ДНК-дуплексы с серосодержащими и иодацетамидными группами в сахарофосфатном остове как реагенты для ковалентного связывания с НК-узнающими белками тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Условные сокращения.

Введение.

I. Серосодержащие НК. Синтез, химическое поведение в супрамолекулярных комплексах биополимеров, биологические свойства. литературный обзор/.

1.1. Серосодержащие аналоги межнуклеотидной фосфодиэфирной связи.

1.1.1. Химическое лигирование как метод введения 3'-0-P(0)(0")-S-CH2-5' и 3'-0-P(0)(0")-S-CH2-C(0)NH-5' связей в сахарофосфатный остов олигонукл еотид ов.

1.1.2. Химическое лигирование как метод зондирования нуклеотидных последовательностей в одно- и двуспиральных

ДНК-мишенях.

1.1.3. Химические и биологические свойства олигонуклеотидов, содержащих межнуклеотидные тиофосфатные группы.

1.2. Нуклеиновые кислоты, содержащие дисульфидные мостики.

1.2.1. Введение дисульфидных связей в заданные участки односпиральных ДНК.

1.2.2. Дисульфидные "сшивки" между концевыми звеньями двух- и трехспиральных ДНК.

1.2.3. ДНК-дуплексы с ковалентно связанными цепями. Дисульфидные связи между внутренними участками двойной спирали.

1.2.4. Внутримолекулярные дисульфидные мостики в молекулах РНК. Зондирование третичной структуры и динамики конформационных перестроек.

1.2.5. Сравнительный анализ матрично-зависимых и внедуплексных реакций, в которых принимают участие серосодержащие олигонуклеотиды.

1.3. Дисульфидные "сшивки" между белками и нуклеиновыми кислотами.

II. ДНК-дуплексы с серосодержащими и иодацетамидными группами в сахарофосфатном остове как реагенты для ковалентного связывания с

НК-узнающими белками. /Обсуждение результатов/.

II.1. Характеристика белка-мишени.

11.2. Дизайн ДНК-дуплексов и выбор участков модификации.

11.3. Изучение термостабильности шпилечных дуплексов.

11.4. Синтез и свойства ДНК-дуплексов с тризамещёнными тиопирофосфатными межнуклеотидными группами, содержащими мостиковый кислород.

11.4.1. Получение S-этиловых эфиров тиофосфатов олигонуклеотидов.

11.4.2. Сравнительная характеристика серо- и кислородсодержащих тризамещённых пирофосфатных межнуклеотидных связей в шпилечных дуплексах получение и свойства).

11.4.3. Связывание ДНК-дуплексов, содержащих ТЗТП группу, с фактором транскрипции NF-kB.

11.5. "Жесткие" и "мягкие" нуклеофилы и электрофилы. Химический запрет на получение ДНК-дуплексов с ТЗТП-группами с мостиковой серой.

11.6. Модифицированные ДНК-дуплексы как потенциальные реагенты для ковалентного связывания с цистеинсодержащими белками.

11.6.1. ДНК, содержащие дифосфорилдисульфидную группировку (pSSp): вместо одной из фосфодиэфирных связей.

11.6.1.1. Синтез олигонуклеотидов с pSSp-связью в заданном положении углеводофосфатного остова.

11.6.1.2. Свойства олигонуклеотидов, содержащих pSSp в углеводофосфатном шпилечном остове.

11.6.1.3. Комплексообразование ДНК-дуплексов, содержащих pSSp-связь, с фактором транскрипции NF-kB.

11.6.2. ДНК-дуплексы содержащие единичные монофосфорилдисульфидные связи (pSS).

11.6.2.1. Синтез олигонуклеотидов, содержащих pSS-связь в заданном положении углеводофосфатного остова.

11.6.2.2. Свойства олигонуклеотидов, содержащих pSS-связь в углеводофосфатном остове.

11.6.2.3. Нековалентное связывание ДНК-дуплексов, содержащих pSS-связь, с фактором транскрипции NF-kB.

11.6.2.4. Ковалентное связывание ДНК-дуплексов, содержащих pSSp- или pSS-связи, с функционально-важными белками.

II. 6.3. ДНК-дуплексы, содержащие иодацетамидную группировку в

2'-положении сахарного остатка.

