Синтез и изучение фрагментов РНК-полимеразы вируса гриппа A тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правахрукописи

Матусевич Олег Владимирович

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ВИРУСА ГРИППА А

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 7 ИЮЛ 2014

Санкт-Петербург - 2014 005550522

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Научный руководитель:

Титов Михаил Иванович

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Позднев Владимир Федорович,

доктор химических наук,

главный научный сотрудник

ФГБУ НИИ биомедицинской химии имени

В.Н.Ореховича (г. Москва)

Сидорова Мария Владимировна, кандидат химических наук, руководитель лаборатории синтеза пептидов ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава РФ (г. Москва)

Ведущая организация:

ФГБУ Институт молекулярной генетики РАН (г. Москва)

Защита состоится 2 октября 2014 г. в 15 часов на заседании совета Д 212.232.28 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Средний пр., д. 41/43, Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А. М. Горького, СПбГУ, Университетская наб., д. 7/9 и на сайте www.spbu.ru

Автореферат разослан " (¿¿ОЛЛ- 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

/В.Н.Сорокоумов/

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы.

В настоящее время выбор препаратов для терапии инфекционных заболеваний, вызванных вирусами гриппа, весьма ограничен. Высокая изменчивость вируса и развитие резистентности к уже существующим препаратам диктуют необходимость разработки противовирусных препаратов нового поколения.

Для профилактики и лечения гриппа используют вакцины, интерфероны и их индукторы, а также препараты, непосредственно воздействующие на вирусные белки. К последним относятся четыре препарата, одобренных агенством FDA: два ингибитора нейраминидазы - занамивир и осельтамивир и два блокатора протонного канала М2 - амантадин и ремантадин. Препарат рибавирин, несмотря на широкий спектр противовирусной активности, используется при гриппе лишь по жизненным показаниям вследствие большого количества побочных эффектов.

Геном вируса гриппа А кодирует 16 белков, которые могут быть потенциальными лекарственными мишенями: гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матричный белок 1 (М1), протонный канал М2, нуклеопротеин (NP), неструктурный белок 1 (NS1), ядерный экспортный белок (NEP или NS2), белки М42, PB1-F2, PB1-F3 (N40), РА-Х, PA-N155, PA-N182, а также три белка, составляющие РНК-полимеразу - РВ1, РВ2 и РА. Несмотря на наличие в жизненном цикле вируса множества потенциальных мишеней для специфической химиотерапии, на сегодняшний день использованы немногие из них.

Перспективной мишенью для химиотерапии гриппа являются консервативные белки: использование таких мишеней может позволить в значительной степени избежать проблемы формирования резистентности к препаратам. Одной из таких мишеней, не задействованной в современных препаратах, использующихся в клинической практике, в случае вируса гриппа А является фермент РНК — полимераза, катализирующий синтез вирусной РНК. Белки, составляющие этот фермент - РВ1, РВ2 и РА, являются консервативными. Сборка фермента осуществляется путем межмолекулярного взаимодействия этих белков (Рис. 1).

Рис. 1 Схема структурной организации РНК-полимеразы вируса гриппа Косыми линиями показаны взаимодействующие участки субъединиц.

Белок РВ1 является ключевым компонентом полимеразного комплекса, так как содержит активный центр фермента, а также два домена, взаимодействующих с субъединицами РВ2 и РА.

Цель работы: поиск пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ1, подавляющих репликацию вируса гриппа А. Для достижения поставленной цели в работе были решены следующие задачи:

1. выбор пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ1;

2. разработка синтеза целевых соединений;

3. тестирование синтезированных пептидов;

4. модификация наиболее активных соединений с целью увеличения их биологической активности.

Научная новизна исследования:

1. Разработан синтез 34 ранее неизвестных пептидов — фрагментов белка РВ1 РНК-полимеразы вируса гриппа А.

2. На основании изучения противовирусной активности синтезированных соединений на культуре клеток МОСК. в отношении пандемического вируса гриппа А/СаНГогша/07/2009 (НШ1) рс!т09 впервые показано, что пептиды - фрагменты 6-13, 6-14, 26-30, 395-400, 531-540 белка РВ1, а также их производные эффективно подавляют репликацию вируса гриппа.

3. Изучение флуоресцентно-меченого фрагмента 6-14 белка РВ1 показало, что препарат действует внутри клетки на ранних стадиях репликации вируса гриппа.

Практическая ценность работы. В ряду синтезированных пептидов выявлены соединения с высокой противовирусной активностью, которые могут быть использованы в качестве основы для создания лекарственных препаратов для профилактики и лечения гриппа А. Получен патент на пептид, обладающий высокой противовирусной активностью.

На защиту выносятся положения и результаты проведенного исследования, включающие:

1. выбор пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ1, входящего в состав РНК-полимеразы вируса гриппа А;

2. синтез 34 пептидов - фрагментов белка РВ1 РНК-полимеразы вируса гриппа А;

3. на основании изучения противовирусной активности синтезированных пептидов выявлены соединения, эффективно подавляющие репликацию пандемического вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1) pdm09 в культуре клеток MDCK.

