Теоретические и практические подходы к созданию искусственной противоящурной вакцины на основе синтетических пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКДДЕШ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ил. Ы.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

ВОЛЫШНА ОЛЬГА МАРКОВНА

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ ИСКУССТВЕННОЙ ПРОТИВОЯЩУРНОЙ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

02.00.10 - Биоорганическая химик, химия природных и физиологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

МОСКВА 1992

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный консультант: Академик В.Т. ИВАНОВ Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Ю.П.ШВАЧКИН

доктор химических наук, профессор В.А.ШИБНЕВ

доктор биологических наук, профессор В.П.ЗАВЬЯЛОВ

Ведущая организация: Институт иммунологии Минздрава Российской Федерации

Защита состоится 1993 г.

в 10 час. на заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: П7871 ГСП Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. Ы.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Автореферат разослан " декабря 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

ОЕЩ&И ХАРШЕК1СТИК4 РАБОТ

Актуальность проблзш. Зг.цнта от вирусных с

помозьв вакцинации шляется одшш из наиболее эффективных нетодоз борьба с заболеванияш вирусной природы как человека так и аивотшх. Однако градационная вакцинация не ыояет решить всех проблей контроля над инфекционными болезнями, поскольку существукцио вакцины, приготовленные на основе шактивнровашгого игруса, ншвт существенные недостатки, связанна с наличнец пршэсей, с остаточной инфекционностыэ, трудностями производства и хранения, а такза ншуностиыуляцией нагелатальных процессов. Кроиа того, для шопа заболеваний вирусной природы ко супаствуаг эффективных традиционных вакцин.

Достижения в иммунологии, ноле1сулярной биологии и биоорганичзскоЯ хиши явились основой для реализации другого, бояео перспективного подхода к создания противовирусных вакщт, гаклвчагзщагося в индукции эффективного шшунитета с помощью "неинфекционных" нолэкул, получаемых иатодаш! пептидного синтеза. Прзинущаство паптндшл вакцин по сравнении с традационншн взкцкнацн, пояученгаши на основе инэкттозирсззгашго вируса, загиючаотся з их химической гоиогенноспс, некнфзкциснностк, строгой направленности ниыукного ответа и отсутствии псбочшх эффектов. Выгодно отличает пептидные вакцшш то, что их производство не связано с переработкой внруссодерявадх отходоз.

Синтез пептидов, соответствующих участкам полипептидной цепи вируснн2 белков, связывающихся с шфуснейтрализующшя! антителаын, осуществлен для ряда возбудителей инфекциошшх

Принятые сокращения: dcc - дицшигагексилкарбодиимид, новт -I-оксибензотриазол, кы - геноциашш улитки, ПАЙ - полный адъювант Фрейнда, НЛО - неполный адызвант Фрейнда, 11®А -гашуноферментный анализ, ИД5(} - инфекциогшая доза вируса, вызывающая заболевание 50 % зшвотных, ГЦДд0 - тканевая цитотоксическая доза вируса, вызывающая 50%-гшй цитотоксический эффект, ТПА - титр противопептидных антител (-iog10), ТВА -титр вируснейтрализущих антител (-log,).

заболеваний: вирусов гриппа, гепатита В, полиоыиелита и др. Для создания на основе пептидов иммуногенных препаратов, способных запищать экспериментальных нивотшх от заболевания, в большинстве случаев используют конъюгаты этих пептидов с белковыми носителями. Однако применение белковых кокьигатов осложнено нехселательной стимуляцией иммунного ответа на саи белковый носитель, сохраненном Т-клеточной памяти после иммунизации коньпгатои лишь на чужеродные Т-эшггопы белка-носителя и химической неоднородностью конъюгата.

Новый и значительно более перспективный подход к созданию иммуногенных пептидов связан с использованием Т-хелперных эпитопов вирусных белков и с получавши сравнительно небольшое пептидов, содераащих одновременно вирусспецифические В- и Т-эгштош. Такие пептидные вакцины являются химически индивидуальными препаратами, они способны без конъюгации с белковым носителем индуцировать строго направленный противовирусный иммунитет, стимулировать как В-клеточную, так и Т-клеточнув противовирусную память и обеспеч1шать долговременную защиту от заболевания. Однако реализация такого подхода требует решения целого комплекса проблем'; связанных с получением детальной информации о распологенни иымуноактивных участков в последовательности вирусных белков и с выявлением иммунодоминантных противовирусных В- И Т-эпитопов, с изучением механизмов противопептидного иммунитета и связи его с противовирусным иммунным ответом, и, в конечном счете, с установлением последовательности пептидов, несущих все ишуноактивные участки вирусного белка, необходимые для стимуляции защиты от заболевания.

В настоящее время в ряде стран ведутся исследования, целью которых является создание чисто пептидных вакцин для вирусных инфекций, но до сих пор нэ получено результатов, позволяющих использовать синтетические вакцины в практике.

Данное исследование посвящено разработке теоретических и практических подходов к созданию чисто пептидной противовирусной вакцины на примере вируса ящура.

в ряду различных вирусов, моделирование антигенных и протективных участков которых пытались реализовать с помощь» синтетических пептидов, особое место занимает вирус ящура. Простота антигенной структуры и наличие доступной естественно

восприимчивой к вирусу шшотаоЗ иоде ли позволили накопить сущесгвоннуэ гаформащпо о структуре я пэханизиах функционирования вируса. Однако, из смотря на значительное число работ, посвященных изучению антигенной структуры вируса щура, данные различных исследователей о расположении в-эпитопов и вирусных белках весы» разноречивы^ Нет сведений о вирусспецкфических Т-эпитопах о структуре белков, а такхе о проявлении свободный» пептидными фрагментами собственной нммуногенности, без конъвгзщш с белковым носителем и без введения в последовательность чуаеродных остатков аминокислот. Описанные к настоящему времени синтетические пептидные фрагменты белка вируса ящура на удовлетворяют требование, предъявлявши к чисто пептидный вакцинам, полноценный противовирусный тшуногонам, ц не обеспечивают стабильной защиты природковоспршшчивых к ящуру зшвотных от заболевания.

В связи с этим актуальной представляется проблема получения пептидного препарата, способного в свободном виде, без коныэгацш с белковым носителей, обеспечивать устойчивый противоящурзшй тояушггет у естественно восприимчивых к вирусу ящура еивотшх.

Цели и задач!! работы. Настоящее исследование посвящено разработке на примера вируса ящура комплексного подхода, позволявшего с псшщьш синтетических пептидов локализовать Еысокошшуногешшэ фрагменты вирусных белков, содержащие иммуноактивные участки, необходимые для индукции противовирусного иммунитета, а именно вирусспецифическио В- и Т-эпитопы, и выявить пептиды, способные в свободной виде, без конъюгации с бзлкоы-ностггелеы, обеспечивать защиту от заболевания при заражении вирусом и пригодные для создания на их основе синтетических противовирусных вакцин.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Осуществить выбор на основе теоретических методов анализа и данных литературы потенциальных имыуноактивных участков белка

вируса ящура. Синтезировать выбранные участки белка и их перекрывающиеся фрагменты.

2. Изучить способность свободных пептидов и их конъюгатов с белком-носителем индуцировать образование противопептидных и вируснейтрализующих антител у лабораторных аивотных - мышей различных линий, кроликов и морских свинок, а такге вызывать

защиту морских свивок от заболевания яцурои,

3. Локализовать противопептидные и противовирусные В-зшггопы, а также противопептидные Т-зшггопы в последова тельности иммуногенных пептидов.

4. Определить среда иммуногенных белковых фрагментов пептиды, способные индуцировать вирусспецифяческий Т-хелперный клеточный ответ.

5. На основе полученных результатов выявить пептид оптимальной структуры, включающий все имыуно&ктивше участки, необходимые для индукции противопептидного и противовирусного иммунного ответа и обладающий наибольший защитный эффектом на лабораторных животных.

6. Изучить способность выявленного синтетического пептида индуцировать образование противопептидвых и вируснейтрализуюсих антител, а также протективный иммунитет у природновоспршшчивых к щуру животных. Выбрать вид животных, для которых синтетический пептид проявляет максимальный протективный эффект. Изучить различные адъювантные системы для иммунизации животных синтетическим пептидом, выбрать адъюваит, пригодный для использования с синтетической вакциной в ветеринарии.

7. Осуществить химическую модификации выбранного пептида, позволяющую улучшить его протектившэ . свойства, Изучить свойства модифицированного пептида на лабораторных и природновоспршшчивых к ящуру животных. Провести контрольные испытания ящурной вакцины, полученной на основе синтетического пептида в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ящурным вакцинам в ветеринарии.

Предложенные подхода были апробированы на белке урх вируса ящура лабораторного штамма 0ХК, внтигенные свойства которого наиболее подробно изучены и описаны в литературе. Затеи, на основе результатов работы по вирусу штамма О^К, были предприняты более широкие исследования для вируса штамма А22> вакцинация против которого необходима во многих районах СНГ.

Научная новизна работы. . В настоящем исследовании разработан подход к выявлению пептидных фрагментов вирусных белков, обеспечивающих протективный противовирусный иммунитет. Впервые локализованы и синтезированы пептиды последовательности иммуиодошшантного района белка урх вируса ящура штаммов 0гК и А22> способные в свободном виде, без конъюгации с белковым

носителем, индуцировать протвитнвный противоящурный иммунитет. В последовательности тшуводошпантного района бе"": ур1 В1фуса штаммов 0гК и ¿22 определены В- и Т-эпитопы. Установлена зависимость между способностью пептидов индуцировать пропшопептидаыа ентитода, наличием в последовательности пептидов функционально вахта участков - В- и Т- эпитопов и протективной активностью пептидов на лабораторных животных. Показано, что участок связывания антител, индуцируемых высошпшуногенныы пептидом, зависит от вида иымунизируешх аивотных, а такяе различается внутри одного вида. Выявлены и синтезированы ранее неизввстшэ фрагменты Овлка ур^, не входящие в шшунодошшантныЭ район, обладающие способностью в свободной виде, без конъюгации с белковым носителем, индуцировать образование противопептидных антител. Впервые определены участки балка ур1, активирующие Т-хелперные клетки, распознаваемые вирусом. Проведенные исследования позволили синтезировать ранее еэ описанный высокоактивный пептвд, пригодный для создания на ого основе синтетической противоящурноа вакцины.

Практическая значимость работы. На основе липофильного синтетического пептида - фрагмента белка вируса ящура штамма А22» совместно с Всесоюзным научно-исследовательским ящурным институтом (г.Владимир) разработан противоящурный вакцинирующий препарат, не уступающий по эффективности действия традиционной противоящурноа вакцине и пригодный для защиты овец от заболевания ящуром (вирус штамма А22). В настоящее время подготовлена нормативно-техническая документация на синтетическую противоящурную вакцину и препарат проходит контрольные испытания для получения разрешения на его использование в ветеринарии. Внедрение синтетической вакцины в сельское хозяйство явится первым в мировой практике примером практического использования искусственной вакцины, полученной на основе синтетического пептида.

Определенный в работе участок не входящий в основной иымуногенный район, способный' активировать вирусспецифические Т-хелперные клетки, может быть использован как "Г-клеточный" носитель протективных В-эпитопов для противоядуршх вакцин следующего поколения. Включение этого участка в состав вакцин, получаемых как методами рекомбинантной ДНК-технологии, так и

пептидного синтеза, позволит повысить шшуногешую а протективнув активность вакцин нового поколения и обеспечить индукцию вирусспецифических Т-клаток памяти, распознаваемых различными серотипами вируса ящура.

Разработанные в данной работе и апробированные для вируса ящура пути выявления вдсокоиммуЕОгеншх пептидов ыогут быть использованы для локализации иыыуноактившх участков и изучения антигенной структура различных вирусов, содергащих последовательные В-эпитопы, а такао для вшшленияния пептидов, обладающих защитным противовирусный эффектш.