П.6.3.1. Получение олигонуклеотидов с единичной иодацетамидной группой в 2'-положении рибозного кольца.

11.6.3.2. Свойства олигонуклеотидов, содержащих иодацетамидную группировку в 2'-положении углеводного остова.

11.6.3.3. Изучение термической устойчивости ДНК-дуплексов, содержащих 2'-амино-2'-дезоксирибоуридиновые звенья.

11.6.3.4. Комплексообразование иодацетамидных производных ДНК-дуплексов с фактором транскрипции NF-kB.

11.6.3.5. Ковалентное связывание иодацетамидных производных

ДНК-дуплексов с фактором транскрипции NF-kB.

Экспериментальная часть.

Выводы.

Модифицированные олигонуклеотиды и их двуспиральные комплексы являются в настоящее время важнейшим инструментом структурно-функциональных исследований биополимеров, а также прикладной биотехнологии. В связи с этим, получение направленно модифицированных нуклеиновых кислот является актуальной задачей современной биоорганической химии. Настоящая работа посвящена разработке одного из перспективных направлений в этой области - постсинтетическому введению в заданное положение олигонуклеотидной двойной спирали химически активных групп. Подобные "реакционноспособные" ДНК-дуплексы, являющиеся структурными аналогами белковых субстратов, могут образовывать ковалентную связь с определёнными аминокислотными остатками непосредственно в активном центре или участке связывания белков, причём без дополнительных внешних воздействий. Благодаря таким свойствам модифицированные ДНК-дуплексы могут использоваться для получения детальной информации о структуре и функционировании белков и ферментов, а также в качестве ингибиторов ферментов и регуляторных белков in vitro. В случае решения проблемы эффективной доставки нуклеиновых кислот в клетки и повышения их устойчивости к нуклеазной деградации, они могут рассматриваться как потенциальные терапевтические средства, контролирующие экспрессию патогенов. До сих пор единственными соединениями подобного рода являлись предложенные и изученные в Московском университете (в лаборатории нуклеиновых кислот) ДНК- и РНК-дуплексы с химически активными тризамещёнными пирофосфатными (ТЗП) [1-3] и ацилфосфатными межнуклеотидными группировками [4,5]. Такие дуплексы -реагенты, способные ковалентно связываться с белками через остатки лизина и гистидина, были успешно использованы для аффинной модификации ферментов рестрикции-модификации [2,6], фактора транскрипции NF-kB [1,7] и РНК-узнающего Tat-пептида вируса иммунодефицита человека [8].

В настоящей работе предполагается расширить арсенал химически активных группировок, которые могли бы взаимодействовать не только с вышеуказанными аминокислотами. Наше внимание привлекли такие высокореакционноспособные дуклеофилы, как тиоловые группы остатков цистеина белков. Известно, что тиоловые группы цистеина, благодаря их диссоциации с образованием тиолят-иона, легко алкилируются и вступают в реакцию дисульфидного обмена при физиологических значениях рН [9]. Анализ литературных данных позволил предположить, что весьма перспективными в этом плане могут оказаться дисульфидные и йодацетамидные группы, введенные в углеводофосфатный остов ДНК. Локализация активной группы на периферии двойной 6 спирали без затрагивания гетероциклических оснований, задействованных в образовании комплементарных пар и специфических белково-нуклеиновых контактов, не будет мешать образованию прочного комплекса белок-ДНК. В ходе выполнения этой работы наше особое внимание было сфокусировано на синтезе и химическом поведении серосодержащих аналогов ДНК. Мало отличаясь по геометрическим параметрам от природных прототипов, они демонстрируют такой комплекс химических свойств, который может позволить создать соединения, способные эффективно взаимодействовать с боковыми радикалами нуклеофильных аминокислот и цистеина. Поэтому наряду с ДНК-реагентами, содержащими 3'-pSSR-5' межнуклеотидные связи, (где R= фосфатная или СНг-группы), были сконструированы и исследованы серосодержащие аналоги ТЗП-группировок. Введение атома серы в фосфатную функцию олигонукдеотида приводит к тому, что такой олигонуклеотидный компонент становится лучшей уходящей группой, по сравнению с кислородсодержащей, в реакциях с нуклеофилами. Мы ожидали, что серосодержащие аналоги ТЗП-группы окажутся более активными, чем ранее предложенные соединения. Для изучения обратимого и необратимого (ковалентного) связывания с ДНК-дуплексами, маркированными химически активными группировками, был выбран транскрипционный фактор человека NF-кВ. Согласно данным PC А, этот белок содержит в участке связывания с ДНК три остатка лизина и один остаток цистеина.

