Разработка подходов для изучения механизма действия и поиска новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Королев, Сергей Павлович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2010
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА
ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
004
На правах рукописи
606315
Королев Сергей Павлович
РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ И ПОИСКА НОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1
02.00.10 - биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
2 4 КЮН
Москва 2010
004606315
Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Научный руководитель:
доктор химических наук, профессор Готтнх Марина Борисовна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук Туницкая Вера Леонидовна
доктор биологических наук Глухов Александр Иванович
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина-и Ю.А. Овчинникова РАН
Защита состоится 15 июня 2010 года в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственно: университете имени М.В. Ломоносова но адресу: 119991, Москва, Ленинские горь Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имен М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 14 мая 2010 года.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук
/Смирнова И.Г./
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Начавшаяся около 30 лет назад пандемия ВИЧ-инфекции и СПИДа охватила все регионы мира. Согласно оценкам, к концу 2008 года численность ВИЧ-инфицированных составила около 33.4 миллионов. Количество умерших от СПИДа достигло 20 миллионов. Каждый день в мире вирусом СПИДа заражаются 7400 человек. Одни из самых высоких темпов роста заражения ВИЧ-инфекцией в мире наблюдаются в Украине и России. Именно поэтому задача разработки эффективных лекарственных препаратов для борьбы с вирусом является особенно актуальной для нашей страны. Одной из самых привлекательных мишеней для разработки ингибиторов является вирусный фермент интеграза (ИН), катализирующая интеграцию вирусной ДНК в клеточную.
На настоящий момент протестировано более 250 000 потенциально-возможных ингибиторов иатегразы, но только один из них препарат Iseníress™ или ралтегравир официально разрешен к применению в качестве одного из компонентов высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ). Однако даже комплексная терапия не способна полностью подавить репликацию вируса и с течением времени к ней развивается устойчивость. Так показано, что устойчивость к ралтегравиру развивается у некоторых пациентов в течение 12 недель. На стадии клинических испытаний находятся только близкие к ралтегравиру по механизму действия ингибиторы. Уже показано, что к ним развивается устойчивость, перекрестная с ралтегравиром. В связи с этим разработка новых ингибиторов интеграции, механизм действия которых отличается от действия ралтегравира, является актуальной задачей.
Поиск новых ингибиторов осложняется тем, что зачастую активные in vitro ингибиторы, оказываются неактивными in vivo. Эксперименты на культуре ВИЧ-инфицированных клеток достаточно трудоемки и дорога, поэтому, несомненно, актуальным является создание системного подхода к оценке механизма действия ингибиторов, который позволил бы отсеять соединения, неспособные работать in vivo и обладающие механизмом действия, схожим с уже известными ингибиторами, к которым выработались устойчивые штаммы вируса.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в создании системы методов, позволяющей охарактеризовать механизм ингибирования ИН различными соединениями и дать рекомендации по дальнейшему применению новых ингибиторов.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.
1. Сформулировать общую схему характеристики ингибиторов ИН.
2. Оптимизировать методику ингибирования каталитической активности ИН.
3. Разработать методику, позволяющую изучать влияние ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН.
4. Провести апробацию разработанных подходов на ингибиторах ИН с известным механизмом действия.
5. Осуществить поиск новых ингибиторов ИН и исследовать их механизм ингибирования интеграции с использованием разработанной системы подходов.
Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе разработана и апробирована система подходов для характеристики ингибиторов ИН с различными механизмами действия in vitro. В частности, можно сказать какой этап интеграции подавляется, связывается ли ингибитор в каталитическом центре ИН или с С-концевым доменом белка, взаимодействует ли ингибитор с ионом металла в активном центре ИН, способен ли действовать на пресформированный комплекс ИН/ДНК. Разработана методика, позволяющая изучать влияние ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН. Кроме того, изучено влияние клеточного партнера ИН, LEDGF/p75, на каталитическую и ДНК-связывающую активность фермента. С использованием метода кросс-линкинга уточнено расположение вирусной ДНК в ее комплексе с ИН и LEDGF. Предложено использовать комплекс ИН/LEDGF в качестве более адекватной модели для характеристики действия ингибиторов ИН ВИЧ-1 in vitro. Исследование действия ингибиторов на активность ИН в комплексе с LEDGF позволит дать рекомендации к дальнейшему изучению их действия на культуре ВИЧ-инфицированных клеток.
Совокупность предложенных подходов была использована для поиска и характеристики новых ингибиторов ИН ВИЧ-1. Найден новый класс ингибиторов интегразы: нитробензофуроксаны/ нитробензофуразаны, изучен механизм их действия и показано, что они относятся к ингибиторам З'-процессинга, связываются в активном центре ИН, препятствуют связыванию в нем ДНК-субстрата и не взаимодействуют с ионом металла-кофактора.
Показано, что димерные бисбензимидазолы (DBBI) способны ингибировать обе стадии интеграции за счет нарушения правильной укладки ДНК-субстрата в активном центре ИН. Эффективность ингибирования зависит от природы линкера, соединяющего пары бензимидазолов, и может различаться в 300 раз. На основании всех полученных результатов сделан вывод о том, что разная ингибирующая активность DBBI обусловлена разным механизмом их действия: DBBI с гептаметиленовым линкером является конкурентным ингибитором интегразы, в то время как для DBBI с триэтиленгликолевым линкером предполагается неконкурентный или более сложный механизм ингибирования.
Публикапии и апробация работы. По материалам публикации опубликовано 4 статьи в отечественных и зарубежных реферируемых журналах. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: международной конференции молодых учёных по фундаментальным наукам "Ломоносов-2006", секция "Химия. Науки о живом" (Москва, 12-15 апреля 2006 г.), 32па FEBS Congress - Molecular Machines (Вена, Австрия, 712 июля 2007 г.), VI съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 г.), XVI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 6-10 апреля 2009 г.), научной конференции «Bionano'09. Химическая
биология, фундаментальные проблемы бионанотехнологии», (Новосибирск, 10-14 июня 2009 г.), международной конференции «Nucleic Acids at the Chemistiy-Biology Interface» (Манчестер, Великобритания, 7-8 сентября 2009 г.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 65 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 134 цитированные работы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
На основе анализа данных литературы, была сформулирована следующая схема характеристики ингибиторов ИН (Рис. 1).
Этап I. Изучается ингибирующее действие веществ на каждую из стадий интеграции: З'-процессинг и перенос цепи. Определяются концентрации ингибиторов, при которых эффективность реакции снижается на 50% (1С50).
Если значение 1С50 для реакции переноса цепи оказывается ниже, чем для 3'-процессинга, то такой ингибитор относится к ингибиторам переноса цепи. Известно, что данные ингибиторы связываются в активном центре фермент-субстратного комплекса и препятствуют взаимодействию с клеточной ДНК. Если значение эффективности • ингибирования З'-процессинга и переноса цепи близки, то данный ингибитор является ингибитором 3 '-процессинга, который препятствует взаимодействию ИН с вирусной ДНК, или амостерическим ингибитором ИН.
Этап II-A. В случае ингибитора переноса цепи необходимо провести сравнение эффективности ингибирования ИН в присутствии ионов Mg2+ и Мп2+. Ионы двухвалентного металла связаны в активном центре ИН и необходимы ей для осуществления процессинга. Если ингибитор взаимодействует с ионом металла, то из-за различной координирующей способности Mg2+ и Мп2+ влияние ингибитора на активность ИН в присутствии разных ионов металлов будет различаться. Соответственно, более высокая ингибирукмцая способность в присутствии иона Мп2+ будет указывать на то, что ингибитор взаимодействует с ионом металла в активном центре ИН. Одинаковая активность указывает на отсутствие такого взаимодействия.
Этап П-Б. В случае ингибитора 3 '-процессинга ши аллостерического ингибитора необходимо изучить его влияние на ДНК-связывающую активность ИН. За связывание ДНК в первую очередь ответственен С-концевой домен ИН. Следовательно, ингибитор, который подавляет связывание ДНК в тех же концентрациях, что и З'-процессинг, взаимодействует с С-концевым доменом. Если ингибитор подавляет связывание менее эффективно, чем процессинг, то очевидно он взаимодействует с каталитическим центром.
.-----— ——
л— _ ./"^ Ингибированив \ «этап 1( З'-процвесинга (Пр) 1 Х^ипереноса цепи (ПЦ^,/
1СМ (ПЦ) - 1СЯ (Пр)
Этап
Рис 1. Схема характеристики механизма действия ингибиторов ИII.
Этап III-A. Для ингибитора, взаимодействующего с каталитическим доменом, необходимо выяснить, влияет ли он на правильную укладку ДНК в активном центре ИН. Если такое влияние есть, то значит, ингибитор препятствует взаимодействию ДНК с активным центром ИН, т.е. является классическим ингибитором З'-процессинга. Если такого влияния нет, то такой ингибитор влияет на каталитическую активность ИН, возможно, за счет частичного изменения структуры активного центра. Для обоих типов ингибиторов необходимо выяснить происходит ли их взаимодействие с ионом металла в активном центре ИН на этапе TV-A.
