы и ЬесЗТес. Отметим, что эти лектины связывались сильнее с тетрасахаридом, содержащим два фрагмента 1_е\ чем с 1_ес3'1_1\1. Химерный галектин-3 не взаимодействовал с Ьес и 1_ес3'1_ес, небольшое связывание наблюдалось в отношении 1_есЗ'1-Ы. С дисахаридом 1_ес взаимодействовали галектины тандемного типа -8 и -9, но не галектин-4. В то же время, связывание галектина-8 с тетрасахаридами, содержащими фрагмент 1_ес, было ниже, а галектина-9 -выше, чем с дисахаридом 1_ес. Из всех Ьес-содержащих тетрасахаридов галектин-4 слабо связывался только с ЬесЗ'Ьес. Как и в случае олиголактозаминов, с тетрасахаридом, в котором [_ес присоединен к 1_Ы связью (31-6, взаимодействовал только галектин-9. причем

связывание это было слабее, чем с 1_есЗ'1_М. Следует также подчеркнуть, что связывание гапектинов с [^-содержащими тетрасахаридами было слабее, чем с соответсвующими гликанами. содержащими Ц<-фрагмент. а именно, сродство всех исследованных галектинов к ЬЫЗ'ЬЫ было выше, чем к ЬесЗ'иМ и ЬесЗ'Ье°.

Рисунок 2. Связывание галектинов человека в составе клеток с 1_ес-содержащими гликанами. На оси абсцисс приведены исследуемые гликаны в составе гликоконъюгатов. Относительную флуоресценцию подсчитывали по формуле [(р/Ро)*ЮО]-ЮО, где -интенсивность флуоресценции клеток, нагруженных галектином, после инкубации с 5ид-РАА-Р1ио, Ро - интенсивность флуоресценции клеток после инкубации с 5ид-РАА-Р1ио в отсутствие галектина. За отсутствие связывания принимали величину флуоресценции <20.

Данное исследование показало, что. в целом, галектины предпочтительнее связываются с олиголактозаминами, чем с Ьес-содержащими гликанами (Рисунок 3).

300 -р-250 ■ 200 ■ | 150 - I 100 : ■ I ги I — ! 0 !_Ы31_К ■ 1.ее31Л \ о 1.е:31е:

Гэлесгин-1 Гапе*гин-2 Гапесгин-3 Галеггкн-4 Гапекгин-7 Г зпеиин-8 Гапеггиь 1-9

Рисунок 3. Сравнение связывания галектинов человека в составе клеток йа^ с олиголактозаминами и |_ес-содержащими гликанами. На оси абсцисс приведены исследуемые гликаны в составе гликоконъюгатов. Относительную флуоресценцию подсчитывали по формуле [(Р/Ро)хЮО]-ЮО, где р* - интенсивность флуоресценции клеток, нагруженных галектином, после инкубации с 5ид-РАА-р1ио, Ро - интенсивность флуоресценции клеток после инкубации с 5ид-РАА-р1ио в отсутствие галектина. За отсутствие связывания принимали величину флуоресценции <20.

выводы

1. Синтезированы (в виде 2-а.миноэтнл- или З-аминопропилгликозндов) линейные и разветвленные олиголактозамнны, а также Ьес-еодержащие олигосахарнды:

С1сЫАср1-ЗСа1р1-4С1сЫАсР-0(СН,),ЫН2 01еЫАсР 1 -6Са1р 1 -4С1сЫАс(!-0(С1-Ь),МЬЬ

01сЫАср!-3Са1р1"401^АсР"0(СН2)2ЫН2

Оа1р1-4С1еЫАср1-6Са сЫД _0(СН2)2КШ 01сЫАср1-3

Са.р.-4с!е^ер!оСа,РМС,сЫАсР-°(СН2^Н2 Са1р1-401сЫАср1-30а1рМ01сМЛср-0(СН,)2НН2 Саф 1 -401сЫЛс(! 1 -бОаф 1 -4С>1сЫЛс[!-0(СН,)2М1Ь

Оаф 1 -4С1сЫЛср 1 -6 аа1р1 -4С1сНАср-0(СН2),МН> Оа1р 1 -4С1сЫАсР 1 -3

аа1р1-Ю1сЫАср1-30а1р1-401сМАср1-30а1р1-401сЫАср-0(СН2ЬМН2

Саф 1 -ЗС1сЫ АсР-0(СН2)3ЫН2

С1еЫАер 1 -ЗСа1р 1 -ЗС1сЫАср-0(СН,),ЫН2

ваЩ! -ЗС1сЫАср 1 -Зваф 1 -ЗС1сЫАср-0(СН2ЬЫН2

Са1р1-ЗС1сЫАср1-ЗСа1р1-4С1сЫАср-0(СН2)_^Н2

Оа1р1 -ЗС1сЫАср 1 -6Са1р 1 -4С1сЫАс|!-0(СН2)>ЫН2

2. Показано, что эффективность гликознлирования [_ес-глнкозилдонором

ниже, чем лактозаминовым.

