Синтез и изучение свойств гидроксилсодержащих циклоимидных производных хлорина P6 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Рузиев Рамзес Джауланович

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ГИДРОКСИЛСОДЕРЖАЩИХ ЦИКЛОИМИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

ХЛОРИНА р.

02.00.10-Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2005

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Миронов Андрей Федорович Официальные оппоненты:

доктор химических наук Рудакова Инна Павловна

кандидат химических наук Жесткое Владимир Павлович

Ведущая организация: Ивановский государственный химико-технологический университет

Защита состоится « ¿V» ceuTjl&J _2005 г. В 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Лютик А.И.

mti

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Успешное применение фотодинамической терапии (ФДТ) в клинике при лечении онкологических заболеваний стимулировало поиск новых высокоэффективных сенсибилизаторов, фотофизические характеристики которых, тропность к злокачественным новообразованиям, низкая фототоксичность и хорошее выведение из организма превосходили бы известные препараты первого поколения.

Одним из перспективных направлений при разработке подобных фотосенсибилизаторов является химическая модификация природных хлоринов, позволяющая оптимизировать гидрофильно-гидрофобный баланс заместителей в макроцикле, влияющий на накопление хлоринов в опухолевых клетках, а также улучшать их фотофизические свойства и растворимость в физиологических средах.

В ряду природных хлоринов особый интерес представляет пурпурин 18. Его отличительной чертой является наличие дополнительного ангидридного цикла и смещение основной полосы поглощения до 698 нм. Хорошие спектральные характеристики, доступность и высокая реакционная способность послужили основными критериями при выборе пурпурина 18 в качестве исходного соединения для разработки новых фотосенсибилизаторов второго поколения. Превращение ангидридного кольца пурпурина 18 в имидный цикл помимо смещения максимума поглощения в длинноволновую область, существенно повышает устойчивость данных соединений. Наиболее изученными представителями этого класса хлоринов являются гидрофобные Л'-алкилциклоимидные производные пурпурина 18, впервые полученные в группе К. Смита (США).

В связи с особым вниманием, проявляемым в последние годы к амфифильным сенсибилизаторам, представляло интерес расширить круг циклоимидов за счет гидроксилсодержащих производных и более глубоко изучить их химические и биологические свойства, включая накопление в раковых клетках и фотодинамическую активность in vitro и in vivo. К началу настоящей работы группа известных амфифильных циклоимидов была немногочисленна и их фотобиологические свойства мало изучены.

Данная работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС в рамках темы № 1Б-4-865 "Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения пр гтке

и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины" и гранта Президента РФ по поддержке Ведущих научных школ России НШ-2013.2003.3.

Цель работы. Целью настоящей работы явился синтез и изучение химических превращений Л'-гидрокси- и ЛГ-(ш-гидроксиалкил)циклоимидных производных хлорина Рб. Основные направления исследования включали региоспецифическое введение гидроксильной группы в пиррольное кольцо О, модификацию винильной группы в пиррольном кольце А и окисление кольца В. В задачу исследования входило получение циклических имидов хлорина рв с интенсивным поглощением в красной области спектра, содержащих гидрофильные и гидрофобные группы в противоположных участках макроцикла, для выяснения влияния этих заместителей на накопление в раковых клетках и ФДТ активность.

Научная новизна. Изучена возможность введения дополнительной гидроксильной группы в пиррольное кольцо И циклоимидов хлорина ре, содержащих при атоме азота гидроксильную и ю-гидроксиалкильную группы. Показано, что раскрытие 8-лактонов циклоимидов в кислой и щелочной средах, а также под действием амина приводит к ранее неизвестным циклоимидам, содержащим гидроксильную группу в положении 18 макроцикла. Установлено, что гидролиз 8-лактонного кольца в #-(ю-гидроксиалкил)цшслоимидах протекает с более высоким выходом в щелочной, а в циклоимидах с N-011 группой - в кислой средах. Получены ранее неописанные 18-гидрокси-Л/-(3-гидроксипропил)- и 18-гидрокси-ЛР-ацетоксициклоимиды хлорина ре. Раскрытие 8-лактонного кольца #-(3-пздроксипропил)циклоимида хлорина рб под действием диэтаноламина приводит к образованию диэтаноламида 18-гидрокси-Аг-(3-гидроксипропил)циклоимида хлорина рц. Показано, что для получения 18-гидрокси-Лг-гидроксициклоимида хлорина р( наиболее оптимальным является способ модификации 18-гидроксипурпурина 18 гидроксиламином в пиридине. Взаимодействием пурпурина 18 и О-гликозилированного гидроксиламина -

О-^-О-галактопиранозилгидроксиламина впервые получен Л'-гликозилоксициклоимид хлорина Рб-

Окислением винильной группы пиррольного кольца А и двойной связи кольца В циклоимидов хлорина ре тетраоксидом осмия получены ранее неизвестные А'-метокси-и N-(3 -гидроксипропил)циклоимиды 3-формил-7,8-дигидроксибактериохлоринов с интенсивным поглощением в области 821-825 нм.

Показано, что при обработке комплексом Вильсмейера производных хлорофилла а формилирование протекает по винильной группе в положении 3, не затрагивая 8-мезо-мостяк.

Практическая значимость. Разработанные методы получения амфифильных циклоимидов хлорина р& путем направленного введения гидроксильной группы в пиррольное кольцо формилирования винильной группы в пиррольном кольце А и окисления кольца В существенно расширяют возможности модификации А'-гидрокси- и Лг-(<»-гидроксиалкил)циклоимидов хлорина ре- Реакция пурпурина 18 с О-Д-О-галактопиранозилгндроксиламином представляет интерес как возможность введения углеводного остатка в молекулу циклоимида. Этот подход не требует дополнительной защиты гидроксильных групп углевода. А^-Гликозилоксициклоимид хлорина рь представляет собой новый тип потенциальных сенсибилизаторов с повышенной специфичностью к раковым опухолям. Улучшен ранее известный способ получения ЛГ-(а>-гидроксиалкил)циклоимидов хлорина рб взаимодействием пурпурина 18 с аминоспиртами, что позволило наработать эти соединения в количествах, необходимых для более глубокого исследования их фотобиологических свойств. В ходе выполнения работы синтезированы циклоимиды хлорина рв и бактериохлорина с интенсивным поглощением в области 708-825 нм. Они различаются количеством и местоположением полярных групп в макроцикле. Направленная модификация хлоринового макроцикла создает возможность проведения исследований возможной зависимости биологической активности синтезированных цикломидов хлорина рв от их структуры. Наличие в циклоимидах реакционноспособных групп позволяет проводить дальнейшие модификации данных соединений, в частности, использовать их в синтезе коныогатов направленного транспорта к злокачественным опухолям.

Образцы полученных циклоимидов были переданы для исследования селективности накопления в опухолях и оценки фотодинамической активности в Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, а также в Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Разработка регио- и стереонаправленного метода введения гидроксильной группы в пиррольное кольцо О в ряду ¿"У-гидрокси- и ЛНю-гидроксиалкил)циклоимидов хлорина Рб Получение ранее неизвестных

хлоринов: Л?-(3-гадроксипропнл)-, ,У-гидрокси-, А'-ацетоксициклоимидов и диэтаноламида Л^-(3-гидроксипропил)циклоимида хлорина ре, содержащих гидроксильную группу в положении 18.

2. Взаимодействие метилового эфира пурпурина 18 с 0-/?-В-галактопиранозилтидроксиламином как один из способов синтеза Л^-гликозилоксициклонмидов с использованием 0-гликозилированных гидроксиламинов.

3. Селективное форматирование винильной группы в ряду циклоимидных производных хлорина рв под действием реагента Вильсмейера с образованием 3-(2-формилвинил)- Л^-гидрокси- и №ацетоксициклоимидов хлорина р6.

4. Синтез ранее неизвестных Л^З-гидроксипропил)- и Л^-метоксициклоимидов 7,8-дигидроксибактериохлоринов с интенсивным поглощением в области 820 нм.

5. Изучение физико-химических свойств синтезированных амфифильных производных хлорина рб и оценка влияния заместителей на спектральнвд характеристики.

Адробадяя работы. Основные результаты опубликованы в 3 статьях, а также доложены на XX Международной конференции по фотохимии в 2001 г., г. Москва; Ш Съезде Биохимического общества в 2002 г., г. Санкт-Петербург; V Школе-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений в 2002 г., г. Звенигород; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Отечественные противоопухолевые препараты" в 2003 г., г. Москва; IX Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов в 2003 г., г. Суздаль; X Конгрессе европейского общества по фотобиологии в 2003 г., г. Вена, X Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии - 2004" в 2004 г., г. Волгоград.

