Синтез модифицированных природных хлорофиллов и изучение их свойств для бинарных методов терапии в онкологии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ГРИН МИХАИЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ

СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПРИРОДНЫХ ХЛОРОФИЛЛОВ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ ДЛЯ БИНАРНЫХ МЕТОДОВ ТЕРАПИИ В ОНКОЛОГИИ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

1 1 НОЯ 2010

Москва-2010

004612155

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Миронов Андрей Федорович

Официальные оппоненты: член-корр. РАН, доктор химических наук,

профессор Койфман Оскар Иосифович

доктор химических наук, профессор Пономарев Гелий Васильевич

доктор химических наук, профессор Томилова Лариса Годвиговна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт химии растворов РАН

Защита диссертации состоится «22» ноября 2010 г. в 15.00 час на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (МИТХТ) по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ: http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан «19» октября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук, /

старший научный сотрудник /у"

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема борьбы со злокачественными новообразованиями остается одной из приоритетных для современного общества. Согласно официальным данным ежегодно в России каждый час злокачественные опухоли поражают 57 человек. В связи с этим разработка новых подходов к лечению онкологических заболеваний чрезвычайно актуальна.

Основными методами лечения в онкологии являются хирургическое вмешательство, лучевая терапия и химиотерапия. Однако в последнее десятилетие все большее распространение получают новые методы, среди которых следует отметить фотодинамическую терапию (ФДТ) и борнейтронозахватную терапию (БНЗТ) рака, которые являются примерами бинарной терапии, когда два раздельно введенных нетоксичных агента (фотосенсибилизатор или соединение бора, с одной стороны, и лазерное излучение или поток тепловых нейтронов, с другой стороны) при встрече в клетке-мишени генерируют цитотоксические вещества, приводящие к разрушению жизненно важных структур раковых клеток и их гибели.

В настоящее время применяются в клинике или находятся на разных стадиях клинических испытаний фотосенсибилизаторы (ФС) различных классов (порфирины и их металлокомплексы, хлорины, бензопорфирины, фталоцианины и др.). Среди них особый интерес представляют природные хлорофиллы и их производные с интенсивным поглощением в красной и ближней ИК-области спектра, поскольку их терапевтическое окно поглощения (660 - 800 нм) открывает новые возможности для диагностики и лечения злокачественных новообразований. Свет с подобной длиной волны проникает в ткань на глубину до 20 мм, что позволяет проводить лечение глубокозалегающих и пигментированных опухолей.

Выбор природных пигментов для создания новых ФС обусловлен рядом причин, включая их распространенность в природе, интенсивное поглощение в длинноволновой области спектра, возможность химической модификации боковых заместителей, структурную близость к эндогенным порфиринам, что предполагает низкий уровень токсичности подобных соединений и быстрое выведение из организма.

Однако сами хлорины и бакгериохлорины имеют ограниченное применение в качестве ФС из-за высокой гидрофобности, низкой химической и фотостабильности, умеренной селективности накопления в раковых клетках. Это диктует необходимость создания устойчивых производных хлоринов и бакгериохлоринов с улучшенными спектральными характеристиками, повышенной гидрофильностью для растворимости в полярных растворителях и воде, обладающих значительной тропностью к опухолям.

Представленная работа посвящена решению этих задач и является дальнейшим развитием основополагающих научных исследований, проведенных ранее в МИТХТ им. М.В. Ломоносова на кафедре химии и технологии биологически активных соединений (ХТ БАС) в области химии порфиринов и родственных соединений, и выполнена по теме фундаментальных научных исследований № 1Б-4-355 «Разработка химических и биотехнологических методов модификации биологически активных соединений с целью моделирования жизненно важных процессов в природе».

Работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты РФФИ № 04-03-33064, 06-03-32459, 07-03-00452, 09-03-00701, 09-03-12203-офи-м), аналитической ведомственной целевой программы (проект 2.1.1/2889) «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы) и гранта ЮТАв № 01-0461.

Целью работы является разработка методов направленной химической модификации хлорофилла а (Хл а) и бакгериохлорофилла а (Бхл а) с целью улучшения их фотофизических характеристик, синтеза конъюгатов с другими классами соединений и получения ФС с интенсивным поглощением в ближнем ИК-диапазоне для бинарных методов терапии в онкологии.

Поставленная проблема имеет комплексный характер, что потребовало решения следующих экспериментальных задач:

1. Разработка способов получения производных Хл а и Бхл а с дополнительными кислород- и азотсодержащими шестичленными циклами.

2. Направленная модификация заместителей в пиррольных кольцах А и С природных хлорофиллов.

3. Разработка методов синтеза амфифильных ФС на основе природных хлоринов и бакгериохлоринов, включая положительно заряженные, а также нейтральные гидрофильные производные.

4. Создание конъюгатов хлоринов и бакгериохлоринов с полиэдрическими соединениями бора для эффективной доставки атомов бора в опухоль с целью использования в БНЗТ и комбинированной (БНЗТ-ФДТ) рака.

5. Разработка способов синтеза конъюгатов природных хлоринов с углеводами для рецептор-опосредованного эндоцитоза ФС в опухоль.

7. Проведение необходимых фотофизических и биологических испытаний и выбор наиболее перспективных ФС для ФДТ и БНЗТ рака.

Научная новизна. Разработана новая стратегия функционализации природных хлоринов, позволяющая получать высокореакционноспособные производные Хл а и Бхл а для их последующей химической модификации.

Осуществлен синтез новых Лг-аминоциклои мидов в ряду Хл а. Впервые получены N-гидрокси- и А'-аминоциклоимиды в ряду Бхл а и показана возможность их дальнейшей модификации.

Предложены новые методы химической модификации пиррола А в бакгериохлориновом макроцикле, позволяющие получать амфифильные производные с гидроксилсодержащими заместителями, а также показана перспективность этих соединений в качестве эффективных ФС для ФДТ рака.

Впервые получены катионные ФС в ряду Бхл а и показана их антимикробная фотодинамическая активность.

Разработаны методы синтеза конъюгатов природных хлоринов с молекулами других классов, базирующиеся на современных реакциях органической химии, включая "click chemistry' (Cu-катализируемое 1,3-диполярное циклоприсоединение терминальных алкинов с азидами), палладий-каталюируемые реакции (реакция Соногаширы), реакции кросс-сочетания (метатезис олефинов) и др.

Впервые получены борсодержащие конъюгаты и гликоконъюгаты в ряду Бхл а.

Практическая значимость. Разработаны универсальные подходы к созданию новых высокоэффективных фотосенсибилизаторов на основе природных пигментов.

Предложен новый способ получения гидразидов в ряду Бхл а, обладающих высокой фотодинамической активностью.

Проведен биологический скрининг различных производных в ряду Хл а и Бхл а и отобраны наиболее перспективные соединения для проведения предклинических испытаний на экспериментальных животных с глубокозалегающими и пигментированными опухолями, трудно поддающимися лечению с использованием ныне существующих ФС.

Разработан новый высокоэффективный инфракрасный ФС на основе N-алкоксибакгериопурпуринимида для ФДТ меланомы и создана его наноструктурированная инъекционная форма.

Получены водорастворимые производные хлоринов и бактериохлоринов, которые используются в практической работе биологов, связанной с изучением направленного внутриклеточного транспорта фотосенсибилизаторов.

Разработан эффективный способ доставки борных полиэдров в опухоль путем связывания с хлоринами и бактериохлоринами. Высокое накопление борсодержащих

конъюгатов как в раковых клетках, так и в опухолях у экспериментальных животных делает этот способ перспективным для БНЗТ рака.

Получен модификационный ряд гликоконъюгатов на основе природных хлоринов и показана перспективность использования некоторых из них в ФДТ рака.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методы синтеза и свойства циклических имидов и их производных в ряду хлоринов и бакгериохлоринов.

2. Способ получения амфифильных бакгериохлоринов с гидроксилсодержащими заместителями в пирроле А.

3. Синтез катионных ФС в ряду бакгериохлорофилла а и их эффективность в антимикробной ФДТ.

4. Методы получения биоконъюгатов на основе природных хлоринов.

5. Синтез конъюгатов хлоринов и бакгериохлоринов с борными кластерами для БНЗТ рака.

6. Методы синтеза гликоконъюгатов на основе природных хлоринов.

Личный вютад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования - от постановки задачи, планирования и проведения ключевых экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на: VIII Международной конференции «Spectroscopy and chemistry of porphyrins and their analogs» (Минск, Беларусь, 1998), III Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 1999), Школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии». (Пущино, 2000), III и IV Съездах фотобиологов России (Воронеж, 2001; Саратов, 2005), III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), VIII Международной научной конференции «High-tech in Chemical Engineering 2002» (Уфа, 2002), IX Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов (Суздаль, 2003), Международных конференциях по порфиринам и фталоцианинам (ICPP-3, США, 2004; ICPP-4, Италия, 2006; ICPP-5, Россия, 2008), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), Седьмой школе-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений (Одесса, 2007), ежегодных научно-практических конференциях «Отечественные противоопухолевые препараты» (2007-2010), 13-ом Международном конгрессе по нейтронозахватной терапии

(Флоренция, Италия, 2008), Десятой международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов (Иваново, 2009), УШ Школе-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений (Гагры, Абхазия, 2009), Второй международной молодежной школе-конференции по физической химии краун-соединений, порфиринов и фталоцианинов (Туапсе, 2010). Публикации. Материалы диссертации опубликованы в монографии [23], 2-х обзорах [19, 20], 24 статьях в отечественных и зарубежных журналах, 1 патенте [28], заявке на изобретение (положительное решение о выдаче патента от 25.08.2010 г.) [29], более чем в 20-ти тезисах докладов на российских и международных конференциях. Объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на_стр., содержит 21 рисунок. 84 схемы. 11 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Гидрированные аналоги порфиринов - хлорины и бактериохлорины - играют важную роль в природе, в том числе участвуют в фотосинтезе и родственных ему процессах. Большой интерес к этим соединениям обусловлен широким спектром полезных свойств их направленно-модифицированных производных. Уникальная способность хлорофиллов избирательно накапливаться в опухолевых тканях и вызывать под действием лазерного облучения определенной длины флуоресценцию либо фотодинамический эффект, успешно используется в флуоресцентной диагностике (ФД) и ФДТ злокачественных новообразований.

Используя Хл а и Бхл а в качестве исходных соединений, в настоящей работе были выполнены исследования, целью которых явилось:

- получение устойчивых индивидуальных производных пигментов со спектральными характеристиками, не уступающими исходным хлорофиллам, а в раде случаев и превосходящими их;

снижение гидрофобности и придание амфифильных свойств молекулам пигментов с целью улучшения растворимости в полярных растворителях и воде;

- введение в макроцикл функциональных групп для присоединения других биоактивных молекул с целью повышения тропности к раковым клеткам и направленного внутриклеточного транспорта.

Выполненная работа строилась путем проведения исследований по следующим основным направлениям:

- синтез и изучение свойств циклических имидов хлорина и бактериохлорина и создание на их основе новых перспективных ФС;

- синтез и изучение свойств конъюгатов природных хлоринов с борными полиэдрами;

- разработка новых подходов к синтезу гликоконъюгатов в ряду Хл а и Бхл а.

1. Синтез и изучение свойств циклических имидов в ряду хлорофилла а и бактериохлорофилла а и создание на их основе новых высокоэффективных ФС

Создание высокоэффективных ФС на основе природных пигментов - комплексная проблема, включающая разработку методов синтеза стабильных производных Хл а и Бхл а с улучшенными спектральными и фотофизическими характеристиками, конструирование новых амфифильных молекул с оптимальным соотношением гидрофобных и гидрофильных заместителей, а также повышение эффективности и избирательности фотодинамического действия сенсибилизаторов. Структура молекул Хл а и Бхл а открывает широкие возможности для их направленной функционализации (Схема 1).

Схема 1. Возможные химические модификации хлорофилла а и бактериохлорофилла а.

Присоединение к основному макроциклу шестичленного ангидридного цикла приводит к повышению общей устойчивости системы. Следует отметить, что впервые пурпурин 18 бьи синтезирован Г. Фишером (Fischer H. et al., Die Chemie des Pyrrols, 1940), затем рядом

других исследователей (Kenner G.V. et al, J. Chem. Soc., Perkin Tram. I, 1973; Lee S.-J. H. et al, J. Chem. Soc„ Perkin Trans.1, 1993); на нашей кафедре методика его получения была существенно улучшена (Миронов А.Ф. и др. Патент РФ № 2 054944, 1996). Что касается бакгериопурпурина (БП), то его синтез осуществлен на кафедре ХТБАС МИТХТ им. М.В. Ломоносова впервые (Mironov A.F. et al, Proc. SPIE, 1992).

Для получения пурпуринов хлорофиллы экстрагируют из биомассы1 и затем без выделения и дополнительной очистки окисляют в щелочной среде кислородом воздуха. Последующая обработка соляной кислотой приводит к образованию ангидридного цикла и получению пурпурина 18 и бакгериопурпурина (Схема 2).

Схема 2. Хлорофилл а и бакгериохлорофилл а и их производные.

Введение эюоцикла приводит к батохромному сдвигу полосы Qy для пурпурина 18 до 700 нм и для БП до 818 нм. Однако ангидридный цикл устойчив лишь в нейтральной и

'Биомассу Rh. Capsulata для выделения Бхл а выращивают в фотобиореакгоре в лаборатории д.б.н. Цыганкова A.A., ИФПБ РАН, г. Пущино.

кислой средах, а в присутствии оснований происходит его быстрое раскрытие с образованием хлорина pt и бакгериохлорина р, поглощающих при 670 и 770 нм, соответственно. Это обстоятельство потребовало превращения ангидрида в более стабильное производное.

К началу наших исследований бьии известны методы замены атома кислорода в экзоциклах пурпурина 18 и бактериопурпурина на азот при взаимодействии с алкиламинами (Pandey, R.K. et a!., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994; Kozyrev, A.N. et al., Tetrahedron Lett., 1996). Полученные таким способом циклоимиды, однако, не могли быть использованы для синтеза других Л-замещсгшых циклических имидов.

Принципиально новые возможности были обнаружены при замене в этой реакции алкиламинов на бифункциональные агенты - гидразингидрат и гидроксиламин. Во-первых, использование сильных нуклеофильных реагентов значительно упростило получение циклоимидов. Во-вторых, наличие в синтезированных циклоимидах амино- или гидроксильной групп при атоме азота позволило на основе лишь одного соединения получать модификационные ряды пурпурин- и бактериопурпуринимидов, что значительно упростило поиск новых наиболее эффективных ФС.

Первоначально реакция с одним из реагентов - гидроксиламином - была выполнена в ряду Хл а с образованием АГ-гидроксипурпуринимида на кафедре ХТБАС (Mironov A.F., Lebedeva V.S. Tetrahedron Lett., 1998).

В настоящей работе предпринято систематическое изучение взаимодействия производных Бхл а с гидроксиламином, а также Хл а и Бхл а с гидразингидратом.

1.1. Новые N-аминопурпуринимиды в ряду хлорофилла а

Превращение ангидридного цикла пурпурина 18 1 в jV-аминоимидный цикл включает две основные стадии (Схема 3). На первом этапе происходит раскрытие экзоцикла и образование смеси моногидразидов 2а и 26, сопровождающееся гипсохромным смещением полосы Qy в область 670 нм. Добавление в реакционную смесь соляной кислоты приводит к внутримолекулярной циклизации с образованием Л-аминоциклоимида 3. Структура его метилового эфира 4 подтверждена спектром 'Н ЯМР, в котором имеется сигнал двух протонов экзоциклической аминогруппы в виде несколько уширенного синглета при 5.7 м.д.

Аминогруппа легко алкилируется и ацилируется. Так, при обработке циклоимида 4 метилиодидом или тозилхлоридом были получены Л'^-диметиламино 5 и Л^-тозильное 6 производные, соответственно. Принципиальная возможность использования первичной аминогруппы в циклоимиде 4 для присоединения биомолекул, несущих формальную

функцию, была показана на примере конденсации последнего с и-нитробензальдегидом с образованием основания Шиффа 7.