Личный вклад автора. Основная часть работы выполнена автором самостоятельно. Она включает в себя непосредственное получение экспериментальных данных, разработку методологии исследования и интерпретацию полученных результатов, формулировку цели, задач и выводов данной работы, написание и публикацию статей.

Апробация диссертационной работы. Материал диссертации был представлен на 4 конференциях и 2 симпозиумах, как российских, так и международных. По теме диссертации опубликованы 2 статьи, 1 патент, тезисы 7 докладов.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 127 страницах, содержит 37 таблиц и 22 рисунка. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, заключения, списка цитированной литературы из 192 наименований.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю, профессору М.И. Титову, коллективу лаборатории синтеза пептидов: И.А. Глуздикову, С.К. Никольской, И.И. Елисееву, A.A. Краснощек, сотрудникам НИИ Гриппа: О.И. Киселеву, В.В. Зарубаеву, A.A. Штро, В.В. Егорову, Ю.П. Гармаю, A.B. Слите, М.И. Дюкову за неоценимую помощь и поддержку при выполнении диссертационной работы.

2. Основные результаты и их обсуждение

Для поиска новых пептидных противовирусных препаратов из аминокислотной последовательности белка РВ1 (штамм A/Hong Kong/156/97(H5Nl)) были выбраны выделенные на рисунке 2 области: 1-30, 111-130, 271-290, 381-420, 525-540. Эти консервативные области высокопатогенного штамма H5N1 и наиболее актуального A/Caüfornia/07/2009 (H1N1) pdm09 отличаются лишь на 1 неэквивалентную замену Metll9Val.

1 MVriPTLLFLKVPAQIIAISTTFP-iTGDPPYSHGTGTGrn-roTVIlRTHQYSEKGRVnTtlTE 60

61 TGAPQLNPIDGPLPEDNEPSGYAQTDCVbEÄMAFLEESHPGLFENSCLETmEWQQTRMD 120

121 KLTQGRQTYDWTLNRNQPAATALAHTXEVFRSHGLTANESGRLIDFLKDVMESMDKEEME ISO

181 ITTHFQRKRRVRDHKTKKI-IVTQRTIGKKKQRLTKKSYLIRALTIiNTMrKDAERGKr.KRRA 240

241 IATPa-IQIRGFVHr^EALARSICEKLEQSGLPVGGNEKH^KLAirWRKia-fniSQDTELSF 300

301 TVTGDNTKWNENQNPRIFLAMITYITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFESK 360

361 Sl«LRTQlPAEHLANIDLKYFNESTRKKIEKIRPLtVEGrrASLSPGMl-IMGMFtJMI.STVLG 420

421 VSILNLGQKRYTKTTVWDGLQSSDDFALIVHAPNHEGIQAGVtlRFY-RTCKLVGINMSKK 480

481 KSYIHRTGTFEFTSFFYRYGFVAÍ)FSMELPSFGVSGIHESADMSXG\m'IKNm4IHNDLí3 540

541 PATAQMALQLFIKDYRYTYRCHRGDTQIQTRRSFELKKLWEQTRSKAGLLVSDGGPNLYH 600

601 IRHLHXPEVGLKWEMDEDYQGRLCNPLNPFVSHKEVESVHNAWMPAHGPAKSMCTDAV 660

661 ATTHSi-nPKRMRSILNTSQRGILEDEQMYQKCCTLFEKFFPSSSYRRPVGISSMMEAMVS 720

721 RARIDARIDFESGRIKKEEFAEILKICSTIEELGRQGK 758

Рис. 2 Аминокислотная последовательность белка РВ1 вируса гриппа A/Hong Kong/156/97(H5Nl). Серым цветом выделены выбранные для исследования области.

Из литературы известно, что наиболее важным для связывания с белком РА является фрагмент 1-15 белка РВ1. Наличие в клетке фрагмента 1-25 белка РВ1 подавляет репликацию вируса в клетке. Авторы исследований при этом полагают, что пептидный ингибитор конкурирует с белком РВ1 за связывание с белком РА. Учитывая вышеперечисленное, мы решили более детально изучить эту область.

При анализе первичной структуры N-концевой части белка РВ1 было установлено, что фрагмент 6-25 содержит зеркально-симметричный мотив (рисунок 3). Из литературы известно, что такие мотивы чаще встречаются вблизи функционально значимых участков белков.

РВ1 6-25 TLLFLKVPACbNAISTTFPYT

РВ1 25-6 TYPFTTSIAN

QAPVKLFLLT

Рис. 3 Зеркально-симметричный мотив в структуре фрагмента 6-25 белка РВ1. Аминокислотные остатки в симметричных позициях обозначены жирным шрифтом, а взаимодействующие с белком РА подчёркнуты.

