Синтез сенсибилизаторов второго поколения с функциональными группами для получения конъюгатов направленного действия к злокачественным опухолям тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



ни*

.'Рч

чаю«--

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УДК 547.979.733

ЛЕБЕДЕВА Виктория Сергеевна

Синтез сенсибилизаторов второго поколения

с функциональными группами для получения конъюгатов направленного действия к злокачественным опухолям

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

академик РИА,

доктор химических наук,

профессор

А.Ф. Миронов

доктор биологических наук, профессор

Р.И. Якубовская

Москва - 1999 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 2

1. ПРИРОДНЫЕ ХЛОРИНЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИХ 4 МОДИФИКАЦИИ

1.1. Хлорофилл а , бактериохлорофилл а и их производные 4

1.2. Химические превращения функциональных групп в природ- 10 ных хлоринах

1.2.1. Реакции по остатку пропионовой кислоты 11

1.2.2. Образование 6 и 7-членных циклов, конденсированных с 16 кольцом Б природных хлоринов

1.2.3. Химические превращения винильной группы кольца А 19

1.2.4. Модификация пиррольного кольца В 28

1.2.5. Модификация циклопентанонового кольца Е 34

1.2.6. Реакции ангидридного кольца в пурпурине 18 и бактерио- 37 пурпурине

1.2.7. Метилирование, цианирование и формилирование 20-мезо- 43 положения в природных хлоринах

2. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА СЕНСИБИЛИЗАТОРОВ ВТОРОГО 46 ПОКОЛЕНИЯ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ ХЛОРИНОВ

2.1. Обоснование выбора исследования ФС второго поколения 46

2.2. Силилирование кетогруппы циклопентанонового кольца Е 48 пирофеофорбида а

2.3. Модификация ангидридного цикла пурпурина 18 53

2.4. Алкилирование и ацилирование ТчГ-боковой цепи синтезиро- 62 ванных циклоимидов хлорина р6

2.5. Дегидрирование кольца Б в циклоимидах хлорина р6 65

2.6. Химические превращения винильной группы кольца А 72 в производных хлорина р6

2.7. Моделирование электронных спектров поглощения циклои- 75 мидов хлорина р6 методами квантовой химии

2.8. Изучение биологической активности некоторых циклоимидов 84 хлорина Рб

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 86

ВЫВОДЫ 112

ЛИТЕРАТУРА 114

ПРИЛОЖЕНИЕ 125

ВВЕДЕНИЕ

Одним из перспективных подходов при лечении злокачественных новообразований является фотодинамическая терапия (ФДТ) рака. Метод основан на способности фотосенсибилизатора (ФС) преимущественно накапливаться в опухолях и при освещении светом определенной длины волны либо флуоресцировать, обозначая границы опухоли, либо инициировать серию фотохимических реакций, приводящих к разрушению раковых клеток.

Развитие и становление метода ФДТ тесно связано с разработкой первых ФС на основе порфиринов. В медицинской практике широко используются препараты на основе гематопорфирина IX - Фотофрин II, Фотосан, Фотокарцинорин и Фото-гем, которые представляют собой смеси переменного состава из мономерных и олигомерных производных. Применение ФДТ в клинике стимулировало, в свою очередь, поиск новых ФС, оптические свойства, способность к накоплению в опухолях и эффективность действия которых, превосходят известные ранее препараты. К числу требований, предъявляемых к сенсибилизаторам второго поколения, относятся интенсивное поглощение в красной области спектра (660-900 нм), высокая селективность накопления в раковых клетках, низкая токсичность, отсутствие или минимально выраженное накопление в коже и хорошая флуоресценция для надежной диагностики. К настоящему времени ни одно из изученных соединений не обладает совокупностью этих свойств. В связи с этим, проблема поиска новых ФС является важной и актуальной.

Разработка высокоэффективных ФС на основе доступного растительного сырья является одним из перспективных направлений исследований. Удобными соединениями для этих целей служат феофорбид а, пирофеофорбид а, хлорины е6 и

рб, пурпурин 18, которые благодаря своей близости к природному хлорофиллу а, способны легко утилизироваться в организме и обладают низкой фототоксичностью.

Данная работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Химии и технологии тонких органических соединений МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках темы № 1 Б-19-865 "Синтез и изучение свойств пор-фиринов и субмолекулярных структур на их основе, содержащих аминокислоты, пептиды, полиены, хиноны, с целью моделирования важнейших биологических процессов и использования для нужд медицины, науки и техники". В ней впервые предпринята попытка синтеза потенциальных ФС ряда производных пирофеофор-бида а и неизвестных ранее циклических имидов хлорина р6 с функциональными группами, которые могут быть использованы в дальнейших превращениях с целью улучшения спектральных характеристик ФС, а также для получения конъюгатов направленного действия к злокачественным опухолям. Исходной предпосылкой для постановки этих исследований послужили появившиеся в последние два десятилетия данные о перспективности использования указанных типов соединений для ФДТ рака.