В ходе превращения пурпурина 18 1 в цикиоимид 3 была обнаружена возможность восстановления винильной группы в пирроле А под действием гидразина. Кинетика восстановления прослеживалась с помощью 'Н ЯМР и электронных спектров, в то время как заметных различий в хроматографической подвижности получаемых продуктов не наблюдалось. Через 48 часов основным продуктом реакции являлся З-зтил-З-девинил-Л-аминопурпуринимид 3 с гипсохромным смещением основной полосы поглощения с 715 до 703 нм.

2а,6

2а: r1 = он; r2 = nh-nh2 26: r1 = nh-nh2; r2 = он сн

pN02C6H4CH0

„ |—3: r'=r2 = r3 = h

_^=£-4: r1 = r2 = h; r3 = ch-

ch3i

c-5: r' = r2 = r3 = chj —*■ 6: r1 = h; r2 = sojcehächä; r3 = ch3 7: r'+r2 = chc6h4n02; r = ch3

Схема 3. Синтез Л'-аминопурпуринимида и его химические модификации.

Описанное восстановление винильной группы с помощью гидразингидрата является новым подходом к получению мезохлорина наряду с традиционно используемым каталитическим гидрированием винильной группы.

1.2. А^-Аминоциклоимиды в ряду бактериохлорофилла а

Изучение взаимодействия БП с гидразингидратом (Схема 4) показало, что, как и в случае с пурпурином 18, на первом этапе очень быстро происходит раскрытие ангидридного цикла и образование моногидразидов 9а и 96, при этом ацетильная группа превращается в гидразон. Предположение о возможном образовании гидразона в ходе реакции и последующем его гидролизе в кислой среде было подтверждено реакцией бактериохлорина р 11 с гидразином. Продукт 12 выделяли без добавления кислоты. Масс-

спектр последнего подтвердил образование гидразона, который в присутствии соляной кислоты легко гидролизуется в исходный бактериохлорин р 11.

В дальнейшем появившаяся в электронном спектре полоса при 750 нм смещается до 836 нм, что свидетельствует о самопроизвольной циклизации моногидразидов. Этот процесс значительно ускоряется при подкислении реакционной массы соляной кислотой.

Схема 4. Реакция бакгериопурпурина с гидразингидратом.

В отличие от аналогичной реакции с пурпурином 18, где мы имели возможность сравнивать собственные результаты с литературными данными по взаимодействию последнего с алкиламинами и гидроксиламином, в случае бактериопурпурина можно было ожидать образование двух изомерных циклоимидов 10а и 106.

Доказательство структуры проводилось с помощью химических модификаций и ЯМР-спекгроскопии. Обработка полученного продукта метилиодидом согласно масс-спектру высокого разрешения давала ЛЛ^диметилпроизводное 13 (Схема 5), в 'Н ЯМР спектре которого присутствуют два синглета, соответствующие метальным группам при 3.36 и 3.37 м.д. Появление этих сигналов позволило использовать двумерный гетероядерный резонанс для доказательства размеров образовавшегося цикла. Отсутствие в спектре гетероядерной корреляции через множественные связи (НМВС) кросс-пиков между протонами

> 0 ° (Na)H02C C02H<Na> НО/ СС

8 11 12

nh2nh?h2o

9а: r1 = nhnh,; r* = он 96: r1 = он; rs= nhnhj

Л-метильных групп Н-135 и карбонильными атомами углерода С-131 свидетельствует в пользу структуры 13а. В изомере 136 эти атомы, разделенные только тремя связями, должны взаимодействовать между собой и в спектре НМВС давать соответствующие кросс-пики.

Усреднение сигналов шести протонов метальных групп при нагревании образца 13 до 50°С является еще одним доказательством в пользу структуры 13а. О наличии свободной аминогруппы также свидетельствует образование основания Шиффа при взаимодействии 10 с п-нитробензальдегидом и ацилирование ее тозилхлоридом с получением соответствующего тозилата.

Способ получения Л'-аминоциклоимидов в ряду бактериохлорофилла а защищен патентом РФ (Миронов А.Ф, Грин М.А, Ципровский А.Г. и др. Патент РФ № 2223274 от 10.02.2004).

1.3. Катионные бактериопурпуринимиды и их свойства

Известно, что тетрапирролы, несущие одну или несколько положительно заряженных группировок, обладают антимикробной активностью при использовании в ФДТ. Это связано с инактивацией вирусов, бактерий, дрожжевых грибов и простейших активными формами кислорода, которые генерируются фотосенсибилизаторами при освещении. Данный метод значительно отстает по уровню фундаментальной разработки и практическому использованию от ФДТ рака, поэтому так актуальны эти исследования.

ЛГ-Аминоциклоимид бактериохлорина р 10 явился ключевым соединением в синтезе серии производных бактериохлорофилла а, имеющих в своей структуре катионные фрагменты. Первоначально планировалось использовать для этих целей Ы,Ы-диметиламинопроизводное 13. Однако обработка его избытком иодисгого метила или диметилсульфата не приводила к кватернизации атома азота.

Более успешным оказался иной подход, основанный на ацилировании Ы-аминопроизводного 10 хлорангидридом изоникотиновой кислоты с последующей

кватернизацией атома азота в пиридиновом кольце соединения 14 иодистым метилом с образованием соли 15 (Схема 6).

Схема 6. Синтез катионного бактериопурпуринимида.

В 'Н ЯМР спектре циклоимида 14 наблюдалось уцвоение сигналов всех протонов. Этот факт можно объяснить наличием изомеров с очень близкой хроматографической подвижностью, исключающей возможность их препаративного разделения. Существование изомерных форм связано, по-видимому, как с кето-енольной таутомерией, так и наличием стереоизомерии, обусловленной отсутствием свободного вращения вокруг связи

Для выяснения этого предположения циклоимид 14 был обработан диазометаном (Схема 7), что привело к получению двух новых соединений с одинаковыми молекулярными массами и разной хроматографической подвижностью. Более подвижному изомеру была приписана структура Лг-метилгидразида 16, а второму изомеру - О-метилимидата 17. Структура изомера 16 была подтверждена встречным синтезом, который включал монометилирование Маминобактериопурпуринимида 10 стехиометрическим количеством иодистого метила и последующее ацилирование монометильного производного 18 хлорангидридом изоникотиновой кислоты. Полученное соединение по молекулярной массе и хроматографической подвижности оказалось идентичным с быстродвижущимся изомером 16.

В спектрах 'Н ЯМР последнего сохраняется удвоение сигналов, подобное тому, что наблюдается для исходного циклоимида 14. Данное явление, по-видимому, связано с отсутствием свободного вращения вокруг связи с(0)-М. Съемка спектров 'Н ЯМР соединений 14 и 16 при 50° приводит к слиянию сигналов, что соответствует преодолению энергетического барьера вращения для таких изомеров. В то же время в спектре 'Н ЯМР

С(0)-К

О-метилимидата 17 подобное удвоение сигналов отсутствует, что объясняется наличием одного 2- или Е- изомера.

Катионный ФС 15 является значительно более гидрофильным соединением по сравнению с исходными бакгерипурпуринимидами 10 и 14, в связи с чем для него характерна лучшая растворимость в водно-спиртовых растворах, что делает его удобным для биологических испытаний и перспективным для последующего медицинского применения.

к

I

Л нзсун ^

Е12о Ру I сна3,1

N К

Антимикробная активность циклоимида 15 и его синтетического предшественника 14 тестировалась по методу фотоиндуцированного подавления биолюминесценции генно-инженерного штамма светящихся грамотрицательных бактерий (Рис. 1).

Рис. 1. Дозовые кривые подавления биолюминесценции биосенсора, проинкубированного 10 мин с различными концентрациями циклоимида 15.

В отличие от циклоимида 14, не имеющего в структуре заряженных групп, ФС 15 вызывал фотоиндуцированное подавление биолюминесценции штамма бактерий, степень которого увеличивалась с ростом концентрации фотосенсибилизатора и дозы облучения.2

Следует отметить, что сам по себе белый свет не оказывал влияния на интенсивность бактериальной биолюминесценции. С другой стороны, в отсутствие облучения ФС 15 не вызывал заметного подавления интенсивности биолюминесценции.

Изучение антифунгицидной активности показало, что катионный фотосенсибилизатор 15 обладает не только антибактериальной активностью, но и проявляет высокую эффективность в инактивации дрожжей рода Candida guilliermondii. Учитывая тот факт, что длинноволновый максимум поглощения циклоимида 15 находится при 830 нм, такого рода ФС в сочетании с соответствующим лазерным источником излучения может быть использован для фотосенсибилизации плотных культур микроорганизмов.

Для оценки влияния структурных особенностей гетероциклических фрагментов, вводимых в молекулу ФС, на химическую активность и изомерию последних, нами в качестве ацилирующих агентов были использованы хлорангидриды 6-метилпиколиновой и 6-метилникотиновой кислот (Схема 8).

кислот.

2Работа по определению антимикробной и антифунгицидной активности проведена на биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова с.н.с. Страховской М.Г.

Оказалось, что кватернизация циклоимида 21, имеющего остаток 6-метилпиколиновой кислоты, с помощью иодистого метила невозможна, по-видимому, из-за отсутствия свободного доступа атакующей метальной группы к атому азота гетероцикла.

Удаление атома азота от карбоксильной группы в остатке 6-метилникотиновой кислоты 19 способствует успешному протеканию реакции кватернизации с образованием четвертичной соли 20. Подобное различие в химической активности также наблюдалось и для циклоимидов с остатками хинолинкарбоновых кислот (Схема 8). Конденсация А'-аминоциклоимида 10 с хлорангидридами 2- и 6-хинолинкарбоновых кислот давала циклоимиды 22 и 24, из которых только соединение 22 превращалось в четвертичную соль 23. Мы не исключаем возможности образования внутримолекулярной водородной связи между атомом азота гетероцикла и амидным водородом в соединениях 21 и 24, что приводит к образованию пятичленного цикла и препятствует кватернизации.

1.4. Борсодержащие конъюгаты на основе ЛГ-аминобактернопурпуринимида

Присоединение борных полиэдров к производным природных хлорофиллов обеспечивает направленную доставку атомов бора в опухоль, что используется при создании препаратов для борнейтронозахватной терапии (БНЗТ) рака.

Нами разработан новый метод синтеза борсодержащих конъюгатов в ряду бактериохлорофилла а с использованием в качестве ключевого соединения Ы-аминобакгериопурпуринимида 10 (Схема 9).

Наличие экзоциклической аминогруппы в нем позволило разработать два пути синтеза, один из которых включал создание СО-МН связи между макроциклом и борными кластерами, а другой заключался в получении конъюгатов путем взаимодействия циклоимида 10 с оксониевым производным металлокарборана (Схема 9).3

Первый подход был реализован за счет взаимодействия циклоимида 10 с карборанилкарбоновыми кислотами, используя различные методы активации карбоксильной группы. Конъюгат 27 получали, действуя на исходный А-аминобакгериопурпуринимид 10 хлорангидридом додекаборатсодержащей карбоновой кислоты 25 в присутствии триэтиламина, в то время как конъюгат 28 был получен в результате взаимодействия того же циклоимида 10 с кислотой 26, активированной дициклогексилкарбодии мидом.

'Производные бис(дикарболлид)кобальта и клозо-додекаборат анионов получены в лаборатории д.х.н., проф. Брегадзе В.И., ИНЭОС РАН.

Схема 9. Синтез конъюгатов А^аминобакгериопурпуриюшида с борными полиэдрами.

Однако такой способ синтеза борсодержащих конъюгатов позволил получить целевые продукты с выходами, не превышающими 20%. Более эффективным оказался подход, включающий нуклеофильное раскрытие цикла в оксониевом производном бис(дикарболлид)кобальта 29 в присутствии ШРЕА. Конъюгат 30, содержащий два борных полиэдра, был получен с выходом 64%. Он имеет поглощение при 830 нм и может рассматриваться как перспективный ФС для комбинированной ФДТ-БНЗТ рака.

1.5. М-Гидроксициклоимиды в ряду бактериохлорофилла а 1.5.1. Синтез и свойства А^-гадрокси- и .М-алкоксибактериопурпуринимидов

Принципиально новые возможности для получения циклоимидов и их последующих химических превращений открылись при использовании гидроксиламина.

В случае БП можно было ожидать, что появление нового реакционного центра (ацетильная группа вместо винильного заместителя в пурпурине 18) несколько осложнит синтез. При обработке БП 8 гидроксиламином в пиридине первоначально образуется оксим 31, и лишь при использовании избытка реагента вторая молекула гидроксиламина вступает в реакцию с ангидридным циклом, давая оксим А'-гидроксибактериопурпуринимида 36 (Схема 10).

31: Р = Н 32: К = СН3 33:= С2Н5 34: Р = С4Н9 35: Р = СбН)з

я'о—N.

36: й = Н 37: К = СН3 38: К = С2Н5 39: И = С4Нв 40: Р? = СвН13

ор1

41:Р1 = СН3;Р2 =Н 42: Р' = Р2 = СН3 43: Р1 = Р2 = С2Н5 44: Р1 = И2 = С«Н9 45: Р1 = Р2 = СаН13

Схема 10. Взаимодействие бактериопурпурина с гидроксиламином и алкоксиаминами.

Наличие в последнем подвижного атома водорода позволяет существенно расширить круг циклоимидов за счет реакций ацилирования и алкилирования. Наиболее интересным

оказалось О-метилыюе производное 41, которое образуется с высоким выходом при действии диазометана на циклоимид 36.

В ходе исследования было обнаружено два интересных факта. Кислотность атома водорода в оксимной функции настолько понижена, что последняя не участвует в реакции с диазометаном. Кроме того, тщательный анализ (ТСХ, масс-спектры) N-метоксипроизводного 41 показал, что вещество является смесью двух изомеров с очень близкими значениями Rf. Выделенные изомеры были охарактеризованы спектрами 'Н ЯМР, включая спектроскопию ID NOE, и на основании полученных данных сделан вывод о существовании соединения в двух стереоизомерных формах (син- и анти-).

Соединение 41 имело хорошие фотофизические свойства. Так, квантовый выход синглетного кислорода (в 1% эмульсии Кремофора в воде) оказался достаточно высоким (фд=0.57) и, как следствие этого, пигмент имеет значительную фотоиндуцированную цитотоксичность на линии клеток А549 (1С5о=0.97мкМ).4

Однако при изучении фармакокинетики данного соединения обнаружился ряд свойств, ограничивающих возможность его дальнейшего использования. Так, вещество имеет низкий индекс селективности (1.2 - 1.6), а динамика изменения концентрации ФС в опухоли, включая короткий период накопления (20-80 мин) и быстрое выведение, не дает возможности проведения эффективного сеанса ФДТ.

Для повышения общей гидрофобности молекулы были получены циклоимиды 42-45, содержащие алкоксильные группы как в эюоцикле, так и в пирроле А.

На биологическую активность ФС существенное влияние оказывает не только общая липофильность молекулы, но и расположение функциональных групп в макроцикле.

В связи с этим нами была разработана схема региоселекгивного синтеза производных бактериопурпуринимида, содержащих гидроксильную и алкоксильные группы в пиррольном кольце А и эюоцикле (Схема 11).

Предложенный подход позволил получить ряд региоизомеров 57-63 с алкильными заместителями разной длины с целью проведения скрининговых биологических испытаний и поиска наиболее эффективного ФС.

Изучение фотодинамической активности полученных циклоимидов проводилось in vitro на линии клеток А549 аденокарциномы легкого человека и in vivo на мышах F1 с опухолью Эрлиха (ELD) и мышах BDF1 с меланомой В16.

■"Эксперименты in vitro проведены в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена в лаборатории д.б.н, проф. Якубовской Р.И.

ТЭА/СНС1,,Л

47:1? = Н 48: Я = СН3 49: Р! = С2Н5 50: И = С4Н9 51:1? = С,Н„

Схема 11. Синтез алюжсипроизводных бакгериопурпуринимида.

В экспериментах на клетках оценивалась фотоиндуцированная цитотоксичность соединений, тогда как на животных изучались три основных параметра биологической эффективности, включая коэффициент накопления активного вещества в опухоли (индекс селективности), торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ) животных

По этим параметрам среди всех исследованных соединений наиболее эффективным оказался циклоимид 43, для которого в дальнейшем были созданы нанострукгурные инъекционные формы.