Для изучения пространственной структуры фрагмента 6-25 сотрудниками лаборатории структурной и функциональной протеомики НИИ Гриппа было проведено компьютерное моделирование структуры этого пептида методами молекулярной динамики. По расчетным данным, соединение образует структуры типа р-шпильки (рисунок 4); аминокислотные остатки, необходимые для стабилизации данной структуры, находятся в районе фрагмента 6-13.

Рис. 4 Предполагаемая пространственная структура фрагмента 6-25 белка РВ1 по данным компьютерного моделирования.

По результатам моделирования пространственной структуры фрагмент 6-13 склонен к образованию линейной структуры и не образует внутримолекулярные связи. На основании вышеизложенного мы предполагаем, что фрагменты 6-13 и 6-25 белка РВ1 могут взаимодействовать друг с другом вследствие конкуренции за внутримолекулярные связи фрагмента 6-13 с той частью молекулы пептида 6-25, которая образует p-структуру. Таким образом возможна стабилизация N-концевой части белка РВ1 в виде p-структуры, препятствующей взаимодействию белков РВ1 и РА, что, как следствие, будет приводить к ингибированию вирусной репликации в клетке.

V . /-ч

„etNia

Выбор пептидов, не принадлежащих N-концу белка РВ1, был во многом произвольным, при этом принимали во внимание такие факторы, как гидрофобность, растворимость, способность проникать сквозь клеточную мембрану, наличие кластеров повторяющихся аминокислотных остатков.

Так, например, фрагмент 525-540 белка РВ1 был выбран, поскольку содержит кластер из остатков аспарагина. Известно, что кластеры остатков аспарагина или глутамина повышают склонность белков к образованию амилоидных агрегатов, где преобладает р-складчатая структура. На основании вышесказанного было сделано предположение, что пептид РВ1 531-540 может быть блокатором образования р-складчатой структуры и нарушать стабильность соответствующего домена полноразмерного белка. По сходному принципу был выбран участок 111-130, содержащий повтор глутамина, а также повтор остатков валина.

Сравнение различных вариантов проводилось согласно расчетам индексов, предложенных в 2005 году Хэлбринком и соавторами.

В результате для синтеза были выбраны следующие пептиды - фрагменты белка РВ1: 1-5, 1-25, 6-13, 6-14, 6-25, 14-25, 26-30, 111-130, 271-290, 381-386, 381-390, 381400, 391-400, 395-400, 411-420, 525-530, 525-535, 531-540.

2.1 Синтез пептидов

Синтез пептидов проводили твердофазным методом на 2-хлортритилхлоридной и Ринк-амидной смолах по Fmoc-/t-Bu стратегии с использованием как методик последовательного наращивания цепи, так и конвергентного подхода. Очистку полученных пептидов проводили методом препаративной обращеннофазной ВЭЖХ, их структура подтверждена масс-спектрометрически (ESI).

Для фрагментов 6-13, 6-14, 26-30, 395-400 и 531-540 были получены амиды, а также N-ацетилированные производные пептидов и их амидов. Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов и их производных представлены в таблицах 1 и 2 соответственно.

Таблица 1. Базовые пептиды 1-18

№ обозначения пептидов аминокислотная последовательность Выход, %* Чистота, % (ВЭЖХ) [M+H]+ рассчитано [М+Н]+ найдено

1 РВ1 (1-5) H-Met1-Asp2-Val3-Asn4-Proi-OH 64 95.1 575.2494 575.2512

2 РВ1 (1-25) H-Met'-Asp'!-Vali-Asn4-Pro5-||-Thr<,-Leu'-Leu8-Phey-Leu")-Lys"-Valu-Рго13-||-А1а -Gln15-Asn16-Ala17-IleI8-Ser19-Thr20-Thr21-Phe22-Pro23-Tyr24-Thr25-OH 22** 96.3 2781.4532 2781.4643

3 РВ1 (6-13) H-Thr'-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val'-Pro8-OH 32 98.6 930.6023 930.6038

4 РВ1 (6-14) H-Thrl-Leu2-LeuJ-Phe4-Leu5-Lys6-Val'-Pro8-Alas-OH 26 98.8 1001.6394 1001.6354

5 РВ1 (6-25) H-Thr'-Leu^-LeuJ-Phe4-Leu:,-Lys<,-Val'-Pro'i-||-Ala"-Gln")-Asn"-Ala'2-[le13-Ser14-Thr15-Thr16-Phe17-Pro18-Tyr19-Thr20-OH 28 97.5 2225.2216 2225.2127

6 РВ1 (14-25) H-Ala1-Gln2-AsnJ-Ala4-Ile3-Ser<,-Thr'-Thrs-Phe"-Pro'u-Tyr"-Thr1'!-OH 29 98.1 1313.6372 1313.6428

7 РВ1 (26-30) H-Gly1-Asp2-ProJ-Pro4-Tyr'-OH 77 96.4 548.2351 548.2332

8 РВ1(111-130) H-Met'-Glu"!-ValJ-Val4-Glnb-||-Gln6-Thr'-Arg8-Met9-Asplu-Lysll-Leuu-Thr13-||-Gln14-Gly15-ArR16-Gln17-Tbr18-Tyr19-Asp20-OH 32 94.5 2427.1755 2427.1849