Обьем и структура работы. Диссертационная работа изложена на па страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных данных, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ЙЙ источника. Работа содержит схем и 2. таблиц.

СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ЛЧИДРОКСИ-И ^-(т-ГИДРОКСИАЛКИЛ)1ЩКЛОИМИДОВ ХЛОРИНА Р6

Известно, что введение гидроксильных групп в гидрофобные производные природного хлорофилла а существенно изменяет их амфифильность. При этом гидроксильные группы могут находиться как непосредственно в макроцикле, так и в составе боковых заместителей Известно, что амфифильные вещества хорошо накапливаются в опухолях. Особый интерес представляют соединения, в которых гидрофобные и гидрофильные заместители расположены в противоположных участках макроцикла. Они легче проникают в клетку и затем концентрируются в ее жизненно важных элементах. Создание новых сенсибилизаторов с различным расположением полярных (гидроксильных и карбоксильных) заместителей в хлориновом макроцикле представляет интерес для изучения механизмов накопления фотосенсибилизаторов в опухолях, выявления сайтов их локализации в раковых клетках и установления взаимосвязи между характером локализации и фотодинамической активностью сенсибилизатора.

В настоящей работе получение циклоимидов хлорина ре осуществлялось превращением ангидридного кольца пурпурина 18 в имидный цикл, содержащий при атоме азота гидрокси- и ю-гидроксиалкильные группы. В целях улучшения спектральных характеристик и введения полярных групп в макроцикл осуществлялась дальнейшая их модификация гидроксилированием пиррольного кольца О, окислением винильной группы пиррольного кольца А и двойной связи кольца В, а также формшшрованием винильной группы медных и никелевых комплексов циклоимидов комплексом Вильсмейера.

Пурпурин 18 получали окислением хлорофилла а, предварительно экстрагированного из сине-зеленых водорослей Яр^гиПпа р1а1еп$1$, кислородом воздуха в щелочных условиях по технологии, отработанной на кафедре ХТБАС МИТХТ им. М.ВЛомоносова. Метиловый эфир пурпурина 18 синтезирован обработкой пурпурина 18 диазометаном.

1. Модификация ангидридного кольца пурпурина 18

Превращение ангидридного кольца пурпурина 18 (1а) (схема 1) в имидный цикл действием аминоспиртов позволяет легко варьировать со-гидроксиалкильные

заместители в хлориновом макроцикле. Для выяснения влияния длины данного фрагмента на биологическую активность циклоимидов хлорина ре нами были синтезированы как известные ЛГ-(2-гидроксиэтил)-, Л^-(З-гидроксипропил)-

«V1— 7 К2=Н Я1 = Н (а), Ме (б)

Схема 1. Синтез АЦсо-гидроксиалкил)-, Л^-гидрокси- и Л^-галактозилоксициклоимидов хлорина рб■

Реагенты и условия проведения реакции: I - МН^СНгУЭН, СНСЬ, 25°С (1), (СР3С0)20 или Ас20 (2), КаНСОз или №ОН (3); П -Ш2ОН-НС1, С5Н5М, 25°С; III - 0-/?-0-галактогшранозилгидроксиламин, СвНзМ; 1У-Ас20,С5Н5К.

циклоимиды (2), (3), так и ранее неописанные Л^-(5-1-идроксипентил)- (4) и М(б-гидроксигексил)- (5) циклоимиды хлорина ре. В ходе работы было установлено, что циклоимиды (4) и (5) описанным способом получаются с низким выходом. С целью повышения выхода циклоимидов было увеличено втрое время выдерживания пурпурина 18 (1а) с 5-аминопентанолом и 6-аминогексанолом, а также произведена

замена уксусного ангидрида на трифторуксусный ангидрид при циклизации промежуточно образующихся моноамидов хлорина рв- Однако наиболее предпочтительной модификацией метода, па наш взгляд, явилась замена бикарбоната натрия при нейтрализации избытка ангидрида на 5%-ный раствор гидроксида натрия. Это позволило получить ранее неизвестные ЛГ-(5-гидроксипентил)- (4) и ^-(б-гидроксигсксил)- (5) циклоимиды с выходом 32-35%, а выход АЧ2-гидроксиэтил)-(2) и N-(3-гидроксипропил)- (3) циклоимидов увеличить до 45-47%. По своим характеристикам (хроматографической подвижности и электронным спектрам) синтезированные соединения (2) и (3) соответствуют ранее полученным циклоимидам. Структура циклоимидов (4) и (5) подтверждена данными 'Н ЯМР, масс- и абсорбционной спектроскопии. #-(5-Гидроксипентил)- (4) и Лт-(6-гидроксигексил)- (5) циклоимиды хлорина ре имеют максимум поглощения в области 708 нм. Масс-спектры этих хлоринов содержат пики молекулярных ионов с m/z 650.5 и 664.3.

Другой тип циклоимидов хлорина р«, полученный модификацией ангидридного кольца пурпурина 18 и использованный нами в дальнейших превращениях, содержал гидроксильную группу непосредственно у атома азота. iV-Гидроксициклоимид (6а) получали в одну стадию взаимодействием пурпурина 18 (1а) с гидрохлоридом гидроксиламина в пиридине с выходом 70%. Метиловый эфир пурпурина 18 (16) в этих условиях реагирует с образованием циклоимида (66) с выходом 93%. По сравнению с ЛЦю-гидроксиалкил)циклоимидами iV-гидроксициклоимиды (6а) и (66) имеют больший сдвиг максимума поглощения в ИК область и поглощают при 718 нм. В спектре 1Н ЯМР метилового эфира N-гидроксициклоимида хлорина рг, (66) в слабом поле при 6 9.16 м.д. имеется уширенный синглет интенсивностью в один протон, который был отнесен к гидроксилу при атоме азота имидного кольца. В ИК-спектре соединения (66) наблюдаются полосы валентных колебаний С=0 связей сложноэфирной группы и имидного кольца при 1732, 1693 и 1600 см*1, а также полоса валентных колебаний О-Н связи гидроксильной группы при атоме азота при 3583 см'1.

Нами для модификации ангидридного кольца пурпурипа 18 в имидный цикл предложено О-гликозилированное производное гидроксиламина -O-yS-D-галактопиранозялгидроксиламин1. Показано, что метиловый эфир пурпурина 18 (16) реагирует с O-^-D-галактопиранозилгидроксиламином в пиридине при комнатной температуре с образованием iV-галактозилоксициклоимида (7) При этом, что особенно важно, превращение в циклоимид осуществляется без

1 O-^-D-Галактопиранозилгилроксиламин синтезирован на кафедре ХТБАС МИТХТ им. М.В. Ломоносова в лаборатории проф. ЮЛ. Себякина.

предварительной защиты гидроксильных групп углевода. Циклоимид (7) имеет максимум поглощения при 714 нм. Его масс-спектр содержит пик молекулярного иона с m/z 756.2. Полученный циклоимид содержит четыре гидроксильные группы, увеличивающие его гидрофильность. Обработка соединения (7) уксусным ангидридом в пиридине приводит к М-галакгозилоксициклоимиду (8). В спектре *Н ЯМР соединения (8) сигналы, отнесенные к протонам остатка галактозы, наблюдаются в областях 5.50 - 5.30 и 4.44 - 4.03 м.д., протоны ацетоксигрупп - в области 2.42 -1.90 м.д. Сигнал аномерного протона находится при 4.44 м.д., что указывает на сохранение /9-конфигурации аномерного центра. Масс-спектр соединения (8) содержит пик с m/z 924.5 (Л/+Н).

Таким образом, за счет модификации ангидридного кольца пурпурина 18 получены три типа хлоринов с шестичленным имидным циклом, отличающиеся заместителями у атома азота. Первый тип - iV-замещенные циклоимиды, содержащие остатки алифатических спиртов. Второй тип представляют циклоимиды с гидроксильной группой у атома азота. Третий тип - jV-гликозилоксициклоимид. У синтезированных соединений по сравнению с пурпурином 18 наблюдается батохромный сдвиг максимума поглощения и повышенная устойчивость в щелочных средах. Введение в структуру гидрофобного макроцикла гидрофильного углеводного заместителя позволяет улучшить растворимость сенсибилизатора в полярных растворителях и повысить его накопление в опухоли. Благодаря потенциальной специфичности /J-галактозидов к галектинам, интенсивно экспрессируемым на поверхности раковых клеток, можно ожидать, что наличие галактозного фрагмента в составе циклоимида хлорина рг, позволит осуществить его направленный транспорт к опухоли.

2. Модификация jV-гидроксициклоимидов хлорина р6

Нами выполнен ряд модификаций по гидроксильной группе в iV-гидроксициклоимидах хлорина р6. Так, при обработке N-гидроксициклоимида (6а) диазометаном получен Л^-метоксициклоимид (9) с выходом 89% (схема 2) Наличие подвижного атома водорода в Л'-гидроксициклоимидах хлорина рг, также позволяет легко осуществлять ацилирование.