Апробация полученных данных. Результата настоящего исследования были дологеш на" vi, vil, vin Всесоюзных симпозиумах "Химия пептидов н Садков" (Рига, 1983, Таллин, 1987, Рига, 1990), HQ 16-ой Конференции Садарации европейских биохимических обществ (Москва, 1534), на х Американской пептидном симпозиума (Сент-Лунс, ISQ7), на 6-огз, 7-ом и 8-оа Советско-западногерманских сиипозиуыах по яишн пептидов и белков (Гамбург, 1987; Дшшаая, ISB9, Асхен, 1991), на симпозиума "Структура, биооштез а купюрах молекулярных элементов иммунной системы" (Пущшо, 1337), на PtsîCKoa научном международном симпозиуме "Иммунологическая диагностика и иммунопрофилактика вирусов животных" (Грайфсвальд, 1989), на ucLA симпозиуме "Технологические достнгешш в разработка вакцин" (Парк-Сити, 1988), ва 20-ои и 21-ои Европейских пептидных симпозиумах (Тюбинген, 1988} Платка д4Аро, 1990), на I Всесоюзном съезде иммунологов (Дагомыс, 1989), на xiv Менделеевском съезда по общей и прикладной хзазш (Ташкент, 1989) на 1-ом Израильско-Советском семинаре по пептадаи к белкам (Реховот, 1990), на ucla симпозиуме "Синтетическнэ пептида" (Ориско, 1990), на I?-c:.¡ iupac симпозиуме "Химия природных соединений" (НькьДели, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 37 печатных работ, в тон числе имеются 2 авторских свидетельства, I авторская заявка и два обобщающих обзора (Журнал всесоюзного химического общества им. Д.И.Шнделеева, 1988; Bioaedicai

Science, 1990).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Вирус япура относится к семейству пнкорлавнрусоз, по антигенным характеристикам вирус подразделяется на 7 серотипов и 70 субтипов. Капсид вируса образован четырьмя белками, из которых только белок vpx ответственной за основные антигенные и тшуногешшо свойства вируса. Участок 130-160 белка vi^ является шшушдоышганттш районом и с-ковцавой участок 200-213 - ыинорнш! ишуногенным рвЙОЯОИ белка (Strotaaiar at al., 1902) . Защита лабораторных зиготных от заболевания ящуроы стимулируется при иммунизации белковыми коньвгатаыи фрагментов белка VPj I4I-I60, 200-213 (Bittle at al.,1932) и 144-159 (Piatt at ai.,1932), а такяе свободными пептидами 141-158-ProCyaGly, 200-2I3-ProProSor-I4I-I58-ProCysGly и CyeCye-200-2I3-ProProSer-I4I-I58-ProCysGly (DiMarchl at al.,1986), Однако d случае крупного рогатого скота активность проявляет лишь последний 40-членный пептид, но и он не обеспечивает стабильную защиту животных от заболевания. Кроме того, щадуцируешА 40-членныц паптидоы ш&фшый ответ отличается от противовирусного шшунитета как по подклассу антител, ток и по специфичности Т-клеточкого отпета, поскольку активированные эггш пептидом Г-хелперные гслетки не "узнают" Фрагменты основного и шторного гшмуногенных районов белка vpx.

(Flynn et al.,1990; Hulcahy et al.f 1990).

В настоящем исследовании был разработан комплексный подход к выявлению высококшуногенных протективных пептидов и создашш на их основе синтетической противоящурной вакцины. Первый этап исследований включал апробацию предложенного подхода для вируса ящура наиболее хорошо изученного лабораторного штамма 0гК, затем была проведена работа для вируса штамма А22' вакцинация против которого актуальна для иногих районов нашей страны. Эксперименты, связанные с работой с вирусом ящура, были проведены во Всесоюзном научно-исследовательском ящурном институте (г. Владимир).

ОСНОВНЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ, ПРШЕНЯШЫЕ В РАБОТЕ Синтез пептидов

Использовашше в работе пептида были синтезированы классический, либо твердофазный методом. Для классического синтеза в растворе использовали стратегия максимальной запиты функциональных груш и применяли блочную конденсацию защищенных фрагментов. Конечное деблокирование пептидов проводили методой переносного гидрирования, либо с помощью еидкого фтористого водорода. Для анализа степени гомогенности проиекуточшх продуктов использовали тонкослойную хроматографию и высокоэффективную адсорбционную, обращеннофазовую и эксклхшонцую хроматографию. Для оценки индивидуальности свободных пептидов применяли аминокислотный и н-когшевой анализы, даншэ ионообменной и обращешюфазовой высокоэффективной хроматографии, о также ЯМР-спекгроскотш и ыасс-споктрометрии. Твердофазный синтез пептидов проводили в ручном варианте либо на 4-(оксима тил)-фенилацагаыидоыетил-полимерв (рдм-полимере), либо на хлорме тилиров аннои сополимера стирола с дивинилбензолоы. Защитные группы были выбраны в расчете на конечное деблокирование кадким фтористым водородом. Реакции конденсации проводили двукратно, первоначально методом симметричных ангидридов, а затем осс/новт методой; в случае полноты протекания реакции менее 99% конденсацию повторяли третий раз, используя осс/новт метод. Для введения в пептидную цепь остатков вооазп и вос01п использовали метод п-нитрофениловых эфиров, остаток восАгд(Тоз) вводили осс методом. Кавдый цикл синтеза завершали ацилированием уксусным ангидридом. Деблокированные пептиды охарактеризованы данными аминокислотного анализа, обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии, анализа н-концевых аминокислот и масс-спектроыетрии. Иммунизация животных

Лабораторные юшотные (кролики, морские свинки и. мыши) были иммунизированы свободными пептидами или их кгл-конъюгатами дважды в дозе 100-200 мкг пептида с интервалом в . 44 дня, либо однократно в дозе 50 мкг. Первую иммунизацию проводили в ПАФ, для второй иммунизации использовали НАФ. Однократную иммунизацию, кроме специально оговоренных случаев, проводили в ПАФ. На 55 день после первой иммунизации (либо на 28 день после

однократной иммунизации) отбирали образцы крови. Иммунизации крупного рогатого скота (телки весом 400-450 кг) и овэц (весом 40-50 кг) проводили различными дозами свободных пептидов по той зе схеме.

Титр противопептидаых антител (ТПА)

Противопептидные антитела определяли методом непрямого ИФА (ige отват), ТПА расчитывали как разведение сыворотки, выраженной в -lg, при которой величина оптического поглощения превышает 0,1. Титр вируснейтрализухщих антител (ТВА)

Бируснейтрализуицуп активность определяли на клетках свиной почки против I00-320 TUHgQ. К клеткам добавляли вирус, предварительно инкубированный с сывороткой в различных разведениях. ТВА расчитивали как разведение сыворотки, выраженное в -iog2, при котором наблюдается 50Х-ный тканевый цитопатический эффект. Протективный (защитный) эффект

Ыорским свинкам для определения протективного эффекта на 55 день (при двукратной иммунизаци) и на 28 день (при однократной иммунизации) вводили 200-500 ИД50 вируса ящура. Защиту определяли как соотношение числе незаболевших гивотных к обцему числу зараженных животных. Крупному рогатому скоту и овцам вводили на 60 день поело первой иммунизации (при двукратной иммунизации), либо на 30 день (при однократной иммунизации) 10 ООО ИД50 вируса ящура. Неззболевшиш считались животные, у которых в течение 7 дней после заражения отсутствовали клинический признаки заболевания и вторичные язвы. Конкуренция между пептидными фрагментами белка vp^ за связывэ-ние с сыворотками "

На плашки наносили изучаемый пептид в концентрации 20 мкг/мл. Полученную против изучаемого пептида сыворотку. либо противовирусную сыворотку в разведении I/4-I/600 инкубировали с синтетическими фрагментами белка vpt в концентрациях от 50 нМ до 0.4 нМ. Инкубированную сыворотку вносили в лунки и измеряли ее связывание с изучаемым пептидом методом ИФА. Процент ингибирования расчитывали, принимая ингибирование связывашя контрольным пептидом за 0%. Антигензависимая пролиферация лимфоцитов

Мышей иммунизировали 100 мкг изучаемого пептида в ПАФ, через 7 дней периферические лимфоузлы извлекали и инкубировали 3 суток

с пептидами в концентрациях от 100 икМ до 0,1 шеи, затеи вносили [Зн]-ттшдан и через 18 часов оценнвалн пролиферации клеток по включению [%]-тшидина, измеряя число импульсов в минуту (иш/ыин). Согласно данным литературы (Loa et ni. ,1979) большинство пролнфарирувдих клеток относится к популяции Т-лимфоцитов.

Способность синтетических пептидов усиливать образование

Ёируснейтрализуютх антител

Кроликов иммунизировали пептадаш в доза 200 ккг в ПА®, на 28 день после иммунизации еиботеш ввешш очищенный инак-тивироващзыа вирус ящура в доза 5 шег d HAS. На 35 день после иммунизации отбирали образца крови и опрздзляли ТПА и ТВА.

I. ПРОТЕКТИВНЫЕ ОРАШЕНТЫ ИШНОДОМШНГНОГО РАЙОНА БЕЛКА VPX ВИРУСА ЯЩУРА ШТМ2.1А OjK

I.I Синтетические фрагшнты шшунодо^шантного района белка vp1 вируса ящура иташа 0ХК

В работе использованы сиктетич8скиег " фрагменты иммукодоминантного района белка vpx, перечисленные на рисунке 11 Пептиды были синтезировании классический штодоа в растворе с использованием переносного гидрирования для конечного дсОлокирования.

136 141 145 148 152 159

ï-n-r-n-l-v-p-n-l-r-g-d-l-q-v-l-a-q-k-v-a-r-t-l

145 159

I_I

145 152 i_i

136 152

i__i

136 148

i_i

141 148 i__i

141 • Í52 i___i

Рис. Г. Синтетические фрагменты иммунодоыинантного района белка vpx вируса ящура штамма 0ХК.

Пептид последовательности 145-159, продетавллет собой укороченный па одон аишокислотнШ остаток гзн?э описапный Фрагмент vpa, обаспачшзащкЯ в вида конъегата с raut защиту лабораторных животных от заболевания ящуром (pfaff et ai., 1982). Фрагменты 135-152 и 136-148 ранее не были описаны, они начинается с экспонированного на поверхности вириона остатка туг136 и включают высоковариабвльшй район белка vpx 136-144. Kfcoua того, для опрадаления участков, ответственных за проявление пептцдаш биологической активности, был синтезирован ряд парекрывавдихся фрагментов основного иьшуногенного района: 145-152, 141—148 И I4I-I52.

1.2 Шшуногвнныэ свойства фрагиентов ишунодошшантного района балка vpx вируса ящура штамма 01К.

Активность синтетических пептидов была охарактеризована в опытах на кролпеах и норских свинках (табл.1) определением титроз противопептидаых, вируснейтрализувдих антител и протактивного эффекта. Результаты испытаний показали, что пептид 145-159 не проявлял вируснейтрализуквдеа и протективной активности, Инцунизадия . гал-ионьпгатом пептида приводила к образованно противопептидкых ентнтел с еысоюш титром, одноко эти антитзлз, на иогли нейтрализовать вирус и вызывать защиту животных. Свободный пептид 145-159 на был способен вызывать образование антител.

Среди синтетических фрагиентов, начинающихся с остатка Tyt*3®, наиболее высокув активность проявлял пептид 136-152. Запита морских евююк была 80%-ной при иммунизации конъюгатом пептида с klh и IOOiS-ной при ишунизации свободным пептидом, несмотря на 'то, что образующиеся против свободного пептида антитела на обладали вируснейтрализуицей активностью in vitro. Однако нельзя исключить, что на самом деле эта активность невелика и для ее обнаружения не хватает чувствительности метода, как было показано для пептида 136-148.

Более короткий пептид 136-148 обладал 50-60%-ным защитным эффектом. Как и в случае пептида 136-152, свободный пептид 136-148 и его кш-коныогат проявляли сходную активность. Вируснейтрализувдая активность противопептидаых сывороток, полученных как при иммунизации конъюгатом пептида с klh, так и

Таблица I. Иммуногенныэ свойства синтетических фрагментов белка vp1 вируса ящура отеша ОхК

Иммуноген* Кролики Морские свивки

ТПА ТВД ТВА Защита

145-159-кш 3.5 <1.0 <1.0 О/Б

145-159 <1.0 <1.0 <1.0 О/б

136-152-кш 4.4 5.0 2.5 4/6

136-152 4.4 <1.0 1.5 5/6

136-148-кш 3.5 <1.0 3.1° <1.0 2/4

136-148 3.5 <1.0 2.9° <1.0 3/5

I4I-I52-KLH 3.5 <1.0 <1.0 О/Б

I4I-I52 <1.0 <1.0 <1.0 0/5

I4I-I48-KLH 3.5 <1.0 <1.0 . 0/5

I4I-I48 <1.0 <1.0 <1.0 0/5

двукратная иммунизация в догэ 200 incr ^

адоза вируса составляла 10-32 ИШ50.

свободным пептидом, отсутствовала. Тем нэ шнге, при сшшошш дозы вируса со 100-320 ТЦД50 до 10-32 ?ЦД50 при провадзши реакции нейтрализации в сыворотках кролик® б ubi обнаруаош вируснейтрализувщие антитела с титрами 2,3-3,1.

Иммунизация гивотшх конъвтатвш пептидов X4I-I48 и 141—152 не приводила к образовать вируснзЕтралпзусзнс антител и защите янвотных. Свободные пептида I4I-I52 п I4I-I48 на обладали собственной тшуногеиисстьз.

Таким образом, тщуногенную и крогекптаув активность проявили пептиды 136-152 и 136-148. 03а пзптида явились полноценными иммуногенаш в свободно:: ыгдо, без конъюгации с белком-носителем.