1.5.2. Метиловый эфир 0-этилоксима М-этоксибактериопурпуринимида и фото динамическая терапия с его использованием

Циклоимид 43 имеет высокую фотоцитотоксичность (1Сзо=0.2б мкМ), которая коррелирует со значительным ингибирующим эффектом препарата на опухоль.

Экспериментальная ФДТ мышиной меланомы В16Т с использованием соединения 43 в форме мицеллярной дисперсии на основе Кремофора EL показала эффективное фотоиндуцированное воздействие вещества на опухоль, что привело к торможению роста опухоли с индексом ТРО, достигающим 91%, а величина УПЖ составила 61,3%.*

Изучение фотоиндуцированной активности ФС 43 при лечении человеческой меланомы Ме17, которая была подкожно привита бестимусным мышам и характеризуется чрезвычайно высокой агрессивностью и резистентностью к известным химиотерапевтическим препаратам, показало также высокую эффективность воздействия на опухоль с индексом ТЮ около 96%. Хорошая фармакокинетика циклоимида 43, включающая максимальное накопление препарата в опухоли в течение 5 часов после введения с индексом селективности, достигающим 11, и высокая фотодинамическая активность делают это соединение весьма перспективным для дальнейшего изучения в качестве высокоэффективного ФС для ФДТ глубокозалегающих и пигментированных опухолей.

1.5.3. Разработка наноструктурированных инъекционных форм метилового эфира О-этилоксима^-этоксибактериопуриуринимида

Учитывая гидрофобный характер исследуемого соединения 43, для биологических испытаний in vivo были созданы нанострукгурированные (липосомальные и мицеллярные) инъекционные формы препарата.

Кроме мицеллярной дисперсии на основе Кремофора была получена дисперсия на основе Эмуксола-268 и липосомальная инъекционная форма, состоящая из липосом с диаметром около 100 нм на основе фосфатидилхсшина, холестерина, фосфатидилэтаноламина и ПЭГа 2000. Выполнены сравнительные биологические испытания трех лекарственных форм препарата и показано, что наилучшей фармакокинетикой и фотоиндуцированной активностью обладает липосомальная форма. Так, величина ТРО для ФС 43, заключенного в липосомы, превысила этот параметр для мицеллярных дисперсий и составила 81 % (Рис.2).

Таким образом, наноструктурирование является существенным фактором, обеспечивающим высокую селективность накопления ФС в опухоли за счет эффективной диффузии наночастиц через дефектный эндотелиальный слой сосудов новообразований.

* Значения ТРО и УПЖ получены при дозах ФС 0.5-1 мг/кг массы тела животных, облучение лазером с длиной волны 797 нм через 1 час после введения препарата, плотность мощности 200 мВт/см2, время облучения 20 мин.

Сутки после ФДГ ПЭмуксол НКремофор ЕЗЛипосомы

Рис. 2. Эффективность ФДТ на меланоме В16 с использованием 3-х инъекционных форм циклоимида 43.5

Способ получения метилового эфира О-этилоксима ЛГ-этоксибакгериопурпуринимида и фотодинамическая терапия с его использованием явились предметом заявки на изобретение № 2009113808/15(018877), на которую получено положительное решение о выдаче патента на изобретение от 25.08.2010 г.

1.6. Бактериохлорины, модифицированные по пирролыюму кольцу А 1.6.1. Синтез винильного аналога бактериопурпурина

Наличие ацетильной группы в производных Бхл а серьезно осложняет протекание реакции с гидроксиламином. Поэтому в настоящей работе предложен способ превращения ее в винильную (Схема 12).

Восстановление ацетильной группы проводилось не на БП8, а на бакгериохлорине р 64, во избежание возможного восстановления ангидридного экзоцикла в 8-лакгонный (Mironov A.F., Efremov A.V., Efremova O.A. et al. J. Chem. Soc., Perkin Trans 1, 1998).

Полученную из БП 8 трикислоту 64 восстанавливали боргидридом натрия в соответствующий спирт 65, имеющий максимум поглощения при 740 нм. Обработка последнего соляной кислотой в диоксане приводила лишь к замыканию ангидридного цикла и не затрагивала а-гидроксиэтильной группы. Образование соединения 66 также наблюдалось при действии тозилхлорида на спирт 65, причем если реакция проводилась более 2 часов, то преимущественно получался О-тозилат.

Эксперименты m vivo и изучение инъекционных форм ФС проведены в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН к.ф.-м.н., с.н.с. Мееровичем Г.А. и к.б.н., с.н.с. Мееровичем И.Г.

сн

L6; R = СН3 R1 = Н в: R = R1 « СН,

г: R = СН3 R1 = TS '

Схема 12. Синтез и модификации З-винил-З-деацетилбакгериопурпурина 67.

Нами разработан эффективный способ дегидратации, основанный на обработке спирта 65 и-толуолсульфокислотой. При этом обнаружено, что наряду с образованием винильной группы происходит замыкание ангидридного экзоцикла в соединении 67, что приводит к возвращению основной спектральной полосы Qy в область 783 нм. Наряду с кислотой 67а получены ее метиловый 676 и этиловый 67в эфиры.

При взаимодействии соединений 67а и 676 с гидроксиламином были получены соответствующие jV-гидроксициклоимиды 68а и 686, а обработка 68а диазометаном давала метиловый эфир jV-метоксициклоимида 68в, который является структурным аналогом метилового эфира ./V-метоксипурпуринимида (Хмакс.=711нм), (Mironov A.F., Lebedeva V.S. Tetrahedron Lett., 1998) в бакгериохлориновом ряду со спектральной полосой Qy, смещенной в район 810 нм.

1.6.2. Амфифильные производные бактериохлоринов

Использование гидрофобных ФС, несмотря на имеющиеся в клинической практике примеры, неудобно, так как оно трудоемко и удорожает лекарственные формы. В этой связи стоит проблема синтеза амфифильных ФС. Известно, что природные бактериохлорины

отличаются высокой гидрофобностью. Для успешного их использования в ФДГ необходимо наличие более сбалансированного соотношения гидрофобных и гидрофильных заместителей в молекуле.

Для увеличения гидрофильности бактериопурпуринимидов нами был осуществлен синтез производных, которые содержат в пирроле А гидроксилсодержащие заместители, присоединенные к макроциклу за счет простой эфирной связи (Схема 13).

Схема 13. Синтез бактериопурпуринимидов с полярными заместителями в пиррольном кольце А.

Модификации проводили на Л/-метоксициклоимиде 69, для получения которого спирт 66 обрабатывали гидроксиламином и диазометаном. Гидроксильную группу в пирроле А активировали с помощью ангидрида трифторуксусной кислоты и полученный трифторацетат 70 конденсировали с метиловым эфиром этиленгликоля, ди- и тризтиленгликолями и глицерином, получая соединения 71-74.

Изучение фотофизических свойств бактериопурпуринимидов 71-74 показало, что характер полярного заместителя в пиррольном кольце А не оказывает существенного влияния на спектральные характеристики пигмента. Однако по сравнению с исходным бактериопурпурином 8 введение в молекулу кислородсодежащих заместителей вдвое повышает генерацию синглетного кислорода (фд=0.27 для БП и <рд~ 0.55 для циклоимидов 69, 71-74).

Этот факт коррелирует с фотоивдуцированной активностью полученных соединений. В экспериментах in vitro на линиях клеток HeLa и А549 было показано, что фотоцитотоксичность соединений с кислородсодержащими заместителями в пирроле А в 20 раз выше, чем у исходного бакгериопурпурина (Рис.3).

1000 -800 -IC 90 600 -

400 200 0

■

Щ ■ < \

■vi ша'

60 80

70 ЩО уво я§° -

60 60

69 60

71 72

Соединение 73

74

Heia cell, nMe

A549 cell, nMe

Рисунок 3. Фотоцитотоксичность бакгериопурпуринимидов с полярными заместителями в пирроле А.

Причина столь высокой активности полученных препаратов связана с их повышенной селективностью к раковым клеткам (коэффициент селективности 8-13) и значительным квантовым выходом генерации синглетного кислорода (0.54-0.57).6 Анализ распределения ФС в тканях показал наибольшее накопление в сосудах опухоли, приводящее к гипоксии и некрозу последней, что полностью согласуется с данными израильских исследователей по механизму действия производных Бхл а.

2. Конъюгаты производных природных хлорофиллов с молекулами

других классов

Использование известных ФС в клинике дает не плохие результаты, но применение этих веществ нередко связано с побочными эффектами. Исследования, направленные на изыскание путей снижения этих явлений, весьма актуальны. Одним из возможных путей повышения избирательности фотодинамического действия является присоединение к молекулам фотосенсибилизатора лигандов, для которых имеются специфические рецепторы на поверхности опухолевых клеток. Для подобных соединений характерна повышенная селективность связывания с поверхностью опухолевых клеток, что приводит к увеличению эффективности фотодинамического действия и позволяет снизить концентрацию препарата.

'Спектральные свойства и фотоцитотоксичность производных Бхл а изучены д.б.н., проф. Феофановым A.B., ИБХ РАН.

Общая стратегия синтеза конъюгатов на основе производных Хл а и Бхл а представлена на Схеме 14. Первый вариант включает нуклеофильное раскрытие циклопентанонового кольца в феофорбиде а и региоселекгивное образование 13'-амидов. В качестве нуклеофилов использовали алкилдиамины, аллиламин и пропаргиламин, получая -таким образом пигменты с терминальными аминогруппой, двойной и тройной связями.

Вариант 1

Схема 14. Методы синтеза конъюгатов.

Ключевыми соединениями во втором варианте синтеза являлись пурпурин 18 и бактериопурпурин, на основе которых были получены циклические имиды с якорными группами для присоединения молекул других классов, таких как моно- и дисахариды, борные кластеры.

Для реализации связывания таких лабильных объектов, как природные хлорины и бактериохлорины, с вышеназванными лигандами в настоящей работе были использованы реакции, отвечающие определенным требованиям, главные из которых - это доступность и простота получения исходных соединений, мягкие условия проведения реакций и высокий выход целевого продукта. Такими реакциями являются:

- Cu-катализируемая реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения терминальных алкинов с азидами;

- реакция кросс-метатезиса олефинов с использованием катализатора Граббса второго поколения;

- Pd-катализируемая реакция образования С-С связей между арил- или винилгалогенидами и терминальными алкинами;

- реакция нуклеофильного раскрытия 1,4-диоксанового кольца в оксониевых производных субстратов.

2.1. Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения в синтезе конъюгатов на основе хлоринов и бактериохлоринов

Реакция циклоприсоединения [3+2] между азидами и алкинами с терминальной тройной связью (Huisgen R. In Book 1,3-Dipolar Cycloadditional Chemistry, 1984) универсальна и используется для создания сложных биоконъюгатов, иммобилизации биомолекул на матрицах различной природы и присоединения лекарств к адресным системам доставки. Широкому применению вышеописанной реакции для нужд биологической и фармацевтической химии способствовало значительное увеличение ее скорости за счет использования соединений Cu(I) в качестве катализатора. Кроме того, последний способствует региоселекгивному протеканию реакции с образованием 1,4-дизамещенных 1,2,3-триазолов.

Нами разработана универсальная схема синтеза конъюгатов хлорина е6, пурпуринимида и бакгериопурпуринимида с остатками углеводов и борными кластерами, в которой ключевой стадией является "click" реакция между ацетиленовыми производными природных хлоринов и бактериохлоринов, с одной стороны, и азидами Сахаров и борных полиэдров, с другой стороны.

2.1.1. Синтез гликоконъюгатов в ряду хлорофилла а

Известно, что раковые клетки обладают высокой экспрессией галекганов (например, Галекгин - 1, Галекгин - 3) - белков, имеющих углевод-\знающий домен с высокой аффинностью к Р-галакгозидам. Поэтому углеводные заместители в хлоринах и бакгериохлоринах способны обеспечить векторную направленность доставки ФС внутрь раковой клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза.

В настоящей работе синтезированы углеводсодержащие ФС на основе производных Хл а и Бхл а с остатками галактозы и лактозы.

В качестве ключевого соединения в синтезе хлоринового гликоконъюгата был использован метилфеофорбид а 75, из которого с выходом 86% получено производное хлорина вб с терминальной тройной связью 76 (Схема 15).

Схема 15. Синтез гликоконъюгатов в ряду производных хлорофилла а.

Структура последнего подтверждена набором ЯМР экспериментов. Сигнал этинильного протона проявляется в виде триплета при 2.39 м.д., а протоны метиленовой группы пропаргильного остатка - в виде мультиплета при 4.50 м.д., давая корреляцию в спектре COSY с соседним NH-протоном амидной группы и прогоном при тройной связи.

Производное 76 конденсировали с перацетами 1-0-{2-азидоэтил)-/Ш-галакгозы 78 и 1-0-(2-азидоэтил)-/Ш-лактозы 79.' Реакция циклоприсоединения проводилась в

'Модифицированные углеводы синтезированы в лаборатории д.х.н., проф. Себякина Ю.Л., МИТХТ им. М.В. Ломоносова

присутствии 10 мол. % иодида меди (I). В течение первых 10 мин. происходило образование Cu-комплекса хлорина, сопровождающееся гипсохромным смещением длинноволновой полосы поглощения пигмента с 663 до 635 нм.

Поэтому в дальнейшем нами был реализован иной подход к синтезу углеводсодержащих хлоринов, основанный на использовании Zn-комплекса амида 77 и получении соответствующих гликоконъюгатов 80 и 81. Было показано, что Zn-комплекс хлорина еб в условиях реакции является достаточно устойчивым и не подвергается замещению на ион меди. Подобная «защита» катионом Zn2+ с последующим деметаллированием в слабокислой среде позволила получить конъюгаты 82 и 83, деблокирование защитных ацетильных групп в которых давало галакгозилхлорин 84 и лактозилхлорин 85 с выходами 90 и 85% соответственно.

Структура гликохлоринов 82 и 83 установлена с помощью одно- и двумерной спектроскопии ЯМР, включая надежное доказательство региоспецифического образования 1,4-дизамещенного триазола методом ROESY.

Введение углеводного фрагмента в молекулу хлорина заметно повысило гидрофильность последнего, а в случае лакгозилхлорина 85 привело к водорастворимому соединению.

2.1.2. "Click chemistry" в синтезе гликоконъюгатов на основе бактериопурпуринимидов

Переход к гликоконъюгатам в ряду производных Бхл а обусловлен поиском ФС с улучшенными спектральными характеристиками. Полученные нами ранее бакгериопурпуринимиды показали высокую химическую стабильность, а батохромный сдвиг Qy-полосы в область 820-835 нм делает их перспективными кандидатами в качестве ФС для ФДГ рака.

В настоящей работе описанный выи;е подход к синтезу гликоконъюгатов в ряду природных хлоринов был успешно реализован для получения гликоконъюгатов на основе бактериопурпуринимида с модифицированной лактозой (Схема 16).

В предложенной схеме использовался второй вариант синтеза, когда ключевым соединением являлся бактериопурпурин 8, из которого получены циклоимиды с пропаргильным заместителем в разных положениях макроцикла. Дело в том, что наличие в молекуле БП двух высокоэлеетрофильных центров (ацетильной группы и ангидридного экзоцикла) приводит к неоднозначному протеканию реакции с пропаргиламином и образованию наряду с циклоимидом 86 также диалкинильного продукта 87. Было показано, что изменение количества пропаргиламина и времени реакции позволяет влиять на соотношения продуктов 86 и 87. Так, кипячение в хлороформе метилового эфира БП с

8-кратным избытком пропаргиламина в течение 16 ч приводило к получению циклоимида 86 с выходом 60% и основания Шиффа 87 с выходом 20%. Увеличение избытка пропаргиламина (40 экв.) и продолжительности реакции до 40 ч приводило преимущественно к образованию дипропаргильного производного 87. Последующее хроматографическое разделение реакционной смеси позволило выделить циклоимиды 86 и 87, которые далее вводили в реакцию с азидным производным лактозы 88, полученным последовательным ацилированием перацетата аминолактозида глицином и азидоуксусной кислотой.8

£Н3 О-

1.СН2М2

СНС13, д

НОгС'

1. МНгИН2-Н20

2.НС1

3.СН2М2

4. СН31ГО1РЕА

6. МаВН4/СН3ОН , 7. 88, Си1

N

Ме02С О

1. МеОМа/МеОН 2.Н*

С

93

94 Р = Н

ОАс Д йо о

1. ЫаВН4 СН3ОН

Си! (10 иол. %), В1РЕА, СН2С12.