Работа содержит литературный обзор, посвященный матрично-направленным реакциям НК-НК и НК-белок с участием серосодержащих функциональных групп.

I. Серосодержащие HK. Синтез, химическое поведение в супрамолекулярных комплексах биополимеров, биологические свойства.

Литературный обзор/ Модифицированные олигонуклеотиды и их двуспиральные комплексы широко используются в качестве прецизионных инструментов для исследования тонких биологических процессов, связанных с реализацией генетической информации, а также в биотехнологической практике. Они позволяют изучать структурно-функциональные аспекты белково-нуклеиновых взаимодействий, природу контактов НК - белок, конформационную динамику НК и др. С помощью синтетических подходов можно придавать модифицированным олигонуклеотидам такие полезные свойства, как устойчивость к нуклеазной деградации, способность необратимо связываться с регуляторными белками и ферментами, проникать через клеточную мембрану, специфически расщеплять НК и др.

Наше внимание привлекли серосодержащие производные олигонуклеотидов. Известно, что аналоги НК, в которых вместо мостикового кислорода в сахарофосфатном остове находится атом серы (эти атомы близки по геометрическим размерам и распределению зарядов), нашли широкое применение при зондировании участков связывания белков, ферментов и металлов с НК. В результате выяснены важные закономерности процессов расщепления фосфодиэфирных связей, катализируемых ферментами и рибозимами [10,11]. В последние годы устойчиво растет интерес исследователей к дисульфидсодержащим аналогам НК, поскольку межцепочечные дисульфидные "сшивки" дают возможность зондировать третичную структуру и контролировать конформационную свободу биополимеров, существенно не меняя их нативную конформацию [12,13]. Это особенно важно при изучении ДНК-связывающих белков, для функционирования которых необходимо разделение комплементарных цепей.

В настоящем обзоре рассмотрены различные типы направляемых вторичной (третичной) структурой химических реакций с участием серосодержащих олигонуклеотидов, а также методы введения серосодержащих группировок в заданные участки биополимеров -сахарофосфатный остов ДНК, между гетероциклическими основаниями одной цепи или между комплементарными цепями ДНК, между сближенными в третичной структуре фрагментами РНК, а также между олигонуклеотидами и белковыми молекулами. Особое внимание уделено специфическим химическим свойствам серосодержащих функциональных групп и новым чертам химического поведения, обусловленным эффектами близкодействия. В обзоре рассмотрены химические методы образования ковалентных связей между реагирующими фрагментами в условиях существования супрамолекулярного комплекса водные растворы, низкая температура, значения рН, близкие к нейтральным); в отличие от ферментативного химический подход позволяет использовать более широкий круг "субстратов". Параллельно оценена возможность протекания некоторых типов реакций вне супрамолекулярных систем. Охарактеризованы особенности вторичной структуры комплексов НК - НК и НК - белок, которые использовались для проведения химического лигирования и ковалентного связывания с белком, а также химические свойства модифицированных соединений и перспективы их использования (или использования предложенных для их получения подходов) в молекулярно- биологических исследованиях.

В обзор не включены многочисленные работы по синтезу широко используемых в "антисмысловой" биотехнологии олигонуклеотидов с межнуклеотидными тиофосфатными группами, а также исследования фотохимических радикальных процессов с участием серосодержащих производных, поскольку химизм таких превращений до сих пор неясен.

108 Выводы

1. Разработан эффективный метод получения новых типов реакционноспособных ДНК-дуплексов для ковалентного связывания с НК-узнающими белками через остатки лизина и цистеина. Активные группировки представлены тризамещенными тиопирофосфатными производными различной конфигурации с мостиковым кислородом, монофосфорилдисульфидной и дифосфорилдисульфидной межнуклеотидными связьями, иодацетамидной функцией, локализованной в 2'-положении рибозного фрагмента.

2. Показано, что тризамещенные тиопирофосфатные группы с мостиковой серой невозможно получить с помощью стандартных методов химического лигирования, успешно используемых для получения других модифицированных связей.