1.3 Определение В- и Т-згогголов тшунодешшаатного района белка vi>j труса ящура штамма OjK

Согласно сущоствуккш представлениям о механизмах ивдужцин

ншуиаого отвага, пошюцашшЭ Ешиуноген - фрагмент вирусного белка, долгвн содержать функционально важные участки: В-зпитоп и Т-зштоп. Поскольку было показано, что п«лгцд 136-152 является гашуногенои, способный индуцировать образование противопептвдных антител с высоким титром, а также защищать животных от заболевания, предстояло определить участки связывания этого пептида с противопептидшлм и с противовирусными антителами - противопептидный и противовирусный В-эпитопы. Локализации В-эпитопов в районе 136-152, удалось провести с помощью перекрыващихся синтетических пептидов этого участка (рис.1): активность пептидов изучали в конкуренции за связывание противовирусной сыворотки кроликов с пептидом 136-152 методом юшуноферментного анализа (рис.2а).

Рис.2. Конкуренция между фрагментами белка вируса штамма ОдК и пептидом 136-152 белка вируса ящура штамма 0гК за связывание с противовирусными кроличьими антителами (а) и противопептидшши (на пептид 136-152) антителами мышей линии ваьв/с (б). Контроль - пептид - 90-98.

Проведенные исследования показали, что пептиды 1^41-152, 136-148 и 141-148, в отличие от пептидов 145-159 и 145-152, способны ингибнровать связывание противовирусных антител с пептидом 136-152 (рис. 2а). При изучении конкурирующей способности укороченшх пептидных фрагментов в реакции пептида 136-152 с противопбптишл".; антителами мышей были получены

1001

136-152 /.1А1-152 136-К8

^•ю-иа

039 1,56 6,25 25 Концентрация ингибитора 1нМ)

0,1 156 25 Концентрация ингибитора !нМ)

аналогичные результаты (рис. 26): ингибируэдуп активность проявили пептида I4I-I52, 136-148, I4I-I48. В обоих случаях минимальным фрагментом, способный конкурировать с пептидом 136-152 за связывание с сыворотками, был пептид I4I-I48. Представленные разульты позволила утвзрздать, что вирусспецифический в-эпитоп локализован ыегду остатками 141 и 148. Необходимо отметить, что полученные результата согласуются с данными литература, указывавши на вагшсть остатков 144, 148 (Stave et.al. ,1998) It УЧЗСТКО 143-146 (Parry et.el.,1989) бежа vp1 в формировании нейтрализующих ашггопов шрусо езтрэ Tima 0.

Для изучения зависимости проишшэппцщого е~^унеого ответа от ir-re иного контроля, шщуногенпость свободного пептида 136-152 была исследована на линиях шэй, различающихся типом н-2 локуса основного комплекса гастосошэсяЕОста.

Как видно из табл.2, высокий тктр щютивопзппзееых езтптол

Таблица 2. Емыуногенные свойства пептида 136-152 белка vp1 вируса ящура штамца О.К на шаах различных линий

Ишуноген* Линия ШВЗЙ Н-2 Ш.

136-152 ealb/c й 4.4

сзн к 3.1

cea/j к 3.1

с57в1/6 Ь <1.0

136-152-КШ с57в1/6 ь 4.4

*аивотных иммунизировали двагды. в доза 100 шт

был получен при иммунизации шве2 H-2d п Н-2к гашгогапа. В то se время шети линии CS7BL/6 Н-2Ь гаплогипа не давали иммунного ответа на пептид. Такш образом было показано, что шыуишй ответ на пептид 136-152 находится под контролен ir-гена. Использование пептида 136-152 в виде кш-коньюгата позволило обойти ir-генный контроль и стимулировать образование противопептидных антител у мышей линии C57bl/g.

Проявление свободным пептидом 136-152 собственной ша/уногенности, без котгезтда с белховгд« носителем, свидетельствует о нажгли Т-згпггопа в последовательности пептида. В связи с этим продстззлялось нообзодизсд» подтвердить присутствие Т-эпитопа в последовательности 136-152 пептида в тесте in vitro и определить участок, ответственный за активацию Т-хэлперных клеток этим поптидоы. Т-клеточная активность пептида 136-152 была исследована в тесте in vitro на "отвечающей" линии шией balb/c (рис. 3). Мыши были иммунизированы пептвдом 136-152, затем были выделены клетки периферических лимфоузлов шлей и изучена способность пептидов 136-152 и 136-148 стимулировать деление клеток.

Результаты испытаний показали, что фрагменты 136-152 и 136-148 способны индуцировать Т-клеточную пролиферацию, хотя активность пептида 136-152 значительно выше активности пептида 136-148.

Рис.3. Антигензависииая пролиферация лимфоцитов периферийных лимфоузлов мышей balb/c, иммунизированных пептидом 136-152 бежа vpt вируса штамма OjK, при стимуляции in vitro пептидами 136-152 и

136-148. Пептиды 90-98 и 136-152 белка vpx вируса [ Пептид ],мкМ штамма А22 были использо-

• ваны как контроль.

Проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что фрагмент 136-152 vpx вируса ящура штамма OjK содержит вируснейтрализующнй ' В-эпитол, " индуцирующий образование вируснейтрализующих противопептидных антител и обеспечиващий протективный эффект этого пептида, и Т-хелперный эпитоп, позволяющий пептиду.136-152 проявлять иимуногенную активность в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем.

Таким образом, для хорошо изученного вируса штамма OjK

136-152 О! К

ТЗб-148 q^

01 1,0 10,0 100,0

136-152 А22 ' 30-98

показана эффективность предложенного подхода, позволшкцзго с помощью методов пептидного синтеза, ишунохимичзских подходов и методов клеточной иммунологии локализовать фрагменты белка обеспечивающие защиту лабораторных хшвотных от заболевания ящуром.

2. ПРОТЕКТИВНЫЕ ФРШ.ШНТЫ ЖОТОДШЕНШНОГО РАЙОНА БЕЛКА ВИРУСА ЩУРА ППАША к^

Излоаашша вше подходы к изучошш свойств Фрагментов иымунодоминантного района бежа ур^ вируса лабораторного штеша 0ХК могно рассматривать как основу для проведения работы по виявлэшт протективных пептидов болка ^ ыфуса ящура штамма А22> вакцинация против которого актуальна для ряда районов СНГ, оптимизации структуры этих пептидов и создания на их основе синтетической противояцурной вакцина.

К согаланни, прямой перенос даншх, получаншх для бежа вируса штамма 0ХК, невозможен из-за отсутствия перекрестных серологических реакций между вирусам этих пташоэ и высокой вариабельности иммунодошяантшх районов балков в связи с этим вновь встала проблзма синтеза большого набора пептидов -фрагментов белка ура и их детального изучвшя.

2.1 Синтетические фрагменты ишулодоминвитного района балка вируса ящура штамма ¿22

Синтезированные фрагменты основного щщуиогенного района урх приведены на рис.4. Пептида последовательности 131-149, 131-139, 140-149, 143-149, 136-151 И 140-151 были получены классическим методой, конэчноа деблокирование пептидов было проведено шдааш фтористым водородом. Пептвда 136-152, 135-159 и его фрагменты 136-159, 140-159, 142-159, 143-159, 136-156-Рго, 140-156-рго, 144-156-р*о синтезировали твердофазным методом на РАМ-ползшере.

Синтетические фрагменты балка (рис.4) можно условно разделить на две группы. Первая груша пептидов (131-149, 131-139, 140-149, 143-149, 136-152, 136-151 и 140-151) представляет собой перекрывающиеся фрагменты н-концевой части иммунодоминантного района белка, ы-концевым остатком этого

131 135 140 143 149 151 156 159

ÍJ-G-T-G-K-Y-S-A-G-G-M-G-R-Jl-G-D-L-E-P-L-» ;-"-V-A-A-Q-L-P

131 149 t___i

131

136

136

135

136

136

139 _i

140

143 i_

140

140 i_

142 i_

143 i—

140 i_

144

i_

149

_i

149

152

151

151 _i

159 —i

159 _i

159

159

159

156

156

156

- Pro

- Pro

- Pro

Рис. 4. Синтетические Фрагменты шлмунодошнантного рзйона белка vpx вируса ящура шташа А22.

участка является остаток AsnAJA с которого, согласно теоретическим расчетам, начинается высокоакрофилышй _pafion белка vpr. Заканчивается изучаемый район остатком А1а15й, по аналогии с последовательностью активного фрагмента 136-152 белка vpa вируса штамма 01К.

Вторая группа соединений представляет собой пептида, включающие С-концеву» последовательность нммунодошшантного района - это сегмент 135-159 vpx и его перекрывающиеся фрагменты, укороченные с N-конца и с С-конца (136-159, 140-159, 142-159, 143-159, 136-156-Рго, 140-156-Рго, 144-156-Рго).

ГСС

Фрагменты с С-концевым Ala1 для повышения устойчивости к протеолизу были удлинены с С-конца на остаток Pro.

2.2. Иммуногенные свойства фрагментов и-концэвой части иммунодоминантного района

Работа по выявлению протекгивных фрагментов белка вируса штамма А22 началась с синтеза и изучения пептидов первой группы. Кролики и морские свинки были иммунизированы кш-конъюгатамм пептидов, либо свободными пептидами. В сыворотках кроликов определяли титры противопептвдных и вирускейтрализувдих антител, а в сыворотках морских свинок -титры вируснейтрализующих антител, а такга изучалась протективная активность пептидов. Результаты испытаний биологической активности фрагментов представлены в таблице 3.

Таблица 3. Иммуногенные свойства синтетических фрагментов

и-концевой части иммунодоминантного района белка ург вируса ящура штамма А22.

Иммуноген* " ТПА Кролики Морские свинки

ТВД ТВА Защита

131-149-кш 4.0 4.7 4.2 3/4

131-149 <1.0 <1.0 4.0 4/5

I31-139-К1Л 3.0 <1.0 <1.0 0/5

131-139 <1.0 <1.0 <1.0 0/5

140-149-кьн 3.0 4.4 2.7 2/4

140-149 <1.0 <1.0 3.0 2/4

136-152-кш 4.1 7.4 4.5 5/6

136-152 <1.0 <1.0 3.3 4/6.

Животных иммунизировали дважды в дозе 200 ккг

Свободные фрагменты иммунодоминантного района 131-149, 140-149, 136-152 не индуцировали у кроликов образования ни про-тивопептидных, ни вируснейтрализующих антител, но, в то же время, у морских свинок вызывали образование вирус-нейтрализувдпх антител и проявляли протективную активность. '

Проведенные исследования позволяют сделать вывод о том,' что иммунный ответ на свободные пептиды этой группы является видоспецифичным, т.е. зависит от вида иммунизируемых животных. '

Когда не с поиски кьн-конъпгато у кр:>лпхоз удается стимулировать противопептидный иммунный ответ, то образующиеся антитела является вируснейтрализующими. кш-конъюгати фрагментов 131-149, 140-149 и 136-152 проявляют, аналогично свободным пептидам, протективную активность на морских свинках, н-концевой участок изучаемого района 131-139 не обнэрухивавт противоящурной активности ни в свободной виде, ни в виде кш-конъюгатэ.

Таким образом оказалось, что н-концевой участок 131-139 на вахен для индукции фрагментами иымунодоиинантного района белка

вируса штамма А22 противопептидного н противовирусного иммунитета. Пептиды 131-149, 140-149 и 136-152, проявившие в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем, протективную активность, обладали сходными свойствами. Все эти пептида вызывали лишь частичную защиту морских свинок от заболевания (50-80%) и на проявляли иымуногещых свойств на кроликах.

Очевидно, что низкая протективная активность и видоспецифзгеность проявляемого иммунитета не позволяют рассматривать изучаеше пептиды как основу для разработки синтетической противоящурной вакцины. По всей вероятности, способность свободных пептидов индуцировать образование антител у морских свинок и отсутствие активности на кроликах связано с хг-генным контролем над иммунным ответом на пептиды района 131-152 белка урх вируса штамма ¿22, по аналогии с выявленный 1г-гешшм контролем над иммунным ответом на фрагмент белка вируса штамма 0гК, проявившим ишуногекные свойства на мшах н-2а и н-2* гаплотипа и неактивным на мышах н-2ь гаплотипа. Можно предположить, что удлинение описанных пептидов с С-конца на фрагмент 153-159, который по теоретическим расчетам образует амфипатическую а-спираль и является потенциальным Т-эпитопом, позволит расширить границы 1г-геиного контроля над противопептидным иммунитетом и, тем самым, обойти видоспецифичность, а такте приведет к индуции противовирусного ответа у кроликов и повысит протективную активность на морских свинках.

2.3. Иммуногенныв свойстве фрагментов С-концевой часта

иммунодоминантного района

Следувдий этап работы был связен с синтезом пептидов второй группы - фрагмента 135-159 и серии его укороченных аналогов и изучением их иммуногенных и протектавных свойств. Для сравнения иммукогенных свойств пептида 135-159 с фрагаентсмн первой группы в качестве типичного прзставителя бал выбран фрагаент 136-152. Иммуногенныв свойства пептидов 135-159 и 136-152 сравнивали в опытах на кроликах, морских свинках в шзах трах линий. На кроликах в морских свинках была твкез изучена шруснейтрализувдвя активность противопвптидаых сывороток, о для морских свинок был определен протективный аффект (табя. 4).