Показано, что хлорангидрид монохлоруксусной кислоты взаимодействует с Л^-гидроксициклоимидом (66) в хлористом метилене в присутствии пиридина при комнатной температуре, давая N-хлорацетоксициклоимид (11) с выходом 73% Его

масс-спектр содержит пики с m/z 670.2 (А/*) (75.5%) и 672.2 (Л/) (24.5%), что соответствует природному распределению ионов 35С1 и 37С1.

JV-Ацетоксициклоимиды (10а) и (106), ранее синтезированные ацилированием JV-гидроксициклоимидов (6а) и (66) уксусным ангидридом в диоксане, в данной работе получены с более высокими выходами (80-84%) взаимодействием пурпурина 18 (1а) и (16) и гидроксиламина с последующей обработкой реакционной смеси уксусным ангидридом без выделения промежуточного продукта. Замещение по гидроксильной группе сопровождается небольшим гипсохромным сдвигом основного максимума поглощения в электронных спектрах циклоимидов с 718 до 710-711 нм.

Наличие в спектрах *Н ЯМР циклоимидов (9), (10а,б) и (11) синглетов трех мезо-протонов, протонов винильной, метальных и метиленовых групп, а также сигналов 17-Н и 18-Н свидетельствует о сохранении хлоринового макроцикла. Наблюдаемые в спектрах соединений (9) и (11) дополнительные синглеты интенсивностью

ссуг оСОСНз

10а,б R= Н (а), Ме (б)

с02Ме OCOCHjO 11

Схема 2. Химические превращения Л^-гидрокснциклоимида хлорина^. Реагенты: I - CH2N2, CHCI3; П - Ас20, C5H5N; Ш - С1СН2СОС1, C5H5N, CHCI3.

в три и два протона при 8 4.70 и 4.37 м.д. были отнесены к метокси- и хлорацетоксигруппам при атоме азота. Спектры хлоринов (10а,б) также подтверждают строение веществ, однако содержат дополнительные сигналы, для отнесения которых нами был использован метод ЫОЕЭУ. В соединении (10а) протоны винильной группы взаимодействуют с одним из жезо-протонов при 9.24 м.д. и синглетом в ЗН при 3.29 м.д. В связи с этим первый сигнал отнесен к 5-мезо-протону, а второй - к метальной группе в положении 2. Кросс-пики 5-жезо-протона позволили определить положение сигнала 7-СНз (3.11 м.д.). Далее были найдены значения химических сдвигов для 8-С2Н5 (3.58 м.д., кв, 1.64 м.д., т), 10-мезо-протона (9.49 м.д.) и 12-СНз (3.74 м.д.). Метальная группа в положении 2 имеет выраженный кросс-сигнал с 20-мезо-протоном (8.49 м.д.). Исходя из взаимодействия последнего установлены химические сдвиги для 18-Н (4.33 мд., кв) и 18-СН3 (1.70 м.д, д). Аналогичным образом установлено положение 17-Н. В спектре ему соответствует два уширенных дублета при 5.22 и 5.16 м.д. примерно равной интенсивности. Три протона 135-СНз также представлены двумя синглетами при 2.62 и 2.61 м.д. Очевидно, для ЛГ-ацетоксициклоимида хлорина рс существуют два состояния (возможно, обусловленные расположением ацильной группы над и под плоскостью макроцикла), химический обмен между которыми происходит медленно во временной шкале ЯМР. Подтверждением такого предположения является уширение сигналов 17-Н и 135-СНз в спектре 'Н ЯМР при повышении температуры. Структура циклоимида (10а) была также подтверждена спектрами 13С ЯМР и двумерного гетероядерного резонанса на ядрах 13С и'Н.

Таким образом, гидроксильная группа при атоме азота имидного кольца Л^-гидроксициклоимидного производного хлорина ре легко вступает в реакции алкилирования и ацилирования, что позволяет получать циклоимиды с N-011 группой с высоким выходом. Введение заместителя с атомом хлора может быть использовано в дальнейших модификациях, в том числе с целью присоединения к молекулам-носителям для осуществления направленного транспорта к раковым клеткам.

3. Введение гидроксильной группы в пиррольное кольцо Б

В ходе исследований, проводящихся на кафедре ХТБАС по изучению реакции внутримолекулярной циклизации остатка пропионовой кислоты в природных хлоринах в соседнее положение 18 и дальнейших превращений образующегося 5-лактонного цикла при пиррольном кольце И, нами показано, что гидролиз 8-лакгонов может быть

использован для создания дополнительного гидрофильного участка в молекулах ЛГ-ацетокси- и Я-(3-гидроксипропил)циклоимидов хлорина рв (схема 3). Исходные

СОгН

О

Я1

3 ЯЧОУзОН 10а Я1=ОАс

14а,б (^(СНЫзОН 156 Я1=ОАс Р2=Н (а), Ме (б)

(НОСИЛ Н^

(СНг)3ОН

16

СОгН

1а

17

СОгМе

18 Х=0

19 Э^МОН

Схема 3. Синтез 18-гидроксизамещенных циклоимидов хлоринарб.

Реагенты: 1-ДЦХ, СНС13; II - СР3С02Н, МеОН (1:10); III-№ОН, ТГФ; IV -ЮТ(СН2СН2ОН)2, ТГФ; V -Ш2ОН-НС1, С5Н5М.

8-лактоны (12) и (13) получены окислением М-(З-гидроксипропил)- и ЛГ-ацетоксициклоимидов (3) и (10а). Так, обработка N-(3-гидроксипропил)циклоимида хлорина ре (3) в атмосфере аргона 1.5 кратным избытком 2,3-дихлор-5,6-дициан-1,4-

бензохинона (ДДХ) в течение 35 мин при 25°С приводит к лактону (12) с выходом 54%. Аналогичным образом соединение (10а) окисляется с образованием 5-лактона N-ацетоксициклоимида хлорина pg (13) с выходом 58%. Образование лактонного цикла не влияет на положение максимума основной полосы поглощения в электронных спектрах циклоимидов.

Обработка лактона (13) раствором трифторуксусной кислоты в метаноле приводит к 18-гидрокси-Л^ацетоксициклоимиду (156) с выходом 62%. В то же время, 5-лактон Л^-(3-гидроксипропил)циклоимида (12) в кислых условиях склонен к дегидратации с образованием порфирина. Раскрытие его 5-лактонного кольца успешнее проходит в присутствии щелочи. При обработке лактона (12) гидроксидом натрия в тетрагидрофуране при комнатной температуре 18-гидроксициклоимид (14а) получен с выходом 70%. Его метилировапие диазометаном приводит к эфиру (146). В масс-спектрах соединений (14а), (146) и (156) имеются пики молекулярных ионов с m/z 637.4,652.1, и 667.2, соответственно.

Как известно, раскрытие 8-лактонного кольца хлоринов также происходит под действием аминов. Нами эта реакция была исследована на 8-лактоне циклоимида (12). С целью введения дополнительных полярных групп в нижнюю часть макроцикла 8-лактон циклоимида (12) обрабатывали диэтаноламином в тетрагидрофуране при комнатной температуре. В результате был получен диэтаноламид 18-гидроксициклоимида (16) с выходом 63%. Его масс-спектр содержит пик молекулярного иона с m/z 725.2.

Для получения 18-rmpoKCH-N-™apoKcmmiuioHMHfla (19) использован иной подход. В качестве исходного соединения был взят пурпурин 18, который под действием ДДХ превратили в 8-лактон (17). Последний действием трифторуксусной кислоты в метаноле раскрывался, давая соединение (18). Это соединение обрабатывали гидрохлоридом гидроксиламина и в результате 18-гидроксициклоимид (19) был получен с выходом 75%. Структура соединения (19) подтверждена данными масс-спектрометрии (пик молекулярного иона с m/z 610.5) и 'Н ЯМР спектроскопии. В спектрах 'Н ЯМР полученных 18-гидроксициклоимидов (14а,б), (156), и (19) отсутствуют квартеты 18-Н протонов, а сигналы 18-СНз сдвинуты в сильное поле с 2.15-2.18 м.д. до 1.82-1.83 м.д. В спектре соединения (19) наблюдается также уширенный синглет при 4.71 м.д. интенсивностью в один протон, который был отнесен к 18-ОН группе.