Экспериментальным исследованиям предшествует систематический анализ обширных литературных данных по химии, спектроскопии и фармакологии модифицированных природных ФС второго поколения. Краткое содержание этой части работы представлено в литературном обзоре. На основе анализа определены целесообразные пути поиска и произведен выбор структур потенциальных ФС.

I. ПРИРОДНЫЕ ХЛОРИНЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИХ МОДИФИКАЦИИ

Поиск сенсибилизаторов для ФДТ рака проводят среди различных классов соединений. В последние годы наблюдается повышенный интерес к природным гидрированным аналогам порфиринов, которые в виде комплексов с магнием участвуют в фотосинтезе и родственных ему процессах.

Имеющиеся обширные данные по химии, фармакокинетике и биораспределению производных хлорофилла а и бактериохлорофилла а подробно рассмотрены в монографиях /1-5/ и обзорных статьях /6-17/. В данном разделе основное внимание уделено наиболее интересным химическим превращениям этих соединений и их фотодинамической активности.

I.I. Хлорофилл а , бактериохлорофилл я и их производные

Хлорофилл а обладает хорошими спектральными характеристиками и широко распространен в природе. Ежегодный биосинтез хлорофилла а составляет порядка одного миллиарда тонн. Биотехнология позволяет выращивать биомассу, содержащую один изомер - хлорофилл а, что дает возможность существенно упростить выделение и очистку пигмента. Хлорофилл а имеет высокий коэффициент экстинкции при 660 нм, а также хороший квантовый выход возбужденного три-плетного состояния, время жизни которого аналогично производному гематопор-фирина (HpD) /18,19/. Хлорофилл а проявляет противоопухолевую активность in vivo, но в отличие от Фотофрина II выводится из организма в течение нескольких дней.

При обработке хлорофилла а (1) (рис.1) концентрированной соляной кисло-

НзС

со2я

к°гС 4 а, б

\

со2сн3° К02С 2 а, б

Н3С

к°гС б а, б

Н,С

Я02С 3 а,

К02С

со2к со2я

5 а, б

I* = Н (а), СН3 (б)

Рис. 1. Химические превращения хлорофилла а.

Реагенты: I- НС1 (1) (а), ОВД (2) (б); П-2,4,6-коллидин, А;

Ш-НС1 (1), N8, СН3ОН, ТГФ (2), СН3С02Н (3) (а) или 0.5% КОН, СН3ОН,

С5Н5М (2) (б);

IV- 02, ИаОН, (СН3)2СНОН (1)ДС1 (2) (а), СН2К2 (3) (б);

V- ШОН, СН3ОН(1) (а), СН2К2 (2) (б); У1-НС1

той происходит удаление иона магния из макроцикла и гидролиз сложноэфирной связи с отщеплением фитола 121. Образующийся при этом феофорбид а (2 а) является одним из первых ФС второго поколения, предложенных для ФДТ рака. Феофорбид а имеет интенсивное поглощение при 667 нм (молярный коэффициент экс-тинкции 50 ООО л/моль см), а также высокий квантовый выход триплетного состояния (Фт=0.80) и синглетного кислорода (Фд=0.51) в этаноле /20/. В водном буферном растворе при рН 7.4 это соединение агрегирует, что приводит к сокращению времени жизни флуоресценции и снижению квантового выхода синглетного кислорода (до Фд=0.01) /16/. По фотодинамической активности in vitro и in vivo феофорбид а (2 а) превосходит HpD /21/.

Изучение биораспределения феофорбида a in vivo проводилось на кроликах с привитой опухолью печени VX2 при внутривенном введении в дозе 1 мг/кг в фосфатном буфере /22/. Концентрация феофорбида а в опухоли через 24 часа составила 129 мкг/г ткани, отношение концентраций в опухоли и печени - 20, а концентрация ФС в коже и крови - 0.75 и 0.41 мкг/г ткани, соответственно. При проведении исследований на мышах с имплантированной карциномой FM3A и саркомой S180 максимальная концентрация феофорбида а в опухоли также наблюдалась через 24 часа после введения ФС и ее значение практически не зависило от типа опухоли /23/. В случае внутривенного введения феофорбида а крысам с опухолью поджелудочной железы /24/ максимальная концентрация достигалась через 1 час после введения, а максимальное отношение концентраций в опухоли и в поджелудочной железе наблюдалось через 48 часов. Уровень феофорбида а в коже, крови и мышце при этом был весьма низким. Таким образом, феофорбид а способен селективно накапливаться в опухолях, причем наилучшие результаты отмечены в случае опу-

холей кожи /21/.