3. Синтезированы флуоресцеин-меченые гликоконъюгаты всех полученных олнгосахарндов, с помощью которых исследована углеводная специфичность галектинов-1, -2, -3, -4, -7, -8, -9 в составе клеточной мембраны. Показано, что галектнны предпочтительнее связываются с олиголактозаминами, чем с соответствующими 1_ес-содержащими глнканамн.

Список работ, опубликованпых по теме диссертации:

Статьи

1. В.В. Северов. И.М. Белянчиков, Г.В. Пазыннпа. Н.В. Бовин. Синтез N-ацетиллактозаминеодержащих олнгосахаридов - лигандов галектинов// Биоорг. Химия, 2007, Т. 33, стр. 131-147.

2. Г.В. Пазыннна, В.В. Северов, Н.В. Бовин. Синтез линейного трплактозамнна// Биоорг. Химия, 2008, Т. 34. стр. 696-730.

3. В.В. Северов, Г.В. Пазынина, Т.В. Овчинникова, Н.В. Бовин. Синтез олнгосахаридов, содержащих внутренний и терминальный фрагмент Gaipi-3GlcNAcp// Биоорг. Химия, 2015. Т. 41, стр. 1-15.

4. Е. М. Rapoport, S. Andre, О. V. Kurmvshkina, Т. V. Pochechueva, V. V. Severov, G. V. Pazynina, H.-J. Gabius, N. V. Bovin. Galectin-Loaded Cells as a Platform for the Profiling of Lectin Specificity by Fluorescent Neoglycoconjugates: a Case Study on Galectins-1 and -3 and the Impact of Assay Setting// Glycobiology, 2008, Vol. 18, pp. 315-324.

5. O.A. Вохмянина, E.M. Рапопорт, И.М. Рыжов, Е.Ю. Корчагина, Г.В. Пазынина, В.В. Северов, Г. Кальтнер, С. Андре, Г.-И. Габиус, Н.В. Бовин. Углеводная специфичность куриного и человеческого гатектннов-8 в составе клеток// Биохимия, 2011, Т. 76. стр. 1452-1460.

6. O.A. Vokhmyanina, E.M. Rapoport, S. Andre, V.V. Severov, I.M. Ryzhov, G.V. Pazynina, E.Yu. Korchagina, H.-J. Gabius, N.V. Bovin. Comparative study of the glycan specificities of cell-bound human tandem-repeat-type galectin-4, -8, and -9// Glycobiology, 2012, Vol. 22, pp. 1207-1217.

7. E.M. Rapoport, V.K. Matveeva, H. Kaltner, S. Andre, O.A. Vokhmyanina, G.V. Pazynina, V.V. Severov, I.M. Ryzhov, E.Yu. Korchagina, I.M. Belyanchikov, H.-J. Gabius, N.V. Bovin. Comparative lectinology: delineating glycan-specificity profiles of the chicken galectins using neoglycoconjugates in a cell assay//Glycobiology, 2015, doi: 10.1093/glycob'cwv012.

Тезисы докладов на конференциях

1. V.V. Severov, G.V. Pazynina, N.V. Bovin. Synthesis of N-acetyllactosamine-containing oligosaccharides — galectin ligands// 10th European Training Course on Carbohydrates, Wageningen, 9-12 June 2008. Book of Abstracts, p. 58.

2. O.A. Kurmyshkina, E.M. Rapoport, V.V. Severov, G.V. Pazynina, N.V. Bovin. Specificity of galectin-1 in cell composition// Meeting of the Society for glycobiology, 15-19 November, 2006, Los-Angeles, CA. Glycobiology, 2006, V.16, p. 85.

3. E.M. Рапопорт, O.B. Курмышкина, Г.В. Пазыннна, В.В. Северов, Е.Ю. Корчагина, Е.В. Моисеева, Н.В. Бовин. Гатектнны: углеводная специфичность в составе

клетки и роль в лектин-зависнмом фагоцитозе// VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.Л.Овчинникова, 25-27 октября 2006 г., Тезисы докладов, стр. 26.

4. N.V. Bovin, О.А. Kurmyshkina, V.V. Severov, Е.М. Rapoport. Unusual specificity of cell-bound galectins// XIX th International symposium on glycoconjugates, 15-20 July, 2007, Cairns, Australia.

Подписано в печать 20.04.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 60 Экз. Заказ № 5441-4-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39