Интеграза ВИЧ-1: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Приказчикова Татьяна Александровна

ИНТЕГРАЗА ВИЧ-1: ИНГИБИРОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОДИФИЦИРОВАННЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2007

003053087

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук

Готтих Марина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Михайлов Сергей Николаевич

доктор химических наук Ефимов Александр Васильевич

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 27 февраля 2007 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 27 января 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

/Смирнова И.Г./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) поражает иммунную систему и вызывает одно из опаснейших заболеваний - синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). По оценкам всемирной организации здравоохранения, на начало 2006 года число людей, зараженных ВИЧ, во всем мире составляло 38,6 миллиона человек. Число людей, заразившихся ВИЧ в 2005 году, составило 4,1 миллиона человек, и 2,8 миллиона человек умерли от СПИДа. До начала применения первых коммерчески доступных лекарственных препаратов против СПИДа продолжительность жизни больных составляла не более одного года. Используемая в настоящее время терапия включает комплексное применение препаратов, направленных на подавление трех стадий репликативного цикла ВИЧ: обратной транскрипции, протеолитического созревания и слияния вирусной частицы с клеткой. Она позволяет продлить время жизни больных СПИДом на срок до 8 лет. Необходимость использования комплекса препаратов обусловлена быстрой эволюцией ВИЧ, которая приводит к появлению устойчивых форм вируса, а также токсичностью этих препаратов и их восприимчивостью организмом инфицированного человека. В связи с этим постоянно ведется активный поиск как новых ингибиторов указанных выше стадий репликативного цикла ВИЧ, так и соединений, нарушающих другие стадии цикла и способных дополнить существующую противовирусную терапию

Большое внимание уделяется созданию эффективных ингибиторов стадии интеграции ДНК-копии вирусного генома в геном зараженной клетки. Этот процесс осуществляет вирусный фермент интеграла. Показано, что вирус, содержащий дефектную интегразу, неспособную осуществлять интеграцию вирусной ДНК, не размножается в культуре клеток. Таким образом, интеграция является одной из ключевых стадий вирусного цикла и ее ингибирование, несомненно, должно приводить к подавлению репликации ВИЧ. Однако, несмотря на всю привлекательность интегразы в качестве мишени для противовирусных препаратов, на сегодняшний день нет ни одного соединения - ингибитора интегразы, которое бы успешно прошло все клинические испытания и было бы предложено как лекарственное средство против СПИДа. Большинство известных ингибиторов интегразы, в том числе и ингибиторы, находящиеся на стадии клинических испытаний, взаимодействуют с ионом магпия, связанным в активном центре фермента. Уже показано, что применение этих ингибиторов приводит к быстрому появлению устойчивых к их действию форм фермента, содержащих мутации в активном центре. В этой связи крайне актуальным является поиск новых соединений, способных подавлять каталитическую активность интегразы, и в том числе ингибиторов с новым механизмом действия.

Цель работы состояла в дизайне и синтезе эффективных, специфичных и нецитотоксичных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе модифицированных олигонуклеотидов, изучении механизма их взаимодействия с ферментом, а также в поиске эффективного носителя для доставки олигонуклеотидного ингибитора в клетки.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе осуществлен синтез серии конъюгатов коротких одноцепочечных олигонуклеотидов с гидрофобными соединениями различной структуры и исследовано их действие на активность интегразы ВИЧ-1. Показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты 11-звенных олигонуклеотидов с эозином или олеиновой кислотой. Эти соединения подавляют обе стадии интеграции: 3'-процессинг и перенос цепи. Установлено, что действие этих ингибиторы направленно на разрушение комплекса интегразы с вирусной ДНК. Впервые, для ингибирования интегразы ВИЧ-1 in vivo предложены конъюгаты 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином или олеиновой кислотой. Впервые установлен участок фермента, с которым взаимодействуют олигонуклеотидные конъюгаты Показано, что он локализован в С-концевом домене фермента. Высокая активность олигонуклеотидных конъюгатов как ингибиторов интегразы ВИЧ-1 свидетельствует о важности данного участка в функционировании фермента. Полученная информация может быть использована для дизайна новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1 Подобраны носители пептидной природы, обеспечивающие эффективную доставку олигонуклеотидного ингибитора в ядра клеток. В сотрудничестве с университетом г. Левен в Бельгии показано, что конъюгаты 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой ингибируют репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках, причем эффективность ингибирования репликации коррелирует с эффективностью проникновения ингибитора в клетку.

Апробация работы Результаты работы были представлены на следующих конференциях: III съезде Российского Биохимического Общества (С.-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г.), международной Пущинской школе-конференции молодых ученых: "Биология - наука XXI века" (Пущино, 7-21 мая 2004 г.), международной конференции "Chemical & Biological Problems of Proteomics'" (Новосибирск, 5-9 июля 2004 г.), международном совещании "Targeting replication and integration of HIV" (Франкфурт, Германия, 20-24 марта 2005 г.), 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference (Будапешт, Венгрия, 2-7 июля 2005 г.), International Symposium "Advances in Science for Drug Discovery'" (Москва - С.-Петербург, 11-16 июля 2005 г.), 3-ей международной научно-практической школе-конференции Медбиотек (Москва, 4-5 декабря 2006 г.), международном совещании "Targeting replication and integration of HIV" (Барселона, Испания, 1112 декабря 2006 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 49 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 161 цитированную работу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Одной из причин отсутствия прогресса в области поиска ингибиторов интегразы ВЙЧ-1

является то, что многие соединения, ингибирующие каталитическую активность изолированного

2

фермента, оказываются неэффективными в ВИЧ-инфицированных клетках и тем более in vivo, где интеграза действует в составе сложного прединтеграционного комплекса, в котором она связана с вирусной ДНК и рядом вирусных и клеточных белков. В этой связи, соединения, способные подавлять каталитическую активность комплекса интегразы с вирусной ДНК, рассматриваются как наиболее перспективные препараты. На момент начала настоящей работы, практически единственными ингибиторами интегразы ВИЧ-1, способными действовать на ее комплекс с ДНК и вызывать его быстрое разрушение, были конъюгаты коротких одноцепочечных олигонуклеотвдов с акридином [Pinskaya М. et al. (2004) Biochemistry. 43, 87358743]. Причем было показано, что способность этих соединений нарушать ДНК-связывакяцую функцию интегразы обусловлена взаимосвязанным действием обоих составляющих конъюгата. Немодифицированные 11-звенные олигонуклеотиды и свободный акридин не вызывали диссоциацию комплекса интегразы с ДНК и ингибировали ее каталитическую активность при значительно более высоких концентрациях, чем их конъюгаты [Pinskaya М. et al. (2004) Biochemistry. 43, 8735-8743]. Было высказано предположение, что отрицательно заряженный олигонуклеотид взаимодействует с интегразой за счет образования электростатических контактов, в то время как акридин формирует гидрофобные контакты, которые способствуют фиксации ингибитора на поверхности фермента и вызывают конформационные изменения в структуре интегразы, которые и приводят к нарушению связывания ДНК и к диссоциации фермент-субстратного комплекса. В настоящей работе мы продолжили изучение механизма действия конъюгатов олигонуклеотидов, а также постарались увеличить их ингибирующую активность. В первую очередь, было необходимо заменить молекулу акридина на другой остаток, который, с одной стороны, был бы существенно менее токсичен, а с другой, увеличивал бы ингибирующее действие конъюгата. Кроме того, следовало повысить устойчивость олигонуклеотидной части конъюгата к нуклеазному гидролизу для того, чтобы иметь возможность исследовать активность конъюгатов в экспериментах на ВИЧ-инфицированных культурах клеток.