Двумерная спектроскопия NOESY выявила наличие сильных взаимодействий между 17-Н и 18-СНз Для соединений (14а) и (156), как и в случае 8-лактонов (12) и

(13), что свидетельствует о том, что данные заместители находятся с одной стороны от плоскости макроцикла и, следовательно, образовавшаяся 18-ОН группа располагается над плоскостью макроцикла. Эти результаты находятся в хорошем соответствии с ранее полученными данными для 18-гидроксипурпурина 18 (18) и диметилового эфира 18-гидроксихлорина Рб- Аналогичное расположение 18-гидроксильной группы можно предположить для 18-гидроксипроизводного (19).

Таким образом, варьирование условий раскрытия 5-лактонного кольца циклоимидов хлорина рв позволяет вводить дополнительную гидроксильную группу в положение 18 макроцикла с сохранением природной конфигурации остагка пропионовой кислоты.

4. Химические превращения винильной группы пиррольного кольца А

Изменение гидрофобности природных хлоринов, а также значительное улучшение их спектральных характеристик может быть достигнуто модификацией по винильной группе пиррольного кольца А. Нами проведен ряд химических превращений винильной группы циклоимидов хлорина рб, ранее показавших хорошую фотодинамическую активность. Циклоимиды (3), (9) и (10а) (схема 4) были окислены периодатом натрия в присутствии каталитических количеств тетраоксида осмия. В процессе работы удалось увеличить выход ранее описанных 3-формилциклоимидов (20а) и (21а) до 72-74%, а также получить новый З-формил-Л'-метоксициклоимид (226) с выходом 80%. Масс-спектр последнего содержит интенсивный пик молекулярного иона с m/z 610.0. Максимумы поглощения соединений (20а), (21а) и (226) находятся в области 746-747 нм.

Существенное смещение максимума поглощения в длинноволновую область (на 20 нм) наблюдается также в случае замещения атома водорода винильной группы на формильную. Для получения циклоимидов с 2-формилвинилыюй группой нами была использована реакция Вильсмейера. В химии хлоринов эта реакция обычно применяется в синтезе 20-формилхлоринов. Однако, имеются данные, что при наличии в хлоритовом макроцикле винильной группы, она первой взаимодействует с комплексом Вильсмейера. Нами была изучена реакция с пурпурином 18. Для этого медный комплекс пурпурина 18 (23) обрабатывали комплексом ДМФА-РОСЬ в ДМФА в течение 48 часов. В результате был выделен единственный продукт - медный комплекс 3-(2-формилвинил)пурпурина 18 (26) с выходом 75%. Масс-спектр этого соединения содержит пики с m/z 669.0 (АГ) (69%) и 671.0 (М*) (31%), что соогветствует

природному распределению ионов 63Си и 65Си. В электронном спектре максимум основной полосы поглощения находится при 702 нм.

Деметаллирование соединения (26) смесью серной и трифторуксусной кислот (15:85) дает 3-(2-формилвинил)пурпурин 18 (29) с выходом 53%, а обработка серной кислотой непосредственно иминиевой соли, образующейся при взаимодействии соединения (23) с комплексом Вильсмейера - 58%. Масс-спектр хлорина (29) содержит пик молекулярного иона с т/г 606.2. В электронном спектре наблюдается батохромный сдвиг максимума поглощения до 728 нм.

сно

16,3,9, Юа,б

23 М=Си,Х=0

24 М=Си, >NOAc

25 М=№, X=NOAc

СНО

26 M=QJ, Х=0

27 M=Cu, X=NOAc

28 M=Ni, X=NOAc

20а R1=(CH2)3OH 21а R1=OAc 226 R1=OMe

R*=H (а), Me (б)

29 R1=CHO, Х=0 |— 30 R1=CHO, X=NOH 31 R1=CHO,X=NOAc VII Ci. 32 R1=CH2OH, X=NOAC

Схема 4. Химические превращения винильной группы пиррольного кольца А.

Реагенты: I - NaRVOsO.,, диоксан, П - Сц(ОАс)2-МеОН, СНС13 или NiCl2, ДМФА; III - ДМФА-РОСЬ, СНС13 (1), NaHC03, Н20 (2); IV - H2SO„, ТФК, V - ДМФА-РОСЬ, СНС13 (1), H2S04 (2), NaHC03, Н20 (3); VI - АсгО; VII-NaBH4.

Cu(II)- и №(П)-комплексы Tv'-ацетоксициклоимида (24) и (25) реагируют с комплексом ДМФА-РОС1з аналогичным образом. Соединение (24) реагирует с ДМФА-РОСЬ в течение 48 часов при комнатной температуре с образованием соответствующего металлокомплекса 3-(2-формилвинил)циклоимида (27). Использование в этой реакции в качестве растворителя хлороформа уменьшало время реакции до 18 часов, а выход 3-(2-формилвинил)хлорина (27) повышался до 90%. Масс-спектр металлокомплекса циклоимида (27) содержит пики молекулярных ионов с m/z 724.1 и 726.0. При кипячении ЩЩ-Л^-ацетоксициклоимида хлорина p¿ (25) с комплексом ДМФА-РОСЬ в ДМФА в течение 1 часа также не обнаружено образования л<ел?-замещенных продуктов, в результате был выделен только 3-(2-формилвинил)циклоимид (28). Удаление металла из соединения (27) смесью серной и трифторуксусной кислот (15:85), сопровождалось гидролизом ацетоксигруппы при атоме азота имндного кольца и 3-(2-формилвннил)-ЛГ-гидроксициклоимид (30) был получен с выходом 55%. В масс-спектре этого соединения имеется пик молекулярного иона с m/z 622.4. А'-Гидроксициклоимид (30), содержащий 2-формилвинильную группу в положении 3 пиррольного кольца А, поглощает в области 744 нм.

При обработке 3-(2-формилвинил)-,У-гидроксициклоимида (30) уксусным ангидридом с выходом 88% получен А'-ацетоксициклоимид (31) Этот хлорин поглощает при 739 нм. Его масс-спектр содержит пик молекулярного иона с m/z 663.3. В спектре 'Н ЯМР хлорина (31) наряду с сигналами трех жезо-протонов при 9.57, 9.37 и 8.67 м.д. имеются дублеты интенсивностью в один протон каждый при 10.10 и 8.74 м.д., отнесенные к 32-СНО и З'-СН, а также дублет дублетов 32-СН (J=17.0 Гц) при 7.35 м.д. Величина константы спин-спинового взаимодействия указывает на трансконфигурацию двойной связи 3-формилвинильной группы.

Для снижения гидрофобности верхней части хлоринового макроцикла формилвинилциклоимид (31) восстанавливали до соответствующего спирта (32). В масс-спектре соединения (32) присутствует пик молекулярного иопа с m/z 666.4. В электронном спектре хлорина (32) по сравнению с исходным формилвипилпроизводным (31) наблюдается гипсохромный сдвиг основной полосы поглощения на 18 нм.

Таким образом, на основании данных по формилированию Си(И)-пурпурина 18 (23), Cu(II)- и №(П)-Л'-ацетоксициклоимидов (24) и (25) в условиях реакции Вильсмейера можно предположить, что образующаяся формилвинильная группа в этих системах снижает реакционную способность 20-л<езо-положсния В пользу этого

свидетельствует также тот факт, что при повторной обработке 3-(2-формилвинил)циклоимидов (26) и (27) комплексом Вильсмейера образования 20-л<езо-замещенных продуктов не наблюдалось.

5. Окисление двойной связи в пиррольном кольце В

Дальнейшее смещение основной полосы поглощения циклоимидных производных хлорина j0( в длинноволновую область может быть достигнуто за счет окисления пиррольного кольца В (схема 5). Обработка 3-формилциклоимида (226) тетраоксидом осмия в присутствии пиридина и последующее разрушение осматного комплекса сероводородом приводят к 7,8-дигидроксибактериопроизводному (336). В масс-спектре соединения (336) присутствует пик молекулярного иона с m/z 643.3. В электронном спектре полученного циклоимида наблюдается интенсивный максимум поглощения при 825 нм. В спектре 'Н ЯМР в слабом поле при 11.32 м.д. присутствует синглет в один протон, отнесенный к формальной группе и удвоенные сигналы трех .мезо-протонов при 9.54 и 9.53 м.д., 9.02 и 9.01 м.д., 8.55 и 8.54 м.д. Анало1ичное удвоение наблюдается для смещенных в более сильное поле сигналов протонов 7-СНз и 8-СНгСНз. Протоны 7-СНз, 8'-CHj и 82-СНэ проявляются в виде двух синглетов

20а ЯЧСНгЬОН, 336 Р1=ОМе

226 К1=ОМе, |- 34а ^»(СНгЬОН

'"I » 346 Р1=(СНг)зОН

(^=Н(а), Ме(б)

Схема 5. Окисление двойной связи пиррольного кольца В циклоимидов хлорина р(, Реагенты: I - 0з04, С5Н5К, СН2С12; II - Н^; III - СН2К2.