9 РВ 1(271-290) H-Leu'-Pro'-Vali-Gly4-Gly3-Asn',-Glu'-Lys'i-Lys!'-Alaiu-Lys"-Leuu-Ala13-Asn14-Val15-Val16-Arg17-Lys18-Met19-Met20-OH 14 97.2 2183.2515 2183.2597

10 РВ1(381-386) H-Phe'-Asn2-GluJ-Ser4-Thr3-Arg6-OH 57 95.7 753.3526 753.3552

11 РВЦ381-390) H-Phe'-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg^Lys'-Lyss-ne9-Glu'u-OH 37 95.2 1251.6692 1251.6646

12 РВ 1(3 81-400) H-Phe1-Asn2-GluJ-Ser4-Thrs-Arg6-||-Lys'-Lys8-Ileif-Gluu,-Lys11-Ile12-Argl3-Pro14-||-Leu15-Leu16-Val -Glu18-Gly"-Thr20-OH 19 96.3 2358.3503 2358.3594

13 РВ 1(3 91-400) H-Lys1-Ile2-ArgJ-Pro4-Leu:'-Leu<'-Val'-GIus-Glya-Thrll'-OH 33 96.5 1125.6990 1125.6948

14 РВ 1(3 95-400) H-Leu'-Leu2-Val3-Glu4-Glyi-Thr6-OH 48 96.9 631.3661 631.3630

15 РВ 1(411-420) H-Met1-Phe2-AsnJ-Met4-Leu:'-Ser<,-Thr'-Val8-Leu!'-Gly"J-OH 37 94.9 1112.5479 1112.5447

16 РВ 1(525-530) H-Ue'-Gly!-Val3-Thr4-Val5-Ile<'-OH 29 95.3 601.3919 601.3901

17 РВ 1(525-535) H-Ile1-Gly2-Vali-Thr4-Val5-Ile<,-Lys'-Asn8-Asn!'-Met'u-IIen-OH 27 94.7 1201.6973 1201.6929

18 РВ 1(531-540) H-Lys'-Asn2-AsnJ-Met4-Ile:'-Asn<,-Asn'-Aspll-Leu"-Gly",-OH 41 94.5 1132.5415 1132.5457

Примечание: знаком || обозначены фрагменты для конвергентного синтеза.

* выход приведен в расчете на первый аминокислотный остаток с учетом очистки пептида с помощью препаративной обращенно-фазной ВЭЖХ ** выход приведен для пептида, синтезированного последовательным наращиванием пептидной цепи

Таблица 2. Производные базовых пептидов 3 а-в, 4 а-г, 7 а-в, 14 а-в, 18 а-в

№ обозначе ния пептидов аминокислотная последовательность Выход %* Чистота % (ВЭЖХ) [М+Н]+ рассчитано [М+Н]+ найдено

За РВ1 (6-13) Н-И1г1-Ьеи2-Ьеи'-РЬе4-Ьеи5-Ьу8<,-Уа17-Рго8-Ш2 27 93.5 929.6183 929.6202

36 Ас-ТЬг'-Ьеи2-Ьеи:1-РЬе4-Ьеи5-Ьу5<>-Уа17-Рго"-ОН 15 94.8 972.6128 972.6098

Зв Ас-ТЬг1-Ьеи^-Ьеи'-РЬе4-Ьеи5-Ьу5<,-Уа1 '-Рго"-Ш2 34 97.2 971.6288 971.6256

4а РВ1 (6-14) Н-ТЬг1-Ьеи'-Ьси'-РЬе4-Ьеи5-Ьуз6-Уа17-Рго8--Л1а9-ЫН2 59 97.3 1000.6554 1000.6561

46 Ас-ТЬг'-Ьеи2-Ьеи'-РЬе4-Ьеи5-Ьу8<,-Уа1/-Рго11--А1а'-ОН 19 93.6 1043.6499 1043.6528

4в Ас-Т11г'-Ьеи2-Ьеи;'-РЬе4-Ьеи5-Ьу86-Уа1'-Рго'1--А1а9-Ш2 28 95.2 1042.6659 1042.6628

4г Р1ТС-А11х1-ТЬг2-Ьеи'-Ьеи4-РЬе5-Ьеи<,-Ьу5'-Уа18-Рго9-А1а10-Ш2 30 94.3 1502.7752 1502.7805