1. ОПТИМИЗАЦИЯ СТРУКТУРЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО ИНГИБИТОРА

ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1

1.1. Оптимизация структуры ненуклеотидной части олигонукпеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1

Прежде всего, мы заменили акридин на остаток другой молекулы, которая была бы менее токсична для клетки, и введение которой в состав конъюгата с олигонуклеотидом сохраняло или усиливало бы его способность разрушать комплекс интегразы с ДНК. Для того чтобы найти подходящую молекулу, были синтезированы конъюгаты 11-звенного олигодезоксинуклеотида с рядом органических молекул Для синтеза конъюгатов был выбран олигодезоксинухлеотид следующего состава: GGTTTTTGTGT (11-D), т. к. его конъюгат с акридином обладал наибольшей ингибирующей активностью по сравнению с конъюгатами олигонуклеотидов

других последовательностей [Pinskaya М et al (2004) Biochemistry 43, 8735-8743] Предполагается, что акридин в составе конъюгата образует с интегразой гидрофобные контакты, поэтому для получения конъюгатов мы выбрали такие гидрофобные соединения различной природы, как флуоресцеин (Ft), эозин (Е), тетраметилродамин (/?), холестерин (Chol), тиохром (Г/1) и олеиновую кислоту (01) (рис 1) Молекулы флуоресцеина, эозина и тетраметилродамина, как и молекула акридина, содержат в своей структуре конденсированную ароматическую систему. Однако в отличие от молекулы акридина эти молекулы не обладают интеркалирующими свойствами, что снижает их токсичность Холестерин, тиохром (продукт окисления тиамина - витамина В1) и олеиновая кислота являются участниками клеточных процессов и заведомо нетоксичны при микромолярных концентрациях Молекула тиохрома представляет собой гетероароматическую систему В свою очередь, холестерин и олеиновая кислота являются структурно совершенно отличными от молекулы акридина Использование для синтеза конъюгатов с олигонуклеотидом структурно различных молекул, помимо расширения области поиска подходящей замены для акридина, позволило бы нам получить информацию о важности тех или иных элементов структуры молекулы для эффективного ингибирования интегразы

акридин (Асг) флуоресцеин (Fl) эозин (Е) тетраметилродамин (R)

А0

холестерин (Chol)

Н,С N

тиохром (77l)

олеиновая кислота (ОГ)

Рис. 1. Структуры радикалов органических молекул, введенных в состав конъюгатов с олигонуклеотидом 11-D.

В процессе встраивания вирусной ДНК в клеточную интеграза катализирует две реакции З'-концевого процессинга и переноса цепи Обе эти реакции можно моделировать т vitro, используя рекомбинантную интегразу и, в качестве ее субстрата, ДНК-дуплексы, последовательности которых имитируют U3 или U5 фрагменты вирусной кДНК Изучение ингибирующей активности синтезированных конъюгатов проводили на примере реакции З'-концевого процессинга В качестве субстрата интегразы использовали дуплекс U5B/A, имитирующий концевой участок U5 последовательности вирусной ДНК. Мерой эффективности ингибирующего действия конъюгата считали значение ICso, соответствующее концентрации ингибитора, при которой эффективность реакции снижалась на 50%, относительно эффективности реакции в отсутствие ингибитора. Значение ICso для каждого конъюгата было определено по результатам трех экспериментов, ошибка измерения составляла не более 15%

Изучение ингибирующей активности конъюгатов проводили в двух различных условиях конкурентного ингибирования, когда ингибитор и субстрат добавляли к ферменту одновременно, и в условиях пресформированного фермент-субстратного комплекса, когда ингибитор добавляли к комплексу интегразы с ДНК-субстратом

Результаты исследований представлены в таблице 1 Видно, что присоединение к олигонуклеотиду 11-D любой из выбранных молекул приводит к усилению его ингибирующей активности Высокую ингибирукяцую активность, превосходящую активность акридинового, проявляют конъюгаты олигонуклеотида с молекулами, обладающими структурным сходством с молекулой акридина флуоресцеином (/С50 = 03 мкМ), тетраметипродамином (IC50 = 031 мкМ) и эозином (ICso = 0 05 мкМ) Причем, среди этих конъюгатов наиболее активным ингибитором является конъюгат с эозином, наиболее гидрофобной молекулой Его большая активность вполне согласуется с высказанным предположением о роли гидрофобных контактов, образуемых ненуклеотидной частью, в механизме ингибирования интегразы олигонуклеотидными конъюгатами Вместе с тем, конъюгат с высоко гидрофобным холестерином проявлял относительно невысокую ингибирующую активность (/С50 = 2 0 мкМ), сравнимую с активностью акридинового конъюгата Вероятно, объемному и достаточно жесткому по структуре остатку холестерина сложно занять то положение в гидрофобном участке интегразы, которое позволило бы образовать нужные гидрофобные контакты В то же время, молекула олеиновой кислоты, сильно отличающаяся по структуре от остальных молекул, также

Таблица 1. Ингибирование каталитической активности интегразы ВИЧ-1 в реакции З'-концевого процессинга конъюгатами олигонуклеотида 11-D с различными молекулами (ЮОнМ интеграза, 2 5 нМ U5B/A, буфер 20 мМ Hepes pH 7 2,7 5 мМ MgCl2, I мМ ДТТ)

Конъюгат ICso, мкМ

Условия конкурентного ингибирования Условия ингибирования пресформированного комплекса

11-D 25 0* >50 0*

11-D-Acr 2 5* 4 0*

11-D-FI 0 30 ± 0 03 0 28 ± 0 02

11-D-E 0 050 ± 0 006 0 055 ± 0 007

11-D-R 0 31 ±0 03 0 34 ± 0 04

11-D-Chol 2 0 ± 0 1 2 2± 0 3

Thr-11-D 3 8±03 2 9 ± 0 3

11-D-OI 0 10 ±0 02 0 09 ± 0 02

* - данные работы [Pinskaya М et al (2004) Biochemistry 43, 8735-8743]

достаточно большая по размерам, обеспечивает конъюгату высокую ингибирующую активность (/С50 = 0.1 мкМ). В отличие от холестерина, олеиновая кислота обладает значительной гибкостью, и, вероятно, за счет нее способна образовать необходимые контакты.

Важно отметить, что все конъюгаты были способны подавлять активность интегразы и в составе пресформироьаииото -комплекса. Это указывало на то, что они сохраняют способность разрушать фермент-субстратный комплекс.

1.2. Оптимизация структуры нуклеотидной части олигонуклвотидного , ^ ингибитора интегразы ВИЧ-1 ,, ..

1.2.1. Влияние длины олигонуклеотида на ингибирующую активность конъюгата

Уменьшение длины олигонуклеотида может повысить специфичность действия его коньюгатов, поскольку снижается вероятность неспецифических взаимодействий олигонуклеотида с различными ДНК-связывающими белками и клеточными нуклеиновыми кислотами. В связи с этим .мы проверили, возможно ли уменьшить длину олигонуклеотндной части конъюгата без значительной потери в его активности. С этой целью мы протестировали способность коньюгатов флуорес ценна с 9-, 7- и 5-звенными олигонуклеотидами,

представляющими собой укороченную с 3'-конца на соответствующее число звеньев последовательность 11-D, ингибировать интегразу в реакции 3'-процесснвга.

Результаты исследования,

представленные на рисунке 2, свидетельствуют о том, что уменьшение олигонуклеотида 11-D всего на два звена приводит к снижению ингибирующей активности конъюгата практически на один порядок.

По этой причине, использование более коротких олигонуклеотндов, чем ] 1-ти звенный для создания ингибитора интегразы ВИЧ-1 мы считаем нецелесообразны м.

1.2.2. Влияния модификаций углеводо-фосфатного остова олигонуклеотида на ингибирующую активность его коньюгатов

Для того чтобы иметь возможность исследовать активность коньюгатов в экспериментах на ВИЧ-инфицированных культурах клеток, следовало повысить устойчивость олигонуклеотндной части конъюгата к нуклеазному гидролизу Известно, что модификация

6

ч ;

Л

11 9 7 5

число нутеотидных звеньев в составе олигонуклеотида

Рис. 2. Влияние длины олигодезоксирнбонуклеотвдной части флуоресцеин-содержащих коньюгатов на ингибирование интегразы ВИЧ-1 в реакции З'-концевого процессинга (100 нМ интеграза, 2.5 нМ U5B/A, буфер: 20 мМ Нерез рН 7.2,7,5 мМ MgClj, 1 мМ ДТТ).