Этап Ш-Б. Для ингибитора, взаимодействующего с С-концевъш доменом, необходимо сравнить его ингибирующее действие в конкурентных условиях, когда ИН, ДНК и ингибитор смешиваются одновременно, с действием на предварительно сформированный комплекс ИН с вирусной ДНК. Если ингибитор не способен ингибировать активность ИН в пресформированном комплексе, его можно отнести к конкурентным ингибиторам связывания ДНК.
Ингибитор, способный подавлять активность ИН в пресформированном комплексе, является скорее аллостерическим ингибитором, вызывающим разрушение комплекса ИН с ДНК или его инактивацию за счет структурных изменений белка. Это заключение необходимо дополнительно проверить в экспериментах по воздействию ингибитора на целостность пресформированного комплекса ИН с ДНК на этапе IV-Б.
Некоторые методы для реализации предложенной схемы были известны из литературы: методики ингибирования З'-процессинга и переноса цепи (Этап I), изучения взаимодействия ингибитора с ионом металла в активном центре ИН (Этап II-A), ингибирования ДНК-связывающей активности ИН (Этап П-Б), исследование действия ингибитора на пресформированный комплекс ИН/ДНК (Этап Ш-Б). Однако для получения достоверных результатов необходимо было оптимизировать известные методики анализа для нашего препарата ИН. Кроме того, на момент начала выполнения работы не существовало метода, позволяющего оценить влияние ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН (Этап Ш-А), такую методику нам предстояло разработать.
1. Разработка и оптимизация методов, необходимых для характеристики действия ингибиторов.
1.1. Оптимизация условий ингибирования З'-процессинга и переноса цепи (Этап I)
В исследованиях ингибиторов ИН in vitro обычно используются рекомбинантные препараты белка и олигонуклеотидные дуплексы, повторяющие нуклеотидную последовательность конца участка U5 длинного концевого повтора (ДКП) вирусной ДНК. В ходе З'-процсссинга от З'-копца процессируемой цепи отщепляется динуклеотид GT, и из радиоактивно меченного исходного 21-звенного дуплекса U5 (Рис. 2А) образуется
дуплекс 19/21 (U5-2). В случае реакции переноса цепи в качестве субстрата используется процессированный дуплекс U5-2. Особенностью ИН является тот факт, что в данной реакции она может встраивать процессированный U5-2 субстрат как в неспецифическую ДНК-мишень, так и в дру1ую молекулу субстрата. Интеграция происходит в разные места и приводит к нескольким продуктам. Для изучения анти-интегразной активности потенциальных ингибиторов отдельно исследуют подавление ингибиторами 3'-процессинга и переноса цепи и для каждого препарата определяют значение IC50. Условия интеграции сильно зависят от метода выделения фермента. Нами использовался метод выделения ИН без детергентов в присутствии Mg2+ и Zn2+, и прежде всего было решено детально охарактеризовать каталитическую активность используемого препарата ИН, чтобы выбрать оптимальные условия для проведения катализируемых ею реакций.
Известно, что в клетке ИН действует в комплексе с вирусными и клеточными белками, входящих в состав прединтеграционного комплекса (ПИК), причем основным кофактором ИН, который входит в состав ПИКа, является клеточный белок LEDGF/p75 (Cherepanov et al., 2003).
Нашим коллегам из Института геномики и молекулярной и клеточной биологии г. Страсбурга (Франция) удалось разработать методику получения комплекса ИН/LEDGF и показать, что в его состав входят 4 субъединицы ИН и 2 субъединицы LEDGF. Структура
комплекса ИН/LEDGF была изучена с помощью крио-электронной
микроскопии и имела разрешение порядка 14 А. Методами компьютерного моделирования с использованием данных о структуре ИН, LEDGF и взаимодействии ИН с вирусной и клеточной ДНК была построена модель ИН/LED GF/Д НК. Однако из-за низкого разрешения крио-электронной микроскопии, точно определить расположение ДНК в этом комплексе было невозможно. Было решено оценить, возможно ли использовать комплекс ИН с LEDGF в качестве модели для изучения действия ингибиторов ИН in vitro.
Необходимо было
охарактеризовать каталитическую активность наших препаратов
А 21-з е U5-cv6cmoam
5' -GTGTGGAAAA.TCTCTAGCACT-3' 3'-CACACCTTTTAOASATCGTCA-5'
40-з в Ц5-субсгтзт
5' -GACTACGGTTCAAGTCAGCGTGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3' 3' -CTGATGCCAAGTTCAGTCGCACACCTTTTAGAGATCGTCA-5'
2,0-
1.5
1.0
ч
а
0,5
0,0
у' / ♦ 7 -V .....V........V ....Я ..... , .-4......... , О
/ .У и HH+2l-1».U5-C)Scipai
♦ ИН + "10-1В. 1'5<у6стрэт
jf о ИН/LEDGF + 2I-W. U5-cy6crpar
V ИН/1.ЕООГ + 40-зв. U5-субстрат
50
100 150 200 250 300 Время, мин
Рис. 2. Изучение каталитической активности ИН и комплекса ИН/ЬЕОСР. (А) Структура 21-звеиного и 40-звснного 115-субстрата. Графики зависимости выхода продукта З'-процессппга 21-и 40-звенных субстратов ИН и комплексом ИН/ЬЕОСГ от времени (Б).
рембинатной ИН и Та6л- 1м. Определение параметров Уц, Кшх и Кт реакции 3'-процссспнга, осуществляемой ИН и комплексом ИН/ЬЕБСР
комплекса ИН/ЬЕООР, предназначенных для изучения ингибиторов ИН. Была исследована кинетика накопления продукта З'-процессинга ИН и комплексом ИНЛЛПЮР, при этом были использованы стандартный 21-звенный субстат и удлиненный 40-звенный субстрат (Рис. 2А). На основании результатов были построены кинетические кривые (Рис. 2Б) и рассчитаны стационарные скорости У0 процессинга (Табл. 1).
Наиболее значительные изменения по сравнению с ИН происходят при 3'-процессинге 40-звенного субстрата комплексом ИН/ЬЕОвР. В этом случае можно наблюдать значительное увеличение эффективности и начальной скорости реакции и полное изменение характера зависимости выхода продукта процессинга от времени (Рис. 2Б). Отсутствие начальной лаг-фазы, которая обусловлена медленным связыванием ИН с ДНК, позволило предположить, что связывание 40-звенного Ш-субстрата комплексом ИН/ЕЕБОР происходит мгновенно. Это затем было подтверждено в экспериментах по изменению анизотропии флюоресценции флуоресцентно-меченного субстрата. Далее были изучены и представлены в координатах Лайнуивера-Берка зависимости скоростей 3'-процессинга, осуществляемого ИН или комплексом ИШЬШХдР, от концентрации 40-звенного и5-субстрата. Были рассчитаны значения У^и и Кт (Табл. 1).
По нашему мнению, данные по стимуляции каталитической и ДНК-связывающей активности ИН в присутствии ЬЕйвЕ указывают на то, что ЬЕОСИ обеспечивает правильную структурную организацию ИН. Мы считаем, что структура ИН в комплексе с ЦПХЗР более соответствует нативной структуре ИН, которая обеспечивается за счет взаимодействия с компонентами ЛИКа. Соответственно, комплекс ИН с ЬЕОвИ является более адекватной моделью для изучения ингибирующей активности соединений, чем свободная ИН.
1.2. Влияние ингибитора на укладку ДНК в активном центре интегразы
(Этап Ш-А)
Основной вклад в связывание ДНК вносит не каталитический, а С-концевой домен ИН, поэтому ингибитор, который связывается в каталитическом домене, может препятствовать взаимодействию вирусной ДНК с активным центром фермента, при этом не оказывая значительного влияния на суммарное связывание ДНК белком. В связи с этим, помимо влияния ингибиторов на ДНК-связывающую активность ИН, было предложено изучить влияние ингибитора на правильную укладку ДНК-субстрата в активном центре
Длина ДНК, н.п. Фермент Уо, нМ/мин Утах, ПМ/М1Ш Кт, нМ
21 ИН 0.010 ±0.001 - -
21 \mJlEDGV 0.010 ±0.001 - -
40 ИН 0.013 ±0.001 0.036±0.004 7.5±0.8
40 ИН/ЬЕЕЮР 0.027 ±0.002 0.14±0.04 27±5
ИН. Для этого решили использовать метод ковапеитного присоединения к ферменту аналогов субстрата, содержащих альдегидную группировку, которая способна взаимодействовать с аминогруппой остатков лизина. Соответственно остатки цитидина в структуре 21-звенного ДНК-субстрата заменяли на 2'-0-(2,3-дигидроксипропил) - цитидин (Ö), а остатки тимидина - на 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)-уридин (Т) (Рис. 3). Модифицированные нуклеозиды вводили вблизи расщепляемой при З'-процессинге связи, поскольку именно этот регион взаимодействует с каталитическим доменом ИН и образует наиболее значимые специфические ДНК-белковые контакты.
