Локализация Т- и В-эпитопов капсидных белков вируса гепатита А с помощью синтетических пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА

РГ6 О На правах рукописи

2 1 М АГ 19ЭД УДК 547.964 : 578.112.083.3

кулик

Людмила Николаевна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ Т-И В-ЭПИТОПОВ КАПСИДНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА А С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Научные руководители: кандидат химических наук А. Т. Кожич, кандидат химических наук В. С. Иванов.

академик АЕН, доктор медицинских наук, профессор А. А. Ярилин,

кандидат химических наук Л. А. Фонина.

Ведущая организация — НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН.

Защита состоится 13 апреля 1994 г. в 10 час. на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан « » марта 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

ОБВАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Серьезную проблему для здравоохранения представляют вирусные гепатиты, среди которых немалое внимание уделяется гепатиту А, составляющему до 40ч от общих заболеваний гепатитами. Особенности размножения вируса н отсутствие возможностей ранней диагностики инфицированных создают благодатную почву для вспышек массовых эпидемия как в странах с низким уровнем санитарии, так и в высокоразвитых, нанося значительный экономический учерб.

Одним из методов борьбы с вирусными инфекциями является вакцинация. D настоящее время для вакцинопрофилактики гепатита А предлагаются вакцины на основе ослабленного и инактивированного вируса, которые обладают рядом недостатков, таких как остаточная инфекциоиность и высокая себестоимость. Альтернативой могут быть искусственные вакцины на основе синтетических пептидов. Потенциальные преимущества таких вакцин заключаются в их хиническоП гомогенности, неинфекционности, возможности производства в больших масштабах, строгой направленности иммунного ответа, возможности длительного хранения и отсутствии побочных эффектов, присущих традиционным вакцинам. Необходимым условием для создания теккх вакцин служит локализация иммунноактивных участков вирусных белков.

Цель работы. Работа является частью комплексного исследования ВГА, проводимого в НБХ РАН совместно с Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН. Целью работы был поиск Т-и В-эпитопов капсидных белков ВГА с помощью теоретических и экспериментальных методов. Для этого с помощью компьютерных методов анализа аминокислотных последовательностей были выбраны возможные Т-и В-эпитопы ВГА. Далее были синтезированы пептиды, перекрывающие

выбранные участки белков, и проведено их i;i!;.!yHo:::;::::4ticr.oe тестирование.

Научная новизна и практическая значимость рыбпт;^. с понощьз указанных подходов локализован иммуноактизныП на белке

VP2. Имкунизация синтетическим пептидом VP2-(£9-05). керекринавакм данный участок, привела к появлении в . мклкак снзороткнх ИГй-связьшающих антител.

Получены мококлональные ВГл-связь&аюзне и пеПтралкгупщмо антитела, - которые поено нспользовач'ь для проведения иммунодиагностики, а такие в исследованиях по структурной организации и по локализации антигенных детерминант на калсизных белках ВГА.

Публикации. По материалам диссертации опубгтаосаио 7 работ.

Апробация работы. Результаты работы дологеиы-' на 18 Международном симпозиуме по молекулярной и кдэточксП биологин (Парк сити, 1989), на 7 международном симпозиуме по хкмпи пептидов и белков' (Дилидан, 1989), на Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов (Рига, 1990), на ИевдУкародноЕ конференции "Биотехнология, иммунизация, СПИД" (Санкт-Петербург, 1991).

Объем и структура диссертации. Диссертация излояена на 118 страницах и состоит нз введения, трех глав и зьксдов, содержит 15 рисунков и 12 таблиц, в списке литературы цитировано 169 названий. В главе I приведен обзор литературных данных по теме "Искусственные- антигены и вакцины", в главе II содержатся результаты исследовании и их обсуждение, в главе III изложены экспериментальные методы.

C01EPSABHE РАБОТЫ

I. АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ КАПСИДНЫХ БЕЛКОВ ВГА С ПОМОЩЬЮ ШШЬЗТЕРНЫХ МЕТОДОВ.

Для расчета вероятных антигенных детерминант (В-эпитопов) в капсидиьк вчл::1х ВГА, были использованы известные алгоритмы. С помодья компьютерных программ были рассчитаны профили гидроф:<льностп, аит!.теяности, подзюгиости основной цепн и вероятная вторичная структура. В качестве кандидатов в В-эпитопы рессыатркЕалксь та фрагменты белков, которым соответствовали ыапсиуедыжа пизи профилей, a такге участки с вероятным образоБанкч;-! ..-изгибов. В результате были выбраны следующие участки кспсидных Сзлаов ВГА: 1-17, 2-33, 6-1?, 10-33, 11-25, 6475, 75-85, 107-126, 112-126, 115-126, 115-139, 126-139, 180-195, 209-231, 276J3S0. 283-298, 290-299 ИЗ белка VP1; 42-62, 65-85, 7605, 173-190 из б-злка VP2 (твбл.1). Основное внимание было уделено балку VIVI, гяэ по данным литературы наиболее вероятна локализация послэдоватэльного В-зпнтопа.