3. Синтезирована серия мономодифицированных ДНК-дуплексов, содержащих участок узнавания фактора транскрипции человека NF-кВ, различающихся положением активных групп вдоль цепи. Показано, что внутренняя комплементарная матрица шпилечных ДНК-реагентов не только стабилизирует двойную спираль, но и защищает pSSp-содержащие олигомеры от рекомбинации. Одноцепочечные ДНК, имеющие в своем составе межнуклеотидные pSS-связи, не склонны к постсинтетической рекомбинации.

4. Изучены химические свойства ДНК-дуплексов с серосодержащими межнуклеотидными связями по отношению к низкомолекулярным нуклеофилам, аминокислотам, а также трипептиду глутатиону. Установлено направление атаки нуклеофила на дизамещенный фосфатный остаток в тризамещенной тиопирофосфатной группировке, или атом серы, связанный с метиленовой группой в pSS-мостике.

5. Показано, что ДНК-дуплекс, содержащий тризамещенную тиопирофосфатную группу, способен ковалентно связываться с субъединицей р50 фактора транскрипции человека NF-кВ, причем в реакции эффективно участвуют оба изомера, различающиеся положением (3'- или 5'-) тризамещенного фосфатного остатка.

6. Установлено, что ДНК-дуплексы с 2'-иодацетамидной группой являются перспективными реагентами для ковалентного связывания с НК-узнающими белками через остатки цистеина.

1. Kozlov I.A., Kubareva Е.А., Ivanovskaya M.G., Shabarova Z.A. Design of new reagents on the base of DNA duplexes for irreversible inhibition of transcription factor NF-kappa В // Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. P. 279-289.

2. Кузнецова С.А., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. X. Направленное введение ацилфосфатных связей в структуру ДНК. //Биоорган, химия. 1991. Т. 17. С. 1633-1639.

3. Shefluan G.Ya., Kubareva Е.А., Kuznetsova S.A., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S., Shabarova Z.A. Cross-linking of SsoII restriction endonuclease to cognate and non-cognate DNAs. //FEBS Lett. 1996. V. 390. P. 307-310.

4. Козлов И.А., Кубарева E.A., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. Определение положения контактов фактора транскрипции NF-kB с ДНК методом региоселективного ковалентного связывания. // Молекулярная биол. 1997. Т. 31. № 1. С. 63-73.

5. Степанов B.M. Структура и функции белков. Москва: «Высшая школа». 1996. С. 192-195.

6. Herschlag D., Piccirilli J.A., Cech T.R. Ribozyme-catalyzed and nonenzymatic reactions of phosphate diesters: rate effects upon substitution of sulfur for a nonbridging phosphoryl oxygen atom. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 4844-4854.

7. Kuimelis R.G., McLaughlin L.W. Ribozyme-mediated cleavage of a substrate analogue containing an internucleotide-bridging 5'-phosphorothioate: evidence for the single-metal model. //Biochemistry. 1996. V. 35. P. 5308-5317.

8. Cohen S.B., Cech T.R. Dynamics of thermal motion within a large catalytic RNA investigated by cross-linking with thiol-disulfide interchange. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 62596268.

9. Maglott E.J., Glick G.D. Probing structural elements in RNA using engineered disulfide crosslinks. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1301-1308.

10. Долинная Н.Г., Шабарова З.А. Химическое лигирование как метод сборки двутяжевых нуклеиновых кислот, модификация и исследование локальной структуры. // Изв. Акад. Наук. Сер. Химическая. 1996. № 8. С. 1889-1911.

11. Shabarova Z.A. Chemical development in the design of oligonucleotide probes for binding to DNA and RNA. // Biochemie. 1988. V. 70. P. 1323-1334.

12. Ошевский С.И. Химическое и ферментативное лигирование 5'-тиофосфатов олигодезоксирибонуклеотидов. // Докл. Акад. Наук. Сер. Биохимия. 1990. Т. 310. С. 233236.

13. Price С.С., Gaucher G. М„ Konery P. et al. Relative reactivities for monofunctional nitrogen mustard alkylation of nucleic acid components. // Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 166. P. 327359.

