Синтез и изучение свойств циклических имидов в ряду бактериохлорофилла а тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ЦИПРОВСКИЙ АЛЕКСАНДР ГЕННАДЬЕВИЧ

I

! «Синтез и изучение свойств циклических имидов в ряду

бактериохлорофилла а»

;

Специальность 02.00.10 — Биоорганическая химия

!

I

1 Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

\

Москва -2003

Работа выполнена на кафедре химии и технологии тонких органических соединений Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты. Доктор химических наук, профессор

Доктор химических наук, профессор

Ведущая организация:

Миронов Андрей Фёдорович

Юркевич Александр Морисович Смирнов Леонид Дмитриевич Центр фотохимии РАН

Защита состоится слгУГс^&^-Д 2003 года в часов на заседании

Диссертационного Совета Д <5?2/120 01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им М. В. Ломоносова по адресу. 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им М. В. Ломоносова по адресу 119831, Москва, ул. М. Пироговская, 1.

Автореферат разослан О V 2003 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета К.Х.Н., с.н.с.

' (¡к^ги*^

Лютик А. И.

"А

1 fjbé

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В последнее десятилетие во многих странах мира, в том числе и в России, активно разрабатываются новые методы диагностики и лечения злокачественных новообразований. Среди них особое место занимают флуоресцентная диагностика (ФД) и фотодинамическая терапия рака (ФДТ), основанные на применении фотосенсибилизаторов (ФС). Синтез фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии рака - это актуальное и бурно развивающееся направление химии тетрапиррольных соединений. Поиск новых фотосенсибилизаторов ведется как среди синтетических соединений порфириновой природы, так и среди природных пигментов.

Последние привлекают особое внимание, так как значительно быстрее выводятся из организма и подвергаются биодеградации, что существенно снижает побочные эффекты ФДТ. К настоящему времени большинство модификаций выполнено на производных хлорофилла а. Существенно медленнее развиваются исследования в области бакгериохлорофилла а. Однако, спектральные свойства именно этого пигмента позволяют рассматривать его в качестве одного из перспективных источников для создания фотосенсибилизаторов нового поколения. При переходе к бактериохлоринам полоса Q в спектрах поглощения смещается в длинноволновую область, что способствует увеличению глубины проникновения возбуждающего света в ткани.

Природные бактериохлорины, благодаря интенсивному поглощению в области 770 нм, обладают высокой фотодинамической активностью. Известно использование в качестве потенциальных ФС Pd-комплексов бактериофеофорбида, бактериохлорина, а также их различных эфиров. Эти производные показали высокую активность как в экспериментах in vivo для диагностики и терапии злокачественных опухолей, так и in vitro для фотодинамического повреждения вирусов и микроорганизмов. Однако, лабильность соединений бактериохлоринового ряда ограничивает возможности использования последних в медицине.

Наличие дополнительного шестичленного ангидридного цикла, сопряженного с основным макроциклом в молекуле бактериопурпурина, приводит к багтохромному сдвигу основной полосы поглощения в длинноволновую область спектра.

Тем не менее, бактериолурпурин имеет ограниченное применение в качестве фотосенсибилизатора, так как он устойчив лишь в " ах, а при

добавлении оснований для улучшения растворимости в воде, происходит быстрое раскрытие ангидридного цикла, и потеря привлекательных спектральных характеристик.

Структура бакгериопурпурина представляет широкие возможности для проведения химических модификаций, что и было использовано в настоящей работе для решения двух основных задач.

Первая включала получение стабильных производных, устойчивых при щелочных значениях рН, с улучшенными'спектральными свойствами.

Вторая состояла во введении в подобного рода производные заряженных групп для повышения гидрофильности молекулы и улучшения накопления фотосенсибилизатора в опухоли.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТТОС МИТХТ им М. В. Ломоносова по теме № 1В-32-865 «Разработка методов получения циклоимидных производных бактериохлорофилла а для создания лекарственных препаратов для фотодинамической терапии рака» и при поддержке фантов РФФИ: № 01-03-32543, № 02-03-06630 «МАС», № 03-03-06670 «MAC»; INTAS №01 -0461.

Цель работы. Диссертационная работа посвящена исследованию направленных превращений в ряду производных бактериохлорофилла а и включает следующие разделы:

1. Разработка способов модификации ангидридного цикла бактериопурпурина (БП), позволяющих получать N-гидрокси- и N-аминоциклоимиды.

2. Синтез циклических имидов бактериопурпурина, содержащих различные функциональные группы при атоме азота экзоцикла, и обладающих повышенной стабильностью и улучшенными спектральными характеристиками.

3. Разработка методов синтеза катионных фотосенсибилизаторов бактериохлоринового ряда.

4. Оценка эффективности полученных циклоимидов на основе их фототоксической активности и внутриклеточного распределения.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые осуществлен синтез производных бактериохлорина р6 с добавочным циклоимидным кольцом, в которых при атоме азота находятся гидроксильная и аминогруппы и показана возможность

химической модификации последних. Изучена сравнительная активность ацетильного заместителя в положении 3 макроцикла и ангидридного цикла бактериопурпурина в реакциях с гидроксиламином и гидразином. Получена группа стабильных циклоиМидов бактериохлоринового ряда, содержащих различные заместители при атоме азота экзоцикла и имеющих батохромное смещение длинноволновой полосы поглощения в электронных спектрах до 830 нм. Синтезирован первый катионный фотосенсибилизатор бактериохлоринового ряда, растворимый в водноспиртовых растворах и обладающий противомикробной активностью. Оценена фототоксическая активность полученных цикпоимидов на клетках аденокарциномы легкого человека А549 и показана перспективность использования некоторых из них в качестве эффективных фотосенсибилизаторов для ФДТ рака.