Для предсказания вероятный Т-эпитопоа з белках был нспольгосзн psnes разработанный интегрированный пакет программ "РХЗШСТ" д.чя поиска Т-эпнтопов. В первой программе пакета использовая алгоритм поиска амфипатичных спиральных структур в белковых послчдовбтзльностях, основанный на оценке корреляции иезду гидрофобностяни оствткоз i: периодической Функцией. Второй алгоритм основан на локализации в аминокислотной последовательности характерного для Т-эпитопов чередования аминокислотных остатков. В пакет такяе входит программа

предсказанил вторичной структуры для оценки конфорнацтнгл-с состояний.

После проведенных расчетов для синтеза и имиунохимическоге тестирования были выбраны следующие участки кьасидных беякоч ВГЛ: 75-92. 115-139 и 209-221 белка VP1, 69-99 и 80-S9 белка VP2, -15-57

и 137-150 белка VP3 и 1-23 белка VP4. Кроме того, в работе были

i

использованы пептиды как вероятные В-эпктопы, являющиеся по расчетам такке Т-эпитопами (10-33 и I276-298 Солке VP1) ила перекрывающиеся с ними (1-17, 11-25 и 75-85 белка VPÍ) (табл.1).

2. СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ.

Пептиды были синтезированы твердофазным методой на модернизированном синтезаторе "Beckman 990" (США). В качестве носителя использовали аминометилированиыЯ сополимер полистирола и 1* дивиннлбензола с л-гидрокекметилфенилацетамидочетильной (Paiti) якорной группировкой. Концентрация аминогрупп составляла 0,25-0,5 ммоль/г смолы. Якорные группировки вводили при поноки Рав-производного защищенной С-концевой аминокислоты.

Для временной защиты -аминогрупп использовали Вос-группу. Для защиты трифункциональных аминокислот использовали бензиловый и циклогексиловый эфиры (Asp, Clu), тозильиуо (Ara), бензилоксиметильную и 2,4-динитрофенильную (His), бензилъную (Ser, Thr), 2,6-дихлорбензильную (Туг), 2-хлорбензилоксикарбонильную (Lys) группы.

Для проведения реакции конденсации использсняли 3-кратный по отношению к исходной концентрации аминогрупп на полимере избыток 1-оксибензотрназоловых эфнров в I'MF. За полнотой протекания реакции следили с помощью качественного и количественного

Тсблицс 1, Синтетические паптнды из капсндных белков ВГй.

Балок Фрагмент Аминокислотная последовательность

VP1 1-17 VGDDSGGFSTTV5TEQH

2-33 GpDSGGFSTTVSTEQHVPDPQVGITTSRDLKG

6-17 GGFSÏTVSTEQN

10-33 ÎTVSTEQNVPDPQVGITTXRDLKG

11-35 TVSTEQUVPDPQVGI

64-75 KVPETFPELKPG

73-35 GESRHTSDH^S

75-93 GESRHXS DHXS ÏYFCF&CR

107-125 YTFPITLSSTSHPPHGLPST

TLSSrSMPPHGLPST

115-125 STSNPPHGLPST

115-130 STSMPPHGLPSTLSKFFNLFOLYRG

117-133 SNPPHGLPSTLRHFFHLFQLYRG

136-139 TLRHFFNLFQLYRG

1Е0-105 DYKTALGAVRFHTRRT

209-221 YAVSGALDGLGDK

376-250 S.SRIAAGDLESSVDDPRSEEDRR

300-300 VDDPRSEEDRR

380-399 DPRSEEDRRF

VP2 Í3-S3 PLKTSVDKPGSKKTQGEKFFL

С5-85 SADWLTTHALFHEVAKLDWK

73-35 ALFHEVAI'LDWK

S9-99 LTTHALFHEVAKLDWKLLYMEQFAVQGLLR

30-99 KLDWKLLYNEQFAVQGLLR

178-1С0 PVHELTIRWSEL

VP3 45-37 GIKITHFTTHTSI

63-75 AQFPFNASDSVGQQ

137-150 PGÎ1ELIDVTGITLK

335-346 APLYHAXDVTTQ

VH 1-33 SHXSKQGIFOTVGSGLDHILSLA

Октвыеры:

137-J. (FKASDSVGQQIKVIP)8-K4-K2-K-G

1S7-3 (FPFHASDSVGQQIKVIP)8-K4-K2-K-G

Х-оетаток норлейцика

нкнгидринового теста. При необходииэстп иопрореагирозаапг:^ аминогруппы ацатилировали.

, Перед отщеплением от полимера с пэпч'идилпоякизра удалили Вос-группу и 2,4-динитрофенильну» защиту с гистиднна.»ДеО.".о!;ироБанкс :i снятие пептидов со сколы проводили сменим HF с добазлэнкак п-крезола. Для деблокирования пептидов, cczsprihn?" остатки Тгр, использоввлй смесь HF - л-кразол - л-ъчлхрйвил, а растворы для промывки и экстракции пептидов содерпьли1г.эокантозтанола.

Деблокированные пептиды очищал:: с псгосьл оЕриЗЭ-тм-ФаговоЯ ВЭНХ. Пептиды охарактеризованы данными аминокислотного анализа, FAB-масс-спектрометрией и аислиткческоП обргщеяно-фазовоП ВЭ^Л.

Октамерные пептидные конструкции очадсяк гсль-зильтрацкэй на колонка с еефйдегссом G-25 в 0,1 И ацггт.уго.-; буфере. ' Наличие октамеров в пиках тестировали с помощью -злеетзюфореза в полиакриланидном геле.

