Изучение молекулярных основ взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Смолов Максим Александрович

ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 С ДНК

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук, вед. науч. сотр.

Готтих Марина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Костров Сергей Викторович

кандидат химических наук, ст. науч. сотр. Хомутов Алексей Радиевич

Ведущая организация: Государственное учреждение

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится 25 апреля 2006 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 25 марта 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

/Смирнова И.Г./

¿OOGft 70 GB

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современная хемиотерапия ВИЧ нацелена на подавление двух вирусных ферментов: обратной транскриптазы и протеазы, и, как правило, соответствующие ингибиторы этих белков применяют сразу одновременно Однако чрезвычайно быстрая скорость мутаций вируса приводит к тому, что даже использование подобных_ терапевтических "коктейлей" со временем оказывается малоэффективным. Именно поэтому поиск новых мишеней и ингибирующих их соединений в случае ВИЧ оказывается крайне актуальной задачей.

Одной из подобных мишеней по праву можно считать вирусный фермент - интегразу (ИН). Известно, что вирусы, содержащие дефектный белок, не способны размножаться в клеточной культуре. Полное отсутствие репликации вируса, обладающего дефектной формой интегразы, свидетельствует о том, что в организме человека нет каких-либо собственных ферментов, способных катализировать интеграцию. К сожалению, создание эффективных ингибиторов ИН тормозится как отсутствием информации о структуре полноразмерного белка и его комплекса с ДНК, так и неоднозначным пониманием целостного биохимического механизма интеграции.

В клетке ИН осуществляет перенос ДНК-копии генома вируса в хромосомную ДНК. Известно, что ИН связывается с концами вирусной ДНК (субстрата) в районе U3- и U5-участков тн длинных концевых повторов (LTR) и катализирует две последовательные реакции: З'-концевой процессинг, при котором гидролизуется межнуклеотидная связь между вторым и третьим от 3'-концов ДНК нуклеотидами, и перенос цепи, включающий встраивание укороченного ДНК-субстрата в геном клетки (мишень). Таким образом, ИН связывает и затем расщепляет две различные молекулы ДНК; при этом расщепление вирусной ДНК строго сиквенс-специфично, а расщепление ДНК-мишени происходит независимо от нуклеотидной последовательности. Механизм взаимодействия ИН с ДНК-субстратом и ДНК-мишенью до сих пор непонятен.

Для осуществления катализа ИН необходимо присутствие кофактора - иона металла, которым в природе является Mg2*. Однако основная масса исследований свойств ИН in vitro выполнена на рекомбинантных препаратах, проявляющих свою активность в присутствии ионов марганца по причине более высокой активности белка в этих условиях. В то же время Мп2+-зависимый катализ характеризуется гораздо меньшей специфичностью по сравнению с М^-зависимым. В результате многие ингибиторы интеграции, найденные с использованием марганец-зависимой ИН в экспериментах in vitro, оказались неактивными в условиях in vivo. В этой связи крайне актуальным является изучение ферментативных свойств и механизма действия ИН, активной в присутствии ионов Mg2*, поскольку данные, полученные для

РОС. национа/ библиотека

такого фермента, можно более адекватно использовать в исследованиях интеграции ВИЧ и создании ингибиторов ИН.

Цель работы. В рамках диссертационной работы ставилась задача выяснения деталей механизма взаимодействия магний-зависимой ИН с ДНК-субстратом и ДНК-мишенью на стадиях связывания и З'-процессинга. Для решения этой задачи было необходимо: (1) оценить ДНК-связывающую и каталитическую активности ИН и определить их основные количественные характеристик; (2) охарактеризовать комплексы ИН с ДНК-субстратом и мишенью на уровне их структурной организации; (3) определить субъединичный состав процессирующего комплекса.

Научная новизна и практическая значимость. При изучении ДНК-связывающей активности показано, что связывание любой ДНК протекает одинаково, не зависит от нуклеотидной последовательности и сопровождается формированием одного типа первичного комплекса. Впервые проведено всестороннее изучение каталитической активности рекомбинантного препарата магний-зависимой интегразы. Показано, что фермент функционирует в принципиально однооборотном режиме. Определены и изучены причины такого поведения ИН, а также экспериментально получены количественные характеристики активности белка. По результатам кинетических экспериментов выдвинута гипотеза относительно механизма связывания ДНК, согласно которой за быстрым формированием первичного комплекса ИН с субстратом следует медленная стадия его структурной реорганизации. Для подтверждения этой гипотезы был использован метод ковалентного присоединения ДНК к ИН. На основании данных кинетических исследований активности ИН и результатов ковалентного присоединения ИН к субстрату, содержащему несколько реакционноспособных звеньев, получена информация о димерной организации процессирующего комплекса. Полученные данные проливают свет на биологический механизм действия ИН и важны для создания специфических ингибиторов интеграции и разработки методов тестирования их анти-интегразной активности.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: III съезде российского биохимического общества (С.-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г.), международной путинской школе-конференции молодых ученых: "Биология - наука XXI века" (Пущино, 7-21 мая 2004 г.), международной конференции "Chemical & Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, 5-9 июля 2004 г.), международном совещании "Targeting replication and integration of HIV" (Франкфурт, Германия 20-24 марта 2005 г.), 30л FEBS Congress and 9th IUBMB Conference (Будапешт, Венгрия, 2-7 июля 2005 г.), International Symposium "Advances in Science for Drug Discovery" (Москва - С.-Петербург 11-16 июля 2005 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы' введение, обзор литературы "Структурные мотивы ДНК-связывающих белков", результаты и обсуждение, экспериментальная часть, выводы и список литературы Материал иллюстрирован 73 рисунками и 5 таблицами Библиографический указатель включает в себя 197 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Важной особенностью ИИ, влияющей на каталитическую активность, является ее мультимерное состояние, при этом число субъединиц в мультимере зависит от концентрации белка, а также наличия в среде катионов, детергентов или ДНК. Высокая склонность к агрегации природной ИН приводит к тому, что ее выделение в подавляющем большинстве случаев осуществляют в присутствии различных детергентов (CHAPS, NP-40), что влияет на структуру белка и его взаимодействие с ДНК и ингибиторами. Такая выделенная в присутствии детергентов ИН обычно активна только в присутствии ионов марганца и обладает гораздо меньшей специфичностью по отношению к субстрату и ингибиторам, чем магний-зависимый фермент.

К моменту начала нашей работы удалось разработать методику выделения ИН в отсутствии каких-либо детергентов [Left, Н., et al. II Biochemistry, 2000]. Выделение осуществлялось в присутствии ионов цинка, которые связываются N-концевым доменом ИН и необходимы для ее активности in vivo. Как показали исследования, такой белок находился в растворе преимущественно в тетрамерном состоянии вплоть до субмикромолярных концентраций, эффективно связывал ДНК и катализировал интеграцию в присутствии ионов Mg2* Все эти сведения позволили нам предположить, что новый рекомбинантный препарат гораздо точнее моделирует свойства ИН, наблюдаемые в условиях in vivo, чем препараты, изучавшиеся ранее. Мы поставили своей задачей охарактеризовать эту М^-зависимую ИН и изучить молекулярные основы ее взаимодействия с ДНК.

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СВОЙСТВ Мв^-ЗАВИСИМОЙ ИН

Одной из причин, затрудняющих изучение каталитических свойств ИН, является ее низкая активность' для осуществления З'-процессинга необходим очень высокий избыток фермента по отношению к ДНК (обычно > 30:1) В литературе столь низкая активность белка обычно объяснялась малым содержанием активных молекул в изучаемых препаратах. Свое изучение свойств М^-зависимой ИН мы начали с исследования стадии связывания ДНК и

З'-концевого процессинга с тем, чтобы количественно оценить ферментативные свойства нового препарата белка.

1.1. Характеристика связывания ДНК интегразой ВИЧ-1

Успешному осуществлению каталитического превращения ДНК-субстрата и его последующего встраивания в ДНК-мишень предшествует процесс образования комплекса ИН/ДНК - стадия связывания.

При изучении препаратов белка, выделенных при наличии детергента и проявляющих свою активность в присутствии ионов двухвалентного марганца было показано, что интеграза способна связывать любую последовательность ДНК с одинаковым сродством. Нам необходимо было выяснить, как происходит связывание ДНК магний-зависимой интегразой, агрегатное состояние которой отличается от состояния ИН, выделенной с использованием детергентов и изучавшейся ранее. В качестве субстрата использовался 21-звенный дуплекс (1/В/17А), последовательность которого соответствует последовательности {/5-повтора вирусной ДНК, расщепляемой ИН при З'-процессинге, в качестве мишени -21-звенный дуплекс случайной последовательности (ТВ/ТА) (Рис. 1).

Прежде всего, была изучена кинетика процесса связывания методом поляризации флуоресценции. Для этого к 5'-концу цепей ив или ТВ присоединялась молекула флуоресцеина (И).

Оказалось, что для осуществления полного связывания любого ДНК-дуплекса необходимо около 20 минут (Рис. 2 А). При отсутствии в реакционной смеси ионов магния кривые связывания Р1-ИВ/1]А и Р1-ТВ/ТА выглядели аналогично представленным на рисунке 2. Следовательно, присутствие необходимо для осуществления каталитического превращения, но не является обязательным условием формирования комплекса ИН с ДНК В том случае, если пренебречь изменениями концентрации ИН в присутствии избытка белка ([/.V] = [М^^), по экспериментальным данным можно вычислить эффективную константу первого порядка для скорости связывания (кт = к/ х [/#1,) с точностью до постоянного множителя - концентрации ИН, согласно уравнению (1):

[IN*DNA\ = lDNA^\0x( 1-е~ (1)

I

ив/ил 5'-ОТвТвСААААТСТСТАССАСТ-3'

3' -САСАССТТТТА<ЗАОАТССТСА-5' 5'-еСААТСТАСС<ЗСС<ЗСААТевТ"3'

3' -ССТТА<гАТССССеС6ТТАССА-5'

Рис. 1. Структура аналогов Ш-субстрата (ЦВ УА) и мишени (7В/ТЛ), используемые в экспериментах по изучению ферментативных свойств (связывания и 3'-процессинга) магний-зависимой юлегразы ВИЧ-1 Верхние цепи дуплексов соответствуют В-цепям субстрата и мишени, нижние - А-цепям Стрелкой указано место растепления фосфодиэфирной связи, протекающего при З'-процессинге

Для 21-звенных аналогов субстрата и мишени константы составили 0.4 ±0.1 и 0.5 ±0.1 (мин'1), соответственно. Эти данные свидетельствуют об относительно медленной ассоциа-

10 20 Время, мин

100 200 300

Время, мин

Рис. 2. Кинетика связывания 3 нМ ДНК 100 нМ ИН при 25°С (А) Начальный участок кривой. (Б) Полная кривая связывания £/5-субстрата.

ими ИН с ДНК по сравнению с известными ДНК-связывающими белками (ЕсоЯУ, Ров/Лт, ТВР), для которых в сходных условиях было зарегистрировано завершение комплексообразования в течение нескольких секунд.

На втором этапе была изучена зависимость комплексообразования от концентрации белка. Для детектирования комплекса мы использовали два метода: поляризации флуоресценции и торможения в геле. Для этого радиоактивно или флуоресцентно меченые ДНК-дуплексы 11В/иА и ТВ/ТА титровали интегразой Титрование проводилось при 25°С, поскольку показано, что в этих условиях ИН способна эффективно связывать субстрат, не осуществляя его процессинг.

Используя метод торможения в геле, мы наблюдали характерную гиперболическую зависимость количества комплекса от [/Л^]0 при увеличении концентрации ИН до ЗООнМ (Рис. ЗА). Дальнейшее увеличение концентрации вплоть до 600 нМ приводило к существенному ухудшению комплексообразования. Мы склонны объяснять такое положение вещей формированием крупных агрегатов ИН, не обладающих ДНК-связывающими свойствами. На основании полученных данных были рассчитаны значения соответствующих эффективных констант диссоциации (КЛ комплексов ИН с субстратом и мишенью. Однако расчет указанных величин не может учесть таких параметров, как мультимерное состояние ДНК-связывающей формы белка и кооперативное взаимодействие субъединиц. Вычисления значений констант осуществляли в соответствии с бимолекулярным механизмом ассоциации по уравнению (2):

II[DNA}?] = + UN]o + Kd '-Vi^lo + UN]0 + К J f - 4[DNA]0[/N]0 } (2),

где [ВЛгЛ]о - общая концентрация ДНК, [/Л/]о - общая концентрация интегразы, К/ -эффективная константа диссоциации комплекса.