7а РВ1 (26-30) Н-01у'-А8р2-Рго:|-Рго4-Туг5-МН2 38 97.7 547.2511 547.2497

76 Ас-Иу 1-А5р'-Рго3-Рго4-Туг5-ОН 50 98.1 590.2457 590.2466

7в Ас-01у'-А5р2-Рго"-Рго4-Туг5-Ш2 34 96.2 589.2616 589.2595

14а РВ1 (395-400) Н-Ьеи'-Ьеи2-Уа1'-01и4-01у5-ТЪг6->1Н2 71 98.7 630.3821 630.3793

146 Ас-Ьеи1-Ьеи2-Уа13-01и4-01у5-ТЬг6-0Н 36 98.0 673.3767 673.3737

14в Ас-Ьси'-Ьси'-Уа^-аи'-Иу'-ТЬг'-МЬ 69 97.3 672.3927 672.3916

18а РВ1 (531-540) Н-Ьув 1-А5п2-А8п3-Ме14-Ие5-Азп6-Азп7-Азр8-Ьеи9--С1у'°-МН2 34 95.4 1131.5575 1131.5541

186 Ас-Ьув'-Азп^Азп-Ме14-11е5-А8п6-А8п7-А8р8--Ьеи'-О1у10-ОН 29 93.5 1174.5521 1174.5553

18в Ас-Ьу81-А8п2-А8п'-Ме14-Ие5-А5п6-А8п7-А8р8--Ьеи9-О1у10-ЫН2 23 93.7 1173.5681 1173.5728

* выход приведен в расчете на первый аминокислотный остаток с учетом очистки пептида с помощью препаративной

обращенно-фазной ВЭЖХ

2.1.1 Последовательное наращивание пептидной цепи

Все представленные в таблице 1 пептиды, кроме РВ1(111-130) и РВ1(381-400) были синтезированы последовательным наращиванием пептидной цепи по одной аминокислоте. Пептид РВ1 (1-25) был синтезирован двумя способами — указанным выше, а также конвергентно.

Синтетические проблемы при "посадке" следующего аминокислотного остатка или же деблокировании Fmoc-группы при синтезе всех обсуждаемых пептидов возникали, чаще всего, в реакциях с гидрофобными, пространственно-затрудненными защищенными аминокислотами — Val, Leu, Ile, Asn, Gin, а также Lys, особенно, если они оказывались соседними в аминокислотной последовательности.

Фрагмент 111-130 белка РВ1 (соединение 8) не удалось получить последовательным наращиванием пептидной цепи - проблемы в синтезе были отмечены при присоединении остатка глутамина в положении 6:

Fmoc-Gln6(Trt)-OH + H2N-Thr7(t-Bu)-Arg8(Pbf)-Met9-Asp10(O-tBu)-Lysu(Boc)-Leu12-Thr13(t-Bu)-Gln14(Trt)-Gly15-Arg16(Pbf)-Gln17(Trt)-Thr18(t-Bu)-Tyr19(t-Bu)-Asp20(O-tBu)-(g)

jüIQHOBt

Fmoc-Gln6(Trt)-Thr7(t-Bu)-Arg8(Pbf)-Met9-Asp10(O-tBu)-Lysu(Boc)-Leu12-Thrl3(t-Bu)-

Gln14(Trt)-Gly15-Arg16(Pbf)-Gln17(Trt)-Thr18(t-Bu)-Tyr19(t-Bu)-Asp20(O-tBu)-(gl

Реакцию не удавалось провести до конца. По данным аналитической обращено-фазной ВЭЖХ смесь продуктов, полученная после финального деблокирования, содержала два пика, отвечающие, по данным масс-спектрометрии, пептидам 6-20 и 720 соответственно:

H-Thr-Arg-Met-Asp-Lys-Leu-Thr-Gln-Gly-Arg-Gln-Thr-Tyr-Asp-OH H-Gln-Thr-Arg-Met-Asp-Lys-Leu-Thr-Gln-Gly-Arg-Gln-Thr-Tyr-Asp-OH Целевое соединение удалось получить конвергентным методом при использовании фрагментов 1-5, 6-13 и 14-20.

Пептид РВ1(271-290) (соединение 9), синтезированный последовательным наращиванием пептидной цепи, содержит два остатка метионина в положениях 19 и 20. После финального деблокирования данного пептида на хроматограмме полученной смеси присутствовало 4 пика (рисунок 5а).

Рис. 5 Хроматограммы пептида РВ 1(271-290) (ЯР-НРЬС) а) после финального деблокирования б) после восстановления.

Мы предположили, что пики 1-3 соответствуют соединениям, содержащим окисленные формы остатков метионина (рисунок 6):

Рис. 6 Окисленные формы остатков метионина.

Действительно, восстановление данной смеси с помощью 1,2-этандитиола и триметилбромсилана в растворе трифторуксусной кислоты привело к целевому соединению, соответствующему пику 4 (рисунок 56).

Аналогичная картина наблюдалась с пептидом РВ1 (525-535) (соединение 17), содержащим один остаток метионина в положении 10 - на рисунке 7 представлены хроматограммы до (а) и после (б) его восстановления: пики 1 и 3 соответствуют окисленной форме, а пик 2 - целевому соединению. Пику 4 соответствует Ртос-защищенный пептид, что подтверждается исчезновением данной группы пиков (3 и 4) после обработки смеси водным раствором аммиака.

а

ил. 01

Рис. 7 Хроматограммы пептида РВ1(525-535) (11Р-НРЬС) а) после финального деблокированиия б) после восстановления.