ДНК-дуплексы были окислены NaI04 для получения альдегидной группы, затем они инкубировались с ИН при 37°С в течение 1 часа, и проводилось восстановление образовавшегося основания Шиффа NaBH3CN в течение 30 минут. Продукты присоединения анализировали при помощи электрофореза в геле по методу Лэммли. Эффективность присоединения модифицированной ДНК к ИН сильно зависела от места расположения модификации в структуре дуплексов. Наибольшая эффективность образования конъюгатов с ИН наблюдалась в случае дуплексов, содержащих модификации во 2-ом и 3-ем положениях непроцессируемой цепи (Рис. 3). Известно, что с первыми четыремя положениями непроцессируемой цепи взаимодействуют остатки 139-152 каталитического домена ИН, которые расположены непосредственно в ее активном центре, а остаток глутаминовой кислоты 152 входит в состав каталитической триады ИН (Heuer and Brown, 1997). Таким образом, использование субстратов с модификацией во 2-ом или 3-ем положениях непроцессируемой цепи позволяет изучать взаимодействие ДНК непосредственно с активным центром ИН. Ингибитор, связывающийся в активном центре ИН и препятствующий взаимодействию активного центра ИН с вирусной ДНК, соответственно должен препятствовать и ковапентному соединению ИН и ДНК.
Кроме того, поскольку использование альдегидной модификации ДНК-субстрата позволяло получать коньюгаты ИН с ДНК с достаточно высокой эффективностью, было
20% 5% 25% 7 1 t tO-t
обв 5' gtgtggaaaatCtcTagCagJ 3'
u5a 3' cacaccttttagagaTCgTCa 5'
it +4 6 5 3 2
30% 5% 40%40%
5' \
О-
Vi
с = Tft „ f = wx
J> он 3-'° o^A^OH
Ряс. 3, Положения Ш-дуплекса, в которые вводилась модификация, а также структурные формулы иуклеозцдов, содержащих 2,3-дигидроксипропильиую группу. Сверху и снизу дуплекса указаны положения модификаций и эффективность присоединения модифицированного субстрата к ИН. Большой стрелкой указано место расщепления ДНК-субстрата при З'-процессинге.
решено использовать кросс-линкинг для уточнения расположения ДНК в комплексе ИН/ЬЕБОР/ДНК.
1.3. Уточнение структуры комплекса ИН/!_ЕООГ/ДНК с использованием метода кросс-линкинга
Было решено провести присоединение модифицированного ДНК-субстрата к комплексу ИН/ЬЕООР и определить аминокислотные остатки белка, ковалентно-связанные с субстратом. Основываясь на полученных результатах, было высказано предположение, что стимуляция ДНК-связывающей активности ИН в присутствии ЬЕБОР объясняется тем, что ЬЕООБ стабатизирует конформационно-подвижные участки ИН, тем самым, облегчая ее взаимодействие с ДНК-субстратом. ДНК-связывающий С-концевой домен ИН обладает высокой коиформационной подвижностью. В то же время каталитический домен, также участвующий в связывании ДНК обладает достаточно жесткой структурой. В связи с этим, было решено, что в присутствии 1ЛШОР наиболее интересно изучить взаимодействие С-концевого домена ИН с ДНК. Известно, что С-концевой домен ИН взаимодействует с 4-ым - 9-ым положениями непроцессируемой (и5А) цепи ДНК (Agapkina е/ а!., 2006), поэтому был выбран ДНК-субстрат с модификацией в 6-ом положении непроцессируемой цепи, способный образовывать конъюгат с ИН с достаточно высокой эффективностью. Ввиду отсутствия 40-звенных модифицированных олигонуклсотидов использовался составной субстрат, в котором 21-звенный олигонуклеотид ША-6, содержащий альдегидную группу в 6 положении и радиоактивную метку на 5'-конце, вместе с олигонуклеотидом 19_и5А составляли комплементарную цепь 40-звенному олигонуклеотиду 40_115В. Для определения аминокислоты, связанной с 6-ым положением субстрата, ДНК-субстрат инкубировали с комплексом ИН/ЬЕВОР, смесь продуктов разделяли методом гель-электрофореза по Лэммли, из геля вырезали полосу, соответствующую по подвижности комплексу \J5A-6/ИН, гидролизовали белок трипсином и полученный конъюгат олигонуклеотида с пептидом очищали от всех примесей последовательно гель-электрофорезом в 20% ПААГ с 7М мочевиной, хроматографией на Ее3+-МТА-агарозе и гель-фильтрацией на колонках Мтгосоп УМ-З.
МАЬШ-ТОР масс-спектрометрический анализ был проведен сотрудником Института биоорганической химии РАН им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Р. X. Зигашпиным. В полученном масс-спектре присутствовал наиболее интенсивный пик с массой 7745 Да. Масса пептида была рассчитана по формуле: М(пептида)=М(пика) -М(олигонуклеотида) - М(Н ) и оказалась равна 1350 Да. Среди пептидов, образующихся при триптическом гидролизе ИН, присутствует пептид 263-273, имеющий массу 1348 Да, в структуре которого присутствуют два остатка лизина: Ьув264 и ЪуБ26б. Конъюгат обработали ОТ для деградации олигонуклеотидной части и провели секвенирование полученного пептида методом тандемной масс-спекгрометрии. Анализ полностью
подтвердил результаты МАЦМ-ЮТ анализа: полученная аминокислотная последовательность ЯКАКШФУОК соответствовала пептиду 263-273 из С-концевого домена интегразы ВИЧ-1. Согласно модели комплекса ИН/ЬЕОвР/ДИК, построенной д-ром Марком Руффом из Института геномики и молекулярной и клеточной биологии г. Страсбурга с учетом полученных нами данных, 6-положение непроцессируемой цепи Ш-субстрата сближено с рис. 4. Модель взаимодействия остатком 1^264 ИН, а не Ьуэ266 (Рис. 4). комплекса ИНЛ.ЕБСГ с ДНК.
2. Апробация системы подходов на ингибиторах интегразы с известными механизмами действия
Необходимо было выяснить, позволяет ли разработанная система подходов делать достоверные выводы о механизме действия ингибиторов ИН. Для этого было решено проверить сформулированные подходы на ингибиторах с известными механизмами действия. Были выбраны 3 известных ингибитора: пурпурогаллин, 1,-708,906 и 11-Р-Е (Рис. 5).
Пурпурогаллин
Пурпурогаллин относится к классу 2-гидрокстрополонов - семичленных небензоидных ароматических гидроксикетонов. Некоторые представители этого класса были изучены в качестве ингибиторов ИН и было показано, что они связываются в ее активном центре, взаимодействуют с ионами двухвалентого металла и препятствует взаимодействию ИН с вирусной ДНК.
На этапе I была оценена способность соединений ингибировать обе реакции, катализируемые интегразой ВИЧ-1 (Табл. 2). Пурпурогаллин с одинаковой
эффективностью ингибировал обе стадии интеграции, что характерно для ингибитора 3'-1 процессинга. На этапе Ц-Б показано, что пурпурогаллин значительно хуже ингибирует связывание ИН с ДНК, чем 3'-процессинг. На этапе Ш-А выяснилось, что пурпурогаллин
влияет на ковалентное связывание
Рис. 5. Структуры известных ингибиторов интегразы: ДНК-субстрата в активном центре (А) пурпурогаллина; (Б) 1,708,906; (В) 11-О-Е. ш с эффекгивностью блшкой к
В
ССТТПТСТСТр^
Табл. 2. Ингибированпс пурпурогаллином, Ь-708,906 н 11-О-Е каталитической активности 1Ш ВИЧ-1 в реакциях З'-процессцнга и переноса цепи я ннгибированиг взаимодействия ИН с ДНК-субстратом.
Название 1С5о*, мкМ
З'-процессинг Перенос цепи Связывание ИНсДНК Связывание ДНК в активном центре ИН
ИН ИН/ЬЕПКЗР ИН
Мп2+
Пурпурогаллин 0.7±0.1 1.5±0.2 0.2±0.1 0.6±0.1 50±20 1.0±0.3
1,-708,906 4.2±1.6 4.0±1.2 1.0±0.2 0.5±0.2 >500 100±40
П-Б-Е 0.05±0.01 0.005±0.001 0.06±0.02 0.06±0.01 0.05±0.01 0.03±0.01
* все значения являются усредненными результатами не менее чем 3-х экспериментов
эффективности ингибирования З'-процессиига (Табл. 2). В соответствии с предложенной схемой эти данные указывают на взаимодействие ингибитора с активным центром ИН.
На Этапе ГУ-А была изучена ингибирующая активность пурпурогаллина в реакции З'-процессинга в присутствии иона Мп2+ (Табл. 2). Оказалось, что пурпурогаллин более чем в ■ 3 раза активнее по отношению к ИН с кофактором-марганцем, чем с кофактором-магнием. Этот результат указывает на взаимодействие ингибитора с ионом металла.