С целью упрощения синтеза в ряда пептгасз остатки мэтионина были заменены изостерическнми остатками при этою rrj

учитывали, что такая замена обычно не' , поводит г. сниненко биологической активности.

3. ТЕСТИРОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЛИНФ0ЦИТ0В МЫШЕИ, ПРИМИРОСАВНЕ": ПЕПТИДАИЧ.

Влияние синтетических пептидов из кепсидних белков ВГА на пролиферацию лимфоцитов из лимфоузлов кыаей, примированных этими же пептидами, тестировали, используя мышей линия СВА, BALB/c, а также F1 (BALB/c х С57В16) и FKCBA х С57В1б). Лимфатические узлы извлекали через 8 дней после иммунизации ккзотных пептидами и изучали способность лимфоидных клеток пролиферировать при

Табяица 2. Влияние с'^тгзткчесгих пептидов кз папснднък Оедкоз ВГЙ

на йрояиФере.цка .янмйзцитсз из янк^аузлов кьвей прнмнрсванных этхми дз пептидами.____

Мндзхс стимуляции (СИ)*

Пептиды ВАЬВ/с ?! СВА

(ВА1Л)/схС57В16)

УР1-(1-17) 1.2 1.3** 1.2

V?!-(10-33) ■а.з 6,0 3.1

УР1-(11-25) 3,1 л, 5 1.3

УР1- (73--5.-?) 6,3 2.2 1,1

1[Р1-(75-35) 1.1 1.0 1,0

\'Р1-(11»-133) 1.0 3,0 1.1

УР1-(107-125) 1,1 1.0 1.1

V?!-(115-126) 1.0 0,9 1.0

УР1-(209-221) 1.1 2,2 1.0

УР1-(376-298) 2,5 4,0 3,1

УРЭ-(69-39) 2.4 2,1 1,0

УР2-(30-99) 1.0 1.2 1,2

УРЗ-(43-37) 1.3 6.1 3,0

УРЗ-(52-75) 1.1 3,5 1,5

УРЗ-(137-150) 1,5 1,7 1,8

Ъ*Р«-(1-33) 1.1 2.2 1.5

Соп Д 9,1 10,2 8,1

* приведено среднее значение СИ из трех определений при оптимальных концентрациях пептидов (100-350 мкг/мл); »» эксперимент проводили на мышах ?1(СВА х С57З15).

добавлении этих яе пептидов. О пролиферации ликфоцитов судили по включения лимфоцитами меченного тритием тимидина.

3 таблице 3 приведены значения индекса стимуляции пролиферации, который равен отноаеншо числа ттульсов в минуту в стимулируемых культурах к числу импульсов в минуту в контрольных.

-8В контрольные лунпи к суспензии лимфоцитов добавляли среду, не содержащую пептидов. Результаты считал:; положительными i¡p;¡ значении индекса стимуляции при оптимальных концентрациях пептйдь больше 2. В качестве положительного контроля использовали лимфоциты, к которым добавляли определенные понцеитраьип конпанавалииа A (Con А).

Кроме того, каждый пептид тестировали тасга ка его кктогеннуз активность. Для этого растзоры пептидбв добавляли к суспензии лимфоцитов* из лимфоузлов мышей, не премированных пептидом, а "иммунизированных" эммульсией, еодеркащей PBS и полный адьювант $рейнда (ПАФ). В данном случае нами не было обнаружено увеличения включения тимидина клеточными культурами при внесении в инкубационную среду тестируемых пептидов. Что подтверждает специфичность получение; результатов.

Как видно из приведенных в таблице 2 »¡гнкых, С7и;е/яяция пептидами пролиферации лимфоцитов зависела от гаплоп.па -нзотных. Это обстоятельство характерно для всех пептидов, за исключением пептидов 10-33 и 276-298 белка VP1, когорь*э вызывали пр&кжьер&цию лимфоцитов мышей всех используемых линий. Аналог пептида VP1-(10-33) пептид VP1-(11-25) не вызывал пролиферация лимфоцитов у кыией линии СВА, а пептид VP1-(1-17) вообще не влиял на пролиферацию лимфоцитов мышей используемых для тестирования линий. Возможно, что пептид VP1-(10-33) охватывает участии, где локализованы перекрывающиеся Т-зпитопы, которые узнают разные молекулы la-белков, как, например, это было определено для Т-эпитопов спорозоитной Формы малярийного паразита. Поиск подобных универсальных Т-эпитопов важен для конструирования синтетических пептидных вакцин против любых инфекций.

Пептид 115-139 белка УР1 вызывая увеличение пролиферации лимфоцитов только у ккяеЯ ¥^(ВК1В/схС^В1^) н у Р1(СВАхС57В1б) и не влиял не активность клеточных культур мышей линий ВАЬВ/с и СВА. Его апологи УР1-(107-126) и УР1-(115-126) не влияли на пролиферацию лимфоцитов ми у одной линии мъшей, приыированных данными пептидами, однако внесение отих пептидов в культуры клеток нз лтйюузлов къибй (СЗЛлС5?В1б), прикироваккьи пептидом УР1-<113-139), вызывало пролиферацию лшфоцитов (табл.3). Подобный эффект но бил обнаружен для лимфоцитов ыьзей линий СВА и ВА1Л)/с. Пептид УР1-(126-139) подавлял пролиферация лимфоцитов как у иеикыушп-« шзей.. теп и у примнроаанких пептидами УР1-(115-139)

Таблица 3. Лоцодкгвцкя тгаукоаатшзного участка пептида 115139 из балка 1Р1".