Ыа/МеОН [

1.МеОЫа/МеОН| 2.1

89 Я = Ас

90 Н = Н

С 91 гс = /м 92 И = Н

уло

Схема 16. Синтез углеводсодержащих производных бактериопурпуринимида.

8Лакгозильное производное 88 синтезировано в лаборатории д.х.н., проф. Книреля Ю.А., ИОХ РАН.

Реакция циклоприсоединения протекала аналогично описанной для хлорина, однако образование Си-комплекса бакгериопурпуринимида в ходе реакции не наблюдалось, что согласуется с известным фактом в химии порфиринов, согласно которому легкость образования металлокомплексов падает в ряду порфирины - хлорины - бактериохлорины. Гликоконъюгат 89 был получен с 80%-ным выходом.

Синтез бактериопурпуринимвда, содержащего в молекуле два остатка лактозы, осуществляли на основе циклоимида 87. Для этого последний восстанавливали боргидридом натрия с образованием смеси диастереомеров, которые затем вводили в реакцию сочетания с лактозидом 88. В результате был получен конъюгат 91 с выходом 70%.

Для направленного введения углеводного фрагмента впиррольный цикл А в качестве исходного соединения был использован А^-диметиламинобактериопурпуринимид, кипячение которого с пропаргнламином в хлороформе привело к образованию соответствующего основания Шиффа, которое затем было восстановлено боргидридом натрия. Образовавшуюся смесь диастереомеров вводили в сочетание с азидным производным перацетата лактозы 88, что приводило к конъюгату 93 с выходом 83%.

Удаление защитных ацетильных групп в соединениях 89, 91 и 93 позволило впервые получить высокогидрофильные углеводсодержащие конъюгаты 90, 92 и 94 в ряду природных бактериохлоринов.

В спектрах ЯМР лакгозилбакгериопурпуринимвдов 89, 91 и 93 были выделены сигналы, относящиеся к макроциклу, триазолу и углеводному фрагменту, что позволило не только надежно установить структуру соединений, но и таутомерные формы и «информации.

Оценка фотоиндуцированной активности полученных углеводсодержащих хлоринов и бактериохлоринов, которая проводилась на линии трансформированных клеток Нер2 (эпидермоидная карцинома гортаноглотки), показала, что наиболее активны гликоконъюгаты в ряду производных хлорофилла а 84 и 85 (Табл. 1). В целом малоактивными оказались производные бакгериопурпуринимида, при этом расположение углеводного остатка в макроцикле определенным образом влияет на фотоцитотоксичность соединений. Бакгериопурпуринимид с дисахаридным остатком в пирроле А 94 обладает средней активностью (1С5о=2.24 мкМ), тогда как введение углевода в экзоцикл 90 или наличие двух остатков дисахарида 92 делает пигменты неактивными.

Низкая активность гликоконъюгатов природных хлоринов и бактериохлоринов (ниже, чем у негликозилированного хлорина е6, 1С5о=0.16 мкМ) может быть связана с высокой гидрофильностью полученных пигментов и присутствием в структуре триазольного гетероцикла.

Таблица 1. Результаты биологических испытаний in vitro гликоконъюгатов хлорина ев и бактериопурпуринимида.

№ Тип макроцикла Тип углеводного ИК50

соединения фрагмента (мкМ)

84 Хлорин ее йа1 0.8

85 Хлорин ее Ьас 0.97

94 Бактериопурпуринимид З-Ьас 2.24

90 Бактериопурпуринимид В'-ЛГ-Ьас -

92 Бактериопурпуринимид ди-Ьас -

98 Триметиловый эфир хлорина е6 (схема 18) - 0.16

2.1.3.1,3-Диполярное циклоприсоединение в синтезе борсодержащих

конъюгатов

Уникальное свойство тетрапиррольных соединений селективно накапливаться в раковой ткани делает их привлекательными транспортными системами как для направленной доставки борных кластеров в опухоль, так и для комбинированной ФДТ и БНЗТ рака, что несомненно должно повысить результативность противоопухолевой терапии. С этой точки зрения особый интерес представляют фотосенсибилизаторы на основе природных хлорофиллов с интенсивным поглощением в ближней ИК-области спектра. В качестве борсодержащих фрагментов были использованы полиэдрические соединения бора -производные хж>зо-додекаборат аниона [В12Н12]2" и аниона бис(дикарболлид)кобальта [3,3'-Со(1,2-С2В9Нц)2]".

При синтезе борсодержащих конъюгатов хлоринов мы использовали реакцию 1,3-диполярного циклоприсоединения между азидами и алкинами с терминальной тройной связью, хорошо зарекомендовавшую себя при получении гликоконъюгатов.

Исходный цинковый комплекс хлорина ев с терминальной тройной связью 77 в присутствии солей одновалентной меди обрабатывали азидами, полученными путем раскрытия азидом натрия диоксанового кольца в оксониевых производных бис(дикарболлид)кобальта [в-СХСНгОЩгО-З.З'-СоЦД-СгВШюХГД'-СгВ^п)] А и кпозо-додекабората [ОССНгСНг^О-ВпНц] Б (Схема 17). После деметаллирования продуктов реакции были получены конъюгаты 95 и % с выходами 60% и 68% соответственно.

Схема 17. Синтез борсодержащих конъюгатов методом 1,3-диполярного циклоприсоединения.

Биологические испытания полученных конъюгатов, выполненные на клетках аденокарциномы легкого человека А549, показали, что внутриклеточная концентрация соединений 95 и 96 недостаточна для эффективного фотодинамического разрушения клеток, что ограничивает использование подобных конъюгатов в ФДТ и БНЗТ рака.

2.2. Кросс-метатезис олефинов в синтезе гликоконъюгатов на основе хлорофилла а

В настоящей работе нами предложен новый эффективный метод синтеза гликоконъюгатов в ряду производных Хл а с использованием реакции кросс-метатезиса алкенов. В главе 2.1.2. было показано, что введение углеводных остатков в различные положения хлоринового макроцикла по-разному влияет на амфифильность молекулы и, как следствие, на биологические свойства пигмента. В частности, гидрофильные заместители в пиррольном кольце А значительно увеличивают фотодинамическую эффективность ФС.

Наличие винильной группы у производных Хл а упрощает получение гликозилированных хлоринов с использованием реакции кросс-метатезиса алкенов, которая заключается в перераспределении алкилиденовых групп между двумя олефинами в присутствии карбеновдных комплексов металлов. Высокоактивный и стабильный рутениевый катализатор Граббса второго поколения 97 позволил нам использовать реакцию кросс-метатезиса для такого малоактивного алкена, каким является хлорин 98 (Схема 18). Последний вводили в реакцию сочетания с тетраацетатом аллил-/?-!)-галактопиранозида 99, полученным гликозилированием аллилового спирта. Изучение данного взаимодействия показало, что оптимальными условиями проведения реакции

является кипячение хлорина 98 с четырехкратным избытком аллилгалакгозида 99 в хлористом метилене в течение 16 часов в присутствии 25 мол. % катализатора.

ГА

"г!

Р(Су)з

97 1.0» коня-РЮН

2. на

3. СН21Ч2

4. н2 ю% рак.

(СНз)2СО

кат. 97 (5 моя. СН2С12 4

Схема 18. Реакция кросс-метатезиса олефинов в синтезе углеводсодержащих хлоринов и пурпуринимидов.

Выход гликоконъюгата 100 в данных условиях составил 40%, причем увеличение концентрации катализатора и/или аллилгалакгозида 99 не оказывало влияния на степень конверсии исходного хлорина 98. Данное взаимодействие протекает стереоселекгивно с образованием двойной связи Е- конфигурации и характеризуется отсутствием побочных продуктов, что упрощает хроматографнческую очистку целевого продукта и позволяет регенерировать исходный хлорин 98 для повторного использования.

Другим местом связывания хлоринового макроцикла с остатком углевода служила аллилъная группа в пиррольном кольце С соединения 102, которую вводили путем раскрытия экзоцикла Е мезофеофорбида под действием аллиламина. Гидрирование винильной группы в пиррольном кольце А метилфеофорбида 75 до этильной диктовалось необходимостью региоселекгивного введения углеводного фрагмента в положение 13 макроцикла. Взаимодействие аллиламида 102 с тетраацетатом аллил-^-О-галакшпиранозида 99 в соотношении 1:5 в присутствии 5 мол. % катализатора Граббса в течение 4 часов давало конъюгат 103. Избыток одного из реагентов необходим для смещения равновесия в сторону образования продукта реакции, так как из литературы известно, что аллильные производные в условиях реакции кросс-метатезиса могут образовывать гомодимеры. Следует отметить, что в данном случае реакция протекала с меньшей стереоселективностью по сравнению с винильной группой в пиррольном цикле А, и наблюдалось образование двух изомеров EIZ соединения 103 с соотношением 5:1 (по данным ЯМР) с общим выходом 80%. Нам удалось разделить изомеры с помощью препаративной тонкослойной хроматографии и выделить основной продукт {Е-изомер), обладающий меньшей хроматографической подвижностью.

Следующий этап работы состоял в синтезе гликоконъюгатов на основе пурпуринимидов с использованием реакции кросс-метатезиса. Переход к пигментам, поглощающим в области 700 нм, обусловлен высокой эффективностью их использования в фотомедицине. Нами была разработана схема региоселекгивного введения углеводного фрагмента в макроцикл пурпуринимидов, аналогичная превращениям хлорина es. Однако попытки проведения реакции кросс-метатезиса с участием винильной группы циклоимида 108 не дали положительного результата даже при использовании большого избытка аллилгалакгозида 99, длительном кипячении реакционной смеси или увеличении количества катализатора Граббса вплоть до 1 эквивалента.

Более успешным оказался путь, включающий кросс-сочетание аллилмезопурпуринимида, полученного из мезопурпурина 105, с аллилгалактозидом 99, приводящий к коньюгату 106 с соотношением E/Z-изомеров 6:1. Основной Я-изомер был выделен с выходом 62%.

Удаление защитных ацетильных групп в соединениях 100, 103 и 106 под действием метоксида натрия в системе МеОН/СН2СЬ приводило к гликококьюгатам 101, 104 и 107 с выходами 65-85%.

Биологические испытания in vitro полученных гликоконъюгатов, проведенные на линии клеток Нер2, позволили нам сделать два основных вывода:

- все галактозилхлорины, полученные реакцией кросс-мегтатезиса и содержащие двойную связь в спейсере, оказались более активными по сравнению с группой гликоконъюгатов, имеющих замещенный триазольный цикл (гл. 2.1.2);

- среди хлоринов с остатком галактозы в разных положениях макроцикла наиболее высокую фотоиндуцированную активность проявил гликоконъюгат 101 с углеводным фрагментом в пирроле А (1С$о=0.02 мкМ), что в 8 раз выше, чем у негликозилированного триметилового эфира хлорина е6 98 (1С<о=0.16 мкМ).

2.3. Реакция Соиогаширы в синтезе борсодержащих конъюгатов на основе

природных хлоринов

Особый интерес среди реакций, используемых для получения конъюгатов тетрапиррольных соединений с молекулами других классов, представляет палладий катализируемая реакция образования С-С связи между арилгалогенидами и терминальными алкинами в присутствии или без добавления солей меди (I) в качестве сокатализатора (реакция Соногаширы).

В настоящей работе нами получены новые борсодержащие конъюгаты на основе алкинилированного кобальт бис(дикарболлид) аниона и л-иодфенильных производных хлорина е6 и пурпуринимида по реакции Соногаширы (Схема 19). Борную субъединицу 116, содержащую концевую ацетиленовую группу, связанную с борным полиэдром гибким гидрофильным спейсером, получали действием 2-пропин-1-илата натрия на оксониевое производное бис(дикарболлид) кобальта 29. Хиориновые компоненты для реакции Соногаширы в виде n-иодфенильных производных 111 и 114 получали ацилированием аминосодержащих хлоринов 110 и 113 хлорангидридом я-иодбензойной кислоты. Реакцию проводили в атмосфере аргона в смеси бензола и диизопропилэтиламина в соотношении 5:1 в течение 48 часов. В качестве катализатора использовали трис(дибензилиденацетон) дипалладий (0) с трифенилфосфином. Для предотвращения возможности встраивания катиона меди в хлориновый макроцикл был реализован вариант реакции Соногаширы без солей Си (I). Конъюгаты 112 и 115 получены с выходами 61% и 69%, соответственно, и их структура подтверждена спектральными характеристиками.

Схема 19. Получение борсодержащих конъюгатов на основе производных хлорофилла а по реакции Соногаширы.

Борсодержащие конъюгаты 112 и 115 являются гидрофобными соединениями. Они хорошо растворяются в органических растворителях и не растворимы в воде. Для исследования этих конъюгатов in vitro при приготовлении растворов был использован биологически совместимый солюбилизатор Кремофор EL (CrEL), который обеспечивает в водных растворах стабилизацию мономерной формы различных гидрофобных тетрапиррольных соединений. Способность хлорина флуоресцировать в красной области спектра в составе конъюгатов позволяет использовать флуоресцентную микроскопию для изучения взаимодействий соединений 112 и 115 с раковыми клетками.

Методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии установлено, что конъюгаты проникают в клетки А549 аденокарциномы легкого человека и накапливаются в цитоплазме. При этом в обоих соединениях наблюдается сходное внутриклеточное распределение - концентрирование в гранулярных клеточных структурах субмикронного размера. При этом они не проникают в ядро клетки и не накапливаются в плазматической мембране. Оказалось, что конъюгаты 112 и 115 обладают низкой фотоиндуцированной

цитотоксичностью, однако выполняют свою основную задачу - доставляют в раковые клетки кластеры бора, необходимые для БНЗТ.

2.4. Синтез борсодержащих конъюгатов с использованием реакции нуклеофильного замещения в оксониевых производных бис(дикарболлид) кобальта

Характерной особенностью металлокарборанов и, в первую очередь, бис(дикарболлидных) комплексов кобальта является образование стабильных заряд-компенсированных оксониевых производных 29, раскрытие 1,4-диоксанового цикла в которых широко используется для присоединения различных нуклеофилов.

В настоящей работе в качестве хлоринового фрагмента были использованы производные хлорофилла двух типов. Первая группа - 13-(ш-аминоалкил) хлорины ец 110,117,118- была получена путем взаимодействия метилового эфира феофорбида а 75 с алкилдиаминами. Реакция протекает при комнатной температуре с высоким выходом (68-85%). Вторая группа хлоринов была представлена циклическими имидами, у которых терминальная аминогруппа находится либо непосредственно при атоме азота экзоцикла 4, либо на некотором удалении от него 113.

Наличие первичной аминогруппы в хлоринах позволяет использовать ее для раскрытия 1,4-диоксанового цикла в металлокарборанах и создания целевых конъюгатов. Синтез первой группы конъюгатов был реализован путем взаимодействия 13-(ю-аминоалкил) хлоринов е6 и оксониевого производного бис(дикарболлид) кобальта (Схема 20). В ходе проведения реакции было обнаружено, что структура образующихся конъюгатов существенно зависит от наличия в реакционной среде такого сильного основания, каким является диизопропилэтиламин (й1РЕЛ). В отсутствие основания происходит присоединение одного борного кластера с образованием конъюгатов 119-121. При добавлении ИРЕА наблюдается присоединение 2-х молекул мелаллокарборана к молекуле хлорина с образованием соединений 123-125.

Нами показано, что конъюгат с одним борным кластером в присутствии ШРЕА легко присоединяет еще одну молекулу бис(дикарболлид) кобальта. Подобное протекание реакции открывает путь для направленного получения конъюгатов хлорина с различным числом борных полиэдров.

По-видимому, роль МРЕА в описанных превращениях связана с депротонированием атома азота в аминохлорине, что дает возможность дальнейшей нуклеофилъной атаки по второй молекуле борного кластера.

Для подтверждения структуры полученных конъюгатов соединения 121 и 125 были превращены в соответствующие Zn-комплексы 122 и 126. Выполненный анализ на ионы металлов показал, что соотношение катионов Zn и Со в конъюгате 122 составляет 1:1, тогда как в конъюгате 1261:2.