углеводо-фосфатного остова олигонуклеотидов позволяет повысить их стабильность и продлить время их биологической активности в клетке [Stein С А. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 32093231; Gryaznov S. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 1508-1514; Iribarren A.M. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei Usa. 87, 7747-7751]. Для того чтобы выбрать модификацию углеводо-фосфатного остова олигонуклеотида, оптимальную с точки зрения активности создаваемого на его основе конъюгата и доступности его синтеза, мы синтезировали конъюгаты флуоресцеина с аналогами олигонуклеотида 11-D, содержащими тиофосфатные (11-PS), N3'—>Р5' фосфамидные (11-NP) и N3'—>Р5' тиофосфамидные (11-NPS) межнуклеотидные группы, 2'-0-метил-нуклеозиды (11-ОМ) или (1-р-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)тимидин вместо природного тимидина (11-Тх) (рис. 3) и протестировали их ингибирующую активность в реакции З'-процессинга.

А

?

0=P-S'

?

Рис. 3. Модификации углеводо-фосфатного остова, использованные для повышения устойчивости олигонуклеотидного ингибитора к нуклеазному гидролизу. А - тиофосфатная, Б - N3'—>Р5' фосфамидная, В -N3'—»P5' тиофосфамидная межнуклеотидные связи, Г—2'-0-метил-олигонуклеотид, Д - олигонуклеотидс (1-Р-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)тимидином вместо природного тимидина.

Оказалось, что конъюгаты 2'-0-метил-олигонуклеотида 11-ОМ и олигонуклеотида 11-NP с N3'—>Р5' фосфамидными межнуклеотидными группами проявляют такую же ингибирующую активность, как и конъюгат немодифицированного олигонуклеотида 11-D (табл. 2). Введение в состав конъюгата с флуоресцеином олигонуклеотида 11-Тх с (1-р-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)тимидинами снижало его ингибирующую активность, а тиофосфатного 11-PS или тиофосфамидного 11-NPS олигонуклеотидов значительно повышало ее.

Таблица 2. Ингибирование каталитической активности интегразы ВИЧ-1 в реакции З'-концевого процессинга конъюгатами модифицированных по углеводо-фосфатному остову олигонуклеотидов с флуоресцеином (ЮОкМ интеграза, 2.5 нМ (У5В/А, буфер: 20 мМ Нереэ рН 7.2,7.5 мМ М^Ь, 1 мМ ДТТ)

Олигонуклеотяд 11-D 11-PS 11-NP 11-NPS 11 -OM 11-TX

1С so, mkM 0.30±0.02 0.020±0.001 0.30±0.02 0.030±0.003 0.32±0.03 2.0±0.2

Следует отметить, что введение в 2'-положение метокси группы или замена атома кислорода в 3'-положении на аминогруппу приводят к изменению конформации углеводного фрагмента. Показано, что в структуре 2'-0-метилированных и N3'—>Р5' фосфамидных олигонуклеотидов он находится в N конформации, свойственной РНК [ЬиЫш Р. ^ а1 (1994)

В

Д

°Xj

t

?

<j) ОСНэ 0=^-0'

?

Chem. Biol. 1 (1) 39-45; Venkateswariu D. et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27 (10), 2189-2195; Ding D. et al. (1998) Biochemistry. 37 (35), 12082-12093]. Однако это не повлияло на взаимодействие конъюгатов олигонукдеотидов 11-ОМ и 11-NP с интегразой, являющейся ДНК-связывающим ферментом. Ранее было показано, что нуклеотидная последовательность конъюгата также не оказывает значительного эффекта на его ингибирующее действие [Pinskaya М. et al. (2004) Biochemistry. 43, 8735-8743]. Все эти данные хорошо согласуются с высказанной гипотезой о механизме действия конъюгатов, в соответствии с которой основная роль олигонуклеотида заключается в образование электростатических контактов с интегразой. Именно поэтому его тонкая структура (конформация сахара, нуклеотидная последовательность) существенно не влияет на ннгибирующую способность олигонуклеотидного конъюгата. Эта гипотеза подтверждается также и тем, что уменьшение длины олигонуклеотида приводит к значительному уменьшению ингибирующей активности конъюгата, очевидно, в результате сокращения числа образуемых им электростатических контактов. Снижение ингибирующей активности конъюгата, содержащего (1-р-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозид)тимидины, можно объяснить значительным изменением расположения фосфатных групп в этом олигонуклеотиде, вызванным инверсией атома кислорода в З'-положении пентозы.

Более высокая ингибирующая активность конъюгатов тиофосфатного и тиофосфамидного олигонуклеотидов, вероятно, связана с возможностью образования ими дополнительных гидрофобных контактов за счет атомов серы.

Учитывая высокую склонность тиофосфатных олигонуклеотидов к неспецифическому связыванию со многими клеточными белхами [Gao W.Y. et al. (1992) Mol Pharmacol. 41, 223229], для дальнейших исследований мы выбрали 2'-0-метил-олигонуклеотид 11-ОМ, активность флуоресцеинового конъюгата которого была сравнима с активностью конъюгата немодифицирозанного олигонуклеотида.

1.3. Влияние олигонукпеотидных конъюгатов на активность некоторых ДНК-

связывающих ферментов

Одной из основных проблем, с которой часто сталкиваются исследователи при разработке ингибиторов ВИЧ, является низкая специфичность их действия, приводящая к высокой токсичности соединений. Для того чтобы оценить возможное неспецифическое действие олигонукпеотидных конъюгатов, мы проверили, способны ли они влиять на каталитическую активность других ДНК-связываюпщх ферментов. В качестве таких ферментов мы выбрали; фрагмент Кленова. как модель ДНК-полимеразы - фермента, чрезвычайно важного для функционирования клетки; эндонуклеазу рестрикции - фермент, осуществляющий, как и интеграза, сиквенс-специфическое расщепление ДНК, а также обратную транскриптазу ВИЧ-1, Оказалось, что ни один из выбранных конъюгатов не подавляет каталитической активности фрагмента Кленова и эндонуклеазы рестрикции во всем диапазоне концентраций, в котором проводилось тестирование (табл. 3).

Таблица 3. Ингибирование каталитической активности ДНК-связывающих ферментов олигонуклеотидными конъюгатами

IC50, мкМ

Конъюгат Интеграза ВИЧ-1 Обратная транскриптаза ВИЧ-1 Фрагмент Кленова Эндонуклеаза рестрикции Msp 9RI

11-D-FI 0.30 ±0.02 30.0 >10.0 >50.0

11-D-E 0 050 ± 0.006 2.9 >100 >50.0

11-D-Chol 2.0 ±0.1 24.0 >10.0 >50 0

11-NPS-FI 0 03±0.003 8.8 >10.0 >50.0

11-OM-FI 0 32 ± 0.02 25 0 >10.0 >50.0

В случае обратной транскриптазы ВИЧ-1 конъюгаты подавляли ее каталитическую

активность, но при концен грациях, значительно более высоких, чем в случае интегразы ВИЧ-1.

***

Проведенные исследования позволили выбрать оптимальную структуру олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1: конъюгаты 11-звенного 2'-0-метил-олигонуклеотида с эозином или олеиновой кислотой. Мы синтезировали данные конъюгаты и протестировали их ингибирующую активность как в реакции 3'-концевого процессинга, так и переноса цепи Значение /С50 для конъюгата с эозином 11-ОМ-Е составляло 50 нМ в реакции 3'-процессинга и 60 нМ в реакции переноса цепи, с олеиновой кислотой 11-OM-OI - 90 нМ и 100 нМ, соответственно. Кроме того, мы проверили действие данных конъюгатов на активность интегразы другого ретровируса, пенящего вируса человека (ПВЧ). Оба конъюгата ингибировали интегразу ПВЧ, но их активность по отношению к этой интегразе была в 5-6 раз ниже, чем к интегразе ВИЧ. Этот результат позволяет надеяться, что предлагаемые нами ингибиторы не будут оказывать значительного влияния на активность других представителей семейства полинуклеотидилтрансфераз, к которому относится интеграза, таких как, например, V(D)J RAG рекомбиназы, которые необходимы для нормального синтеза антител в организме.

2. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ КОНЪЮГА ТОВ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ УЧАСТКА СВЯЗЫВАНИЯ ИНГИБИТОРА

2.1. Действие олигонуклеотидных конъюгатов на комплекс интегразы ВИЧ-1

с ДНК

Напомним, что конъюгаты олигодезоксирибонуклеотидов с акридином ингибировали интегразу ВИЧ-1, разрушая ее комплекс с ДНК. Для того чтобы убедиться в том, что

синтезированные нами конъюгаты сохранили эту способность, мы воспользовались методом "торможения" в геле.

Интегразу инкубировали с радиоактив но-мече иным ДНК-субстратом в течение 30 мин при температуре 20° С. Показано, что в данных условиях интеграза формирует фермент-субстратный комплекс, но не осуществляет каталитический акт [Pinskava М. el а]. (2004) Biochemistry 43. 8735-8743]. Затем к комплексу добавляли различные концентрации олигонуклеотидного ингибитора 11-ОМ-Е7 инкубировали смесь 5 мин при 37" С и анализировали ее в полиакрил амид ном геле, несодержащем денатурирующих агентов. В этих условиях Д! JK-белковый комплекс и свободная ДНК, в силу своих разных масс и зарядов, мигрируют в геле с

В отсутствие олигонуклеотидного ингибитора весь радиоактивно-меченный субстрат связан с интегразой (рис. 4). Добавление возрастающих концентраций конъюгата 11-ОМ-Е (от ¡0 нМ до I мкМ) приводит к уменьшению количества субстрата, связанного в комплекс, н к возрастанию количества свободной ДНК. При концентрации конъюгата 50 нМ происходит 50%-ое уменьшение количества фермент-субстратного комплекса, что согласуется со значением 1С so данного конъюгата. Аналогичный эксперимент был проведен для конъюгата 11-OM-OI Для него 50%-ое уменьшение количества комплекса интегразы с ДНК-субстратом наблюдалось при концентрации 100 нМ, которая соответствует значению 1С ¡о данного коньюгага. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ингибирующая активность коньюгатов 2'-О-метилированного олигонуклеотида с эозином или олеиновой кислотой связана с их способностью вызывать диссоциацию комплекса интегразы с ДНК-субстратом.

2,2. Но валентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1. Определение участка связывания ингибитора

Для того чтобы понять механизм ингибирутощего действия конъюгатов, мы решили, в первую очередь, идентифицировать участок фермента, с которым взаимодействует олигонуклеотидный ингибитор, путем его присоединения к интегразе, последующего протеолитического гидролиза ко валентно связанного комплекса, выделения конъюгата ингибитора с пептидом и определения его массы с помощью масс-спектрометри».

to

различной скоростью, что приводит к их разделению.

Интеграза

Концентрация конъюгата, мкМ

0 0.01 0.05 0.I 1.0

»W.

Комплекс ИН с субстратом

ДН К-субстрат

1'ис. 4. Изучение влияния конъюгата 11-ОМ-Е на устойчивость комплекса интегразы с ДНК-субстратом методом ''торможения" в геле, Электрофореграмма комплекса "''Р-меченого ДНК-субстрата и интегразы ВИЧ-1, инкубированного с различными концентрациями ингибитора. (В%-ный ПААГ без моченины, буфер для электрофореза: 20 мМ Трис-ацетат, рН 7.2, 7.5 мМ

месщ.

Отрицательно заряженная олнгонуклеотидная часть ингибитора, очевидно, взаимодействует с интегразой за счет образования, главным образом, электростатических контактов с положительно заряженными остатками Lys и Arg. Известно, что первичная структура интегразы содержит большое число остатков лизина - 26 из 288 аминокислот. В связи с этим, вероятность успешного присоединения ингибитора к лизину в составе интегразы была достаточно высока Для осуществления присоединения олигонуклеотидного ингибитора к остатку лизина в качестве реакционноспособной группировки, вводимой в структуру олигонуклеотида, хорошо подходит альдегидная группа.

Были синтезированы олигонуклеотидные конъюгаты, содержащие 2,3-дигидроксипропильную группировку, которая окисляется периодатом натрия до альдегидной группы в мягких условиях, не затрагивающих других функциональных групп ДНК. Поскольку мы не обладали какой-либо информацией о том, с каким из нуклеотидов может быть сближен остаток лизина, то мы выбрали два положения в структуре олигонуклеотидного ингибитора, в которые были введены модифицированные звенья В структуре олигонуклеотида Т1 нуклеотид с 2,3-дигидроксипропильной группировкой располагался вблизи 5'-конца, а в случае олигонуклеотида Т2 - вблизи его З'-конца и гидрофобной молекулы, входящей в состав конъюгата. В качестве ненуклеотидной компоненты конъюгата была выбрана молекула флуоресцеина в связи с доступностью реагента, простотой синтеза конъюгата и его достаточно высокой ингибирующей активностью. 5.

О

GGU'TTTTGTGT-FI T1-FI

и =

GGTTTTTG W G T-Fl T2-FI

Обработанные периодатом натрия ингибиторы T1-FI или T2-FI инкубировали с интегразой, при этом образовавшаяся при окислении ингибитора альдегидная группа способна образовывать основание Шиффа с е-аминогруппой пространственно сближенного остатка лизина. Для получения устойчивого в условиях анализа продукта присоединения образующееся основание Шиффа восстанавливали цианборогидридом натрия. Продукты присоединения анализировали при помощи электрофореза в геле по методу Лэммли. На рисунке 5 видно, что инкубация интегразы с окисленным ингибитором с последующим восстановлением цианборгидридом натрия приводит к возникновению на геле полосы, мигрирующей чуть выше белкового маркера с массой в 34 кДа. Расчетная масса продукта реакции составляет M„„Tcrpa3b, + М,|„ГИби-гора = 32 кДа + 4 кДа = 36 кДа. Следовательно, появление на геле указанной полосы свидетельствует в пользу формирования продукта присоединения ингибитора к интегразе. В дополнительных экспериментах мы показали, что этот продукт образуется лишь в случае соблюдения всех стадий описанной схемы. Были подобраны оптимальные условия присоединения: концентрации интегразы - 300 нМ, ингибитора, содержащего альдегидную группу, - 10 нМ, время инкубации

U

ингибитора с интегразой до восстановления цианборгидридом натрия - 15 мин, время восстановления образовавшегося основания Шиффа цианбор гидридом натрия - 15 мин.

Эффективность присоединения в значительной степени зависела от положения ре акц ион неспособной группы в структуре олигонуклеотида. Максимальная эффективность присоединения Т1-Н составляла 20% от исходного количества ингибитора (рис. 5, 1 А). а Т2-Р1 - 40% (рис. 5, 1 Б). Наличие зависимости эффективности присоединения от положения альдегидной группы может свидетельствовать о существовании некоторого специфического участка связывания ингибитора.

ИН

Продукт _„

присоединения ингибитора к ИН

Ингибитор —»

+ + кД

Г „ I 120

1 1 i S6

Ф* 47 34

26

20

Продукты

триптического гидролиза ' ковалентно связанного комплекса ИН'T2-FI

T2-FI

Рис, 5 1 - Присоединение ингибитора к интегразе: А - T1-FI, Б - T2-FI. (3 нМ иигибитор, 300 нМ интеграза, инкубация ингибитора с интегразой до восстановления - 15 мин, восстановление NaBH,CN -Ii мин при 37° С). Радиоавтографы электрофоретического анализа продуктов реакции а ПААГ с долецилсульфатом натрия, 2 - радиоавтограф электрофоретического анализа продуктов гриптического гидролиза ко валентно связанного комплекса ингибитора T2-FI с и иге граю й в 20% ПААГ77 М мочевина.