14. Herrlein M.K., Nelson J.S., Letsinger R.L. A covalent lock for self-assembled oligonucleotide conjugates. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 10151-10152.

15. Xu Y., Kool E.T. Chemical and enzymatic properties of bridging 5'-S-phosphorothioester linkages in DNA. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 3159-3164.

16. Xu Y., Kool E.T. High sequence fidelity in a non-enzymatic DNA autoligation reaction. // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 875-881.

17. Barone A.D., Tang J.-Y., Caruthers M.H. In situ activation of bis-dialkylaminophosphines a new method for synthesizing deoxyoligonucleotides on polimer supports. // Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 4051-4061.

18. Xu Y., Kool E.T. A novel 5'-iodonucleoside allows efficient nonenzymatic ligation of single-stranded and duplex DNAs. // Tetrahedron Lett. 1997. V. 38. P. 5595-5598.

19. Gryaznov S.M., Schultz R., Chaturvedi K., Letsinger R.L. Enhancement of selectivity in recognition of nucleic acids via chemical autoligation. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 2366-2369.

20. Herrlein M.K., Letsinger R.L. Selective chemical autoligation on a double-stranded DNA template. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 5076-5078.

21. Wilk A., Stec WJ. Analysis of oligo(deoxynucleoside phosphorothioate)s and their diastereomeric composition. //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 530-534.

22. Scott E.C., Uhlenbeck O.C. A re-investigation of the thio effect at the hammerhead cleavage site. // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 479-484.

23. Slim G., Gait M.J. Configurationally defined phosphorothioate-containing oligoribonucleotides in the study of the mechanism of cleavage of hammerhead ribozymes. // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1183-1188.

24. Mayer A.N., Barany F. Photoaffinity cross-linking of TaqI restriction endonuclease using an aryl azide linked to the phosphate backbone. // Gene. 1995. V. 153. P. 1-8.

25. Crooke S.T. Vitravene-another piece in the mosaic. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1998. V. 8. P. 115-122.

26. Krieg A.M., Stein C.A. Phosphorothioate oligodeoxynucleotides: antisense or anti-protein? // Antisense Res. Dev. 1995. V. 5. P. 241.

27. Matteucci M.D., Caruthers M.H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. 1981. // Biotechnology. 1992. V. 24 P. 92-8.

28. Kuimelis R.G., McLaughlin L.W. Ribozyme-mediated cleavage of a substrate analogue containing an internucleotide-bridging 5'-phosphorothioate: evidence for the single-metal model. //Biochemistry. 1996. V. 35. P. 5308-5317.

29. Kuimelis R.G., McLaughlin L.W. Cleavage properties of an oligonucleotide containing a bridged internucleotide 5'-phosphorothioate RNA linkage. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4753-4760.

30. Mag M., Luking S., Engels J.W. Synthesis and selective cleavage of an oligodeoxynucleotide containing a bridged internucleotide 5'-phosphorothioate linkage. // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1437-1441.

31. Vyle J.S., Connolly B.A., Kemp D., Cosstick R. Sequence- and strand-specific cleavage in oligodeoxyribonucleotides and DNA containing 3'-thiothymidine. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 3012-3018.

32. Gryaznov S.M., Letsinger R.L. Template controlled coupling and recombination of oligonucleotide blocks containing thiophosphoryl groups. // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 1403-1408.

33. Dolinnaya N., Metelev V., Oretskaya T. Et al. Hairpin-shaped DNA duplexes with disulfide bonds in sugar-phosphate backbone as potential DNA reagents for crosslinking with proteins. // FEBS Lett. 1999. V. 444. P. 285-290.

34. Ueno Y., Nakagawa A., Matsuda A. Nucleosides and nucleotides. 165. Chemical ligation of oligodeoxynucleotides having a mercapto group at the 5-position of 2'-deoxyuridine via a disulfide bond. //Nucleosides and Nucleotides. 1998. V. 17. P. 283-289.

35. Cain R.J., Zuiderweg E.R.P., Glick G.D. Solution structure of a DNA hairpin and its disulfide cross-linked analog. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 2153-2160.

36. Cain R.J., Glick G.D. The effect of cross-links on the conformational dynamics of duplex DNA. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 836-842.

37. Osborne S.E., Cain R.J., Glick G.D. Structure and dynamics of disulfide cross-linked DNA triple helices. //J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 1171-1182.