имп/нмн

Иммуноген Антиген 0 100 250**

УР1 -(115- 125) УР1- (115- •125) 7382+1224 8571+1124 9126+1456

V?! -(107- •126) УР1- (107- 126) 11956+2461 12831+1123 12222+ 924

УР1 -(126- 139) УР1- (126- ■139) 11624+ 834 1611+ 927 1675+ 824

;тР1 -(115- 139) УР1- (115- 139) 10544+2639 21858+5264 14692+ 824

и — УР1- <115- ■126) 5780+ 924 26924+4532 30167+2100

УР1- (107- ■126) 5780+ 924 15826+5423 18224+4220

__ М УР1- (126- ■139) 5780+ 924 1224+ 246 2245+1210

ПАФ УР1- (115- ■139) 5544+1189 4833+2264 5692+ 824

— * — УР1- (115- •125) 5544+1189 4924+4532 6167+2100

УР1- (107- ■126) 5544+1189 6826+5423 5224+4220

а. М .. УР1- (126- ■139) ■5544+1189 1289+1456 3245+2210

»- эксперимент проводили на (лотах ^(СВАхС57В1б)г »'-концентрация пептидов (¡г'.г/мл).

или УР1-(126-139). Интересно, что пептид ИР1-(115-139), о состав которого входят аминокислотные остатки 126-13?, не обладал антиррэлиферативнш свойством. Таким образа« ноано предполовить, что фрагмент 115-139 несет в себе два функциональных участка: один из них (126-139) обладает актнпролиферативкык действием, а другой (115-126) стимулирует пролиферацию лимфоцитов, причем, а ¡тс пролнфератнвное действие вьаве снтнпролиффративкого,

П. ЛОКАЛИЗАЦИЯ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВГА С ПОКОЩЬВ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ И лНТИ-ВГА АНТИТЕЛ.

Ранее в нашей группе были проведены исследования по поиску В-эг.ктопов В ГА с понощьв синтетических пептидов, Паптидк 11-25, 7585, 97-111, 101-106, 112-122, 276-298, 290-299 из белкР. УР1, 46-82 белка УР2 и 76-85 белка УРЗ были протестированы на связывание с поликлональной сывороткой реконвалесцеита, с гягаве с сывороткой морской свинки, полученной в ответ па иммыуниз&ция иатишзд: или денатурированным ВГА. В этом варианте ке было обнаружено статистически достоверного специфического связывания сывороток е каким-либо пептидом. В настоящей работе для усиления чувствительности ИФА мы использовали меченные биотином полнклональные человеческие анти-ВГА антитела, выделенные из пула сывороток реконвалесцектов. Наряду с полиплокальными аитн-ВГА антителами мы использовали ранее описанный вкруснейтралиэуюцке моноклональные антитела (МА) НВ-1 (1дС2а), и полученные нами МА В.2.6.8 (1аС2а) и 1.2.2.2 (ЮН).

Для получения НА, направленных к ВГА, мы использозали 15-дневную схему 5-кратной внутрибрюшинной иммунизации мыаей линии ВАЬВ/с низкими концентрациями нативного ВГА - всего 200 нг на

иммунизащяэ одной ныли. Слнякне сплепоцитов с клетками миеломной линии Ao-Q.553.l63 проводили по обиепринятой методике, используя 50% лолиэтиленгликоль МП500. Нлоны-продуцента МА выявляли методом "сэндвич"-ИФА используя з качестве первых внтитед человеческие внти-ВГА гитителв.

В результате нам удалось получить три стабильные гибридонн, продуцирующие НА, связывающиеся с ВГА. МА 1.3.3.3 и 1.3.6.9 относятся з классу 1д'А, В.2.6,8 являются антителами длассо 1дС2а.

Выделение ентитея В.2.б.8, а такие НА НВ-1 из культуральной илп есцитноЯ пидкостеП проводили с помощью еффинной хроматографии на колонке с 5ело;5 А- сефзрозсй. Антитала 1.2.2.3 и 1.3.6.9 выделяли нэ гецмтиш зидяоетей осандеияем полиэтидвигликолек.

Тэстирование специфичности антител полазало, что !1А 1.2.2.3 и 1.2.6.9 помнко ВГА саязывЕптся такг.е и с нш?уиоглобулинами человека и иши 1ай и ТдМ классов. Этот факт дает основание предположить, что на капсиде ВГА и ишуиоглобулинах имептся перекрестные зпг.топы и ИА 1.3.2.3 и 1.2.6.9 направлены к этим эг.итопаи, либо сто связывание обусловливается природой данных МА. Связывания МА 1.3.3.2 и 1.3.6.9 с вирусом Т-лейкемми человека II типа (Н'ШГ-Ш, который использовали в качестве отрицательного контроля, обнорупено ие было. Свойство связывания НА 1.2.2.2 и 1.3.6.9 с иг^муиогпобулинвки делает их непригодными для использования в гсачествэ зторичных антител при тестировании ВГА. В то ае время при сорбцяи антител 1.3.2.2 и 1.3.6.9 на пластике их способиость ввиикодзПстсовать с иммуноглобулинами исчезала, а способность связывать вирус сохранялась, что дает возмонность использовать их в качестве первых актител для иммобилизация вируса.