Синтез фрагмента 6-13 белка РВ1 (соединение 3) и его N-ацетилированного производного (соединение 36, таблица 2)

H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OH Ac-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OH не представляет сложностей в условиях твердофазного синтеза. Однако синтез в таких же условиях фрагмента 6-14 белка РВ1 и его N-ацетилированного производного (соединения 4 и 46),

H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-OH Ac-Thr'-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-OH отличающихся от фрагмента 6-13 остатком аланина в положении 9, приводит к возникновению проблем как с присоединением треонина-1, так и с последующим деблокированием Fmoc-группы. В данном случае эти проблемы решает увеличение избытка реагентов на стадии присоединения Thr-1, а также времени протекания реакции. Для деблокирования Fmoc-группы Thr-1 в случае соединений 4 и 46 возникает необходимость в использовании более эффективного реагента DBU (1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен).

Амид фрагмента 6-13 (соединение За) был получен амидированием, которое проводили с использованием аммиачной соли гидроксибензотриазола и диизопропилкарбодиимида:

Boc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6(Boc)-Val7-Pro8-OH

1) DIC/NH4OBt , ,2) TFA/TIS/H20

H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH2 Получить соединения Зв и 7в описанным выше способом не удалось — реакции не проходили до конца при увеличении как избытка реагентов, так и времени протекания реакции. Синтез соединения Зв также осложнялся плохой растворимостью защищенного пептида:

Ac-Thr1(t-Bu)-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6(Boc)-Val7-Pro8-OH Поэтому соединения Зв и 7в, а также соединения 4а, 4в, 4г, 7а, 14а, 14в, 18а, 18в были синтезированы с использованием Ринк-амидной смолы, позволяющей получать соответствующие амиды на стадии отщепления от полимерного носителя. Получаемые таким образом амиды не содержат примесей соответствующих кислот (как в случае

проведения реакции амидирования с помощью карбодиимида), что упрощает очистку целевых соединений.

2.1.2 Конвергентный синтез

Конвергентно были синтезированы пептиды РВ1 (1-25), РВ1 (111-130) и РВ1 (381400) (таблица 3).

Таблица 3. Конвергентный синтез пептидов

№ обозначения пептидов конденсации фрагментов растворитель избыток карбоксильной компоненты реагент

2 РВ1 (1-25) (6-13)+ (14-25) NMP 2.0 HOBt

(1-5)+ (6-25) DMF 2.7 HOBt

8 РВ1 (111-130) (6-13)+ (14-20) DMF 2.9 HOAt

(1-5)+ (6-20) DMF 3.0 HOAt

12 РВ1 (381-400) (7-14)+ (15-20) DMF 2.4 HOAt

(1-6)+ (7-20) DMF 3.5 HOAt

Наличие в молекулах РВ1 (1-25), РВ 1(3 81-400) остатков пролина в положениях 5, 13 (для РВ1 (1-25)), 14 (для РВ1(381-400)) открыло возможности для использования в их синтезе фрагментных конденсаций с разбивкой аминокислотной последовательности по данной аминокислоте. Такой выбор обусловлен весьма низкой способностью пролина подвергаться рацемизации. В случае пептида РВ1(381-400) разбивку проводили также по аргинину в положении 6. В конденсациях использовали 2-3.5-кратные избытки защищенных фрагментов.

В случае фрагмента 1-25 целевое соединение, полученное с использованием конвергентного синтеза на хроматограмме совпадало с таковым, полученным последовательным наращиванием пептидной цепи. Лучшие результаты были получены в случае конвергентного синтеза.

2.2 Противовирусная активность пептидов Испытания по противовирусной активности пептидов были проведены сотрудниками лаборатории молекулярных основ химиотерапии вирусных инфекций

НИИ Гриппа на культуре клеток МОСК., активность оценивали в отношении вируса гриппа (А/СаИГогша/07/2009 (НШ1) р<1т09), ввивавшего пандемию в 2009 году. В экспериментах оценивали 50%-е цитотоксическую (СТО50) и эффективную (ЕО50) дозы, на основании которых рассчитывали индекс селективности (81). Считали активными препараты, имеющие >10.

Первоначально были протестированы базовые соединения 1-18 (таблица 4), для дальнейшей работы были выбраны наиболее активные. В качестве препаратов сравнения были выбраны ремантадин, в отношении которого исследуемый штамм обладает устойчивостью, а также осельтамивир, к которому он чувствителен.