38. Cain R.J., Glick G.D. Use of cross-links to study the conformational dynamics of triplex DNA. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 1456-1464.

39. Radhakrishnan I., Patel D.J. DNA triplexes: solution structures, hydration sites, energetics, interactions, and function. //Biochemistry. 1994. V. 33. P. 11405-11417.

40. Azhayeva E., Azhayev A., Guzaev A. et al. Looped oligonucleotides from stable hybrid complexes with a single-stranded DNA. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 1170-1176.

41. Wang S., Booher M.A., Kool E.T. Stabilities of nucleotide loops bridging the pyrimidine strands in DNA pyrimidine.purine.pyrimidine triplexes: special stability of the CTTTG loop. // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 4639-4644.

42. Ferentz A.E., Verdine G.L. Disulfide cross-linked oligonucleotides. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. P. 4000-4002.

43. Erlanson D. A., Chen L., Verdine G.L. DNA methylation through a locally unpaired intermediate. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 12583-12584.

44. Анцыповиц С.И., Орецкая T.C. Двуспиральные нуклеиновые кислоты с ковалентно связанными цепями синтез и применение в молекулярной биологии. II Успехи химии. 1998. Т. 67. С. 274-293.

45. Wang Н., Osborne S.E., Zuiderweg E.R.P., Glick G.D. Three-oimensional structure of a disulfide-stabilized non-ground-state DNA hairpin. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 50215022.

46. Wolfe S.A., Ferentz A.E., Grantcharova V. et al. Modifying the helical structure of DNA by design: recruitment of an architecture-specific protein to an enforced DNA bend. // Chem. Biol. 1995. V. 2. P. 213-221.

47. Erlanson D.A., Glover J.N.M., Verdine G.L. Disulfide cross-linking as a mechanistic probe for the B<-*Z transition in DNA. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 6927-6928.

48. Allerson C.R., Chen S.L., Verdine G.L. A chemical method for site-specific modification of RNA: the convertible nucleoside approach. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 7423-7433.

49. Allerson C.R., Verdine G.L. Synthesis and biochemical evaluation of RNA containing an intrahelical disulfide crosslink. // Chem. Biol. 1995. V. 2. P. 667-675.

50. Coodwin J.T., Osborne S.E, Scholle E.J., Glick G.D. Design, synthesis and analysis of Yeast tRNAPhe analogs possessing Intra- and Interhelical disulfide cross-links. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 5207-5215.

51. Sigurdsson S.Th., Tuschl Т., Eckstein F. Probing RNA tertiary structure: interhelical crosslinking of the hammerhead ribozyme. // RNA. 1995. V. 1. P. 575-581.

52. Chu B.C.F., Orgel L.E. Ligation on oligonucleotides to nucleic acids or proteins via disulfide bonds. //Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 3671-3691.

53. Dolinnaya N.G., Blumenfeld M., Merenkova I.N. et al. Oligonucleotide circularization by template-directed chemical ligation. // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 5403-5407.

54. Gao H., Yang M., Patel R., Cook A.F. Circularization of oligonucleotides by disulfide bridge formation. //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 2025-2029.

55. Rajur S.B., Roth C.M., Morgan J.R., Yarmush M.L. Covalent protein-oligonucleotide conjugates for efficient delivery of antisense molecules. //Bioconjug. Chem. 1997. V. 8. P. 935-940.

56. Bongartz J.P., Aubertin A.M., Milhaud P.G., Lebleu B. Improved biological activity of antisense oligonucleotides conjugated to a fusogenic peptide. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 46814688.

57. Bruick R.K., Dawson P.E., Kent S.B., Usman N., Joyce G.F. Template-directed ligation of peptides to oligodeoxyribonucleotides. // Chem., Biology. 1996. V. 3. P. 49-56.

58. Liu J., Taylor J-S. Template-directed photoligation of oligodeoxyribonucleotides via 4-thiothymidine. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 3300-3304.

59. Moore M.H., Gulbis J.M., Dodson E.J. et al. Crystal structure of a suicidal DNA repair protein: the Ada 06-methylguanine-DNA methyltransferase from E. coli. // EMBO J. 1994. V. 13. P. 1495-1501.