Для субстрата ИН UB/UA эффективная константа диссоциации соответствовала 65 ±8 нМ, а для дуплекса ТВ/ТА - аналога ДНК-мишени - 66 ±9 нМ.

При использовании метода поляризации флуоресценции константа диссоциации комплекса ИН с UB/UA оказалась немного меньшей: 21 ±6 нМ. Расхождения в результатах, очевидно, связаны с суммарной точностью определения подобных величин Учитывая это соображение, в дальнейшем для ДНК-субстрата за истинное мы принимали среднее значение К/ = 43 нМ, которое хорошо согласовалось с данными по изучению связывания, проделанному в работе [Deprez, £., et al. II Mol. Pharmacol., 2004].

Магний-зависимая интеграза также демонстрировала сродство к одноцепочечной ДНК. Однако, как видно из соответствующей кривой связывания 5 нМ олигонуклеотида UA, оно было гораздо более слабым по сравнению с ДНК-дуплексами (Рис. 3 А). Рассчитанная эффективная константа диссоциации составила около 600 нМ.

Рис. 3. Изучение связывания ИН с разными ДНК (А) Прямое титрование радиоактивно-меченых 5 нМ 1/5-(черные точки) и неспецифического (белые точки) дуплексов, а также одноцепочечного олигонуклеотида ил возрастающими концентрациями интегразы при 25°С (Б) Вытеснение 2 нМ флуоресцентно-меченого субстрата П-ИВИА из комплекса со 125 нМ ИН немечеными (Л5- (черные точки) и неспецифическим (белые точки) дуплексами при 25°С Изменение анизотропии флуоресценции (Дг) определялось по формуле* Аг - г([1Ы]) -тона, где г([ 1ТМ ]) и г ОНА представляют значения анизотропии флуоресценции смеси ДНК/ИН и свободной ДНК

Помимо прямого титрования мы провели эксперимент по вытеснению 2 нМ флуоресцентно меченого аналога субстрата РШВ/Ш из комплекса со 125 нМ интегразой немечеными дуплексами иВЮА и ТВ/ТА (Рис 3 Б) Никаких видимых различий обнаружено не было. На основании полученных данных можно сделать один общий вывод о том, что в

экспериментах tn vitro сродство магний-зависимой ИН к двуцепочечной ДНК выше, чем к одноцепочечной, и не зависит от нуклеотидной последовательности ДНК-дуплекса. 1.2. Характеристика каталитических свойств интегралы ВИЧ-1

На втором этапе мы приступили к изучению каталитических свойств белка на примере реакции З'-процессинга. Для этого использовался радиоактивно меченый по процессируемой цепи (UB) 21-звенный C/5-субстрат (Рис 1). По образованию укороченного на два нуклеотида 19-звенного продукта мы судили о протекании процессинга. Анализ состава реакционных смесей осуществляли при помощи гель-электрофореза в денатурирующих условиях (Рис. 5 А).

Прежде всего, был проведен подбор оптимальных условий реакции: соотношения концентраций ИН и ДНК-субстрата. Мы изучили зависимость эффективности З'-процессинга 3 нМ UB/UA от концентрации ИН. Зависимость образования продукта З'-процессинга носила явный колоколообразный характер (Рис. 4). Начальное повышение концентрации белка вызывало улучшение эффективности процессинга, достигая максимума при 100 нМ интегразе.

Наблюдаемое снижение активности склонны объяснять ее агрегацией Напомним, что при [w]„ > 600 нМ наблюдается также и ухудшение связывания (см стр 7) Чтобы исключить влияние агрегации, в дальнейшем во всех экспериментах мы использовали растворы белка с концентрацией < 200 нМ 1.2.1. Изучение кинетики накопления продукта процессинга

Нами был исследован ход реакции З'-процессинга во времени, для чего измерялось накопление продукта реакции в условиях избытка белка по сравнению с 21-звенным ДНК-субстратом UB/UA Как видно из рисунка (Рис 5 Б), на кривой накопления продукта процессинга можно выделить три характерных участка.

Начальная лаг-фаза (I) длится 15-20 минут, после чего, даже несмотря на сильный избыток белка по отношению к субстрату (т е несоблюдение условий кинетики Михаэлиса-Ментен), наблюдается фаза линейного роста концентрации продукта реакции (II) Спустя 2 часа, на смену линейной фазе приходит фаза насыщения (ГО) Наблюдаемое плато соответствует примерно 80%-ной конверсии начального количества субстрата и не достигает

0.9

0 6

В К

&0.3.

о

a

~ 0.0

0 200 400 2000 4000

[in]

о'

иМ

Рис. 4. Влияние концентрации ИН на каталитическую активность. ИН (5 нМ-5 цМ) инкубировалась с 3 нМ ДНК-субстратом в течение 1 ч при 37°С.

ИН при повышении ее концентрации мы

его полного превращения Данное значение хорошо согласуется с определенной нами константой диссоциации 43 нМ), которое подразумевает связывание 85% ДНК в активный комплекс в условиях описываемого эксперимента Разница в 5%, по всей видимости, связана с неактивными молекулами ИН, которые способны связывать ДНК, не процессируя ее.

По величине занимаемого промежутка времени мы предположили, что первая фаза обусловлена медленным связыванием субстрата интегразой По данным (Рис 2 А) полное связывание ДНК интегразой заканчивается как раз за 20 минут Чтобы доказать взаимосвязь лаг-фазы с образованием комплекса, мы изменили схему эксперимента и сначала провели инкубацию иВ/иА с ИН в течение 20 минут при 20°С (те температуре, при которой связывание происходит, а катализ - нет), а потом нагреванием до 37°С стимулировали протекание З'-процессинга. Как видно из рисунка, предварительная инкубация субстрата с ИН, привела к исчезновению лаг-фазы (Рис. 5 В).

су6страт_ продую-_

время, мин о ш

В

100 200 Время, мин

300

2.5

ч 2.0

1.5

ъ

к >> 1.0

и

о Л 0.5

и

0.0

100 200 300 Время, мим

Рис. 5. Изучение хода реакции З'-процессинга во времени в присутствии ионов магния (А) Радиоавтограф Г1ААГ, полученный при анализе накопления продуктов процессинга. (Б) Кривая накопления 19-звенного продукта 3*-концевого процессинга 3 нМ Ш-субстрата 100 нМ ИН Вертикальными линиями ограничены временные отрезки, соответствующие лаг-фазе (I), фазе линейного роста (II) и фазе насыщения (III) (В) То же самое с 20-минугной предварительной инкубацией реакционной смеси при 20°С

В конечном счете, спустя шесть часов, наблюдаются одинаковые концентрации продукта процессинга как при использовании предварительной инкубации, так и без нее Это

свидетельствует в пользу одинакового течения каталитической реакции после осуществления связывания

Вторая фаза (Рис 5 Б) демонстрирует явный линейный характер и протекает гораздо медленнее связывания Прямолинейная зависимость увеличения концентрации продукта процессинга похожа на многооборотное функционирование фермента согласно принципам кинетики Михаэлиса-Ментен, однако, это сходство оказывается чисто внешним. Поскольку в экспериментах по изучению каталитической активности ИН используется большой избыток белка относительно ДНК-субстрата, мы имеем дело с типичными однооборотными условиями, где использование стандартного формализма Михаэлиса-Ментен недопустимо. Нами был предложен другой математический аппарат, объясняющий поведение ИН в квазистационарном приближении для однооборотных реакций. 1.2.2. Кинетика З'-процессинга в условиях реакции одного оборота

Наблюдаемую схему превращения субстрата можно выразить уравнением'

+ БШз ° Ш*ОЫА3 БЫАр (3)

к-1

где индексы 5 и Р обозначают принадлежность дуплекса субстрату или продукту З'-процессинга соответственно. Используя систему, включающую уравнения материального баланса по субстрату и белку, закон действия масс, а также принцип стационарной концентрации по фермент-субстратному комплексу: £ЙШАР

Л

:кса,'[Ш*ОМА!!]

Л [1И\ = [дг]+ [¿V * ]«[/Л']

[йЫА}+ [т * \DNAr ]

где [DNA]<l и [/Л/]о соответствует общей концентрации ДНК и ИН, взятых в реакцию, можно показать, что:

. [РИА\ . _ кш

1п____г:-гSL—^ = k„^.xt ,лу „

{Що

К

Чтобы избежать возможной путаницы с кинетикой Михаэлиса-Ментен, для однооборотного режима катализа соответствующие значения констант обозначены как Кт' и кш'

Из уравнения (4) можно в явном виде выразить функцию, описывающую накопление продукта З'-процессинга во времени, дифференцирование которой по времени приводит к уравнению скорости накопления в виде: ,_d[DNAp]_[DNA]0xkcal\

V/ =---=-X Z7 Л/и . %

dt Кп,' 11 ешг' (б) *

[Щ0

В случае, когда кш'« 1, в уравнении (6) можно опустить экспонециальный множитель: *

d[DNAp] JDNA\*kJ

dt X»' | t (7),

[IN}0

и можно действительно наблюдать постоянную скорость накопления продукта, как это имеет место в фазе II.

Мы изучили зависимость эффективности процессинга (/.5-субстрата от концентрации интегразы в течение заданного промежутка времени (36 или 60 мин). По этим данным при помощи уравнения (4) рассчитывались значения эффективной константы процессинга (к,*,). Построение зависимости кы,, от концентрации ИН и ее последующая аппроксимация уравнением (5) позволила определить значения аналогов каталитической константы и константы Михаэлиса реакции З'-процессинга в <

однооборотном режиме (Рис. 6). Важно, что при такой постановке эксперимента каталитическая константа не включает шаг диссоциации комплекса ИН/ДНК и, следовательно, отражает только лишь те процессы, которые протекают между стадией связывания и актом гидролиза межнуклеотидной связи. Рассчитанные по экспериментальным данным значения К„' и Km' составили 30 ±10 нМ и 0.005 ±0.001 мин'1, соответственно. Определяемая в однооборотных условиях каталитическая константа демонстрирует чрезвычайно низкое значение Сравнительный анализ показывает, что ИН расщепляет фосфодиэфирную связь примерно в 1000 раз медленнее некоторых эндонуклеаз рестрикции [Etzkorn, С., etal. // Biochemistry, 2004].

Рис. 6. Концентрационная зависимость "эффективной константы З'-процессинга 3 иМ субстрата. Черные точки соответствуют процессингу в течение 36 минут, белые - в течение 1 часа. На вставке данные эксперимента представлены в двойных обратных

координатах- {Ик0ь3', 1/\ш\,).

Экспериментально определенные значения Кт 'и кем' подтверждают предположение о том, что стадия превращения фермент-субстратного комплекса интегразы {IN*DNAs) является намного более медленной, чем связывание Действительно нетрудно показать, что если в уравнении (3) принять ki < кса,', то начальная скорость образования продукта (при /—>0) должна линейно зависеть от концентрации фермента Мы обнаружили, что скорость накопления продукта зависела от концентрации ИН явно нелинейным образом. Аналогично самой скорости З'-процессинга зависимость ее эффективной константы к„ь, от концентрации белка имела нелинейный характер (Рис. 6). Следовательно, кi > kcalИ МОЖНО ГОВОрИТЬ О приближении значения константы Михаэлиса к константе диссоциации фермент-субстратного комплекса, что подтверждается нашими (43 нМ) данными Таким образом, мы установили, что катализ ИН осуществляется намного медленнее связывания ДНК 1.2.3. Многооборотный режим

Мы также проверили, может ли инге фаза функционировать в многооборотном режиме. Для этого определялась концентрация продукта процессинга, образующегося за 1 час инкубации 100 нМ фермента с US-дуплексом, взятым в различных концентрациях, в том числе и превышающих |Ж)о Оказалось, что в присутствии 100 нМ ИН увеличение концентрации ДНК вплоть до 50 нМ приводило к одновременному увеличению скорости отщепления динуклеотида. Дальнейшее увеличение концентрации ДНК до 300 нМ не оказывало видимого влияния (Рис 7) На основании этих данных было сделано заключение о неспособности фермента катализировать процессинг в многооборотном режиме

Обобщая весь набор результатов, можно с уверенностью говорить о внутренней однооборотной природе, присущей интегразе Определенное в эксперименте значение kcat говорит о том, что ИН процессирует половину субстрата за время около 220 минут. Такое поведение фермента вполне соответствует его предназначению: в клетке ИН должна осуществить интеграцию одной единственной ДНК-копии вирусного генома. По всей видимости, природная однооборотность присуща многочисленным представителям семейства DDE-полинуклеотидилтрансфераз В случае ретровирусных интеграз она

[U5]0, нМ

Рис. 7. Зависимость образования продукта процессинга от концентрации ДНК-субстрата 0 3300 нМ 21 -звенный ДО-субстрат инкубировали при 37°С в течение 1 ч со 100 нМ ИН в присутствии 7.5 мМ

диктуется практической необходимостью интеграции единственной ДНК, а для транспозаз низкая каталитическая активность является фактором, регулирующим частоту перемещения частей генома и, следовательно, его мутационную устойчивость.

Несомненно, низкая каталитическая активность ИН является важнейшим фактором, препятствующим осуществлению катализа З'-процессинга в многооборотном режиме. Однако необходимо также отметить, что ДНК-белковый комплекс, будучи сформирован, остается устойчивым в течении длительного промежутка времени (Рис 2 Б). Этот факт позволил нам предположить, что распаду спроцессированного комплекса препятствует сильное сродство ИН к продукту З'-процессинга, и это является вторым фактором, препятствующим многооборотному функционированию фермента. Для того, чтобы доказать это, было определено сродство ИН к ДНК-субстрату и продукту З'-процессинга при помощи метода поляризации флуоресценции. Использовались 3 нМ флуоресцентно меченые дуплексы И-ЦВ/иА и Е1-иВ-2/Ш, имитирующие субстрат и продукт его процессинга, соответственно. Мы не обнаружили никакой ощутимой разницы в связывании этих двух дуплексов.

Определенные по экспериментальным данным при помощи уравнения (2) значения констант диссоциации соответствовали 40-60 нМ интервалу, говоря об одинаковом сродстве фермента как к субстрату, так и к продукту процессинга. Таким образом, сильное сродство ИН к продукту З'-процессинга также препятствует диссоциации комплекса и реализации многооборотного режима функционирования.

В случае ИН прочное связывание белка с продуктом З'-процессинга является обязательным условием успешного проведения интеграции. Считается, что З'-процес-синг происходит в цитоплазме, в то время как для переноса цепи комплекс должен попасть в ядро. Таким образом, комплекс ИН с продуктом процессинга должен быть достаточно стабильным в течение этого перемещения.

Рис. 8. Изотерма связывания 21-звенного (/5-субстрата, меченого флуоресцеином FI-UB/UA (черные точки), и соответствующего ему продукта З'-процессинга FI-UB-2/UA (белые точки). ДНК-дуплексы (ЗнМ) инкубировались с ингегразой в течение 20 минут при 25°С в буферном растворе, содержащем 20 мМ Tris (рН 7 2), 20 мМ NaCI, 1 мМ DTT и 5 мМ MgCI2 Изменение анизотропии флуоресценции (Дг) определялось по формуле. Дг = i([IN]) - Tona, где r([lN]) и гшд представляют значения анизотропии флуоресценции комплекса и свободной ДНК.

1.2.4. Определение содержания активной формы ИН

Чтобы исключить или подтвердить возможность низкого содержания активной формы интегразы, влияющего на степень применимости формализма Михаэлиса-Ментен, мы провели анализ экспериментальных данных с использованием соотношения, предложенного А. Корниш-Боуденом:

d[DNAr] kca[IN]a{[DNA\-[DNAr}) dt Кт + [/ЛПо + ([Z)M]0 - [DNAp])

В соответствии с ним при как это имеет место в условиях однооборотного

режима, кинетическая константа процессинга кы,„ определяемая уравнением (4), будет зависеть от [Z/V]o гиперболическим образом, как предсказывает уравнение (5). В случае многооборотного режима [w]o «\DNA^¡, и зависимость к„ь, от концентрации интегразы при условии [zW/lJo < К„ будет носить линейный характер:

Ш Km

Как видно из графика (Рис. 6), в случае магний-компетентной ИН зависимость носила явно нелинейный характер, свидетельствуя в пользу малой доли каталитически неактивного белка. Таким образом, ингеграза, выделенная нами по методике [Leh, Я, et al П Biochemistry, 2000], была, в основном, каталитически активной.

2. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПРОЦЕССИРУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1

Определенная нами в однооборотных условиях константа кса,', равная 0.005 мин'1, не зависит от скорости связывания ДНК или скорости диссоциации фермент-субстратного комплекса в отличие от того, как это имеет место в многооборотном режиме. Таким образом, оказывается, что только сама стадия гидролиза или предшествующий ей процесс организации активного комплекса, происходящий уже после стадии связывания, являются причиной столь низкого ее значения. Логично предположить, что сама стадия расщепления фосфодиэфирной связи по 8ы2-механизму протекает достаточно быстро, как это происходит в комплексах различных нуклеаз Это наводит на мысль, что именно перестройка первичного комплекса ИН с ДНК-субстратом с последующим образованием активного интермедиата является лимитирующей стадией катализа. Принимая во внимание одинаковое сродство ИН к различным молекулам ДНК (f/5-субстрату и мишени) (Рис 3), можно предположить, что на первом этапе ИН одинаково связывает субстрат и мишень за счет неспецифических контактов с углеводо-фосфатным остовом. Контакты, которые являются специфическими по

отношению к ДНК-субстрату, образуются позже в процессе конформационной перестройки первичного комплекса, которая, в первую очередь, определяется тонкой структурой и конформационной подвижностью двойной спирали субстрата Процессингу подвергается 3'-конец одной из цепей, связывание же может происходить в различных участках ДНК, поэтому можно представить, что в процессе образования активного интермедиата ИН перемещается по цепи ДНК и в случае субстрата фиксируется на его конце за счет образования специфических контактов, невозможных в случае ДНК-мишени. Неспецифическая ДНК-связывающая активность может приводить к тому, что при достаточном количестве ИН любая ДНК окажется облепленной белком по всей своей длине

Для того чтобы более детально изучить процесс связывания ИН с ДНК-субстратом и мишенью, было решено использовать метод ковалентного соединения интегразы с ДНК. Известно, что в аминокислотной последовательности интегразы ВИЧ-1 содержится 26 лизиновых остатков. Поэтому для получения ковапентных комплексов ИН с ДНК мы решили использовать аналоги субстрата и мишени, содержащие свободную альдегидную группировку, способную образовать основание Шиффа с пространственно сближенными в составе ДНК-белкового комплекса остатками лизина Восстановление основания Шиффа цианоборгидридом натрия должно привести к фиксации продуктов связывания. По тому, какие остатки лизина способны образовывать ковапентную связь с содержащей альдегидную группу ДНК, можно определить, какие именно участки ИН участвуют в связывании субстрата или мишени.

2.1. Дизайн и синтез аналогов субстрата и мишени ИН, содержащих 2'-альдегидную группировку

Для изучения взаимодействия ИН с аналогами субстрата и мишени использовались 21-звенные ДНК-дуплексы, содержащие 2-оксоэтильную группировку при 2'0-атоме в составе уридина или цитидина и представленные на рисунке 9. Эта группировка генерируется при окислении 2,3-дигидроксипропильной группы в условиях, не затрагивающих никакие другие группировки в составе ДНК [Зацепин ТС. и др // Биоорг. Химия, 2001]. В названиях отдельных цепей (А или В) субстрата (Ü) или мишени (7) цифрой обозначена позиция модифицированного звена по отношению к правому концу дуплекса (в случае субстрата он подвергается процессингу) Буква А после номера указывает на тип модификации - 2'-альдегидную группу

Было необходимо поместить альдегидные группы вблизи расщепляемой при 3'-процессинге связи, поскольку именно этот регион образует наиболее значимые специфические ДНК-белковые контакты [Chiu, Т., et al И Curr Top Med Chem, 2004] Известно, что любые замены консервативного четвертого Cyd процессируемой цепи (UB)

приводят к ингибированию З'-процессинга, поэтому мы не стали модифицировать этот нуклеозид Следующим по ходу цепи пиримидином является седьмой тимидин, который мы заменили на альдегид-содержащий нуклеозид В непроцессируемой цепи (иА) мы ввели модифицированный нуклеозид напротив расщепляемой связи, т.е вместо третьего тимидина. Для того чтобы сравнить контакты субстратной ДНК с контактами, образуемыми ДНК-мишенью, были синтезированы дуплексы ТВ-7/ТА и ТВ/ТА-3, содержащие модификацию в тех же положениях олигонуклеотидных цепей (Рис. 9).

II

а о

я

2

§ I

иВ-7АЮА

иВЮА-ЗА

иВ-7АЮА-ЗА

ТВ-7А/ГА

ТВ/ТА-ЗА

5' -вТСТвСААА&ТСТСиАССАСТ-З' 3' -САСАССТТТТАОА(ЗАТСвТСА-5'

5' -вТСТОЗДиШТСТСТАОСДбТ-З' 3' -САСАССТТТТАйА11АТСойсА- 5'

5' -СТСТбвААААТСТСилССАвТ-З' 3'-САСАССТТТТАОАСАТСсйсА-5'

5' -вбЯНТСТАбСбССбСААТССТ-З' 3' -ССТТАвАТСйСССССТТАССА-Б'

5'-СКААТСТАвСТССвСАМвет-З' 3' -ССТТАвАТСвССвСвТТАССЛ-5'

5"

\

'V.

,0 о^н

и = з'

6'

\ г

°>°4

с = 3-

Рис. 9. Структура модифицированных аналогов субстрата н мишени ИН, использованных в эксперименте по кросс-лин кингу при помощи взаимодействия 2'-альдегидной труппы с аминогруппами лизиновых остатков

2.2. Влияние 2'-альдегидной модификации на специфичность взаимодействия ДНК с ИН Введение модифицированных нукпеозидов рядом с местом процессинга может приводить к потере способности субстрата ИН расщепляться, и, следовательно, такие дуплексы будут способны выступать лишь в качестве мишени Чтобы исключить подобную возможность, было изучено протекание З'-процессинга во всех модифицированных субстратах (Табл 1).

Табл. 1. Значения относительных стационарных скоростей реакции З'-процессинга модифицированных субстратов, содержащих 2,3-дигидроксипропильную или 2'-(0-оксоэтильную) группы в седьмом положении процессируемой или третьем положении непроцессируемой цепей £/5-дуплекса

субстрат ЦВ/иА иВ-7А/Ш иВ/Ш-ЗА иВ-7А/иА-ЗА

Уге1 (диольный предшественник) 1 0.78 ±0.09 019 ±0.02 014 ±0.03

К«, (2'-альдегидный дуплекс) 1 0.68 ±0.06 0.19 ±0.03 0.17 ±0.03

Оказалось, что модифицированные субстраты, равно как и их 2,3-дигидроксипропипьные предшественники, расщеплялись интегразой, однако, наблюдалось

общее падение эффективности процессинга модифицированных субстратов по сравнению с природной ¿/^-последовательностью Если в случае ЦВ-7АЮА оно было незначительным, то иВ/иЛ-ЗЛ субстрат процессировался почти в пять раз хуже немодифицированного дуплекса Одновременное присутствие двух модификаций в комплементарных цепях (иВ-7А/1/А-ЗА) еще больше снижало способность к процессингу Похожее соотношение стационарных скоростей процессинга наблюдалось и в случае 2,3-дигидроксипропильных предшественников субстратов ИН

Известно, что присутствие в 2'-положении электроноакцепторных заместителей, в частности О-алкильных группировок, приводит к изменению конформации углеводного фрагмента на СЗ'-эндо состояние, характерное для нуклеозидов рибо-ряда Это, в свою очередь, приводит к локальному нарушению структуры двойной спирали. Наблюдаемое снижение эффективности расщепления субстратов (Табл 1) могло быть связано с нарушением контактов белка с гетероциклическими основаниями, если они отклоняются от своего нормального положения в дуплексе в связи с нарушением его структуры Необходимость контактов с гетероциклическими основаниями мы проверили, изучив процессинг аналогов субстрата, содержащих в 7-ом положении процессируемой или 3-ем положении непроцессируемой цепей, ненуклеозидную вставку - остаток 1,3-пропандиола Отсутствие основания в аналогах субстрата иВ-7РЮА и 1/В/Ш-ЗР приводило к падению их термической устойчивости, но не снижало скорости процессинга (Табл 2).

Табл. 2. Значени» относительных стационарных скоростей реакции З'-процессинга и температуры плавления модифицированных субстратов, содержащих 2'-0-метильную (М) группу или ненуклеозидную вставку (Р) в седьмом положении процессируемой или третьем положении непроцессируемой цепей 1/5-цуплекса.

субстрат ив/ил иВ-7Р/Ш иВ-7МУШ ив/ш-зр ив/ш-зм

Т^СС) 66.5 ±0.5 60.2 ±0 5 64.5 ±0 5 64.0 ±0 5 65.3 ±0.5

У,<1 1 1.10 ±0 09 0 91 ±0.18 131 ±0 08 1 80 ±0 35

Более того, субстрат, содержащий ненуклеозидную вставку в 3-ем положении непроцессируемой цепи, был способен участвовать в реакции З'-процессинга даже с большей скоростью и эффективностью, чем природная С/5-последовательность. Очевидно, дестабилизация третьей нуклеотидной пары, вызванная отсутствием гетероциклического основания в Ш цепи, стимулирует процессинг за счет облегчения атаки молекулы воды на расщепляемую фосфодиэфирную связь.

Таким образом, наблюдаемое ухудшение процессинга в случае модифицированных аналогов субстрата, содержащих 2'-альдегидную группу, не связано с нарушением контактов ИН с гетероциклическими основаниями В качестве альтернативного объяснения мы предположили, что нарушаются контакты с углеводо-фосфатным остовом. Для проверки

этого предположения было изучено протекание процессинга ДНК-дуплексов, содержащих в 7-ом положении процессируемой или 3-ем положении непроцессируемой цепи 2'-0-метилуридин, иВ-7МЮА и 1/В/Ш-ЗМ, соответственно Эта модификация, подобно 2'-альдегидной группе, вносит искажения в конформацию углеводного фрагмента, меняя ее на СЗ'-эндо состояние Из таблицы 2 видно, что такая модификация также снижает термическую устойчивость ДНК, хотя и в меньшей степени, чем ненуклеозидная вставка. Наличие 2'-0-метилуридина в процессируемой цепи (иВ-7М/1/А) не оказывало серьезного влияния на скорость процессинга По аналогии с иВ/1!А-ЗР субстратом дуплекс, который содержал 2'-0-метилуридин в 3-ем положении Ш-цепи, процессировался лучше природной последовательности (Табл. 2).

Эти результаты показали, что снижение скорости процессинга дуплексов, содержащих альдегидную или диольную группу в 2'-положении углеводного фрагмента в дуплексах 1}В/иА-ЗА и иВ-7А/1!А-ЗА, непосредственно не связано с нарушением локальной структуры ДНК. Можно предположить, что экспонируемый в малую бороздку кислородный атом альдегидной или гидроксильной (в случае предшественника) групп способен образовывать дополнительную водородную связь с ИН, выступая в качестве акцептора протона Такая связь должна способствовать пространственной фиксации нуклеотида и, следовательно, препятствовать дестабилизации двойной спирали вблизи точки процессинга. Как следует из экспериментальных данных по ковалентному присоединению (Рис. 10), указанный нуклеотид сближен, по крайней мере, с одним из лизиновых остатков, который способен выступать в роли потенциального донора протона Возможно также, что объемная альдегидная или цис-диольная группа затрудняет правильную фиксацию ДНК на поверхности ИН, необходимую для эффективного процессинга. Такие стерические препятствия могут объяснить и снижение скорости проиессига дуплекса 1}В-7АЮА (Табл. 1). 2.3. Оптимизация условий синтеза конъюгатов ИН с ДНК

В первую очередь мы проверили, способны ли выбранные модифицированные аналоги субстрата (11В-7АЮА, ЦВ/ЦА-ЗА) и мишени (ТВ-7А/ТА, ТВ/ТА-ЗА) образовывать конъюгаты с ИН. Для этого ДНК-дуплексы (5 нМ) инкубировали с интегразой (100 нМ) при 37°С в течение 1 часа, после чего производили восстановление образовавшегося основания Шиффа цианоборо гидридом натрия в течение 30 минут. Продукты ко валентного присоединения анализировали при помощи электрофореза в геле по методу Лэммли.

Оказалось, что все указанные дуплексы были способны образовывать конъюгаты с ИН (Рис. 10). Наблюдаемая подвижность всех конъюгатов оказалась несколько меньшей, чем у белкового маркера массой 47 кДа, что подтверждало рассчитанное теоретическое значение молекулярной массы комплекса (32 кДа + 2x6 5 кДа = 45 кДа) Это являлось важным

подтверждением того, что в результате последовательного выполнения всех операций формируется именно ковалентный ДНК-белковый комплекс.

Мы также изучили влияние времени инкубации ДНК с ИН на эффективность образования комплексов на примере обоих модифицированных аналогов субстрата Для этого варьировали длительность стадии формирования комплекса от 0 до 120 минут Восстановление проводили в течение короткого промежутка времени (3 мин)

Полученные результаты хорошо согласовались с экспериментом по изучению кинетики связывания методом поляризации флуоресценции (Рис. 2). За 20 минут кривые комплексообразования практически выходят на плато, что говорит о зависимости формирования ковалентного комплекса от степени связывания ДНК

Также с определенностью можно говорить, что в наших условиях скорость восстановления основания Шиффа примерно в 4-5 раз превосходит скорость связывания. Полученные результаты демонстрировали явную зависимость выхода конъюгатов от места расположения модификации в структуре дуплексов (Рис. 10) Зависимость эффективности ковалентного соединения ИН с ДНК от местоположения модифицированного нуклеотида связана с различным расстоянием между реагирующими аминной и альдегидной группами или их различной взаимной ориентацией в пространстве

2.4. Изучение связывания ИН с дуплексами, содержащими 2'-альдегидную группу

Как мы предположили выше, после образования первичного комплекса ИН с ДНК происходит его структурная перестройка, предшествующая расщеплению межнуклеотидной связи Мы решили попытаться идентифицировать различия между этим первичным комплексом и каталитически компетентным интермедиатом Для этого дуплекс ИВ- 7А/и А инкубировали с ИН разное время, и после восстановления основания Шиффа проводили трипсинолиз Инкубацию с ИН осуществляли в течение 15 минут - когда уже большая часть ДНК оказывается связанной, а продуктами процессинга (а, следовательно, и специфическими комплексами) еще можно пренебречь, и 120 минут - когда эффективность

ИН - ♦- + -♦- + «Я»

дупммс ЦВ-7АЛМ ивлм-зл ТВ- 7А/Т А ТВ/ТА- ЗА

¡грепттхгп 50.40 ,5.90 20-30 18-23 мраэманмя яипюгата, %

Рис. 10. Изучение способности модифицированных аналогов субстрата (1/В-7А1/А, иВ/иА-ЗА) и мишени (ТВ-7АТА, ТВ/ТА-ЗА) образовывать ко валентно связанные комплексы с ИН.

процессинга составляет в среднем 45%, и значит, по крайней мере, 45% первичных комплексов уже подверглось структурной реорганизации. В том случае, если в зависимости от времени инкубации субстрата с ИН набор продуктов ковалентного присоединения будет изменяться, можно говорить об осуществляющейся перестройке.

После обработки трипсином и элекгрофоретического анализа продуктов оказалось, что независимо от времени предварительной инкубации образовывались идентичные наборы пептидов Из этого следовало, что либо реакция альдегидной группы с лизиновыми

остатками происходит в составе первичного комплекса, причем происходит очень быстро, еще до того как осуществляется его перестройка, либо наша гипотеза неверна и никакой перестройки нет вообще. Однако в этом случае субстрат должен сразу образовывать с ИН каталитически активный комплекс, в котором может происходить З'-процессинг, мишень же каталитически активный комплекс не образует, т.е. комплексы должны быть разными.

Мы проверили, с какими участками ИН происходит связывание субстрата и мишени, для чего был осуществлен синтез конъюгатов с дуплексами 1!В-7А/иА, иВ/Ш-ЗА, ТВ-7А/ТА и ТВ/ГА-ЗА.

Оказалось, что для каждой пары субстрат/мишень, содержащей альдегидную группу в одинаковом месте (к при-

21за днк В-ТА А-ЗА

ДНК

Ряс. 11. Радиоавтограф денатурирующего ПААГ, полученного при анализе продуктов триптического гкдролюата конъюгатов ИН с субстратами и мишенями, содержащими модификацию в третьем положении ^-цепей или седьмом положении В-цепей. Слева в качестве конгролей показаны полосы соответствующие изолированным олигоиуклеотидам Соответствующие цепи субстрата и мишени (например, В-иепи ТВ и Ш) имели одинаковую подвижность в геле

меру, 11В-7А/иА и ТВ-7А/ТА), наблюдались очень похожие наборы продуктов трипсинолиза (Рис. 11).

На основании полученного результата можно сделать вывод о том, что с субстратом и мишенью контактируют одинаковые аминокислоты, те. связывание происходит в одинаковых сайтах независимо от типа ДНК Это подтверждает наше предположение об образовании неспецифического первичного комплекса при связывании и субстрата, и мишени с ИН.

3. СУБЪЕДИНИЧНОЕ СТРОЕНИЕ ПРОЦЕССИРУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА

При изучении влияния концентрации субстрата на эффективность З'-процессинга наблюдался выход на плато при концентрации ДНК выше 50 нМ, при этом концентрация ИН была 100 нМ (Рис 7). Из этого можно заключить, что для осуществления З'-процессинга с ДНК с необходимостью должна связаться димерная форма белка. В пользу такой интерпретации можно привести работу [Deprez, Е„ et al. И Mol. Pharmacol., 2004], рассматривающую кооперативную модель взаимодействия ИН с ДНК, согласно которой экспериментально определенное значение коэффициента Хилла лишь немного отличалось от двух (~ 1.8).

* UB-7A

«Páá ^

Х- еТО-ТОМАА<АТС-ТС шюсдет. г Г - САС-АСС-ТТТ -TAO-AOA-TCQ-UCA ■ 5*

t.

+ интеграэа

ири

т- sts-tomaa-atc-tcú-mc-aot - г э* - cac-acc-ttt -taiwwja-tce-uca - в'

+ немеченый

дуплекс

ОТО-ТОО-ААЛ-ЛТС-ТСи-АОСлАОТ ■ Г Г - САС-АСС-ТТТ -ТАв-АвА-ТСО-ТСА-в'

6' - аТв-ТвОАМ-ЛТС-ТСТ-ЛОС-ЛОТ-у Г - САС-АСС-ТТТ -TAIMOA-TCO-UCA - 5"

Й S S S' é < ¿ <

h « г» « г»

тт

Рис. 12. Взаимодействие дуплекса иВ-7А/1/А-ЗА с ИН (А) Схематическое кюбражение эксперимента по ковалентному присоединению ИН к ДНК-субстрату, содержащему по одному модифицированному нуклеотиду в каждой из комплементарных цепей (Б) Радиоавтограф геля, полученный при электрофоретическом анализе в присутствии додецилсульфата натрия продуктов ковалентного присоединения радиоактивно меченых аналогов субстрата, в т ч с последующим добавлением "холодного" дуплекса ив/1/А

Мы решили использовать реакцию образования основания Шиффа для ответа на вопрос о количестве субъединиц ИН, способных к взаимодействию с процессируемым концом вирусной ДНК. Для этого мы сформировали ДНК-дуплекс, содержащий в каждой из комплементарных цепей по одному модифицированному нуклеотиду (1/В-7А/Ш-ЗА) и изучили его взаимодействие с интегразой Как видно из рисунка 12, такой субстрат способен ковалентно присоединяться к интегразе с образованием двух основных продуктов. Подвижность первого из них соответствовала подвижности мономерной формы белка, образующей комплекс с ДНК Подвижность второго продукта соответствовала двум мономерным единицам ИН, присоединенным к различным цепям ДНК-дуплекса (~ 80 кДа).

Для того чтобы подтвердить, что присоединение обеих субъединиц происходит по разным цепям дуплекса, к конъюгату ИН с дуплексом 1/В-7А/иА-ЗА, содержащим радиоактивную метку в процессируемой цепи (Ш-7А), мы добавили избыток дуплекса иВ/иА в немеченом состоянии и нагрели смесь до 95°С При этом произошла денатурация ДНК, а при последующем охлаждении в присутствии избытка ДНК образовались дуплексы, в которых ИН была присоединена только к одной цепи (Рис. 12 А). Как видно из рисунка (Рис 12 Б), это приводило к исчезновению верхней полосы и увеличению относительной интенсивности полосы про-

ДНК * дииер ИН — ДНК + ионоиер ИН —.

ДНК-дуплекс —. Время, мии

О 5 10 15 30 60

дукта мономерного присоединения. Таким образом, это подтвердило наше предположение о присоединении двух различных субъединиц ИН В качестве контрольного эксперимента в дуплексе иВ-7А/1/А-ЗА была также помечена только непроцессируемая цепь (С/А). Как видно из радиоавтографа геля (Рис. 12 Б), такой субстрат также образовывал высокоидущий продукт присоединения двух субъединиц ИН, который разрушался при добавлении избытка немеченого дуплекса ИВ/иА.

Мы также провели изучение кинетики формирования димерного комплекса ИН с ДНК-субстратом, содержащим модифицированные нуклеотиды в обеих цепях Для этого 10 нМ дуплекс иВ-7А/{]А-ЗА инкубировали со 100 нМ ИН в течение различного времени (от 0 до 60 минут), после чего следовало трехминутное восстановление 25 мМ цианоборогидридом натрия Как видно из радиоавтографа геля, полученного при анализе продуктов восстановления (Рис. 13), конъюгат, соответствующий присоединению двух субъединиц ИН, образуется одновременно с продуктом присоединения единственной молекулы ИН и с такой же скоростью. Это говорит о том, что, по-видимому, ДНК связывается непосредственно с димером ИН, либо формирование димера ИН на молекуле ДНК происходит очень быстро.

Рис. 13. Изучение кинетики формирования димерного комплекса

ИН с дуплексом UB-7AVA-3A Радиоактивно меченый по UB-7A-цепи дуплекс (10 нМ) инкубировался при 37°С в течение указанного времени со 100 нМ ИН, после чего в реакционную смесь добавляли 25 мМ цианоборогкорид натрия и инкубировали 3 минуты при 37°С Анализ реакционной смеси осуществляли при помощи электрофореза в ПААГ по методу Лэммли

выводы

1 Впервые изучена ферментативная активность препарата Mg21 -зависимой ИН и получены количественные характеристики' эффективные константы Михаэлиса и скорости реакции Установлено, что ИН функционирует в принципиально однооборотном режиме, что хорошо согласуется с ее биологической функцией.

2. Показано, что М^-зависимая ИН облазает одинаковым сродством к различным последовательностям ДНК-дуплексов, оценено время формирования комплексов ДНК с ИН, их временная устойчивость и рассчитаны константы диссоциации для комплексов ИН с ДНК-субстратом и мишенью.

3. При помощи метода ковалентного соединения ДНК с ИН показано, что связывание субстрата и мишени происходит в одинаковых участках ИН. На основании этих результатов и данных по каталитической активности ИН выдвинута гипотеза о формировании первичного неспецифического комплекса ИН с ДНК, который в случае ДНК-субсграта подвергается структурной реорганизации, приводящей к реакции З'-процессинга.

4. С использованием аналога субстрата, содержащего альдегидные группы в обеих цепях ДНК, продемонстрировано, что для осуществления З'-процессинга с ДНК с необходимостью должна связаться димерная форма белка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смолов М.А, Агапкина Ю.Ю., Зубин Е.М. Новый подход к синтезу ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями.// Доклады академии наук, 2003, Т. 390, №6, С. 783-786

2. Agapkina J., Smolov М., Zubin Е., Mouscadet J.-F., Gottikh M. HIV-1 integrase can process a З'-end crosshnked substrato. Implications of DNA end-&aying requirement during the 3'-processing reaction.// Eur J.Biochem., 2003, V. 271, P. 205-211.

3. Агапкина Ю.Ю., Приказчикова T.A., Смолов M.A., Готтих МБ. Структура и функции интегразы ВИЧ-1.// Усп. биол. химии, 2005, Т. 45, С. 87-122.

4. Smolov М., Gottikh М., Tashlitskii V., Korolev S., Demidyuk I., Brochón J.-C., Mouscadet J.-F., Deprez E. Kinetic study of the HTV-1 DNA З'-end processing. Single-turnover property of integrase.// FEBS J., 2006, V. 273, Р. 1137-1151.

5. Agapkina J., Smolov M, Barbe S., Zubin E , Zatsepin Т., Deprez E., Le Bret M., Mouscadet J.-F., Gottikh M. Probing of HIV-1 integrase-DNA interactions using novel analogs of viral DNA // J. Biol. Chem., 2006, V. 281, P.8831-8841.

)> M

(

/

t*

12- 7 0 6 9

Подписано в печать 24 марта 2006 г. Заказ 637. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.

1. СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. СТРУКТУРНЫЕ МОТИВЫ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ.

3.1. ВВЕДЕНИЕ.

3.2. ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ.

3.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК ПРИ УЧАСТИИ а-СПИРАЛЕЙ.

3.3.1. Спираль-поворот-спираль.

3.3.2. Цинковые пальцы.

3.3.3. Лейциновая молния.

3.3.4. Спираль-петля-спираль.

3.3.5. Взаимодействие а-спирали с малой бороздкой ДНК.

3.4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК ПРИ УЧАСТИИ Р-СТРУКТУР.

3.4.1. Лента-спираль-спираль.

3.4.2. Трехтяжевой Р-лист.

3.4.3. ТВР-подобный мотив.

3.4.4. Р-петли 1НР.

3.5. СТРУКТУРНЫЕ МОТИВЫ ДОМЕНОВ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

4. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ.

ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 С ДНК.

4.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СВОЙСТВ

МАГНИЙ-ЗАВИСИМОЙ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

4.1.1. Характеристика связывания ДНК интегразой ВИЧ-1.

4.1.2. Характеристика каталитических свойств интегразы ВИЧ-1.

4.1.3. Изучение кинетики накопления продукта процессинга.

4.1.4. Кинетика 3'-процессинга в условиях одного оборота.

4.1.5. Определение содержания активной формы интегразы ВИЧ-1.

4.1.6. Многооборотпый режим.

4.1.7. Факторы, способствующие однооборотному режиму функционирования интегразы ВИЧ-1.

4.1.8. Механизм взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК-субстратом.

4.2. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ

ПРОЦЕССИРУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

4.2.1. Дизайн и синтез аналогов субстрата и мишени интегразы ВИЧ-1, содержащих 2'-альдегидную группировку.

4.2.2. Влияние 2'-альдегидной модификации на специфичность взаимодействия ДНК с интегразой ВИЧ-1.

4.2.3. Оптимизация условий синтеза конъюгатов.

4.2.4. Зависимость выхода коиъюгата от места расположения. альдегидной группы.

4.2.5. Оптимизация условий обработки трипсином.

ДНК-белковых конъюгатов.

4.2.6. Изучение связывания интегразы ВИЧ-1 с ДНК дуплексами,. содержащими 2'-альдегидную группу.

4.3. ИЗУЧЕНИЕ СУБЪЕДИНИЧНОГО СТРОЕНИЯ ПРОЦЕССИРУЮЩЕГО

КОМПЛЕКСА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

5.1. РЕАКТИВЫ.

5.2. ФЕРМЕНТЫ.

5.3. ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДЫ.

5.3.1. Модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды.

5.3.2. Состав синтезированных олигонуклеотидов.

5.3.3. Анализ синтезированных олигонуклеотидов.

5.4. БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ.

5.5. МЕТОДЫ.

5.5.1. Электрофорез в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях.

5.5.2. ДСН-полиакриламидный гель.

5.5.3. УФ-спектры.

5.5.4. Температурная зависимость УФ-поглощения дуплексов.

5.5.5. 5'-[у-32Р-АТФ]-фосфорилирование.

5.5.6. Выделение [32Р]-фосфорилированных дуплексов.

5.5.7. Изучение связывания интегразы ВИЧ-1 с ДНК-дуплексами.

5.5.7.1. Гель-электрофорез в недепатурирующих условиях.

5.5.7.2. Метод поляризации флуоресценции.

5.5.8. Изучение влияния модификаций и5-субстрата на специфическую активность интегразы ВИЧ-1.

5.5.9. Ацилирование 2'-аминогруппы в дуплексе UB-7N/UA.

5.5.10. Получение конъюгатов интегразы ВИЧ-1 с ДНК.

6. ВЫВОДЫ.

3.2. ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ.14

3.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК ПРИ УЧАСТИИ а-СПИРАЛЕЙ.163.3.1. Спираль-поворот-спираль.173.3.2. Цинковые пальцы.233.3.3. Лейциновая молния.293.3.4. Спираль-петля-спираль.343.3.5. Взаимодействие а-спирали с малой бороздкой ДНК.383.4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК ПРИ УЧАСТИИ Р-СТРУКТУР.393.4.1. Лента-спираль-спираль.413.4.2. Трехтяжевой Р-лист.453.4.3. ТВР-подобный мотив.483.4.4. Р-петли 1НР.523.5. СТРУКТУРНЫЕ МОТИВЫ ДОМЕНОВ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.564. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ.

ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 С ДНК.614.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СВОЙСТВ.

МАГНИЙ-ЗАВИСИМОЙ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.644.1.1. Характеристика связывания ДНК интегразой ВИЧ-1.664.1.2. Характеристика каталитических свойств интегразы ВИЧ-1.704.1.3. Изучение кинетики накопления продукта процессинга.714.1.4. Кинетика 3'-процессинга в условиях одного оборота.734.1.5. Определение содержания активной формы интегразы ВИЧ-1.784.1.6. Многооборотпый режим.794.1.7. Факторы, способствующие однооборотному режиму.функционирования интегразы ВИЧ-1.814.1.8. Механизм взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК-субстратом.844.2. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ.

ПРОЦЕССИРУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.874.2.1. Дизайн и синтез аналогов субстрата и мишени.интегразы ВИЧ-1, содержащих 2'-альдегидную группировку.894.2.2. Влияние 2'-альдегидной модификации на специфичность.взаимодействия ДНК с интегразой ВИЧ-1.914.2.3. Оптимизация условий синтеза конъюгатов.974.2.4. Зависимость выхода коиъюгата от места расположения.альдегидной группы.1014.2.5. Оптимизация условий обработки трипсином.

ДНК-белковых конъюгатов.1024.2.6. Изучение связывания интегразы ВИЧ-1 с ДНК дуплексами,.содержащими 2'-альдегидную группу.1034.3. ИЗУЧЕНИЕ СУБЪЕДИНИЧНОГО СТРОЕНИЯ ПРОЦЕССИРУЮЩЕГОКОМПЛЕКСА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.1065. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.1105.1. РЕАКТИВЫ.1105.2. ФЕРМЕНТЫ.1105.3. ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДЫ.1105.3.1. Модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды.1115.3.2. Состав синтезированных олигонуклеотидов.1125.3.3. Анализ синтезированных олигонуклеотидов.1125.4. БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ.1125.5. МЕТОДЫ.1135.5.1. Электрофорез в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях. 1135.5.2. ДСН-полиакриламидный гель.1135.5.3. УФ-спектры.1145.5.4. Температурная зависимость УФ-поглощения дуплексов.1145.5.5. 5'-[у-32Р-АТФ]-фосфорилирование.1145.5.6. Выделение [32Р]-фосфорилированных дуплексов.1155.5.7. Изучение связывания интегразы ВИЧ-1 с ДНК-дуплексами.1155.5.7.1. Гель-электрофорез в недепатурирующих условиях.1155.5.7.2. Метод поляризации флуоресценции.1165.5.8. Изучение влияния модификаций и5-субстрата.на специфическую активность интегразы ВИЧ-1.1165.5.9. Ацилирование 2'-аминогруппы в дуплексе UB-7N/UA.1175.5.10. Получение конъюгатов интегразы ВИЧ-1 с ДНК.1186. ВЫВОДЫ.1207. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.122

6. выводы

1. Впервые изучена ферментативная активность препарата М§2+-зависимой ИН и получены количественные характеристики: эффективные константы Михаэлиса и скорости реакции. Установлено, что ИН функционирует в принципиально однооборотном режиме, что хорошо согласуется с ее биологической функцией.

2. Показано, что 1У^2+-зависимая ИН обладает одинаковым сродством к различным последовательностям ДНК-дуплексов, оценено время формирования комплексов ДНК с ИН, их временная устойчивость и рассчитаны константы диссоциации для комплексов ИН с ДНК-субстратом и мишенью.

3. При помощи метода ковалеитного соединения ДНК с ИН показано, что связывание субстрата и мишени происходит в одинаковых участках ИН. На основании этих результатов и данных по каталитической активности ИН выдвинута гипотеза о формировании первичного неспецифического комплекса ИН с ДНК, который в случае ДНК-субстрата подвергается структурной реорганизации, приводящей к реакции З'-процессинга.

4. С использованием аналога субстрата, содержащего альдегидные группы в обеих цепях ДНК, продемонстрировано, что для осуществления З'-процессинга с ДНК с необходимостью должна связаться димерная форма белка.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор диссертационной работы выражает благодарность всем сотрудникам лаборатории химии нуклеиновых кислот МГУ им. М.В. Ломоносова за помощь, оказанную при ее выполнении, и ценные указания при обсуждении ее итогов. Отдельно хочется поблагодарить сотрудников Ю.Ю. Агапкину, Т.А. Приказчикову, С.П. Королева, В.Н. Ташлицкого, Е.М. Зубина и Т.С. Зацепина, без чьей весомой поддержки было бы затруднительно осуществить многие начинания.

Необходимо также выразить особую благодарность моему научному руководителю Марине Борисовне Готтих и сотруднику "Ecole Normale Supérieure de Cachan" (Франция) Эрику Депре.

1. Autran B., Carcelain G., Li T.S., Blanc C., Mathez D., Tubiana R., Katlama C., Debre. P., Leibowitch J. (1997) Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science, 277, 112-116.

2. Richman D.D. (2001) HIV chemotherapy, Nature, 410, 995-1001.

3. Cara A., Guarnaccia F., Reitz M.S. Jr., Gallo R.C., Lori F. (1995) Self-limiting, cell type-dependent replication of an integrase-defective human immunodeficiency virus type 1 in human primary macrophages but not T lymphocytes. Virology, 208, 242-248.

4. Pedersen F.S., Duch M. (2001) Retroviral Replication. Encyclopedia of life sciences. Nature Publishing Group / www.els.net.

5. Luscombe N.M., Austin S.E., Berman H.M., Thornton J.M. (2001) An overview of the structures of protein-DNA complexes. Genome Biol., 1, 1-37.

6. Luscombe N.M., Laskowski R.A., Thornton J.M. (2001) Aminoacid-base interactions: a three-dimensional analysis of protein-DNA interactions at an atomic level. Nucleic Acids Res., 29, 2860-2874.

7. Luscombe N.M., Thornton J.M. (2002) Protein-DNA interactions: amino acid conservationand the effects of mutations on binding specificity. J. Mol. Biol., 320, 991-1009.

8. Church G.M., Sussman J.L., Kim S.H. (1977) Secondary structural complementarity between DNA and proteins. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 1458-1462.

9. Smith T.L. (1998) Secret code. Nat. Struct. Biol., 5, 100.

10. Sarai A., Kono H. (2005) Protein-DNA recognition pattern and predictions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 34, 379-398.

11. Koudelka G.B., Carlson P. (1992) DNA twisting and the effects of non-contacted bases on affinity of 434 operator for 434 repressor. Nature, 355, 89-91.

12. Lamoureux J.S., Maynes J.T., Glover J.N. (2004) Recognition of 5'-YpG-3' sequences by coupled stacking^ydrogen bonding interactions with amino acid residues. J. Mol. Biol., 335, 399-408.

13. Seeman N.D., Rosenberg J.M., Rich A. (1976) Sequence-specific recognition of double helical nucleic acids by proteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 73, 804-808.

14. Mandel-Gutfreund Y., Schueler O., Margalit H. (1995) Comprehensive analysis of hydrogen bonds in regulatory protein DNA-complexes: in search of common principles. J. Mol. Biol., 253, 370-382.

15. Reddy C.K., Das A., Jayaram B. (2001) Do water molecules mediate protein-DNA recognition? J. Mol. Biol., 314, 619-632.

16. Ponting C.P., Russell R.R. (2002) The natural history of protein domains. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 31, 45-71.

17. Artymiuk P.J., Poirette A.R., Rice D.W., Willet P. (1997) A polymerase palm domain in adenylyl cyclase. Nature, 388, 33-34.

18. Финкельштейн А.В., Птицыы О.Б. (2002) Физика белка. М., Книжный дом "Университет", 187.

19. Garvie C.W., Wolberger С. (2001) Recognition of specific DNA sequences. Mol. Cell, 8, 937-946.

20. Pabo C.O., Nekludova L. (2000) Geometric analysis and comparison of protein-DNA interfaces: why is there no simple code for recognition? J. Mol. Biol., 301, 597-624.

21. Schumacher M.A., Choi K.Y., Zalkin H., Brennan R.G. (1994) Crystal structure of LacI member, PurR, bound to DNA: minor groove binding by a helices. Science, 266, 763-770.

22. Suzuki M., Yagi N. (1996) An in-the-groove view of DNA structures in complexes with proteins, J. Mol. Biol., 255, 677-687.

23. Suzuki M., Brenner S.E. (1995) Classification of multi-helical DNA-binding domains and application to predict the DBD structures of a factor, LysR, OmpR/PhoB, CENP-B, Rap 1, and XylS/Ada/AraC, FEBS Lett., 372, 215-221.

24. Nelson H.C.M. (1995) Structure and function of DNA-binding proteins. Curr. Opin. Gen. Dev., 5, 180-189.

25. DeLano W.L. The PyMOL molecular graphics system (2002) on World Wide Web http://www.pymol.org

26. Murzin A.G., Brenner S.E., Hubbard T., Chothia C. (1995) SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures. J. Mol. Biol., 247, 536-540.

27. Branden C., Tooze J. (1999) Introduction to protein structure. NY, London, Garland Publ. Inc., second ed., 129.

28. Ramos J.L., Martinez-Bueno M., Molina-Henares A.J., Teran W., Watanabe K., Zhang X., Gallegos M.T., Brennan R., Tobes R. (2005) The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 69, 326-356.

29. Albright R.A., Matthews B.W. (1998) Crystal structure of lambda-CRO bound to a consensus operator at 3.0 A resolution. J. Mol. Biol., 280, 137-151.

30. Kissinger C.R., Liu B., Martin-Blanco E„ Romberg T.B., Pabo C.O., (1990) Crystal structure of an engrailed homeodomain/DNA complex at 2.8 angstroms resolution: a framework for understanding homeodomain/DNA interactions, Cell, 63, 579-590.

31. Orth P., Schnappinger D., Hillen W., Saenger W., Hinrichs W. (2000) Structural basis of gene regulation by the tetracycline inducible Tet repressor-operator system. Nat. Struct. Biol. 7,215-219.

32. Parkinson G., Wilson C., Gunasekera A., Ebright Y.W., Ebright R.E., Berman H.M. (1996) Structure of the CAP-DNA complex at 2.5 angstroms resolution: a complete picture of the protein-DNA interface. J. Mol. Biol., 260, 395-408.

33. Kodandapani R., Pio F., Ni C.Z., Piccialli G., Klemsz M., McKercher S., Maki R.A., Ely K.R. (1996) A new pattern for helix-turn-helix recognition revealed by the PU.l ETS-domain-DNA complex., Nature, 380, 456-460.

34. Affolter M., Percival-Smith A., Muller M., Leupin W., Gehring W.J. (1990) DNA binding properties of the purified Antennapedia homeodomain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4093-4097.

35. Pabo C.O., Sauer R.T. (1992) Transcription factors: structural families and principles of DNA recognition. Annu. Rew. Biochem., 61, 1053-1095.

36. Miller J., McLachlan A.D., Klug A. (1985) Repetitive zinc-binding domains in the protein transcription factor III A from Xenopus oocytes. EMBO J., 4, 1609-1614.

37. Pavletich N.P., Pabo C.O. (1991) Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A. Science, 252, 809-817.

38. Wolfe S.A., Nekludova L., Pabo C.O. (2000) DNA recognition by Cys2His2 zinc finger proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 3, 183-212.

39. Corbi N., Libri V., Fanciulli M., Passananti C. (1998) Binding properties of the artificial zinc fingers coding gene Sintl. Biochem. Biophys. Res. Commun., 253, 686-692.

40. Corbi N., Perez M., Maione R., Passananti C. (1997) Synthesis of a new zinc finger peptide; comparison of its "code" deduced and "CASTing" derived binding sites. FEBS Lett., 417, 71-74.

41. Laity J.H., Lee B.M., Wright P.E. (2001) Zinc finger proteins: new insights into structural and functional diversity. Curr. Opin. St. Biol., 11, 39-46.

42. Laity J.H., Dyson H.J., Wright P.E. (2000) DNA-induced alpha-helix capping in conserved linker sequences is a determinant of binding affinity in Cys(2)-His(2) zinc fingers. J. Mol. Biol., 295, 719-727.

43. Laity J.H., Dyson H.J., Wright P.E. (2000) Molecular basis for modulation of biological function by alternate splicing of the Wilms tumor suppressor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 11932-11935.

44. Bowers P.M., Schaufler L.E., Klevit R.E. (1999) A folding transition and novel zinc finger accessory domain in the transcription factor ADR1. Nat. Struct. Biol., 6, 478-485.

45. Omichinski J.G., Pedone P.V., Felsenfeld G., Gronenborn A.M., Clore G.M. (1997) The solution structure of a specific GAGA factor-DNA complex reveals a modular binding mode. Nat. Struct. Biol., 4, 122-132.

46. Pavletich N.P., Pabo C.O. (1993) Crystal structure of a five-finger GLI-DNA complex: new perspectives on zinc fingers. Science, 261, 1701-1707.

47. Elrod-Erickson M., Benson T.E., Pabo C.O. (1998) High-resolution structures of variant Zif268-DNA complexes: implications for understanding zinc fmger-DNA recognition. Structure, 6, 451-464.

48. Albagli O., Dhordain P., Devveindt C., Lecocq G„ Leprince D. (1995) The BTB/POZ domain: a new protein-protein interaction motif common to DNA- and actin-binding proteins. Cell. Growth Differ., 6, 1193-1198.

49. Urrutia R. (2003) KRAB-containing zinc-finger repressor proteins. Genome Biol., 4, article 231.

50. Bardwell V.J., Treisman R. (1994) The POZ domain: a conserved protein-protein interaction motif. Genes Dev., 8, 1664-1677.

51. O'Shea E.K., Klemm J.D., Kim P.S., Alber T. (1991) X-ray structure of the GCN4 leucine . zipper, a two-stranded, parallel coiled coil. Science, 254, 539-544.

52. Landschulz W. H., Johnson P. F., McKnight S. L. (1988) The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science, 240, 1759-1764.

53. Harbury P.B., Zhang T., Kim P.S., Alber T. (1993) A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science, 262, 1401-1407.

54. Lumb K.J., Kim P.S. (1995) A buried polar interaction imparts structural uniqueness in a designed heterodimeric coiled coil. Biochemistry, 34, 8642-8648.

55. Weiss M.A., Ellenberger T., Wobbe C.R., Lee J.P., Harrison S.C., Struhl K. (1990) Folding transition in the DNA-binding domain of GCN4 on specific binding to DNA. Nature, 347, 575-578.

56. Ellenberger T.E., Brandl C.J., Struhl K., Harrison S.C. (1992) The GCN4 basic region leucine zipper binds DNA as a dimer of uninterrupted alpha helices: crystal structure of the protein-DNA complex. Cell, 71, 1223-1237.

57. Angel P., Karin M. (1991) The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation. Biochim. Biophys. Acta., 1072, 129-157.

58. Glover M.J.N., Harrison S.C. (1995) Crystal structure of the heterodimeric bZIP transcription factor c-Fos-c-Jun bound to DNA, Nature, 373, 257-261.

59. Talanian R.V., McKnight C.J., Kim P.S. (1990) Sequence-specific DNA binding by a short peptide dimer. Science, 249, 769-71.

60. Voronova A., Baltimore D. (1990) Mutations that disrupt DNA binding and dimer formation in the E47 helix-loop-helix protein map to distinct domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 4722-4726.

61. Ma P.C.M., Rould M.A., Weintraub H., Pabo C.O., (1994) Crystal structure of MyoD bHLH domain-DNA complex: perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation. Cell, 77, 451-459.

62. Konig P., Richmond T. (1993). The X-ray structure of the GCN4-bZip bound to ATF/CREB site DNA shows the complex depends on DNA flexibility. J. Mol. Biol., 233, 139-154.

63. Ferre-D'Amare A.R., Prendergast G.C., Ziff E.B., Burley S.K. (1993). Recognition by Max of its cognate DNA through a dimeric b/HLH/Z domain. Nature, 363, 38-45.

64. Ferre-D'Amare A.R., Pognonec P., Roeder R.G., Burley S.K. (1994) Structure and function of the b/HLH/Z domain ofUSF. EMBO J., 13, 180-189.

65. Ptashne M. (1988) How eukaryotic transcriptional activators work. Nature, 335, 683-689.

66. Chothia C., Janin J. (1981) Relative orientation of close-packed ß-pleated sheets in proteins. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 4146-4150.

67. Ph'illips S.E.V. (1994) The ß-ribbon DNA recognition motif. Annu. Rev. Biophys. Biomo. Struct., 23, 671-701.

68. Tateno M., Yamasaki K., Amano N., Kakinuma J., Koike H., Allen M.D., Suzuki M. (1997) DNA recognition by ß-sheets. Biopolymers, 44, 335-359.

69. Somers W.S., Phillips S.E. (1992). Crystal structure of the met repressor-operator complex at 2.8 Ä resolution reveals DNA recognition by ß-strands. Nature, 359, 387-393.

70. Raumann B.E., Rould M.A., Pabo C.O., Sauer R.T, (1994) DNA recognition by ß-sheets in the Arc repressor-operator crystal structure. Nature, 367, 754-757.

71. Burgering M.J., Boelens R., Gilbert D.E., Breg J.N., Knight K.L., Sauer R.T., Kaptein R. (1994) Solution structure of dimeric Mnt repressor (1-76). Biochemistry, 33, 1503615045.

72. Suzuki M. (1995) DNA recognition by a beta-sheet. Protein Eng., 8, 1-4.

73. Gomis-Ruth F.X., Sola M., Acebo P., Parraga A., Guasch A., Eritja R., Gonzalez A., Espinosa M., del Solar G., Coll M. (1998) The structure of plasmid-encoded transcriptional repressor CopG unliganded and bound to its operator. EMBO J., 17, 74047415.

74. Phillips S.E.V., Manfield I., Parsons I., Davidson B.E., Rafferty J.B., Somers W.S., Margarita D., Cohen G.N., Saint-Girons I., Stockley P.G. (1989) Cooperative tandem binding of Met repressor of Escherichia coli. Nature, 341, 711-715.

75. Flick K.E., Jurica M.S., Monnat R.J.Jr., Stoddard B.L. (1998) DNA binding and cleavage by the nuclear intron-encoded homing endonuclease I-Ppo I. Nature, 394, 96-101.

76. Allen M.D., Yamasaki K., Ohme-Takagi M., Tateno M., Suzuki M. (1998). A novel mode of DNA recognition by a ß -sheet revealed by the solution structure of the GCC-box binding domain in complex with DNA. EMBO J., 17, 5484-5496.

77. Wojciak J.M., Connolly K.M., Clubb R.T. (1999) NMR structure of the Tn916 integrase-DNA complex. Nature Struct. Biol., 6, 366-373.

78. Wojciak J.M., Sarkar D., Landy A., Clubb R.T. (2002) Arm-site binding by X-integrase: solution structure and functional characterization of its amino-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 99, 3434-3439.

79. Connolly K.M., Ilangovan U., Wojciak J.M., Iwahara M., Clubb R.T. (2000) Major groove recognition by three-stranded ß -sheets: affinity determinants and conserved structural features. J. Mol.BioI., 300, 841-856.

80. Brown B.M., Milla M.E., Smith T.L., Sauer R.T. (1994) Scanning mutagenesis of the Arc repressor as a functional probe of operator recognition. Nature. Struct. Biol., 1, 164-168.

81. Cohen S.X., Moulin M., Hashemolhosseini S., Kilian K., Wegner M., Muller C.W. (2003) Structure of the GCM domain-DNA complex: a DNA-binding domain with a novel fold and mode of target site recognition. EMBO J., 22, 1835-1845.

82. Kim J.L., Nikolov D.B., Burley S.K. (1993) Crystal structure of TBP recognizing the minor groove of TATA element. Nature, 365, 520-527.

83. Kim Y., Geiger J.H., Hahn S„ Sigler P.B. (1993) Crystal structure of a yeast TBP/TATA-box complex. Nature, 365, 512-520.

84. Burley S.K., Roeder R.G. (1996) Biochemistry and structural biology of transcription factor IID. Annu. Rev. Biochem., 65, 769-799.

85. Vis H., Mariani M., Vorgias C.E., Wilson K.S., Kaptein R„ Boelens R. (1995) Solution structure of the HU protein from Bacillus stearothermophilus. J. Mol. Biol., 254, 692-703.

86. Rice P.A., Yang S., Mizuuchi K., Nash H.A. (1996) Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell, 87, 1295-1306.

87. Swinger K.K., Rice P.A. (2004) IHF and HU: flexible architects of bent DNA. Curr. Opin. Struct. Biol., 14, 28-35.

88. Hales L.M., Gumport R.I., Gardner J.F. (1996) Examining the contribution of a dARdT element to the conformation of Escherichia coli integration host factor-DNA complexes. Nucleic Acids Res., 24, 1780-1786.

89. Lynch T.W., Read E.K., Mattis A.N., Gardner J.F., Rice P.A. (2003) Integration host factor: putting a twist on protein-DNA recognition. J. Mol. Biol., 330, 493-502.

90. Cramer P., Larson C.J., Verdine G.L., Muller C.W. (1997) Structure of the human NF-kB p52 homodimer-DNA complex at 2.1 A resolution. EMBO J., 16, 7078-7090.

91. Kern S.E., Kinzler K.W., Bruskin A., Jarosz D., Friedman P., Prives C., Vogelstein B. (1991) Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein. Science, 252, 1708-1711.

92. Khan E., Mack J. P. G., Katz R. A., Kulkosky J., Skalka A. M. (1991) Retroviral integrase domains: DNA binding and the recognition of LTR sequences. Nucleic Acids Res., 19, 851-860.

93. Cai M., Zheng R., Caffrey M., Craigie R., Clore G.M., Gronenborn A.M. (1997) Solution structure of the N-terminal zinc binding domain of HIV-1 integrase. Nat. Struct. Biol., 4, 567-577.

94. Vink C., Oude Groeneger A.M., Plasterk R.H. (1993) Identification of the catalytic and DNA-binding region of the human immunodeficiency virus type I integrase protein. Nucl. Acids Res., 21, 1419-1425.

95. Zheng R., Jenkins T.M., Craigie R. (1996) Zinc folds the N-terminal domain of HIV-1 integrase, promotes multimerization, and enhances catalytic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 13659-13664.

96. Lee S.P, Xiao J., Knutson J.R., Lewis M.S., Han M.K. (1997) Zn2+ promotes the self-association of human immunodeficiency virus type-1 integrase in vitro. Biochemistry, 36, 173-180.

97. Dyda F., Hickman B„ Jenkins T.M., Engelman A., Craigie R., Davies D.R. (1994) Crystal structure of the catalytic domain of H1V-1 integrase: similarity to other polynucleotidyl transferases. Science, 266, 1981-1986.

98. Goldgur Y., Dyda F., Hickman A.B., Jenkins T.M., Craigie R., Davies D.R. (1998) Three new structures of the core domain of HIV-1 integrase: an active site that binds magnesium. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95, 9150-9154.

99. Esposito D., Craigie R. (1998) Sequence specificity of viral end DNA binding by HIV-1 integrase reveals critical regions for protein-DNA interaction. EMBO J., 17, 5832-5843.

100. Beese L.S., Steitz T.A. (1991) Structural basis for the 3'-5' exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism. EMBO J, 10, 25-33.

101. Puras Lutzke R.A., Vink C., Plasterk R. (1994) Characterization of the minimal DNA-binding domain of the HIV integrase protein. Nuc. Acids Res., 22, 4125-4131.

102. Greenwald J., Le V., Butler S.L., Bushman F.D., Choe S. (1999) The mobility of an HIV-1 integrase active site loop is correlated with catalytic activity. Biochemistry, 38, 8892-8898.

103. Robinson H., Gao Y.G., McCrary B.S., Edmondson S.P., Shriver J.W., Wang A.H. (1998) The hyperthermophile chromosomal protein Sac7d sharply kinks DNA. Nature, 392, 202-205.

104. Gao Y.G., Su S.Y., Robinson H., Padmanabhan S., Lim L., McCrary B.S., Edmondson S.P., Shriver J.W., Wang A.H. (1998) The crystal structure of the hyperthermophile chromosomal protein Sso7d bound to DNA. Nat. Struct. Biol., 5, 782-786.

105. Bushman F.D., Engelman A., Pelmer I,, Wingfield P.T., Craigie R. (1993) Domains of integrase protein of human immunodeficiency virus type-1 responsible for polynucleotidyl transfer and zink binding. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 3428-3432.

106. Lodi P.J., Ernst J.A., Kuszewski J., Hickman A.B., Engelman A., Craigie R., Clore G.M., Gronenborn A.M. (1995) Solution structure of the DNA binding domain of HIV-1 integrase. Biochemistry, 34, 9826-9833.

107. Heuer T.S., Brown P.O. (1998) Photo-cross-linking studies suggest a model for the architecture of an active human immunodeficiency virus type 1 integrase-DNA complex, Biochemistry, 37, 6667-6678.

108. Gao K., Butler S.L., Bushman F. (2001) Human immunodeficiency virus type 1 integrasc: arrangement of protein domains in active cDNA complexes, EMBO J., 20, 3565-3576.

109. Wang J.-Y., Ling H., Yang W., Graigie R. (2001) Structure of a two-domain fragment of HIV-1 integrase: implications for domain organization in the intact protein. EMBO J., 20, 7333-7343.

110. Podtelezhnikov A.A., Gao K., Bushman F.D., McCammon, J.A. (2003) Modeling HIV-1 integrase complexes based on their hydrodynamic properties. Biopolymers, 68, 110-120.

111. Karki R.G., Tang Y„ Burke T.R.J., Nicklaus M.C. (2004) Model of full-length HIV-1 integrase complexed with viral DNA as template for anti-HIV drug design. J. Comput. Aided Mol. Des., 18, 739-760.

112. Wielens J., Crosby I.T., Chalm D.K. (2005) A three-dimensional model of the human immunodeficiency virus type 1 integration complex. J. Comput. Aided Mol Des., 19, 301317.

113. Chen A., Weber I.T., Harrison R., Leis J. (2006) Identification of amino acids in HIV-1 and avian sarcoma virus integrase subsites required for specific recognition of the long terminal repeat ends. J. Biol.Chem., 281, 4173-4182.

114. De Luca L., Vistoli G., Pedretti A., Barreca M.L., Chimirri A. (2005) Molecular dynamics studies of the full-length integrase-DNA complex. Biochem. Biophys. Res. Coinmun., 336, 1010-1016.

115. Wang L.-D., Liu C.-L., Chen W.-Z., Wang C.-X. (2005) Constructing HIV-1 integrase tetramer and exploring influences of metal ions on forming integrase-DNA complex. Biochem. Biophys. Res. Commun., 337, 313-319.

116. Davies D.R., Goryshin I.Y., Reznikoff W.S., Rayment I. (2000) Three-dimensional structure of the Tn5 synaptic complex transposition intermediate. Science, 289, 77-85.

117. Lovell S., Goryshin I.Y., Reznikoff W.R., Rayment I. (2002) Two-metal active site binding of a Tn5 transposase synaptic complex. Nat. Struct. Biol., 9, 278-281.

118. Yuan J.F., Beniac D.R., Chaconas G., Ottensmeyer F.P. (2005) 3D reconstruction of the Mu transposase and the type 1 transpososome: a structural framework for Mu DNA transposition. Genes Dev., 19, 840-852.

119. Katzman M., Sudol M. (1996) Influence of subterminal viral DNA nucleotides on differential susceptibility to cleavage by human immunodeficiency virus type 1 and visna virus integrases. J. Virol., 70, 9069-9073.

120. Mazumder A., Pommier Y. (1995) Processing of deoxyuridine mismatches and abasic sites by human immunodeficiency virus type-1 integrase. Nucl. Acids. Res., 23, 28652871.

121. Wang T., Balakrishnan M., Jonsson C.B. (1999) Major and minor groove contacts in retroviral integrase LTR interactions. Biochemistry, 38, 3624-3632.

122. Scottoline B.P., Chow S., Ellison V., Brown P.O. (1997) Disruption of the terminal base pairs of retroviral DNA during integration. Genes Dev., 11, 371-382.

123. Sherman P.A., Dickson M.L., Fyfe J.A. (1992) Human immunodeficiency virus type 1 integrase protein: DNA sequence requirements for cleaving and joining reaction. J. Virol., 66,3593-3601.

124. LaFemina R.L., Callahan P.L., Cordingley M.G. (1991) Substrate specifity of recombinant human immunodeficiency virus integrase protein. J. Virol., 65, 5624-5630.

125. Vink C., van Gent D.C., Elgersma Y., Plasterk R.H. (1991) Human immunodeficiency virus integrase protein requires a subterminal position of its viral DNA recognition sequence for efficient cleavage. J. Virol., 65, 4636-4644.

126. Engelman A., Craigie R. (1995) Efficient magnesium-dependent human immunodeficiency virus type 1 integrase activity. J. Virol., 69, 5908-5911.

127. Sherman P.A., Fyfe J. A. (1990) Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5119-5123.

128. Pemberton I.K., Buckle M., Buc H. (1996) The metal ion-induced cooperative binding of HIV-1 integrase to DNA exhibits a marked preference for Mn(II) rather than Mg(II), J. BioI.Chem., 271, 1498-1506.

129. Deprez E„ Tauc P., Leh H., Mouscadet J.-F., Auclair C., Brochon J.-C., (2000) Oligomeric states of the HIV-1 integrase as measured by time-resolved fluorescence anisotropy. Biochemistry, 39, 9275-9284.

130. Tramontano E., Colla P.L., Cheng Y.C. (1998) Biochemical characterization of the HIV-1 integrase 3'-processing activity and its inhibition by phosphorothioate oligonucleotides. Biochemistry, 37, 7237-7243.

131. Chow S.A. (1997) In vitro assays for activities of retroviral integrase. Methods, 12, 306317.

132. Engelman A., Hickman A.B., Craigie R. (1994) The core and carboxyl-terminal domains of the integrase protein of human immunodeficiency virus type 1 each contribute to nonspecific DNA binding. J. Virol., 68, 5911-5917.

133. Vink C., Lutzke R. A., Plasterk R. H. (1994) Formation of a stable complex between the human immunodeficiency virus integrase protein and viral DNA. Nucleic Acids Res., 22, 4103-4110.

134. Hazuda D.J., Wolfe A.L., Hastings J.C., Robbins H.L., Graham P.L., LaFemina R.L., Emini E.A. (1994) Viral long terminal repeat substrate binding characteristic of the human immunodeficiency virus type 1 integrase. J. Biol. Chem., 269, 3999-4004.

135. Pinskaya M., Romanova E., Volkov E., Deprez E., Leh H., Brochón J.C., Mouscadet J.F., Gottikh M. (2004) HIV-l integrase complexes with DNA dissociate in the presence of short oligonucleotides conjugated to acridine. Biochemistry, 43, 8735-8743.

136. Perez-Howard G.M., Weil P.A., Beechem J.M. (1995) Yeast TATA binding protein interaction with DNA: fluorescence determination of oligomeric state, equilibrium binding, on-rate, and dissociation kinetics. Biochemistry, 34, 8005-8017.

137. Kohler J.J., Schepartz A. (2001) Kinetic studies of Fos/Jun/DNA complex formation: DNA binding prior to dimerization. Biochemistry, 40, 130-142.

138. Hiller D.A., Fogg J.M., Martin A.M., Beechem J.M., Reich N.O., Perona J.J. (2003) Simultaneous DNA binding and bending by EcoRV endonuclease observed by real-time fluorescence. Biochemistry, 42, 14375-14385.

139. Deprez E., Barbe S., Kolaski M., Leh H., Zouhiri F., Auclair C., Brochón J.C., Le Bret M., Mouscadet J.F. (2004) Mechanism of HIV-l integrase inhibition by styrylquinoline derivatives in vitro. Mol. Pharmacol., 65, 85-98.

140. Yi J., Asante-Appiah E., Skalka A.M. (1999) Divalent cations stimulate preferential recognition of a viral DNA end by HIV-l integrase. Biochemistry, 38, 8458-8468.

141. Schauer M., Billich A. (1992) The N-terminal region of HIV-l integrase is required for integration activity, but not for DNA-binding. Biochem. Biophys. Res. Commun., 185, 874-880.

142. Etzkorn C., Horton N. C. (2004) Ca2+ binding in the active site of HincII: implications for the catalytic mechanism. Biochemistry, 43, 13256-13270.

143. Корииш-Боуден Э. (1979) Принципы ферментативной кинетики, М., Мир.

144. Gerton J.L., Ohgi S., Olsen M„ DeRisi J., Brown P.O. (1998) Effects of mutations in residues near the active site of human immunodeficiency virus type 1 integrase on specific enzyme-substrate interactions. J. Virol., 72, 5046-5055.

145. Jones K.S., Coleman J., Merkel G.W., Laue T.M., Skalka A.M. (1992) Retroviral integrase functions as a multimer and can turn over catalytically. J. Biol. Chem., 267, 16037-16040.

146. Bushman F.D., Wang B. (1994) Rous sarcoma virus integrase protein: mapping functions for catalysis and substrate binding. J. Virol., 68, 2215-2223.

147. Jenkins T.M., Esposito D., Engelman A., Craigie R. (1997) Critical contacts between H1V-1 integrase and viral DNA identified by structure-based analysis and photo-crosslinking. EMBO J., 16,6849-6859.

148. DeMott M.S., Beyret E., Wong D., Bales B.C., Wang J.-T., Greenberg M.M., Demple B. (2002) Covalent trapping of human DNA polymerase beta by the oxidative DNA lesion 2-deoxyribonolactone. J. Biol. Chem., 277, 7637-7640.

149. Mazumder A., Neamati N., Pilón A.A., Sunder S., Pommier Y. (1996) Chemical trapping of ternary complexes of human immunodeficiency virus type 1 integrase, divalent metal, and DNA substrates containing an abasic site. J. Biol. Chem., 271, 2733027338.

150. Chheda A.D., Teebor G.W., Cunningham R.P. (2000) Identification, characterization, and purification of DNA glycosylase/AP lyases by reductive crosslinking to 29-deoxyribooligonucleotides containing specific base lesions. Methods, 22, 180-187.

151. Lipford J.R., Worland S.T., Farnet C.M. (1994) Nucleotide binding by the HIV-1 integrase protein in vitro. J. Acquired Immune Defic. Syndr., 7, 1215-1223.

152. Hohenegger M., Nanoff C., Ahorn H., Freissmuth M. (1994) Structural and functional characterization of the interaction between 2',3'-diaIdehyde guanine nucleotide analogues and the stimulatory G protein alpha-subunit. J. Biol. Chem., 269, 32008-32015.

153. Kachalova A.V., Zatsepin T.S., Romanova E.A., Stetsenko D.A., Gait M.J., Oretskaya T.S. (2000) Synthesis of modified nucleotide building blocks containing electrophilic groups in the 2'-position. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 19, 1693-1707.

154. Зацепин T.C., Качалова А.В., Романова E.A., Стеценко Д.А., Гейт М.Дж., Орецкая Т.С. (2001) Синтез и свойства модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 2'-0(2,3-дигидроксипропил)уридип и 2'-0-(2-оксоэтил)уридин. Биоорг. Химия, 27, 45-51.

155. Гриценко О.М., Громова Е.С. (1999) Диальдегидсодержащие нуклеиновые кислоты и их компоненты: синтез, свойства, аффиипая модификация белков. Успехи химии, 68, 267-278.

156. Турутип Д.В., Зацепин Т.С., Тимченко М.А., Кубарева Е.А., Орецкая Т.С. (2002) Ковалентное присоединение фактора транскрипции NF-кВ к ДНК-лиганду, содержащему 2'-альдегидную группу. Мол. Биология, 36, 877-879.

157. Судьина А.Е., Зацепин Т.С., Пингоуд В., Пипгоуд А., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. (2005) Аффинная модификация эндонуклеазы рестрикции SsoII ДНК-дуплексами, содержащими 2'-альдегидную группу. Биохимия, 70, 1137-1144.

158. Chiu Т.К., Davies D.R. (2004) Structure and function of HIV-1 integrase. Curr. Top. Med. Chem. 4, 965-977.

159. Venkateswarlu D., Lind K.E., Mohan V., Manoharan M., Ferguson D.M. (1999) Structural properties of DNA:RNA duplexes containing 2'-0-methyl and 2'-S-methyl substitutions: a molecular dynamics investigation., Nucl. Acid. Res., 27, 2189-2195.

160. Deshmukh H.M., Broom A.D. (1996) Probing nucleic acid geometries: oligonucleotides containing 2'-0-phenethyladenosine at specific sites, Bioconjugate Chem., 7, 108-120.

161. Bobst A.M., Cerutti P.A., Rottman F. (1969) Structure of poly(2'-0-methyladenylic acid) at acidic and neutral pH. J. Am. Chem. Soc., 91, 1246-1248.

162. Gelfand C.A., Plum G.E., Grollman A.P., Johnson F., Breslauer K.J. (1998) Thermodynamic consequences of an abasic lesion in duplex DNA are strongly dependent on base sequence. Biochemistry, 37, 7321-7327.

163. Plach H., Westhof E., Ludemann H.D., Mengel R. (1977) Solution conformational analysis of 2'-amino-2'-deoxyadenosine, 3'-amino-3'-deoxyadenosine and puromycin by pulsed nuclear-magnetic-resonance methods. Eur. J. Biochem., 80, 295-304.

164. Bertrand H., Ha-Duong T., Fermandjian S„ Hartmann B. (1998) Flexibility of the B-DNA backbone: effects of local and neighbouring sequences on pyrimidine-purine steps. Nucleic Acids Res., 26, 1261-1267.

165. Packer M.J., Dauncey M.P., Hunter C.A. (2000) Sequence-dependent DNA structure: dinucleotide conformational maps. J. Mol. Biol., 295, 71-83.

166. Dickerson R.E., Chiu T.K. (1997) Helix bending as a factor in protein/DNA recognition. Biopolymers, 44, 361-403.

167. Jones S., van Heyningen P., Berman H.M., Thornton J.M. (1999) Protein-DNA interactions: a structural analysis. J. Mol. Biol., 287, 877-896.

168. Hickman А.В., Palmer I., Engelman A., Craigie R., Wingfield P. (1994) Biophysical and enzymatic properties of the catalytic domain of HIV-1 integrase. J. Biol. Chem., 269, 29279-29287.

169. Fusinita M.I., van den Ent F.M., Vos A., Plasterk R.H. (1999) Dissecting the role of the N-terminal domain of human immunodeficiency virus integrase by trans-complementation analysis. J. Virol., 73, 3176-3183.

170. Brown P.O. (1997) Integration in Retroviruses (Coffin J.M., Hughes S., Varmus H. eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 161-203.

171. Faure A., Calméis С., Desjobert С., Castroviejó M., Caumont-Sarcos A., Tarrago-Litvak L., Litvak S., Parissi V. (2005) HIV-1 integrase crosslinked oligomers are active in vitro. Nucleic Acids Res., 33, 977-986.

172. Кузнецова Л.Г., Волков Е.М., Романова Е.А., Ташлицкий В.Н., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. (1991) Синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 2'-амино-2'-дезоксиуридиновые звенья. Биоорган, химия, 17, 1289-1291.

173. Sinha N.D., Striepeke S. (1991) Oligonucleotides with reporter groups attached to the 5'-terminus. (in "Oligonucleotides and analogues. A practical approach." Ed. Eckstein F.), Oxford University Press, Oxford, NY, Tokyo, 185-210.