Прк проведении теста нейтрализации Ы А с подопью МА было показано, что МА В. 2.6.8, являются вируснейтрализушнк:!. Преиикубированиа НА 1.2.Э.2 и 1.2.6.5 с вирусом не влияло иа способность вируса заражать клетки. В то ^е гремя ИА 1.2.2.2 блокируют на 100% присоединение сыворотки реконвалесцента к ВГА. Для КА В.2.6.8 соотзетствуший показатель при такгс; ке концентрациях составляет 60«.

В литературе имеются данные о ваянобтп острт.оо Лэр70 и С1п74 белка УРЗ для связывания вируса с эируснейтрализуюзмми НА, о такке описано получение ВГА-связывавднх антител при нняупизецин кивотных конъвгатом пептида 62-75 белка УРЗ с К1.К. В то ае время иммунизация яивотных октаиарноЯ конструкцией не основе пептида УРЗ-(62-75) не приводила к появлению антител, связывающих ЗГА. Авторы предполагает, что в формирование имда»:одоминантного сайте вовлечена С-концевая часть пептида УРЗ-(53-75), которая не доступна для клеточного рецептора в случае оптймерной ;сонг.трукцки на основе пептида ЛГРЗ-(62-75). В св^зи с зтии прздполояенйе» мы синтезировали октакерные конструкции (197^1, 197-2) на основе пептидов УРЗ-(66-80) и УРЗ-(64-80) (рис.1), которые такие были протестированы на связывание с анти-ВГА ентителгии.

Все синтезированные пептиды тестировались на связывание с анти-ВГА антителами в твердофазном ИФА. Как видно из таблицы 4, нами не было обнаружено связывания пептидов 1-17, 2-33, 6-17, 11.25 и 10-33 из белка \ГР1, охватывающих или частично перекрывающих описанный В-эпитоп 11-25 белка УР1, с поли- или моноклональными анти-ЬГА антителами. Как видно из результатов твердофазного ИФА, пептид УРЗ—(62-75) также не связывался нл с одним из анти-ВГА антител. Октамер 197-1 на основе пептиде \ФЗ-(66-80) взаимодействовал лишь с НА 1.2.2.2 и несколько хуже - с фракцией

ЬуБ \

Ьуз-С1у-0Н

/ Ьуэ

Ркс. 1 Структура октамерных конструкций, где X! - УРЗ-(66-80) или УРЗ-(6-5-80).

1С« из пулй сывороток реконвалесцэнтов. Удлинение мономера на два аминокислотных остатка к М-концевой части (октамер 197-2) привело к резкому увеличению сигнала при взаимодействии со всени антителами.

Связывание со всеми антителами мы наблюдали и для пептидов УР1-(117-139), УР1-(12б-139), УР2-(80-99). Причем аналоги этих пептидов пептиды УР1-(115-139) и УР2-(69-99) связывались только с НА 1.2.2.2. Пептиды, соответствующие М-копцевому участку пептида 107-139 белка УР1 (107-126, 112-126 и 115-126), также как и пептиды УР2-(65-85), УР2-(73-85), не взаимодействовали ни с одним из анти-ВГА антител (табл.4).

Возможно, Факт связывания пептидов со всеми антителами обьясняется случайным совпадением каких-то структурных особенностей данных пептидов. Также можно заметить, что одни и те же антитела связывались с пептидами из разных белков и не имеющих структурных сходств. Подобный Феномен описан в литературе. В