60. Gao K., Butler S.L. and Bushman F. Human immunodeficiency virus type 1 integrase: arrangement of protein domains in active cDNA complexes. // EMBO J. 2001. V. 20. № 13. P. 3565-3576.

61. Huang H., Chopra R., Verdine G.L. and Harrison S.C. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-l reverse transcriptase: implications for drug resistance. // Science. 1998. V. 282. P. 1669-1675.

62. Huang H., Harrison S.C. and Verdine G.L. Trapping of a catalytic HIV reverse transcriptase*template:primer complex through a disulfide bond. // Chem. Biol. 2000. V. 7. P. 355-364.

63. Liang C., Allen L.C. Sulfur does not form double bonds in phosphorothioate anione. // J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 6449-6453.

64. Reed M.W., Fraga D., Schwartz D.E., Scholler J., Hinrichsen R.D. Synthesis and evaluation of nuclear targeting peptide-antisense oligodeoxynucleotide conjugates. // Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. P. 101-108.

65. Grimm S., Baeuerle P.A. The inducible transcription factor NF-kappa B: structure-function relationship of its protein subunits. // Biochem. J. 1993. V. 290. P. 297-308.

66. Chosh G., Duyne G.V., Ghosh S., Silgler P.B. Sructure of NF-кВ homodimer bound to а кВ site. // Nature. 1995. V. 373. P. 303-310.

67. Muller C.W., Rey F.A., Harrison S.C. Comparison of two different DNA-binding modes of the NF-кВ p50 homodimer. // Nature Structural Biology. 1996. V. 3. P. 224-227.

68. Smith D.B., Johnson K.S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. //Gene. 1988. V. 67. P. 31-40.

69. Muller C.W., Rey F.A., Sodeoka M., Verdine G.L., Harrison S.C. Structure of the NF-kappa В p50 homodimer bound to DNA. // Nature. 1995. V. 373. P. 311-317.

70. Toledano M.B., Leonard W.J. 1991. Modulation of transcription factor NF-кВ binding activity by oxidation-reduction in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 88. P. 4328-4332.

71. Toledano M.B., Ghosh D., Trinh F., Leonard W.J. N-terminal DNA-binding domains contribute to differential DNA-binding specificities of NF-кВ p50 and p65. // Mol. Cell. Biol. 1993. V. 13. P. 852-860.

72. Kandori H., Kinoshita N„ Shichida Y., Maeda A., Needleman R. and Lanyi J.K. Cysteine S-H as a hydrogen-bonding probe in proteins. // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 5828-5829.

73. Sen R., Baltimore D. Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein NF-кВ by a posttranslation mechanism. // Cell. 1986. V. 47. P. 921-928.

74. Frey P.A. and Sammons R.D. Bond order and charge localization in nucleoside phosphorothioates. // Science. 1985. V. 228. P. 541-545.

75. Dolinnaya N.G., Merenkova I.N., Shabarova Z.A. Sequence-dependent structural variations of DNA revealed by chemical ligation. // Nucleosides & Nucleotides. 1994. V. 13. P. 2169-2182.

76. Козлов И.А., Ивановская М.Г., Кубарева E.A., Волков Е.М., Шабарова З.А. Синтез и свойства ковалентно связанного ДНК-дуплекса, содержащего участок узнавания фактора транскрипции NF-кВ. // Молекулярная биол. 1996. Т. 30. № 4. С. 852-863.

77. Mikolajczyk М., Kielbasinski P., Goszczynska Z. Direct observation, isolation, and structure of 1:1 adducts from carbodiimides and dialkylphosphorothio(seleno)ic acids. // J. Org. Chem. 1977. V. 42. P. 3629-3630.

78. Pearson R.G. Acids and bases. // Science. 1966. V. 151. № 14. P. 172-179.

79. Ивановская М.Г., Готтих М.Б., Шабарова З.А. и Прокофьев М.А. Активные эфиры олигонуклеотидов новый тип фосфорилирующих агентов в водной среде. // Докл. АН. СССР. 1987. Т. 295. С. 477-481.

80. Reddy S., Jones A.D., Cross С.Е., Wong P. S.-Y. and van der Vliet A. Inactivation of creatine kinase by S-glutathionylation of the active-site cysteine residue. // Biochem. J. 2000. V. 347. P. 821-827.

81. Bulaj G., Kortemme T. and Goldenberg D.P. Ionization-reactivity relationships for cysteine thiols in polypeptides. // Biochemistry 1998. V. 37. P. 8965-8972.

82. Packer L Methods in enzymology. California. Academic Press. 1995. V. 251. P. 351-382.

83. Arscott L.D., Veine D.M., and Williams C.H. Mixed disulfide with glutathions as an intermediate in the reaction catalyzed by glutathione reductasw from yeast and as a major form of the enzyme in the cell. // Biochemistry 2000. V. 39. P. 4711-4721.

84. Wedemeyer W.J., Welker E., Narayan M. and Scheraga H. Disulfide bonds and protein folding. // Biochemistry 2000. V. 39. № 15. P. 4207-4216.

85. Wu C.-W., Eder P.S., Gopalan V. and Behrman E.J. Kinetics of Coupling reactions that generate monothiophophate disulfides: implications for modification of RNAs. // Bioconjugate Chem. 2001. V. 12. № 6. P. 842-844.

86. Хаскин Б.А. Фосфоросодержащие полисульфиды( методы получения и химические свойства. // Успехи Химии. 1994. Т. ЦП. Вып. 8. С. 1325-1348. ^

87. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. М.: Химия,группой. // Биоорг. химия. 1999. Т. 25. С. 490-494.

88. Burgin A.B.Jr., Huizenga B.N., Nashe H.A. A novel suicide substrate for DNA topoisomerases and site-specific recombinases. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 2973-2979.

89. Sproat B.S., Beijer В., Rider P., Neuner P. The synthesis of protected 5'-mercapto-2',5'-dideoxyribonucleoside-3'-0-phosphoramidites; uses of 5'-mercaptooligodeoxyribo-nucleotides. //Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 4837-4848.

90. Sinha N.D., Striepeke S. Oligonucleotides and Analogues. Eds Eckstein F. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press. 1991. P. 201-202.

91. Sengle G., Jenne A.,Arora P.S., Seelig В., Nowick J.S., Jaschke A. and Famulok M. Synthesis, incorporation efficiency, and stability of disulfide bridged functional groups at RNA 5'-ends. // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2000. V. 8. P. 1323-1324.

92. Escalante C.R., Shen L., Thanos D., Aggarwal A.K. Structure of NF-кВ p50/p65 heterodimer bound to the PRDII DNA element from the Interferon-P promoter. // Structure. 2002. V. 10. P. 383-391.

93. Reed M.W., Fraga D., Schwartz D.E., Scholler J., Hinrichsen R.D. Synthesis and evaluation of nuclear targeting peptide-antisense oligodeoxynucleotide conjugates. // Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. P. 101-108.

94. Ташлицкий B.H., Орецкая T.C. Оптимизация условий ион-парной ВЭЖХ олигонуклеотидов. // Биоорган, химия. 1997. Т. 23. С. 684-693.

95. Зубин Е.М. // Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2000. С. 103.1978. с. 12.s,99. Метелеволигонуклеотидов с концевой тиофосфатной486.117

96. Jeltsch A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. // ChemBioChem. 2002. V. 3. P. 274-293.

97. Sheflyan G.Ya., KubarevaE.A., Kuznetsova S.A., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S., Shabarova Z.A. Cross-linking of SsoII restriction endonuclease to cognate and non-cognate DNAs. // FEBS Lett. 1996. V. 390. P. 307-310.

98. O' Gara M., Zhang X., Roberts R.J., Cheng X. Structure of a binary complex of HhaI methyltransferase with S-adenosyl-L-methionine formed in the presence of a short non-specific DNA oligonucleotide. // J. Mol. Biol. 1999. V. 287. P. 201-209.

99. Василенко H.JI., Булычев H.B., Горн B.B., Левина А.С., Невинский Г.А. Узнавание урацила в составе ДНК урацил-ДНК-гликозилазой из плаценты человека. // Молекуляр. биология. 1994. Т. 28. С. 679-690.

100. Karyagina, A.S., Lunin V.G., Levtchenko I.Ya., Labbe D., Brousseau R., Lau P.C.K., Nikolskaya I.I. The SsoII and NlaX DNA methyltransferases: overproduction and functional analysis. // Gene. 1995. V. 157. P. 93-96.

101. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680.