Таблица 4. Противовирусная активность базовых пептидов

№ обозначения пептидов показатели активности

CTD50, мкг/мл ED50, мкг/мл SI

1 РВ1 (1-5) 745 106 7.0

2 РВ1 (1-25) 1000 340 2.9

3 РВ1 (6-13) 1000 95 10.5

4 РВ1 (6-14) 1000 34 29.4

5 РВ1 (6-25) 1000 287 3.5

6 РВ1 (14-25) 1000 500 2.0

7 РВ1 (26-30) 1000 63 15.9

8 РВ1(111-130) 500 140 3.6

9 РВ 1(271-290) 600 72 8.3

10 РВ1(381-386) 1000 500 2.0

И РВЦ381-390) 500 500 1.0

12 РВ1(381-400) 330 54 6.1

13 РВ1(391-400) 700 80 8.7

14 РВ 1(395-400) 1000 57 17.5

15 РВ 1(411-420) 1000 411 2.4

16 РВ1(525-530) 1000 500 2.0

17 РВ1(525-535) 500 500 1.0

18 РВ1(531-540) 1000 58 17.2

препараты сравнения

ремантадин 50 20 2.5

осельтамивир 300 0.3 1000

Как следует из приведенных в таблице 4 данных, синтезированные соединения нетоксичны для клеток. Наиболее активными в отношении вируса гриппа пептидами являются фрагменты 6-13, 6-14, 26-30, 395-400, 531-540 белка РВ1 (соединения 3, 4, 7,

14, 18). Интересно отметить, что соединения 14 и 18 не являются фрагментами N-концевой области белка РВ1, необходимой для связывания с белком РА.

Индексы селективности фрагментов 6-13 и 6-14 белка РВ1 (соединения 3 и 4) отличаются почти в три раза. Возможно, это связано с увеличением количества проникшего в клетки соединения 4 по сравнению с соединением 3 за счет наличия в составе соединения 4 гидрофобного остатка аланина. Кроме того, остаток аланина в положении 14 белка РВ1 взаимодействует с остатком глутамина-670 белка РА.

Для увеличения стабильности и биодоступности наиболее активных соединений было решено синтезировать модифицированные пептиды — ацетилированные по N-концевой аминогруппе и амидированные по С-концевой карбоксильной группе. Данные модификации позволяют повысить устойчивость пептидов к экзопептидазам и облегчить их проникновение через клеточную мембрану. Результаты тестирования представлены в таблице 5.

Таблица 5. Противовирусная активность модифицированных пептидов

№ аминокислотная последовательность показатели активности

CTDS0 мкг/мл EDjo мкг/мл SI

3 H-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-OH 1000 95 10.5

За H-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-NH2 1000 32 31.2

36 Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-OH 1000 32 31.2

Зв Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-NH2 >500 И >45

4 H-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-OH >500 33 >15

4а H-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH2 >500 6 >83

46 Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-OH 1000 85 11.8

4в Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH2 >500 4.5 >111

4г FITC-Ahx-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH2 >500 5 >100

7 H-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-OH 1000 63 15.9

7а H-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-NH2 1000 55 18.2

76 Ac-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-OH 1000 56 17.9

7в Ac-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-NH2 500 150 3.3

14 H-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-OH 1000 57 17.5

14а H-Leu-Leu-VaI-Glu-Gly-Thr-NH2 500 500 1.0

146 Ac-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-OH 500 200 2.5

14в Ac-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-NH2 500 500 1.0

18 H-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu-Gly-OH 1000 58 17.2

18а H-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu-Gly-NH2 1000 50 20.0

186 Ac-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu-Gly-OH 1000 83 12.0

18в Ac-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu-Gly-NH2 1000 128 7.8

Как следует из таблицы, во всех случаях, кроме производных фрагмента 395-400 (соединения 14, 14 а-в), амиды оказались более активными, чем соответствующие кислоты, а введение N-концевой ацетильной группы в амиды пептидов привело к увеличению активности только в случае фрагментов 6-13 и 6-14 белка РВ1 (соединения 3 и 4). Наиболее активным из всех протестированных соединений оказалось соединение 4в, имеющее SI >111.

Для изучения механизма противовирусной активности этого соединения в следующей серии опытов были изучены его вирулицидные свойства (противовирусная активность вне клеток) и клеточная локализация.

Эксперименты по вирулицидному действию соединений 4в и 4г показали снижение титра вируса на 1.5 и 1 lgEIDjo по сравнению с контролем, что свидетельствует об их слабом вирулицидном действии. Вероятно, данный механизм не является основным для этих соединений.

Также был проведен эксперимент по изучению влияния соединения 4в на различные стадии жизненного цикла вируса гриппа. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что соединение 4в, вероятно, влияет на ранние стадии жизненного цикла вируса гриппа.

Для изучения способности соединения 4в к проникновению в клетки в амид соответствующего пептида была введена флуоресцентная метка с помощью флуоресцеин-5-изотиоцианата, линкером выступала 6-аминогексановая кислота. Введение флуоресцентной метки практически не отразилось на противовирусной активности изучаемого препарата (4г, таблица 5) что свидетельствует о сходстве механизмов действия соединений 4в и 4г.

Исследование локализации флуоресцентно-меченого соединения 4г в клетках MDCK с помощью проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии позволило сделать вывод о том, что исследуемое соединение проникает через клеточную мембрану. С помощью проточной цитофлуориметрии было показано, что данный пептид способен к связыванию с живыми клетками MDCK. Изучение окрашенных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии показало, что окрашивание происходит за счёт проникновения соединения 4г сквозь мембрану клетки.