При кипячении феофорбида а (2 а) в пиридине (5 ч) или коллидине (1.5 ч) образуется пирофеофорбид а (3 а) /1,2/. Аналогично феофорбиду а, пирофеофор-бид а поглощает в длинноволновой области спектра и обладает противоопухолевой активностью, причем по сравнений с НрБ вызывает незначительную сенсибилизацию кожи /24/.

Наиболее изученным производным хлорофилла а является хлорин е6 (4 а). Его получают щелочным гидролизом хлорофилла а /2/. В фосфатном буфере при рН 7.4 этот сенсибилизатор имеет интенсивный пик при 654 нм /12/. Максимум флуоресценции хлорина е6 в этаноле находится при 675 нм, а в фосфатном буфере при 735 нм /12,25/. Соединение имеет хороший выход долгоживущего триплета (760 мкс) и квантовый выход синглетного кислорода (~0.7) /26/. Бычий и человеческий сывороточные альбумины связываются с хлорином е6 в соотношении 1:1 /27/, причем при присоединении к человеческому альбумину спектральные и энергетические свойства хлорина еб сохраняются. Это соединение в связанном состоянии восстанавливает метилвиологен в присутствии аскорбата /25/. Для хлорина е6 характерно повышенное сродство к липопротеинам высокой плотности плазмы крови человека /29/.

При внутривенном введении мышам с имплантированной карциномой БМЗА хлорина е6, хелатированного с [48У] ванадилхлоридом, отношения концентраций ФС в опухоли и мышце, в опухоли и коже составили 13 и 6.7% от введенной дозы, соответственно, что значительно выше по сравнению с феофорбидом а (2 а) /30/. Максимальная концентрация хлорина е6 в опухоли наблюдалась через 6 часов после введения. Хлорин е6 (4а) имеет умеренную противоопухолевую

активность.

Другое производное хлорофилла а - хлорин р6 (5 а) /31/ по своим спектральным, энергетическим и кинетическим характеристикам близок к хлорину е6. Он имеет основной максимум поглощения при 665 нм и квантовый выход флуоресценции в этаноле около 10% /32/. Последнее очевидно связано с частичной агрегацией хлорина р6. Аналогично гематопорфирину, хлорин р6 при облучении белым светом вызывает фотоокисление гистидина, а при облучении светом с длиной волны 650 нм на несколько порядков эффективнее НрБ в сенсибилизации фоторазрушения фибробластов человека /31/. Максимум основной полосы поглощения три-метилового эфира хлорина р6 (5 б) в неполярных средах (674 нм) совпадает с длиной волны генерации Кг-лазера /32/. Это обстоятельство и относительно высокая растворимость делает триметиловый эфир хлорина рб перспективным объектом для ФДТ при лазерном возбуждении.

Окисление хлорофилла а (1) кислородом воздуха в изопропаноле в присутствии щелочи и последующая обработка полученной реакционной смеси соляной кислотой дает пурпурин 18 (6 а) с выходом 64% (рис. 1) /33,34/.

Пурпурин 18 (6 а) имеет сравнительно ограниченное применение в ФДТ. Его ангидридное кольцо устойчиво лишь в кислой и нейтральной средах. В присутствии щелочи происходит раскрытие ангидридного кольца и гипсохромное смещение основной полосы поглощения с 69.8 до 665 нм. Квантовый выход флуоресценции для пурпурина 18 в зависимости от природы растворителя изменяется от 0.08 (в этаноле) до 0.13 (в пиридине) /32/.

В отличие от хлорофилла а, фотосинтетический пигмент бактерий бактерио-хлорофилл а (7 а) (рис. 2) имеет дополнительную гидрированную связь в положе-

ниях 7 и 8, что приводит к батохромному смещению основной полосы поглощения до 773 нм и повышенной лабильности на воздухе /35/. Кроме того, бактериохлоро-филл а плохо растворяется в воде. Омылением бактериохлорофилла а получен водорастворимый бактериохлорофиллин а (7 б) с максимумом основной полосы поглощения при 770 нм /36/. При удалении иона магния из бактериохлорофиллина а (7 б) под действием ацетатного буфера (рН 5.0) образуется бактериохлорин а (8 а) /37/. Превращение бактериохлорофилла а в бактериохлорин а сопровождается гип-сохромным сдвигом на 10 нм. Эксперименты in vitro показали, что бактериохлорин а и бактериохлорофиллин а способны вызывать фотодинамическое разрушение клеток L929 /37/. При этом бактериохлорин а обладает большей эффективностью, по сравнению с бактериохлорофиллином а и HpD.