129: R»CH2CH3; n=0 130: R * сн=сн2; n32

119: М-2H, n=2 120: М ■ 2Н, п=4 /121: М-2Н, П=8 2п(ОДсь(

122:M=Zn,n=6

123: М-2Н, п»2 124: М я 2И, П*4 ^125: М-2Н, п=в

'l26:M«Zn, п=6

Схема 20. Синтез конъюгатов хлорина е« и пурпуринимидов с борными кластерами.

Строение соединений 119-121 и 123-125 также подтверждено данными ЯМР, масс-, ИК и электронных спектров.

Аналогичные закономерности наблюдались и при синтезе второй группы конъюгатов, в которой были использованы пурпуринимвды 4 и 113. В случае Лг-(аминоэтил)циклоимида 113 в присутствии ШРЕА происходит присоединение двух борных кластеров с

образованием конъюгата 130, тогда как в отсутствие основания образуется лишь монозамещенный циклоимид 128.

Несколько иной характер протекания реакции наблюдался для Л'-аминоциклоимида 4. В отсутствие основания последний не вступал в реакцию с оксониевым производным бис(дикарболлид) кобальта. Однако при добавлении DIPEA реакция приводила к дизамещенному продукту 129.

Обнаруженные различия в реакционной способности циклоимидов 4 и 113, по-видимому, связаны со значительно меньшей нуклеофильностью аминогруппы, непосредственно связанной с атомом азота экзоцикла 4. Ранее нами уже наблюдалась низкая реакционная способность Л'-аминоциклоимида в реакции кватернизации экзоциклической аминогруппы (гл. 1.3.).

Биологические испытания, выполненные для группы конъюгатов на основе хлорина е6119-121 и 123-125, показали, что селективность накопления этих соединений in vitro (клетки аденокарциномы легкого человека А 549) и in vivo (опухоль Эрлиха) зависит от двух факторов: длины спейсера между хлорином и борным фрагментом и числом борных полиэдров в молекуле конъюгата (Рис. 4).

Ко»ффици«нт е«л«к*и«ноети"кл«тк»-ср*да"

с »»junto»»

Рис. 4. Диаграмма накопления в клетках линии А 549 борсодержащих конъюгатов.

Показано, что внутри двух групп соединений с одинаковым числом борных кластеров 119-121 и 123-125 коэффициенты внутриклеточного накопления (максимальное отношение внутриклеточной концентрации соединения к его концентрации в инкубационной среде) повышаются с увеличением длины спейсера. Аналогичные значения коэффициентов селективности были получены для всех конъюгатов в опытах на животных.

Изучение влияния числа борных кластеров в молекулах конъюгатов на проникновение в раковые клетки и накопление внутри них показало, что соединения с одним борным полиэдром 119-121 имеют индексы селективности на порядок превышающие эти величины для конъюгатов с двумя борными фрагментами 123-125 (Рис.4). По-видимому, сказывается уменьшение общего заряда молекулы, что улучшает ее транспорт через клеточную мембрану и усиливает внутриклеточное накопление.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ получения циклических имидов в ряду хлорофилла а и бакгериохлорофилла а, содержащих амино- и гидроксильную группы при атоме азота экзоцикла, и изучена их реакционная способность.

2. Существенно расширен круг синтетических превращений природных хлоринов, включая взаимодействие с гетероциклическими соединениями, аминами различной природы, гидроксилсодержащими молекулами.

3. Предложен новый нанострукгурный инфракрасный фотосенсибилизатор на основе алкоксибакгериопурпуринимида для фотодинамической терапии меланомы.

4. Получены амфифильные и водорастворимые производные природных хлоринов и показана специфика их функционирования.

5. Создан модификационный ряд катионных ФС с целью их возможного применения в антимикробной ФДТ.

6. Разработана методология получения конъюгатов природных хлоринов с молекулами других классов, включающая использование современных методов органического синтеза.

7. Синтезированы гликоконъюгаты в ряду производных хлорофилла а и бакгериохлорофилла а и изучена их структура с использованием спектроскопии ЯМР.

8. Впервые получены борсодержащие конъюгаты на основе производных бакгериохлорофилла а, в том числе содержащие большое количество атомов бора, что делает их перспективными фотосенсибилизаторами для проведения комбинированной ФДТ и БНЗТ рака.

Автор выражает искреннюю благодарность своему учителю - зав.каф. ХТБАС МИТХТ им. М.В. Ломоносова профессору А.Ф. Миронову за оказанную помощь и внимание к работе, руководителям лабораторий и сотрудникам сторонних организаций за предоставленную возможность совместных исследований и активное участие в них, а также аспирантам и студентам кафедры ХТБАС им. H.A. Преображенского за помощь и поддержку.

Публикации по теме диссертации

1. Mironov A.F., Grin М.А., Dzardanov D.V., Golovin K.V., Shim Y.K. Synthesis of a vinyl-containing analogue of bacteriochlorophyll all Mendeleev Commun- 2001. - Vol. 11. - No.6. -P. 205-206.

2. Mironov A.F., Grin M.A., Tsiprovskiy A.G. Synthesis of the first N-hydroxycycloimide in bacteriochlorophyll a series II J. Porphyrins Phthalocyanmes. - 2002. - Vol. 6. - No. 5. - P. 358361.

3. Миронов А.Ф., Грин M.A., Кармакова Т.А., Плютинская А.Д., Феофанов A.B., Якубовская Р.И., Вини П. Новые фотосенсибилизаторы для ФДТ рака на основе природного бакгериохлорофилла all Российский биотерапевтический журнал. - 2003. - Т. 1. - №1. - С. 33-34.

4. Миронов А.Ф., Грин М.А., Ципровский А.Г., Сегеневич A.B., Дзарданов Д.В., Головин К.В., Цыганков A.A., Шим Я.К. Новые фотосенсибилизаторы бактериохлоринового ряда для фотодинамической терапии рака // Биоорганическая химия. - 2003. - Т. 29. - № 2. - С. 214-221.

5. Mironov A.F., Grin М.А., Nochovny S.A., Toukach F.V. Novel cycloimides in the chlorophyll a series // Mendeleev Commun. - 2003. - Vol. 13,- No. 4. - P. 156-158.

6. Mironov A.F., Grin M.A., Tsiprovskiy A.G., Kachala V.V., Karmakova T.A., Plyutinskaya A.D., Yakubovskaya R.I. New bacteriochlorin derivatives with a fosed Л-aminoimide ring // J. Porphyrins Phthalocyanines. - 2003. - Vol. 7. - P. 725-730.

7. Mironov A.F., Grin, M.A., Tsiprovskiy A.G., Titeev R.A., Nizhnik E.A., Lonin I.S. Synthesis of cationic bacteriochlorins // Mendeleev Commun. - 2004. - Vol. 14.- No. 5. - P. 204-207.

8. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G., Sergienko O.V., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Sobolev A.S. Recombinant modular transporters on the basis of epidermal growth factor for targeted intracellular delivery of photosensitizers // Proc. SPIE. -2005. - Vol. 5975. - P. 103-112.

9. Артеменко E.O., Гилязова Д.Г., Розенкранц A.A., Лунин В.Г., Сергиенко О.В., Тимофеев К.Н., Грин М.А., Миронов А.Ф., Рубин А.Б., Соболев A.C. Исследование влияния присоединения бактериохлорина р к модульным рекомбинангным транспортерам для направленной внутриклеточной доставки на эффективность его фотодинамического действия // Молекулярная медицина. - 2005. - № 4. - С. 43-47.

10. Sharonov G.V, Karmakova Т.А., Kassies R., Pljutinskaya A.D., Grin M.A., Refregiers M., Yakubovskaya R.I., Mironov A.F., Maurizot J.-C., Vigny P., Otto C., Feofanov A.V. Cycloimide bacteriochlorin p derivatives: photodynamic properties, cellular- and tissue distribution // Free radicals in biology and medicine. - 2006. - Vol. 40. - P. 407-419.

11. Меерович И.Г., Грин М.А., Меерович Г.А., Ципровский А.Г., Масс O.A., Журов A.B., Барканова С.В., Борисова Л.М., Оборотова H.A., Лощенов В.Б., Барышников А.Ю., Миронов А.Ф. Новые фотосенсибилизаторы ближнего инфракрасного диапазона на основе производных бакгериохлорина р\ предварительные результаты изучения in vivo II Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т. 5. - № 2. - С. 73-76.

12. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G., Sergienko O.V., Khraratsov Y.V., Timofeyev K.N., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Georgiev G.P., Sobolev A.S. Targeting Cancer Cells by Novel Engineered Modular Transporters // Canser Research. - 2006. - Vol. 66,-No. 21.-P. 10534-10540.

13. Миронов А.Ф., Грин M.A. Сенсибилизаторы бактериохлоринового ряда: перспективы использования в фотодинамической терапии // Вестник МИТХТ. - 2006. - Т.1. - № 4,- С. 528.

14. Meerovich I. G., Grin М.А., Tsyprovskiy A. G., Meerovich G A., Barkanova S. V., Borisova L. M., Oborotova N. A., Baryshnikov A.Yu., Mironov A. F. New near-infrared photosensitizers based on bacteriochlorin p derivatives: preliminary results of in vivo investigations // Proc. SPIE. -2007. - Vol. 6427. - P. 64270W1-W9.

15. Grin M.A., Lonin I. S., Fedyunin S.V., Tsiprovskiy A.G., Strizhakov A.A., Tsygankov A.A., Krasnovsky A.A., Mironov A.F. Zn-chlorin-bacteriochlorin dimer.synthesis and properties // Mendeleev Commun. - 2007. - Vol.17. - No. 4. - P. 209-211.

16. Nazarova A., Ignatova A., Feofanov A,, Karmakova Т., Pljutinskaya A., Mass O., Grin M., Yakubovskaya R., Mironov A., Maurizot J.-C. 13,15-jV-CycIoimide derivatives of chlorine pt with isonicotinyl substituent are photosensitizers targeted to lysosomes // Potochem. Photobiol. Sei. -

2007.-Vol. 6.-P.l 184-1196.

17. Grin M.A., Semioshkin A.A., Titeev R.A., Nizhnik E.A., Grebenyuk J.N., Mironov A.F., Bregadze V.l. Synthesis of a cycloimide bacteriochlorin p conjugate with the cfoio-dodecaborate anion // Mendeleev Commun. - 2007. - Vol. 17. - No. 1. - P. 14-15.

18. Grin M.A., Lonin I. S., Makarov A.I., Lakhina A.A., Toukach F.V., Kachala V.V., Orlova A.V., Mironov A.F. Synthesis of chlorin-carbohydrate conjugates by "click chemistry" // Mendeleev Commun. - 2008. - Vol. 18. - No.3. - P. 135-137.

19. Grin M.A., Mironov A.F., Shtil A.A. Bacteriochlorophyll a and Its Derivatives: Chemistry and Perspectives for Cancer Therapy. (Review') //Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. - 2008. - Vol. 8. - No. 6. - P. 683-697.

20. Mironov A.F., Grin M.A. Synthesis of Chlorin and Bacteriochlorin Conjugates for Photodynamic and Boron Neutron Capture Therapy. (Review) // J. Porphyrins Phthalocyanines. -

2008.-Vol. 12.-P. 1163-1172.

21. Грин М.А, Миронов А.Ф, Брегадее В.И, Сиваев И.Б, Титеев Р.А, Бриттал Д.И, Бакиева О. М, Лобанова И.А. Новый борсодержащий конъюгат на основе циклоимида бактериохлоринар // Известия Академии наук. - Серия химическая. - 2008. -№ 10. - С. 21902192.

22. Grin М.А, Mironov A.F. Synthetic and natural bacteriochlorins: synthesis, properties and application // In: Chemical Processes with participation of biological and related compounds. Ed. by T.N. Lomova, G. T. Zaikov. - 2008. - Leiden, Boston. - Brill. - P. 5-43.

23. Grin M.A, Lonin I.S, Lakhina A.A, Ol'shanskaya E.S, Makarov A.L, Sebyakin Y.L, Guryeva L.Yu, Toukach P.V, Kononikhin A.S, Kuzmin V.A, Mironov A.F. 1,3-Dipolar cycloaddition in the synthesis of glycoconjugates of natural chlorins and bacteriochlorins // J. Porphyrins Phthalocyanines. - 2009. - Vol. 13. - P. 336-345.

24. Bregadze V.I., Sivaev I.B, Lobanova I.A, Titeev R.A, Brittal D.I, Grin M.A, Mironov A.F. Conjugates of boron clusters with derivatives of natural chlorin and bacteriochlorin // Applied Radiation and Isotopes. - 2009. - Vol. 67 - P. 101-104.

25. Bregadze V.I, Semioshkin A.A, Laslcova J. N, BerzinaM.Ya, Lobanova I.A, Sivaev I.B, Grin M.A, Titeev R.A, Brittal D.I, Uybina O.V, Chestnova A. V, Ignatova AA, Feo&nov A.V, Mironov AF. Novel types of boronated chlorin ej conjugates via "click chemistry" // Applied Organometallic Chemistry. - 2009. - Vol. 23 - P. 370-374.

26. Возняк Д.Ф, Захарова Г.В, Чибисов А.К, Грин М.А, Харитонова О.В, Семенихин КО, Миронов А.Ф. Первичные фотопроцессы в диадах на основе индокарбоциашшовых красителей и хлорина еб // Химия высоких энергий. - 2010. - Т. 44. - № 1. - С. 33-38.

27. Грин М.А, Титеев Р.А, Бриттал Д.И, Честнова А.В, Феофанов А.В, Лобанова И.А, Сиваев И.Б, Брегадзе В.И., Миронов А.Ф. Синтез конъюгатов бис(дикарболлид)кобальта с природными хлоринами по реакции Соногаширы // Известия Академии наук. - Серия химичзская - 2010. - С. 215-220.

28. Миронов А.Ф, Грин М.А, Ципровский А.Г, Дзарданов Д.В, Головин К.В, Феофанов

A.В, Якубовская Р.И. Гидразиды . в ряду бактериохлорофидла а, обладающие фотодинамической активностью, и способ их получения // Патент РФ №2223274,- 2004.

29. Миронов А.Ф, Грин М.А, Ципровский А.Г, Меерович Г.А, Меерович И.Г, Лощенов

B.Б, Оборотова Н.А, Трещалина Е.М, Андронова Н.В, Барышников А.Ю, Цыганков А.А. Фотосенсибилизатор на основе производного бакгериохлорина р, способ получения производного бакгериохлорина р и способ фотодинамической терапии рака с использованием этого фотосенсибилизатора // Заявка № 2009113808/15(018877). Положительное решение о вьщаче патента на изобретение от 25.08.2010.

30. Грин М.А., Зыков С. А., Миронов А.Ф. On interaction of bacteriopurpurin with hydroxylamine // Тезисы докладов VIII Международной конференции «Spectroscopy and chemistry of porphyrins and their analogs». - Минск, Беларусь. - 1998. - C.34.

31. Грин M.A., Миронов А.Ф., Соболев A.C., Розенкранц A.A., Зыков СЛ., Набатников П.В. Разработка сенсибилизаторов на основе бактериохлорофилла а доя направленного внутриклеточного транспорта // Тезисы докладов III Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». - Пугцино. - 1999. - Т.1. -С.245-247.

32. Грин М.А., Ципровский А.Г., Зыков С.А., Миронов А.Ф. Разработка сенсибилизаторов с интенсивным поглощением в ближней ИК-области на основе производных бактериохлорофилла а И Тезисы стендовых сообщений Школы-конференции «Горизонты физико-химической биологии». - Пущино. - 2000. - С.145.

33. Грин М.А., Сегеневич A.B., Дзарданов Д.В., Головин К.В., Миронов А.Ф. Синтез первого винилсодержащего аналога бактериохлорофилла а // Тезисы докладов Третьего съезда фотобиологов России. - Воронеж. - 2001. - С.52.

34. Грин М.А., Миронов А.Ф., Цыганков A.A. Разработка фотосенсибилизаторов второго поколения на основе природного бактериохлорофилла а // Тезисы докладов III Съезда биохимического общества. -Санкт-Петербург. - 2002. -С.191.

35. Грин М.А., Миронов А.Ф. Разработка новых фотосенсибилизаторов на основе природного бактериохлорофилла а // Труды IX Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов. - Суздаль. - 2003. - С. 16-18.