Практическая значимость работы. Исследованные в работе природные бактериохлорины с имидным экзоциклом могут быть использованы при синтезе новых высокоэффективных фотосенсибилизаторов. Полученные циклоимиды содержат в своей структуре гидроксильную и аминогруппы, которые могут быть модифицированы с целью присоединения белков, Сахаров и других биологически активных молекул для повышения сродства к опухоли и увеличения селективности накопления в раковых клетках Полученные циклоимиды показали высокую фототоксическую активность, на порядок превышающую аналогичные параметры для известных ФС, что открывает перспективу их дальнейшего продвижения до клинических испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Химическая модификация бактериопурпурина по ангидридному циклу, приводящая к получению 1М-гидрокси- и Ы-аминоциклоимидов.

2. Изучение реакционной способности экзоциклических гидроксильной и аминогрупп циклоимидов, включая получение их О- и М- апкильных и ацильных производных.

3. Синтез катионного циклического имида бактериохлоринового ряда и тестирование его антимикробной активности.

4. Оценка фотодинамической активности полученных циклоимидов и изучение их внутриклеточного распределения.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всероссийской конференции «Горизонты физико-химической биологии», 2000 г., Пущино, на III Съезде биохимического общества, 2002 г., Санкт-Петербург, на IX Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов, 2003 г., Суздаль.

Публикации. Результаты работы отражены в 3 статьях, 4 тезисах конференций и Заявке на изобретение № 2002123618/04(025072), приоритет 04. 09. 2002.

Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на ^страницах машинописного текста, содержит^" схем, i таблиц. рисунков. Она состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка используемой литературы сШ=сылок).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы наблюдается повышенный интерес к производным природных хлорофиллов, содержащим дополнительный шестичленный имидный экзоцикл. Отличительными особенностями этих соединений являются повышенная стабильность и улучшенные спектральные и фотофизические свойства.

Известны два метода получения подобных циклоимидов. В обоих случаях в качестве исходных соединений используются ди- и тетрагидропорфирины с дополнительным ангидридным циклом, такие как пурпурин 18 и бакгериопурпурин. В первом случае замена атома кислорода на азот осуществляется действием аминов с последующей циклизацией образующихся моноамидов под действием различных реагентов в соответствующие циклоимиды. Во втором методе, разработанном на кафедре ХТТОС, используется гидроксиламин, в результате чего циклоимиды образуются в одну стадию с высокими выходами.

Целью настоящей работы являлась разработка способов модификации ангидридного цикла бактериопурпурина и синтез производных, содержащих полярные группы для повышения общей гидрофильности молекулы пигмента.

1. ПОЛУЧЕНИЕ БАКТЕРИОПУРПУРИНА

Ключевым соединением в синтезе циклоимццов являлся бактериопурпурин (БП). Для его получения был использован метод окисления бакгериохлорофилла а, содержащегося в биомассе пурпурных бактерий ЯЬос1оЬас(егсар8и1а№' (схема 1).

Схема 1

Такой подход позволял превратить циклопентаноновый экзоцикл в молекуле бакгериохлорофилла а в ангидридный, который далее может бьггь трансформирован в имидный

2. СИНТЕЗ N - ГИДРОКСИЦИКЛОИМИДОВ В РЯДУ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА а 2.1. ИЗУЧЕНИЕ РЕАКЦИИ БАКТЕРИОПУРПУРИНА С ГИДРОКСИЛАМИНОМ

В настоящей работе ранее разработанный на кафедре ХТТОС метод модификации ангидридного цикла пурпурина 18 под действием гидроксиламина был применен к бактериопурпурину. Наличие в структуре последнего ацетильной группы в пиррольном кольце А приводит к появлению дополнительного реакционного центра, что изменяет ход и состав продуктов реакции.

Нами было обнаружено, что в ходе реакции БП (1) с гидроксиламином первоначально образуется аддукт, молекулярная масса которого (М+ 596) соответствует БП с одной присоединенной молекулой гидроксиламина.

'Биомассу вЬойоЬааег сарзиШиз выращивали в фотобиореакторв в Институте фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино., зав. лаб., д.б н. А. А. Цыганков.

При этом в электронном спектре происходит гипсохромный сдвиг основной полосы Q с 818 нм, характерной для БП, до 792 нм.

На этом основании был сделан вывод о том, что ангидридный цикл на данном этапе реакции сохраняется, а гидроксиламин взаимодействует с ацетильной группой с образованием оксима 2 (схема 2).

Схема 2

Реагенты: (а) - ЫН2ОН-НС1, С5Н5Л/, 20°С; (Ь) - ЫаОН, СН3ОН, 2(?С, 1ч; (с) -АсгО, С5Н5Л/, 20°С, 1 ч; (<1) - СН2Ы2, й20, 20°С, 20 мин.