СОСНз Н СН3 СОСН3 н Сн3 сосн3 Н СН;

но2с 8

о=с

7 а-в

о=с

9 а-в

\

\

R

R

a R = OC20H39 б R = OH

в R = 0CH2CH(C02H)NH2

a R = ОН

б R = NHCHCH2C02C(CH3)3

I

С02С(СН3)3 в R = NHCHCH2C02CH2C6Hs

со2сн2сбн5

Рис. 2. Химические превращения бактериохлорофилла а.

Реагенты: I- КОН, СН3ОН (1), ацетатный буфер pH 5.0 (2); II- 02, NaOH, (СН3)2СНОН (1), HCl (2) (а), ДЦК, ДМАП, КН2СН[С02С(СНз)з] СН2С02С(СН3)3 НС1(3) (б) или NH2CH[C02CH2C6H5]CH2C02CH2C6H5 HCl (3) (в)

При внутривенном введении 99тТс-бактериохлорина а хомякам с имплантированной меланомой /38/ максимальная концентрация ФС в опухоли обнаружена через 2 ч, а отношения концентраций ФС в опухоли и коже, в опухоли и крови составляли 1.6 и 0.3, соответственно. Изучение биораспределения бактериохлорина а при введении в виде эмульсии на основе Cremophor EL /39/ показало, что отношение концентраций ФС в опухоли и нормальной ткани через 10-15 мин повышается с 1.9 до 2.5, а затем снижается до 0.5.

В последние годы особый интерес вызывает другое производное бактерио-хлорофилла а - бактериопурпурин (9 а) /33/. Аналогично пурпурину 18, бактерио-пурпурин содержит шестичленный ангидридный цикл, конъюгированный с пир-рольным кольцом С. Этот экзоцикл влияет на распределение электронной плотности в молекуле бактериопурпурина, вследствие чего в электронном спектре наблюдается батохромный сдвиг основной полосы поглощения на 49 нм по сравнению с бактериохлорином а (7ч,1акс 760 нм). Бактериопурпурин, полученный по аналогии с пурпурином 18 окислением бактериохлорофилла а (7 а) кислородом воздуха в изопропаноле в присутствии щелочи /33/, по своим спектральным свойствам является перспективным объектом исследования в качестве сенсибилизатора, однако в щелочной среде неустойчив и превращается в тринатриевую соль бактериохлорина р6 с максимумом поглощения при 766 нм.

1.2. Химические превращения функциональных групп в природных хлоринах

Ограниченное использование рассмотренных соединений для ФДТ рака связано с рядом обстоятельств, включая плохую растворимость в водных растворах и низкую селективность накопления в опухолях. Однако, наличие в этих соединени-

ях различных функциональных групп позволяет осуществлять структурные модификации пигментов в направлении требуемых свойств.

1.2.1. Реакции по остатку пропионовой кислоты

Для улучшения растворимости производных хлорофилла а (1) и бактерио-хлорофилла а (7 а) в водных растворах были проведены модификации остатка пропионовой кислоты. Гидролиз хлорофилла а и бактериохлорофилла а до хлорофил-лина а (10 а) (рис. 3) и бактериохлорофиллина а (7 б) (рис. 2) на несколько порядков повышает растворимость в воде /36/.

к о, с

со2сн30

10 а, б а и = н

б л = сн2сп(с02и)м12

н,с

о=с

I

нгч

¿о2сн3°

со2н

со2н 11

н3с

о=с

и 12 а - в а и = гшсщсогщснгсогн б Я = ]\Н(СН2)з1ЧН(СН2)4>Щ2 К = ^(СН2)21\+(СИз)зГ

н3с

о=с о

\

13 а - в

а и! = и2 = осн3, из = ¡ун(сн2)21^н2 б и] = \исн(с02н)си2с02п,

= = он в и, = и2 = nhch(c02h)ch2c02h, 1*3 = 011

Рис. 3. Примеры некоторых амино- и аминокислотных производных феофорбида а, пирофеофорбида а, пурпурина 18 и хлорина е6

Последующая ферментативная этерификация (10 а) и (7 б) серином и тирозином с помощью хлорофиллазы Китайского дерева приводит к еще более растворимым соединениям /19/. Сериновые производные (10 б) и (7 в) также получены ферментативной переэтерификацией хлорофилла а и бактериохлорофилла а серином /19/. Синтезированные соединения имеют высокую фото динамическую активность. В опытах in vivo максимальная концентрация сериновых производных (2.64 мкг/кг) в опухоли достигалась через 1-5 часов после введения ФС в дозе 20 мг/кг. Продолжительность выведения ФС (10 б) и (7 в) из опухоли составляет 72 и 16 часов, соответственно. Аминокислотное производное бактериохлорофил-ла а (7 в), благодаря хорошим спектральным характеристикам, селективности, фотодинамической активности и способности быстро выводиться из организма, можно использовать для лечения меланом.

Высокую фотодинамическую активность также проявили производные феофорбида а, мо