при 2.46 и 2.40 м.д., мультиплета при 1.01 м.д и двух триплетов при 0.86 и 0.82 м.д., соответственно. Сигналы Ы-Н групп представлены в виде четырех синглетов при 0.01, -0.05 и -0.10, -0.15 м.д. Все выше перечисленное указывает на то, что

дигидроксициклоимид (336) существует в виде двух изомеров, что обусловлено расположением введенных гидроксильных групп над и под плоскостью макроцикла. Аналогичным образом из циклоимида (20а) был синтезирован 7,8-дигидроксибактериоциклоимид (34а) с 3-гидроксипропильным заместителем при атоме азота имидного кольца, поглощаюший в области 821 нм В масс-спектре соединения (34а) присутствует пик с m/z 679.0, соответствующий (A/*+Na). Структура полученного 7,8-дигидроксибактериоциклоимида подтверждена также данными спектра *Н ЯМР для его метилового эфира (346), синтезировапного обработкой соединения (34а) диазометаном. Масс-спектр циклоимида (346) содержит пик молекулярного иона с m/z 670.4.

2.6. Анализ данных по биологической активности АЦю-гидроксиалкил)- и А'-гидроксициклоимидов хлорина р6 и их производных

Фотобиологические свойства А/-(ш-гидроксиалкил)- и JV-гидроксициклоимидов хлорина ре, а также их производных, в отличие от М-алкилциклоимидов, к началу настоящей работы были изучены недостаточно. Разработанными методами циклоимида (2), (3), (6а,б), (9) и (10а) были синтезированы в необходимых количествах, обеспечивающих более глубокое исследование их селективного накопления в раковых клетках, генерирования синглетного кислорода при облучении светом и фотодинамической активности в условиях in vitro и in vivo2

13,15-#-(2-Гидроксиэтил)циклоимид хлорина Рб (2),

13,1 5-jV-(3-гидроксипропил)циклоимид хлорина рс (3), метиловый эфир 13,15-N-гидроксициклоимида хлорина рц (66), метиловые эфиры 13,15-№метоксициклоимида хлорина ре (9) и П.^-ЛГ-ацетоксициклоимида хлорина Рб (10а) обладают низкой темновой токсичностью. Эти соединения характеризуются достаточно высоким квантовым выходом синглетного кислорода (0.35-0.73), при этом максимальное значение 0.73 наблюдалось для №метоксициклоимида хлорина ре (9), а минимальное 0.35 зарегистрировано для Д'-шдроксициклоимида (66). Фотостабильность циклоимидов снижается в ряду (66)>(3)>(2),(9),(10a). Интересно отметить, что наибольшую фототоксичность на клетках аденокарциномы легкого человека А 549 проявил метиловый эфир У-гидроксициклоимида хлорина р( (66). Для изученных циклоимидов она убывала в ряду (66)>(9)>(3)>(2)>(10a). Активность хлорина (66) в

2 Биологические исследования проводились в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им П А Герцена в отделении модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии в группе профессора Р И Якубовской и в Институте биоорганической химии им M M Шемякина и Ю А Овчинникова РАН в труппе старшего научного сотрудника А В Феофанова

8 раз выше, чем у соединения (10а), а фотодинамическая активность циклоимида (10а) в 100 и 280 раз выше, чем для хлорина ре и препарата Фотогем, соответственно. При этом не наблюдалось прямой взаимосвязи между фотодинамической активностью этих шшгоимидных производных и их концентрацией в раковой клетке, которая достигала наибольших значений у соединений (9) и (10а).

Ранее полученные данные по фотодинамической активности jV-алкил циклоимидов хлорина ре также свидетельствовали о том, что высокая концентрация сенсибилизатора в опухоли не является главным критерием его эффективности. Было высказано предположение, что для того, чтобы фотосенсибилизатор был эффективен, он должен локализоваться в наиболее чувствительных к фотодинамическому воздействию участках раковой клетки Изучение внутриклеточного распределения циклоимидов (2), (3), (66), (9) и (10а) на клетках А549 показало, что соединения с полярными группами (цикдоимиды (2), (3) и (66), содержащие гидроксильную или со-гидроксиалкильные группы при атоме азота имидного кольца, а также iV-ацетоксициклоимид (10а) со свободным остатком пропионовой кислоты) накапливаются в митохондриях и аппарате Гольджи, тогда как гидрофобный метиловый эфир iV-метоксициклоимида (9) локализуется в лизосомах. Согласно литературным данным, воздействие сенсибилизатора на вышеперечисленные участки может инициировать процесс апоптоза клетки. Возможно, характер внутриклеточной локализации ЛГ-гидроксициклоимида (66) является одной из причин того, что, имея самые низкие квантовый выход синглетного кислорода и концентрацию накопления в раковой клетке, это соединение проявляет высокую фотодинамическую активность.

Предварительные данные по фотодинамической активности №(3-гидроксипропил)циклоимида хлорина Рб (3) in vivo получены на мышах с лимфолейкозом Р388. Циюгоимид (3) вызывает практически 100% торможение роста опухоли с 7 по 14 день наблюдения при дозе 2.5 мг/кг. При этом наблюдался высокий процент животных без опухоли с полным восстановлением кожного покрова.

Таким образом, полученные данные по накоплению в раковых клетках и фотодинамической активности Д^-гидроксиалкил- (2), (3) и Л^-гидрокси- (66) циклоимидов хлорина рб, а также их производных (9) и (10а), подтверждают ранее высказанное предположение о существовании корреляции между характером внутриклеточной локализации фотосенсибилизатора и его фотодинамической активностью.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод регио- и стереонаправленного введения гидроксильной группы в пиррольное кольцо Б в ряду Л^-гидрокси- и М-(га-гидроксиалкил)циклоимидов хлорина ре. Синтезированы ранее неописанные 18-гидрокси- 13,15-.л/-гидрокси-, 13,15-ЛГ-ацетокси- и 13,15-ЛЦЗ-гидроксипроиил)циклоимиды хлорина р/,, а также диэтаноламид 18-гидрокси-13,15-Аг-(3-гидроксипропил)циклоимида хлорина р6.

2. Впервые предложен способ синтеза Л'-гликозилоксицюслоимидов хлорина рв-Взаимодействием метилового эфира пурпурина 18 с 0-^-1>галактопиранозилгидроксиламином получен ранее неизвестный АЧО-/?-0-галактозил)оксициклоимид хлорина ре.

3. Показано, что в ряду природных хлоринов с дополнительным сопряженным шестичленным экзоциклом происходит селективное замещение атома водорода винильной группы в положении З2 на формильную под действием реагента Вильсмейера. Синтезированы ранее неизвестные 3-(2-формилвинил)-3-девинил-13,15-#-гидрокси- и 13,13-Л'-ацетоксициклоимиды хлорина/^.

4. Окислением двойной связи в пиррольном кольце В циклоимидов хлорина рб получены 7,8-дигидроксибактериохлорины с максимумом поглощения в области 820 нм.

5. Предварительные данные биологических исследований 13,15-//-(2-гидроксиэтил)-, Л'-(З-гидроксипропил)-, ¿У-гидрокси-, Л^-метокси- и Л^-ацетоксициклоимидов хлорина р( подтверждают существование связи между характером внутриклеточной локализации этих соединений и фотодинамической активностью. Наличие гидроксильных групп в структуре циклоимидных производных хлорина Рб способствует накоплению циклоимидов в аппарате Гольджи и митохондриях, фотодинамическое воздействие на которые, по-видимому, инициирует процесс апоптоза, существенно повышая эффективность сенсибилизаторов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. А Ф. Миронов, Р.Д. Рузиев, B.C. Лебедева. Синтез и химические превращения ЛГ-гидрокси- и Л^-гидроксиалкилциклоимидов хлорина р(Л Биоорган, химия, 2004, т. 30, № 5, с.520-530.

2. A. Feofanov, G. Sharonov, A. Gtichine, Т. Kannakova, A. Pljutinskaya, V. Lebedeva, R. Ruziyev, R. Yakubovskaya, A. Mironov, M. Refregier, J-C. Maurizot and P. Vigny. Comparative study of photodynamic properties of 13,15 -Л'-cycloimide derivatives of chlorinp6.H Photochemistry and Photobiology, 2004, v.79, № 2, p.172-188.

3 A.B. Феофанов, А.И. Назарова, Т.А. Кармакова, А.Д. Плютинская, А.И. Гришин, Р.И. Якубовская, B.C. Лебедева, Р.Д. Рузиев, А.Ф. Миронов, Ж-К. Моризо, П. Вини. Фотобиологические свойства 13,1 б-Л^карбоксиметил)- и (2-карбоксиэтил)- циклоимидных производных хлорина р6.Н Биоорган, химия, 2004, т. 30, № 4, с. 417-428.