К овале нт но связанный комплекс интегразы с о л и го ну к лести дн ы м ингибитором T2~FI мы подвергли триптическому гидролизу. Электрофоретический анализ продуктов трипсинолиза показал образование нескольких олигонуклеотидопептидов (рис. 5. 2). Их смесь была проанализирована методом масс-спектрометрии MALDI-TOF в режиме анализа олигонуклеотидов. В качестве матрицы испльзовали 2,4,6-тригидроксиацетофенон. Массу пептидов, входящих в состав олигонуклеотидопептидов, рассчитывали по следующей формуле:

Мпсппца = Mnl1ti-(MHHiHSmpi-Mo + Мн) + Мц' = Мпкш - Мингабнтор + 16, где Мщпа - значение массы, соответствующее пику масс-спектра. Мо - масса карбонильного атома кислорода, теряемого ингибитором при образовании основания Шиффа, Мн - масса атома водорода, получаемого ингибитором при восстановлении основания Шиффа, Мн' - масса атома водорода, который теряет аминогруппа лизина при образовании конъюгата с ингибитором.

Массы двух пептидов, рассчитанных по формуле, нам удалось соотнести с массами пептидов из теоретически возможного набора продуктов триптического гидролиза интегразы. Масса первого пептида, рассчитанная из данных MALDI-TQF, составляет 999 г/моль. С этой массой соотнесен пептид 232DPVWKGPAK:4° Его теоретически рассчитанная масса составляет 998 г/моль. Данный пептид содержит единственный внутренний Lys236, аминогруппа которого могла участвовать в образовании ковалентной связи с альдегидной группой ингибитора. Масса второго пептида, полученная на основании данных масс-спектрометрии. составляет 2596 г/моль.

12

С этой массой мы соотнесли массу пептида 220IQNFRVYYRDSRDPVWKGPAK240, которая составляет 2597 г/моль. Видно, что второй пептид включает пептид 232-240 и является продуктом неполного трипсинолиза интегразы. Важно отметить, что пептид 220-240 не содержит других внутренних лизинов помимо Lys236. Этот результат позволяет нам считать, что с альдегидной группой ингибитора при его связывании с интегразой взаимодействует аминогруппа этого лизина. Оба идентифицированных пептида принадлежат С-концевому домену интегразы. Это позволяет утверждать, что олигонуклеотидный ингибитор взаимодействует именно с этим доменом фермента, а не с его активным центром.

Показано, что С-концевой домен способен связывать ДНК с эффективностью близкой к полноразмерному ферменту [Puras Lutzke R.A. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22 (20), 4125-4131]. Основную роль в образовании контактов с ДНК играют положительно заряженные аминокислотные остатки домена. Однако ß-баррельную структуру самого домена формируют контакты гидрофобных аминокислотных остатков, таких как Val225, Туг227, А1а239, Val249, Ile251, Val260 и А1а265 [Lodi P.J. et al. (1995) Biochemistry. 34 (31), 9826-9833]. Мы полагаем, что связывание нашего ингибитора, конъюгата олигонуклеотида с гидрофобной молекулой, в районе Lys236 приводит к нарушению именно этих гидрофобных контактов и, как следствие, к нарушению структуры всего С-концевого домена и его ДНК-связывающей функции.

3. ДОСТАВКА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО ИНГИБИТОРА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 В

КЛЕТКИ

В исследованиях, проводимых в культуре клеток, обычно не удается обнаружить активности олигонуклеотидов, если не обеспечить их эффективную доставку в клетки. Одним из способов, позволяющим улучшить транспорт олигонуклеотидов через клеточную мембрану, является использование носителей, образующих с олигонуклеотидами комплексы за счет электростатических взаимодействий. В нашем распоряжении было два типа носителей: синтетический полимер, поли-диметиламиноэтил-метакрилат (pDMAEMA), синтезированный в научной группе к.х.н. Н.С. Мелик-Нубарова (кафедра ВМС Химического факультета МГУ) и ряд носителей пептидной природы, любезно предоставленных нам доктором Ж. Дивита (отдел биофизики Центра исследований биохимии макромолекул, Монпелье, Франция) в рамках сотрудничества по проекту 6-ой рамочной программы Европейского Сообщества.

pDMAEMA является водорастворимым катионным полимером. Показано, что его комплексы с ДНК проникают в клетку по механизму эндоцитоза [van de Wetering Р. et al. (1998) J Control Release. 53, 145-153; Jones R.A. et al. (2004) J Control Release 96, 379-391]. Эффективность проникновения зависит от молекулярной массы полимера (степени полимеризации) и соотношения ДНК/полимер в комплексе. В нашем случае степень полимеризации п составляла 100 звеньев.

Одним из пептидных векторов был специально сконструированный 27-звенный пептид MPG (Ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-NHCH2CH2SH), включающий фрагмент

белка gp41 ВИЧ-1, ответственный за его слияние с клеточной мембраной, и фрагмент Т-антигена вируса SV-40, ответственный за ядерную локализацию. Данный вектор ранее использовали для доставки в клетку как одноцепочечных олигонуклеотидов, так и плазмидных ДНК [Morris М.С. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (14), 2730-2736; Morris М.С. et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27 (17), 3510-3517]. Показано, что олигонуклеотиды в комплексе с MPG менее чем за 1 час, с эффективностью >90% проникают в клетки различных клеточных линий и локализуются преимущественно в ядре. Предполагают, что их проникновение протекает по механизму, отличному от эндоцитоза.

Структура второго пептидного вектора, называемого далее Пептид 1, включает 21 аминокислотный остаток: KETWFETWFTEWSQPKKKRKV. Данный пептид был разработан для доставки в клетки незаряженных или слабо заряженных ПНК [Morris М,С. et al. (2004) Gene Therapy. 11, 757-764]. Структура третьего вектора, Пептида 2, в настоящее время является объектом готовящегося патента. Пептид 2, как и Пептид 1, амфифилен. Он был разработан для доставки коротких олигонуклеотидов. Как и в случае с MPG, предполагается, что проникновение комплексов олигонуклеотидов с Пептидом 1 и Пептидом 2 через мембрану клетки происходит по механизму, отличному от эндоцитоза.

3.1. Формирование комплексов олигонуклеотидного ингибитора с

носителями

Прежде всего, мы проверили, способны ли имеющиеся у нас носители образовывать с олигонуклеотидным ингибитором комплексы. Для этого мы воспользовались методом электрофореза в агарозном геле. Олигонуклеотидный ингибитор смешивали с различными количествами носителя, смесь инкубировали для формирования комплекса, а затем наносили на агарозный гель. В экспериментах по выбору носителя для доставки ингибитора в клетку мы использовали только конъюгат с эозином 11-ОМ-Е. Присутствие в его составе молекулы-флуорофора позволяло следить как за его миграцией в геле, так и за его проникновением в клетки без дополнительного введения какого-либо маркера. Электрофоретический анализ показал, что в случае MPG полного связывания олигонуклеотидного ингибитора в комплекс с носителем не происходит даже при молярном соотношении ингибитор/носитель = 40:1, максимальном соотношении, использованном в данном эксперименте. Возможно, плохое связывание коньюгата с MPG обусловлено недостаточной длиной олигонуклеотида. Необходимо отметить, что ранее этот носитель использовался для доставки в клетки более длинных (> 18-звеиьев) олигонуклеотидов и ДНК. В случае Пептида 1, при молярном соотношении ингибитор/носитель 1:10 и выше образовывался комплекс ингибитора с носителем, однако устойчивость комплекса в условиях электрофореза была низкой. При использовании Пептида 2, уже при соотношении 1:5 весь ингибитор связывался в комплекс. Комплекс олигонуклеотидного ингибитора с pDMAEMA формировался при соотношении зарядов полимера и олигонуклеотида >2:1.

3.2. Трансфекция клеток комплексами олигонуклеотидного ингибитора с пептидными носителям

Проникновение комплексов олигонуклеотидного ингибитора с пептидными носителями в клетки изучали методом флуоресцентной микроскопии с использованием культуры клеток карциномы человека НеЬа.