Для подтверждения этого полученное соединение 2 было обработано водноспиртовым раствором щелочи. Гипсохромный сдвиг полосы О до 745 нм и сильное уменьшение хроматографической подвижности указывают на раскрытие ангидридного цикла с образованием тринатриевой соли оксима бактериохлорина (5). Присоединение молекулы гидроксиламина по ацетильной группе БП было подтверждено реакцией тринатриевой соли бактериохлорина (4) с гидроксиламином.

Полученный оксим 5 имел спектральные характеристики и хроматографическую подвижность, идентичные с образцом, синтезированным из соединения 2.

Анализ оксима 2 показал, что он состоит из двух соединений с одинаковой молекулярной массой и близкими значениями Rf. Данный факт связан, по нашему мнению, с образованием син- и анти- форм двух стереоизомерных оксимов, что возможно при взаимодействии кетонов с гидроксиламином.

Спекгрофотометрический контроль за ходом реакции БП с гидроксиламином показал, что гипсохромное смещение полосы Q до 792 нм, соответствующее образованию оксима, происходит в течение первых 3 часов реакции, после чего эта полоса постепенно возвращается в длинноволновую область. Этот этап реакции связан с взаимодействием оксима 2 со второй молекулой гидроксиламина с образованием N-гидроксициклоимида (3). Реакция полностью проходит за 10 часов, что определяется по смещению длиноволновой полосы поглощения с 792 до 812 нм.

N-Гидроксициклоимид оксима бакгериохлорина (3) охарактеризован электронным и масс-спектрами. Спектр 1Н ЯМР полученного соединения оказался малоинформативным из-за сильного уширения сигналов всех протонов Аналогичный факт наблюдался также для N-гидроксициклоимида хлорина ре.

2.2. ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ N - ГИДРОКСИЦИКПОИМИДА БАКТЕРИОХЛОРИНА

N-Гидроксициклоимид бактериохпорина (3), имея в своем составе подвижный атом водорода, легко вступал в реакции ацилирования и алкилирования. Обработка соединения 3 уксусным ангидридом привела к образованию диацетата 6а, в масс-спектре которого имеется молекулярный ион с m/z 696.2 и интенсивные пики с m/z 638.1 и 580, соответствующие молекуле без одной или двух ацетатных групп. Данное соединение 6а оказалось лабильным, и образование с течением времени моноацетата и исходного N-гидроксициклоимида (3) фиксировалось с помощью ТСХ.

Связь N-0-C в соединении 6Ь, возникающая при обработке соединения 3 диазометаном, оказалась значительно прочнее, что позволило охарактеризовать данное соединение спектром 1Н ЯМР.

В нем отчетливо виден синглет при 4.35 м.д. интенсивностью в ЗН, который был отнесен к метоксильной группе, расположенной при атоме азота имидного экзоцикла.

Было показано, что продукт метилирования 6Ь состоит из двух веществ с одинаковой молекулярной массой, незначительно отличающихся хроматографической подвижностью. Данные вещества были выделены в индивидуальном состоянии с помощью препаративной ТСХ и охарактеризованы спектрами 1Н ЯМР. За исключением положения сигналов протонов 2-СНз, 32-СНз, 5-Н, расположенных близко к оксимной группе, эти спектры оказались практически идентичными, что позволяет сделать вывод о существовании стереоизомерных сини анти- форм оксимов.

С помощью одномерной спектроскопии ЫОЕ были определены сигналы мезо-протонов бактериохлоринового макроцикла в каждом из них (рис. 1).

В данных экспериментах облучались СНз-группы, находящиеся во 2 и 12 положениях макроцикла, и наблюдалось изменение интенсивности сигналов мезо-протонов 20-Н и 10-Н, соответственно.

Рис. 1. Выявленные пространственные взаимодействия протонов циклоимида вЬ.

При облучении СНз-группы ацетильного заместителя оксима был получен аналогичный отклик для мезо-протона 5-Н, что свидетельствует об их пространственной сближенности. Облучение СНз-группы в метоксильном заместителе (4.35 м д.) не привело к отклику ни одного сигнала в спектре 1Н ЯМР циклоимида, что подтверждает изолированное положение метоксильной группы в молекуле.

В настоящей работе впервые в ряду бакгериохлоринов получены производные Ы-гидроксициклоимидов, которые могут быть далее функционапизированы с целью получения новых высокоэффективных ФС.

осн3

3. СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА а С ДОПОЛНИТЕЛЬНЫМ N - АМИНОИМИДНЫМ ЦИКЛОМ

3.1. ИЗУЧЕНИЕ РЕАКЦИИ БАКТЕРИОПУРПУРИНА С ГИДРАЗИНОМ

В рамках исследования взаимодействия БП с сильными нуклеофильными агентами нами была изучена реакция БП с гидразином. Гидразин и его производные обнаруживают чрезвычайно высокую нуклеофильную активность по отношению к углеродным атомам с вр^гибридизацией. В связи с этим ангидриды кислот являются удобными реагентами для ацилирования гидразина.

При добавлении к раствору бактериопурпурина (1) в пиридине гидразингидрата практически моментально происходит гипсохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения в область 750 нм, что соответствует раскрытию ангидридного цикла и образованию смеси изомерных моногидразидов 7а и Ь (схема 3).