4. A. Feofanov, A. Grichine, Т. Karmakova, A. Pljutinskaya, V. Lebedeva, R. Ruziyev, R. Yakubovskaya, A. Mironov, M. Refregier, J-C. Maurizot and P. Vigny. Photobiological effects of cycloimide derivatives of chlorin рб, new promising near IR photosensitizers.// XX International conference on photochemistry. - Moscow, 2001, p.262-263.

5. Р.Д. Рузиев, B.C. Лебедева, А.Ф. Миронов. Новые 3-(2-формилвинил)замещепные jV-гидрокси- и #-(3-гидроксипропил)циклоимиды хлорина рб.Н Тезисы докладов III Съезда биохимического общества. - Санкт-Петербург, 2002, с.209.

6. Р.Д. Рузиев, B.C. Лебедева, А.Ф. Миронов. Формилирование природных хлоринов с винильной группой в условиях реакции Вильсмейера.// Тезисы докладов V Школы-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений. - Звенигород, 2002, с.74.

7. Т.А. Кармакова, Г.В. Шаронов, А,И. Гришин, А.Д. Плютинская, А.И. Филясова, А.В. Феофанов, Н.И. Казачкина, Р.И. Якубовская, B.C. Лебедева, Р.Д. Рузиев, А.Ф. Миронов, П. Вини. Структурно-функциональные взаимосвязи фотосенсибилизаторов на примере циклоимидных производных хлорина р6Л Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Отечественные противоопухолевые препараты". -Москва, 2003, с.25.

A. Feofanov, G. Sharonov, A. Grichine, T. Karmakova, A. Pljutinskaya, V. Lebedeva, R. Ruziyev, R. Yakubovskaya, A. Mironov, M. Refregier, J-C. Maurizot and P. Vigny. Cycloimide derivatives of chlorin Рб - novel near-IR photosensitize«.// The 10ш Congress of the European society for photobiology. - Vienna, 2003, p.92. Р.Д. Рузиев, В С. Лебедева, А.Ф. Миронов. 18-Гидроксициклоимиды хлорина Рб-И Тезисы докладов IX Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов. - Суздаль, 2003, с.67.

A.B. Феофанов, Г.В. Шаронов, А.И. Назарова, Т.А. Кармакова, А.И. Гришин, А.Д. Плютинская, Р.И. Якубовская, В С. Лебедева, Р.Д Рузиев, А.Ф. Миронов, Ж-К. Моризо, П. Вини. Оптимизация структуры циклоимидных производных хлорина ре для фотодинамической терапии рака.// Суздаль, 2003, с.339-341. Р.Д. Рузиев, B.C. Лебедева, А.Ф. Миронов. Метод стереонаправленного гидроксилирования в ряду циклоимидных производных хлорина р^Л Тезисы докладов X Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии -2004".- Волгоград, 2004, с.320-321.

Принято к исполнению 12/08/2005 Исполнено 16/08/2005

Заказ № 980 Тираж: 75 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

»14753

«

РНБ Русский фонд ^

2006-4 11853

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. ЦИКЛОИМИДЫ ХЛОРИНА Р6. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ХИМИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ

1.1. Методы получения циклоимидов хлорина рв

1.2. Химические превращения функциональных групп в циклоимидах хлорина/^

1.2.1. Реакции по остатку пропионовой кислоты

1.2.2. Реакции с участием винильной группы

1.2.3. Модификация заместителей при атоме азота циклоимида

1.2.4. Реакции по 20-л<езо-положению и модификация пиррольного кольца А

1.2.5. Превращения в пиррольном кольце D

1.2.6. Модификация пиррольного кольца В

Успешное применение фотодинамической терапии (ФДТ) в клинике при лечении онкологических заболеваний стимулировало поиск новых высокоэффективных сенсибилизаторов, фотофизические характеристики которых, тропность к злокачественным новообразованиям, низкая фототоксичность и хорошее выведение из организма превосходили бы известные препараты первого поколения.

Одним из перспективных направлений при разработке подобных фотосенсибилизаторов является химическая модификация природных хлоринов, позволяющая оптимизировать гидрофильно-гидрофобный баланс заместителей в макроцикле, влияющий на накопление хлоринов в опухолевых клетках, а также улучшить их фотофизические свойства и растворимость в физиологических средах.

В ряду природных хлоринов особый интерес представляет пурпурин 18. Его отличительной чертой является наличие дополнительного ангидридного цикла и смещение основной полосы поглощения до 698 нм. Хорошие спектральные характеристики, доступность и высокая реакционная способность послужили основными критериями при выборе пурпурина 18 в качестве исходного соединения для разработки новых фотосенсибилизаторов второго поколения. Превращение ангидридного кольца пурпурина 18 в имидный цикл помимо смещения максимума поглощения в длинноволновую область, существенно повышает устойчивость данных соединений. Наиболее изученными представителями этого класса хлоринов являются гидрофобные iV-алкилциклоимидные производные пурпурина 18, впервые полученные в группе К. Смита (США).

В связи с особым вниманием, проявляемым в последние годы к амфифильным сенсибилизаторам, представляло интерес расширить круг циклоимидов за счет гидроксилсодержащих производных и более глубоко изучить их химические и биологические свойства, включая накопление в раковых клетках и фотодинамическую активность in vitro и in vivo. К началу настоящей работы группа известных амфифильных циклоимидов был немногочисленна и их фотобиологические свойства мало изучены.

Целью настоящей работы явился синтез и изучение химических превращений А^-гидрокси- и Аг-(со-гидроксиалкил)циклоимидных производных хлорина рб- Основные направления исследования включали региоспецифическое введение гидроксильной группы в пиррольное кольцо D, модификацию винильной группы в пиррольном кольце А и окисление кольца В. В задачу исследования входило получение циклических имидов хлоринар^с интенсивным поглощением в красной области спектра, содержащих гидрофильные и гидрофобные группы в противоположных участках макроцикла, для выяснения влияния этих заместителей на накопление в раковых клетках и ФДТ активность.

Данная работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС в рамках темы № 1Б-4-865 "Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины" и гранта Президента РФ по поддержке Ведущих научных школ России НШ-2013.2003.3.

Экспериментальным исследованиям предшествует систематический анализ литературных данных по химии, спектроскопии и биологической активности циклоимидных производных хлорина ре. На основе анализа определены целесообразные пути поиска и произведен выбор структур потенциальных фотосенсибилизаторов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод регио- и стереонаправленного введения гидроксильной группы в пиррольное кольцо D в ряду JV-гидрокси- и ЛЦсо-гидроксиалкил)циклоимидов хлорина рв. Синтезированы ранее не описанные 18-гидрокси- 13,15-ТУ-гидрокси-, 13,15-JV-ацетокси- и 13,\5-N-(3 -гидроксипроп ил)циклоимиды хлорина рб, а также диэтаноламид 18-гидрокси-13,15-7^-(3-гидроксипропил)циклоимида хлорина рб.

2. Впервые предложен способ синтеза jV-гликозилоксициклоимидов хлорина рв. Взаимодействием метилового эфира пурпурина 18 с O/f-D-галактопиранозилгидроксиламином получен ранее неизвестный N-iO-p-D-галактозил)оксициклоимид хлорина рб.

3. Показано, что в ряду природных хлоринов с дополнительным сопряженным шестичленным экзоциклом происходит селективное замещение атома водорода винильной группы в положении 3 на формильную под действием реагента Вильсмейера. Синтезированы ранее неизвестные 3-(2-формилвинил)-3-девинил- 13,15-А^-гидрокси- и 13,1 б-А^-ацетоксициклоимиды хлорина рб.

4. Окислением двойной связи в пиррольном кольце В циклоимидов хлорина рб получены 7,8-дигидроксибактериохлорины с максимумом поглощения в области 820 нм.

5. Предварительные данные биологических исследований 13,15-Лг-(2-гидроксиэтил)-, N-(3 -гидроксипропил)-, jV-гидрокси-, JV-метокси- и iV-ацетоксициклоимидов хлорина рв подтверждают существование связи между характером внутриклеточной локализации этих соединений и фотодинамической активностью. Наличие гидроксильных групп в структуре циклоимидных производных хлорина рб способствует накоплению циклоимидов в аппарате Гольджи и митохондриях, фотодинамическое воздействие на которые, по-видимому, инициирует процесс апоптоза, существенно повышая эффективность сенсибилизаторов.

1. А.Ф.Миронов, Фотодинамическая терапия рака./ Успехи химии порфиринов.// Под ред. О.А.Голубчикова. Санкт-Петербург: НИИ Химии СпбГУ, 1997, с.357-374.