Вероятно, противовирусная активность соединения 4в — N-ацетилированного амида фрагмента 6-14 белка РВ1 реализуется путем нарушения сборки комплекса РНК-

полимеразы либо за счет связывания пептида 4в с белком РА, либо за счет стабилизации p-структурированного состояния N-концевой части белка РВ1.

Данное соединение, на наш взгляд, является перспективной основой для дальнейшей разработки средств профилактики и/или терапии гриппа.

3. Выводы

1. Разработан синтез пептидов из областей 1-30, 111-130, 271-290, 381-400, 525-540 белка РВ1 РНК-полимеразы вируса гриппа А. Всего получено 34 соединения.

2. На основании изучения противовирусной активности синтезированных соединений на культуре клеток MDCK в отношении пандемического вируса гриппа A/Californ¡a/07/2009 (H1N1) pdm09 показано, что пептиды - фрагменты 6-13, 6-14, 26-30, 395-400, 531-540 белка РВ1, а также их производные эффективно подавляют репликацию вируса гриппа.

3. Изучение флуоресцентно-меченого фрагмента 6-14 белка РВ1 показало, что препарат проникает через мембрану клетки и действует на ранних стадиях репликации вируса гриппа.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

Статьи:

1. Матусевич, О. В.; Глуздиков, И. А.; Титов, М. И. Синтез фрагментов субъединицы РВ1 РНК-полимеразы вирусов гриппа А // Вестник Санкт-Петербургского университета. — 2011. - серия 4. вып. 2. - С. 150-156.

2. Egorov, V. V.; Matusevich, О. V.; Shaldzhyan, A. A.; Skvortsov, A, N.; Zabrodskaya, Y. А.; Garmay, Y. P.; Landa, S. В.; Lebedev, D. V.; Zarubayev, V. V.; Sirotkin, А. К.; Vasin, A. V.; Kiselev, О. I. Structural features of the peptide homologous to 6-25 fragment of influenza A PB1 protein // International Journal of Peptides. -2013. - Vol. 2013. - ID 370832.

Патент:

Киселёв, О. И.; Деева, Э. Г.; Зарубаев, В. В.; Штро, А. А.; Матусевич, О. В.; Титов, М. И.; Глуздиков, И. А. Пат. 2492178 РФ С1. Противовирусный пептид, подавляющий репликацию вируса гриппа - № 2012115794/10; заявл. 19.04.2012; опубл. 10.09.2013, Бюл. №25. 12 С.

Тезисы докладов:

1. Matusevich, О. V.; Kiselev, О. I. The Synthesis of Some Peptides Intended to Be Inhibitors of the RNA-Polymerase of Influenza A Virus // Proceedings of the 31st European Peptide Symposium, Copenhagen, Denmark, September 5-9, 2010. P. 548.

2. Matusevich, О. V. Synthesis of the PB1 protein fragment of RNA-polymerase of influenza A virus // Journal of Peptide Science. - 2010. - Vol. 16. SI. - P. 65.

3. Глуздиков, И. А.; Краснощек, А. А.; Матусевич, О. В.; Титов, М. И.; Киселев, О. И. Синтез фрагментов белка РВ1-субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа типа А // Тез. докл. IV Российского симпозиума "Белки и пептиды", Казань, 23-27 июня 2009. С. 147.

4. Матусевич, О. В. Синтез фрагмента белка РВ1 РНК-полимеразы вируса гриппа А // Материалы междунар. конф. "Основные тенденции развития химии в начале XXI-го века", Санкт-Петербург, 21-24 апреля 2009. С. 403.

5. Матусевич, О. В.; Глуздиков, И. А. Синтез фрагмента РВ1 (111-130) РНК-полимеразы вируса гриппа А // Тез. докл. V Всерос. конф. студентов и аспирантов "Химия в современном мире", Санкт-Петербург, 2011. - СПб: ВВМ, 2011. - С. 404.

6. Забродская, Я. А.; Шалджян, А. А.; Матусевич, О. В.; Егоров, В. В. Пептиды, способные к взаимодействию с белками вируса гриппа // Тез. докл. конф. молодых специалистов "Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение", СПб, 2012. С. 21.

7. Забродская, Я. А.; Егоров, В. В.; Матусевич, О. В.; Гармай, Ю. П.; Васин, А. В.; Киселёв, О. И. Структурные особенности сайта связывания белка РВ1 и белка РА вируса гриппа А // Тез. докл. 16-й Междунар. школы-конф. молодых ученых "Биология -наукаXXI века", Пущино, 16-21 апреля, 2012. С. 109.

Подписано к печати 05.06.14. Формат 60 х 84 '/и. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать цифровая. Печ. л. 1,00. _ Тираж 100 экз. Заказ 6037._

Отпечатано в Отделе оперативной полиграфии химического факультета СПбГУ 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 26 Тел.: (812) 428-4043,428-6919