Таблица 4. Иммуногенныв свойства фрагментов 135-159 и 136-152 белка vp1 вируса ящура штамма А^

Пептид Доза Кролики Ыорскио свинки

(мкг) balb/c c57bl/6 cba/j

ТПА ТВА ТВА Защита ТПА ТПА ТПА

135-159 200Х28 3.8 4.2 4.0 5/5 3.1 2.4 <1.0

50° 3.5 4.2 4.0 5/5

136-152 200x2е <1.0 <1.0 2.5 3/5 <1.0 <1.0 <1.0

д----гз—--

"двукратная иммунизация; "однократная иммунизация

Изучение иммуногенных свойств пептидов 136-159 u 135-152 на кроликах и морских свинках показало, что двукратная иммунизация пептидом 135-159 в дозе 200 мкг стимулировала у кроликов образование противопептидных и вируснейтрализувдих антител с высоким титром, в то время как фрагмент 136-152 не проявлял иммуногенной активности (табл. 4). Двукратная (по 200 мкг) иммунизация морских свинок пептидом 135-159 такяе приводила к появлению высокого уровня вируснейтрализувдих антител и обеспечивала 100%-нуп защиту хсивотных от заболевания. Протективный эффект фрагмента 136-152 был значительно низе и составлял лишь 60%, противопептидные антитела обладали небольшой Еируснейтрализуодей способностью. Высокая активность

пептида 135-159 была продемонстрирована в опытах по однократное иммунизации кроликов и морских свинок в дозе 50 мкг. Оказалось, что столь невысокая доза 25-членного пептида способна обеспечить индукции антител и полную защиту животных от заболевания.

Изучение ишуногенных свойств пептидов 135-15Э и 136-152 на шшах различных линий показало (табл. 4), что пептид 135-159 индуцирует образование протнвопептвдных антител с высоким титром у мытой линий вльв/с (а-гашктт) и с57вь/б (ь-гаплотип), но не у мышей сва/з (к-гаплотип). В отличив от пептида 136-152 белка ур1 вируса штамме 0ХК (табл.2), пептид 136-152 белка вируса штамма А22 не стимулировал образования антител у мышей всех изученных линий.

Протективные свойства пептидов 135-159 и 136-152 были изучены на крупном рогатом скоте (табл. 5). Двукратная иммунизация 25-члениым пептидом в дозе I мг стимулировала образование вируснейтрализувщих и противопептидных антител с

Таблица 5. Протективные свойства фрагментов 135-139 и 136-152 белка VPX вируса ящура штамма А22 на кРУнном рогатом скоте

Пептид Й живот- Доза, мг тпд ТВА За-

ного 1-я иммунизация 2-я иммунизация щита

135-159 I I I 4.4 5.76 4-

135-159 2 I I 4.4 6.00 +■

135-159 3 5 - 3.5 4.66 -

135-159 4 5 - 4.1 5.23

136-152 5 I I 3.5 2.32 _

136-152 6 I I 3.5 <1.0 -

кон- 7 _ _ <1.0 <1.0

троль 8 - - <1.0 <1.0 -

высоким титром и защиту животных от заболевания при введении им 10 ООО ИД50 вируса ящура штвммв Д22. Иммунизация крупного рогатого скота пептидом 136-152 в тех же дозах не обеспечивала протективного эффекта. Однократная иммунизация пептидом 135-159

в дозе 5 иг приводила к защите одного кивоткого из двух.

Таким образом, удлиненна слабоимыуногенного пептида 136-152 с С-конца на фрагмент 153-159 существенно повысило способность пептида индуцировать образование противопаптидных и вируснейтрализуквдх антител, позволило расширить граница 1г-генного контроля над противопептиднны иммунным отватоа и обеспечило защиту естественно восприимчивых гивотных от заболевания.

Имнуногенные свойства укороченных фрагментов пептида 135-159 были изучены в опытах па мышах линии ваьв/с и на морских свинках (табл.6). В противопептвдных сыворотках швей измеряли титры противопепгидках антител, а в сыворотках морских свинок - титры противопептидаых и вируснейтрализущих антител. Кроме того, для морских свинок был определен протективный эффект.

Таблица 6. Иммуногенность укороченных фрагментов пептида 135-159

Пептид* Мыши ВАВВ/с Морские свингаг

ТПА ТПА твд Защита

135-159 3.4 3.4 4.5 5/5

136-159 3.4 3.4 3.7 5/5

140-159 3.4 3.4 2.2 5/5

142-159 3.4 3.4 <1.0 5/5

143-159 3.1 3.1 <1.0 4/5

135-156 3.1 2.8 <1.0 4/5

140-156 3.1 1.7 <1.0 2/5

144-156 <1.0 <1.0 <1.0 0/5

*Мыше8 иммушзировали дэакда в дозе 100 ют, иммунизацию морских свинок проводили однократно в дозе 50 шаг.

Анализ противопептидаых антител мышей позволил сделать вывод о том,что уменьшение длины пептидных фрагментов с н-конца до остатка 143 и с С-конца до остатка 156 существенно не влияет на их иммуногенные свойства, титры противопептидаых антител варьировали от 3,1 до 3,4. Полностью исчезала активность у

полтвда 144-156. Определенна тнтроз протпвх г.яптндных и вируснейтрализуюгда антител в сыворотках • -эрсних свинок, показало, что в раду фрагментов 135-15Э, 136-159, 140-159 и 142-159 происходило падение титров вируснойтрализуэдих антител при сохранении уровня противопептидных антител. Списание титров противопептидшх антител паблвдалось при уменьшении длиш пептидных фрагментов с н-конца с остатка 142 до остатка 144, а с С-конца с остатка 159 до остатка 156. Пептид 142-159 являлся самым коротким из всех изученных фрагментов, обеспечивавших полную защиту яивотных от заболевания, а фрагмент 140-156 -самым коротким, вызывавшим частичную защиту етвотных (2/5). Фрагмент 144-155 полностью был лишен активности не только в опытах на мылах, но и в экспериментах на морских свинках: при иммунизации этим пептидом отсутствовали титры противопептидшх, вируснейтралпзущих антител, а такие протективная активность.

Иммунизация пептидами 142-159, 143-159, 136-156 и"140-156 хотя и вызывала защиту гзгеотных, но не сопровождалась индукцией вируснейтрализувдих антител. По-видимому, это связано с низкой чувствительностью используемого метода ' определения нейтрализующих антител, что было показано для пептидного фрагмента бежа ур вируса штамма 0ХК (табл. I), когда только снижение ' дозп вируса в тесте позволило выявить вируснейтрализующие антитела в противопептидшх сыворотках.

2.4 0пределеш1е В- и т-эпитопов иммунодоштантного района белка урх вируса ящура штамма Л22

Высокая иммуногенная активность пептида • 135-159, проявляемая в свободной виде, без конъюгации с белковом носителем, свидетельствует .о присутствш! Т-эпитона в последовательности этого пептида. В связи с этим предстоял» определить участок пепицной цепи, ответственный за активации Г-хелперных клеток. Задача была решена с помощью набора перекрывающихся фрагментов участка 135-159.

Способность пептидных фрагментов индуцировать пролиферации Т-клеток периферийных лимфоузлов была исследована ни "отвечающей" линии мышей ваьв/с, иммунизированных пените 135-159. Как видно из рис. 5, лишь пептида 1-13и Ыо !':.'..■ были способны интенсивно стимулировать пролиферации клшчж.

то-

•е

X

I 6

с S 3 2

0.1

1Л

135-159 /

-143-159 "440-159

136-156 к 140- 56

Рис.5. Антигензавн-симая пролиферация лимфоцитов шшеа balb/c, шшувизиро-ванных пептидом 135-159 белка vpx вирусе штамма А^ стимулировании in vitro фрагментами пептида 135-159.

I Пептид], мкМ

136-152. 136-152 О^К „ ТМ ж 4 цз_1/,9 Пептид 136-152 Оелха

tip iqqq ' vpx вируса штамма 0гК

использовали в ка-

честве контроля.

Активность пептидов 136-156 и 140-156 была значительно ниже.хотя достоверно превышала фоновые значения. Полученные результаты позволяют определить Т-эпитоп пептида 135-159 в участке 140-156.

Таким образом. наблюдается корреляция между иммуногенностью синтетических фрагментов на мышах вмв/с, их способностью индуцировать пролиферацию лимфоцитов тех хе животных in vitro и иинуногенностью на морских свинках. Минимальный фрагмент - 140-156. способный индуцировать пролиферацию лимфоцитов, проявляет имиуногенные свойства на мышах и морских свинках. В то хе время это наиболее короткий Фрагмент, вызывающий защиту тавотных от заболевания.

В ряду изученных пептидов фрагмент 135-159 обладает наиболее высокой способностью стимулировать образование вируснейтрализующих антител, что не могут объяснить результаты проведенных экспетиментов: пептид 135-159 проявлял сравнимую с другими, более короткими фрагментами активность в индукции противопептидных антител (табл. 6), Т-эпитоп изучаемого участка vpx был определен в более коротком фрагменте 140-156. Вопрос высокой вируснейтрализующей активности. пептида 135-159 был решен с помощью экспериментов по определению участков в последовательности 135-159, ответственных за связывание с антителами - В-эпитопов.

Для выявления В-эпитопов была изучена способность перекрывающихся фрагментов ншунодошшантного района конкурировать с пептидом 135-159 за связывание с противопептидной и противовирусной сыворотками различных лабораторных животных: мышей- кроликов и морских свинок, (pic. 6).

136-Е2.136-152 0|К, 136-151 134«. K0-15I. U0-U9 - - - КЭ-К9.904В

о.

s

3 fe

3

04

100 7550 25

5-Ю"3 5-Ю2 5-ТЭ"' 5

6-Ю'"

0,1

1,6

1j6-ßl IUI IN .'.0 U.4 I Л-'.« T0-9Î

25

Концентрация ингибитора (нМ1

135-59

юо-

136-152

&

О lo

э

310

31СН

50

Концентрация

110 fjh

ui ist,

иь si, ut-149

5 104 5 10 v ингибитора 1нМ|

Рис.6. Конкуренция меяду пептидом 135-159 белка вируса

ядура штамма &22 и его Фрагментами за связывание с антителами, полученными при иммунизации пептидом 135-159 мышей ваг.в/с (а), кроликов (б), морских свинок (г), а также с противовирусными антителами кроликов (в). Пептиды 90-98 и 136-152 белка VI-5 вируса штамма 01К использовали как контроль.

Исследование сыворотки мышей, полученной после иммушиащш пептидом 135-159 (рис.6а), позволило выявить мишшалышП фрагмент 144-156, способный конкурировать за снизывании с

пептидом 135-159.

В случае прогивопептидноа сыворотки кроликов (рис. 66) ингибируюцей активностью обладали фрагменты 143-159 и 136-152. Интересно, что пептид 136-152 проявлял тггибцрувдую активность, а отличающийся от изго одним аминокислотним остатком пептид Ю6-151 бал яшен ее, что дзионстрярует Енсокую чувствительность используемого «етода.

В противовирусной сыворотке кроликов (ряс. 6в) большинство антител связывалось рядом пептидных Срагагнтоз, из которых самим коротким Сыл пептид 140-149. Для противопептидной сыворотки морских свшок шниявлыаш участки! связывания являлся пептид 143-159 (рис. 6г).

Весьма вероятно, что аналогично ксевидсвнм различиям монет наблюдаться дисперсия спектра образующихся антител п внутри популяции яивотшх, Изучение сывороток группы крупного рогатого скота, состоящей из 7 голов, подтвердило зто предположение (рис. 7).

'00

75-

I >

п

50-

~> 25'

5

35-159 "140-139

10СН

о

о 75Н а. . з ю

§50

5

о4

135-156,136-152 131-1Д9, „1^-156 -*—х" 1и-1ЙВ

5 10"'

5 50

Концентрация ингибитора 1нМ)

143-1*9

90- 98

135-159 143-159 140-151

^ 144-156

136-152

90-98

0.1 1 10 50 Концентрация ингибитора 1нМ)

Рис.7. Конкуренция ыеяду пептидом 135-159 белка ур1 В1фуса ящура штамма &22 и его Фрагментами за связывание с антителами, полученными при ншунизвции пептидом 135-159 крупного рогатого скота (а - группа из 5 животных, б - группа из 2 кивотных). Пептид УО-98 использовали в качестве контроля.