Схема 3

7« R'-NHNH^-OH 7Ь R'-OH; R^NHNH2

Реагенты: в - ЫгН, НгО, пиридин; Ь - 1N HCl; е - Et20; d - NaOH, СН3ОН.

Спектрофотометрический контроль за ходом реакции показал, что с течением времени появляется новая полоса поглощения при 834 нм, свидетельствующая о самопроизвольной циклизации моногидразидов. Добавление в реакционную среду соляной кислоты приводит к быстрому образованию экзоцикла. Конечный продукт 10 представлял собой не ожидаемый гидразон, а содержал свободную ацетильную группу в положении 3 макроцикла.

Предположение о возможном образовании гидразона в ходе реакции и последующем его гидролизе в кислой среде было подтверждено реакцией бактериохлорина Рб (8) с гидразином. Продукт 9 выделяли, не используя кислот. Масс-спектр последнего, в котором присутствует молекулярный ион с m/z 614.4, подтвердил образование гидразона, последующий кислотный гидролиз которого привел к исходному бактериохлорину рв-

3.2. ГИДРАЗИДЫ БАКТЕРИОХЛОРИНА р»

Особенностью реакции гидразина с ангидридами дикарбоновых кислот является возможность увеличения размера исходного цикла с образованием 1,2-дизамещенных гидразидов. В случае бактериопурпурина это могло приводить к образованию гидразида с шести- или семи-членным экзоциклом. Определение размера цикла в циклоимиде 10 проводилось с помощью химических модификаций последнего, а также с привлечением спектроскопии ЯМР.

Спектр 1Н ЯМР соединения 10 в СИСЬ оказался неинформативен из-за отсутствия в нем сигналов протонов при атомах азота экзоцикла. Введение в экзоцикл двух дополнительных метальных групп путем обработки соединения 10 метилиодидом с образованием диметильного производного 11 (схема 4) привело к появлению в спектре 1Н ЯМР двух близко расположенных синглетов при 3.37 и 3.36 м д. и позволило привлечь метод двумерной гетероядерной корреляции (НМВС) для выяснения вопроса о размере экзоцикла".

В спектре НМВС отсутствуют кросс-пики протонов метальных групп при атоме азота с карбонильными атомами углерода, что свидетельствует о наличии между ними не менее четырех связей (С131-М132-Ж З3-С134-Н135) и подтверждает шестичпенную структуру экзоцикла (рис. 2).

"ЯМР исследования выполнены в ИОХ им. Н. Д. Зелинского РАН, к.х.н. Ф. В. Тоукачем.

Схема 4

и

В случае семичленного цикла таких связей было бы три (С131-Ж32-С133-Н134) и наблюдалось бы 13С - 1Н взаимодействие.

Рис. 2. Возможные варианты экзоцикпа в гидразиде 11.

Различие химических сдвигов двух метильных групп является, по-видимому, следствием заторможенного вращения последних вокруг связи

Подтверждением этому являются данные спектра 1Н ЯМР, снятого при нагревании образца до 50° С, в результате чего происходит слияние двух сигналов

)

СНз-групп при атоме азота в один синглет интенсивностью в 6 протонов, что подтверждает наличие в молекуле N.М-диметиламиногруппы (рис. 3).

Рис. 3. Фрагмент 'Н ЯМР спектра соединения 11: а - при температуре 290К; Ь - при температуре 323К.

Химический подход к доказательству структуры циклоимида 10 включал его взаимодействие с 4-диметиламинобензальдегидом (схема 4). В спектре 1Н ЯМР полученного соединения 12 имеется добавочный сигнал атома водорода, находящийся в слабом поле рядом с сигналом 20-Н мезо-протона (8.64 и 8.61м д.).

Для их отнесения использовали спектроскопию Ю МОЕ, облучая протоны в орто-положениях фенильного кольца. В результате наблюдалось изменение интенсивности сигнала протона при 134 углеродном атоме (8.64м.д.).

Обработка последнего триацетоксиборгидридом натрия (для сохранения ацетильной группы в макроцикле) не привела к восстановлению связи С-Ы и с течением времени он разрушался с образованием исходного циклоимида 10.

Более удачный вариант модификации циклоимида 10 имел место при обработке последнего тозилхлоридом (схема 4). Сульфамид 13 был получен с высоким выходом и являлся стабильным соединением, которое в дальнейшем может бьггь использовано для модификации молекулы пигмента.

Для М-гидрокси- и М-аминоциклоимидов и их производных характерно батохромное смещение основной полосы поглощения в район 830-836 нм, что превосходит аналогичные характеристики для бактериопурпурина на 12-17 нм, при сохранении высоких значений коэффициента молярной экстинкции (б = 30000).

I

I

4. СИНТЕЗ КАТИОННОГО ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА БАКТЕРИОХЛОРИНОВОГО

РЯДА

Для усиления гидрофильных свойств полученного Ы-аминоциклоимида 10 проводилась модификация аминофуппы за счет присоединения к ней заряженной пиридиниевой фуппировки. С этой целью циклоимид 10 конденсировали с хлорангидридом изоникотиновой кислоты, а производное 14 обрабатывали метилиодидом (схема 5). Полученное соединение 15 обладало чрезвычайно низкой хроматофафической подвижностью.