Таблица I. Взцгсгадэйстаие пептидов с оити-ВГА антителами1

Пептид НА Фракция 1дС из пуль сывороток реконвалесцентов

8.2 .6.8 НВ- -1 1.2 2.2

Р/Ы ответ Р/Ы ответ Р/й ответ Р/М отает

УР1- 1-17) 1.0 „ 1,1 1.1 _ 1,0

УР1- 2-33) 1.2 - 1,1 - 1.0 - 1,2 -

УР1- 6-17) 1,1 - 0.9 - 1.2 - 0,3 -

УР1- 10-33) 1,0 - 1.7 - 1,4 - 1,6 -

УР1- 11-25) 1,1 - 1,2 - 1.2 - 1,1 -

УР1- 64-75) 1,2 - 1,2 - 1.4 - 1.2 -

УР1- 75-85) 1,0 - 1,0 - 1.1 - 1.0 -

УР1- 75-92) 1,1 - 1,1 - ид 1,2 -

УР1- 107-126) 1.2 - 1,3 - 1.4 - 1,2 -

УР1- 112-126) 1,4 - 1,3 - 1.6 - 1.2 -

УР1- 115-126) 1.1 - 1,2 - 1,2 - 1.1 -

УР1- 115-139) 1.3 - 1,3 - 6,2 + 1.6 -

УР1- 117-139) 4,2 4- 4,9 + 9,6 + 2, С +/-

УР1- 126-139) 2,9 + 7,1 + 18,2 + 2,4

УР1- 180-195) 1.0 - 1,0 - НД 0,9 -

УР1- 209-221) 0,9 - 1,1 - ИД 1.0 -

УР1- 276-298) 1,1 - • 1.0 - ИД 1,0 -

УР1- 288-298) 1,2 - 0.9 - кд 1,0 * -

УР1- 290-299) 0,9 - 1.1 - •ид 1,1 -

УР2- 42-62) 1,1 - 0,9 - ид 0,9 -

УР2- 65-85) 1,1 - 1,0 - 1,0' - 1.1 -

УР2- 73-85) 1,0 - 1,0 - 1.0 - 1,0

УР2- 69-99) 1,5 - 1,6 - 12,2 + 2,3 +/-

УР2- 80-99) 2,6 + 2,9 + 22,3 + 2,« +

УР2- 178-190) 2,0 +/- 2,0 +/- 1.8 - 1,8 -

УРЗ- 45-57) 1,2 - 1,0 - 2,7. + 1,2 -

УРЗ- 62-75) 1,1 - 1,2 - 1,2 - 1,1 -

урз- 137-150) 1,1 - 1,4 - 3,7 + 1,2 -

УРЗ- 235-246) 1,1 - 1,0 - ид 0,9 -

(продолжение табл. 4)

НА Фракция IgG из

пула сывороток

Пептид Б.2,6.8 НВ-1 1.2 .2.2 реконвалесцентов

Р/М ответ Р/М ответ P/N ответ Р/М ответ

VP4-(1-23) ' 1,0 - 1,0 1,1 - 1,5 -

197-1 2,2 +/- 2.2 +/- 5,7 + 2,3 +

197-2 12,7 + 9,8 + 32,3 + 17,5 +

* Приведено соотношение P/II, где Р - поглощение (-4,492 им) в лунках с пептидами, И - поглощение в лунках, с иммобилизованным ВЯД. Результаты считали положительными при Р/М > 2,2; нд-нет данных.

частности,, в работе по картированию с помощью КА эпитопоп' бе л па аЕ вируса герпеса первого типа было показано, что НА связывались с пептидами из разных участков этого белка и эти синтетические пептиды блокировали присоединение IIA к белку. С покопаю синтетических пептидов имеющих замены ряда аминокислот на глицин, авторами Снло обнаружено, что за связывание с антителами этретственны только определенные аминокислотные остатки и их число значительно меньше, чем предполагалось исходя из общего числа 1ептицов, связывающихся с НА.

5. ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ.

Пептиды 117-139, 115-139 из белка VP1, 69-99, 80-99 из белка !?2, октамерные конструкции, связывающиеся с анти-ВГА антителами, I такие пептиды VP1-(10-33) и VP3-(62-75), перекрывающие описанные 1-эпитопы, были выбраны для получения антипептидных сывороток. !мму1<1<зацию мшией проводили свободными пептидами или их

конъюгатами с белкоы-носителем. Пептид VP4-(1-23) был выбран для иммунизации животных как контрольный пептид, так как он не взаимодействовал ни с одними из анти-ВГА антител, ко вызывал антигензависимую пролиферацию лимфоцитов шшеи линий C57BI5 и СВА и мы использовали мышей линии C^Blg для иммунизации этик пептидом. Линии мышей для иммунизации другими свободными пептидами также выбирали исходя из результатов по антигеизавнсимоЛ пролиферации лимфоцитов. Коньюгати пептидов с овельбуинноы (OVA) или гемоцианинои (KLH) получали при помощи глутарового альдегида. Коньюгаты пептидов с OVA и KLH вводили мылам линии BALB/c.

Иммунизацию проводили по стандартной схеио иммунизации, четырехкратно, с двухнедельным интервалов посла каасдой иммунизации. Имиуиную сыворотку получали па третий день после последней иммунизации.

Тестирование антипептидных антител в иммунных скворотхах проводили методом непряного ИФА. Для тестирования использовали пул сывороток от трех иивотнъзх, иммунизированных соответствующим антигеном. Как видно из результатов, представлении в таблице 5 иммунизация животных свободными пептидами 117-135 и 115-139 белке VP1, 69-99 белка VP2 и VP4-(l-23) привела к появлению в -имуунних сыворотках антипептндных антител.

Пептид VP2-(69-99) содерзит в своем .составе два лизиновш остатка в полоиениях 80 и 85, -аминогруппы которых тькло взаимодействуют с глутаровыа альдегидом во время поньюгеции. Иммунизация животных 69-99-0VA не привела к появлении антител, связывающих пептид VP2-(G0-99), что предполагьет влияние эти> остатков на Формирование антигенной детерминанты, локализованно* на пептиде. Коньюгаты пептидов 117-139 и 115-139 из белка VP1 с

Э7А при . иммунизации вызывали образование антител, связывающих гоответветствушис пептиды.

ГаЭлица 5. Нкмунногзнность синтетических пептидов.

Пэптид Линия мышей Н-2 Титр проти- Титр ВГА-

вопептидных связывающих антител, -1д антител, -1д .

