Синтез и изучение свойств гликоконъюгатов природных хлоринов и бактериохлоринов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

□□3486584

На правах рукописи

ЛОНИН ИВАН СЕРГЕЕВИЧ

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ГЛНКОКОНЪЮГАТОВ ПРИРОДНЫХ ХЛОРИНОВ И БАКТЕРИОХЛОРННОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия

- з ПЕН 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003486584

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Доктор химических наук, профессор

Миронов Андрей Федорович

Официальные оппоненты: Доктор химических наук, профессор

Пономарев Гелий Васильевич

Доктор химических наук, профессор

Томилова Лариса Годвиговна

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт Физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН

Защита состоится «21» декабря 2009 года в часов на заседании

Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте http://mitht.ru

Автореферат разослан «20» ноября 2009 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, к.х.н., с.н.с.

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ1

Актуальность проблемы.

Фотодинамическая терапия (ФДТ) рака является относительно новым неинвазивным способом лечения злокачественных новообразований, основанным на применении трех малотоксичных компонентов, а именно фотосенсибилизатора (ФС), кислорода и неверного излучения, которые при совместном воздействии обусловливают цитотоксический эффект. В последнее время в качестве препаратов для ФДТ особое внимание привлекают ФС на основе природных хлоринов и бактериохлоринов. Данные соединения обладают низкой темновой токсичностью, подвергаются биодеградации и быстро выводятся из организма, а также характеризуются интенсивным поглощением в красной и ближней ИК-области спектра (650-830 нм), где проницаемость ткани для света максимальна, что позволяет воздействовать на глубоко залегающие опухоли и проводить терапию пигментированных новообразований, таких как меланомы.

Одним из дальнейших путей улучшения эффективности ФДТ является повышение селективности накопления ФС в опухоли. Решение данной задачи может быть достигнуто за счет связывания молекул пигмента с различными системами адресной доставки. В частности, в качестве лигандов, способных специфически связываться с рецепторами на поверхности опухолевых клеток, могут выступать углеводы. Из литературы известно, что многие виды рака отличаются повышенным уровнем экспрессии галектинов - белков, проявляющих высокую аффинность к /¡-галактозидам. Показано, что присоединение галактозы и лактозы к порфиринам и их аналогам обеспечивает специфическое связывание конъюгатов с галектинами клетки. Кроме того, присоединение к гидрофобному тетрапиррольному макроциклу углеводных фрагментов позволяет увеличить растворимость пигмента в водных растворах и может использоваться для придания молекуле амфифильного характера, что влияет на накопление и локализацию ФС в опухолевой клетке.

Таким образом, актуальным является синтез галактозилсодержащих конъюгатов на основе природных хлоринов и бактериохлоринов и исследование их биологической активности в качестве новых фотосенсибилизаторов для ФДТ рака.

Настоящая работа посвящена решению выше названных задач и является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС МИТХТ им М.В. Ломоносова по теме № 1Б-4-355 «Разработка химических и биотехнологических методов модификации биологически активных соединений с целью моделирования жизненно важных процессов

1 Работа выполнена при участии доцента каф. ХТБАС М.А. Грина.

в природе и создания новых лекарственных препаратов», и выполнена при поддержке гранта РФФИ 07-03-00452-а (Новый инфракрасный катионный фотосенсибилизатор на основе бактериохлорофилла о).

Целью работы является синтез и изучение свойств гликоконъюгатов природных хлоринов и бактериохлоринов, включающий разработку методов синтеза модифицированных хлорофиллов для получения на их основе высокоэффективных фотосенсибилизаторов направленного действия для диагностики и терапии злокачественных новообразований. Достижение поставленной цели потребовало решения следующих экспериментальных задач:

1. Разработка способов направленной функционализации хлоринов и бактериохлоринов для последующего введения углеводных фрагментов.

2. Синтез гликоконъюгатов, содержащих моно- и дисахаридные фрагменты в различных положениях хлоринового макроцикла.

3. Структурный анализ углеводсодержащих хлоринов и бактериохлоринов с использованием современных методов ЯМР.

4. Предварительная оценка фотоиндуцированной активности полученных гликоконъюгатов.

Научная новизна. В работе предложены новые эффективные подходы к синтезу углеводсодержащих конъюгатов природных хлоринов. Одним из них является использование реакции Cu-катализируемого 1,3-диполярного циклоприсоединения терминальных алкинов и азидов ("click chemistry"). Для ее реализации впервые получены производные хлорофилла а и бактериохлорофилла а с терминальной тройной связью в различных положениях макроцикла. Адаптированы условия "click''-реакции для получения углеводсодержащих хлоринов и бактериохлоринов. Другой подход, использованный для синтеза гликохлоринов, основан на реакции кросс-метатезиса олефинов. Были получены новые алкенильные производные хлорофилла а и показана перспективность данного метода в синтезе конъюгатов хлоринов с различным положением углеводного остатка в макроцикле. Оценена фотоцитотоксичность полученных гликоконъюгатов на клетках НЕр2 и показана перспективность использования некоторых из них в качестве эффективных фотосенсибилизаторов для ФДТ рака.

Практическая значимость. В результате данного научного исследования разработаны универсальные подходы к созданию углеводсодержащих производных природных хлоринов и бактериохлоринов. Получен модификационный ряд гликоконъюгатов на основе природных хлоринов и показана перспективность использования некоторых из них в ФДТ рака.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка подходов к синтезу гликоконъюгатов на основе природных хлорофиллов.

2. Синтез производных природных хлоринов и бактериохлоринов с терминальными двойными и тройными связями.

3. Использование метода "click chemistry" в синтезе углеводсодержащих хлоринов и бактериохлоринов.

4. Применение кросс-метатезиса олефинов для получения гликохлоринов с различным положением сахарного остатка в макроцикле.

5. Установление структур полученных гликоконьюгатов методом ЯМР.

6. Результаты предварительных биологических исследований углеводсодержащих производных природных хлоринов и бактериохлоринов.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены и обсуждены на VII и VIII школах-конференциях молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений (Одесса, 2007, Гагра, 2009), V Международной конференции по порфиринам и фталоцианинам (ICPP-5, Москва, 2008), X Международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов (Иваново, 2009), V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2009).

Публикации. По теме диссертации имеется 10 публикаций, в том числе 3 статьи в отечественных и зарубежных научных журналах.

Объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на_стр., содержит_рисунков,_схем,_таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В последние годы наблюдается повышенный интерес к углеводсодержащим тетрапиррольным соединениям. Данные вещества находят применение в различных областях науки и техники, таких как молекулярное узнавание, катализ энантиоселективного окисления и создание новых сенсоров. Кроме этого, гликопорфирины широко исследуются в медицинских целях в качестве ФС для ФДТ рака. Это обусловлено тем, что введение в состав пигмента moho-, ди- и олигосахаридных фрагментов позволяет не только придавать ФС амфифильный характер, но и может обеспечить направленную доставку в опухоль за счет взаимодействия с галектинами, которые сверхэкспрессированы на поверхности раковых клеток. Однако, количество работ, посвященных синтезу и применению гликоконъюгатов на основе природных хлоринов, ограничено, а предложенные способы их получения малоэффективны. В то же время, наибольший интерес для ФДТ представляют именно природные хлорины и бактериохлорины, так как они обладают рядом преимуществ перед синтетическими аналогами благодаря своим уникальным фотофизическим и биологическим свойствам.

Используя хлорофилл а и бактериохлорофилл а в качестве исходных соединений, в настоящей работе были выполнены исследования, целью которых явилось получение гликоконъюгатов природных пигментов как потенциальных эффективных ФС для ФДТ рака.