Таким образом, совокупность предложенных подходов позволила достоверно определить механизм ингибитора ИН пурпурогаллина, который полностью согласуется с литературными данными. Помимо этого, было определено значение 1С50 пурпурогаллина для реакции З'-процессинга, катализируемой комплексом ИН с ЫШСР (Табл. 2). Оказалось, что в присутствии 1ЛФОР ингибирующая активность пурпурогаллина снижается примерно в два раза. Этот факт, по нашему мнению, указывает на то, что данный ипгибитор не будет эффективно ингибировать репродукцию ВИЧ-1 в клеточной культуре. Хотя подобные исследования для пурпурогаллина не проводились, из литературы известно, что большая часть изученных 2-гидрокситрополонов оказалась не способна защитить МТ-2 клетки от цитопатического эффекта, вызванного ВИЧ-1 {¡¡етепоуа е/ а/., 2006), они также слабо ингибировали репродукцию ВИЧ-1 в зараженных лимфобластоидных СЕМ-ББ и МТ-4 клетках (йийе/у'еда е/ а1, 2005). 1.-708,906
Ь-708,906 - ингибитор переноса цепи, содержащий мотив дикетокислоты (2,4-диоксобутановой кислоты), который имеется во всех наиболее активных ингибиторах переноса цепи, в том числе и в ралтегравире. Данный ингибитор связывается в активном центре ИН, уже связанной с вирусной ДНК, взаимодействует с ионом металла и мешает
связыванию клеточной ДНК. Ингибиторы данного класса не влияют на связывание ИН с вирусной ДНК.
Проведенные эксперименты показали, что Ь-708,906 действительно практически на порядок лучше ингибирует перенос цепи, чем З'-процессинг и при этом взаимодействует с металлом-кофактором (Табл. 2). Для проверки схемы было изучено влияние Ь-708,906 на ДНК-связывающую активность ИН и правильную укладку ДНК в активном центре (Табл. 2). В соответствии со своим механизмом действия, Ь-708,906 не влиял на связывание ДНК с ИН, а на укладку ДНК в активном центре действовал примерно в 20 раз хуже, чем на З'-процессинг. Определенное значение 1Сз0 для З'-процессинга, катализируемого комплексом ИН/ЬЕОйР, практически совпало с определенным для ИН, таким образом, полученные данные указывают на то, что ингибитор является потенциально активным на клетках. В литературе показана высокая противовирусная активность Ь-708,906 на МТ-2 клетках, зараженных ВИЧ-1 (Р1иутег$ е/ а/., 2002). Таким образом, в соответствии с разработанной схемой был подтвержден известный из литературы механизм действия 1,-708,906. 11-О-Е
11-1>Е - разработанный в нашей лаборатории неконкурентный ингибитор ИН. Он представляет собой коньюгаг одноцепочечного олигодезоксирибонуклеотида и флуоресцентного красителя эозина. 11-В-Е является аллостерическим ингибитором ИН: он связывается с С-концевым доменом и вызывает разрушение комплекса ИН с ДНК.
Изучение ингибирующей активности П-Б-Е в реакциях З'-процессинга и переноса цепи (Этап I), показало, что данный ингибитор подавляет обе реакции с одинаковой эффективностью (Табл. 2), что согласуется с его механизмом действия. На этапе П-Б было показано, что 1ЬБ-Е способен подавлять связывание ДНК с той же эффективностью, что и З'-процессинг (Табл. 2), что указывало на то, что он взаимодействует с С-концевым доменом ИН. Изучение действия П-Э-Е на З'-процессинг, осуществляемый пресформированным комплексом ИН/ДНК (Этап Ш-Б), и влияния ингибитора на целостность пресформированного комплекса ИН/ДНК (Этап 1У-Б) показало, что 11 -Б-Е действительно является аллостерическим ингибитором ИН: ингибитор разрушал комплекс ИН/ДНК с 1Сзо порядка 0.0б±0.02 мкМ, что соответствовало его 1С5о при ингибировании каталитической активности ИН.
Кроме того, для проверки схемы было изучено действие 11-Б-Е на З'-процессинг в присутствии иона марганца и правильную укладку ДНК в активном центре (Табл. 2). Как и следовало ожидать, 11-О-Е, который в соответствии со своим механизмом действия не взаимодействует с активным центром ИН и не координирует ион металла, ингибировал З'-процессинг в присутствии ионов любого из этих металлов с одинаковой эффективностью. Также 11-Э-Е оказался способным подавлять специфическое связывание ДНК в активном центре фермента с той же эффективностью, что и З'-процессинг, что неудивительно, учитывая его способность вызывать диссоциацию комплекса ИН с ДНК.
Полученные данные полностью подтверждали аллостерический характер ингибирования 11-О-Е. Для того чтобы более подробно изучить изменения, происходящие в структуре ИН при взаимодействии с ингибитором, было решено провести дополнительные исследования с
использованием метода флуоресцентной спектроскопии.
В структуре ИН находятся семь остатков триптофана, причем два из них, Тгр235 и Тгр243, расположены в С-концевом домене ИН вблизи Ьуз236, с которым, как было ранее показано, взаимодействует этот ингибитор. Было изучено влияние на собственную флуоресценцию ИН ингибитора П-О-Е и соответствующего олигонуклеотада 11-Б без эозина, который ингибирует ИН при гораздо более высоких концентрациях, 1С50 = 6.0 ± 0.5 мкМ. Оказалось, что связывание 11-О-Е с ИН приводит к значительным изменениям собственной флуоресценции остатков триптофана ИН (Рис. 6А). Олигонуклеотид без эозина, 11 -О, тушил флуоресценцию ИН значительно менее эффективно (Рис. 6А). Кроме того, скорость тушения флуоресценции
I .О 30
У л4 3 «.♦
5 I 20
II
§ §■ 10 ¡й
Я" о
1Ш + 11-О-Е I ИН+11-13 1
_............
50 100 190 200
[Ингибитор], нМ
250
200
5 175
5 1М
.125
ИН
ин+ш ИН + П-И-Е
« ■ «V*
0 5 10 15 20
Время, мин
Рис. 6. Влияние 1Ю-Е на собственную флуоресценцию остатков триптофана ИН. (А) Тушение флуоресценции остатков триптофанов ИН при св&зывании с 11-О-Е и 11-0. (Б) Кинетика изменении флуоресценции 100 нМ ИН при инкубации при 3ТС, в присутствии 50 иМ €5-субстрата или 50 нМ ингибитора 11-О-Е.
ИН ингибитором 11-Б-Е была значительно выше, чем Ш-субстратом (Рис. 6Б). Эти данные хорошо коррелируют с ранее опубликованными данными по связыванию ингибитора данного класса и ДНК-субстрата с ИН {РЫхкауа е1 а!., 2004). Кроме того, они являются подтверждением того, что субстрат и ингибитор связываются в разных сайтах ИН.
Нами также впервые было обнаружено, что в присутствии ЬШХЗР активность соединения 1143-Е существенно возрастает. Это указывает на его потенциальную активность как ингибитора репликации ВИЧ, которая подтверждается предварительными испытаниями, проведенными д-ром Мириам Битеру из Каталического университета г. Левена (Бельгия) на лимфобластоидных клетках МТ-4, зараженных ВИЧ-1.
Проведенные исследования показали, что с использованием разработанной системы подходов можно проводить достоверную характеристику ингибиторов ИН с совершенно
различными механизмами действия. Совокупность предложенных подходов была использована для поиска и характеристики новых ингибиторов ИН ВИЧ-1.
3. Поиск и характеристика низкомолекулярных ингибиторов интегразы
В рамках выполнения проекта МНТЦ, в Институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН с использованием программы PASS была проведена выборка из баз данных органических соединений веществ, потенциально активных в качестве ингибиторов ИН ВИЧ-1. Нашей задачей являлась проверка анти-интегразной активности синтезированных соединений, их структурно-функциональный анализ и изучение механизма действия веществ, проявивших наибольшую активность. На начальном этапе исследований было протестировано более 100 потенциально активных ингибиторов ИН. Некоторая анти-интегразная активность была обнаружена для синтезированных в Институте органической химии им. НД Зелинского РАН производных N-оксидов 2,1,3-бензоксадиазолов (бензофуроксанов) (Рис. 7). С целью поиска наиболее активных ингибиторов ИН было проведено структурно-функциональное исследование ингибиторов данного структурного класса, а также их аналогов - бензофуразанов (2,1,3-бензоксадиазолы) (Рис. 7).
3.1. Структурно-функциональный анализ производных бензофуроксанов и бензофуразанов
3.1.1. Бензофуроксаны и беизофуразаны
В первую очередь было решено изучить влияние заместителей на способность соединений данного класса ингибировать реакцию переноса цепи (ПЦ). Был синтезирован незамещенный бензофуроксан (соединение 75), а также бензофуроксаны, имеющие различные заместители в 4, 5, 6 и 7 положениях. Оказалось, что соединения, не содержащие нитрогрупп, практически не подавляли каталитическую активность ИН. В связи с этим, мы сосредоточились на исследовании нитробензофуроксанов (НБФС) и нтробензофуразанов (НБФЗ).