¡7Р1- (10-33-. ВА1В/с й <1 <1

7Р1- (10-33) -к?л ЪКЬВ/с 6 3 <1

УР1-(115-139) СВА к <1 <1

ВАЬВ/с й <1 <1

_ и _ С57В1б . Ь 3,5 <1

¡П?1-(115-139)-ОУЗ ВАЬВ/с а 3,2 <1

1/Р1- (117-135) ■ СВД к <1 <1

С37В1б ь 3,5 <1

1'Р1- (117-13?) -Оуа ВАЬВ/с а 3,3 <1

УРа-(69-99) ВАЬВ/с <1 4,2 3,2

1'Р2- (69-99) -ОУС ВАЬВ/с 6 <1 <1

"Р2-(80-99) СВА к <1 <1

ЕАЬВ/с л <1 <1

С57В1б ь <1 <1

УР2-(80-99)-КьН ВАЬВ/с й 3 <1

УРЗ-(62-75) Г1(СВА х С57В16) к/Ь <1 <1

ВАЬВ/с й <1 <1

(62-75)-ган ВАЬВ/с а 3 <1

УР4-(1-23) С57В1б ь 4 <1

197-1 ВАЬВ/с а 5,1 <1

197-2 ВАЬВ/с а 4,8 <1

Нам не удалось получить атительного ответа к пептидам УР1-(10-33) и УРЗ-(52-75) при иммунизации мышей свободными пептидами. 3 то время как игмунизация коныогатми (10-33)-КЬН и (62-75)-КЬН приводила к появлению пептидсвязываюцих антител. Эти данные, вместе с результатами по локализации на пептидах Т-эпитопов, показывают, что пептиды УРЗ-(10-33) и УРЗ-(62-75) являются слабыми

иммуногенани. Иммунизация мьпаей линии BALJB/c октамеркквли конструкциями на основа пептидов VP3-(66-80) и УРЗ-{64-30) привела к появлению в иммунных сыворотках антител, связываэдих окта^еры с достаточно высокими титрами (табл.6). Однако сыворотки к октамерным конструкциям 197-1 и 197-2 очень слабо связывались с пептидом VP3-(62-75), что указывает на наличие октаыерах новой антигенной детерминанты к которой в основное направлен ьнтктельный ответ. Эта антигенная детерминанта локализована блипе к С-концавоЯ области пептидов и является общей для обоих октенеров. так как сыворотки, полученные в ответ на имыукнзацкз одник октамерон, связывались с исходным сштигокоы и другие октацйрои: с приблизительно одинаковыми титрами.

Таблица б. Ишуноггнность пептида VP3-(62-75) и оптаиерньк конструкций на основе его аналогов.

титр антител, -lg

сыворотка ишобилизсванмий антиген

VP3-(62-75) 197-1 197-3 ВГА

анти-УРЗ-(62-75) <1 <1 <1 <1

анти-(62-75)-KLH 3 3 2,9 <1

анти-197-l 2,8 5,1 ■ 5 <1

анти-197-2 2,2 5 4,8 <1

анти-197-1* 2,5 4,5 нд <1

»-сыворотка, полученная по 15-дневной схеме иммунизации; нд-нет данных.

Нами было получено, что использование 15-дневной схемы для иммунизации мышей ВАЬВ/с октамерными конструкциями, такке индуцирует выработку октамер-связивающих антител (табл.6). Причем,

при исгшльзой^нич 15-,пневноЯ схемы иммунизации, титр сывороток был иине г. среднем в 2-5 раз по сравнения с таковым у яивотных, нммунизкровьннсос по 4-х кратной схема. Эти данные еще раз подтверждают цеяесобразность получения октамерных конструкций для повыкения нмыуногенности синтетнчаскнх пептидов. Предварительно на»эд было получено, что свободные пептиду VP1-(117-139), VP1-(115-139), при использовании 15-днепной схемы иммунизации, не индуцируют 2Ъ!рабстку антипептидных антител, в то время как использование 4-х кратной схемы иммунизации, приводит к положительным результатам.

Снвороткн, полученные после иммунизации мышей октамереми, свободными пептидами и их коныогатами, были протестированы на связывание с нативтем вирусом гепатита А. Тестирование проводили методом непрямого ИФА. D качестве контрольных сывороток выступали сыворотки неиммунных мышей, сыворотки мышей, иммунизированных OVA :¡ KLH. 3 результате оказалось, что только сыворотки животных, иммунизированных пептидом VP2-(69-99), связывались с вирусом (тебл.5, рис.2). Сыворотка к пептиду VP4-(l-23) не взаимодействовала с ЗГА, однако, эта se сыворотка специфически взаимодействовала с IoG из пула сывороток реконвалесцентов.

Б то ае время иммунные сыворотки к пептиду 69-99 белка VP2 не блокировали присоединение IoG из пула сывороток реконвалесцентов к вирусу. Отсюда следует, что зпнтоп, моделируемый пептидом VP2-(69-99), ко является т;укодоминантным на ВГА, либо при естественном развитии заболевания в сыворотке реконвалесцентов появляются антитела, направленные к эпитопам, отличным от эпитопа, моделируемого пептидом. Возможно, что пептид VP2-(69-99) моделирует эпитоп, который узнают 1оМ антитела в начальной стадии

492 nm

-Q- aHTH-VP2- (65-99)

антн-УР2-(69-99)-OVA ВНТИ-VPl-(117-139) акти-VPl-(117-139)-OVi -g- анти-VPl-(115-139) ^ aHTK-VPl-(315-139)TOV/ антн-OVA фон

1/10 1/40 1/160 1/G40 1/2560 1/10240

разведение сывороток

Рис.2. Связывание иммунных сывороток с ВГЛ.

заболевания. В этом случае не исключается использование пептид! VP2-(69-99) или его аналогов для ранней диагностики гепатита А.