Схема 5

Для подтверждения структур цикпоимидов 14 и 15 были сняты спекфы 1Н ЯМР, в которых наблюдалось удвоение сигналов всех протонов, что указывало на присутствие в образце двух изомеров. Их существование, по-видимому, связано с затрудненным вращением вокруг связи С(0)-1Ч, которое возникает в результате сопряжения неподеленной электронной пары азота и я - элеюронов карбонильной фуппы.

В связи с этим были сняты спекфы 1Н ЯМР соединений 14 и 15 при 50°С и подтверждены приведенные структуры цикпоимидов 14 и 15.

Катионный фотосенсибилизатор 15 обладает растворимостью в водноспиртовых растворах, что позволит в будущем окончательно отказаться от использования Кремофора при приготовлении водорастворимых форм пигмента для биологических испытаний.

5. ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ И АНТИФУНГИЦИДНОЙ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ *и

Тестирование катионного циклоимида 15 и его синтетического предшественника 14 проводилось по методу фотоиндуцированного подавления биолюминесценции генно-инженерного штамма светящихся грамотрицательных бактерий. В отличие от циклоимида 14, не имеющего в структуре заряженных групп, ФС 15 вызывал фотоиндуцированное подавление биолюминесценции штамма бактерий, степень которого увеличивалась с ростом концентрации фотосенсибилизатора и дозы облучения (рис.4).

100

60

10-

ЮшМ

-о-ашм

•»••40 «жМ

—! 10

Доза белого света, Дж/см1

Рис. 4. Дозовыв кривые подавления биолюминесценции биосенсора, проинкубированного 10 мин с различными концентрациями циклоимида 15.

Следует отметить, что сам по себе белый свет во всем диапазоне используемых доз не оказывал влияния на интенсивность бактериальной биолюминесценции. С другой стороны, в отсутствии облучения фотосенсибилизаторы 14 и 15 не вызывали заметного подавления интенсивности биолюминесценции.

2

4

в

"* Исследования выполнены на кафедре биофизики МГУ им М. В. Ломоносова под руководством с н.с. М. Г. Страховской.

I

I

i

Полученные данные о фотосенсибилизирующей активности циклоимидов 14 и 15 хорошо согласуются с их физико-химическими свойствами, определяющими эффективность связывания с клетками-мишенями.

Как известно," внешняя поверхность бактериальных клеток имеет 1 отрицательный заряд. Очевидно, что наиболее эффективного связывания с

бактериальными клетками и, следовательно, фотодинамического действия, следует ч ожидать от катионного ФС, что и наблюдалось в случае использования

циклоимида 15.

Изучение антифунгицидной активности показало, что катионный фотосенсибилизатор 15 обладает не только антибактериальной активностью, но и проявляет высокую эффективность в инактивации дрожжей рода Candida guilliermondii. Фоточувствительность (1/LDso) культур дрожжей при использовании 5 мкМ циклоимида 15 составляет около 0,42 см2/Дж (рис. 5).

Доза белого ста, Дж/сн*

Рис. 5. Дозовая кривая инактивации дрожжей, проинкубированных 10 мин с 5 мкМ циклоимида 15.

Учитывая тот факт, что длинноволновый максимум поглощения циклоимида 15 располагается при 830 нм (область высокой оптической проницаемости биологической среды), последний в сочетании с соответствующим лазерным источником излучения может бьггь использован для фотосенсибилизации плотных культур микроорганизмов.

Таким образом, катионный фотосенсибилизатор 15 имеет широкий спектр антимикробной активности и может быть использован для фотодинамической инактивации про- и эукариотных микроорганизмов.

6. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ N - ГИДРОКСИ- И N - АМИНОЦИКЛОИМИДОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Для анализа накопления, распределения и взаимодействий соединений в клетках был использован метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции двух- и трехмерных спектральных изображений (КОМИРСИ) **'*.

Показано, что с использованием эмульсии Кремофора в качестве стабилизатора мономерной формы удается обеспечить высокое проникновение циклоимидов 6Ь, 10 и 11 в клетки аденокарциномы легкого человека А549, эпидермоидной карциномы гортаноглотки человека НЕр2, рака шейки матки человека НеЬа и в клетки эритроидной лейкемии человека К562.

Для исследуемых соединений 6Ь, 10 и 11 характерно избирательное накопление в липидных каплях, клеточных органеллах, ответственных за хранение и метаболизм нейтральных липидов.

При облучении светом мембранно-связанные производные 6Ь и 11 характеризуются достаточно высокими квантовыми выходами генерации синглетного кислорода (0.53 и 0.47, соответственно), что выше аналогичного параметра для бактериохлорина (0.33).

Вне зависимости от внутриклеточной локализации гидразиды бактериохлоринового ряда обладают высокой фотоцитотоксичностью""*.

Так, для соединений 10 и 11 ИК50 и ИКэо составили 0.3, 0.98 и 0.19, 0.44 мкмоль/л, соответственно.

""Исследования выполнены в ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, под руководством с.н.с. А. В. Феофанова.

'""Исследования выполнены в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П. А. Герцена под руководством профессора Р. И. Якубовской.

Тогда как для известных фотосенсибилизаторов, например, хлорина ре эти концентрации составили 2.8, 4.5; для формилхлорина ре - 6.7, 9.2, а для препарата Фотосенс - 5 0 и 9.8 мкмоль/л.