Фяюроткп хаэдсго гппзотного изучались шизпзддуадьпо н лояучешшо розуят-татн позволили пишть двэ группы гпвотных, разлившихся участков сззязызапия ¿троттзспоптидгах антител, йщпшааши крупного рогатого скота пептидом 135-159 приводила ;< сарлзойзгапэ глггател, сйязивЕзгттксл с участка? 143-159 у пяти глтстгах .(группе I, рлс. 7а), а у двух яивотпих антитела сСраэоячяпятеь протай болео кроткого участка 144-156 (группа 2, ряс. 73), Из ~".с, 7 приЕэдеш результаты для одного из ягодой группа зштотшп, для остаяьшх зевотных наздой группн Сплп получены аналопгшыз дашше.

"скга! ой^азсм, В-згоггоп пептида 135-15Э был определен в . учзстко 126-152 при исслодовашш прот!госпсптидкса сыворотки Гфоликсз; в пзсткз 143-159 для сыворотки морских свзпгск; 1 утастко 14-1-156 для сыворотки шшзй; в ргастнаг 143-159 либо 144-156 для сывсроток короз (гпсотцне I п 2 групп ссответ-стт-ешо). Исследование протиЕопнрусной снвороткл кролжса позволило локализовать Б-зшиоп в участке 140-149. Обобщенные результата работа по определен® противопоптпдных В-эпптспоз представлены в табл. 7.

Таблица 7. В-згоггспи пептлдэ 135-159, определенные с згспояьзоватюм нротивспгп'шдшх снвороток различных вэдсв ашотных

Ещ яшотного В-зпитоп

136 152

Кролики ' , | |

143 159

'Морские спинки I-.............................................."

144 156

¡,'1КИ ВАШ/С 1-) - I-1

143 159

Кореш гр.1 (5 яга.) I-1 ■- --<

144 156

К0р0В1] гр.2(2 отв.) i-!"' ■ ——----i-1

Необходимо отметить, что иммунизация как пептидом, так и вирусом, приводит к индукции антител широкой специфичности и используемый подход позволяет выявить лишь участок связывания

большинства антител, которые и определят вируснейтрализущую активность пептида, во не выявляет минорные В-мштопы.

Таюш образом показано, что иммунизация одним к тем же пептидом различных животных приводит к индукции антител, направленных на разные участка пептидной цепи; при этом наблюдаются не только межвидовые различия специфичности противопептндаых антител, но и различия кеаду отдельными особями внутри одного вида.

Проведенное изучение фрагментов иммунодоминантного района . белка ур1 вируса ящура штамма ¿22 позволяет сделать вывод о том, что пептид 135-159 является полноценным иммуногеноа, содержащий Т-эпитоп и набор В-эпитшов, на которые направлены антитела различных видов животных. Этот пептид индуцирует протективный иммунитет на лабораторных и естественно восприимчивых к ящуру животных, что позволяет рассматривать этот фрагмент как основу для разработки синтетической проти-воящурной вакцины. В ходе работы были "выявлэш и болза короткие фрагменты, обеспечивавшие 100%-ную защиту лабораторных животных от заболевания (например, пептид 142-159), однако для них характерна низкая, по сравнению с пептиден 135-159, вируснейтра-лизуюиая активность, что связано, по всей вероятности, с узким спектром протнвопептидных антител.

3. ОДтЮАКТШШЕ ФРАГМЕНТЫ БЕЛКА УР1, НЕ ВХОДЯЩИЕ В • ИШУНОДОМИНАНТНЬШ РАЙОН

Участки белка урх, не относящиеся к основному и минорному щшуногенвыы районам, не привлекали внимания исследователей из-за отсутствия в их последовательности, согласно результатам работ с поликлона льными, моноклональшош противовирусными антителами и фрагментами расщепления белка урх, вирусней«'рализупцих В-эпитопов. Анализ современных представлений об антигенной структуре вирусов, а также данных литературы о противоящурном иммунитете, позволили предположить наличие в последовательности белка урх ранее не описанных иммунокомпетентных участков, не входящих в иммунодоминантный район.

3.1 Синтетические фрагменты vpJf по входящие в , иммунодоминантный район

В райках настоящего исследования был проведен анализ первичной структуры белка vpa на основе теоретических методов предсказания потенциальных антигенных детерминант и выбраны пептида для синтеза: 10-24, 39-61, 50-69, 90-98, 170-189, 175-189, 197-213 (рис. 8).

I 50 100 150 200 213

10 24 50 69 90 98 175 189 197 213

i_i i_i

39 61 170 189

I-1 ■-»

10 24

p-v-t-t-t-v-e-n-y-g-g-e-t-q-v

39 61

f-v-x-1-q-ij-l-n-p-i-h-v-i-d-l-h-q-t-h-q-n-g-l

50 69

v-i-d-l-h-q-t-h-q-h-g-l-v-g-a-l-l-r-a-a

90 98

p-h-g-a-p-e-a-a-l

170 189

t-t-i-h-e-l-l-v-r-m-k-r-a-e-l-y-c-p-r-p

175 189

l-l-v-r-h-k-r-a-e-l-y-c-p-r-p

197 213

g-q-d-r-h-ic-q-k-i-i-a-p-a-k-q-l-l

Рис. 8. Синтетические фрагменты белка vpx вируса ящура отамма А22

Вибор фрагмента 10-24 был основан на его высокой гидрофильности и вероятности присутствия ¿-изгиба. Перекрывающиеся фрагменты 39-61 и 50-69 могла представлять интерес как потенциальные антигенные детерминанты, поскольку в последовательности белка vpx, кроме иммунодоыинантного района, существует еще один участок с больший количеством замен в ряду белков различных серотилов вируса ящура - это район 40-60. Существенно также, что соседний с ним участок 60-70 имеет высокую тенденцию к образованию а-спирали. Участок 90-98 был выбран для синтеза как обладающий, согласно расчетам, высокой акрофильностью и содержащий о-спираль.

Анализ вариабельности белковых цепей вирусов различных шташоэ позволил обнаружить еща один район, представляющий интерес для выявления ковах кшуноактивнах участков белки - это фрагмент 170-189. Этот пептид соответствует консервативному н гидрофильному району белка и, по аналогии с консервативна: районом гемагглотинина вируса гриппа, мог оказаться функционально значимым при индукции противоящурного иммунитета. Эти предпосылки послужили основанием для синтеза пептида 170-189 и его укороченного фрагмента 175-189. Фрагмент 197-213 был выбран для синтеза на основе литературных данных о протективной активности кхл-коньпгата пептида 200-213, однако для придания свободному пептиду иымуногешшх свойств следовало удлинить синтетический пептид на гидрофильный участок 197-199.

Пептида были синтезирована твердофазньш ызтодом. Для синтеза пептидов 10-24 и 197-213 был использован хлорыетилированный сополимер стирола с дивишлбензолом, остальные лапищу были синтезированы на РАК-пояимзро.

3.2 Антигенные свойства фрагментов ур1, нз входящих в иммунодошшантный район

Для выявлешм среда! синтетических фрагментов участков, со-деряаадх шруснвОгрализущив В-эпитопы, были изучат антигенные свойства пептидов, т.е. способность взаимодействовать с ¿итителаки. В табл. 8 приведены результаты связывания синтетических пептидов с противовирусной сывороткой кроликов.

Пептид Титр противовирусных антител

10-24 <1.0

39-Ы <1.0

50-69 <1.0

90-93 <1.0

135-159 3.1

175-189 <1.0

170-189 <1.0

197-213 1.6

Таблица 8. Связывание противовирусной сыворотки кроликов с синтетическими фрагментами балка ур вируса штамма А22

Данные получены методом шмунофернснтяого енализа. Здесь и далее при изучении свойств фрагментов, не входящих в основной нммуногенный район, для сравнения исследовалась активность Фрагмента основного ишуного иного района 135-159. !Тз прнво-дешшх данных следует, что противовирусшза антитела били способны связываться только с фрагментом и/мунодошшантного района 135-159 и шнорного HMjynoremioro района 197-213. Eco остальные пептида на проявили активности в этой тесто. Полученные результаты согласуются с данными литературы о наличии противовирусных В-эпитопов только в этих двух районах vpj.

3.3 Иммуногонные свойства фрагментов vplt не входящих з кшунодошщантшй район

Для изучения способности пептидов стинуяфопать образование антител лабораторные аивотные были иыыуниз1фовани синтетическими пептидами в свободном виде, без козьюгации с балкоЕыи носителем. Исследование проводили на мышах различных линий, кроликах и норских свинках, определяя титры противопептидшх антител в сыворотках всех животных и, кроме того, титры вирус-пейтрализующих антител в сыворотках кроликов и морских свинок, а также протективкый эффект для морских свинок (табл. 9).

Анализ. тнтров противопептидных антител лабораторных пивотных позволил выявить следующие ишуногенкне фрагменты белка vpxî 39-61, 50-69, 175-189, 170-189 и 197-213. В то ze время ни один кз. изученных фрагментов, крош прзшэденного для сравне!шя протектшзпого пептида 135-159, на индуцировал образования вируснейтрализухщих антител ни у кроликов, ни у морских свинок, а также не проявлял протективной активности, кьн-конъюгаты изученных пептидов также были способны вызывать у кроликов и морских свинок лишь образование противопептидных антител, не способных нейтрализовать вирус и не обладающих протективной активностью (данные не приведены). Исключение составлял лишь, кш-конъюгат пептида 197-213, который вызывал 60%-ную; защиту морских свинок от заболевания.

Сравнение иммуногенных свойств перекрывающихся фрагментов 39-61 и 50-69 показало, что фрагмент 39-61 проявляет значительно более высокую активность, вызывая образование противопептидных антител у мышей двух линий, кроликов и морсюи

Таблица 9. Еммуногенные свойства фрагментов vp1 д^, не входящих в шшунодоыинантныа район

1&ГТШ Кролики Lopeкие свинки

Пептид* BAXB/C CBA/J С57В1/< ТПД ТВД ТПД ТВД Зени-

ТПД nu ТПД та«»)

10-24 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 0

39-61 5.5 3.1 <1.0 5.0 <1.0 4.1 <1.0 0

50-69 <1.0 <1.0 <1.0 3.1 <1.0 2.5 <1.0 0

90-98 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 0

135-159 3.4 <1.0 4.8 3.8 4.2 3.4 3.7 100

175-189 2.6 3.2 2.8 4.9 <1.0 <1.0 <1.0 0

170-189 5.8 5.8 5.5 5.2 <1.0 4.1 <1.0 0

197-213 <1.0 <1.0 <1.0 3.5 <1.0 2.8 <1.0 0

'животных кммушзироваяи дваяды, шаей в доза 100 мкг, с кроликов и морских свинок в дозе 200 ккг.

свинок. Паптвд га 50-69 индуцировал невысокий уровень антител только у кроликов и морских свинок. Обращает иа себя вшшаниа важный факт, что 39-61 пептид проявляет более высокую активность со сравнению с пептиден 135-159 на всех изученных животных, за исключение!! мышей сы&ъ/б.

Сопоставление данных, полученных по пептидам 175-189 и 170-169, указывает на расширение границ Iг-генного контроля над противопептидным иммунитетом и повышение иммуногенности при удлинении пептида с и-конца на пять аминокислотных остатков. При этом наблюдалось увеличение числа "отвечающих" животных и возрастание титров антител. Существенно, что фрагмент 170-189 индуцировал значительно более высокий уровень антител по сравнению с протективным пептидом 135-159.

Пептид 197-213 проявил иммуногенные свойства только на кроликах и морских свинкэх и не был активен ни на одной из изученных линий мьшей. Несмотря на то, что этот фрагмент в виде кш-коныогата проявлял протективные свойства, пептид в свободном виде индуцировал образование противопетидных антител,

не обладавдих вируснейтрализующай активностью п па вызывающих защиту морских свинок от заболевания. Поскольку титры противопептидных антител, стимулируемые свободный пептидои и ого конъпгатои существенно но отличались, отсутствие вируснейтрализующеИ активности штат быть связано с ппдукциой свободный пептидом антител но участок пептидной цепи, отличный от вируснейтралкзувдего эпитопа.

Необходимо отеэпггь, что так ае, как и в случае фрагментов гашунодомянантпого района белка для слабо ишуногенных пептидов, нэ входящих в этот район, наблюдалась вадоспецифичность пндуцируемого пептпдаш иммунитета, как • например для Фрагшнтоэ 50-69 н 197-213.

Тагаш образов, проведенные исследования позволили определить в последовательности белка ранее не описаншэ фрагмэпты, способные проявлять ишуногекнуз активность в свободно!! вида, без конъюгации с белкой носителем - это пептиды 39-61, 50-69, 175-189, 170-189 и 197-213. При этом наиболее Еысокая тшуногеннзя ективность характерна для пептидов 39-61 п 170-189.