2. А.Ф.Миронов, Фотосенсибилизаторы на основе порфиринов и родственных соединений для фотодинамической терапии рака.// ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер. Современные проблемы лазерной физики, 1990, т.З, с.5-62.

3. А.Ф.Миронов, Разработка сенсибилизаторов второго поколения на основе природных хлорофиллов.// Российский химический журнал, 1998, №5, с.23-36.

4. P.H.Hynninen, Chemistry of chlorophylls: modifications.// In the chlorophylls./ Ed. H.Scheer, CRC Press: Boca Raton., FL, 1991, pp. 146-209.

5. R.Bonnett, Photosensitisers of the porphyrin and phthalocyanine series for photodynamic therapy.// Chem. Soc. Rev., 1995, v.24, pp. 19-33.

6. R.Bonnett, Chemical aspects of photodynamic therapy. // Gordon and Breach Science Publishers, 2000.

7. G.Garbo, Purpurins and benzochlorins as sensitizers for photodynamic therapy.// J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1996, v.34, p.109-116.

8. R. W.Boyle, D.Dolphin, Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers.// Photochem. Photobiol., 1996, v.63, pp.469-485.

9. J.D.Spikes, New trends in photobiology and medicine. // J. Photochem. Photobiol., B: Biol., 1990, v.6, pp.259-274.

10. C.J.Gommer, Preclinical examination of first and second generation photosensitizers used in photodynamic therapy.// Photochem. Photobiol., 1993, v.54, pp.1093-1107.

11. D.Kessel, K.Woodburn, Biodistribution of photosensitizing agents. // Int. J. Biochem., 1993, v.25, pp.1377-1383.

12. T.J.Dougherty, Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumors.// Photochem. Photobiol., 1987, v.45, pp.879-889.

13. J.Moan, Porphyrin photosensitization and phototherapy.// Photochem. Photobiol., 1986, v.43, pp.681-690.

14. A.F.Mironov, Second generation photosensitizers based on natural chlorins and bacteriochlorins.// Proc. SPIE., 1996, v.2728, pp.150-164.

15. W.M.Sharman, C.M.Allen, J.E.vanLier, Photodynamic therapeutics: basic principles and clinical applications.// Drug Discov. Today, 1999, v.4, pp.507-517.

16. R.K.Pandey, Recent advances in photodynamic therapy.// J. Porphyrins Phthalocyanines, 2000, v.4, pp.368-373.

17. R.K.Pandey, G.Zheng, Porphyrins as photosensitizers in photodynamic therapy.// The porphyrin handbook. Applications: Past, Present and Future. Eds. K.M.Kadich, K.M.Smith, R.Guilard., Academic press, San Diego, 2000, v.6, pp. 157-230.

18. J.Osterloh, M.G.H.Vicente, Mechanisms of porphyrinoid localization.// J. Porphyrins Phthalocyanines, 2002, v.6, pp.305-324.

19. R.Hudsen, R.W.Boyle, Strategies for selective delivery of photodynamic sensitizers to biological targets.// J. Porphyrins Phthalocyanines, 2004, v.8, pp.954-975.

20. S.-J.Lee, N. Jagerovic, K.M.Smith, Use of the chlorophyll derivative, purpurin 18, for syntheses of sensitizers for use in photodynamic therapy.// J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1993, pp.2369-2377.

21. G.Zheng, W.R.Potter, K.M.Smith, TJ.Dougherty, R.K.Pandey, Photosensitizers related to purpurin- 18-iV-alkylimides: a comparative in vivo tumoricical ability of ester versus amide functionalities.// Bioorg. J. Med.Chem.Lett., 2000, v. 10, pp.123-127.

22. R.K.Pandey, T.J.Dougherty, K.M.Smith, F.Y.Shaiu, Purpurin 18 anhydrides and imides as photosensitizers.// Pat. WO 95/32206, 1995.

23. A.N.Kozyrev, G.Zheng, C.Zhu, T.J.Dougherty, K.M.Smith, R.K.Pandey, Syntheses of stable bacteriochlorophyll a derivatives as potential photosensitizers for photodynamic therapy.// Tetrahedron Lett., 1996, v.37, pp.6431-6434.

24. R.K.Pandey, A.N.Kozyrev, TJ.Dougherty, Synthesis of carbodiimide analogs of chlorins and bacteriochlorins and treatment of cancer.// Pat. US 5591847,1997.

25. A.N.Kozyrev, G.Zheng, E.Lazarov, T.J.Dougherty, K.M.Smith, R.K.Pandey, Syntheses of emeraldin and purpurin 18 analogs as target-specific photosensitizers for photodynamic therapy.// Tetrahedron Lett., 1997, v.38, pp.3335-3338.

26. A.F.Mironov, V.S.Lebedeva, R.I.Yakubovskaya, N.T.Kazachkina, G.I.Fomina, Chlorines with six-membered imide ring as prospective sensitizers for cancer PDT.// Proc. SPIE, 1999, v.3563, pp.59-67.

27. A.F.Mironov, V.S.Lebedeva, Cyclic JV-hydroxyimides in a series of chlorin and porphyrin.// Tetrahedron Lett., 1998, v.39, pp.905-908.

28. A.F.Mironov, M.A.Grin, S.A.Nochovny, P.V.Toukach, Novel cycloimides in the chlorophyll a series.// Mendeleev Commun., 2003, pp. 156-158.

29. R.K.Pandey, A.B.Sumlin, F.-Y.Shiau, T.J.Dougherty, K.M.Smith, Structure/activity relationships among photosensitizers related to pheophorbides and bacteriopheophorbides.// Bioorg. Med. Chem. Lett., 1992, v.2, pp.491-494.

30. D.A.Bellnier, B.W.Henderson, R.K.Pandey, W.R.Potter, T.J.Dougherty, Murine pharmacokinetics and antitumor efficacy of the photodynamic sensitizer HPPH.// Photochem. Photobiol. B. Biol., 1993, v.20, pp.55-61.

31. R.K.Pandey, W.R.Potter, T.J.Dougherty, Carotene analog of porphyrins, chlorines and bacteriochlorins as therapeutic and diagnostic agents.// Pat. WO 99/67248,1999.

32. R.K.Pandey, W.R.Potter, T.J.Dougherty, Alkyl ether analogs of chlorins having an TV-substituted imide ring.// Pat. WO 99/67249, 1999.

33. A.Rungta, G.Zheng, J.RMissert, W.R.Potter, W.R.Potter, R.K.Pandey, Purpurinimides as photosensitizers: effect of the presence and position of the substituents in the in vivo photodynamic efficacy.// Bioorg. J. Med. Chem. Lett.,2000, v.10, pp.1463-1466.

34. R.K.Pandey, T.J.Dougherty, K.M.Smith, F.-Y.Shiau, Long wavelength absorbing photosensitizers related to purpurin-18, bacteriopurpurin-18 and related compounds with imide linkages.// Pat. US 5591847, 1997.

35. В.С.Лебедева, Синтез сенсибилизаторов второго поколения с функциональными группами для получения конъюгатов направленного действия к злокачественным опухолям.// Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук.-Москва, 1999.

36. М.А.Грин, А.Г.Ципровский, Р.А.Титеев, И.СЛонин, А.Ф.Миронов, Катионные фотосенсибилизаторы в ряду ди- и тетрагидропорфиринов.// X Международная научно-техническая конференция "Наукоемкие химические технологии 2004", 2004, с.240-242.

37. A.F.Mironov, M.A.Grin, A.G.Tsiprovskiy, V.V.Kachala, T.A.Karmakova, A.D.P1 yutinskay, R.I.Yakubovskaya, New bacteriochlorin derivatives with a fused N-aminoimide ring.//J. Porphyrins Phthalocyanines, 2004, v.7, pp.725-730.

38. S. Fukuzumi, New perspective of electron transfer chemistry.// Org. Biomol. Chem., 2003, v.l, pp.609-620.

39. S.Mettath, G.Li, T.Srilkrishnan, R.Mehta, Z.D.Grossman, T.J.Dougherty, R.K.Pandey, Effect of substituting in reactions of the formation of benzochlorins and isobacteriochlorins in porphyrin and chlorin systems.// Org. Lett., 1999, v.l, pp.1961-1964.

40. А.В.Нечаев, Химическая модификация природных хлоринов по пиррольному кольцу D.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук, Москва, 2002.

41. А.Ф.Миронов, А.В.Нечаев, Направленная модификация природных хлоринов по пиррольному кольцу D.// Биоорганическая химия, 2001, т.27, с.141-144.

42. A.F.Mironov, A.V.Efremov, O.A.Efremova, R.Bonnett, G.Martinez, Chlorins with an exocyclic 5-lactone ring and their derivatives.// J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1998, pp.3601-3608.