В отсутствии светового облучения гидразиды, в концентрациях многократно превышающих фототоксические, не влияют на рост клеточной культуры.

Таким образом, полученные гидразиды 10 и 11 являются высокоактивными фотосенсибилизаторами нового поколения, поглощающими в длинноволновой области спектра.

7. ВЫВОДЫ

1. Разработан способ получения циклических имидов бакгериохлоринового ряда.

2. Получен ряд новых производных циклоимидов бакгериохлоринового ряда, обладающих повышенной стабильностью, поглощающих в ближней ИК-области спектра с улучшенными фотофизическими свойствами.

3. Разработан метод получения катионных фотосенсибилизаторов бакгериохлоринового типа, обладающих высокой антимикробной активностью.

4. Изучены фотодинамические свойства циклоимидов бакгериохлоринового ряда.

Выражаю особую благодарность моему учителю доценту М. А. Грину и коллегам: профессору Р. И. Якубовской, д.б.н. А. А. Цыганкову, с.н.с. А. В. Феофанову, с.н.с. Т. А. Кармаковой, с.н.с. М. Г. Страховской и к.х.н. Ф. В. Тоукачу.

8. Список публикаций

1. А.Ф. Миронов, М.А. Грин, А.Г. Ципровский, A.B. Сегеневич, Д.В. Дэарданов, К.В. Головин, A.A. Цыганков, Я.К. Шим. Разработка новых фотосенсибилизаторов бактериохлоринового ряда для фотодинамической терапии рака. II Биоорганическая химия. - 2003. - Т. 29. - №2. - С. 214-221.

2 A.F. Mironov, М.А. Grin, A.G. Tsiprovskiy. Synthesis of the first N-hydroxycycloimide in the bacteriochlorophyll a series. II Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. - 2002. - V.6. - № 5. - P. 358-361.

3. А.Ф. Миронов, М.А. Грин, А.Г. Ципровский. Синтез N-гидроксициклоимидов в ряду бактериохлорофилла а. // Деп. в ВИНИТИ № 1432-В2001. БУ«Депонированные научные работы». - 2001. - № 8.

4. АФ. Миронов, М.А. Грин, А.Г. Ципровский, С.А. Зыков. Разработка сенсибилизаторов на основе бактериохлорофилла а для направленного внутриклеточного транспорта. Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии». // Тезисы стендовых сообщений. - Пущино. - 2000. -С. 145.

5. М.А. Грин, А. Г. Ципровский, Д.В. Дзарданов, К. В. Головин. Синтез и изучение свойств гидрофильных производных бактериохлорофилла со спейсерными группами для направленного внутриклеточного транспорта. Ill Съезд биохимического общества. II Тезисы докладов. - Санкт-Петербург. - 2002. - С. 151.

6. А.Ф. Миронов, МА. Грин, А.Г. Ципровский, К.В. Головин, А.Н. Бровкин. Амфифильные фотосенсибилизаторы бактериохлоринового ряда для фотодинамической терапии. IX Международная конференция по химии порфиринов и их аналогов. // Тезисы докладов. - Суздаль. - 2003. - С. 308 -309.

7. A.B. Феофанов, Т.А. Кармакова, Р.И. Якубовская, А.Ф. Миронов, М.А. Грин, А Г. Ципровский, А.И. Гришин, Ж.-К. Моризо, П. Вини, И.Р. Кассис, К. Отто. Новые ИК - фотосенсибилизаторы на основе циклоимидных производных бакгериохлорина. IX Международная конференция по химии порфиринов и их аналогов. II Тезисы докладов. - Суздаль. - 2003. - С. 332 - 334.

8. А.Ф. Миронов, М А. Грин, А.Г. Ципровский, Д.В. Дзарданов, К.В. Головин, A.B. Феофанов, Т.А. Кармакова, Р.И. Якубовская. Гидразиды в ряду бактериохлорофилла а, обладающие фотодинамической активностью, и способ их получения. // Заявка на изобретение № 2002123618/04(025072), приоритет 04. 09. 2002.

ч

Принято к исполнению 20/11/2003 Заказ № 444

Исполнено 21/11/2003 Тираж:80 экз.

ООО «НАКРАПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 318-40-68 да^.аШогеГеШ ги