4. ФРАГМЕНТЫ БЕЛКА ВИРУСА ЩУРА ШТАША А^, АКТИВИРУЮЩИЕ ВЯРУССПЕШШЧЕСКИЕ Т-КЛЕШ

Изучение способности пептидных фрагментов белка ур1 индуцировать образование противопептидных антител позволило выявить три пептида, проявивших максимальную шшуногеннув активность - это пептиды 39-61, 135-159 и 170-189. Фрагменты 39-61 и 170-189 но содержат вируснэйтрализукзих В-эпитопов, однако проявление свободными пептидами собственной икмуногенности свидетельствует о наличш Т-эпитопов в их последовательности. В связи с этим встал вопрос о способности активированных пептидами Т-клеток узнавать вирус. Та ае проблема требовала своего решения и для протективного пептида 135-159, который содер&ит вируснейтрализующий В-эпитоп и противопептидный Т-эпитоп, поскольку перспективы использования пептида 135-159 для создания иммунологической противовирусной памяти зависят ог. того, является ли противопептидный Т-клеточный ответ вирусспецифическим. Так ае представлялось целесообразным оценить, не проявляет ли вирусную специфичность

Т-зпитоп пептида 197-213, который в-виде кьн-кояъюгата обладал протективными свойствами.

Вирусную специфичность активированных паптидами Т-клеток изучали в опытах in vivo на кроликах по способности пептидов увеличивать образование индуцированных вируса« вируснейтрали-зувдих антител (табл. 10).

Таблица 10. Способность синтетических пептидов усиливать

образование вируснейтрализущих антител у кроликов

1-я иммуни- 2-я иммуни- ТПА ТВА

зация зация

39-61 вирус 4,4 1,2

39-61 - 4,4 <1,0

135-159 вирус 3,4 4,4

135-159 - 3,4 1,5

170-189 вирус 4,9 4,0

170-189 - 4,9 <1,0

197-213 вирус 3,6 1,5

197-213 - 3,6 <1,0

' ПА» вирус - 1,3

Для этого кроликов предварительно иммунизировали пептидами, а затеи тавотным вводили инактивированный вирус в субимцунизирувдей доза. Контрольной группе еивоткых вводили вместо пептида ПАЗ. Результаты исслэдований показали, что только пептиды 135-159 и 170-189 способны увеличивать титр вируснейтрализущих антител. Поскольку протективный пептид 135-159 содержит вируснейтрализувдий В-эпитоп, не удивительно, что иммунизация одним этим пептидом приводила к образованию вируснейтрализущих антител (титр 1.5). Однако в случае прайминга пептидом 135-159, с последующим введением вируса, титр вируснейтрализупцих антител был значительно выше (4.4), что, вероятно, являлось результатом узнавания вируса и В- и

Т-клэткЕШ!, активированными пептидом. Пептэд 170-189 ко содерзит вируснойтрализувдих В-зшггопов и, следовательно, ко способен стимулировать образования нейтрализующие антител, но при иммунизации пептидом и последующем введении взфуса иейтрзлзгауиио антитела образовывались с высокий тнтрсм (4.0). Гзгаш образом, пептид 170-189 был способен активировать Т-хелперние клетки, которыз распознавались вирусом и участвовали в процессе шадуквди вируснейтрализукцих антител. ПраЕшшг пептидами 39-61 и 197-213 но приводил к увеличению титров вируснейтрализувдих антотел, поскольку полученные значения не отличались от контрольных.

Специфичность активированных пептида.« Т-клэток была изучена такте в опытах in vitro па лимфоцитах шлей линии balb/c (табл. II). f.'irzm были иммунизированы пептидами 135-15Э, 170-189, либо 39-61 ("имыуногены" в табл. II). Пролифэративную активность клеток, выделенных из лимфоцитов иммунизированных мышей, изучали при добавлении пептидов 135-159, 170-189Аса, 39-61, инактиЕировониого В1фуса, а такге контрольных пептидов 90-98, I3S-I52 ("антигены" в табл. II). В качестве антигена п этом эксперименте использовали пептид 170-189, модифицированный ацетамидометильной группой (лет-группой) по остатку суа186 (I70-I89xcn), поскольку было обнаружено, что пептид 170-189 со свободной sn-фунцией остатка цистеина неспецифически ингибирует пролиферацию лимфоидных клеток неиммунных мышей.

Как видно из данных, приведенных в табл. II, все изученные пептиды стимулировали деление клеток, выделенных из тавотных, иммунизированных этим же пептидом, однако вирус ящура стимулировал Т-клеточную пролиферацию только в случае клеток яивотных, предварительно иммунизированных пептидами 135-159 и 170-189.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что пептид 135-159 содержит не только вируснейтрализувдий В-эпитоп, но и вирусспецифический Т-хелперный эпитоп. Таким образом, пептид 135-159 способен индуцировать полноценный противовирусный иммунный ответ, обеспечивая индукцию противовирусной В- и Т-клеточной памяти. Основываясь на проявленных пептидом 135-159 свойствах можно предположить, что этот фрагмент является оптимальным для создания на его основе синтетической противоящурной вакцины.

Таблица II. Индукция вир/сои пролиферации - гз&гфсцлтоз 1шгааа ваьв/с, шшунизировянных пептидаш1.

ОДмуноген Антиген Индекс стимуляции*

0,1МХЫ** 1ыкМ 10акЫ ЮОмкМ

135-159 1.1 2.5 5.4 7.3

135-159 вирус*** 0.9 1.6 2.2 3.2

90-98 1.0 1.0 0.9 1.0

170-189(Аса; 0.9 2.1 4.3 4.6

170-189 • ** вирус 0.9 1.6 2.4 2.9

136-152 0.9 1.0 1.1 1.1

39-61 1.1 1.4 1.8 . 3.7

39-61 вирус*** 0.9 0.9 1.1 1.1

136-152 1.0 1.0 1.1 1.0

135-159 0.9 1.0 1.0 0.9

170-189(Дсп) 0.9 0.9 0.9 0.9

- 39-61 1.0 1.0 1.0 1.0

вирус*** 0.9 0.8 0.8 1.0

*- индекс стимуляции вычисляли как отновэннэ шп/шн в культуре клеток, сгкнуяировашшя антигеном, к шт/шш в контроле;

- концентрация антигена; -очищенный шактивированшй вирус в концентрациях 0,03; 0,1; I; 5 ихг

Особый интерес представляет пептид 170-189, не содержащий вируснейтрализущуго В-эшггопо, но вшшчаедий в своя последовательность вирусспэцифический Т-халперный зпитоп. У всех из; генных животных способность пептида 170-189 вызывать образование антител была выше, чей у других фрагментов урх. Кроме того, пептид 170-189 содержит консервативный в ряду различных серотипов вируса ящура район белка ур1. Таким образом, пептид 170-189 может представлять интерес при создании противоящурных вакцин следующего поколения, включающих набор различных имыунокомпетентных участков вирусных белков, которые могут быть получении как методами пептидного синтеза, так и

методами генной шиенерии. Включение пептида 170-189 в состав противоящурной вакцины позволит не только распирать границы 1г-геиного контроля над проигоопептидаыы гшыушыы ответом, но и обеспечит шздукцюэ вирусспецифических Т-кло;ок памяти, распознаваемых различными сероткпеыи кфуса ящура.

5.С03ДДНИЕ ШПЕПИЕСКОН ПРОШВОЩУРНОЙ ВАКЦПП1

Создание ез основе пептида 135-159 синтетической протнво-ящурной вакцшш потребовало многолетнего сотрудничества с Всесоюзный научно-ксслздоватальским яцурпыц институтом (г.Влвда- . ига), где проводаяксь испытания 25-чяэкного пептида на естест-Езнно-Еоспршшчквах к ящуру анвотннх. В хода испытанна был выбран вид швотних, на которых синтетическая вагашэ проявляет максимальную эффэктивность, отработаны доза и схема галмуш-заций, проведен поиск подходящей адызвпнтной системы в связи с непригодностью Г&О для вакципацни сельскохозяйственных гивот-пых. Одновременно была проведена работа по зпшичасксЗ шздпЗя-кащш пептида 135-159 для повышения ого протектквгаз свойств.

5.1 Ишдуногеишэ и протшстшные свойства пептида 135-159 па крупном рогатой скоте.

Изучение протоктивных свойств пептида 135-159 на крупном рогатом скотз ира использовании небольшой группы шшотных показало (табл. 5), что двукратная инмунпзадая яивотшх в доза 1ыг (1-я иммунизация в ПАЗ, 2-я в 1Ш) загряцает два гивотных из двух вакцинированных.

Более широкие испытания пептида 135-159 на крупном рогатом скотз были проведены в Индийском ветеринарном исследовательском институте (г.Изатпагар). Результаты эксперимента приведены в табл. 12.

16 животных были разбиты на 4 группы, животные первой и второй групп был! иммунизированы двукратно пептидом в дозе 2 мг, для животных первой группы использовали ПАФ, иммунизацию зшвотных второй группы проводили в НА® с добавлением н-ацети-лглюкозаминшшураыил-А1а-о-о1п-нн2 (ГМДП), синтетического гликопентидного адъюванта, разработанного в ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН Андроновой Т.М. и Ивановым В.Т.

Таблица 12. Протективше свойства пептида 135-159 vpx а22 на крупном рогатом скоте

й живот- ТВА (ТПД)* Защита

ного Дни после иммунизации

10 20 30 45 60

Группа I I 1.0(1.5) 2.0(2.1) 2.7(2.7) 2.2(2.7) 3.4(>3.0) " +

2 2.0(1.8) 2.7(2.7) 2.7(2.7) 3.0(2.7) 3.2(2.7) +

_ 3 0.4(1.4) 1.0(2.3) 2.0(2.6) 1.7(2.6) 2.2(3.0) -

4 0.5(1.8) 2.5(2.7) 3.0(3.0) 3.0(3.0) 3,6(>3.0) +

Группа II 5 0.0(1.5) 0.5(2.0) 0.5(2.3) 0.5(2.3) 2.5(>3.3) +

б 1.0(1.7) 1.0(1.7) 2.0(2.3) 2.0(2.7) 3.0(3.0) +

7 1.0(1.8) 1.0(2.6) 2.0(2.6) 1.0(2.4) 3.3(>3.3) +

8 0.5(1.5) 1.0(1.8) 1.0(2.1) 1.0(2.4) 3.0(>3.3) +

Группа III 9 2.3(2.0) 2.6(2.1) 3.0(2.1) 2.7(2.3) 3.7(2.1) +

10 2.0(2.0) 2.4(2.1) 2.5(2.3) 2.7(2.3) 3.5(2.4) +

II 1.5(2.3) 1.5(2.1) 1.5(1.8) 2.0(1.7) 3.2(2.0) +

12 2.3(1.8) 2.5(1.7) 2.5(2.4) 2.7(1.7) 3.6(2.1) +

Группа iv <0.5(<1.0) <0.5(<1.0) <0.5(<1.0) <0.5(<1.0) <0.5(<1.0) -13-16

Кивоткнх I и II групп иммуиизировали пептидом двукратно в дозе 2 иг. 1-ю иммунизацию проводили в ПАФ (I группа), либо в НАФ + ГМДП (II группа), 2-ю иммунизацию проводили в НАФ. Животным III группы вводили коммерческую противоящурную вакцину, приготовленную на оскозе инактивировашого вируса. iv группу животных не иммунизировали.

*ТВА(ТПА) - титр вируснейтрализующих антител, в скобках титр противопоптидных антител, выраженные в -ig.

Третьей группе животных была введена традиционная противоящурная вакцина, группа й iv была использована в качестве контроля. Наилучше результаты были получены во второй группе, где ни одно животное не заболело ящуром, в. то,;время как в первой группе было защищено .лишь 3 животных из 4. Таким . образом, была продемонстрирована высокая протективная активность синтетического пептида, а также была показана

' л

возможность замены П&"5 синтетический адьввантом ПЩ1, применение которого разрешено в ветеринарии. Однако обрсщает на себя внимание то, что мощный противопептидныа иммунитет у животных первой й второй групп на всегда сопровождался высоким уровней влрусноатралазуЕяшс антител, как нспример у животного ИЗ. В то so ерзая пришнонио традиционной в акции (группа III) ш стимулировало столь высокого уровня протнвопептидных антител, по эти антитела обладали более сильной вируспэйтрзлззувдей активностью.

(Лногочзсленшэ испытания синтетического пептида, проводэшпзз во ЕЙШ (г.Владгашр) на дуплах иэ 2-8 животных . в точепяз последних 7 лет (более 10 опытов), показали, что протеягивша эффект значительно взрькрует от эксперимента к сксперсгкапту, изменяясь от 0 до 100%. При этом противопептидные яггатзяа образовывались с еысокиц титром, но, как п з случае, «шсаяаоа в табл. 12, ,зтн антитела не всегда обладал! высокой внруспэйтрзлпзуютВ активностью п не всегда обеспечивали защиту глпзотши. По-втошепу, отсутствие стабильной защити крупного рогатого скота при провздэгаш ширскомасатгбтх ксшташй мозет бить сбьяспоЕо выявланяш наш явлением индукции различными зивотшш противопептвдгшх антител, направленных на рззше участки пептидной цепи, и, следовательно, различающихся по своей вируснейтралязущсЗ активности. Тагам образом,'результаты испытанна, синтетического пептида 135-159 делают сомнительным возможность использования . этого паптида для разработки протизсящурной вакцины для крупного рогатого скота.