43. R.K.Pandey, M.Isaac, I.MacDonald, C.J.Medforth, M.O.Senge et al, Pinacol-pinacolone rearrangements in vic-dihydroxychlorins and bacteriochlorins: Effect of substituents at the peripheral positions.// J. Org. Chem., 1997, v.62, pp. 14631472.

44. A.N.Kozyrev, G.Zheng, M.Shibata, J.L.Alderfer, T.J.Dougherty et al, Thermolysis of v/c-dihydroxybacteriochlorins: a new approach for the synthesis of chlorin-chlorin and chlorin-porphyrin di'mers.// Org. Lett., 1999, v.l, pp.11931196.

45. P.Margaron, M.Gregoire, V.Scasnar, Structure-photodynamic activity relationships for series of 4-substituted phthalocyanines.// Photochem. Photobiol., 1996, v.63, p.217-223.

46. G.J.Smith, The effects of agregation on the fluorescence and triplet state yield of hematoporphyrin.//Photochem. Photobiol., 1985, v.41, pp.123-126.

47. Y.Nishiwaki, S.Nakamura, S.Sakaguchi, New method of photosensitizer accumulation for photodynamic therapy in an experimental liver tumor.// Lasers Surg. Med., 1989, v.9, pp.254-263.

48. K.Iwai, T.Ido, R.Iwata, M.Kawamura, S.Kimura, Localising efficiency of 48V. vanadyl-pheophorbide in tumor as a new tumor imaging agent.// Nuclear Med. Biol., 1989, v. 16, pp.783-789.

49. M.Aprahamian, S.Evrard, P.Keller, M.Tsuji, G.Balboni, C.Damge, J.Marescaux, Distribution of pheophorbide a in normal tissues and in experimental pancreatic cancer in rats.// Anti-Cancer Drug Design, 1993, v.8, pp.101-114.

50. J.J.Schuitmaker, R.I.J.Feitsma, J.G.Journee-DeKorver, T.M.A.R.Dubbelman, E.KJ.Pauwels, Tissue distribution of bacteriochlorin a labelled with 99mTc-pertechnititate in hamster Greene melanoma.// Int. J. Radiat. Biol., 1993, v.64, pp.451-458.

51. K.Woodburn, C.K.Chang, S.Lee, B.Hendersen, D.Kessel, Biodistribution and PDT efficacy of a ketochlorin photosensitizer as a function of the delivery vehicle.//Photochem. Photobiol., 1994., v.60, pp. 154-159.

52. H.B.Ris, H.J.Altermatt, B.Nachbur, J.C.M.Stewart, Q.Wang, C.K.Lim, R.Bonnett, U.Althals, Effect of drug-light interval on photodynamic therapy with meta-tetrahydroxyphenylchlorin in malignant mesothelioma.// Int. J. Cancer, 1993, v.53, pp.141-146.

53. L.Morlet, V.Vonarx-Coinsmann, P.Lenz, M.-T.Foultier, L.Xavier de Brito, C.Stewart, T.Patrice, Correlation between meta(tetrahydroxyphenyl)chlorin (m

54. THPC) biodistribution and photodynamic effects in mice.// J. Photochem. Photobiol., B. Biol., 1995, v.28, pp.25-32.

55. R.Whelpton, A.T.Michael-Titus, S.S.Basra, M.Grahn, Distribution of temoporfin, a new photosensitizer for the photodynamic therapy of cancer in a murine tumor model.// Photochem. Photobiol., 1995, v.61, pp.397-401.

56. A.Richter, A.KJain, A.J.Canaan, E.Waterfield, E.D.Sternberg, J.C.Levy, Photosensitizing efficiency of two regioisomers of the benzoporphyrin derivative monoacid ring A (BPD-MA).// Biochem. Pharmacol., 1992, v.43, pp.2349-2358.

57. A.S.Brandis, A.N.Kozyrev, A.F.Mironov, Synthesis and study of chlorin and porphyrin dimers with ether linkage.// Tetrahedron., 1992, v.48, pp.6485-6494.

58. Porphyrins and metalloporphyrins./ Ed. K.M.Smith. Amsterdam-Oxford-New York:Elsevier., 1975, p.835 (a), p.798 (6).

59. G.W.Kenner, S.W.McCombie, K.M.Smith, Pyrroles and related compounds. Part XXIV. Separation and oxidative degradation of chlorophyll derivatives.// J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1,1973, pp.2517-2523.

60. А.Ф. Миронов, Р.Д. Рузиев, B.C. Лебедева. Синтез и химические превращения iV-гидрокси- и ТУ-гидроксиалкилциклоимидов хлорина рв.Н Биоорган, химия, 2004, т. 30, с.520-530.

61. Р.Д. Рузиев, B.C. Лебедева, А.Ф. Миронов. 18-Гидроксициклоимиды хлорина рб.// Тезисы докладов IX Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов, Суздаль, 2003, с.67.

62. A.N.Kozyrev, A.V.Efimov, O.A.Efremova, P.Yn.Perepyolkin, New chlorin and bacteriochlorin-type photosensitizers for photodynamic therapy.// Proc. SPIE., 1994, v.2325, pp.297-304.

63. A.F.Mironov, Synthesis and properties of new chlorin and bacteriochlorin photosensitizers.//Proc. SPIE., 1996, v.2625, pp.23-32.

64. K.M.Smith, S.-J.Lee, F.-Y.Shiau, R.K.Pandey, N.Jagerovic, Synthesis of chlorin and bacteriochlorin-type photosensitizers for photodynamic therapy.// Photodynamic Therapy Biomed. Lasers, 1992, pp.769-773.

65. K.M.Smith, M.F.B.Graham, M.J.Bushell, Partial syntheses of optically pure methyl bacteriopheophorbides с and d from methyl pheophorbide a.// J. Org. Chem., 1980, v.45, pp.2218-2224.

66. K.M.Smith, D.A.Goff, D.J.Simpson, Meso Substitution of chlorophyll derivatives: direct route for transformation of bacteriopheophorbides d into bacteriopheophorbides cJt J. Am. Chem. Soc., 1985, v. 107, pp.4946-4954.

67. S.Mettath, M.Shibata, J.L.Alderfer, M.O.Senge, K.M.Smith, R.Rein, T.J.Dougherty, R.K.Pandey, Synthesis and spectroscopic properties of novel benzochlorins derived from chlorophyll a.// J. Org. Chem., 1998, v.63, pp. 16461656.

68. V.Wray, U.Jurgens, H.Brockmann, Electrophilic reactions of chlorin derivatives and a comprehensive collection of 13C data of these products and closely related compounds.// Tetrahedron., 1979, v.35, pp.2275-2283.

69. Р.Д. Рузиев, B.C. Лебедева, А.Ф. Миронов. Новые 3-(2-формилвинил)замещенные iV-гидрокси- и ЛЦЗ-гидроксипропил)циклоимиды хлорина рб-Н Тезисы докладов III Съезда биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, с.209.

70. M.Geze, P.Morliere, J.C.Maziere, K.M.Smith, R.Santus, Lysosomes, a key target of hydrophobic photosensitizers proposed for photochemotherapeutic applications.// J. Photochem. Photobiol., Section B: Biology, 1993, v.20, p.23.

71. M.D.Mason, Cellular aspects of photodynamic therapy of cancer.// Rev. Contempt. Pharmacother., 1999, v. 10, pp.25-37.

72. D.Kessel, Y.Luo, Mitochondrial photodamage and PDT induced apoptosis.// Cell Differ., v.6, pp.28-35.

73. A.Graham, G.Li, Y.Chen, J.Morgan, A.Oseroff, T.J.Dougherty, R.K.Pandey, Structure-activity relationship of new octaethylporphyrin-based benzochlorins as photosensitizers for photodynamic therapy.// Photochem. Photobiol., 2003, v.77, pp.561-566.

74. D.Kessel, R.Luguyab, M.G.H.Vicente, Localization and photodynamic efficacy of two cationic porphyrins varying in charge distribution.// Photochem. Photobiol., 2003, v.78, pp.431-435.

75. M.H.Teiten, L.Bezdetnaya, P.Morliere, R.Santus, F.Guillemin, Endoplasmic reticulum and Golgi apparatus are the preferential sites of Foscan localization in cultured tumour cells.// Br. J. Cancer., 2003, v.88, pp.146-152.

76. J.-F.Tremblay, S.Dussault, G.Viau, F.Gad, M.Boushira, R.Bissonnette, Photodynamic therapy with toluidine blue in Jurkat cells: cytotoxicity, subcellularlocalization and apoptosis induction.// Photochem. Photobiol. Sci., 2002, v.l, pp.852-856.

77. D.Kessel, Correlation between subcellular localization and photodynamic efficacy.// J. Porphyrins Phthalocyanines, 2004, pp.1009-1014.