Пептиды VP3-(69-99) и VP2-(80-99) блокировали присоединение i пептиду и к ВГА сыворотки анти-УР2-(69-99) (табл.7), подтверада/ специфичность взаимодействия антител с антигенами. Иммунна; сыворотка к VP2-(69-99) связывалась с пептидом VP3-(80-99) < титром 1:10000, но на взаимодействовала с пептидами 73-85 и £5-8! белка VP2. Также преинкубация сыворотки к VP2-(63-99) с пептидом! VP2-(65-85) и VP2-(73-85) не влияла нь связывание иммунно! сыворотки с пептидом VP2-(69-99) и с ВГА. Из полученных дашшз можно сделать предположение, что антигенная детерминанта пептида,

блица 7. Блокчрозснне синтетическими пептидами связывания

даунных сьлороток* с ВГА и с пептидами.

иммобилизо- конкурирую- ов492

сцЕоротка ванный анти- иий пептид*

ген

ВГА _ 1,334

анти-УРЗ-(69-99) ВГА УР2-(69-99) 0,219

(1:200)• ЯГА УР2-(80-99) 0,341

Р,ГА УР2-(73-85) 1,295

УР2-(69-99) - 2,394

\fP2- (69-99) УР2-(69-99) 0,153

УР2-(69-99) УР2-(80-99) 0,456

УР2-(69-99) УР2-(73-85) 2,454

Рабочая коцентрация пептидов 10 мкг/мл.

оде^пруквдр.ч эпитоа ВГА, локализована ближе к С-концеВой части ептила УРЭ-(69-99) н в ее Формировании участвуют аминокислотные ствтри с «0 (85)-го по 99-й.

ВЫВОДЫ

1. С помоиыо компьютерного анализа аминокислотных последо-зтсльностей копсидных белков ВГА выбраны участки, представляющие эбой потенциальные Т- и В-эпитопы. Проведен твердофазный синтез эптидов, перекрывающих выбранные участки.

2. Найден ряд пептидов, перекрывающих участки 10-33, 75-92, 15-1 39 276-293 болка УР1, 69-99 белка №2, 45-57 белка УРЗ и 1-23

белка VP4, влияющих на пролиферацию лимфоцитов мысе примированных этими se пептидами.

3. Проведен скрининг пептидов с помощью моко-поликлональных анти-ЕГА- антител. Пептиды из областей 115-1 белка VP1, 69-99 белка VP2, а такае пептиды 65-57 и 137-150 белка VP3 связывались с енти-ВГА антителами.

4. Исследованы иммуногенкые свойства синтетических пелтздо; Локализован имиуиоактивный участок на белке VP2. Иммунизация мьшг. линии BALB/c синтетическим пептидом VP2-(69-99), перекрывай»» данный участок, привела к появлении в иммунных сыворотках В Г/ связывающих антител.

5. Получены НА В.2.6.8, 1.2.2.2, 1.2.6.9, связывание вир! гепатита А. НА В.2.6.8 являются тскяо вируснейтрализую'зхыи. f мокно использовать в иммунохимических исследованиях капсида ЕГА для проведения ИФА.

Основные результаты диссертационной работы изложены следующих публикациях:

1. A.T.Kozhlch A.E.Gabrlellan, L.D.Tchlkin, L;H.Kullf V.T.Ivanov.-Proorams for predicting T-fcell epltops and thai applicatitlng on to hepatitis A virus // 18th Annual UCLA SympbsJ on molecular & cellular biology, J. Cel. Biochem. Suppl. 13A 1S8S P.272.

2. А.Т.Кохич, А.Э.Габриэлян, JI.H.Кулик, Л.Д.Чипш Т.А.Насташенко., D.В.Кусов..М.С.Балаян.- Гинтетичекма подходы изучению антигенной структуры вируса гепатита А // 7-й Симпозиз СССР-ФРГ по химии пептидов и белков. Тезисы докладов. 1989. с.23

-233. А.Т.Когчч, Л. Д. Чикин, Л.II. Нулик, А.Э.Габриелян.-еятнфкквцик Т-клеточных эпитопов вируса гепатита А //. Всесоюзный ;глознуи по химии пептидов. Тезисы докладов. 1990. с.б.

4. Кулиг. Л.Н., Беркова Н.П., Кокич А.Т..- Антиидиотипические титана- поводы к создания новой вакцины против вируса гепатита // Международная конференция "Медицинская биотехнология, муиизация, СПИД". Т^сисы докладов. 1991, S6-7. ' 5. Kozhlch А.Т..- Gabrlellan Д.Е., Ivanov V.S., Kullk L.M., tilkin L.D. Synthetic approaches to hepatitis A virus antigenic rnctur«. In: Chemistry of peptides and proteins.'Vol. 5/6. Proc. i USSR-FRG зуир. chemistry of peptides and proteins and 8th FRG-3R зукр. cJieaEistry of peptides and proteins / Ed. Jrandenburg, V.Ivsnov, IJ.Voelter.- Aachen: Mainz, 1993", p.849-J.

6. Л.Н.Кулкк, Т.А.Насташенко, Н.П. Беркова,■ О.H. Попова, 1.Хозилская, Е.А.Стукачева, В.С.Иванов. Получение и свойства юклонадъиых антител к вирусу гепатита А. Биотехнология, 1993, 9, С. 2-6.

7. Л.Н.Кулик, В.С.Иванов, А.Э.Габриэлян, Л.Д.Чикин, '.Иванов. Поиск Т-эпитопов вируса гепатита А с помощью |тетических пептидов.- Биоорг. химия, 1993, Т. 19. No. 12, С. 9-1172.