2<=О5 -А

I. ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

II. ВВЕДЕНИЕ

III. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7 Введение

3.1. Общие подходы к разработке фотосенсибилизаторов для ФДТ рака

3.2. Новые ФС хлоринового и бактериохлоринового рядов

3.3. Синтез устойчивых производных хлоринов и бактериохлоринов

3.3.1. Циклические имиды, содержащие при атоме азота связь N-C

3.3.2. N-Гидроксициклоимиды и их производные

3.4. Коньюгаты циклических имидов хлоринового ряда с сахарами

3.5. Катионные ФС хлоринового типа и их биологическая активность

3.5.1. Синтез катионных ФС

3.5.2. Антимикробная фотодинамическая активность катионных ФС

Одним из перспективных и быстро развивающихся методов диагностики и лечения злокачественных новообразований является фотодинамическая терапия рака. Метод фотодинамической терапии рака основан на введении в организм фотосенсибилизаторов, локализующихся преимущественно в опухоли, которые при световом возбуждении продуцируют цитотоксичные вещества, вызывающие гибель злокачественных клеток. Синтез фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии рака это актуальное и быстро развивающееся направление химии тетрапиррольных соединений. Поиск новых фотосенсибилизаторов ведется как среди синтетических соединений порфириновой природы, так и среди природных пигментов. Последние привлекают особое внимание, так как значительно быстрее выводятся из организма и подвергаются биодеградации, что существенно снижает побочные эффекты фотодинамической терапии. К настоящему времени большинство модификаций выполнено на производных хлорофилла а. Существенно медленнее развиваются исследования в области бактериохлорофилла а. Однако, спектральные свойства именно этого пигмента позволяют рассматривать его в качестве одного из перспективных источников для создания фотосенсибилизаторов нового поколения. Следует отметить, что лабильность соединений бактериохлоринового ряда ограничивает возможности использования последних в медицине. Настоящая работа направлена на разработку путей создания новых высокоэффективных фотосенсибилизаторов бактериохлоринового ряда, обладающих высокой стабильностью, поглощающих в ближней РЖ-области спектра с улучшенными фотофизическими свойствами.ш. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Введение В последнее десятилетие у нас в стране и за рубежом, активно разрабатываются новые методы диагностики и консервативного лечения злокачественных новообразований. Среди них особое место занимают флуоресцентная диагностика (ФД) и фотодинамическая терапия рака (ФДТ), основанные на применении природных и синтетических фотосенсибилизаторов (ФС) [1-10], которые, благодаря особенностям химического строения, селективно накапливаются в опухолевой ткани [11-16]. При поглощении света определенной длины волны молекула ФС переходит в синглетное состояние, затем конвертируется в триплетное состояние и при взаимодействии с молекулой кислорода переводит его в активную форму, которая в свою очередь инициирует свободнорадикальные процессы с образованием активных радикальных соединений, вызывающих гибель опухолевых клеток [17-20]. Описанные процессы в совокупности обуславливают эффект ФДТ. Метод ФД основан на способности ФС флуоресцировать под действием света определенной длины волны и, таким образом, являться маркером злокачественной клетки [21-28]. В настоящее время методы ФД и ФДТ успешно применяются в мировой практике в клинической онкологии на ранних стадиях рака, при поверхностных новообразованиях и предраковых патологических состояниях [29-35]. Первая группа препаратов, разрешенных к клиническому применению, основана на производных гематопорфирина: Фотофрин 1, Фотофрин 2 (США) [36-38], Фотосан (Германия) и первый отечественный ФС Фотогем [39-41]. Однако указанные препараты имеют ряд недостатков, таких как неоднородный химический состав, низкая селективность накопления в опухоли, выраженная кожная токсичность, высокая стоимость. Одним из существенных недостатков является низкое поглощение в длинноволновой области спектра, наиболее проницаемой для света (рис. 1).Проникновение в ткани, мм 10 а f У X б 4/ 2- 1 400 1 500 1 600 1 1 700 им 800 Бшафнохлорнны t\ \1 Порфирнны Хлорины Рис, 1. Проницаемость света через ткани. Это обуславливает низкую эффективность воздействия на глубоко лежащие ткани и опухоли большого размера [42]. СП(0Н)СНз СН(ОН)СНз СОгН COjH Гематопорфирин в связи с этим актуальной задачей является создание новых эффективных опухолетропных ФС, лишенных вышеназванных недостатков.3.1. Общие подходы к разработке фотосенсибилизаторов для ФДТ рака Специфика функционирования терапевтических ФС, а именно, взаимодействие с биологическими тканями и клетками в многоклеточном организме обусловливает целый комплекс особых требований к ним. Многолетние и масштабные исследования в области ФД и ФДТ позволили сформулировать основные требования, предъявляемые к идеальному ФС: сильное поглощение в спектральном диапазоне, где биологические ткани имеют наибольшее пропускание (красный и ближний ИК диапазоны); интенсивный максимум (или максимумы) в спектре возбуждения; высокий квантовый выход триплетного состояния с энергией не менее 94 кДж/моль для эффективного образования синглетного кислорода; постоянный химический состав; устойчивость при хранении, а также введенного в организм препарата; высокая селективность накопления в опухолях по сравнению с окружающими нормальными тканями; слабое накопление в коже; сравнительно быстрое выведение из организма; низкая токсичность, включая нейротоксичность и фототоксичность кожи [43-47]. В настоящее время в различных лабораториях мира разрабатываются новые ФС, обладающие большинством из вышеперечисленных свойств. Очевидно, что спектральные характеристики далеко не единственные критерии, определяющие эффективность тех или иных ФС, однако именно они используются для отнесения известных ФС к следующим трем группам: 1) порфирины и их аналоги с терапевтическим окном поглощения в области 620-650 нм; 2) природные и синтетические хлорины, фталоцианины и другие соединения с интенсивным поглощением в интервале 660-750 нм [48, 49]; 3) бактериохлорофиллы, нафталоцианины и иные красители, интенсивно поглощающие в области 760-900 нм [50-53]. В настоящем литературном обзоре рассмотрены методы синтеза и химическая модификация ФС на основе представителей двух последних групп: хлоринов и бактериохлоринов, как наиболее перспективных для ФДТ классов соединений, поглощающих в ближнем ИК-диапазоне спектра [54-56]. 