5.2. йммуногеиные и лротектизнш свойства пептида 135-159 на , овцах.

Овцы, в отличие от крупного рогатого скота, оказались яивотншл, иммунизация которых пептидои 135-159 обеспечивала стабильнуи защиту на 60 день при двукратной иммунизации (доза 1нг + O.Iiлг), а также на 30 день при однократной иммунизации в дозе I мг (данные не приведены).

Результаты изучения различных адьювантов, использованных для введения пептида овцам, представлены в табл. 13. Первая группа яивотных была иммунизирована пептидом в W®, для второй группы использовали синтетическое масло - адыовзвт для вакцина-

Таблица 13. Протективная активность пептида 135-159

белка vpx вируса оташа на 0В1*ах в различных адыовавтиых системах.

Адыозант Я живот- ТВД(ТПА)* Защита

кого Дни после иммунизации ~~

ii 21 32

Группа I I 1.0(<1.0) 2.4(3.2) 3.7(3.2) +

ПА® 2 <I.Q(<I.Q) 3.0(2.6) 3.6(2.3) '4-

Группа II 3 <1.0(<1.0) <1.0(<1.0) 2.8(2.3)

Наело 4 <1.0(<1.0) I.8(<1.0) 3.3( 1.0) ¥

В <1.0(<1.0) <1.0(<1.0) <I.0( 1.0) . -

I^pynna III 6 <I.0(d.0) <I.O(<I.O) 2.0( 1.0) +

Масло + 7 <1.0(<1.0) 7.7(2.6) 8.0(3.5) +

ГМДП в <1.0(<1.0) 5.0(2.6) 5.5(2.9) +

Группа Iv 9 <I.0(«I.0) <1.0(<1.0) <1.0(<1.0) —

Сапонин + 10 <1.0(<1.0) <1.0(<1.0) <1.0(<1.0) -

гидроксал II <1.0(<1.0) <I.O(<X.O) <1.0(<1.0) -

Контроль 12 <1.0(<1.0) <I.O(<I.O) <1.0(<1.0) —

• 13 <1.0(<1.0) <I.O(<I.O) <1.0(<1.0) -

Животные были иммунизированы однократно в дозе I иг пептида, в ПА© (I группа), в синтетической масле (II группа), в синтетическом масла + ГЩП в дозе I ur(III пзуппа), с добавлением сапонина и гидроксала (iv группа).Контрольные нивотныа не были юшунизированы. Еивотшх зараколи на 32 день.

*ТВА(ТПА) - титр внруснвйтралазукщих антител, в скобках титр противопеппдашх антител.

дай, заменяющий НАС* и разработанный во ВИИЯИ, аивотным третьей группы пептид вводили в синтетическом масле с добавлением ГОДП, для четвертой группы использовали широко применяемый в ветеринарии адьювант - пщроксал с сапонином, животные контрольной группы не были иммунизированы. Как показали испытания, ПА® ыоено с успехов заменять на ГЩП с добавкой синтетического масла. В двух группах кивотшх (I и Ш группы) нсЗлздалась

стимуляция антител, нмавдих высокое сродство к пептиду и обладащшс кощнна влруспейтрализуодш аффектом; защита яивотиых s этих двух грушах была полной. Использование одного масла (группа II ) сопровождалось лишь частичной защитой кивотшх и стимуляцией цротпвопептидных и вируспейтрализувдих антител со значительно более низкими титраш. Приыэнаниз в качестве адаювапта сапошша с гвдроксолои но проводило к индукция противопептидного п протекторного ишушггота (группа iv).

Дальнейшие испытания пептида 135-159 на овцах показали, что стабильный протектившзй аффект, сопровождаемый индукцией высокого уровня протиашептидЕых а вируснейтралазукщп антэтел, . пгбязделся и при введении гивоташ пептида в дозе 0,5мт. В соответствии с требованиям, предытляешш! к шщщцц вакцинон, протектйЕПНй ньыупитет долзен сохранятся у агаотшх еэ некое 6 месяцев посла ваквднащпь Однако оказалось, что чарзз 6 косяцев посла иммунизации пептндои 135-159 только 5QX гивотных было защищено от заболевания. В связи с этим возникла зкоходиность поиска путей повызеши активности паптидз п слздуапцщ -зтапом исследования явилась работа по подификацал пептида 135-159 с долью повыйения его протективпых свойств.

5.3 ¡Тмщгногешшэ и протзктившо свойства пептида Paia2l35-I59 на овцах

Лет повыпэгая протектгавшх свойств был подучен ^Эфщяронанкый по и" 'с-Емтгогруппам остатка . Lys135 ДШ2ДШ1Т0НЯЬН03 ПрОНЗЕОДИОО ШПТНДО 135-159 (Ра1в2135-159). Нодггфнкащгэ проводили, основываясь на данных лхтературы, согласно йотершл, введение липофильшх групп з nsirnroi ^взлшшзаэ'г их сродство к мембранам и, следовательно, сспрсзоддпзтся повышением иммуногенности а результата стннуляцпи болзэ селективного шшунного отвага.

Два остатка пальмитиновой кислоты были введенп в последовательность пептида посла удаления нв,с зеецгошх грута остатка .гташа загзнщзнЕого пептидил-поликера. Протоктстные свойства пептида 135-159 и его пальштоильного производного вначале была продемонстрированы на морских свинках (табл. 14).

Как показала результата испытаний, и пептид 135-159, и его лшефильныа аналог в- дозе 50 нкг вызывали ГССЗ-яуи зациту

Таблица 14. Протективныэ свойства пептида 135-159 бел:» ур.

вируса ящура вташа Д^ и его липофильного аналога на морских свинках

Пептид* Доза (МКГ) Ддыовант Защита

135-159 50 ПА® 5/5

135-15Э 10 ПА® О/Б

135-159 10 НАв 0/5

135-159 5 ПАО 0/5

Ра1т2135-159 50 ПАЗ 5/5

Ра1в2135-159 10 ПА© 5/5

Ра1и2135-159 10 НАй 3/5

Ра1в2135-159 5 ПА® 4/5

"животных иммунизировали однократно.

животных о? заболевания. В дозе 10 мкг свободный пептид не обеспечивал защиты морских свинок при использовашш различных адъшантоа - ПМ в НА5, в то врет как липофильнна пептид сохранял полную активность при вводешш в Ш> и защищал 3 глвотних из 5 при ввадашм в НА5>. В дозэ 5 шт при использовании ПАО РагЕ^ГЗБ-ХбЭ пептид защищал 4 птотных из 5. Таким образом, испытания на лабораторных вивотных показали, что введение липофилышх групп в пептид 135-159 ур1 вируса штамма ¿22 существенно поЕьиает его протоптанную активность.

Сравнение активности пептида 135-159 и его липофильного аналога было проведено на овцах (табл. 15).

Результаты испытаний показали, что хотя 100%-ная защита наблюдается для обоих изучаемых пептидов, титры противопептидных и вируснейтрализующих антител значительно выше при использовании Ра1ш2135-159 пептида. Таким образом, была продемонстрирована более высокая способность пептида раХш2135-159 вызывать образование противопептидных и вируснейтрализувдих антител, а также обеспечивать защиту овец, по сравнению со свободным пептидом 135-159.

Дальнейшие работы по созданию синтетической противоящурной вакцины для овец велись на основе пептида Ра1ш2,135-159.

Таблица 15. Протактпвшэ свойства пептида 135-159 болка

вируса ящура птамла и его липофальпого аналога па овцах

й siiBOT- Пэшгдц* ТВД(ТПД)** Защита

пого • Дни посла юшунизащш

14 21 31

I . 135-15Э 5.0(3.3) 5.3(3,5) 6.5(4.1) +

2 135-159 9.2(3.9) 9.2(4.4) 9.0(4.1) +

3 135-159 1.5(3.5) 1.0(4.1) 2.2(4.4) +

4 135-159 5.3(3.9) 9.3(4.7) 9.5(5.0) +

5 135-159 3.2(3.9) 8,5(4.7) 8.6(4.4) +

6 Paln2I35-I59 10.3(4.9) 10.3(5.2) 10.2(5.5) +

7 Ра1в2135-159 7.7(4.9) 10.2(5.5) 10.7(5.8) +

а Paln2I35-I59 8.3(5.8) 11.5(5.2) 11.3(5.8), +

э Pala2I35-I59 8.3(5.2)- 11.3(5.5) 11.0(6.1) +

10 Palm 135-159 10.6(4.9) 11.5(5.5) 11.0(5.5) +

контроль

II—15 - <1.0(<Г.0) <1.0(<1.0) <1.0(<1.0)

Еивотшх шафтзирозам однократно паптидаш! а доза 0.5иг в синтетической маслз с дсбавлзпнэи I иг ЩЩ1.

**ТЕА(ТПА) - титр Енруснейтрзлизущих антител, в скобках титр противопептшцшх антител.

Изучение продолжительности протоктивного иммунитета, гшдуцаруеиого лшофильвыу пептидом в сроки от 14 дней до 6 кесяцев показало (табл. 16), что ра1п2135-159 пептид в дозе 0,5 2л1 с использованием в качества адашанта синтетического масла н ЩДП в дозо I нт обеспечивал полную защиту овец уже на 14 день после иммунизации, протоктивннй иммунитет.сохранялся в течение 6 месяцев! защита через I ыесяц и 3 месяца 100%, через 6 месяцев 80%, что удовлетворяет требованиям, предъявляемым к противоящуршм вакцинам. Изучение протективиого эффекта на свцах а зависимости от дозы пептида показало, что при снижении дозы в два раза были защищены 4 животных из 5, а сшгае¡те дозы в 5 раз обеспечивало защиту 3 животных из 5 (данные не приведены).

Таблица 16. Продолхительность иммунитете, индуцируемого " пептидом Ра1и2135-159 на овцах*

й животного Дни после иммунизации ТВД Защита

I 14 7.6 +

2 14 8.0 +

3 14 5.0 +

4 14 9.0 +

5 14 6.7 +

6 30 10.2 +

7 30 В.О

в 30 10.0 +

9 30 6.3 +

10 30 8.8 +

II 90 9.5 +

12 90 7.3 +

13 SO 8.3 +

14 80 7.4 +

16 80 7.5 4-

• 16 180 6.0 +

17 180 6.0

16 180 6.5 +

i? 180 6.0 +

20 180 6.0 +

'Однократная иммунизация, доза липофшшного пептида 0.5цг, доза гадл I иг

В настоящее время совместно с Всесоюзным научно-исследовательским ящурным институтом (Г.Владимир) на основе синтетического липофильного пептида разработан противоящурньй вакцинирующий препарат для овец, на уступающий по эффективности действия традиционной противоящурной вакцине, получаемой из инактивированного вируса, но иыеший такие преимущества, как отсутствие остаточной инфекционности, стабильность при хранении

(более года при 24°), химическая гомогенность и знание механизмов противопептидного иммунитета, облегчающее контроль над развитием ишунного ответа у аивотных. Разработанный вакцишфувднй препарат может найти применение для вакцинации ценных пород скота, когда проявление недостатков, связанных с иммунизацией традиционной вакциной, будет сопровождаться серьезный материальны« ущербом. Кршэ того, возможно использование сшггетической противоящграой вакциш в качестве резервного вакщширувщего иеинфокциснпого препарата в странах, отказавшихся от применения традиционной противоящурной вакцшщ.

В настоящее врзия противояцурныЗ вакцинирувдиа препарат, приготовленный на основа синтетического пептида ра1в2135-159, проходит контрольные испытания, Езобходшяю для разрешения на использование его в ветеринарии для аадиты овец от заболевания яцурои (вирус птенца ¿23)«

ЕЫВ0ДЫ

1. Синтезировано 2В семи-двадцатапятичлэнвых пептидов фрагментов белка vpx вируса ящура штаммов огК и Agg, выбранных на основе данных яггературы и теоретических методов анализа потенциальных шнунокошетентных участков белков. Всестороннее изучение их свойств козволило решить как теоретические, так и практические проблемы создания сшггетической противоящурной вакциш.

2. Выявлены фрагменты шшунодоыинантного района белка vpx взфуса ящура штамма 0ХК 136-148 и 136-152, способные в свободном вида, без конъюгации с белком-носителем, индуцировать образование противопептидных и вируснейтра-лизувдих антител, а также вызывать защиту экспериментальных животных от заболевания ящуром при заражении их вкусом штамма 0ХК. -

3. Определены В- и Т-эпитопы в последовательности иммуно-доминзнтного района белка vp1 вируса ящура штамма 0ХК. Показано, что пептид 136-152 содержит В- и Т-эпитопы, обеспечивающие индукцию противовирусного иммунитета.