3.1.2.4-нитробензофуроксаны и -фуразаны
В первую очередь была изучена анти-интетразная активность незамещенных 4-НБФС (76) и 4-НБФЗ (84). 4-НБФС 76 в отличие от бензофуроксана 75 оказался способен
ингибировать перенос цепи с 1С50 порядка 80 мкМ. s^-Vj^n^ n=o: Бензофуразаны 4-нитробензофуразан 84 также оказался активен и k^Sl'' n=1 ■" Бензофуроксаны проявил иншбирующую активность порадка 30-40
1(0)п мкМ"
Рис. 7. Структуры бензофуразана и Была т>'чена ингибирующая активность ряда
бензофуроксана. производных 4-НБФС и 4-НБФЗ. Оказалось, что все
они являются ингибиторами ИН, причем были выявлены следующие закономерности:
- 4-НБФС и 4-НБФЗ с аналогичными заместителями, как правило, ингибируют ИН с близкой эффективностью, независимо от положения заместителя;
- наиболее активными являются соединения, содержащие метальную группу в 5-м и/или 7-м положениях, соединение 74 (7-метил-4-нитробензофуроксан) подавляло ИН с 1С5о(ПЦ)=0.4 мкМ;
- электороноакцепторные заместители, как правило, увеличивают иигибируюшую активность 4-НБФС и 4-НБФЗ, а электоронодонорные - нет, исключением являются метальные группы.
3.1.3. 6-нитробетофуроксаны и 5-нитробензофуразаны
Была изучена анти-интегразная активность некоторых 6-НБФС и 5-НБФЗ. Оказалось, что незамещенные 6-НБФС {92,1С50(ПЦ)=5 мкМ) и 5-НБФЗ (109,1С50(ПЦ)=5 мкМ) значительно лучше иншбируют интегразу, чем незамещенные 4-НБФС и 4-НБФЗ (сравн. 76 и 92, 84 и 109). Однако в отличие от 4-НБФС, введение заместителей в 6-НБФС не только не улучшало его ингибирующую активность, а даже ухудшало ее.
3.1.4.4,6-динитробеизофуроксаиы
Незамещенный диНБФС (77, 1С50(ПЦ)=500 мкМ) оказался менее активен, чем соответствующий 4-НБФС (76). Этот факт согласуется с данными литературы по ингибированию биосинтеза нуклеиновых кислот в культуре клеток. Наличие заместителей в сгруетуре диНБФС значительно увеличивало их ингибирующую активность. Соединение 118, содержащее бром-метильный заместитель в 7-м положении, и соединение 132, содержащее метельный заместитель, были практически на 2 порядка активнее незамещенного диНБФС. Таким образом, по структурно-функциональным закономерностям диНБФС близки к 4-НБФС, но менее активны.
Поскольку нам удалось открыть ранее неописанный структурный класс ингибиторов ИН, мы решили детально изучить механизм действия найденных ингибиторов. В качестве объектов исследования были отобраны 8 соединений (Рис. 8). Были выбраны наиболее активные ингибиторы 74 (7-метил-4-нитробензофуроксан) и ¡09 (5-нитробензофуразан). Для изучения влияния заместителя на механизм действия ингибиторов были выбраны соединения 49 (метил[(4-нитробензофуроксан-7-ил)амино]ацетат), 130 (4-шпро-7-(фенилтио)-бензофуразан) и 118 (7-(бромометил)-4,6-динитрофуроксан). Также были отобраны проявившие анти-интегразную активность нитросодержащие соединения, не относящиеся к классам бензофуроксанов и бензофуразанов, 103 (4-азидо-3-хлор-2-(4-хлорфенид-)-6-нитро-1-бензотиофен), 107 (3,7,8-триншропиразол-[5,1-с][1,2,4]триазин-4-амин)и 112 (2-ами!ю-5,7-динитрохинолин-3-карбошприл 1-оксид).
3.2. Определение механизма действия выбранных ингибиторов
3.2.1. Ингибированис З'-процессинга и переноса цепи, катализируемых ИН и комплексом ИНЯЛЯЮР
В соответствии с предложенной схемой исследования, на этапе I была детально оценена способность веществ ингибировать каталитическую активность ИН в реакциях 3'-концевого процессиига и переноса цепи. Были определены значения 1С5о веществ для обеих реакций, из которых следовало, что большинство соединений ингибирует 3'-процессинг с той же эффективностью, что н перенос цепи (Табл. 3, Колонки 1 и 4). Таким образом, выбранные соединения относятся к ингибиторам З'-процессинга или к аллостерическим ингибиторам ИН. Также было установлено, что в присутствие ЬЕБОР/р75 ингибирующее действие веществ, как правило, несколько улучшается (Табл. 3, Колонки 2 и 5). Некоторое улучшение иншбирующей активности веществ по отношению к комплексу указывает на то, что данные соединения могут проявлять
активность по отношению к предшггеграционному комплексу.
3.2.2. Влияние ингибиторов на ДНК-связывакнцую активность ИН
В соответствии с разработанной схемой, далее было решено перейти к этапу П-Б. Действие ингибиторов на связывание ДНК было изучено с использованием метода торможения в геле. Оказалось, что практически все исследуемые соединения в гораздо меньшей степени влияют на суммарное связывание ДНК интегразой, чем на З'-процессинг (Табл. 3, Колонка 7). Этот факт позволил предположить, что ингибиторы взаимодействуют с каталитическим доменом ИН
49
0,4
02Ы
н \-г V
74 N0,
103
ЧА/ огыАД1;!ЛМН2 02Н
109
112
107
о-
Рис. 8. Структуры ннгабяторов интегразы нз классов нитробензофуроксапов, штгробензофуразанов и других нитросодержащих соединений, выбранных для характеристики их механизма действия.
Табл. 3. Ингибирование Н5ФС, НБФЗ и другими шпросоединешшми каталитической активности ИН ВИЧ-1 в реакциях З'-процессинта и переноса цепи, влияние ингибиторов на ДНК-свкзывакнцуп активность ИН и связывание ДНК в активном центре ИН.
№ соед. 1С»*, мкМ
З'-процессинг Перенос цепи Связ. ИНсДНК Связ. ДНК в акт. центре ИН
ИН ИН/ЬЕБОР ИН ИН ИН/ЬЕШР ИН
Мп14 Мп"
1 2 3 4 5 6 7 8
49 50±10 203=5 35±10 80±30 40±15 70±20 500±100 90±20
74 0.5±0.2 0.4±0.1 0.5±0.1 0.4±0.2 0.5±0.1 0.5±0.2 10±2 0.6±0.2
103 30±5 10±3 20±5 35±5 10±1 30±5 500±100 40±10
107 50±10 20±5 40±10 50±20 40±10 45±15 300±50 65±10
109 0.5±0.1 3±1 1.0±0.2 5±2 3±1 4±1 45±10 1.0±0.5
112 4±1 3±0.5 3±1 4±1 5±1 4±1 25±5 6±2
118 6±2 3.0±0.5 5±2 2.0±0.5 4.0±0.5 5±2 25±8 6±2
130 20±5 15±5 20£5 15±5 20±5 25±5 40±10 20±5
* все значения являются усредненными результатами не менее чем 3-х экспериментов
3.2.3. Влияние ингибиторов на правильную укладку ДНК в активном центре ИН
Далее было исследовано влияние веществ на специфическое связывание ДНК в активном центре ИН (Этап П1-А). Значения 1С50 для этих веществ при подавлении ковалентного связывания ДНК в активном центре фермента совпадали с полученными для катализа (Табл. 3, Колонка 8). Этот результат указывает на то, что ингибиторы взаимодействуют с активным центром ИН и препятствуют правильной укладке в нем ДНК-субстрата. При этом связывание ингибиторов не приводит к таким изменениям структуры ИН, которые могли бы полностью блокировать ее ДНК-связывающую активность.
3.2.4. Взаимодействие ингибиторов с ионом металла в активном центре ИН
Основываясь на предположении, что ингибиторы связываются в активном центре фермента, было решено выяснить, взаимодействуют ли данные вещества с ионами металла-кофактора, которые связаны в активном центре ИН и необходимы ей для осуществления процессинга (Этап 1У-А). Оказалось, что ингибиторы не взаимодействуют с ионом металла, поскольку тип металла не оказывает влияния на эффективность ингибирования (Табл. 3, Колонки 1 и 3,4 и 6).