Трансфекцию клеток осуществляли по двум схемам. Согласно первой из них, клетки инкубировали с комплексом олигонуклеотидного ингибитора с пептидным носителем в среде в отсутствие сыворотки в течение 2 часов при 37°С, затем фиксировали их с помощью раствора формальдегида; по второй схеме, клетки инкубировали с комплексом в течение 1 часа, затем к клеткам с комплексом добавляли сыворотку и инкубировали еще 1 час, после этого их фиксировали. Известно, что в присутствии сыворотки устойчивость комплекса олигонуклеотид-носитель снижается, что, в свою очередь, сказывается на эффективности проникновения олигонуклеотида в клетки. С другой стороны, условия трансфекции в присутствии сыворотки являются более благоприятным для клеток и могут снижать токсичность трансфицирующих агентов. По этим причинам, нам было важно сравнить эффективность проникновения олигонуклеотида в клетки при наличии сыворотки и в ее отсутствие.

О проникновении олигонуклеотидного ингибитора внутрь клеток судили по возникновению флуоресцентного свечения (520-530 нм, желто-зеленая флуоресценция) трансфицированных клеток при облучении УФ. Для того чтобы идентифицировать место локализации флуоресценции, ядра фиксированных клеток были окрашены красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (ЛарО (461 нм, синяя флуоресценция). Сопоставление картин, полученных с разными фильтрами, позволяло определить место нахождения олигонуклеотидного ингибитора (цитоплазма клетки или ее ядро).

Для трансфекции клеток мы использовали комплексы олигонуклеотидного ингибитора 11-ОМ-Е со всеми тремя пептидными носителями. Комплексы с пептидами формировались из расчета, чтобы конечная концентрация 11-ОМ-Е в растворе, с которым инкубируются клетки, составляла I мкМ, при этом количество носителя варьировалось. В случае МРв мы брали 5-ти и 20-ти кратные молярные избытки пептида по отношению к ингибитору, а в случае Пептида 1 и Пептида 2 — 5-ти, 20-ти и 40-кратные избытки. В качестве контроля мы использовали клетки, инкубированные с 1 мкМ раствором 11-ОМ-Е без носителя (рис. 6, Л). Отсутствие флуоресценции в этих клетках свидетельствовало о том, что олигонуклеотидный ингибитор без носителя в клетки не проникает. При инкубации клеток с 11-ОМ-Е в комплексе с носителями самый низкий уровень флуоресценции наблюдался в клетках, для трансфекции которых применяли комплекс 11-ОМ-Е с МРв (рис. 6, Б). Этот результат, очевидно, объясняется низким содержанием комплекса, обусловленным слабым связыванием олигонуклеотидного конъюгата с полимером.

Рис. 6. Трансфекпия клеток Heia А ингибитором 11-ОМ-Е tío j носителя, Б комплексом ингибитора 11-ОМ-Е с MPG / картина, полученная с фильтром для зеленой флуоресценции, II картина, полученная с фильтром для синей флуоресценции.

При трансфекции клеток комплексом с Пептидом 1 уровень флуоресценции и место ее локализации зависели от соотношения ингибитора и пептида (рис. 7, А) Проникновение коиъюгата в клетки детектировалось уже при соотношении ! :5, мри соотношении 1:20 эффективность трансфекции значительно увеличивалась, причем наблюдалась п основном внутриядерная локализация флуоресценции. Дальнейшее повышение количества пептида существенно не влияло на уровень трансфекции. Для Пептида 1 были получены схожие результаты по эффективности проникновения, как в отсутствие сыворотки, так и в ее присутствии.

V Л

о £ Б К с

S г ё

в л

D

Ё

О

0 X

1 1:20

Ю S

X S

i

X

I 1:40

0 г

1

Q

о

Рис. 7. Трансфекпия клеток Hela ií отсутствие сыворотки: А - комплексом ингибитора 11-ОМ-Е с Пептидом 1, Б комплексом ингибитора 11-ОМ'Е с Пептидом 2 I картина, полученная с фильтром для зеленой флуоресценции. II картина, полученная с фильтром для синей флуоресценции

Напомним, что уже при соотношении ингибитора к Пептиду 2 1:5 весь ингибитор связывался в прочный комплекс. Тем не менее, комплекс таког о состава и клетку практически не проникал. Флуоресценция наблюдалась только в районе клеточной мембраны (рис. 7, Б), При увеличении количества пептидного носителя проникновение улучшалось, однако при соотношении ингибитора к пептиду 1:40 комплекс становился токсичным для клетки. На

рисунке 7, Б (при соотношении ингибитора к носителю 1:40) можно видеть клетки с нарушенной ядерной мембраной. Однако при трансфекшш клеток в присутствии сыворотки токсичность комплекса 1:40 снижалась.

Таким образом, для доставки ингибитора 11-ОМ-Е к ВИЧ-инфицированные клетки целесообразно использовать его комплексы с Пептидом 1 и с Пептидом 2 при соотношении не более 1:20, причем грансфекцию можно проводить в присутствии сыворотки

3.3 Трансфекция клеток комплексом олигонуклеотидного ингибитора с

pDMAEMA

Для изучения проникновения олигонуклеотидного ингибитора в клетку с помощью

pDMAEMA были использованы клетки мышиных фибробластов NIH ЗТЗ. Механизм и

эффективность проникновения ДНК с помощью этого носителя отличаются m механизма и

эффективности проникновения ДНК в комплексе с пептидными носителями. При инкубации

клеток с комплексом Д H K/pDMA ЕМ А в течение I часа транефм 11 нрованным и оказываются лишь

3-6% клеток [van de Wetering Р. el al. (1998) J. Control Release. 53, 145-153]. По этой причине

схема трансфекшш клеток комплексом олигонуклеотидного инг ибитора 11-ОМ-Е с pDMAEMA

отличалось от таковой при использовании пептидных носителей.

Для трансфекции к легок мы

использовали две концентрации

ингибитора - I мкМ и 5 мкМ.

Соотношение зарядов

олигонуклеотидного ингибитора и

полимера в обоих случаях составляло

I I0. Одна серия клеток инкубировалась

с комплексом 11'OM-E/pDMAEMA п

течение 4 часов в отсутствие сыворотки

при температуре 37° С, затем

фиксировалась раствором

формальдегида. Д русая серия клегок

гакже в течение 4 часов инкубировалась

с комплексом R отсутствие сыворотки,

затем к клеткам с комплексом добавляли сыворотку и инкубировали eme 20 часов, после Этого

клетки фиксировали. Трансфицированкые к легки наблюдали во флуоресцентный микроскоп

(рис. 8}. Мри трансфекции ImkM комплексом по истечении 4 часов уровень флуоресценции в

клетках был достаточно низким. При увеличении времени инкубации до 24 часов количество

ингибитора, прошедшего и клетки увеличивалось. При этом флуоресценция наблюдалась,

главным образом, в цитоплазме клеток. В случае использования 5 мкМ комплекса высокий

17

Инкубация 4 часа Инкубация 24 часа

1мкМ 11-ОМ-Е

I'm. S. Трансфекция клеток NIH ЗТЗ комплексом ингибитора 11-ОМ-Е с носителем pDMAEMA

уровень флуоресценции клеток наблюдался уже при 4 часовой инкубации. При этом флуоресценция детектировалась не только в цитоплазме клеток, но и в их ядрах.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что рйМАЕМА может быть использована для доставки олигонуклеотидного ингибитора в ВИЧ-инфицированные клетки, однако время трансфекции клеток должно быть больше, чем в случае использования носителей пептидной природы.

ТЕСТИРОВАНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ИНГИБИТОРОВ НА ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ

Тестирование противовирусной активности олигонуклеотидных ингибиторов 11-ОМ-Е и 11-0М-01 на ВИЧ-инфицированных клетках было проведено д-р Мириам Витвру (факультет медицины, Каталический университет г. Левей, Бельгия) в рамках сотрудничества по проекту 6-ой рамочной программы Европейского Сообщества. Тестирование проводилось с использованием линии лимфобластоидных клеток человека МТ-4, инфицированных штаммом НТЬУ-Шв/ЬА1 ВИЧ. Противовирусная активность характеризовалась значением концентрации ингибитора ЕСзд, при которой цитопатогенное действие вируса подавлялось на 50%. Параллельно определялась цитотоксичностъ ингибитора в комплексе с носителем - СС¡о Помимо исследованных нами пептидов, в качестве носителя использовался также укороченный аналог Пептида 1, называемый далее Пептид 3. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Таблица 4. Противовирусная активность олигонуклеотидных ингибиторов

Ингибитор Носитель ЕС ¡о, мкМ СС50, мкМ Б/

11-ОМ-Е МРв >2.0 >2.0 -

шшшшшшт Пептид 1 (1:20) >31.0 УЛЯ&Г 1

Пептид 2 (1:20) >5.6 >5.6 -

Пептид 3 (1:20) 0.82 3.0 3

рОМАЕМА 0.105 0.3 3

11-0М-01 МРв >10.0 >10.0 -

Пептид 2 (1:20) >6.9 6.9 -

Пептид 3 (1:20) 0.69 3.5 5

рОМАЕМА 0.116 0.45 35

Высокую противовирусную активность - ЕС ¡о - 3 нМ - в сочетании с относительно низкой цитотоксичностью показал олигонуклеотидный конъюгат с эозином 11-ОМ-Е в случае использования в качестве носителя Пептида 1 (соотношение ингибитор/носитель 1:10). При

18

использовании Пептида 3 и рйМАЕМА оба ингибитора показали противовирусную активность. Однако индекс селективности Э/ - соотношение цитотоксичности и активности данных комплексов - имел низкие значения

ВЫВОДЫ

1. Синтезирована серия конъюгатов сдигодезоксинуклеотида в О ТТТТТО Тв Т с различными гидрофобными молекулами, исследована их способность ингибировать каталитическую активность интегразы ВИЧ-1 и показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты с эозином и олеиновой кислотой. Исследовано влияние длины олигонуклеотида и структуры его углеводо-фосфатного остова на ингибирующую активность. Установлено, что конъюгаты 11-звенного 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой специфично подавляют активность в реакциях З'-процессинга и переноса цепи.

2 Показано, что конъюгаты подавляют активность интегразы, разрушая ее комплекс с субстратной ДНК.

3 Установлено, что конъюгаты взаимодействуют с С-кониевым доменом интегразы в районе Ьув236. Предложена гипотеза, согласно которой взаимодействие ингибитора с ферментом в данном участке приводит к нарушению гидрофобных контактов, формирующих р-баррельную структуру С-концевого домена, что в результате вызывает нарушение его ДНК-связываюшей функции.

4. Изучено проникновение олигонуклеотидного ингибитора в клетки в присутствии носителей различной природы и подобраны оптимальные условия трансфекции. Обнаружено, что конъюгат 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином 11-ОМ-Е в комплексе с пептидным носителем (Пептид 1) эффективно ингибирует репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Агапкина Ю.Ю., Смолов М.А., Приказчикова Т.А.. Зубин Е.М., Готтих М Б. Взаимодействие интегразы вируса иммунодефицита человека с модифицированными аналогами вирусной ДНК. Материалы III съезда биохимического общества, 26 июня 2002 года, Санкт-Петербург, Россия, с. 474;

2 Приказчикова Т.А., Готтих М.Б. Интеграза ВИЧ-1: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами 8-ая международная Путинская школа-конференция молодых ученых, 17-21 мая 2004, Пущино, Россия;

3. Smolov М., Prikazchikova Т.. Agapkina Y., Pinskaya М., Deprez Е., Mouscadet J-F., Gottikh M. HIV-1 integrase: mechanism of action and search for inhibitors. Международная конференция "Chemical & Biological Problems of Proteomics", 5-9 июля 2004, Новосибирск, Россия;

4. Prikazchikova Т.. Mouscadet J.-F. and Gottikh M. Integrase HIV-1: inhibition catalytic activity by modified oligonucleotides. 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference "The Protein World", 2-7 July 2005, p. 17;

5. Prikazchikova Tatiana. Agapkina Julie, Gottikh Marina Integrase HIV-1: inhibition catalytic activity in vitro. International Symposium "Advances in Science for Drug Discovery", 11-16 July 2005, B-41;

6. Ю.Ю. Агапкина, T.A Приказчикова. M.A. Смолов, М.Б. Готтих. (2005) Структура и функции интегразы ВИЧ-1. Успехи биологической химии, т. 45, с. 87-122;

7. Д.В. Акимов, Д.А. Филимонов, Т.А Приказчикова. М.Б. Готтих, В.В. Поройков. (2005) Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1. Биомедицинская химия, т. 51, вып. 3, с. 335-340;

8. Т.А Приказчикова. Е.М. Волков, Е.М. Зубин, Е.А. Романова, М. Б. Готгах (2007) Ингибирование интегразы ВИЧ-1 модифицированными олигонуклеотидами. Оптимизация структуры ингибитора. Молекулярная биология, т. 41, № 1, с. 130-138.

Принято к исполнению 22/01/2007 Исполнено 23/01/2007

Заказ № 43 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Список принятых сокращений.

Введение.

1. Ингибиторы интегразы вируса иммунодефицита человека и механизм их действия /обзор литературы/.

1.1. Интеграза ВИЧ-1: строение и функции.

1.2. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1.

1.2.1. Низкомолекулярные ингибиторы.

1.2.1.1. Производные дикетокислот.

1.2.1.2. Производные нафтиридина.

1.2.1.3. Стирилхинолиновые ингибиторы.

1.2.1.4. L-цикориевая кислота и ее производные.

1.2.1.5. Производные гидроксикумарина.

1.2.2. Пептиды и антитела.

1.2.3. Олигонуклеотиды.

2. Интеграза ВИЧ-i: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами результаты и обсуждение/.

2.1. Оптимизация структуры олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1.

2.1.1. Оптимизация структуры ненуклеотидной части олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1.

2.1.1.1. Дизайн и синтез конъюгатов.

2.1.1.2. Влияние структуры ненуклеотидной части конъюгата на его ингибирующую активность.

2.1.1.3. Влияние положения ненуклеотидной части в структуре конъюгата на его ингибирующую активность.

2.1.2. Оптимизация структуры нуклеотидной части ингибитора интегразы ВИЧ-1.

2.1.2.1. Влияние длины олигонуклеотида на ингибирующую активность конъюгата.

2.1.2.2. Влияние модификаций углеводо-фосфатного остова олигонуклеотида на ингибирующую активность его конъюгатов.

2.1.3. Влияние олигонуклеотидных конъюгатов на активность некоторых ДНК-связывающих ферментов.

2.1.4. Проверка ингибирующей активности конъюгатов 2'-0-метил-олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой.

2.2. Механизм действия олигонуклеотидных конъюгатов.

Определение участка связывания ингибитора.

2.2.1. Действие олигонуклеотидных конъюгатов на устойчивость комплекса интегразы ВИЧ-1 с ДНК.

2.2.2. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1 и определение участка связывания.

2.2.2.1. Дизайн и синтез олигонуклеотидных ингибиторов, содержащих 2,3 -дигидроксипропил ьную группировку при 2'-0-атоме уридина.

2.2.2.2. Оптимизация условий ковалентного присоединения ингибитора к интегразе.

2.2.2.3. Получение препаративного количества ковалентно связанного комплекса ингибитора T2-F1 с интегразой, его триптический гидролиз и подготовка продуктов гидролиза к масс-спектрометрическому анализу.

2.2.2.4. Масс-спектрометрический анализ продуктов триптического гидролиза ковалентно связанного комплекса ингибитора с интегразой.

2.3. Доставка олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1 в клетки.

2.3.1. Оптимизация условий формирования комплексов олигонуклеотидного ингибитора с носителями.

2.3.2. Проникновение олигонуклеотидного ингибитора в клетки.

2.3.2.1. Трансфекция клеток комплексами олигонуклеотидного ингибитора с пептидными носителями.

2.3.2.2. Трансфекция клеток комплексом олигонуклеотидного ингибитора с pDMAEMA.

Тестирование противовирусной активности олигонуклеотидных ингибиторов на ВИЧ-инфицированных клетках.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Реактивы иматериалы

3.1.1. Реактивы.

3.1.2. Ферменты.

3.1.3. Олигонуклеотиды.

3.1.4. Буферные растворы.

3.2. Методы.

3.2.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотида с флуоресцеином, эозином и тетраметилродамином.