1. ГЛИКОКОНЪЮГАТЫ НА ОСНОВЕ ХЛОРОФИЛЛА а

Создание углеводсодержащих ФС на основе природных хлоринов является комплексной проблемой, включающей выбор методов образования конъюгатов, синтез функционализированных производных и получение на их основе соответствующих гликохлоринов. Структура хлорофилла а открывает широкие возможности для направленной функционализации хлоринового макроцикла. В настоящей работе для синтеза углеводсодержащих конъюгатов хлоринового ряда были использованы два основных подхода, включающие введение углеводного фрагмента посредством модификации экзоцикла Б и р-винильной группы в пиррольном кольце А (Схема 1). Необходимо отметить, что стратегия синтеза конъюгатов на основе таких лабильных объектов, как природные хлорины и бактериохлорины, должна отвечать определенным требованиям, главные из которых - это доступность и простота получения исходных соединений, мягкие условия проведения реакции и высокий выход целевого продукта.

Схема 1. Подходы к синтезу гликоконъюгатов в раду хлорофилла а.

1.1. Использование "click chemistry" в синтезе гликоконъюгатов природных хлоринов

Ключевой стадией для получения гликоконъюгатов на основе хлорина ег, являлась Cu-катализируемая реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения терминальных алкинов и азидов ("click chemistry"). Данное взаимодействие удовлетворяет вышеперечисленным требованиям, отличается универсальностью и используется для создания сложных биоконъюгатов, иммобилизации биомолекул на матрицах различной природы и присоединения биологически активных веществ к адресным системам доставки.

Ключевым соединением в синтезе являлся метиловый эфир феофорбида а (3), который был получен из хлорофилла а (1), выделяемого из микроводоросли Spirulina Platensis (Схема 2). Известно, что экзоцикл феофорбида вступает в ретро-конденсацию Дикмана с различными нуклеофилами, включая низкомолекулярные первичные и вторичные амины, давая соответствующие 13'-амиды. В настоящей работе при действии пропаргиламина был получен амид 4 с выходом 86%.

Далее этинильное производное 4 конденсировали с перацетатом (2-азидоэтил)-у?-0-галактопиранозида (6), полученным при действии на 2-бромэтапьный предшественник азидом натрия по описанной ранее методике2. Реакцию циклоприсоединения проводили в

2 Модифицированные углеводы 6,10 синтезированы в лаборатории проф. Ю.Л. Себякина, МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

ацетошггриле с добавлением диизопропилэтиламин (01РЕА) в присутствии 10 мол. % иодида меди(1). Однако, при этих условиях в течение первых 10 минут наблюдалось гипсохромное смещение длинноволновой полосы поглощения с 663 до 635 нм за счет образования Си-комплекса хлорина. В связи с этим был реализован иной подход, основанный на использовании гп-комплекса амида 5. Было показано, что гп-комплекс производного хлорина ев 5 в условиях реакции является устойчивым, и ион цинка не подвергается замещению на ион меди. Подобная «защита» катионом 2п2+ с последующим деметаллированием комплекса 7 в слабокислой среде позволила получить гликоконъюгат 8 с выходом 84%. Стоит отметить, что реакция протекает полностью региоселективно с образованием 1,4-дизамещенного 1,2,3-триазола. Последующие удаление защитных ацетильных групп в присутствии раствора метоксида натрия в метаноле с последующим подкислением уксусной кислотой приводило к галактозилхлорину 9 с выходом 90%. Аналогичным образом, с выходом 82%, был получен лактозилхлорин 12, который после деблокирования гидроксильных групп дисахарида давал конъюгат 13 с выходом 85%.

Схема 2. Синтез гликоконъюгатов природных хлоринов с использованием "click chemistry".

Полученные конъюгаты были охарактеризованы физико-химическими методами анализа, включая ИК- и электронную спектроскопию, масс-спектрометрию, в том числе HRMS (масс-спектрометрия высокого разрешения), а так же с использованием спектроскопии ЯМР.

1.2. Установление структуры гликохлоринов методом ЯМР

Структура соединений 8 и 12 была установлена с помощью одно- и двумерной спектроскопии ЯМР. Сигналы в спектрах 'Н и 13С ЯМР были полностью отнесены с помощью двумерной гомоядерной корреляционной спектроскопии (COSY), 'н,13С -эксперимента по гетероядерной одноквантовой когерентности (HSQC) и гетероядерной корреляции через множественные связи (НМВС). Отнесение сигналов в спектрах ЯМР соединения 12 также проводили при помощи тотальной корреляционной спектроскопии (TOCSY) и спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат (ROESY). Последний эксперимент был использован для подтверждения региоспецифического образования 1,4-дизамещенного триазола. Так, сигналы двух неэквивалентных протонов НЗ1 (-СН2-СН2- фрагмента спейсера) были определены из корреляции Н2-Н31 в спектре ROESY, что подтвердило (наряду с Н2-Н11 корреляцией) место присоединения хлорина и углеводного остатка к триазольному кольцу (Рис. 1).

Рис. 1. Структура гликоконьюгата 12. Пунктирные линии обозначают границы остатков: хлорин е6 (Chl), триазол и спейсеры (Trz), остаток /í-D-глкжопиранозы (GIc), остаток /S-D-галактопиранозы (Gal). Наблюдаемые протон-протонные NOE-корреляции показаны стрелками (в том числе не упомянутые в тексте).

1.3. Кросс-метатезис олефииов в синтезе гликоконъюгатов на основе хлорофилла а

Ранее было показано, что введение одинаковых заместителей в различные положения хлоринового макроцикла по-разному влияет на амфифильность молекулы и, как следствие, на биологические свойства пигмента. В частности, отмечалось, что гидрофильные заместители в пиррольном кольце А значительно увеличивают фотодинамическую эффективность ФС (Я.К. Рапс1еу а а1, 2007). Наличие винильной группы у производных хлорофилла а значительно упрощает получение гликозилированных хлоринов с использованием реакции кросс-метатезиса алкенов.

Ключевым соединением в синтезе являлся триметиловый эфир хлорина ев (14), полученный раскрытием экзоциклического фрагмента в метилфеофорбиде а (3) действием метоксида натрия. Хлорин 14 вводили в реакцию сочетания с тетраацетатом аллил-/?-0-галактопиранозида (15), полученным по известной методике гликозилирования аллилового спирта. Кросс-метатезис проводили в присутствии катализатора Граббса второго поколения (Схема 3). Изучение данного взаимодействия показало, что оптимальными условиями проведения реакции является кипячение хлорина 14 с четырехкратным избытком аплилгалактозида 15 в хлористом метилене в течение 16 часов в присутствии 25 мол. % катализатора. Выход гликоконъюгата 16 в данных условиях составил 40%, причем увеличение концентрации катализатора и/или аплилгалактозида 15 не оказывало влияния на степень конверсии исходного хлорина 14. Данное взаимодействие протекает стереоселективно с образованием двойной связи Е-конфигурации и характеризуется отсутствием побочных продуктов, что упрощает хроматографическую очистку целевого продукта и позволяет регенерировать исходный хлорин 14 для его повторного использования в реакции.

Кат.

Схема 3. Синтез гликоконъюгата на основе хлорина е6 с остатком галактозы в пиррольном цикле А.

Другим местом связывания хлоринового макроцикла с остатком углевода служила аллильная группа в пиррольном кольце С, которую вводили путем раскрытия экзоцикла Е мезофеофорбида 18 под действием аллиламина. Гидрирование винильной группы в пиррольном кольце А феофорбида 3 до этильной диктовалось необходимостью региоселективного введения углеводного фрагмента в положение 13 макроцикла. Каталитическое гидрирование феофорбида 3, протекающее с количественным выходом, и последующее взаимодействие мезофеофорбида 18 с аллиламином приводило к аллиламиду мезохлорина ев (19) с общим выходом 85% (Схема 4).

Взаимодействие последнего с тетраацетатом аллил-/9-0-галактопиранозида 15 в соотношении 1:5 в присутствии 5 мол. % катализатора Граббса в течение 4 часов давало конъюгат 20. Избыток одного из реагентов необходим для смещения равновесия в сторону образования продукта реакции 20, так как из литературы известно, что аллильные производные в условиях реакции кросс-метатезиса могут образовывать гомодимеры. Следует отметить, что в данном случае реакция протекала с меньшей стереоселективностью по сравнению с вышеописанным кросс-метатезисом по винильной группе в пиррольном цикле А. Наблюдалось образование двух изомерных конъюгатов с ¿//-соотношением 5:1 (по данным ЯМР) с общим выходом 80%. Нам удалось разделить изомеры с помощью препаративной тонкослойной хроматографии и выделить основной продукт (£-изомер), обладающий меньшей хроматографической подвижностью.

Схема 4. Синтез конъюгата на основе мезохлорина е6 с остатком галактозы в пиррольном цикле С.

При создании новых высокоэффективных ФС необходимо стремиться к тому, чтобы максимум поглощения находился в районе 700-850 нм. В ряду хлорофилла а в указанный диапазон попадают производные с имидным экзоциклом (А.тах - 700 нм). Поэтому следующий этап работы состоял в синтезе гликоконъюгатов на основе пурпуринимидов. Исходным соединением являлся пурпурин 18 (22), который был

получен посредством алломеризации хлорофилла а. Дальнейшая стратегия синтеза включала региоселективное введение углеводного фрагмента либо в пиррольное кольцо А, либо в имидный экзоцикл Е. Для реализации первого подхода был получен /V-метоксипурпуринимид 23 по ранее разработанной на кафедре ХТБАС методике, состоящей в действии на пурпурин 18 (22) гидрохлоридом гидроксиламина в пиридине с последующим метилированием диазометаном (Схема 5). Циклоимид 23 далее вводили в реакцию кросс-метатезиса с перацетатом аллил-/№-галактопиранозида 15. Однако, даже длительное кипячение пурпуринимида 23 с большим избытком аллилгалактозида и увеличение количества катализатора Граббса вплоть до 1 эквивалента не позволило добиться выхода конъюгата 24 более 5%. Данный факт может быть объяснен влиянием экзоциклического фрагмента, сопряженного с основным макроциклом, на винильную группу в 3-м положении. По-видимому, имидный цикл, обладая электроноакцепторными свойствами, дезактивирует винильную группу, снижая ее реакционную способность в реакции кросс-метатезиса.

Схема 5. Кросс-метатезис олефинов в синтезе углеводсодержащих пурпуринимидов.

Более реакционноепоеобной оказалась терминальная двойная связь при экзоцикле Е. Для реализации второго подхода пурпурин 18 (22) метилировали с помощью диазометана, а затем подвергали каталитическому гидрированию в виде гп-комплекса (Схема 5). После деметаллирования в кислой среде мезопурпурин 25 был выделен с общим выходом около 90%. Последний вводили в реакцию с аллиламином, что приводило к раскрытию ангидридного цикла с образованием изомерных 13- и 15-амидов, о чем свидетельствовало гипсохромное смещение длинноволновой полосы поглощения с 690 нм до 650 нм. Рециклизацию осуществляли последовательной обработкой смеси изомерных амидов диазометаном и раствором КОН в метаноле, что приводило к УУ-аллилмезопурпуринимиду (26) с общим выходом 85%. Реакцию сочетания осуществляли в условиях, аналогичных получению конъюгата 20. В данном случае стереоселективность реакции была выше, и соотношение £>г-изомеров составило 6:1. Основной £-изомер был выделен хроматографически с выходом 62%.

Удаление защитных ацетильных групп в соединениях 16, 20 и 27 под действием метоксида натрия в системе МеОН/СН2СЬ приводило к гликоконъюгатам 17, 21 и 28 с выходами 65-85%.

1.4. Анализ спектров ЯМР галактозилсодержащих хлоринов

Анализ спектра ПМР конъюгата 16 показал, что кросс-метатезис с участием хлорина 14 протекает полностью стереоселективно, и образующийся апкен обладает Е-конфигурацией, о чем свидетельствует наблюдаемое значение КССВ протонов при двойной связи 3Унз'-нз2 равное 16 Гц (Рис. 2).

Рис. 2. Спектр ПМР гликоконъюгата 16.

С другой стороны, 'н ЯМР спектры продуктов реакции кросс-метатезиса хлорина 19 и пурпуринимида 26 оказались сложнее, что связано с образованием изомерных форм конъюгатов 20 и 27. В частности, наблюдались сигналы протонов двойной связи для Е- и ¿-изомеров, которым соответствуют значения КССВ 3Ушз4-шз5 15 и 11 Гц, соответственно. Интегрирование сигналов в спектрах 'Н ЯМР показало, что данные изомеры образуются в соотношении (1-У/) 5:1 и 6:1 для конъюгатов 20 и 27, соответственно, что согласуется с литературными данными. Нам удалось разделить изомерные гликоконъюгаты с помощью препаративной тонкослойной хроматографии, причем соединения с меньшей хроматографической подвижностью соответствовали ¿-изомерам (Рис.3). Структуры последних были также подтверждены полным отнесением сигнатов в спектре 13С ЯМР, с использованием двумерных гетероядерных экспериментов 'н,13С - Ш(2С и 'Н,13С -НМВС.

А

Gai

\

>

0-тгСН2

e.fta% 13Л. "... (-j

N О

I 13»

,СН2-..

13« j

н -С

6.7 Mz

ни'

1/\

\J \

\л

в

Н13«

н

И! А

у V V !.

i,

IV V

vVi

O^n O

1?,' I 13=

...H. ,CH2-..

.13<

' 13" ib ь H2

*. 6.0 Hz

Gai

fc.iO 6.15

S.90

Рис. 3. Фрагменты спектров ПМР изомерных форм конъюгата 27 после хроматографического разделения. А: область алкенильных протонов соединения Z-27 (Bruker DPX 300); В: область алкенильных протонов соединения Е-21 (Bruker Avance 600).

2. ГЛИКОКОНЪЮГАТЫ В РЯДУ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА а

Переход к синтезу гликоконъюгатов в ряду бактериохлорофилла а обусловлен поиском ФС, поглощающих в области спектра, где проницаемость ткани для света максимальна. Полученные ранее в нашей лаборатории разнообразные циклические имиды бактериохлорина р показали высокую химическую стабильность, а батохромный сдвиг длинноволновой (2-полосы в область 800-830 нм делает их перспективными в качестве ФС для ФДТ. В связи с этим вышеописанный подход к синтезу гликоконъюгатов хлоринов с использованием 1,3-диполярного циклоприсоединения был успешно реализован в синтезе лактозильных производных циклических имидов бактериохлорина р. Введение углеводного остатка в различные положения макроцикла был осуществлен на основе бактериопурпуринимидов за счет модификации имидного экзоцикла Е и ацетильной группы пиррольного кольца А (Схема 6).

Введение углеводного фрагмента посредством модификации экзоцикла Е

Введение углеводного фрагмента с использованием ацетильной группы пиррольного кольца А

Н, Н3СЧ

PWO2C Me02tf „-a

Бактериохлорофилл а (29) W 800 - 830 нм у 4 *

Схема 6. Подходы к синтезу гликоконъюгатов в ряду бактериохлорофилла а.

Н.»СН3

2.1. Синтез лактозильных производных бактериохлорина р

Ключевым соединением в синтезе лактозильных производных в бактериохлориновом ряду являлся бактериопурпурин (БП) (30), который получали из бактериохлорофилла а (29), содержащегося в биомассе пурпурных бактерий Rhodobacter capsulants (Схема 7). Метиловый эфир БП (31) вводили в реакцию с пропаргиламином при кипячении в хлороформе. Однако, наличие в молекуле БП двух высоко электрофильных центров (ацетильной группы и ангидридного экзоцикла) приводит к неоднозначному протеканию реакции и возможности образования наряду с циклоимидом 32 также диалкинильного продукта 33 (Схема 7). Изучение данной реакции показало, что изменение количества пропаргиламина и времени ее протекания позволяет влиять на соотношения продуктов 32 и 33. Так, кипячение в хлороформе метилового эфира БП (31) с 8-кратным избытком пропаргиламина в течение 16 часов приводило к получению циклоимида 32 с выходом 60% и основания Шиффа 33 с выходом 20%. Увеличение

избытка пропаргиламииа (40 эквив.) и продолжительности реакции до 40 часов преимущественно приводило к образованию дипропаргильного производного 33. Последующее хроматографическое разделение реакционной смеси позволяло выделить циклоимиды 32 и 33 в индивидуальном виде.

Схема 7. Синтез пропаргильных производных бактериохлоринового ряда.

Далее циклоимид 32 вводили в реакцию с азидным производным лакгозида 34, полученным последовательным ацилированием перацетата аминолактозида глицином и азидоуксусной кислотой3 (Схема 8). Выбор углевода обусловлен специфичностью углеводузнающего домена галектинов к последовательностям ди- и олигосахаридов с терминальным остатком /3-галактозы. Реакцию 1,3-диполярного циклоприсоединения проводили с использованием иодида меди(1) в хлористом метилене с добавлением диизопропилэтиламина в качестве основания (Схема 8).

С 35: Я = Ас 36: = Н

Схема 8. Синтез углеводсодержащего бактериопурпуринимида 36.

Реакция протекала 20 мин при комнатной температуре, приводя к гликоконъюгату 35 с 80%-ным выходом, при этом образование Си-комплекса циклоимида

3Лактозильное производное 34 синтезировано в лаборатории проф. Ю.Н. Книреля, ИОХ РАН.

32 не наблюдалось, что не противоречит известному факту, согласно которому легкость образования металлокомплексов падает в ряду порфирины > хлорины > бактериохлорины.

Для направленного введения углеводного фрагмента в пиррольный цикл А, в качестве исходного соединения был использован Л'-диметиламинобактериопурпуринимид 37, который был получен из бактериопурпурина (30) по ранее разработанной методике в нашей лаборатории (Схема 9). Кипячение циклоимда37 с пропаргиламином в хлороформе привело к образованию соответствующего основания Шиффа, которое затем было восстановлено боргидридом натрия. Образовавшуюся смесь диастереомерных пропаргильных производных 38 вводили в сочетание с азидным производным перацетата лактозы 34, что приводило к конъюгату 39 с выходом 83%.

Удаление защитных ацетильных групп в соединениях 35 и 39 под действием метоксида натрия в метаноле позволило впервые получить углеводсодержащие конъюгаты 36 и 40 на основе природных бактериохлоринов.

Схема 9. Направленное введение углеводного фрагмента в пиррольное кольцо А бактериохлоринового макроцикла.

Известно, что увеличение количества углеводных остатков в гликоконъюгатах приводит к повышению эффективности связывания с галектинами. В связи с этим был осуществлен синтез бивалентного лактозилсодержащего производного бактериохлорина на основе пурпуринимида 33. Для этого последний восстанавливали боргидридом натрия с образованием смеси диастереомерных пропаргиламинов 41, которые затем вводили в

30 37 38

2.2. Синтез бивалентного лактозилбактериопурпуринимида

реакцию сочетания с лактозидом 34 (2 эквив.) (Схема 10). В результате был получен конъюгат 42 с выходом 70%, который после деблокирования гидроксильных групп обладал повышенной гидрофильностью и ограничено растворялся в воде.

2.3. Доказательство структур лактозилбактериопурпуринимидов с использованием методов ЯМР

Строение полученных соединений 35, 39, 42 было подтверждено методами одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР на протонах и ядрах 13С, 15N. При помощи двумерных методик COSY, TOCSY, ROESY и 'н,13С - hsqc были отнесены все сигналы в протонных спектрах и сигналы гидрогенизированных атомов углерода в спектрах 13С-ЯМР. При помощи спектров ROESY, ]Н,13С - и 'h,15N - НМВС было подтверждено взаимное расположение фрагментов молекулы (углеводного остатка, спейсерной группы и бактериохлоринового макроцикла), и сделано полное отнесение всех сигналов ядер 13С и 13N. Показано, что соединения 39 и 42 присутствуют в виде двух диастереомеров в соотношении 1:1, которые отличаются рядом сигналов в спектрах ЯМР.

3. ФОТОИНДУЦИРОВАННАЯ АКТИВНОСТЬ ГЛИКОКОНЪЮГАТОВ ПРИРОДНЫХ ХЛОРИНОВ И БАКТЕРИОХЛОРИНОВ*

Оценку фотоиндуцированной активности полученных углеводсодержащих хлоринов и бакгериохлоринов проводили на линии трансформированных клеток Нер2 (эпидермоидная карцинома гортаноглотки), при плотности посева 60 тыс. кл./мл и времени инкубации до облучения 2 часа. Во всех экспериментах облучение проводилось с использованием широкополосного фильтра КС-13 (Х5630 нм) при дозе света 10 Дж/см2. Показано, что все синтезированные гликоконъюгаты не проявляли темновой токсичности в исследованном диапазоне концентраций (до 10 мкМ). Полученные данные по фотоцитотоксичности представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты предварительных биологических исследований in vitro на линии клеток Нер2.

Соединение ик5„ (мкМ) Комментарии

№ соединения Тип углеводного фрагмента Структура спейсера* Тип макроцикла

17 Gal R2 Хлорин ев 0.02 Высокая

28 Gal Мезо- 0.11 фототоксичность

RV пурпуринимид

21 Gal Мезохлорин ев 0.43

12 Gal К* Хлорин ев 0.80

13 Lac к^ N н* вГ — N Хлорин 0.97 Средняя фототоксичность

40 LacNH2 о rf Бактерио-пурпуринимид 2.24

36 LacNH2 1 rS в-.,,,A^V" Бактерио-пурпуринимид Фототоксичноть

43 2 LacNH2 i н" Бактерио-пурпуринимид отсутствует

14

Триметиловый эфир хлорина ев

0.16

* R - остаток углеводного фрагмента; R*- остаток тетрапиррольного макроцикла

4Биологические испытания проведены в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена в лаборатории проф. Р.И. Якубовской

Как видно из таблицы 1, наибольшую фотоцитотоксичность проявили гликоконъюгаты в ряду хлорофилла а, содержащие остаток галактозы (17 и 28). Введение в состав ФС триазолсодержащего спейсера и/или дисахаридного остатка приводило к снижению фотоцитотоксичности пигментов на данной линии клеток. Из всех полученных в настоящей работе гликоконьюгатов два гапактозильных производных хлорофилла а (17 и 28) обладают высокой фотоцитотоксичностью в сочетании с низкой темновой токсичностью, что делает их перспективными ФС для ФДТ рака.

4. ВЫВОДЫ

1. Получены новые функционапизированные производные природных хлоринов и бактериохлоринов с терминальными двойными и тройными связями.

2. Разработаны способы получения гликоконьюгатов на основе природных хлоринов с использованием реакций "click chemistry" и кросс-метатезиса олефинов.

3. Синтезирован ряд природных хлоринов, содержащих моно- и дисахаридные фрагменты.

4. Осуществлен региоселективный синтез гапактозилхлоринов с использованием реакции кросс-метатезиса олефинов.

5. Впервые получены гликоконъюгаты на основе бактериохлорофилла а.

6. Установлены структуры полученных соединений с использованием современных методов ЯМР.

7. Выполнены предварительные биологические испытания синтезированных углеводсодержащих хлоринов и бактериохлоринов.

Выражаю особую благодарность спектроскопистам ЯМР, принимавшим непосредственное участие в исследовании структур полученных соединений: сотрудникам лаборатории ЯМР ИОХ РАН ст.науч.сотр. Ф.В. Тоукачу и науч.сотр. В.В. Качапе, а также научному сотруднику лаборатории ЯМР ГНИИХТЭОС Д.А. Пешкову.

Список публикаций по теме диссертации

1. Grin М.А., Lonin I.S., Makarov A.I., Lakhina A.A., Toukach F.V., Kachala V.V., Orlova A.V. and Mironov A.F. / Synthesis of chlorin-carbohydrate conjugates by 'click chemistiy'//Mendeleev Commun., 2008, V. 18, P. 135-137.

2. Lonin I.S., Makarov A.I., Lakhina A.A., Guryeva L.Yu., Grin M.A., Sebyakin Y.L. and Mironov A.F. / The synthesis of chlorin-carbohydrate conjugates via 1,3-dipolar cycloaddition between carbohydrate azides and chlorins with terminal triple bond // J. Porphyrins Phthalocyanines, 2008, V. 12, P. 619.