36. Грин М.А., Головин К.В., Ципровский А.Г., Бровкин А.Н., Миронов А.Ф. Амфифильные фотосенсибилизаторы бактериохлоршювого ряда для фотодинамической терапии рака // Там же. - С. 308-309.

37. Феофанов A.B., Шаронов Г.В, Грин М.А, Кармакова Т.А, Плютинская А.Д, Якубовская Р.И., Миронов А.Ф. Новые ИК-фотосенсибилизаторы на основе циклоимидных производных бакгериохлорина // Там же. - С. 332-334.

38. Mironov A.F., Grin, М.А., Tsiprovskii A.G. Cationíc cycloimides in the di- and tetrahydroporphyrins series // J. Porphyrins Phthalocyanines. - 2004. - Vol. 8. - P. 668.

39. Mironov A.F., Grin M.A., Sebyakin Y.L., Titeev R.A., Budanova U.A. Cationic glycosil cycloimides in the bacteriochlorophyll a series // Там же. - P. 646.

40. Mironov A.F., Grin M.A, Titeev R.A., Lonin I.S., Feofanov A.V., Sharonov G.V., Karmakova T.A., Yakubovskaya R.I., Meerovich I.G., Meerovich G.A. Bacteriochlorophyll a series photosensitizers with hydroxyl substitutes in the pyrrole AII Там же. - P. 770.

41. Грин М.А., Лонин И.С., Федюнин С.В., Ципровский А.Г., Миронов А.Ф. Хлорин-бакгериохлориновый димер: синтез и свойства // Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. - Москва. - 2007. - С. 523.

42. Меерович И.Г., Грин М.А., Ципровский А.Г., Меерович Г.А., Оборотова Н.А., Лощенов В.Б., Барышников А.Ю., Миронов А.Ф. Высокоэффективный инфракрасный фотосенсибилизатор на основе бакгериохлорофшша а // Российский биотерапевтический журнал. - Москва. - 2007. - Т. 6 - № I - С. 22.

43. Грин М.А., Титеев Р.А., Бриттал Д.И., Семиошкин А.А., Сиваев И.Б., Миронов А.Ф., Брегадзе В.И. Синтез и изучение свойств конъюгатов природных хлоринов с борными кластерами // Тезисы докладов Седьмой школы-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений. - Одесса. - 2007. - С. 95-97.

44. Грин М.А. Последние достижения в химии бактериохлоринов и медицинские аспекты их использования // Там же. - С. 18-19.

45. Meerovich I. G., Grin М.А., Tsyprovskiy A.G., Meerovich G. A., Oborotova N. A., Loschenov V. В., Baryshnikov A.Yu., Mironov A. F. New Efficient Near-IR Photo sensitizer Based On Bacteriochlorin p A-methoxycycloimide Oxyme Methyl Ester // Book of Abstracts of International Conference "Advances Laser Technologies ALT'07".- Levi, Finland. - 2007,- P.41.

46. Grin M.A., Kharitonova O.V., Lonin I.S., Semenikhin K.O., Strizhakov A.A., Krasnovsky A. A., Mironov A.F. The conjugates of natural chlorophylls with polycarbocyanine dyes for tumor cell labeling // J. Porphyrins Phthalocyanines. - 2008. - Vol. 12. - P. 527.

47. Lonin I.S., Makarov A.I., Lakhina A.A., Guryeva L.Yu., Grin M.A., Sebyakin Y.L., Mironov A.F. The synthesis of chlorin-carbohydrate conjugates via 1,3-dipolar cycloaddition between carbohydrate azides and chlorins with terminal triple bond // J. Porphyrins Phthalocyanines. -2008.-Vol.12.-P. 619.

48. Meerovich G.A., Meerovich I.G., Grin M.A., Tsiprovskij A.G., Oborotova N.A., Loschenov V.B., Baryshnikov A.Yu., Mironov A.F. Efficient photodynamic treatment of melanoma using bacteriochlorin p N-methoxycycloimide oxyme methyl ester // J. Porphyrins Phthalocyanines. -2008. - Vol.12. - P.635.

49. Titeev R.A., Brittal D.I., Grin M.A., Sivaev I.B., Bregadze V.I., Mironov A.F. Synthesis of chlorin and bacteriochlorin conjugates with boron clusters // J. Porphyrins Phthalocyanines. -2008. - Vol.12. - P.752.

50. Bregadze V.I., Sivaev I.B., Lobanova I.A., Titeev R.A., Brittal D.I., Grin M.A., Mironov A.F. Conjugates of boron clusters with derivatives of natural chlorine and bacteriochlorin // 13 111 International Congress on Neutron Capture Therapy "A new option against cancer". - Florence. -2008. - P.168-171.

51. Грин М.А., Лонин И.С., Макаров А.И., Ольшанская Е.С., Новикова О.С., Лихошерстов Л.М., Миронов А.Ф. Гликоконъюгаты природных хлорофиллов: направленное введение углеводов в хлориновый макроцикл // Тезисы 10-ой Международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов. - Иваново. - 2009,- С 59.

52. Ольшанская Е.С., Грин М.А., Лонин И.С., Макаров А.И., Новикова О.С., Лихошерстов Л.М., Миронов А.Ф. Первые углеводные производные в бакгериохлориновом раду: синтез и свойства /У Тезисы докладов VIII школы-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений. - Гагра, Абхазия. - 2009. - С. 16.

53. Грин М.А. Синтез модифицированных природных хлорофиллов и изучение их свойств для бинарных методов терапии в онкологии // П Международная молодежная школа-конференция по физической химии краун-соединений, порфиринов и фталоцианинов. -Туапсе. - 2010. - С. 13.

Подписано в печать 12.10.2010 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0пл. Тираж 100 экз. Заказ № 872. Отпечатано в типографии «Гелиопринт» 119602 г. Москва, ул. Академика Анохина, д.3&, юэрп.1

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Основные требования, предъявляемые к фотосенсибилизаторам.

1.1. Интенсивное поглощение в дальней красной и ближней инфракрасной областях спектра.

1.2. Амфифильность ФС и высокая растворимость в полярных растворителях и воде.

1.3. Высокий квантовый выход синглетного кислорода и других реакци-онноспособных форм кислорода.

1.4. Высокая селективность накопления ФС в опухоли.

1.5. Низкая темновая токсичность.

1.6. Быстрое выведение ФС из организма.

2. Хлорофилл а и его производные.

2.1. Хлорофиллид а и его производные.

2.2. Феофорбид и его производные.

2.2.1. Алломеризация циклопентанонового фрагмента.

2.2.2. Нуклеофильное раскрытие экзоцикла Е.

2.3. Пирофеофорбид и его производные.

2.4. Бифункциональные агенты для диагностики и фотодинамической терапии опухолей на основе НРРН.

2.5. Вердинохлорины - новый класс ИК-фотосенсибилизаторов в ряду хлорофилла а.

2.6. Новые хлорины с конденсированными хиноксалиновым и бенз-имидазольным циклами.

2.7. Пути модификации винильной группы пирофеофорбида а.

2.8. Пурпурин 18 и циклические имиды.

2.8.1. Восстановление ангидридного цикла.

2.8.2. Синтез хлоринов с циклоимидным фрагментом.

2.8.3. Фторсодержащие пурпуринимиды и их биологическая активность.

2.8.4. Пурпуринимиды, содержащие ковалентно связанные остатки Сахаров.

2.8.5. Конъюгаты пурпуринимидов с фуллеренами.

2.8.6. тУ-Гидроксипурпуринимиды и их производные.

2.9. Фотосенсибилизаторы хлоринового ряда для ФДТ рака.

3. Природные бактериохлорины и их химические модификации.

3.1. Амфифильные и водорастворимые производные бактериохлорофилла а.

3.2. Производные бактериопирофеофорбида а, содержащие различные заместители в пирроле А.

3.3. Бактериопурпурин - ключевое соединение в синтезе новых ФС бактериохлоринового ряда.

3.4. Циклические имиды в ряду бактериохлорофилла а.93 ■

3.5. Структурно-функциональные исследования производных бактериохлорофилла а.

3.6. Бактериопурпуринимиды с фторсодержащими заместителями и их биологическая активность.

Для населения России, которое проживает в условиях сочетанного влияния вредных факторов внешней среды, злокачественные новообразования становятся все более острой медицинской и социально-экономической проблемой.

Практически повсеместно в онкологии многие годы использовали три основных метода лечения. Два из них связаны с местным воздействием. Это хирургический метод и лучевая терапия. Третий метод - химиотерапия включает системное воздействие на организм. Однако в определенный момент стало ясно, что каждый из этих методов достиг плато эффективности, и поэтому в последние 20 лет в клинической онкологии стали бурно развиваться комплексные методы лечения, заключающиеся в сочетании местных и системных воздействий, а также исследования, направленные на оптимизацию каждого компонента сложной, иногда многоступенчатой терапии.

Приоритетным направлением становится разработка принципиально новых методов диагностики новообразований и воздействия на опухоль. Это, например, физические методы, в том числе флуоресцентная диагностика (ФД), фотодинамическая терапия (ФДТ) и борнейтронозахватная терапия (БНЗТ) рака.

Методы ФДТ и БНЗТ являются примерами бинарной терапии, когда два раздельно введенных нетоксичных агента (фотосенсибилизатор или соединение бора, с одной стороны, и лазерное излучение или поток тепловых нейтронов, с другой стороны) при встрече в клетке-мишени генерируют цитотоксические вещества, приводящие к разрушению жизненно важных структур раковых клеток и их гибели.

В настоящее время применяются в клинике или находятся на разных стадиях клинических испытаний фотосенсибилизаторы (ФС) различных классов (порфирины и их металлокомплексы, хлорины, бензопорфирины, фталоцианины и др.). Среди них особый интерес представляют природные хлорофиллы и их производные с интенсивным поглощением в красной и ближней ИК-области спектра, поскольку их терапевтическое окно поглощения (660 - 800 нм) открывает новые возможности для диагностики и лечения злокачественных новообразований. Свет с подобной длиной волны проникает в ткань на глубину до 20 мм, что позволяет проводить лечение глубокозалегающих и пигментированных опухолей.

Выбор природных пигментов для создания новых ФС обусловлен рядом причин, включая их распространенность в природе, интенсивное поглощение в длинноволновой области спектра, возможность химической модификации боковых заместителей, структурную близость к эндогенным порфиринам, что предполагает низкий уровень токсичности подобных соединений и быстрое выведение из организма.

Однако сами хлорины и бактериохлорины имеют ограниченное применение в качестве ФС из-за высокой гидрофобности, низкой химической и фотостабильности, умеренной селективности накопления в раковых клетках. Это диктует необходимость создания устойчивых производных хлоринов и бактериохлоринов с улучшенными спектральными характеристиками, повышенной гидрофильностью для растворимости в полярных растворителях и воде, обладающих значительной тропностью к опухолям.

Настоящая работа посвящена решению этих задач и является дальнейшим развитием основополагающих научных исследований в области тетрапиррольных соединений, проводимых на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР на тему:

Природные хлорофиллы и их производные: синтез, свойства и использование в фотомедицине»

Гидрированные аналоги порфиринов - хлорофиллы и бактериохлорофиллы — играют важную роль в природе, в том. числе участвуют в фотосинтезе и родственных ему процессах. Большой интерес к этим соединениям обусловлен широким спектром полезных свойств их модифицированных производных. Уникальная способность хлоринов избирательно накапливаться в опухолевых тканях и вызывать под действием лазерного облучения флуоресценцию либо фотодинамический эффект успешно используется в флуоресцентной диагностике и фотодинамической терапии злокачественных новообразований. В настоящее время границы ФДТ расширились, метод вышел за рамки онкологии и успешно применяется в различных областях медицины, включая кардиологию [1], дерматологию [2], иммунологию [3], гинекологию [4], урологию [5].

В 20-е годы прошлого века среди многих свойств злокачественных опухолей была отмечена их способность накапливать порфирины крови. Важным шагом на пути к применению ФДТ в онкологии явилось получение «производного гематопорфирина» (ПГП), которое представляет сложную смесь мономерных и олигомерных порфиринов. В зависимости от способа приготовления в разных странах ПГП получило различные фирменные названия: Фотофрин-1 и Фотофрин-2 (США), Фотосан (Германия), HPD (Китай), Фотогем (Россия).

В настоящее время применяются в клинике или находятся на разных стадиях клинических испытаний фотосенсибилизаторы различных классов (хлорины, пурпурины, производное бензопорфирина, фталоцианины). Соединения с интенсивным поглощением в ближней* ИК-области спектра привлекают особое внимание в качестве потенциальных ФС, так как их поглощение в диапазоне 650 - 850 нм открывает новые возможности для диагностики и лечения злокачественных новообразований.

Такими соединениями, поглощающими В' вышеназванном диапазоне, являются природные и синтетические хлорины и бактериохлорины.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ получения циклических имидов в ряду хлорофилла а и бактериохлорофилла а, содержащих амино- и гидроксильную группы при атоме азота экзоцикла, и изучена их реакционная способность.

2. Существенно расширен круг синтетических превращений природных хлоринов, включая взаимодействие с гетероциклическими соединениями, аминами различной природы, гидроксилсодержащими молекулами.

3. Осуществлен региоселективный синтез бактериопурпуринимидов, содержащих гидроксильную и алкокси- группы в разных положениях макроцикла, и показано влияние структуры пигментов на их биологическую эффективность.

4. Предложен новый наноструктурный инфракрасный фотосенсибилизатор на основе алкоксибактериопурпуринимида для фотодинамической терапии меланомы.

5. Получены амфифильные и водорастворимые производные природных хлоринов и показана специфика их функционирования.

6. Создан модификационный ряд катионных ФС с целью их возможного применения в антимикробной ФДТ.

7. Разработана методология получения конъюгатов природных хлоринов с молекулами других классов, включающая использование современных методов органического синтеза.

8. Синтезированы гликоконъюгаты в ряду производных хлорофилла а и бактериохлорофилла а и изучена их структура с использованием спектроскопии ЯМР.

9. Впервые получены борсодержащие конъюгаты на основе производных бактериохлорофилла а, в том числе содержащие большое количество атомов бора, что делает их перспективными фотосенсибилизаторами для проведения комбинированной ФДТ и БНЗТ рака.

1. Gross S., Gilead A., Scherz A., Neeman M., Salomon Y. Monitoring photodynamic therapy of solid tumors online by BOLD-contrast MR // Nature Medicine.-2003.-Vol. 9.-P. 1327-1331.

2. Oseroff A., Shieh S., Frawley N., Blumenson L., Parsons J.,Potter E., Graham A., Henderson B.W., Dougherty T.J. PDT for skin cancer: What do we know about how to go // 29th Annu, Meeting Am. Soc. Photobiol. Abstract. 2001. - P. 146.

3. Henderson B.W., Gollnick S.O. Mechanistic principles of photodynamic therapy // In: Biomedical Photonics Handbook, Editor T. Vo-Dinh, Boca Raton: CRC Press. 2002.

4. Keefe K.A., Tadir Y., Tromberg B., Berns M., Osann K., Hashad R.,Monk B.J. Photodynamic therapy of high-grade cervical intraepithelial neoplasia with 5-aminolevulinic acid // Lasers Surg. Med. 2002. - Vol. 31. - P. 289-293.

5. Gronlund-Pakkanen S., Pakkanen T.M., Koski E., Talja M., Ala-Opas M., Alhava E. Effect of photodynamic therapy on urinary bladder function: an experimental study with rats // Urol. Res. 2001. - Vol. 29. - P. 205-209.

6. Wilson B.C., Jeeves W.P., Lowe D.M., Adam G. Light propagation in animal tissues in the wavelength range 375-825 nanometers // Prog.Clin. Biol. Res. -1984.-Vol. 170.-P. 115-132.

7. Karmakova T., Feofanov A., Pankratov A., Kazachkina N., Nazarova A., Yakubovskaya R., Lebedeva V., Ruziyev R., Mironov A., Maurizot J.-C., Vigny

8. P. Tissue distribution and in vivo photosensitizing activity of 13,15-N-(3-hydroxypropyl)cycloimide chlorin p6 and 13,15-N-methoxycycloimide chlorin p6 methyl ester // Photochem. Photobiol. B: Biology. 2006. - Vol. 82. - P. 28-36.