3.2.2. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность интегразы ВИЧ-1.

3.2.3. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность фрагмента Кленова.

3.2.4. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность эндонуклеазы рестрикции Msp 9RI.

3.2.5. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность мутантов интегразы ВИЧ-1.

3.2.6. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность интегразы ПВЧ.

3.2.7. Изучение действия олигонуклеотидных конъюгатов на устойчивость комплекса интегразы ВИЧ-1 с ДНК.

3.2.8. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1 и определение участка связывания.

3.2.9. Изучение проникновения олигонуклеотидного конъюгата в клетки.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) поражает иммунную систему и вызывает одно из опаснейших заболеваний - синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). По оценкам всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), на начало 2006 года число людей, зараженных ВИЧ, во всем мире составляло 38,6 миллиона человек (рис.1) [1]. Число людей, заразившихся ВИЧ в 2005 году, составило 4,1 миллиона человек, и 2,8 миллиона человек умерли от СПИДа. В Российской Федерации с момента начала эпидемии и до начала 2006 года официально было зарегистрировано около 350 000 случаев ВИЧ-инфекции. Однако фактическое число людей, живущих в России с ВИЧ-инфекцией намного выше. По различным оценкам, их количество на начало 2006 года составляет от 560000 до 1,6 миллиона человек.

15.04-34,0% □ 1.0%-<5.0% □ 0,1%-<Я.5Ч

5,0%-<15,0Ч □ 0,5%-<1,0% □ <0,1%

Рис. 1. Глобальная картина ВИЧ-инфекции по данным ВОЗ (на начало 2006 года) [1].

До начала применения первых коммерчески доступных лекарственных препаратов против СПИДа продолжительность жизни больных составляла не более одного года. Используемая в настоящее время комплексная терапия HAART (highly active antiretroviral therapy) позволяет продлить время жизни больных СПИДом до 8 лет [2]. Данный вид терапии включает лекарственные препараты, направленные на подавление трех стадий репликативного цикла ВИЧ: обратной транскрипции, протеолитического созревания и слияния вирусной частицы с клеткой. Необходимость использования комплексной терапии обусловлена быстрой эволюцией ВИЧ, которая приводит к появлению устойчивых к препаратам форм вируса. Несмотря на то, что

HAART-терапия рассматривается как наиболее действенная и доступная на сегодняшний день, ее применение приводит к желаемому снижению уровня инфекции только у 50-90% наблюдаемых больных. Она так же не позволяет полностью остановить репликацию ВИЧ. Кроме того, часто возникают проблемы с доступностью препаратов, применяемых в HAART-терапии, их токсичностью и восприимчивостью организмом инфицированного человека. По этим причинам в настоящее время продолжается активный поиск как новых ингибиторов указанных выше стадий репликативного цикла ВИЧ, так и соединений, нарушающих другие стадии цикла вируса и способных дополнить существующую противовирусную терапию.

Большое внимание уделяется разработке ингибиторов стадии интеграции. В ходе собственного воспроизводства вирус использует ресурсы клетки, для чего ему необходимо встроить (интегрировать) ДНК-копию своего генома в геном зараженной клетки. Этот процесс осуществляет вирусный фермент интеграза. Показано, что вирус, содержащий дефектную интегразу, не способную осуществлять интеграцию вирусной ДНК, не размножается в культуре клеток [3]. Это говорит о ключевой роли стадии интеграции в репликативном цикле ВИЧ. Кроме того, остановка репликации вируса при нарушении функций интегразы свидетельствует также о том, что клетка не содержит каких-либо собственных ферментов, способных катализировать интеграцию. В связи с этим, ингибиторы, специфично подавляющие каталитическую активность интегразы, не должны влиять на другие клеточные процессы и, как следствие, должны быть менее токсичны для клетки и всего организма в целом по сравнению с ингибиторами других стадий репликативного цикла ВИЧ. Но, несмотря на всю привлекательность интегразы в качестве мишени для противовирусных препаратов, на сегодняшний день нет ни одного соединения - ингибитора интегразы, которое бы успешно прошло все клинические испытания и было бы предложено как лекарственное средство против СПИДа. Большинство известных на сегодняшний день ингибиторов интегразы, в том числе и ингибиторы, находящиеся на стадии клинических испытаний, взаимодействуют с ионом магния, связанным в активном центре фермента. Однако уже показано, что применение этих ингибиторов приводит к быстрому появлению устойчивых к их действию форм фермента, содержащих мутации в активном центре. Кроме того, такие ингибиторы способны влиять на активность клеточных ферментов, относящихся к тому же семейству, что и интеграза, и использующих при катализе ионы магния, например, V(D)J RAG рекомбиназы, которые необходимы для нормального синтеза антител в организме. В этой связи крайне актуальным является поиск новых соединений, способных подавлять каталитическую активность интегразы, и в том числе ингибиторов с новым механизмом действия.

Целью настоящей работы стала разработка эффективных, специфичных и нецитотоксичных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе модифицированных олигонуклеотидов. В ходе работы был осуществлен синтез серии конъюгатов коротких одноцепочечных олигонуклеотидов с гидрофобными соединениями различной структуры и исследовано их действие на активность интегразы ВИЧ-1. Показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты 11-звенных олигонуклеотидов с эозином и олеиновой кислотой. Эти соединения подавляют обе стадии интеграции: З'-процессинг и перенос цепи. Кроме того, было исследовано влияние длины олигонуклеотида и структуры его углеводо-фосфатного остова на ингибирующую активность конъюгатов. По результатам исследований, для ингибирования интегразы ВИЧ-1 in vivo предложены конъюгаты 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином или олеиновой кислотой.

Для того чтобы понять механизм действия предложенных нами ингибиторов, мы изучили их действие на комплекс интегразы с ДНК-субстратом - U5 фрагментом ДНК ВИЧ. Установлено, что действие ингибиторов на основе модифицированных олигонуклеотидов направленно на разрушение комплекса интегразы с вирусной ДНК. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе с последующим масс-спектрометрическим анализом продуктов триптического гидролиза ковалентно связанного комплекса позволило идентифицировать участок фермента, с которым взаимодействует ингибитор. Показано, что он локализован в С-концевом домене интегразы. Высокая активность олигонуклеотидных конъюгатов как ингибиторов интегразы ВИЧ-1 свидетельствует о важности данного участка в функционировании фермента. Полученная информация может быть использована для дизайна новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

Для тестирования противовирусной активности предлагаемых нами ингибиторов на ВИЧ-инфицированных клетках мы подобрали носители, обеспечивающие эффективную доставку олигонуклеотидных конъюгатов в ядра клеток. В сотрудничестве с университетом г. Левен (Бельгия) показано, что конъюгаты 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой ингибируют репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках.

Работа включает обзор литературы, посвященный основным классам ингибиторов интегразы ВИЧ-1 и механизмам их действия.

выводы

1. Синтезирована серия конъюгатов олигодезоксинуклеотида GGTTTTTGTGT с различными гидрофобными молекулами, исследована их способность ингибировать каталитическую активность интегразы ВИЧ-1 и показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты с эозином и олеиновой кислотой. Исследовано влияние длины олигонуклеотида и структуры его углеводо-фосфатного остова на ингибирующую активность. Установлено, что конъюгаты 11-звенного 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой специфично подавляют активность в реакциях З'-процессинга и переноса цепи.

2. Показано, что конъюгаты подавляют активность интегразы, разрушая ее комплекс с субстратной ДНК.

3. Установлено, что конъюгаты взаимодействуют с С-концевым доменом интегразы в районе Lys236. Предложена гипотеза, согласно которой взаимодействие ингибитора с ферментом в данном участке приводит к нарушению гидрофобных контактов, формирующих p-баррельную структуру С-концевого домена, что в результате вызывает нарушение его ДНК-связывающей функции.

4. Изучено проникновение олигонуклеотидного ингибитора в клетки в присутствии носителей различной природы и подобраны оптимальные условия трансфекции. Обнаружено, что конъюгат 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином 11-ОМ-Е в комплексе с пептидным носителем (Пептид 1) эффективно ингибирует репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках.