Модифицированные олигонуклеотиды - ингибиторы интеграции ДНК вируса иммунодефицита человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Список принятых сокращений.

Введение.

I. Интеграция ДНК вируса иммунодефицита человека в ДНК клетки и ее ингибирование соединениями нуклеотидной природы обзор литературы).

1.1. Репликативный цикл ВИЧ.

1.2. Интеграция ДНК ВИЧ-1 в геном клетки.

1.3. Строение интегразы ВИЧ-1.

1.4. Ингибиторы интеграции ДНК ВИЧ-1.

1.4.1. Ингибирование интегразы ВИЧ-1 нуклеотидами и их аналогами.

1.4.2. Ингибирование интеграции ДНК ВИЧ-1 олигонуклеотидами.

1.4.2.1. Ингибирование интеграции ДНК ВИЧ-1 триплексобразующими олигонуклеотидами.

1.4.2.2. Ингибирование интегразы ВИЧ-1 олигонуклеотидами.

1.5. Использование олигонуклеотидов в качестве противовирусных препаратов.

II. Модифицированные олигонуклеотиды - ингибиторы интеграции ДНК вируса иммунодефицита человека обсуждение результатов).

II. 1. Конъюгаты олигонуклеотидов с ароматическим заместителем.

II. 1.1. Конъюгаты 3' -3'-разветвленных олигонуклеотидов с оксазолопиридокарбазолом.

11.1.1.1. Изучение формирования З'-З' -разветвленными олигонуклеотидами триплекса с и5 фрагментом ДНК ВИЧи самокомплементарных структур.

II. 1.1.2. Подбор оптимальных условий для изучения ингибирования ферментативной активности интегразы ВИЧ-1 в реакциях 3'-концевого процессинга и переноса цепи с помощью модифицированных олигонуклеотидов.

II. 1.1.3. Ингибирование интеграции ДНК ВИЧ

З'-З'-разветвленными олигонуклеотидами и их конъюгатами с оксазолопиридокарбазолом.

II. 1.2. Конъюгаты природных олигонуклеотидов с ароматическим заместителем.

II. 1.2Л. Ингибирование интеграции ДНК ВИЧконъюгатами природных олигонуклеотидов с ароматическим заместителем.

II. 1.2.2. Выявление структурных детерминант ингибирующей активности конъюгатов олигонуклеотидов с ароматическими заместителями.

11.2. Олигонуклеотиды, содержащие модифицированные гетероциклические основания.

11.2.1. Ингибирование интеграции ДНК ВИЧ-1 олигонуклеотидами, содержащими 6-оксо-цитозин.

11.3. Механизм ингибирования интегразы ВИЧмодифицированными олигонуклеотидами.

11.3.1. Влияние модифицированных олигонуклеотидов на формирование комплекса интегразы с и 5 фрагментом ДНК ВИЧ-1.

11.3.2. Взаимодействие модифицированных олигонуклеотидов с интегразой ВИЧ-1.

II.3.3. Действие модифицированных олигонуклеотидов на каталитическую активность интегразы ВИЧ-1 в составе ее комплекса с субстратом.

II.3.4. Влияние модифицированных олигонуклеотидов на устойчивость комплекса интегразы с U5 фрагментом ДНК ВИЧ-1.

II.4. Ингибирование активности прединтеграционного комплекса, выделенного из ВИЧ-инфицированных клеток, модифицированными олигонуклеотидами.

III. Экспериментальная часть.

III. 1. Реактивы и материалы.

III.2. Методы.

III.2.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотидов с ароматическими заместителями.

111.2.2. Физико-химические методы изучения формирования олигонуклеотидами вторичных структур и их комплексов с ДНК ВИЧ-1.

111.2.3. Изучение действия олигонуклеотидов на каталитическую активность интегразы ВИЧ-1.

111.2.4. Изучение взаимодействия олигонуклеотидов с интегразой ВИЧи ее комплексом с U5 субстратом.

Выводы.

В течение длительного времени активно развивается область биохимии, связанная с синтезом и применением биологически направленных олигонуклеотидов. Действие олигонуклеотидов основано на специфическом узнавании и связывании с комплементарными последовательностями РНК, ДНК, а также белками. Именно способность олигонуклеотидов к специфическому взаимодействию с мишенью и отсутствие иммунного ответа организма на их воздействие делает олигонуклеотиды столь привлекательными для использования в качестве терапевтических препаратов [1]. Получены первые положительные результаты при лечении некоторых заболеваний, когда можно осуществлять локальные инъекции олигонуклеотидов в область заражения, в том числе при лечении вирусных ретинитов [2]. Показано, что олигонуклеотиды могут специфически подавлять рост раковых клеток, содержащих мутантные онкогены [3].

Широко изучается возможность использования олигонуклеотидов для подавления репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающего СПИД [4-6]. Различают два типа вируса: ВИЧ-1 и ВИЧ-2, которые незначительно отличаются друг от друга строением генома [7; 8]. Настоящая работа была посвящена ингибированию интеграции ДНК ВИЧ типа 1, как более патогенному и более широко распространенному вирусу. Тем не менее, учитывая высокую схожесть в структуре и биологии двух вирусов, можно предположить, что полученные в работе результаты могут быть распространены и на ВИЧ-2.

Можно выделить два подхода к созданию олигонуклеотидных ингибиторов репликации ВИЧ-1, один из которых использует информацию о структуре мишени (антисмысловые, триплексобразующие олигонуклеотиды, рибозимы, ингибиторы-аналоги субстратов вирусных белков), другой - комбинаторные методы, например БЕЬЕХ, для ингибиторов направленных на вирусные белки (РНК- и ДНК-аптамеры) [9-12].

Для того чтобы действие олигонуклеотидов не затрагивало процессов, жизненно важных для функционирования клетки и организма в целом, их целесообразно направлять на подавление тех стадий, которые являются ключевыми в репликативном цикле ВИЧ-1 и характерны только для его развития. Одной из таких стадий является интеграция вирусной ДНК в геном зараженной клетки, которая осуществляется при участии вирусного фермента - интегразы. Препараты, направленные на подавление интеграции, могут позволить не только замедлить развитие СПИДа, как это делают ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы, но также остановить и локализовать распространение вирусной инфекции. В связи с этим настоящая работа посвящена созданию модифицированных олигонуклеотидов, способных эффективно ингибировать именно стадию интеграции ДНК вируса иммунодефицита человека в геномную ДНК. Для того чтобы оценить возможность применения таких ингибиторов в качестве противовирусных препаратов, изучен механизм их ингибирующего действия.

Нами для подавления интеграции ДНК ВИЧ-1 были синтезированы короткие модифицированные олигонуклеотиды двух типов: содержащие ароматический заместитель или модифицированные гетероциклические основания. Изучение ингибирования интеграции ДНК ВИЧ-1 in vitro с помощью таких модифицированных олигонуклеотидов проводили в условиях, наиболее приближенных к физиологическим, впервые, с использованием интегразы, выделенной без детергентов и активной в присутствии ионов Mg2+. Мы изучили действие модифицированных олигонуклеотидов на каталитическую активность интегразы, в том числе и в составе ее комплекса с субстратом - U5 фрагментом ДНК ВИЧ-1; установили структурные детерминанты ингибирующей активности олигонуклеотидов, в частности влияние состава, последовательности, длины олигонуклеотида, а также природы модификации на эффективность их ингибирующего действия.

Для того чтобы понять механизм действия модифицированных олигонуклеотидов на интегразу ВИЧ-1, мы изучили их взаимодействие с интегразой, а также комплексом интегразы с субстратом. Для этого мы использовали методы поляризации флуоресценции и ковалентного присоединения. Оказалось, что короткие модифицированные олигонуклеотиды могут взаимодействовать как с самой интегразой, так и ее комплексом с субстратом. Они подавляют каталитическую активность интегразы в предварительно сформированном комплексе за счет того, что вызывают его быструю и эффективную диссоциацию. Для того чтобы оценить потенциал модифицированных олигонуклеотидов как ингибиторов репликации ВИЧ-1, мы изучили их действие на активность прединтеграционного комплекса, выделенного из ВИЧ-инфицированных клеток и являющегося, собственно, мишенью для ингибиторов интеграции in vivo.

Работа включает обзор литературы, посвященный интеграции ДНК вируса иммунодефицита человека в ДНК клетки и ее ингибированию соединениями нуклеотидной природы.

I. ИНТЕГРАЦИЯ ДНК ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА В ДНК КЛЕТКИ И ЕЕ ИНГИБИРОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЯМИ НУКЛЕОТИДНОЙ ПРИРОДЫ /обзор литературы/

Синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД) вызывает вирус, называемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), который прямо и опосредованно поражает иммунную систему организма [13]. Попытки контроля эпидемии СПИДа сосредоточены на изучении биологии, биохимии и структурной биологии ВИЧ, а также на поиске ингибиторов вируса. Изучается возможность подавления репродукции вируса на разных стадиях репликативного цикла: транскрипции, трансляции, интеграции, сборки и созревания вирусных частиц. Первые коммерческие препараты против ВИЧ были созданы в 1987 году и представляли собой ингибиторы нуклеотидной (зидовудин, дидезоксиинозин) и ненуклеотидной природы (невирапин), подавляющие ферментативную активность вирусного фермента -обратной транскриптазы [14]. Поскольку быстрая эволюция ВИЧ in vivo приводит к возникновению устойчивых к этим препаратам форм вируса, медики начали применять комплексную терапию, включающую ингибиторы обратной транскриптазы и другого вирусного фермента - протеазы [15]. И хотя на сегодняшний день эта терапия, называемая HAART (highly active antiretroviral therapy), рассматривается как наиболее действенная и доступная, она не приводит к полной остановке репликации вируса, а позволяет лишь подавлять ее до низкого уровня, продлевая жизнь ВИЧ-инфицированным пациентам [16; 17]. Кроме того, использование этого подхода часто ограничивается доступностью препаратов, токсичностью, селективностью их действия в клетках и восприимчивостью к ним организма инфицированного человека. В связи с этим внимание ученых сосредоточено на поиске новых мишеней и новых ингибиторов репликации вируса. Одной из самых привлекательных и актуальных мишеней на сегодняшний день является третий вирусный фермент - интеграза. Она катализирует ключевой процесс репликативного цикла ВИЧ - встраивание вирусной ДНК в клеточную [18]. Понятно, что подавление этого процесса должно необратимо привести к полной остановке репликации вируса.

Для понимания и оценки различных подходов к ингибированию вируса рассмотрим основные этапы репликативного цикла ВИЧ.

1.1.

РЕПЛИКАТИВНЫЙ ЦИКЛ ВИЧ

Вирус иммунодефицита человека принадлежит к классу ретровирусов. Следует отметить, что существует два типа вируса: ВИЧ-1 и ВИЧ-2, которые незначительно отличаются друг от друга строением генома [7; 8]. В частности, РНК-геном ВИЧ-2. кодирует белок Vpx, ответственный за инфицирование макрофагов и распространение вируса, однако, в его геноме отсутствует ген белка Vpu, который отвечает за down-регуляцию клеточного рецептора CD4 и белков MHC-I, участвующих в иммунном узнавании Т-лимфоцитов, а также стимулирует отпочковывание вируса. Настоящая работа была посвящена ингибированию интеграции ДНК ВИЧ типа 1, как более патогенному и более широко распространенному типу вируса. Поэтому далее в обзоре литературы будут рассмотрены вопросы, связанные с репликацией и ингибированием интеграции ДНК именно ВИЧ-1.

Рассмотрим основные этапы развития ВИЧ-1. Его репликативный цикл условно можно разделить на две фазы: 1) раннюю, которая начинается с узнавания клетки-мишени зрелым вирионом и включает все процессы, ведущие к интеграции вирусной ДНК в хромосому зараженной клетки; и 2) позднюю фазу, начинающуюся с регулируемой экспрессии интегрированного провирусного генома и заканчивающуюся отпочковыванием и созреванием вируса (рис. 1) [19].

I. Ранняя фаза:

Частицы ВИЧ-1 связываются специфично только с клетками, несущими на поверхности белок CD4, ответственный за иммунное узнавание клетки. Связывание вируса с CD4 осуществляется через специфическое взаимодействие гликопротеина оболочки вируса gpl20 и N-концевого домена иммуноглобулина белка CD4. Для проникновения вируса в клетку-мишень необходимы также дополнительные белки, в частности, хемокиновые рецепторы (CXCR4, CCR5). Вслед за проникновением следуют процессы «раздевания» и высвобождения внутриклеточного предтранскрипционного комплекса. Обратная транскрипция геномной РНК осуществляется вирусным ферментом - обратной транскриптазой - в цитоплазме. Возможно, на этом этапе важную роль играют вспомогательный вирусный белок Vif, способствующий инициации транскрипции, и нуклеокапсидный белок (р7).

Белки оболочки р7 (нукпеокапсид)

Обратная транскриптаэа

Интеграза

ТТротвааа

Р13 (Ург)

Рис.1. Строение зрелого вириона и репликативный цикл ВИЧ-1.

Праймером для синтеза (-)цепи кДНК служит клеточная тРНКЬу\ часть которой образует комплементарный комплекс с праймер связывающим участком вирусного генома. Далее эта ДНК используется в качестве матрицы для синтеза двуцепочечной кДНК. Двуцепочечная кДНК транспортируется в ядро в составе прединтеграционного комплекса, включающего ряд вирусных белков (интегразу, матриксный белок р17, обратную транскриптазу, вспомогательный белок Vpr), а также клеточные белки. Локализация прединтеграционного комплекса в ядре определяется белком р17 и Vpr, который также оказывает влияние и на нормальное развитие клеточного цикла, подавляя рост инфицированных клеток в G2 фазе [20]. После транспорта в ядро кДНК ковалентно интегрируется в геном клетки хозяина благодаря каталитической активности вирусного фермента - интегразы - с образованием провирусной ДНК. Детальный механизм процесса интеграции будет рассмотрен ниже в разделе 1.2.

II. Поздняя фаза:

Поздняя фаза репликативного цикла вируса начинается с транскрипции вирусных генов. Контроль за экспрессией вирусного генома осуществляют как клеточные, так и вирусные факторы. U3 длинный концевой повтор в составе провирусной ДНК содержит ряд последовательностей для посадки полимеразы и факторов транскрипции, в частности, последовательность ТАТАА - сайт посадки клеточной РНК-полимеразы типа II, энхансерные последовательности, с которыми связываются клеточные факторы NFAT и NF-kB, а также модуляторы для связывания целого ряда других клеточных факторов. Сначала транскрибируются те части провирусной ДНК, которые кодируют регуляторные белки Tat, Rev и Nef. Ранние РНК-транскрипты экспортируются из ядра в цитоплазму и подвергаются сплайсингу и трансляции. Белок Nef образуется в результате трансляции дважды сплайсированной мРНК. Поздние РНК-транскрипты остаются на этом этапе в ядре и деградируют.

Белки Tat и Rev направляются в ядро. В ядре Tat кооперативно связывается с последовательностью TAR вирусной РНК и циклином Т1, компонентом фактора элонгации транскрипции b (P-TEFb). В результате такого взаимодействия киназа CDK9, являющаяся также компонентом фактора элонгации P-TEFb, фосфорилирует С-концевой домен клеточной РНК-полимеразы II, повышая процессивность фермента. Это позволяет полимеразе осуществлять транскрипцию поздних мРНК [21]. Белок Rev участвует в процессе транспорта поздних мРНК вместе с клеточным ядерным белком экспортином-1 и ядерным фактором экспорта, гуанозинтрифосфатазой Ran. Поздние мРНК транспортируются в цитоплазму, где они высвобождается из комплекса, a N-концевой фрагмент белка Rev, отвечающий за ядерную локализацию, направляет импорт комплекса обратно в ядро. Белок Rev служит своего рода переключателем между ранним синтезом высоко сплайсированных мРНК, кодирующих белки Tat, Rev и Nef, и поздним синтезом несплайсированных транскриптов, содержащих гены gag и gag-pol, и односплайсированных транскриптов, кодирующих белки Env, Vpu, Vif и Vpr. Поздние мРНК-транскрипты содержат сайт связывания Rev, называемый RRE, и их экспорт из ядра клетки возможен только в присутствии Rev, то есть на поздней стадии репликативного цикла ВИЧ-1.

В результате трансляции гена env образуются белки оболочки вируса, gpl20 и gp41. Они синтезируется в виде полипротеинового предшественника в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), где он олигомеризуется с образованием тримерных структур и гликозилируется. Далее в ЭР и аппарате Гольджи полипротеиновый предшественник разрезается клеточной протеазой на тримерный гликозилированный комплекс (gp41-gpl20)3. Такой комплекс транспортируется к клеточной мембране для сборки вируса. Важно отметить, что и вирусный белок оболочки gpl20, и клеточный рецептор CD4, оба синтезируются в ЭР. Их преждевременное связывание друг с другом может привести либо к ингибированию транспорта Env к клеточной мембране, либо к ингибированию образования полнофункционального тримерного комплекса (gp41-gpl20)3. Помогает избежать этого вирусный белок Vpu, который связывает CD4, и таким образом дает сигнал к деградации клеточного рецептора по пути убиквитин-протеасомного гидролиза. Находящиеся на поверхности клетки молекулы CD4 атакуются белком Nef и направляются в эндосомы для деградации. Таким образом аппарат вируса помогает избежать клетке иммунного ответа организма.

В результате трансляции несплайсированной мРНК синтезируется полипротеин Gag, включающий в себя структурные белки. Сдвиг рамки считывания при трансляции приводит к образованию меньших количеств полипротеинов Gag-Pol, которые затем ассоциируются с полипротеином Gag на клеточной мембране. Ген pol кодирует вирусные ферменты: обратную транскриптазу, интегразу и протеазу. Приблизительно 1200-2000 копий Gag упаковываются с образованием незрелой вирусной частицы, в которую инкапсулированы две копии несплайсированного вирусного РНК-генома. После отпочковывания вируса вирусная протеаза в составе полипротеинового предшественника Gag-Pol осуществляет саморасщепление полипротеинов на три вирусных фермента, а также структурные белки матрикса (р!7), капсида (р24) и нуклеокапсида (р7). Затем в процессе созревания вируса структурные белки перегруппировываются с образованием уже инфекционной вирусной частицы [22].

Подавление репликации ВИЧ разумно вести на ранних этапах развития вируса -обратной транскрипции и интеграции, - в которых принимают участие вирусные ферменты. Наиболее широко развито направление, связанное с подавлением стадии обратной транскрипции ВИЧ-1. В качестве ингибиторов обратной транскриптазы используют в основном аналоги ее субстрата - модифицированные фосфорилированные нуклеозиды [23]. Как упоминалось ранее, такая стратегия подавления репликации вируса оказывается малоэффективной, поскольку вирус крайне быстро эволюционирует, приобретая устойчивость к таким ингибиторам [24].

Направление, связанное с ингиброванием интеграции вирусной ДНК в геном клетки хозяина, на настоящее время наименее развито, несмотря на то, что это ключевая стадия репликативного цикла ВИЧ. Интеграза, катализирующая реакцию интеграции, не имеет гомологов в клетке, что делает ее привлекательной с точки зрения селективности и эффективности воздействия антивирусных препаратов. Подавление стадии интеграции позволило бы предотвратить репликацию вируса в de novo зараженных клетках и в последствии элиминировать зараженные клетки, изолированные в тканях пациента, подвергающегося химеотерапии [18].

Поскольку процесс интеграции очень сложный и протекает при участии не только интегразы, но также ряда других вирусных и клеточных факторов, для выбора стратегии подавления интеграции, в частности мишени и типа ингибитора, необходимо рассмотреть детальный механизм этого процесса.

выводы

1. Установлено, что короткие модифицированные олигонуклеотиды являются эффективными ингибиторами интегразы ВИЧ-1. Взаимодействие ингибитора с ферментом определяется структурой модифицированного олигонуклеотида (природой модификации, длиной, составом и последовательностью олигонуклеотида).

2. Показано, что З'-З'-разветвленные олигонуклеотиды 0,А-состава эффективно ингибируют интегразу ВИЧ-1 только в том случае, если они образуют вторичную структуру в виде параллельного дуплекса. Таким образом, впервые обнаружено, что интеграза ВИЧ-1 способна взаимодействовать с параллельными ДНК.

3. Установлено, что присоединение ароматического заместителя к природным олигонуклеотидам существенно усиливает их активность как ингибиторов интегразы ВИЧ-1. Эффективность ингибирующего действия определяется степенью разветвленное™ ароматической системы заместителя и зависит от последовательности олигонуклеотида. Присутствие двух молекул заместителя на разных концах олигонуклеотида увеличивает его ингибирующее действие.

4. Обнаружено, что олигонуклеотиды, содержащие хотя бы одно модифицированное гетероциклическое основание являются эффективными ингибиторами интегразы ВИЧ-1. Наибольшим ингибирующим действием среди них обладают олигонуклеотиды, содержащие 6-оксо-цитозин. Ингибирующая активность олигонуклеотида еще более возрастает при замене двух гетероциклических оснований на модифицированные. Эффективность действия олигонуклеотидов, содержащих 6-оксо-цитозин, определяется длиной олигонуклеотида и расположением модификации в олигонуклеотидной цепи. При уменьшении длины олигонуклеотида реакция переноса цепи становится более чувствительна к присутствию олигонуклеотидного ингибитора, чем реакция 3'-концевого процессинга.

5. Показано, что короткие модифицированные олигонуклеотиды могут взаимодействовать как с самой интегразой, так и с ее комплексом с вирусной ДНК. Они подавляют каталитическую активность интегразы в фермент-субстратном комплексе за счет того, что вызывают быструю и эффективную диссоциацию комплекса.

6. Установлено, что олигонуклеотиды, содержащие 6-оксо-цитозин, подавляют активность интегразы в составе прединтеграционного комплекса, выделенного из ВИЧ-инфицированных клеток.

1. Juliano R.L., Astriab-Fisher A., Falke D. (2001): Emerging strategies for drug discovery in the postgenome era. Mol. Interventions 1, 40-53;

2. Saison-Benmoaras T. Tocque B., Rey, I., Chassignol M., Thuong N. T., Helen C. (1991): Cultured human fibroblasts contain a large pool of precursor beta 1-integrin but lack an intracellular pool of mature subunit. EMBO J. 10, 1111-1118;

3. McShan W. M., Rossen R. D., Laughter A. H., Trial J., Kessler D. J., Zendegui J.

4. G., Hogan M. E., Orson F. M. (1992): Inhibition of transcription of HIV-1 in infected human cells by oligodeoxynucleotides designed to form DNA triple helices. J. Biol. Chem. 267 (8). 5712-5721;

5. Hotoda H., Koizumi M., Koga R., Kaneko M., Momota K., Ohmine T., Furukawa

6. Clavel F„ Guyader M., Guetard D„ Salle M., Montagnier L., Alizon M. (1986): Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature 324 (6098), 691-695;

7. Essex M. (1999): Human immunodeficiency viruses in the developing world. Adv Virus Res. 53,71-88;

8. Snasel J., Rejman D., Liboska R., Tocik Z., Ruml T., Rosenberg I., Pichova I. (2001): Inhibition of HIV-1 integrase by modified oligonucleotides derived from U5' LTR. Eur. J. Biochem. 268 (4), 980-986;

9. Tramontano E., La Colla P., Cheng Y.-C. (1998): Biochemical characterization of the HIV-1 integrase 3'-processing activity and its inhibition by phosphorothioate oligonucleotides. Biochemistry 37, 7237-7243;

10. Allen P., Worland S„ Gold L. (1995): Isolation of high-affinity RNA ligands to HIV-1 integrase from a random pool. Virology 209 (2), 327-336;

11. Mazumder A., Neamati N., Ojwang J. O., Sunder S., Rando R. F., Pommier Y. (1996): Inhibition of the human immunodeficiency virus type 1 integrase by guanosine quartet structures. Biochemistry 35, 13762-13771;

12. Kaufmann G. R., Cooper D. A. (2000): Antiretroviral therapy of HIV-1 infection: established treatment strategies and new therapeutic options. Current Opinion in Microbiology 3, 508-514;

13. Geist A., BouHamdan M., Nunnari G., Pomerantz R.J., Kulkosky J. (1999): HIV-1 DNA integration: advancing anti-HIV-1 gene therapy approaches by blocking and modulating the process. Gene Ther. Mol. Biol. 4, 133-141;

14. Turner B.G., Summers M.F. (1999): Structural biology of HIV. J. Mol. Biology 285, 1-32;

15. Frankel A.D., Young J.A. (1998): HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu. Rev. Biochem. 67, 1-25;

16. Brown P.O., Bowerman B., Varmus H.E., Bishop J.M. (1987): Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell 49 (3), 347-356;

17. Bukrinsky M.I., Sharova N., Dempsey M.P., Stanwick T.L., Bukrinskaya A.G., Haggerty S., Stevenson M. (1992): Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (14), 6580-6584;

18. Miller M.D., Farnet C.M., Bushman F.D. (1997): Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71 (7), 5382-5390;

19. Farnet C.M., Bushman F.D. (1997): HIV-1 cDNA integration: requirement of HMG I(Y) protein for function of preintegration complexes in vitro. Cell 88 (4), 483-492;

20. Bushman F.D. (1999): Host proteins in retroviral cDNA integration. Adv. Virus Res. 52, 301-317;

21. Brown P. O. (1990): Integration of retroviral DNA. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 157, 19-48;

22. Carteau S., Hoffmann C., Bushman F. (1998): Chromosome structure and human immunodeficiency virus type 1 cDNA integration: centromeric alphoid repeats are a disfavored target. J. Virol. 72 (5), 4005-4014;

23. Appa R.S., Shin C.G., Lee P., Chow S.A. (2001): Role of the nonspecific DNA-binding region and alpha helices within the core domain of retroviral integrase in selecting target DNA sites for integration. J. Biol. Chem. 276 (49), 45848-45855;

24. Goulaouic H., Chow S.A. (1996): Directed integration of viral DNA mediated by fusion proteins consisting of human immunodeficiency virus type 1 integrase and Escherichia coli Lex A protein. J. Virology 70 (1), 37-46;

25. Bushman F.D, Miller M.D. (1997): Tethering human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes to target DNA promotes integration at nearby sites.

26. J. Virology 71 (1), 458-464;

27. Haren L., Ton-Hoang B., Chandler M. (1999): Integrating DNA: Transposases and Retroviral Integrases. Annu. Rev. Microbiol. 53, 245-281;

28. Eds Coffin J. M., Hughes S. H., Varmus H. E. (1998): Retroviruses. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. Press, 161-203;

29. Brin E., Yi J., Skalka A., Leis J. (2000): Modeling the late steps in HIV-1 retroviral integrase-catalyzed DNA integration. J. Biol. Chem. 275 (50), 39287-39295;

30. Bushman F. D., Craigie R. (1992): Integration of human immunodeficiency virus DNA: adduct interference analysis of required DNA sites. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 3458-3462;

31. Bushman F. D., Craigie R. (1991): Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 1339-1343;

32. Chow S.A, Vincent K.A., Ellison V., Brown P.O. (1992): Reversal of integration and DNA splicing mediated by integrase of human immunodeficiency virus. Science 255, 723-726;

33. Vincent K.A., Ellison V., Chow S.A., Brown P.O. (1993): Characterization of human immunodeficiency virus type 1 integrase expressed in Escherichia coli and analysis of variants with amino-terminal mutations. J. Virology 67 (1), 425-437;

34. Hansen M.S., Smith G.J., Kafri T., Molteni V., Siegel J.S., Bushman F.D. (1999): Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro. Nat. Biotechnology 17, 578-582;

35. Farnet C.M., Wang B. Lipford J.R., Bushman F.D. (1996): Differential inhibition of HIV-1 preintegration complexes and purified integrase protein by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93 (18), 9742-9747;

36. Rice P.A., Baker T.A. (2001): Comparative architecture of transposase and integrase complexes. Nat. Struct. Biol. 8 (4), 302-307;

37. Kulkosky J., Skalka A.M. (1994): Molecular mechanism of retroviral DNA integration. Pharmacol. Ther. 61, 185-203;

38. Engelman A., Bushman F. D„ Craigie R. (1993): Identification of discrete functional domains of HIV-1 integrase and their organization within an active multimeric complex. EMBO J. 12 (8), 3269-3275;

39. Lee S. P, Xiao J., Knutson J. R., Lewis M. S., Han M.K. (1997): Zn2+ promotes the self-association of human immunodeficiency virus type-1 integrase in vitro. Biochemistry 36 (1), 173-180;

40. Cai M„ Zheng R., Caffrey M., Craigie R., Clore G. M., Gronenborn A. M. (1997): Solution structure of the N-terminal zinc binding domain of HIV-1 integrase. Nat. Struct. Biol. 4 (7), 567-577;

41. Eijkelenboom A. P., van den Ent F. M., Wechselberger R., Plasterk R. H., Kaptein R., Boelens R. (2000): Refined solution structure of the dimeric N-terminal HHCC domain of HIV-2 integrase. J. Biomol. NMR 18 (2), 119-128;

42. Wang J. Y., Ling H., Yang W., Craigie R. (2001): Structure of a two-domain fragment of HIV-1 integrase: implications for domain organization in the intact protein. EMBO J. 20 (24), 7333-7343;

43. Schauer M., Billich A. (1992): The N-terminal region of HIV-1 integrase is required for integration activity, but not for DNA-binding. Biochem. Biophys. Res. Comraun. 185 (3), 874-880;

44. Katzman M., Sudol M. (1998): Mapping viral DNA specificity to the central region of integrase by using functional human immunodeficiency virus type 1/visna virus chimeric proteins. J. Virology 72 (3), 1744-1753;

45. Dirac A. M., Kjems J. (2001): Mapping DNA-binding sites of HIV-1 integrase by protein footprinting. Eur. J. Biochem. 268 (3), 743-751;

46. Kim D. J., Lee S. K„ Oh Y. T., Shin C. G. (2000): Minimal core domain of HIV-1 integrase for biological activity. Mol. Cells 10 (1), 96-101;

47. Yang W., Hendrickson W. A., Crouch R. J., Satow Y. (1990): Structure of ribonuclease H phased at 2 Á resolution by MAD analysis of the selenomethionyl protein. Science 249 (4975), 1398-1405;

48. Ariyoshi M., Vassylycv D. G., Iwasaki H., Nakamura H., Shinagawa H., Morikawa K. (1994): Atomic structure of the RuvC resolvase: a holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell 78 (6), 1063-1072;

49. Venclovas C., Siksnys V. (1995): Different enzymes with similar structures involved in Mg(2+)-mediated polynucleotidyl transfer. Nat. Struct. Biology 2 (10), 838-841;

50. Goldgur Y., Dyda P. Hickman A. B, Jenkins T. M., Craigie R., Davies D. R. (1998): Three new structures of the core domain of HIV-1 integrase: an active site that binds magnesium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (16), 9150-9154;

51. Wlodawer A. (1999): Crystal structures of catalytic core domains of retroviral integrases and role of divalent cations in enzymatic activity. Adv. Virus Res. 52, 335-350;

52. Andrake M. D., Skallca A. M. (1996): Retroviral integrase, putting the pieces together. J. Biol. Chem. 271 (33), 19633-19636;

53. Engelman A., Hickman A. B., Craigie R. (1994): The core and carboxyl-terminal domains of the integrase protein of human immunodeficiency virus type 1 each contribute to nonspecific DNA binding. J. Virology 68 (9), 5911-5917;

54. Lutzke R. A., Plasterk R. H. (1998): Structure-based mutational analysis of the C-terminal DNA-binding domain of human immunodeficiency virus type 1 integrase: critical residues for protein oligomerization and DNA binding. J. Virology 72(6), 4841-4848;

55. Lodi P. J., Ernst J. A. Kuszewski J., Hickman A. B., Engelman A., Craigie R., Clore G. M., Gronenborn A. M. (1995): Solution structure of the DNA binding domain of HIV-1 integrase. Biochemistry 34 (31), 9826-9833;

56. Gerton J. L., Brown P. O. (1997): The core domain of HIV-1 integrase recognizes key features of its DNA substrates. J. Biol. Chem. 272 (41), 25809-25815;

57. Gao K., Butler S. L., Bushman F. (2001): Human immunodeficiency virus type 1 integrase: arrangement of protein domains in active cDNA complexes. EMBO J. 20 (13), 3565-3576;

58. Appa R. S., Shin C. G., Lee P., Chow S. A. (2001): Role of the nonspecific DNA-binding region and alpha helices within the core domain of retroviral integrase in selecting target DNA sites for integration. J. Biol. Chem. 276 (49), 45848-45855;

59. Pommier Y., Marchand C., Neamati N. (2000): Retroviral integrase inhibitors year 2000: update and perspectives. Antiviral Res. 47 (3), 139-148;

60. Neamati N., Marchand C., Pommier Y. (2000): HIV-1 integrase inhibitors: past, present, and future. Adv. Pharmacol. 49, 147-165;

61. Field A.K. (1999): Oligonucleotides as inhibitors of human immunodeficiency virus. Curr. Opin. Mol. Ther. 1 (3), 323-331;

62. Jones P.S. (1998): Strategies for antiviral drug discovery. Antivir. Chem. Chemother. 9 (4), 283-302;

63. Agarwal R. P., Mian A. M. (1991): Thymidine and zidovudine metabolism in chronically zidovudine-exposed cells in vitro. Biochem. Pharmacol. 42 (4), 905-911;

64. Mazumder A., Cooney D., Agbaria R., Gupta M., Pommier Y. (1994): Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 integrase by 3'-azido-3'-deoxythymidylate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (13), 5771-5775;

65. Mazumder A., Neamati N., Sommadossi J-P., Gosselin G., Schinazi R. F., Imbach J-L., Pommier Y. (1996): Effects of nucleotide analogues on human immunodeficiency virus type 1 integrase Mol. Plarmacol. 49, 621-628;

66. Farnet C.M., Wang B„ Lipford J.R., Bushman F.D. (1996): Differential inhibition of HIV-1 preintegration complexes and purified integrase protein by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9742-9747;

67. Drake R. R., Neamati N., Hong H., Pilon A., Sunthankar P., Hume S. D„ Milne G. W., Pommier Y. (1998): Identification of a nucleotide binding site in HIV-1 integrase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4170-4175;

68. Lipford J. R., Worland S. T., Farnet C. M. (1994): Nucleotide binding by the HIV-1 integrase protein in vitro. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 7 (12), 1215-1223;

69. Esposito D., Craigie R. (1998): Sequence selectivity of viral end DNA binding by HIV-1 integrase reveals critical regions for protein-DNA interactions. EMBO J. 17, 5832-5843;

70. Zhang J., Neamati N. Pommier Y., Nair V. (1998): Inhibition of HIV integrase by novel nucleotides bearing tricyclic bases. Bioorganic and Medical Chemistry Letters 8, 1887-1890;

71. Taktakishivli M., Neamati N., Pommier Y., Nair V. (2000): Recognition and inhibition of HIV integrase by novel dinucleotides. J. Am. Chem. Soc. 122, 56715677;

72. Taktakishvili M., Neamati N., Pommier Y., Nair V. (2000): Discovery of a nuclease-resistant, non-natural dinucleotide that inhibits HIV-1 integrase. Bioorg. Med. Chem. Letters 11, 1433-1435;

73. Taktakishivli M., Neamati N., Pommier Y., Nair V. (2000): Recognition and Inhibition of HIV Integrase by a Novel Dinucleotide. Bioorg. Med. Chem. Letters 10,249-251;

74. Mouscadet J-F., Carteau S., Goulaouic H., Subra F., Auclair C. (1994): Triplex-mediated inhibition of HIV DNA integration in vitro. J. Biol. Chem. 269, 2163521638;

75. Mouscadet J-F., Ketterie C„ Goulaouic H., Carteau S., Subra F., Le Bret M., Auclair, C. (1994): Triple helix formation with short oligonucleotide-intercalator conjugates matching the HIV-1 U3 LTR end sequence. Biochemistry 33, 41874196;

76. Bouziane M., Cherny D., Mouscadet J.-F., Auclair C. (1996): Alternate strand DNA triple helix-mediated inhibition of HIV-1 U5 long terminal repeat integration in vitro. J. Biol. Chem. 271, 10359-10364;

77. Felsenfeld G., Davies D.R., Rich A. (1957): Formation of a three-stranded polynucleotide molecule. J. Am. Chem. Soc. 79, 2023-2024;

78. Casey B.P., Glazer P.M. (2001): Gene targeting via triple-helix formation. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 67, 163-192;

79. Moser H.E., Dervan P.B. (1987): Sequence-spesific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science 238, 645-650;

80. Chan P.P., Glazer P.M. (1997): Triplex DNA: fundamentals, advances, and potential applications for gene therapy. J. Mol. Med. 75 (4), 267-282;

81. Brunar, H. and Dervan, P.B. (1996): Sequence composition effects on the stabilities of triple helix formation by oligonucleotides containing N7-deoxyguanosine. Nucleic.Acids.Res. 24, 1987-1991;

82. Berressem R., Engels J. W. (1995): 6-Oxocytidine a novel protonated C-base analogue for stable triple helix formation. Nucleic Acid Res. 23 (17), 3465-34726;

83. Kandimalla E.R., Manning A.N., Venkataraman G., Sasisekharan V., Agrawal S. (1995): Single strand targeted triplex formation: targeting purine-pyrimidine mixed sequences using abasic linkers. Nucleic Acids Res. 23 (21), 4510-4517;

84. Gowers D.M., Fox K.R. (1999): Towards mixed sequence recognition by triple helix formation. Nucleic Acids Res. 27 (7), 1569-1577;

85. Vasquez K.M., Wilson J.H. (1998): Triplex-directed modification of genes and gene activity. Trends Biochem. Sci. 23 (1), 4-9;

86. Diviacco S., Rapozzi V., Xodo L., Helene C., Quadrifoglio F., Giovannangeli C. (2001): Site-directed inhibition of DNA replication by triple helix formation. FASEB J. 15 (14), 2660-2668;

87. Floris R., Scaggiante B., Manzini G., Quadrifoglio F., Xodo L.E. (1999): Effect of cations on purine.purine.pyrimidine triple helix formation in mixed-valence salt solutions. Eur.J.Biochem. 260, 801-809;

88. Olivas W. M., Maher L. G. (1994): DNA recognition by alternate strand triple helix formation: affinities of oligonucleotides for a site in the human p53 gene. Biochemistry 33, 983-991;

89. Home D. A., Dervan P.B. (1990): Recognition of mixed sequence duplex DNA by alternate-strand triple helix formation. J. Am. Chem. Soc. 112, 2435-2437;

90. Giovannangeli C., Helen C. (1997): Progress in developments of triplex-based strategies. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 413-421;

91. Brodin P., Gottikh M., Auclair C., Mouscadet J-F. (1999): Inhibition of HIV-1 integration by mono- and bi-functionalized triple helix forming oligonucleotides. Nucleosides & Nucleotides 18, 1717-1718;

92. Sun S. (2000): Technology evaluation: SELEX, Gilead Sciences Inc. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (1), 100-105;

93. Gold L., Brown D. He Y„ Shtatland Т., Singer B.S., Wu Y. (1997): From oligonucleotide shapes to genomic SELEX: novel biological regulatory loops. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 59-64;

94. Копылов A.M., Спиридонова B.A. (2000): Комбинаторная химия нклеиновых кислот: SELEX. Молекулярная биология 34 (6), 1097-1113;

95. Kerwood D. J., Cavaluzzi M. J., Borer P. N. (2001): Structure of SL4 RNA from the HIV-1 packaging signal. Biochemistry 40 (48), 14518-14529;

96. Regalia M., Rosenblad M. A., Samuelsson T. (2002): Prediction of signal recognition particle RNA genes. Nucleic Acids Res. 30 (15), 3368-3367;

97. Belanger F., Leger M. Saraiya A. A., Cunningham P. R., Brakier-Gingras L. (2002): Functional studies of the 900 tetraloop capping helix 27 of 16S ribosomal RNA.

98. J. Mol. Biol. 320 (5), 979-989;

99. Ojwang J. O., Elbaggari A., Marshall H. В., Jayaraman K., McGrath M. S., Rando R. F. (1994): Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 activity in vitro by oligonucleotides composed entirely of guanosine and thymidine. J. AIDS 7, 560570;

100. Bishop J. S., Guy-Caffey J. K., Ojwang J. O., Smith S. R., Hogan M. E, Cossum P. A., Rando R. F., Chaudhary N. (1996): Intramolecular G-quartet motifs confer nuclease resistance to a potent anti-HIV oligonucleotide. J. Biol. Chem. 271, 569856703;

101. Cherepanov P., Este J. A., Rando R. F., Ojwang J. O., Reekmans G., Steinfeld R., David G., De Clercq E., Debyser Z.(1997): Mode of interaction of G-quartets with the integrase of human immunodeficiency virus type 1. Mol. Pharmacology 52, 771-780;

102. Jing N„ Marchand C„ Liu J., Mitra R., Hogan M. E., Pommier Y. (2000): Mechanism of inhibition of HIV-1 integrase by G-tetra forming oligonucleotides. J. Biol. Chem. 275, 21460-21467;

103. Jing N., Rando R. F., Pommier Y., Hogan M. E. (1997): Ion selective folding of loop domains in a potent anti-HIV oligonucleotide. Biochemistry 36, 12498-12505;

104. Wallace T. L., Gamba-Vitalo C., Loveday K. S., Cossum P. A. (2000): Acute, multiple-dose, and genetic toxicology of AR177, an anti-HIV oligonucleotide. Toxicol. Sci. 53 (1), 63-70;

105. Balakrishnan M., Jonsson C.B. (1997): Functional identification of nucleotides conferring substrate specificity to retroviral integrase reactions. J. Virology 71, 1025-1035;

106. Majumdar C., Stein C. A., Cohen J. S., Broder S., Wilson S. H. (1989): Stepwise mechanism of HIV reverse transcriptase: primer function of phosphorothioate oligodeoxynucleotide. Biochemistry 28, 1340-1346;

107. Stein C. A., Neckers L., Nair B., Mumbauer S., Hoke G., Pal R. (1991): Phosphorothioate oligodeoxycytidine interferes with binding of HIV-1 gpl20 to CD4. J. AIDS 4, 686-693;

108. Yakubov L., Khaled Z., Zhang L.-M., Truneh A., Vlassov V., Stein C. A. (1993): Oligodeoxynucleotides interact with recombinant CD4 at multiple sites. J. Biol. Chem. 268, 18818-18823;

109. Stein C. A., Tonkinson J. L., Yakubov L. (1991): Phosphorothioate oligodeoxynucleotides anti-sense inhibitors of gene expression? Pharmacol. Ther. 52,365-384;

110. Stein C. A. (1996): Exploiting the potential of antisense: beyond phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Chemistry & Biology 3, 319-323;

111. Pemberton I. K., Buc H., Buckle M. (1998): Displacement of viral DNA termini from stable HIV-1 integrase nucleoprotein complexes induced by secondary DNA-binding interactions. Biochemistry 37, 2682-2690;

112. Wickstrom E. (1986): Oligodeoxynucleotide stability in subcellular extracts and culture media. J. Biochem. Biophys. Methods 13, 97-102;

113. Mahato R.I., Takakura Y., Hashida M. (1997): Development of targeted delivery systems for nucleic acid drugs. J. Drug Target 4, 337-357;

114. Giraldo R., Suzuki M„ Chapman L., Rhodes D. (1994): Promotion of parallel DNA quadruplexes by a yeast telomere binding protein: a circular dichroism study. Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, 7658-7662;

115. Fang G., Cech T.R. (1993): The beta subunit of Oxytricha telomere-binding protein promotes G-quartet formation by telomeric DNA. Cell 74, 875-885;

116. Shafer R.H., Smirnov I. (2000-2001): Biological aspects of DNA/RNA quadruplexes. Biopolymers 56 (3), 209-227;

117. Jaasena S.D., Johnston B.H. (1992): Oligonucleotide-directed triple-helix formation at adjacent oligopurine and oligopyrimidine DNA tracts by alternate strand recognition. Nucleic Acids Res. 20, 5279-5288;

118. Brodin P., Sun J.S., Mouscadet J.F., Auclair C. (1999): Optimization of alternatestrand triple helix formation at the 5'-TpA-3' and 5'-ApT-3' junctions. Nucleic Acids Res. 27 (15), 3029-3034;

119. Shchyolkina A.K., Borisova O.F. (1997): Stabilizing and destabilizing effects of intercalators on DNA triplexes. FEBS Letters 419 (1), 27-31;

120. Ивановская M. Г., Готтих M. Б., Шабарова З.А. (1987): Активные эфиры олигонуклеотидов новый тип фосфорилирующих агентов в водной среде. Докл. АН СССР 293 (2), 477-481;

121. Rippe K., Fritsch V., Westhof E., Jovin T. M. (1992): Alternating d(G-A) sequences form a parallel-stranded DNA homoduplex. EMBO J. 11, 3777-3786;

122. Olivas W.M., Maher L.J. (1995): Competitive triplex/quadruplex equilibria involving guanine-rich oligonucleotides. Biochemistry 34, 278-284;

123. Porumb H., Monnot M., Fermandjian S. (2002): Circular dichroism signatures of features simultaneously present in structured guanine-rich oligonucleotides: A combined spectroscopic and electrophoretic approach. Electrophoresis 23 (7-8), 1013-1020;

124. Kypr J., Vorlickova M. (2002): Circular dichroism spectroscopy reveals invariant conformation of guanine runs in DNA. Biopolymers 67 (4-5), 275-277;

125. Mergny J. L., Phan A. T., Lacroix L. (1998): Following G-quartet formation by UV-spectroscopy. FEBS Letters 435, 74-78;

126. Germann M.W., Kalisch B.W., van de Sande J.H. (1998): Structure of d(GT)n.d(GA) sequences: formation of parallel stranded duplex DNA Biochemistry 37. 12962-12970;

127. Carteau S., Mouscadet J.-F., Goulaouic H., Subra F., Auclair C. (1993): Quantitative in vitro assay for human immunodeficiency virus deoxyribonucleic acid integration. Arch. Biochem. Biophys. 300 (2), 756-760;

128. Deprez E., Taue P., Leh H., Mouscadet J-F., Auclair Ch., Brochón J-C. (2000): Oligomeric states of the HIV-1 integrase as measured by time-resolved fluorescence anisotropy. Biochemistry 39 (31), 9275-9284;

129. Vorlícková M., Kejnovská I., Kovanda J., Kypr J. (1999): Dimerization of the guanine-adenine repeat strands of DNA. Nucleic Acids Res. 27 (2), 581-586;

130. Smith F. W., Feigon J. (1992): Quadruplex structure of Oxytricha telomeric DNA oligonucleotides. Nature 356, 164-168;

131. Lin K-Y., Matteucci M. (1991): Hybridization properties of deoxyoligonucleotides containing antraquinone pseubonucleosides. Nucleic Acids Res. 19 (11), 3111-3114;

132. Zhao H., Neamati N. Hong H., Mazumder A., Wang S., Sunder S., Milne G., Pommier Y., Burke T. (1997): Arylamide inhibitors of HIV-1 integrase. J. Med. Chem. 40, 242-249;

133. Haugan I.R., Nilsen B.M., Worland S., Olsen L„ Heiland D.E. (1995): Characterization of the DNA-binding activity of HIV-1 integrase using a filter binding assay. Biochem. & Biophys. Comm. 217 (3), 802-810;

134. Molnar G., O'Leary N„ Pardee A., Bradley D. (1995): Quantification of DNAprotein interaction by UV crosslinking. Nucleic Acids Res. 23 (16), 3318-3326;