9. Wainwright M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) // J. Antimicrob. Chemother. 1998. - Vol. 42. - P. 13-28.

10. Krasnovsky A.A. Primary mechanisms of photoactivation of molecular oxygen. History of development and the modern status of research // Biochemistry. 2007. - Vol. 72. - P. 1065-1080.

11. Crestini C., D'Auria M. Photodegradation of lignin: the role of singlet oxygen // J. Photochem. and Photobiol. A. 1996. - Vol. 101. - P. 69-73.

12. Seen H., Spikes J., Kopecek P. Photodynamic crosslinking of proteins. I. Model studies using histidine- and lysine-containing N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers // J. Photochem. and Photobiol. B. 1996. - Vol. 34. -P. 203-210.

13. Girotti A.W. Photodynamic lipid peroxidation in biological systems // J. Photochem. and Photobiol. 1990. - Vol. 51. - P. 497-509.

14. Piette J. New trends in photobiology: Biological consequences associated with DNA oxidation mediated by singlet oxygen // J. Photochem. and Photobiol. B. -1991.-Vol. 11.-P. 241-260.

15. Baker A., Kanofsky J. Quenching of singlet oxygen by biomolecules from L1210 leukemia cells // J. Photochem. and Photobiol. 1992. - Vol. 55. - P.523-528.

16. Moan J. On the diffusion length of singlet oxygen in cells and tissues // J. Photochem. and Photobiol. B. 1990. - Vol. 6. - P. 343-344.

17. Daziano J., Steenken S., Chabannon C., Mannoni P., Chanon M., Julliard M. Photophysical and Redox Properties of a Series of Phthalocyanines: Relation with

18. Their Photodynamic Activities on TF-1 and Daudi Leukemic Cells // Photochem. and Photobiol. 1996. - Vol. 64. - P. 712-719.

19. Takemura Т., Ohta N., Nakajima S., Sakata I. Critical importance of the triplet lifetime of photosensitizer in photodynamic therapy of tumor. // Photochem. and Photobiol. 1989. - Vol. 50. - P. 339-344.

20. Spiller W., Kliesch H., Wohrle D., Hackbarth S., Roder В., Schnurpfeil G. Singlet oxygen quantum yields of different photosensitizers in polar solvents and micellar solutions // Porphyrins and Phthalocyanines. 1998. - Vol. 2. - P. 145158.

21. Goff B.A., Bamberg M., Hasan T. Photoimmunotherapy of human ovarian carcinoma cells ex vivo // Cancer Res. 1991. - Vol. 51. - P. 4762-4767.

22. Reddi E. Role of delivery vehicles for photosensitizers in the photodynamic therapy of tumours // J. Photochem. and Photobiol. B. 1997. - Vol. 37. - P. 189195.

23. Sears P., Wong C.H. Carbohydrate mimetics: a new strategy for tackling the problem of carbohydrate-mediated biological recognition // Angew. Chem., Int. Ed. 1999. - Vol. 38. - P. 2301-2324.

24. Krasnovsky A.A., Neverov K.V., Egorov S.Yu., Roder B., Lewald W. Photophysical studies of pheophorbide a and pheophytin a phosphorescence and photosensitized singlet oxygen luminescence // J. Photochem. Photobiol. B-Biol. -1990i - Vol. 5. - P. 245-254.

25. Hynninen P.H. Multiple liquid-liquid partition: II. Theory of Martin-Synge distribution (MSD) // Acta Chem. Scand. 1973. - Vol. 27. - P. 1771-1780i

26. Hynninen P.H., Wasielewski M.R., Katz J.J. Chlorophylls VI. Epimerization and enolization of chlorophyll'a and its magnesium free derivatives // Acta Chem. Scand. B. 1979. - Vol. 33. - P. 637-648.

27. Gaffar R., Kermasha S., Bisakowski B. Biocatalysis of immobilized chlorophyllase in a ternary micellar system // J. Biotechnology. 1999. - Vol. 75. - P. 45-55.

28. Scherz A., Salomon Y., Fiedor L. Preparation of chlorophyll" and bacteriochlorophyll conjugates and their applications as photosensitizers in photodynamic therapy and general diagnostics // 1994, EP Appl 584552.

29. Weller A., Livingston R. The reaction of chlorophyll in amines // J. Am. Chem. Soc. 1954. - Vol. 76. - P. 1575-1578.

30. Willstater R., Stoll A. Untersuchungen uber chlorophyll // In Chlorophyll; Springer: Berlin. 1913.

31. Hynninen P. H. Mechanism of the allomerization of chlorophyll: the inhibition of the allomerization by carotenoids pigments // Z. Naturforsch. 1981. - Vol. 36b.-P. 1010-1016.

32. Seely G.R. The structure and chemistry of functional groups. // In "The Chlorophylls" L.P. Vernon, G.R. Seely. Academic Press. New York, London. -1966.-P. 67-109.

33. Hynninen P.H. Chemistry of chlorophylls: modifications // In: Chlorophylls, Ed. H. Scheer, CRC Press, Boca Raton AnnArbor. Boston, London. 1991. - P. 145-209.

34. Lötjönen S., Hynninen P.H. A convenient method for the preparation of chlorin and rhodin g7 trimethyl esters // Synthesis. 1980. - P. 541-543.

35. Миронов А.Ф. Разработка сенсибилизаторов второго поколения, на основе природных хлорофиллов // Российский хим. журнал. 1998. - С. 2326.

36. Belykh D.V., Karmanova L.P., Spirikhin L.V., Kuchin A.V. Synthesis of amide derivatives of chlorin e6 // Russ. J. Org. Chem. 2007. - Vol. 43. - P. 126134.

37. Sternberg E.D., Dolphin D., Brückner С. Porphyrin-based photosensitizers for use in photodynamic therapy // Tetrahedron. 1998. - Vol. 54. - P. 4151-4202.

38. Mody T.D. Pharmaceutical development and medical applications of porphyrin-type macrocycles // J. Porphyrins and Phthalocyanines. 2000. - Vol. 4.-P. 362-367.

39. Pandey R.K. Recent advances in photodynamic therapy // J. Porphyrins and Phthalocyanines. 2000. - Vol. 4. - P. 368-373.

40. MacDonald I., Dougherty T.J. Basic principles of photodynamic therapy // J. Porphyrins and Phthalocyanines. 2001. - Vol. 5. - P. 105-129.

41. Taber S.W., Fingar V.H., Coots C.T., Wieman T.J. Photodynamic therapy using mono-L-aspartyl chlorine // Clin. Cancer. Res. 1998. - Vol. 4. - P. 27412746.

42. Spikes J.D., Boomer J.C. Chlorophyll and related pigments as photosensitizers in biology and medicine // In: Chlorophylls, Scheer H. Ed. CRC Press: Boston. -1996. -P. 1182-1204.

43. Bommer J., Ogden B. F. Tetrapyrrole therapeutic agents // U. S. Patent 4,693,885, Sept 15, 1987.

44. Gomi S., Nishizuka T., Ushiroda O., Takahashi H., Sumi S. The structures of mono-L- aspartyl chlorin e6 and its related compounds // Heterocycles. 1998. -Vol. 48.-P. 2231-2243.

45. A Thesis of J.A. Hargus. Naturally-derives porphyrin and chlorine photosensitizers for photodynamic therapy // Louisiana State University, December 2005.

46. Belykh D.V., Tarabukina, Gruzdev I.V., Kodess M.I., Kuchin A.V. Aminomethylation of chlorophyll a derivatives using bis(N,N-dimethylamino) methane // J. Porphyrins and Phthalocyanines. 2009. - Vol. 13. - P. 949-956.

47. Kuchin A.V., Ol'shevskaya V.A., Mal'shakova M.V., Belykh D.V., Petrovskii P.V., Ivanov O.G., Shtil A.A., Kalinin V.N. New carborane derivatives of chlorin e6 // Doklady Chemistry. 2006. - Vol. 409. - P. 135-138.

48. Pandey R.K., Bellnier D.A., Smith K.M., Dougherty T.J. Chlorin and porphyrin derivatives as potential photosensitizers in photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. 1991. - Vol. 53. - P. 65-72.

49. Bellnier D.A., Henderson B.W., Pandey R.K., Potter W.R., Dougherty T.J. Murine pharmacokinetics and anti- tumor efficacy of the photodynamic sensitizers // J. Photochem. Photobiol. 1993. - Vol. 20. - P. 55-61.

50. Kenner G.W., McCombie S.W., Smith K.M. Separation and oxidative degradation of chlorophyll derivatives // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1. 1973. -P. 2517-2523.

51. Kozyrev A.N., Dougherty T.J., Pandey R.K. LiOH protonated allomerization of pyropheophorbide a. A convenient synthesis of 132-oxopyropheophorbide a and its unusual enolization // Chem. Commun. 1998. - P. 481-482.

52. Pandey R.K., Goswami L.N., Chen Y., Gryshuk A., Missert J.R., Oseroff A., Dougherty T.J. Tumor-imaging and photodynamic therapy // Lasers in Surgery and Medicine. 2006. - Vol. 38. - P. 445-467:

53. Profio A.E. Review of Fluorescence Diagnosis Using Porphyrins // Proc. SPIE. 1988. - Vol. 907. - P. 150-156.

54. Monnier Ph., Savary M., Fontolliet C.H. Photodetection and photodynamic therapy of 'early' squamous cell carcinomas of the pharynx, oesophagus and tracheo-bronchial tree // Lasers in Med. Science. 1990. - Vol. 5. - P. 149-169.

55. Scherz A., Brandis A., Mazor O., Salomon Y., Scheer H. Water-soluble bacteriochlorophyll derivatives and their pharmaceutical uses // PCT/IL Appl 152900.-2002.

56. Scherz A., Salomon Y., Fiedor L. Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmacological compositions comprising them //US Pat 5,650,292.- 1997.

57. Kozyrev A.N., Alderfer J.L., Dougherty T.J., Pandey R.K. Synthesis of verdinochlorins: A new class of long-wavelength absorbing photosensitizers // Chem. Commun. 1998. - P. 1083-1084.

58. Fuhrhop J.H. Irreversible reactions on the porphyrin periphery (excuding oxidations, reductions and photochemical reactions) // In: The Porphyrins, ed. D. Dolphin, Elsevier. 1978. - P. 131-159.

59. Fischer H., Ebersberger J. Über Mesorhodin und seinen Übergang zu Chlorophyll porphyrinen, sowie Oxydation des Phylloerythrins // Justus Liebigs Ann. Chem. 1934. - Vol. 509. - P. 19-37.

60. Morgan A.R., Rampersaud A., Keck R.W., Selmam S.H. Verdins: new photosensitizers for photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. 1987. -Vol. 46.-P. 441-444.

61. Sakata G., Makino K. Recent progress in the quinoxaline chemistry synthesis and biological activity // Heterocycles. - 1988. - Vol. 27. - P. 2481-2515.

62. Sessler J.L., Hemmi G., Mody T.D., Murai T., Burrel A., Young S.W. Texaphyrins: synthesis and applications // Ass. Chem. Res. 1994. - P. 43-50.

63. Smith K.M., Goff D.A., Simpson D.J. Meso- substitution of chlorophyll derivatives: direct route for transformation of bacteriopheophorbides d into bacteriopheophorbides c // J. Am. Chem. Soc. 1985. - Vol. 107. - P. 4946-4954.

64. Sasaki S., Mizutani K., Kunieda M., Tamiaki H. Synthesis, modification and optical properties of C3-ethynylated chlorophyll derivatives // Tetrahedron Letters. 2008. - Vol. 49. - P. 4113-4115.

65. Kolb H.C., Sharpless B. The growing impact of click chemistry on drug discovery // Drug Discovery Today (DDT). 2008. - Vol. 24. - P. 1128-1137.

66. Kozyrev A.N., Alderfer J.L., Robinson В. Pirazolinyl and' cyclopropyl' derivatives of protoporphyrin IX and, chlorins related to chlorophyll a // Tetrahedron. 2003. - Vol. 59. - P. 499-504.

67. Vicente M.G.H. Reactivity and functionalization of ß-substituted porphyrins and chlorins // The Porphyrin Handbook: Kadish K.M., Smith K.Ml, Guilard R. Eds.'.Academic. New York. 2000. - Vol. 1. - P. 149-199i

68. Chatterjee A.K., Morgan J.P., Scholl M., Grubbs R.H. Synthesis of functionalized olefins by cross and ring-closing metatheses // J. Am. Chem. Soc. -2000. Vol. 122. - P. 3783-3784.

69. Lin X., Sternberg E., Dolphin D. Cross-metathesis reactions of vinyl- chlorins* and porphyrins catalyzed by a "second generation" Grubbs1 catalyst // Chem. Commun. 2004. - P. 852-853.

70. Fischer H., Stern A. Die chemie des pyrrols // Academ. Verlags.: Leipzig. -1940.-Vol. 2. P. 108'.

71. Kenner G.V., McCombie S.W., Smith K.M. Pyrroles and related compounds // J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. 1973. - P. 2517-2523.

72. Lee S-J. H., Jagerovic N., Smith K.M. Use of the chlorophyll derivative, purpurin-18 for syntheses of sensitizers for use in photodynamic therapy // J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. 1993. - P. 2369-2377.

73. Mironov A.F., Kozyrev A.N., Brandis A.S. Sensitizers of second generation for photodynamic therapy of cancer based on chlorophyll' and bacteriochlorophyll derivatives // Proc. SPIE. 1993. - Vol. 1922. - P. 204-208.

74. Zenkevich E., Sagun E., Knyukshto V., Shulga A., Mironov A., Efremova O., Bonnett R., Pinda Songca S., Kassem M. New fluorinated photosensitizers based on tetrakis (hydroxyphenyl) porphyrins // J. Photochem. Photobiol. B. 1996. -Vol. 33.-P. 171-180.

75. Физер M., Физер Л. Реагенты для органического синтеза // М.: Мир. -1975.-Т. 6.-С. 186.

76. Mironov A.F., Efremov A.V., Efremova O.A., Bonnett R., Martinez G. Chlorins with an exocyclic 8-lactone ring and their derivatives // J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. 1998. - P. 3601-3608.

77. Pandey R.K., Shiau F.-Y., Sumlin A.B:, Dougherty T. J., Smith K. M. Syntheses of new bacteriochlorins and their antitumor activity // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994. - Vol. 4. - P. 1263-1267.

78. Kozyrev A.N., Zheng G., Zhu C.F. Synthesis of stable bacteriochlorophyll a derivatives as potential photosensitizers for photodynamic therapy // Tetrahedron Letters. 1996. - Vol. 37. - P. 6431-6434.

79. Mironov A.F., Lebedeva V.S., Efremova O.A. Int. Simp. "Problems and Trends of Photobiochemistry". Moscow. - 1997. - P. 47.

80. Mironov A.F., Lebedeva V.S., Yakubovskaya R.I. Abstract Book of the "BIOS Europe-98". 1998. - P. 37.

81. Prakash S, Yudin A.K. Perfluoroalkylation with organosilicon reagents // Chem. Rev. 1997. - Vol. 97. - P. 757-786.

82. Banks R.E., Smart B.E., Tatlow J.C. Fluorinated inhalation anesthetics // Organofluorine chemistry principles and commercial applications. Plenum Press: - New York. - 1994.

83. Gryshuk A.L., Graham A., Pandey S.K., Potter W.R., Missert J.R., Oseroff A., Dougherty T.J., Pandey R.K. Nonfluorinated photosensitizers for photodynamic therapy // Photochem. and Photobiology. 2002. - Vol. 76. - No. 5. - P. 555-559.

84. Barondes S. H., Castronovo V., Cooper D.N.W., Cummings R. D., Drickamer K., Feizi T., Gitt M. A., Hirabayashi J., Hughes C., Kasai K., Leffler H., Liu F., Lotan R., Mercurio A. M., Monsigny M., Pillai S., Poirer F., Raz A., Rigby

85. P.W.J., RiniJ. M., Wang J.L. Galectins: a family of animal f3-galactoside-binding lectins // Cell. 1994. - Vol. 76. - P.1 597-598.

86. Zheng G., Dougherty T. J., Pandey R. K. Novel chlorin-diene building block by enyne metathesis: synthesis of chlorin-fullerene dyads // Chem. Commun. -1999. P. 2469-2470.

87. Mironov A.F., Lebedeva V.S., Yakubovskaya R.I:, Kazachkina Nil., Fomina G.I. Chlorins withsix-membered imide ring as prospective sensitizers for cancer PDT // Proc SPIE. 1999.! - Vol. 3563. - P. 59-67.

88. Feofanov A.V., Grichine A., Karmakova T., Pljutinskaya T., Lebedeva V.,i

89. Lebedeva V.S., Ruziev R.D., Popov A.V., Sebyakin Y.L., Mironov A.F. Synthesis of glycoconjugated chlorin p6 cycloimide // Mendeleev Commun. -2007.-Vol. 17.-P. 212-213.

90. Pandey R.K., Zheng G. Porphyrins as Photosensitizers in Photodynamic Therapy // Edited by Karl M. Kadish; Kevin M. Smith and Roger Guilard. The Porphyrin Handbook. 2000. - P. 157-230.

91. Eisner U. Some novel hydroporphyrins // 'J.Chem. Soc. 1957. - P. 3461 -3469.

92. Scheer H. Chlorophylls // CRC Press, Boca Raton Ann Arbor. Boston London. - 1991.

93. Миронов А.Ф., Ефремов A.B. Патент РФ «Способ получения бактериохлорофилла а» №2,144.085 12.07. 1996.

94. Tsygankov A.A., Laurinavichene T.V., Gogotov I.N. Laboratory scale photobioreactor // Biotechnol. Tech. 1994. - Vol. 8 - P. 575-578.

95. Tsygankov A.A., Laurinavichene T.V., Bukatin V.E., Gogotov I.N., Hall D.O. Biomass production by continuous cultures of Rhodobacter capsulatus grown in various bioreactors // Biochem. Microbiol. 1997. - Vol. 33. - P. 485490.

96. Bonnett R. Chemical Aspects of Photodynamic Therapy // Gordon and Breach Science Publishers. UK. - 2000.

97. Fiedor L., Rosenbach-Belkin V., Sai M., Scherz A. Preparation of tetrapyrrole-amino acid covalent complexes // Plan. Physiol. Biochem. 1996. -Vol. 34. - P. 393-398.

98. Scherz A., Salomon Y., Brandis A., Scheer H. Palladium-substituted bacteriochlorophyll derivatives and use there of// PCT Pat WOOO/33833. 2000.

99. Henderson B.W., Sumlin A.B., Owcharczak B.L., Dougherty T.J. Bacteriochlorophyll a as photosensitiser for photodynamic treatment of transplantable murine tumors // Photochem. Photobiol. B-Biol. 1991. - Vol. 10. -P. 303-313.

100. Vakrat-Haglili Y., Weiner L., Brumfeld V., Brandis A., Salomon Y., Mcllroy B., Wilson B.C., Pawlak A., Rozanowska M., Sarna T., Scherz A. // J. Am. Chem. Soc. 2005. - Vol. 127. - P. 6487-6497.

101. Sasaki S., Tamiaki H. Synthesis and optical properties of bacteriochlorophyll-a derivatives having various C3-substituents on the bacteriochlorin 7i-system // J. Org. Chem. 2006. - Vol. 71. - No. 7. - P. 26482654.

102. Mironov A.F., Kozyrev A.N., Brandis A.S. Sensitizers of second generation for photodynamic therapy of cancer based on chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives// Proc. SPIE. 1992. - Vol. 1922. - P. 204-208.

103. Fischer, H., Lambrecht R., Mittenzwei H. Z. Physiol. Chem. - 1939. - Vol. l.-P. 253.

104. Hartwich G., Fiedor L., Simonin I.,.Cmiel E., Schafer W., Noy D., Scherz A., ScheerH1. Metal-substituted bacteriochlorophylls. 1. Preparation and influence of metal and'coordination on, spectra // J. Am. Chem. Soc. 1998. - Vol. 120. - P. 3675-3683.

105. Waielewski M.R., Svec W.A. Synthesis of covalently linked dimeric derivatives of chlorophyll a, pyrochlorophyll a1, chlorophyll b, and bacteriochlorophyll a // J. Org. Chem. 1980. - Vol: 45. - P. 1969-1974.

106. Gryshuk A.L., Chen Y., Potter W., Ohulchansky T., Oseroff A., Pandey R.K. In vivo stability and photoidynamic efficacy of fluorinated bacteriopurpurinimides derived from* bacteriochlorophyll-a // J. Med. Chem. -2006.-Vol. 49.-P. 1874-1881.

107. Kessel D:, Luo Y., Deng Y., Chang C. K. The role of subcelular localization in initiation of apoptosis by photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. -1997. Vol. 65. - No. 3. - P. 422-426.

108. Almeida R. D., Manadas B. J., Carvalho A. P., Duarte С. B. Intracellular signaling mechanisms in photodynamic therapy // Biochim. Biophys. Acta. -2004. P. 59-86.

109. Mironov A.F., Grin M.A., Nochovny S.A., Toukach F.V. Novel cycloimides in the chlorophyll a series // Mendeleev Commun. 2003. - Vol. 13. - No. 4. - P. 156-158.

110. Mironov A.F., Grin M.A., Tsiprovskiy A.G., Kachala V.V., Karmakova T.A., Plyutinskaya A.D., Yakubovskaya R.I. New bacteriochlorin derivatives with a fused N-aminoimide ring // J. Porphyrins Phthalocyanines. 2003. - Vol. 7. - P. 725-730.

111. Remy D.E., Whitfield R.E., Needles H.L. Study of the decomposition rates of aqueous peroxydisulphate in the presence of selected amides and N-acetylamino-acids // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1967. - P. 681-695.

112. McCarthy A.R., Ollis W.D., Barnes A.N. Cyclic meso-ionic compounds. Part VI. Synthesis, spectroscopic properties, and dipole moments of the isosydnones // J. Chem. Soc. (B). 1969. - P. 1185-1193.

113. Belnaik K., Domagaliva E., Nopkala H. Cyclic hydrazides of dicarboxylic aromatic and heterocyclic acids. VI. Sulfamide and sulfhydrazide derivatives of the phthalazine series // Roczniki Chem. 1967. - Vol. 41. - P. 831-843.

114. Миронов А.Ф., Грин M.A., Ципровский А.Г., Дзарданов Д.В., Головин К.В., Феофанов А.В., Якубовская Р.И. Гидразиды в ряду бактериохлорофилла а, обладающие фотодинамической активностью, и способ их получения. Патент РФ № 2223274. - 2004 г.

115. Yoshikawa Т.Т. Antimicrobial resistance and aging: beginning of the end of the antibiotic era// Am. Geriatr. Soc. 2002. - Vol. 50 (7 Suppl). - P. 226-229.

116. Sanglard D. Resistance of human fungal pathogens to antifungal drugs // Curr. Opin. Microbiol. 2002. - Vol. 5. - No. 4. - P. 379-385.

117. Malik Z., Hanania J., Nitzan Y. Bactericidal effects of antimicrobial drugs // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1990. - Vol. 5. - P. 281-293.

118. Hawthorne M. . F. The Role of Chemistry in the Development of Boron Neutron Capture Therapy of Cancer // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1993. - Vol. 32. - P. 950-984. ' 1

119. Soloway A. I-I., Tjarks W., Barnum B. A., Rong F.-G., Barth R. F., Codogni I: Mi, Wilson J:, G; The chemistry of neutron capture therapy // Chem. Rev. -1998.-Vol. 98.-P. 1515-1562.

120. Bregadze V. I., Sivaev I. B:, Glazun S. A. Polyhedral boron compounds as potential diagnostic and therapeutic antitumor agents // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 2006. - Vol. 6. - P. 75-109.

121. Bregadze V. I., Sivaev I. B., Gabel D., Wohrle D. Polyhedral boron derivatives of porphyrins and phthalocyanines // J. Porphyrins and Phthalocyanines. 2001. - Vol. 5. - P. 767-781.

122. Renner M. W., Miura M., Easson M. W., Vicente M. G. H. Recent Progress in the Syntheses and Biological Evaluation of Boronated Porphyrins for Boron Neutron-Capture Therapy // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 2006. -Vol. 6.-P. 145-157.

123. Fabris C., Jori G., Giuntini F., Roncucci G. Photosensitizing properties of a boronated phthalocyanine: studies at the molecular and cellular level // Photochem. Photobiol. 2001. - Vol. 64. - P. 1-7.

124. Tsaiyova O., Semioshkin A., Wohrle D., Bregadze V. Novel Polyhedral Boron Derivatives of Phthalocyanines // Porphyrins Phtalocyanines. 2005. -Vol. 9. - P. 268-274.

125. Grin M.A., Semioshkin A.A., Titeev R.A., Nizhnik E.A., Grebenyuk J.N., Mironov A.F., Bregadze V.I. Synthesis of a cycloimide bacteriochlorin p conjugate with the closo-dodecaborate anion // Mendeleev Commun. 2007. -Vol. 17.-No. l.-P. 14-15.

126. Sivaev I. B., Bregadze V.I. Chemistry of cobalt bis(dicarbollides).A review // Collect. Czech. Chem. Commun. 1999. - Vol. 64. - P. 783-805.

127. Sivaev I. B., Starikova Z. A., Sjoberg S., Bregadze V. I. Synthesis of functional derivatives of 3,3'-Co(l,2-C2B9Hn)2. anion // J. Organomet. Chem. - 2002.-Vol. 649. - P. 1-8.

128. Olejniczak A. B., Plesek J., Kriz O., Lesnikowski Z. A Nucleoside Conjugate Containing a Metallacarborane Group and Its Incorporation into a DNA Oligonucleotide // J. Angew. Chem. Int. Ed. 2003. - Vol. 42. - P. 5740-5743.

129. Olejniczak А. В., Plesek J., Lesnikowski Z. Nucleoside conjugate containing metallacarborane group and its incorporation into DNA-oligonucleotide // Chem. Eur. J. 2007.-Vol. 13.-P. 311-318.

130. Hao E., Vicente M. G. H. Expeditious synthesys of porphyrin-cobaltocarborane conjugates // Chem. Commun. 2005. — P. 1306.

131. Hao E., Jensen T. J., Courtney В. H., Vicente M. G. H. Synthesis and Cellular Studies of Porphyrin-Cobaltacarborane Conjugates // Bioconjugate Chem. 2005. - Vol. 16. - P. 1495-1502.

132. Hao E., Sibrian-Vazquez M., Serem W., Garno J. C., Fronczek F. R.„Vicente M. G. H. Enhanced cellular uptake with a cobaltacarborane-porphyrin-HIV-1 Tat 48-60 conjugate // Chem. Eur. J. 2007. - Vol. 13. - P: 9035-9039.

133. Mironov A.F., Grin M.A., Tsiprovskiy A.G. Synthesis of the first N-hydroxycycloimide in bacteriochlorophyll a series // J. Porphyrins Phthalocyanines. 2002. - Vol. 6. - No. 5. - P. 358-361.

134. Лебедева B.C. Синтез сенсибилизаторов второго поколения с функциональными группами для получения конъюгатов направленногодействия к злокачественным опухолям // Диссертация на соиск. уч. степени канд. хим. наук. Москва. - 1999.

135. Меерович И.Г., Грин М.А., Меерович Г.А., Ципровский А.Г., МассI

136. Mironov A.F., Grin М.А., Dzardanov D.V., Golovin K.V., Shim Y.K. Synthesis of a vinyl-containing analogue of bacteriochlorophyll a // Mendeleev Commun. 2001. - Vol. 11. - No. 6. - P. 205-206.

137. Grin M.A., Mironov A.F., Shtil A.A. Bacteriochlorophyll a and Its Derivatives: Chemistry and Perspectives for Cancer Therapy // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 2008. - Vol. 8. - No. 6. - P. 683-697.

138. Mironov A.F., Grin M.A. Synthesis of Chlorin and Bacteriochlorin Conjugates for Photodynamic and Boron Neutron Capture Therapy // J. Porphyrins Phthalocyanines. 2008. - Vol. 12. - P. 1163-1172.

139. Wang Q., Chan T.R., Hilgraf R., Fokin V.V., Sharpless K.B., Finn M.G. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne 3+2. cycloaddition // JACS.- 2003.-Vol. 125.-P. 3192-3193.

140. Chen Q., Yang F., Du Y. Synthesis of a C3-symmetric (l-6)-N-acetyl-|3-D-glucosamine octadecasaccharide using click chemistry // Carbohydrate Research.- 2005. Vol. 340. - P. 2476 - 2482.

141. Link A.J., Tirrell D.A. Cell Surface Labeling of Escherichia coli via copper(I)-catalyzed 3+2. cycloaddition// JACS. 2003. - Vol. 125. - P. 1116411165.

142. Silva A.M.G., Tome A.C., Neves M.G.P.M.S., Cavaleiro J.A.S., Perrone D., Dondoni A. Porphyrins in 1,3-Dipolar Cycloadditions with Sugar Azomethine Ylides. Synthesis of Pyrrolidinoporphyrin Glycoconjugates. // Synlett. 2005. - P. 857-859.

143. Bock V.D., Hiemstra H., Maarseveen J.H. Cul-catalyzed alkyne-azide "click" cycloadditions from a mechanistic and synthetic perspective // Eur. J. Org. Chem. 2006.-P. 151-167.

144. Grin M.A., Lonin I. S., Makarov A.I., Lakhina A.A., Toukach F.V., Kachala V.V., Orlova A.V., Mironov A.F. Synthesis of chlorin-carbohydrate conjugates by "click chemistry // Mendeleev Commun. 2008. - Vol. 18. - No. 3. - P. 135-137.

145. Dieck H.A., Heck F.R. Palladium Reagents in Synthesis // J. Organomet. Chem. 1975. - Vol. 93. - P. 259-263.

146. Cassar L. Synthesis of aryl- and'vinyl-substituted acetylene derivatives by the use of nickel and palladium complexes // J. Organomet. Chem. 1975. - Vol. 93. - P. 253-257.

147. Sonogashira K., Tohda Y., HagiharaN. A convenient synthesis of acetylenes: catalytic substitutions of acetylenic hydrogen with bromoalkenes, iodoarenes and-bromopyridines // Tetrahedron Lett. 1975. - Vol. 16. - P. 4467-4470.

148. Sonogashira K.,Pd-catalyzed cross-coupling reaction // In: Metal-catalyzed cross-coupling reactions Eds: F. Diederich, P.J. Stang, Eds Wiley-VCH. -Weinheim, Germany. 1998. - P. 203-229.

149. Marsden J.A., Haley M.M. Cross-coupling reactions to sp carbon atoms // In: Metal-catalyzed cross-coupling reactions. A. de Meijere, F. Diederich, Eds: Wiley-VCH. Weinheim, Germany. - 2004. - P. 319-345.

150. Wagner R.W., Ciringh Y., Clausen C., Lindsey J.S. Investigation and Refinement of Palladium-Coupling Conditions for the Synthesis of Diarylethyne-Linked Multiporphyrin Arrays // Chem. Mater. 1999. - Vol. 11. - P. 2974-2983.

151. Chaignon F., Torroba J., Blart E., Borgstrom M., Hammarstrom L., Odobel F. Distance-independent photoinduced energy transfer over 1.1 to 2.3 nm in ruthenium trisbipyridine-fullerene assemblies // New J. Chem. 2005. - Vol. 29. -P. 1272-1284.

152. Etheve-Quelquejeu M., Tranchier J.-P., Rose-Munch F., Rose E., Naesens L., Clereq E.D. n6-(Arene)tricarbonylchromium and Manganese Complexes Linked to 2'-Deoxyuridine // Organometallics. 2007. - Vol. 26. - P. 5727-5730.

153. Sasaki Т., Morin J.-F., Lu M. Synthesis of a Single-Molecule Nanotruck // J. M. Tour. Tetrahedron Letters. 2007. - Vol. 48. - P. 5817-5820.

154. Bregadze V.I., Sivaev I.B., Lobanova I.A., Titeev R.A., Brittal D.I., Grin M.A., Mironov A.F. Conjugates of boron clusters with derivatives of natural chlorin and bacteriochlorin // Applied Radiation and Isotopes. 2009. - Vol. 67 -P. 101-104.

155. Gottlieb H.E., Kotlyar V., Nudelman A. NMR chemical shifts of common laboratory solvents as trace impurities // J. Org. Chem. 1997. - Vol. 62. - P. 7512-7515.