4. Выявлены фрагазнты ишунодомииантного района белка ур2 вируса ящура штамма А^: 131-149, 140-149, 135-152, 135-159, 136-159, 140-159, 142-159, 143-159, 136-166 В 140-156, способные в свободной виде, без конъюгации с балкои-носнтелем, индуцировать образование цротивопептвдных антител и вызывать защиту эдсспериыонтальдах швотшх от заболевания ядурон при зарввеши их вирусом штамма ¿22>

5. Определены В- а Т-ашггопн в последовательности ишу-нодошнантного района белка вирусе ящура штамма ¿22' Установлена зависимость мезду аддукцией противопептидных антител, протоктивнш эффектом в наличием Г- и В-зпктопов в последовательности пептидов. Показано, что специфичность пропшшзнтндных антител различается шдду кивотшми разных видов, а текла внутри популяции тавотных.

6. Выявлены фрагменты белка вируса ящура шташа ¿¿2' НР входящие в основной шмуногенный район: 39-61, 50-69, 175-189, 170-189 и 197-213, способныо в свободной вида, баз конъюгация с белкой носителем, вызывать образовать противопоппццшх антител.

7. Установлено, что пептида последовательности 135-159 и 170-189 \п>1 вируса ящура штамма А^ октшшруют вирусспецифическиэ Т-халпаршэ клетки. Рекомендовано использование пептида 170-189 для повышения эффективности искусственных противоадуршх вакцин сладувдэго поколения.

&. Установлено, что в ряду изученных пептидов фрагмент последовательности 135-159 вируса ящура штамма ¿22 проявляет максимальную протективную и вируснейтрализующую активность, обеспечивая 100%-нув защиту от заболевания экнериментаяьных вдвотных .и овец. Показано, что пептид 135-159 содержит все иммуноактивше участки, необходимые для индукции лротивоящурного иммунитета.

9. Получэн высокоактивный липофилышй аналог пептида последовательности 135-159 ур1 вируса ящура штамма А22 и на его основе разработан противоящурный вакцинирующий препарат для сельского хозяйства.

Основшо результаты диссертационной работы излоаены в слодукщк публикациях:

1. Суровой А.Ю., Вольшша О.М., Скэткова Е.В., Иванов В.Т. Антигенная детерминанта поверхностного белка вируса яцура: синтез, фазнко-хиыическне и ншуногешше свойства. -Тезисы докладов vx Всессаэпого симпозиума по химии пептидов и волков, Рига, 1983, с. 254-255.

2. Вольшша О.Ц., Суровой А.Ю., Сштковэ Б.В., Подрезова Е.П., Карелин В.П., Сирин В.И. Синтетическая антигенная детершшанта поверхностного белка vpx вируса ящгра. -Тезисы докладов 15 конферзпщш федерации европейских биохимических обществ,-Иосква, 1984, с. 374.

3. Вольшша О.М., Суровой A.D., Иванов В.Т., Чопуряин A.D., Иванаденков В.Н., Бурдов А.Н., Дрягалин Н.Н. Подхода к создапиэ сгштетачаской противоящуркоЗ вакцтш. - Теснса докладов езшпозпунз "Структура, биосинтез п функции шле-куляркых элементов иммунной системы", Пущшзо, 1987, с. 88.

4. Вольшша 0.1!., Суровой А.Ю., Гельфаноа В.М., Яров А.В., Чспургош А.В., Иваищенков В.Н., Дрлгзлин Н.Н., Бурдов Д.Н. Протектившю зпнтопы Еируса ящура: локализация, синтез и изучений механизма шиуностинуляции. - Сборник тезисов viz Всесоюзного симпозиума по хголш болнов и пептидов, Таллин, .1987, с. 165-166.

5. Суровой А.Ю., Волышпа O.U., Иванов В.Т., Чепургага А.В., Ивопвдопков В.Н., . Бурдов А.Н., Дрягалин Н.Н. Моделирование с помопгью синтетических пептидов протективных эпитопов белка vpx вируса яяура. серотипов 0 и А. -

• Биооргап. ХИМИЯ, 1987, T.I3, Л 8, C.II32-II35

5. Чепуркин А.В., Дрягалин Н.Н., Иванщенков В.Н., Лядский а.М.,: Иудрак И.С., Суровой Д.Ю., Ео льгота О.М. Продолжительность иммунного ответа у кроликов на введение езштетичеаадх пептидов. - Актуальные проблемы ветерзшарней вирусологии, часть I, тезисы докладов научной конференции, г. Владимир, 1988, с. 25-26.

6. Surovoy A.Yu., Volpina О.И., Gelfanov V.H., Ivanov V.T. Hinicking protective epitopes of foot-and-mouth disease virus with synthetic peptides. - In: Peptides: chemistry and biology. Eds G.R. Marshall. ESCOM, Leiden, 1900, p. 553-554.

7. Vol'pina O.K., Burovoy A.Vu., Gelfanov V.M., Khan Z.B., Ivanov V.T. Novel foot-and-aouth disease protective peptides: mechanise of ixuaunoat initiation. - Ins Tecnological advances in vaccine development. Ed.L.Laokly, New York, Alan Я. Lisa Inc., 1988, p.391-400.

6. Суровой A.D., Волышна О.У., Снеткова'Е.В., Волкова Т.Д., Иванов В.Т., Чапуркин ¿.В., Иванщенков В.К., Бурдов Д.Н., Дрягалин H.H. Антигенная структура вируса щура. I. Синтез протективных пептидов последовательности основного иымуногенного района бедка vpt вируса ящура стаииа 0^. -Биоорган, хшия, 1988, Т.14, й 10, с. 1352-1362.

9. Волышна O.U., Суровой A.D., Ульяшн В.В., Иванов В.Т., Чепуркин A.B., Иванщенков В.Н., Бурдов А.Н., Дрягалин H.H. Антигенная структура вируса ящура. II. Синтез протективных пептидов последовательности основного иимуногеиного района белка vp1 вируса ящура штейна Д22. - Биоорган. хишя, I9E8, т.14, Л 10, с. I363-I37I.

10. Иванов В.Т., Вольпина O.U., Андронова Т.Н. Пептидные антигены и вдаюванты в синтетических вакцинах. - Еурн, всесоюзного химического общаствэ ни. Д.И.Ыендолеева. XXXIII, 1988, H 5, с. 523-530.

11. Surovoy А.Уи., Gelfanov V.M., Grechaninova L.A., Yarov A.v., Vol'pina 0,11., Ivanov V.T. Functional sites of foot-and-mouth disease virus detected with synthetic pcptidce. - Abstracts of 20-th Eur. pept. syiapos., Tubingen, FRG, 1938, p. 183.

12. Вольпина O.M., Суровой А.Ю., Гельфанов B.M., Яров A.B., Гречанинова Л.А., Чепуркин А.В*, Иванов В.Т. Защита животных от заболевания ящуром с помощью синтетических пептидов. - Сборник тезисов I Всесоюзного съезда иммунологов, Москва, 1989, т.I, с. 145.

13. Yerov А,V., Grechaninova L.A., Gelfanov V.M., Surovoy A.Yu., Vol'pina O.M., Chepurkin A.V., Ivanov V.T. Protection from foot-and-mouth disease with synthetic peptides. - Kurzreferate 3 Riemsee Wissenschaftlichen simposium "Immunologische diagnostik und immunoprophilexe animaler virosen" mit internaler Beteiligunge Greifswald, 1989, p. 19-20.

14. Surovoy A.Yu., Gelfanov V.M., Grechaninova L.A., Yarov

А.V., Vol'pina O.K., Ivanov V.T. Use of synthetic peptides in FMDV vaccine and receptor binding site studies. -Abstracts of the 7-th USSR-ШЗ synposiua on cheaiotry of peptides and proteins., Dilizhan, 1989, p. 23. .

15. Surovoy A.Yu., Gelfanov V.H., Grochoninova L.A., Yarov A.V., Vol'pina О.И., Ivanov. V.T. Towards peptide vaccine against the foot-and-mouth disease. - Proceedings of 20th Eur. pept. вувр. Eds: G.Jung, B. Bayer, Berlin - Hew York: Halter de Gryter and Co., 1989, p.691-694.

16. Суровой A.D., Гельфанов В.И., Вольшша O.LI., Иванов В.Т., Чепуркии А.В., Иванкценков В.Н., фягалин Н.Н., Бурдов ■ А.Н. Антигенная структура вируса ящура. III. Иимуногенные свойства синтетических пептидов последовательности основного тшуногеяного района белка vpx вируса ящура штампов 0ХК и ~ Биоорган. • химия, 1989, т.15, й 9, C.II85-II92.

17. Яров A.B., Гельфанов В.М., Гречанинова Л.А., Суровой А.Ю., Вольпипа О.М., Иванов В.Т., Чепуркин А.В., Луговской А.А., Дрягалш Н.Н., Иватэденков В.Н., Бурдов А.Н. Антигенная структура вируса ящура, iv. синтез и шшуногенные свойства новых фрагментов белка vpx вируса ящура иташа Д22. -Биоорган, химия 15, 1989, й 9, с.I193-1205.

18. Яров А.В. Гельфанов В.М., Гречанинова Л.А., Суровой А.О., Вольпина О.Н., Иванов В.Т., Чепуркия А.В., Дрягалин Н.Н., Иванищенков В.Н. Антигенная структура вируса ящура, v. Защита природаовосприимчивых животных от заболевания ящуром с помощь» синтетического пептида. - Биоорган, химия

' 15, 1989, Л 10, C.I3I3-I3I7.

19. Vol'pina O.M., Surovoy A.Yu., Gelfanov V.M., Kahn E.S., Ivanov V.T. Hovel approaches to £oot-and-nouth disease protective peptides. - In: Cheaistry of peptides and proteins. V.4. Edss W.A.Konig, W.Voelter, Attempto verlag Tubingen, 1989, vol.4, p.223-228.

20. Vol'pina О.И., surovoy A.Yu., Ivanov V.T. Protection against, viral infections with the aid of synthetic peptides. The foot-and-mouth disease as an example. -Biomed. Sci.,1990, V. 1, p. 23-32.

21. Vol'pina O.K., Surovoy A.Yu., Gelfanov V.M., Yarov A.V., Ivanov V.T. Immunogenic and protective properties of

foot-and-mouth disease related peptides. - Abstracts of the 1-st Israel-Soviet sesinar on peptides and proteins, Rehovot, 1990, p. 24.

22. Surovoy A.Yu., Vol»pina O.H., Gelfanov V.M., Yarov A.V., Xvanov v.T. Synthesis and immunogenic activity of new peptide derivates related to the capsid protein sequence of foot-and-mouth disease virus. - Abatacts of 21-th Eur. peptide synposium, Platja d'Aro, Spain, 1990, p. 251.

23. Vol'pina О.И., Surovoy A.Yu., Gelfanov V.II., Grechaninova L.A., Yarov A.V., Ivanov V.T. Iimunogenieity of synthetic VP^ protein fragnents and FKDV vaccina. - J. Cell. Biochea., 14C, 1990, p. 239.

24. Ivanov V.T., Vol'pina O.K., Surovoy A.Yu., Volkova T.D., Kozhich A.T., Tchicin L.D., Kusov Yu.Yu., Vargin V.V., Rubin S.G., Secanov D.P., Oshorolkov S.V., Scmashko I.V. Towards synthetic antiviral vaccines. - Pure and Appl. Chem., 1990, v. 62, Й 7, p. 1433-1436.

25. Гельфаноа B.L5., Яров А.В., Гречанинова Л.А., Суровой А.Ю., Еолышза О.М., Иванов В.Г. Антигенная структура вирусе яяура. vx. функционалыша участки мшукодоиннантного района болка vpx кфуса ящура пташгоа 0ХК и ¿¿г*- &100Рган' химия 17, 1991, Л 5, С. 595-606.

26. Vol4pina O.tl., Gelfanov V.H., Konakova М.А., Yarov A.V., Surovoy A.Yu., Ivanov V.T. Hays for increasing the protective activity of peptide FHDV vaccine. - Proceedings of a-tli PRG-VSSR eynpoaluu on chsaietry of peptides and proteins. 1993, in press.

27. Вольпинэ O.ti., Суровой А.Ю., Иванов В.Т., Чепуркин ¿.В., Иванвденков В.II., Дрягалин Н.Н., Бурдов А.И. Пептид, обладапций защитный действием против вируса ящура штамма ¿22- ~ Авторское свидетельство й 1576880 (приоритет от 14."7.1987).

28. Яров А.В., Гельфанов В.М., Гречанинова Л.А., Суровой A.D., Вольпина О.Ы., Иванов В.Т., Чепуркин А,В., Иванвденков В.Н., Дрягалин Н.Н., Бурдов А.Н. Пептид, обладающий защитный действием против вируса ящура штамма А22. -Авторское свидетельство й 1702657 (приоритет от 15.II.1988).

29. Яров. А.В., Чепуркин А.В., Суровой A.D., Волкова Т.Д.,