3.2. Новые ФС хлоринового и бактериохлоринового рядов Как известно, хлорофиллы выполняют функцию переноса электронов в растительных организмах и у бактерий. Их производные обладают оптимальными свойствами для использования в качестве фотодинамических агентов интенсивно поглощают в длинноволновой области спектра (650 700 нм) и характеризуются низкой темновой токсичностью [57-59]. В настоящее время производные хлорина Сб находятся на различных стадиях клинических испытаний [60-63]. Так, водорастворимый N аспартилхлорин ев (препараты NPe6, MACE), поглощающий при 664 нм с молярным коэффициентом поглощения около 25000, является одним из первых ФС, предложенньпс как альтернатива Фотофрину 2 [3638]. Близким химическим аналогом хлорина е является хлорин рв, который также оценивается как перспективный агент для ФДТ [64-66]. н,С COjH COjH СО н,е СОгН Хлорин е Хлорин/; luc CO2II CO2H HO2C tOjH MACE Синтетический хлорин 5,10,15,20 тетракис (л/ гидроксифенил) хлорин (темопорфин, т ТНРС, Фоскан) имеет удовлетворительные фотофизические параметры (квантовый выход синглетного кислорода 0.43), обладает низкой темповой токсичностью (LDso 3 мг/кг) и не мутагенен [67-70]. .он но. он но Темопорфин (т ТНРС) Производные бензопорфирина с максимумом поглощения при 690 нм (s 33000) являются синтетическими аналогами хлорина. Эти соединения нерастворимы в воде и используются в виде липосомальных композиций или масляных эмульсий. Завершаются клинические испытания одного из этих соединений BPD-MA (бензопорфирин монокислота, кольцо А).НЗС02С HjCGjC? СО2Н СО2Н Беиюпорфирин монокислота, кольцо А Достаточно эффективными фотосенсибилизаторами с низкой кожной токсичностью показали себя феофорбиды производные хлорофилла, не содержащие металла и остатка фитола в положении 17 макроцикла. COjH R СО2СН3 феофорбид а R Н пирофеофорбид а Другим не менее перспективным классом ФС природного происхождения являются производные бактериохлорофилла а, для которых характерно дальнейшее смещение длинноволновой полосы поглощения в красную область. Природные бактериохлорины имеют интенсивную полосу поглощения в области 770 нм и обладают высокой фотодинамической активностью. Известно использование в качестве потенциальных ФС Pd-комплексов бактериофеофорбида и бактериохлорина, а также их эфиров [71-76]. Эти производные бактериохлорофилла а показали высокую активность как в экспериментах in vivo для диагностики и терапии злокачественных опухолей, так и in vitro для фотодинамического повреждения вирусов и микроорганизмов.н,С COjH CO2CH3 Pd комплекс бактериофеофорбида a Проблемой здесь является поиск устойчивых при хранении производных бактериохлорина рб, поскольку при гидрировании порфиринового кольца одновременно со спектральным смещением уменьшается стабильность молекулы в реакциях окисления. сн н,с COjH СОгН СО2Н Бактериохлорин Хлорины бактериохлорины имеют четыре основных типа спектров, представленных на рисунке 2. При переходе к бактериохлоринам полоса Q в спектрах поглощения смещается в длинноволновую область, что способствует увеличению глубины проникновения возбуждающего света в ткани [77-80].В Хлориновый тип 400 660 Пурпуриновый тип J1 500 700 Бактериохлориновьш тип I В Б актериопурпуриновый тип 770 S1S Рис. 2. Спектры поглощения соединений хлорипового и бактериохлоринового рядов.Таким образом, при разработке путей синтеза новых ФС хлоринового и бактериохлоринового рядов, как правило, решаются две основные задачи, включающие создание более стабильных производных с улучшенными фотофизическими и спектральными свойствами и повышение общей гидрофильности ФС, что улучшает их растворимость в водных растворах и способствует накоплению в опухоли. 3.3. Синтез устойчивых производных хлоринов и бактериохлоринов Включение в хлориновый макроцикл ангидридного цикла приводит к повышению устойчивости соединения, а также к улучшению спектральных характеристик (Лтах 700 нм и 818 нм для пурпурина 18 и бактериопурпурина, соответственно) (рис. 3), однако в щелочных средах ангидридный цикл способен раскрываться с образованием хлорина рб или бактериохлорина/?б. Описанный в литературе способ стабилизации ангидридного цикла включает замену атома кислорода на атом азота, приводящую к получению стабильных циклоимидов как в хлориновом, так и в бактериохлориновом рядах [81-83]. i;i; С,Н 2П5 I I"! НзС н,с СОгН COjH Пурпурин 18 Бактериопурпурин Рис. 3. Структуры пурпурина 18 и бактериопурпурина. Подобная модификация включает взаимодействие пурпурина 18 и бактериопурпурина с различными аминами и последующую циклизацию образующихся моноамидов [84-86]. внутримолекулярную

1. Разработан способ получения циклических имидов бактериохлоринового ряда.2. Получен ряд новых производных циклоимидов бактериохлоринового ряда, обладающих повышенной стабильностью, поглощающих в ближней ИК-области спеюра с упучшенными фотофизическими свойствам^!.3. Разработан метод получения катионных фотосенсибилизаторов бактериохлоринового типа, обладающих высокой антимикробной активностью.4. Изучены фотодинамические свойства циклоимидов бактериохлоринового ряда.