3. Grin M.A., Lonin I.S., Lakhina A.A., Ol'shanskaya E.S., Makarov A.I., Sebyakin Y.L., Guryeva L.Yu., Toukach P.V., Kononikhin A.S., Kuzmin V.A. and Mironov A.F. / 1,3-Dipolar cycloaddition in the synthesis of glycoconjugates of natural chlorins and bacteriochlorines // J. Porphyrins Phthalocyanines, 2009, V. 13, P. 336-345

4. Лонин И.С., Федюнин C.B., Макаров А.И., Грин М.А., Миронов А.Ф. / Синтез функциональных производных природных хлорофиллов для "click chemistry" // Тезисы докладов VII школы-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений, Одесса, 2007, С. 54-55.

5. Лонин И.С. / Разработка методов синтеза функциональных производных хлорофиллов для "click chemistry" // Тезисы II Молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технолгии», Москва, 2007, С. 46.

6. Грин М.А., Лонин И.С., Макаров А.И., Ольшанская Е.С., Новикова О.С., Лихошерстов Л.М., Миронов А.Ф. / Гликоконъюгата природных хлорофиллов: направленное введение углеводов в хлориновый макроцикл // Тезисы 10 Международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов, Иваново, 2009, С. 59.

7. Лонин И.С., Лахина A.A., Грин М.А., Миронов А.Ф. / Реакция кросс-мет атезиса в синтезе гликозилированных хлоринов // Тезисы 10 Международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов, Иваново, 2009,С. 65.

8. Лонин И.С., Грин М.А., Лахина A.A., Ольшанская Е.С., Макаров А.И. / Синтез гликоконъюгатов в ряду природных хлорофиллов // Тезисы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009, С. 165-166.

9. Лонин И.С., Лахина A.A., Грин М.А., Миронов А.Ф. / Синтез углеводсодержащих хлоринов // Тезисы докладов VIII школы-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений, Гагра, 2009, С. 32

10. Ольшанская Е.С., Грин М.А., Лонин И.С., Макаров А.И., Новикова О.С., Лихошерстов Л.М., Миронов А.Ф. / Первые углеводные производные в бактериохлориновом ряду: синтез и свойства // Тезисы докладов VIII школы-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений, Гагра, 2009, С. 41.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛИКОКОНЪЮГАТЫ НА ОСНОВЕ

ДИ- И ТЕТРАГИДРОПОРФИРИНОВ.

1.1. Природные гликохлорины.

1.2. Гликоконъюгаты на основе синтетических ди- и тетрагидропорфиринов.

1.2.1. Синтез гликохлоринов на основе углеводсодержащих порфиринов.

1.2.2. Гликобензохлорины.

1.2.3. Реакции циклоприсоединения в синтезе углеводсодержащих хлоринов и бактериохлоринов.

1.3. Гликоконъюгаты на основе природных хлоринов и бактериохлоринов.

1.3.1. Гликоконъюгаты на основе производных феофорбида а.

1.3.2. Углеводсодержащие пурпуринимиды.

Фотодинамическая терапия (ФДТ) рака является относительно новым неинвазивным способом лечения злокачественных новообразований, основанным на применении трех малотоксичных компонентов, а именно фотосенсибилизатора (ФС), кислорода и лазерного излучения, которые при совместном воздействии обусловливают цитотоксический эффект. В последнее время в качестве препаратов для ФДТ особое внимание привлекают ФС на основе природных хлоринов и бактериохлоринов. Данные соединения обладают низкой темновой токсичностью, подвергаются биодеградации и быстро выводятся из организма, а также характеризуются интенсивным поглощением в красной и ближней ИК-области спектра (650-830 нм), где проницаемость ткани для света максимальна, что позволяет воздействовать на глубоко залегающие опухоли и проводить терапию пигментированных новообразований, таких как меланомы [1].

Одним из дальнейших путей улучшения эффективности ФДТ является повышение селективности накопления ФС в опухоли. Решение данной задачи может быть достигнуто за счет связывания молекул пигмента с различными системами адресной доставки. В частности, в качестве лигандов, способных специфически связываться с рецепторами на поверхности опухолевых клеток, могут выступать углеводы. Из литературы известно, что многие виды рака отличаются повышенным уровнем экспрессии галектинов - белков, проявляющих высокую аффинность к /?-галактозидам. Показано, что присоединение галактозы и лактозы к порфиринам и их аналогам обеспечивает специфическое связывание конъюгатов с галектинами клетки. Кроме того, присоединение к гидрофобному тетрапиррольному макроциклу углеводных фрагментов позволяет увеличить растворимость пигмента в водных растворах и может использоваться для придания молекуле амфифильного характера, что влияет на накопление и локализацию ФС в опухолевой клетке [2].

Таким образом, актуальным является синтез галактозилсодержащих конъюгатов на основе природных хлоринов и бактериохлоринов и исследование их биологической активности в качестве новых фотосенсибилизаторов для ФДТ рака.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ГЛИКОКОНЪЮГАТЫ НА ОСНОВЕ ДИ- И ТЕТРАГИДРОПОРФИРИНОВ

Порфирины и родственные соединения находят широкое применение в различных областях науки, техники и медицины благодаря их уникальным фотофизическим и электрохимическим свойствам. Начиная с 70-х годов прошлого века порфирины начали активно изучаться в качестве ФС для фотодинамической терапии онкологических, сердечнососудистых, кожных, глазных и инфекционных заболеваний [3-6]. На сегодняшний день фотодинамическая терапия является эффективным неинвазивным методом лечения, основанным на применении ФС, которые после накопления в опухоли при облучении светом определенной длинны волны способны вызывать цитотоксический эффект, в основном за счет образования синглетного кислорода ('Ог, реакция II типа) или свободных радикалов (реакция I типа) [7]. Первым ФС для лечения различных видов рака, в том числе рака легкого, желудочно-кишечного тракта, шейки матки и других видов, был препарат Photofrin® [8]. Несмотря на его успешное применение в таких странах, как США, Канада, Германия и Япония, данный препарат оказался далеко не идеальным ФС для ФДТ. Photofrin® представляет собой сложную смесь мономеров и олигомеров, производных гематопорфирина IX, причем активными являются лишь некоторые компоненты данной смеси [9]. К тому же, максимум поглощения ФС составляет всего 630 нм, ограничивая проникновение света в ткани лишь на глубину до 5 мм. Другим недостатком является высокий уровень накопления препарата в коже, что вызывает после проведения ФДТ длительную светочувствительность сроком до 10 недель. В связи с этим актуален поиск новых высокоэффективных ФС второго поколения [2, 10].

Ключом к решению вышеназванных проблем является понимание зависимости между структурой и активностью для соединений данного класса. Установлено, что эффективность ФДТ зависит от различных факторов, ключевыми из которых являются фотофизические и спектральные характеристики пигмента, а именно, высокий уровень генерации 'СЬ и наличие максимума поглощения в красном и ближнем ИК-диапазоне (650 - 850 нм), где проницаемость света в ткани максимальна. Этим требованиям удовлетворяет большинство гидрированных аналогов порфиринов, а именно хлорины и бактериохлорины.

Следующей важной характеристикой ФС, обусловливающей эффективность препарата, является коэффициент накопления, пигмента в раковой опухоли, который определяется как отношение концентрации вещества в опухоли к окружающей ее здоровой ткани. Хотя механизм относительно селективного накопления ФС порфириновой природы недостаточно ясен, полагают, что амфифильный характер молекулы играет важную роль [9, 11, 12]. Присоединение к гидрофобному порфириновому макроциклу полярных молекул, включая остатки Сахаров, не только придает амфифильный характер ФС и увеличивает его растворимость в воде, но также может повышать коэффициент накопления препарата за счет адресной доставки в опухоль.

Практически для всех типов Сахаров известны соответствующие рецепторы на поверхности клеток. Среди них особое место занимают рецепторы, регулирующие транспорт глюкозы (ОЬиТэ), которые характеризуются повышенной экспрессией в опухолях. Глюкоза является гидрофильным соединением и не может проникать сквозь липидный бислой посредством обычной диффузии. Для ее транспорта внутрь клетки необходимы специфичные белки-транспортеры. Функция ОЬиТэ заключается в регулировании переноса глюкозы между внеклеточным и внутриклеточным пространством, поддерживая ее концентрацию на уровне, необходимом для метаболизма [13].