3.2.5. Действие ингибиторов на каталитическую активность ИН в условиях пресформированного комплекса
Дополнительно было решено выяснить, способны ли ингибиторы влиять на каталитическую активность ИН, уже связавшую субстрат. Необходимость этого эксперимента обусловлена тем, что при осуществлении интеграции ИН постоянно остается связанной с вирусной ДНК. Для этого эксперимента было выбрано соединение 74, как одно из наиболее активных. Ингибитор оказался столь же активным по отношению к ИН, предварительно связанной с ДНК-субстратом, как и в условиях, когда ингибитор, ИН и ДНК инкубировались совместно (1С50 = 0.5±0.2 мкМ). Таким образом, ингибитор оказался способен действовать на ИН, связавшую субстрат, поэтому целесообразно было изучить его влияние на клетки, зараженные ВИЧ-1.
В рамках проекта МНТЦ нашими коллегами из Национального института рака г. Фредерик (США) было изучено действие некоторых веществ на МТ-4 клетки, зараженные ВИЧ. К сожалению, наиболее активные in vitro соединения 74 и 109 подавляли репликацию ВИЧ-1 при тех же концентрациях, при которых проявлялась их цитотоксичность для клеток. Только для соединений 49 а 118 ингнбирующее действие проявилось при более низких концентрациях, чем цитотоксичность. Однако индекс селективности (отношение цитотоксичности к величине терапевтического эффекта), показанный этими соединениями, оказался не слишком высок.
Таким образом, был обнаружен новый класс ингибиторов ИН -нитробензофуроксаны и нитробензофуразаны. С использованием разработанного подхода был охарактеризован их механизм действия: они оказались ингибиторами З'-процессинга, которые взаимодействуют с каталитическим центром ИН и препятствуют связыванию в нем и5-субстрата, но при этом они не взаимодействуют с ионом металла-кофактора. В дальнейшем планируется провести дополнительный синтез производных нитробензофуроксанов и -фуразанов, а также структурно-функциональное исследование новых веществ для улучшения их ингибирующей активности и снижения цитотоксичности.
4. Ингибирование интегразы димерными бисбензимидазолами
Одной из возможных стратегий ингибирования интеграции является разработка соединений, которые специфично связываются с вирусной ДНК и препятствуют ее расщеплению ИН. В рамках этой стратегии, нашими коллегами из Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН методами компьютерного моделирования были сконструированы лиганды малой бороздки ДНК, специфично взаимодействующие с АЛГ-ггоследовательностями, - димерные бисбензнмидазолы (DBBI), которые отличались между собой длиной и структурой линкера, соединяющего пары 2,6-замещенных бензимидазольных фрагментов. Линкеры были созданы на основе олигометиленовой и триэтиленгликолевой цепочек (Рис. 9). Было установлено, что
20
наиболее активно ингибирует ИН соединение, имеющее гептаметиленовый линкер, ВВВ1(7). Соединение с более коротким пентаметилсновым линкером подавляло 3'-продессиш- в 3 раза хуже. Наименьшую активность в серии проявляли соединения с наиболее длинным, но гидрофильным триэтиленгликолевым линкером, ОВВЦЗ). Было решено провести детальное исследование механизма действия ОВВ1(7) и ОВВ1(8) для того, чтобы выявить факторы, определяющие столь сильные различия их ингибирующей активности.
4.1. Изучение механизма действия 0ВВ1
4.1.1. Влияние ОВВ1 на З'-процессинг и перекос цепи, катализируемые ИН и комплексом ИН/ЬЕОСР
В первую очередь была детально оценена способность димерных бисбензимидазолов ОВВ1(7) и БВВ1(8) подавлять каталитическую активность ИН (Табл. 4). Оказалось, что ингибирующая активность ОВВ1(7) в обеих реакциях, по крайней мере, на два порядка превышает активность ВВВ1(8). Также оба соединения ингибировали перенос цепи несколько хуже, чем З'-процессинг. Этот факт плохо соответствовал предполагаемому механизму ингибирования за счет экранирования ДНК от связывания с ИН. Кроме того, было установлено, что в присутствии ЬЕООР ингибирующее действие обоих ВВВ1 несколько ухудшается, причем влияние ЬЕПС-Р более выражено в случае ОВВ1(7) (Табл. 4).
4.1.2. Ингибирование БВВ! ДНК-связывающей активности ИН
В соответствии со схемой характеристики механизма действия ингибиторов ИН, была предпринята попытка изучить влияние БВВ! на ДНК-связывающую активность ИН (Этап Н-Б), используя метод торможения в геле. К сожалению, оценить влияние ОВВ1 на ДНК-связывающую активность ИН не удалось, так как положительно заряженные молекулы БВВ1 препятствовали вхождению ДНК в гель. Поэтому при увеличении концентрации ОВВ1 формально наблюдалась стабилизация комплекса ИН/ДНК, хотя этот
О
ЫН
О
НИ
---°х/СН2
Н3С-Ы
Н3С
0ВВ!(8):Я= СН
СНЭ
'2
Рис. 9. Структуры димерных бнсбезомидазолов (ОВВ1).
Табл. 4. Ингибирование димерными бисбеюимидазоламн каталитической активности ИН ВИЧ-1 в реакциях З'-процессинга и переноса цепи и влияние ингибиторов на связывание ДНК в активном центре ИН.
Ингибитор IC50*, МкМ
З'-процессшгг Перенос цепи Связывание ДНК в активном центре ИН Ингибирование З'-процессинга в пресформ. компл. ИН/ДНК
ИН ИН/LEDGF ИН ИН/LEDG F
DBBI(7) 0.033±0.00( 0.14±0.04 0.044±0.017 0.09±0.03 0.052±0.016 0.39±0.10
DBBI(8) 10±2 14±3 16±6 23±8 2б±6 >100
* все значения являются усредненными результатами не менее чем 3-х экспериментов
процесс маловероятен. Тем не менее, было решено продолжить изучение механизма действия ингибиторов по разработанной схеме и параллельно изучить влияние DBBI на правильную укладку ДНК в активном центре ИН (Этап П1-А), и на активность пресформированного комплекс ИН/ДНК (Этап 1П-Б).
4.13. Влияние DBBI на правильную укладку ДНК в активном центре ИН
Было установлено, что DBBI(7) препятствует связыванию ДНК-субстрата в активном центре фермента при концентрациях, сравнимых с теми при которых ингибируется интеграция, a DBBI(8) - при несколько более высоких концентрациях (Табл. 4). Таким образом, ингабирующее действие веществ, и в первую очередь DBBI(7), можно объяснить тем, что они препятствуют правильной укладке ДНК-субстрата в активном центре ИН. Это может быть следствием взаимодействия DBBI как с ДНК, так и с ИН.
4.1.4. Действие DBBI на каталитическую активность ИН в условиях пресформированного комплекса
Была измерена ингибирующая активность DBBI в условиях, когда перед добавлением ингибитора осуществляли преинкубацию ИН с субстратом U5B/U5A. Оказалось, что эффективность ингибирования снижалась, по крайней мере, на порядок по сравнению с условиями, когда DBBI, ИН и ДНК инкубировались совместно (Табл. 4). Это означало, что DBBI не способны ни вытеснять ДНК из уже сформированного комплекса ИН/ДНК, ни инактивировать ИН за счет изменения ее коиформации.
4.1.5. Взаимодействие ингибиторов с ДНК-субстратом
Известно, что димерные бисбензимидазолы обладают высоким сродством к А/Т-последовательностям двухцепочечной ДНК. Соответственно, в рамках изучения механизма действия этих ингибиторов необходимо было оценить константы взаимодействия DBBI с дуплексом U5B/U5A в условиях проведения каталитической реакции.
Для
взаимодействия флуоресценции, собственной
характеристики этого
использовался метод т.к. интенсивность флуоресценции ОВВ1
увеличивается при связывании с ДНК. На основании данных по увеличению интенсивности флуоресценции БВВ1 (Рис. 10А и Б) в присутствии возрастающих концентраций ДНК были построены изотермы связывания и определены константы диссоциации комплексов ОВВ1 с ДНК. Значения К4 для комплексов субстрата ШВ/ША с БВВ1(7) и с ОВВ1(8) была равны 270 ± 20 нМ и 140 ±11 нМ, соответственно.
Значение константы диссоциации комплекса ОВВ1(7) с ДНК оказалось значительно выше, чем значение 1С50 этого ингибитора для З'-процессинга, а в случае ОВВ1(8), наоборот, константа диссоциации была намного ниже, чем 1С50 (Табл. 4). Очевидно, что ингибирсвание интеграции ни одним из исследуемых соединений нельзя объяснить конкуренцией ингибитора и ИН за связывание с ДНК. В случае ОВВ1(7) ингибирование интеграции происходит при концентрациях, когда ингибитор еще не связан с ДНК-субстратом. БВВ1(8) может связаться с ДНК, но либо это не препятствует связыванию ИН со своим ДНК-субстратом и его процессингу, либо ИН вытесняет ингибитор из его комплекса с ДНК и осуществляет процессинг субстрата.
Таким образом, используя разработанную систему подходов, удалось показать, что ингибирование интеграции БВВГ осуществляется за счет взаимодействия этих ингибиторов с ИН, а не с ДНК. Ингибиторы препятствовали правильной укладке ДНК в активном центре ИН. Однако использованные методы не позволили определить, чем объясняется разница в эффективности ингибирования каталитической активности ИН ОВВ1(7) и ВВВ1(3). Было решено построить кинетические модели взаимодействия ОВВ1 с ИН и определить тип ингибирования для этих соединений.