Во время деления и роста клеток их потребность в энергии возрастает, что особенно актуально для бесконтрольно растущей опухоли. Для получения АТФ из глюкозы в ходе окислительного фосфорилирования расходуется большое количество кислорода. Однако, несмотря на то, что в процессе своего роста опухоль формирует собственные сосуды для доставки кислорода и питательных веществ, скорость ангиогенеза отстает от скорости канцерогенеза. Это приводит к появлению областей гипоксии в опухоли, что сопровождается усиленной экспрессией ОЬиТя на поверхности раковых клеток [14].

Другими потенциальными мишенями для Сахаров являются галектины, представляющие собой белки семейства лектинов, специфичные к р-галактозидам. На сегодняшний день известно 15 различных типов галектинов млекопитающих. Специфичность галектинов к Р-галактозидам обусловлена наличием у всех 15 типов белков консервативного углеводузнающего домена (СЬЮ), включающего около 135 аминокислотных остатков, образующих 2 р-складчатых листа, формирующих полость, способную удерживать линейный тетрасахарид [15]. Показано, что данные белки играют важную роль в регуляции процессов роста, дифференциации, адгезии и апоптоза раковых клеток [16]. Среди подобных рецепторов особый интерес представляют галектин-1, галектин-3 и галектин-8, которые характеризуются более высоким уровнем экспрессии в опухоли по сравнению с другими типами галектинов [17]. Функции этих белков связаны с возникновением, развитием и метастазирующей активностью разных типов раковых опухолей [18-21]. В связи с этим, введение ß-галактозидных заместителей в состав ФС может обеспечить направленную доставку последних в опухоль.

В настоящем обзоре рассмотрен синтез углеводсодержащих конъюгатов на основе синтетических и природных ди- и тетрагидропорфиринов, обсуждены их биологические свойства и возможное применение в качестве агентов для ФДТ.

IV. ВЫВОДЫ

1. Получены новые функционализированные производные природных хлоринов и бактериохлоринов с терминальными двойными и тройными связями.

2. Разработаны способы получения гликоконъюгатов на основе природных хлоринов с использованием реакций "click chemistry" и кросс-метатезиса олефинов.

3. Синтезирован ряд природных хлоринов, содержащих моно- и дисахаридные фрагменты.

4. Осуществлен региоселективный синтез галактозилхлоринов с использованием реакции кросс-метатезиса олефинов.

5. Впервые получены гликоконъюгаты на основе бактериохлорофилла а.

6. Установлены структуры полученных соединений с использованием современных методов ЯМР.

7. Выполненные биологические испытания синтезированных соединений позволили определить перспективные ФС для последующего изучения.

1. X. Zheng and R.K. Pandey. Porphyrin-carbohydrate conjugates: impact of carbohydrate moieties in photodynamic therapy (PDT). // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 2008, V. 8, pp 241-268.

2. K.M. Kadish, K. M. Smith, and R. Guilard. The Porphyrin Handbook. II2000, V. 6, N.Y.: Acad. Press, pp 158-159.

3. Y.N. Konan, R. Gurny and E. Allemann. State of the art in the delivery of photosensitizers for photodynamic therapy. // J. Photochem. Photobiol. B. 2002, V. 66, № 2, pp 89-106.

4. X. Chen, L. Hui, D.A. Foster and C.M. Drain. Efficient Synthesis and Photodynamic Activity of Porphyrin-Saccharide Conjugates: Targeting. // Biochemistry. 2004, V. 43 № 34, pp 10918-10929.

5. S. Ahmed, E. Davoust, H. Savoie, A.N. Boa and R.W. Boyle. Thioglycosylated cationic porphyrins—convenient synthesis and photodynamic activity in vitro. II Tetrahedron Letters. 2004, V. 45, № 31, pp 6045-6047.

6. Bonnett, R. Chemical Aspects of Photodynamic Therapy. II 2000, V.l, UK: Gordon and Breach Science Publishers, pp 70-76.

7. T.J. Dougherty, CJ. Gomer, B.W. Henderson, G. Jori, D. Kessel, M. Korbelik, J. Moan and Q. Peng. Photodynamic therapy. II J. Natl. Cancer 1.1998, V. 90, № 12, pp 889-905.

8. E.S. Nyman and P.H. Hynninen. Research advances in the use of tetrapyrrolic photosensitizers for photodynamic therapy. // J. Photochem. Photobiol. B. 2004, V. 73, pp 1-28.

9. Z. Huang. Photodynamic Therapy. A Review of Progress in* Clinical Photodynamic Therapy. // Technol. Cancer Res. T. 2005, V. 4, pp 227-310.

10. R. Bonnett, G. Martinez. Photobleaching of sensitisers used in photodynamic therapy. // Tetrahedron. 2001, V. 57, № 47, pp 9513-9547.

11. R'.A. Medina and G.I. Owen. Glucose transporters: expression; regulation and cancer. // Biol. Res. 2002, V.35, № 1, pp 9-26.

12. M.J. Birnbaum, H.C. Haspel and O.M. Rosen. Transformation of rat fibroblasts by FSV rapidly increases glucose transporter gene transcription. II Science. 1987, V. 235, pp 1495-1498.

13. R. Loris. Principles of structures of animal and plant lectins. // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) General Subjects. 2002, V. 1572, pp 198-208.

14. A. Krzeslak and A. Lipinska. Galectin-3 as a multifunctional protein. // Cell Mol. Biol. Lett. 2004,V. 9, pp 305-328.

15. H. Lahm, S. Andre, A. Hoeflich, H. Kaltner, H.C. Siebert, B. Sordat, C.W. Lieth, E. Wolf and HJ. Gabius. Tumor galectinology: Insights into the complex network of a family of endogenous lectins. // Glycoconjugate Journal. 2004, V. 20, pp 227-238.

16. A. Gillenwater, X.C. Xu, A.K. EINaggar, G.L. dayman and R. Lotan. Expression of galectins in head and neck squamous cell carcinoma. // Head Neck-J. Sci. Spec. 1996, V. 18, № 5, pp 422 432.

17. X.C. Xu, A.K. el-Naggar and R. Lotan. Differential expression of galectin-1 and galectin-3 in thyroid tumors. Potential diagnostic implications. II Am. J. Pathol. 1995, V. 147, pp 815822.

18. R. Lotan, H. Ito, W. Yasui, H. Yokozaki, D. Lotan and E. Tahara. Expression of a 31-kDa lactoside-binding lectin in normal human gastric Mucosa and in primary and metastatic gastric carcinomas. II Int. J. Cancer. 1994, V. 56, № 4, pp 474-480.

19. R.S. Bresalier, P.S. Yan, J.C. Byrd, R. Lotan and A*. Raz. Expression of the endogenous galactose-binding protein galectin-3 correlates with the malignant potential of tumors in the central nervous system. // Cancer. 1997, V. 80, № 4, pp 776 787.

20. Ortiz de Montellano PR. Cytochrome P450 Structure, Mechanism, and Biochemistry. II 1995, N.Y.: Plenum Press, pp 166-169. ISBN 0-306-48324-6.

21. B Meunier. Biomimetic Oxidations Catalyzed by Transition Metal Complexes. // 2000, London: Imperial College Press, pp 171-181. ISBN 1-86094-098-6.

22. M. Yunus, U. Pathre, P. Mohanty, Probing Photosynthesis: Mechanism, Regulation and Adaptation. //2000, London: Taylor & Francis, pp 43-50. ISBN 0-7484-0821-5.

23. K.C. Nicolaou and H.J. Mitchell. Adventures in Carbohydrate Chemistry: New Synthetic Technologies, Chemical Synthesis, Molecular Design, and Chemical . Biology. // Angewandte Chemie International Edition. 2001, V. 40, № 9 pp 1576-1624.