«0 450 500 Длина волны, км
Рис. 10. Увеличение интенсивности флуоресценции 50 нМ ОВВ1(7) (А> и 50 нМ 1}ВВ1(8) (Б) в присутствии Ш-субстрата (концентрации ДНК в мк.М
4.1.6. Построение кинетической модели взаимодействия ИН с ингибитором на основе зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата и ингибитора для определения К,
Для определения типа ингибирования ОВВ1(7) были найдены зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концешрации субстрата при различных концентрациях ингибитора (Рис. 11 А). На основании полученных данных предложена модель полного конкурентного ингибирования ферментативной активности. В соответствии с моделью были получены значения константы Михаэлиса Кт - 9.5±2.9 нМ и константы ингибирования АГ/ = 30±5 нМ.
Таким образом, ОВВ1(7) является конкурентным ингибитором ИН, причем ингибирующее действие 1>ВВ1(7) обусловлено именно взаимодействием с ИН, а не с ДНК. Этот вывод хорошо согласуется с результатами изучения влияния ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН. В условиях ферментативной реакции ОВВ1(7) конкурирует с Ш-субстратом за связывание в активном центре ИН и именно поэтому эффективно подавляет ковалентное присоединение субстрата к ИН. Конкурентный механизм хорошо согласуется и с фактом 4-х кратного повышения 1С50(РВВ1(7)) для 3'-процессинга в присутствии ЬЕОйР. Дело в том, что ЬЕООР также взаимодействует с каталитическим доменом ИН и, следовательно, он может препятствовать связыванию с ним ОВВ1(7).
Совсем другой вид приобретают эти зависимости, когда в качестве ингибитора используется БВВ1(8) (Рис. 11Б). Вид кривых свидетельствует в пользу схемы неконкурентного ингибирования ИН, тем не менее, учитывая, что величина эффективной константы Михаэлиса не постоянна, можно предположить более сложной механизм ингибирования ферментативной активности. Очевидно, однако, что связывание БВВ1(8) вне активного центра ИН тем не менее препятствует правильной укладке ДНК-субстрата в активном центре ИН. С учетом найденных ранее величин была достоверно определена величина константы ингибирования А7= 4.7±0.б мкМ.
я
¡5
^ ¡0
• 0
о 0.003
д. 0.01
V 0.0175
♦ 0.025
1/[Ш1, нМ'1
гг
V»'.
■ 0
о 1
* 2.5
3.75
♦ 5
0.3
1/[Ю]0, нМ"'
Рис. 11. Зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при различных концентрациях ОВВ1(7) (А) и ОВВЩ) (Б) в координатах Лайяуивера-Берка. Концентрации ингибиторов (в мкМ) указаны на графике.
выводы
1. Разработан набор подходов, позволяющий охарактеризовать механизм действия ингибиторов интегразы ВИЧ-1 in vitro.
2. Охарактеризован комплекс интегразы с ее клеточным кофактором LEDGF/p75; установлено, что в присутствии LEDGF ускоряется связывание, увеличивается начальная скорость и эффективность З'-процессинга 40-звенного ДНК-субстрата; определено, что шестое положение непроцессируемой цепи субстрата сближено с остатком лизина 264 интегразы.
3. Найден новый класс ингибиторов интегразы - нитробензофуроксаны/ нитробензофуразаны; с использованием разработанных подходов изучен механизм их действия и показано, что они относятся к ингибиторам З'-процессинга, связываются в активном центре фермента и препятствуют связыванию в нем ДНК- субстрата.
4. Показано, что димерные бисбензимидазолы, DBBI, способны ингибировать обе стадии интеграции, при этом эффективность ингибирования существенно зависит от природы линкера, соединяющего остатки бисбензимидазола. Установлено, что DBBI взаимодействуют с иитегразой и препятствуют правильной укладке ДНК в ее активном центре; на основании всех полученных результатов сделан вывод о том, что разная ингибирующая активность DBBI(7) и DBBI(8) обусловлена разным механизмом их действия: DBBI(7) является конкурентным ингибитором интегразы, в то время как для DBBI(8) предполагается скорее неконкурентный механизм ингибирования.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Smolov М., Gottikh М., Tashlitskii V., Korolev S., Demidyuk I., Brochon J.C., Mouscadet J.F., Deprez E. Kinetic study of the HIV-1 DNA З'-end processing. Single-turnover property of integrase.//FEBSJ., 2006,273,1137-1151.
2. Zhuse A.L., Gromyko A.V., Ivanov A.A., Salynov V.I., Popov K.V., Korolev S.P.. Gottikh M B., Oleynikov V.A., Streltsov S.A. New highly fluorescing bis-Hoechsts: physicochemical, biochemical and cytological studies. //J. Biomol. Struct. Dyn., 2007,24(6), 666-668.
3. Громыко A.B., Салянов В.И., Стрельцов С .А., Олейников В.А., Королев С.П.. Готтих М.Б., Жузе A.JI. Лиганды, специфичные к определенным последовательностям пар оснований ДНК. ХП1. Новые димерные молекулы Хёхста 33258. Синтез, взаимодействие с ДНК, ингибирование интегразы ВИЧ-1. // Биоорган. Химия., 2007, 33(6), 613-623.
4. Michel F., Crucifix С., Granger F., Eiler S., Mouscadet J-F., Korolev S.. Agapkina J., Ziganshin R., Gottikh M., Nazabal A., Emiliani S., Benarous R., Moras D., Schultz P., and RuffM. (2009) Structural basis for HIV-l DNA integration in the human genome, role of the LEDGF/p75 cofactor. HEMBOJ., 2009, 28(7), 980-991.
5. Королев С.П. Изучение структуры комплекса интегразы ВИЧ-1 с ДНК методом аффинной модификации // Материалы Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломопосов-2006", секция "Химия. Науки о живом", г. Москва, 12-15 апреля 2006 года, том 2, стр. 26.
6. Agapkina Y., Korolev S.. Aleksandrov D., Romanova E., Shevelev S., Poroikov V., Gottikh M. Study of the new HIV-1 integrase inhibitors mechanism of action using modified substrates // Abstracts of 32nd FEBS Congress - Molecular Machines, Vienna, Austria, 7-12 July, 2007, FEBS Journal 274 (si), p. 239.
7. Прокофьев O.H., Королев С.П., Агапкина Ю.Ю., Смолов М.А., Готтих М.Б. Изучение функциональной активности комплекса интегразы ВИЧ-1 с фактором транскрипции LEDGF/p75 И VI съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008 года, стр. 85.
8. Королев С.П.. Агапкина Ю.Ю., Готтих М.Б. Разработка подхода для изучения механизма действия ингибиторов интегразы вируса иммунодефицита человека // XVI Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 6-10 апреля 2009 г., стр. 540.
9. Готтих М.Б., Королев С.П.. Приказчикова Т.А., Агапкина Ю.Ю., Смолов М.А. Нанокомплексы модифицированных олигонуклеотидов с транспортными пептидами -ингибиторы интеграции и репликации ВИЧ-1 // Научная конференция «Bionano'09. Химическая биология, фундаментальные проблемы бионанотехнологии», Новосибирск, 10-14 июня 2009 г., стр. 19.
10. Sergei Korolev. Tatiana Prikazchikova, Julia Agapkina, Maksim Smolov, Marina Gottikh. Short modified oligonucleotides as efficient allosteric inhibitors of HIV-1 integrase II Nucleic Acids at the Chemistry-Biology Interface, Manchester, UK, 7-8 September, 2009, p. 10.
Подписано в печать:
12.05.2010
Заказ № 3722 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ИНТЕГРАЦИИ ВИЧ-1 /обзор литературы/.
2.1. СТАДИИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ.
2.2. МЕХАНИЗМ ИНТЕГРАЦИИ ВИЧ-1.
2.2.1. Реакции, осуществляемые ИН.
2.2.2. Строение ИН.
2.3. СОЗДАНИЕ ИНГИБИТОРОВ ИНТЕГРАЦИИ ВИЧ-1, ПОДАВЛЯЮЩИХ РЕАКЦИЮ ПЕРЕНОСА ЦЕПИ.
2.3.1. L-731,
2.3.2. 5С1ТЕР.
2.3.3. S-1360.
2.3.4. L-870,810 и L-870,812.
2.4. РАЛТЕГРАВИР - ПЕРВЫЙ РАЗРЕШЕННЫЙ К ПРИМЕНЕНИЮ ИНГИБИТОР ИНТЕГРАЦИИ ВИЧ-1.
2.4.1. Создание ралтегравира.
2.4.2. Фармакокинетика и взаимодействие с компонентами ВААРТ.
2.4.3. Клинические испытания.
2.4.4. Безопасность.
2.4.5. Рекомендации к применению.