24. M.R. Prinsep, F.R. Caplan, R.E. Moore, G.M.L. Patterson and C.D. Smith. Tolyporphin, a novel multidrug resistance reversing agent from the blue-green alga Tolypothrix nodosa. // J. Am. Chem. Soc. 1992, V. 114 , № 1, pp 385-387.

25. M.R. Prinsep, G.M.L. Patterson, L.K. Larsen and C.D. Smith. Further tolyporphins from the Blue-Green alga Tolypothrix nodosa. // Tetrahedron. 1995, V. 51, № 38, pp 10523-10530.

26. T.G. Minehan and Y. Kishi. Total Synthesis of the Proposed Structure of (+)-Tolyporphin A 0,0-Diacetate. // Angewandte Chemie International Edition. 1999, V. 38, № 7, pp 923-925.

27. W. Wang and Y. Kishi. Synthesis and Structure of Tolyporphin A 0,0-Diacetate. // Org. Lett. 1999, V. 1, № 7, pp 1129-1132.

28. S.G. Sprague. Structural and functional consequences of galactolipids on thylakoid membrane organization. // Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 1987, V. 19, № 6, pp 691-703.

29. R. Bonnett, A.N. Nizhnik and M.C. Berenbaum. Second generation tumour photosensitisers: the synthesis of octa-alkyl chlorins and bacteriochlorins with graded amphiphilic character. II J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1989, pp 1822 -1823.

30. G. Fulling, D. Schroder and B. Franck. Water-Soluble Porphyrin Diglycosides with Photosensitizing Properties. //Angewandte Chemie International Edition. 1989, V. 28, № 11, pp 1519-1521.

31. Y. Kuroda, T. Hiroshige, T. Sera, Y. Shiroiwa, H. Tanaka and H. Ogoshi. Cyclodextrin-sandwiched porphyrin. II J, Am. Chem. Soc. 1989, V. 111, № 5, pp 1912-1913.

32. P. Maillard, S. Gaspard, J.L. Guerquin-Kern and M. Momenteau. Glycoconjugated tetrapyrrolic macrocycles. // J. Am. Chem. Soc. 1989, V. 111, № 25, pp 9125-9127.

33. Y. Mikata, Y. Onchi, M. Shibata, T. Kakuchi, H. Ono, S. Ogura, I. Okura, S. Yano. Synthesis and phototoxic property of tetra and octa-glycoconjugated tetraphenylchlorins. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, V. 8, pp 3543-3548.

34. A.M.G. Silver, A.C. Tomer, M.G.P.M.S. Neves, A.M.S. Silva, J.A.S. Cavaleiro, D. Perrone, A. Dondoni, Porphyrins in 1,3-dipolar cycloaddition reactions with sugar nitrones.

35. Synthesis of glycoconjugated isoxazolidine-fused chlorins and bacteriochlorins. // Tetrahedron Lett. 2002, V. 43, pp 603-605.

36. A.F. Mironov and M.A. Grin. Synthesis of chlorine and bacteriochlorin conjugates for photodynamic and boron capture therapy. // Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 2008, V. 12, pp 1163-1172.

37. H.W. Whitlock Jr., R. Hanauer, M.Y. Oester and B.K. Bower. Diimide reduction of porphyrins. II J. Am. Chem. Soc. 1969, V. 91, № 26, pp 7485-7489.

38. A. Radu, G. Wagnieres, H. van den Bergh and P. Monnier. Photodynamic therapy of early squamous cell cancers of the esophagus. // Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am. 2000, V. 10, № 3, pp 439-460.

39. K. Lang, J. Mosinger and D.M. Wagnerova. Photophysical properties porphyrinoid sensitizers non-covalently bound to host molecules; models for photodynamic therapy. // Coord. Chem. Rev. 2004, V. 248, pp,321-350.

40. Y. Mikata, Y. Onchi, K. Tabata, S. Ogura, I. Okura, H. Ono and S. Yano. Sugar-dependent photocytotoxic property of tetra- and octa-glycoconjugated tetraphenylporphyrins. // Tetrahedron Letters. 1998, V. 39, № 25, pp 4505-4508.

41. R.W. Boyle and D. Dolphin. 5,15-Diphenyl-7-oxobenzochlorins. Novel long-wavelength absorbing photosensitizers for photodynamic therapy. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994, pp 2463-2464.

42. D.H. Kohli and A.R. Morgan. Preparation of substituted chlorins and benzochlorins. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, V. 5, pp 2175-2178.

43. P. Maillard, C. Hery and M. Momenteau. Synthesis, characterization and photocytotoxicity of a glycoconjugated meso-monoarylbenzochlorin. // Tetrahedron Letters. 1997, V. 38, № 21, pp 3731-3734.

44. A.S. Phadke, B.C. Robinson, K.M. Barkigia and J. Fajer. Synthesis of Benzochlorins and Rhodinobenzochlorins. // Tetrahedron. 2000, V. 56, № 39, pp 7661-7666.

45. A. Dondoni, G. Mariotti and A.Marra. General, stereoselective synthesis of.ethylene isosteres of a- and (3-glycosylasparagines. // Tetrahedron Letters. 2000, V. 41, № 18; pp 34833487.

46. R.K. Pandey and T.J. Dougherty. Galectin recognized photosensitizers for photodynamic therapy. European Patent, EP1256586, 2002:.

47. A.N. Kozyrev, T.J. Dougherty and R.K. Pandey. Effect of substituents in OSO4 reactions of metallochlorins regioselective synthesis of isobacteriochlorins and bacteriochlorins. // Tetrahedron Letters. 1996, V. 37, № 22, pp 3781-3784.

48. A.C. Tome, P.S.S. Lacerda, M.G.P.M.S. Neves and J.A.S. Cavaleiro. Meso-arylporphyrins as dienophiles in Diels-Alder reactions: a novel approach to the synthesis of chlorins, bacteriochlorins and naphthoporphyrins. II Chem. Commun. 1997, pp 1199-1200.

49. J.A.S. Cavaleiro, M.G.P.M.S. Neves and A.C. Tome. Cycloaddition reactions of porphyrins. // ARKIVOC. 2003, V. XIV, pp 107-130.

50. A.M.G. Silva, A.C. Tome, Maria G.P.M.S. Neves, A.M.S. Silva and J.A.S. Cavaleiro. Meso-tetraarylporphyrins as dipolarophiles in 1,3-dipolar cycloaddition reactions. // Chem. Commun. 1999, pp 1767-1768.

51. J. Flemming and D. Dolphin. Carbonyl ylide 1,3-dipolar cycloadditions with porphyrins. // Tetrahedron Letters. 2002, V. 43, № 40, pp 7281-7283.

52. A. Desjardins, J. Flemming, E.D. Sternberg and D. Dolphin. Nitrogen extrusion from pyrazoline-substituted porphyrins and chlorins using long wavelength visible light. // Chem. Commun. 2002, pp 2622-2623.

53. A.M.G. Silva, A.C. Tome, M.G.P.M.S. Neves, J.A.S. Cavaleiro, D. Perrone, A. Dondoni. Porphyrins in 1,3-Dipolar Cycloadditions with Sugar Azomethine Ylides. Synthesis of Pyrrolidinoporphyrin Glycoconjugates. // Synlett. 2005, pp 857-859.

54. A. Schonberg and R. Moubacher. The Strecker Degradation of a-Amino Acids. // Chem. Rev. 1952, V. 50, № 2, pp 261-277.

55. R.K. Pandey, L.N. Goswami, Y. Chen, A. Gryshuk, J.R. Missert, A.Oseroff and T.J. Dougherty. Nature: A rich source for developing multifunctional agents. Tumor-imaging and photodynamic therapy. // Lasers in Surgery and Medicine. 2006, V. 38, pp 445-467.

56. W. Tang, H. Xu, R. Kopelman and M.A. Philbert. Photodynamic characterization and in vitro application of methylene blue-containing nanoparticle platforms. // Photochem. Photobiol. 2005, V. 81, № 2, pp 242-249.

57. M.C. DeRosa and R.J. Crutchley Photosensitized singlet oxygen and its applications. // Coordination Chemistry Reviews. 2002, V. 233-234, pp 351-371.

58. S.P. Songca and B. Mbatha Solubilization of meso-tetraphenylporphyrin photosensitizers by substitution with fluorine and with 2,3-dihydroxy-l-propyloxy groups. // Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2000, V. 52, № 11, pp.1361-1367.

59. M.A. Grin, A.F. Mironov and A.A. Shtil. Bacteriochlorophyll a and its derivatives: chemistry and perspectives for cancer therapy. // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 2008, V. 8, № 6, pp 683-697.

60. C.A. Llewellyn, R. Fauzi C. Mantoura, R.G. Brereton, Products of chlorophyll photodegradation-2. Structural identification. // Photochem. Photobiol. 1990, V. 52, № 5, pp 1043-1047.

61. A.A. Аксенова, Ю.Л. Себякин и А.Ф. Миронов. Синтез галактопиранозилзамещенных производных феофорбида. // Биоорганическая химия. 2000, V. 26, № 2, рр 126-129.

62. А.А. Аксенова, Ю.Л. Себякин и А.Ф. Миронов. Синтез и изучение свойств О- и S-гликозилированных производных пирофеофорбида а. И Биоорганическая химия. 2001, V. 27, №2, рр 145-150.

63. J.H. van Esch, А.М.Р. Peters and R.J.M. Nolte. Location and aggregation behaviour of tetra-aryl-porphyrins in dioctadecyldimethylammonium chloride vesicles. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1990, pp 638-639.

64. Y.K. Park, B. Bold, B.C. Cui, J.Q. Bai, W. Lee and Y.K. Shim. Binding Affinities of Carbohydrate-Conjugated Chlorins for Galectin-3. // Bull. Korean Chem. Soc. 2008, V. 29, № 1, pp 130-134.

65. H. Tamiaki, A. Shinkaia and Y. Kataoka. Synthesis of galactosylated zinc bacteriochlorophylW analogs and their self-aggregation in an aqueous methanol solution. // J. Photochem. Photobiol. A. 2009, V. 207, № 1, pp 115-125.

66. H. Tamiaki, R. Shibata and T. Mizoguchi. The 17-Propionate function of (bacterio)chlorophylls: Biological implication of their long esterifying chains in photosynthetic systems. // Photochemistry andPhotobiology. 2007, V. 83, № 1, pp 152-162.

67. S.S. Gambhir, J. Czernin, J. Schwimmer, D.H.S. Silverman, R.E. Coleman and M.E. Phelps. A tabulated summary of the FDG PET literature. // J. Nucl. Med. 2001, V. 42 (Suppl.), 1S-93S.

68. M.M. Abouzied, E.S. Crawford and H.A. Nabi. 18F-FDG imaging: pitfalls and artifacts. // J. Nucl. Med. Technol. 2005, V. 33, pp 145-155.

69. J. Koziorowski, C. Henssen and R. Weinreich. A new convenient route to radioiodinated N-succinimidyl 3- and 4-iodobenzoate, two reagents for radioiodination of proteins. // Appl. Radiat. Isot. 1998, V. 49, pp 955-959.

70. T.R. Anderson, T.J. Dougherty, D. Tan, A. Sumlin, J.M. Schlossin and P.M. Kanter. Photodynamic therapy for sarcoma pulmonary metastases. // Anticancer Res. 2003, V. 23, pp 3713-3718.

71. G.M. Loewen, R. Pandey, D. Belliner, B. Henderson and T. Dougherty. Endobronchial photodynamic therapy for lung cancer. // Lasers Surg. Med. 2006, V. 38, pp 364-370.

72. A.F. Mironov. Synthesis and properties of new chlorin and bacteriochlorin photosensitizers. // Proc. SPIE. 1996, V. 2625, pp 23-33.

73. G. Schermann, R. Schmidt, A. Volcker, H.D. Brauer, H. Mertes and B. Franck. Potential photosensitizers for photodynamic therapy. Photophysical properties of 26 porphyrin. // Photochem. Photobiol. 1990; V. 52, № 4, pp 741-744.

74. A.F. Mironov and V.S. Lebedeva. Cyclic N-hydroxyimides in a series of chlorins and porphyrins. // Tetrahedron Letters. 1998, V. 39, № 8, pp 905-908.

75. A.F. Mironov, M.A. Grin and A.G. Tsyprovskiy. Synthesis of the first N-hydroxycycloimide in, the bacteriochlorophyll a series. II Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 2002, V. 6, pp 358-361.

76. G. Li, M.P. Dobhal, M. Shibata and R.K. Pandey. Purpurinimidefullerene dyads: introduction of fullerene moiety at various peripheral positions of the purpurinimide system. // Org. Lett. 2004, V. 6, pp 2393-2396.

77. J.A.S. Cavaleiro, J.P.C. Tome and M.A.F. Faustino. Synthesis of Glycoporphyrins. // Top Heterocycl Chem. 2007, V. 7, pp 179-248.

78. Q. Wang, T.R. Chan, R. Hilgraf, V.V. Fokin, K.B. Sharpless and M.G. Finn. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne 3+2. cycloaddition. // JACS. 2003, V. 125, pp 3192-3193.

79. Q. Chen, F. Yang and Y. Du. Synthesis of a C3-symmetric (l-6)-N-acetyl-p-D-glucosamine octadecasaccharide using click chemistry. // Carbohydrate Research. 2005, V. 340, pp 2476-2482.

80. A.J. Link and D.A. Tirrell. Cell Surface Labeling of Escherichia< coli via copper(I)-catalyzed 3+2. cycloaddition. !I JACS. 2003, V. 125, pp 11164-11165.

81. H.C. Kolb and K.B. Sharpless. The growing impact of click chemistry on drug discovery. // Drug Discovery Today. 2003, V. 8, pp 1128-1137.

82. V.D. Bock, H. Hiemstra and J.H Maarseveen. Cul-catalyzed alkyne-azide "click" cycloadditions from a mechanistic and synthetic perspective. // Eur. J. Org. Chem. 2006, pp 5168.

83. Y. Mikata, Y. Shinohara, K. Yoneda, Y. Nakamura, K. Esaki, M. Tanahashi, I. Brudzinska, S. Hirohara, M. Yokoyama, K. Mogami, T. Tanase, T. Kitayama, K. Takashiba, K. Nabeshima, R. Takagi, M. Takatani, T. Okamoto, I. Kinoshita, M. Doe, A. Hamazawa, M.

84. Morita, F. Nishida, T. Sakakibara, C. Orvig, S. Yano. Sugar-Pendant Diamines. // J. Org. Chem. 2001, V. 66 pp 3783-3789.

85. B.A. Смит и Д.А. Дильман. Основы современного органического синтеза. П 2009, БИНОМ Лаборатория знаний, Москва, сс 683-701. ISBN 978-5-947774-941-0.

86. A.K. Chatterjee, T.L. Choi, D.P. Sanders, and R.H. Grubbs. A General Model for Selectivity in Olefin Cross Metathesis. // J. Am. Chem. Soc. 2003, V. 125, pp 11360-11370.

87. A.F. Mironov, M.A. Grin, A.G. Tsiprovskiy, V.V. Kachala, T.A. Karmakova. New bacteriochlorin derivatives with a fused N-aminoimide ring. // Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 2003, V. 7, pp 725-730.

88. H.E. Gottlieb, V. Kotlyar and A. Nudelman. NMR chemical shifts of common laboratory solvents as trace impurities. II J. Org. Chem. 1997, V. 62, pp 7512-7515.

89. A.S. Brandis, A.N. Kozyrev and A.F. Mironov. Synthesis and study of chlorin and porphyrin dimers with ether linkage. // Tetrahedron. 1992, V. 48, № 31, pp 6485-6494.

90. A.F. Mironov, A.N. Kozyrev and A.S. Brandis. Sensitizers of second generation for photodynamic therapy of cancer based on chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives. // Proc. SPIE. 1993, V. 1922, pp 204-209.

91. S. Lotjonen, P.H. Hynninen. A convenient method for the preparation of chlorine ев and rhodin g-j trimethyl esters. // Synthesis. 1980, pp 541-543.