2.4.6. Возникновение устойчивости к ралтегравиру.
2.5. АНАЛОГИ РАЛТЕГРАВИРА - ИНГИБИТОРЫ ИНТЕГРАЦИИ ВИЧ-1.
2.5.1. МК
2.5.2. BMS
2.5.3. Элвитегравир (GS-9137).
2.5.3.1. Фармакокинетика и взаимодействие с компонентами ВААРТ.
2.5.3.2. Клинические испытания.
2.5.3.3. Безопасность.
2.5.3.4. Возникновение устойчивости к элвитегравиру.
2.5.4. GSK-364735.
2.5.5. S/GSK1349572.
2.5.6. Новые ингибиторы ИН, созданные на основе ралтегравира.
2.5.7. Перспективы применения аналогов ралтегравира в качестве ингибиторов интеграции.
2.6. АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПУТИ ИНГИБИРОВАНИЯ ИНТЕГРАЦИИ ВИЧ-1.
2.6.1. Ингибиторы З'-процессинга.
2.6.2. Аллостерические ингибиторы.
2.6.3. Ингибиторы мультимеризации интегразы.
2.6.4. Ингибиторы взаимодействия ИН с LEDGF/p75.
Синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД) — одна из самых масштабных эпидемий конца XX - начала XXI вв. СПИД вызывается вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), который поражает иммунную систему организма. Согласно оценкам всемирной организации здравоохранения, к концу 2008 года число людей, зараженных ВИЧ, во всем мире составляло 33,4 миллиона человек (Рис. 1) [1]. Число людей, заразившихся ВИЧ в 2008 году, составило 2.7 миллиона человек, более 2.1 миллионов человек умерли от СПИДа. Каждый день в мире вирусом СПИДа заражаются 7400 человек. Одни из самых высоких темпов роста заражения ВИЧ-инфекцией в мире наблюдаются в Украине и России. По некоторым оценкам, распространенность ВИЧ среди взрослого населения России составляет более 1.1% (Рис. 1) [1]. Именно поэтому задача разработки эффективных лекарственных препаратов для борьбы с этим вирусом является особенно актуальной для нашей страны. ъ
Fiic. I. Глобальная картина ВИЧ-мнфекцин по данным всемирной организации здравоохранения (на начало 2009 года) [I]. Слева вверху указана шкала показателя распространенности ВИЧ (в %) среди взрослых 15-49 лет.
Одной из самых привлекательных мишеней для разработки ингибиторов ВИЧ-1 является вирусный фермент интеграза (ИИ), катализирующая интеграцию вирусной ДНК в клеточную - ключевую стадию в репликативном цикле ВИЧ. Показано, что вирус, содержащий дефектную интегразу, не способную осуществлять интеграцию вирусной ДНК, не размножается в культуре клеток [2], Это говорит о ключевой роли стадии интеграции в репликативном цикле ВИЧ. Кроме того, остановка репликации вируса при нарушении функций интегразы свидетельствует также о том, что клетка не содержит каких-либо собственных ферментов, способных катализировать интеграцию. В связи с этим, ингибиторы, специфично подавляющие каталитическую активность ИН, не должны влиять на другие клеточные процессы и, как следствие, должны быть менее токсичны для клетки и всего организма в целом по сравнению с ингибиторами других стадий репликативного цикла ВИЧ.
На настоящий момент протестировано более 250 ООО потенциально-возможных ингибиторов интегразы, но только один из них — препарат Isentress™ или ралтегравир — официально разрешен к применению в качестве одного из компонентов высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) [3, 4]. Данный вид терапии помимо ингибитора ИН включает лекарственные препараты, направленные на подавление трех стадий репликативного цикла ВИЧ: обратной транскрипции, протеолитического созревания и проникновения вирусной частицы в клетку. Необходимость использования комплексной терапии обусловлена быстрой эволюцией ВИЧ, которая приводит к появлению устойчивых к препаратам форм вируса. Однако даже комплексная терапия не способна полностью подавить репликацию вируса и с течением времени к ней развивается устойчивость. Так показано, что устойчивость к ралтегравиру развивается у некоторых пациентов в течение 12 недель [5]. Необходимо отметить, что на стадии клинических испытаний находятся только близкие к ралтегравиру по механизму действия ингибиторы. Уже показано, что к ним развивается устойчивость, перекрестная с ралтегравиром [6]. В связи с этим разработка новых ингибиторов интеграции, механизм действия которых отличается от действия ралтегравира, является актуальной задачей.
Поиск новых ингибиторов осложняется тем, что зачастую активные in vitro ингибиторы, оказываются неактивными in vivo [7, 8]. Эксперименты на культуре ВИЧ-инфицированных клеток достаточно трудоемки и дороги, поэтому, несомненно, актуальным является создание системного подхода к оценке механизма действия ингибиторов, который позволил бы отсеять соединения, неспособные работать in vivo, а также обладающие механизмом действия, схожим с уже известными ингибиторами, к которым выработались устойчивые штаммы вируса.
Цель настоящей работы заключалась в создании системы методов, позволяющей охарактеризовать механизм ингибирования ИН различными соединениями и дать рекомендации по дальнейшему применению новых ингибиторов. Была разработана и апробирована система подходов для характеристики ингибиторов ИН с различными механизмами действия in vitro. Эта система, в частности, позволяет сказать какой этап интеграции подавляется, связывается ли ингибитор в каталитическом центре ИН или с С-концевым доменом белка, взаимодействует ли ингибитор с ионом металла в активном центре ИН, способен ли действовать на пресформированный комплекс ИН/ДНК. Разработана методика, позволяющая изучать влияние ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН. Кроме того, изучено влияние клеточного партнера ИН, LEDGF/p75, на каталитическую и ДНК-связывающую активность фермента. С использованием метода кросс-линкинга уточнено расположение вирусной ДНК в ее комплексе с ИН и LEDGF. Предложено использовать комплекс ИН/LEDGF в качестве более адекватной модели для характеристики действия ингибиторов ИН ВИЧ-1 in vitro. Исследование действия ингибиторов на активность ИН в комплексе с LEDGF позволит дать рекомендации к дальнейшему изучению их действия на культуре ВИЧ-инфицированных клеток.
Совокупность предложенных подходов была использована для поиска и характеристики новых ингибиторов ИН ВИЧ-1. Найден новый класс низкомолекулярных ингибиторов интегразы: нитробензофуроксаны/ нитробензофуразаны, изучен механизм их действия и показано, что они относятся к ингибиторам З'-процессинга, связываются в активном центре ИН, препятствуют связыванию в нем ДНК-субстрата ' и не взаимодействуют с ионом металла-кофактора.
Исследовано влияние димерных бисбензимидазолов (DBBI) на процесс интеграции. Показано, что эти соединения способны ингибировать обе стадии интеграции за счет нарушения правильной укладки ДНК-субстрата в активном центре ИН. Эффективность ингибирования зависит от природы линкера, соединяющего пары бензимидазолов, и может различаться в 300 раз. На основании всех полученных результатов сделан вывод о том, что разная ингибирующая активность DBBI обусловлена разным механизмом их действия: DBBI с гептаметиленовым линкером является конкурентным ингибитором интегразы, в то время как для DBBI с триэтиленгликолевым линкером предполагается неконкурентный или более сложный механизм ингибирования.
Работа включает обзор литературы, посвященный проблемам и перспективам клинического применения ингибиторов интеграции ВИЧ-1.
6. выводы
1. Разработан набор подходов, позволяющий охарактеризовать механизм действия ингибиторов интегразы ВИЧ-1 in vitro.
2. Охарактеризован комплекс интегразы с ее клеточным кофактором LEDGF/p75; установлено, что в присутствии LEDGF ускоряется связывание, увеличивается начальная скорость и эффективность З'-процессинга 40-звенного ДНК-субстрата; определено, что шестое положение непроцессируемой цепи субстрата сближено с остатком лизина 264 интегразы.
3. Найден новый класс ингибиторов интегразы - нитробензофуроксаны/ нитробензофуразаны; с использованием разработанных подходов изучен механизм их действия и показано, что они относятся к ингибиторам З'-процессинга, связываются в активном центре фермента и препятствуют связыванию в нем ДНК- субстрата.
4. Показано, что димерные бисбензимидазолы, DBBI, способны ингибировать обе стадии интеграции, при этом эффективность ингибирования существенно зависит от природы линкера, соединяющего остатки бисбензимидазола; установлено, что DBBI взаимодействуют с интегразой и препятствуют правильной укладке ДНК в ее активном центре; на основании всех полученных результатов сделан вывод о том, что разная ингибирующая активность DBBI(7) и DBBI(8) обусловлена разным механизмом их действия: DBBI(7) является конкурентным ингибитором интегразы, в то время как для DBBI(8) предполагается скорее неконкурентный механизм ингибирования.
1. http://www.unaids.org/ru
2. Сага A., Guarnaccia F., Reitz M.S. Jr., Gallo R.C., Lori F. Self-limiting, cell type-dependent replication of an integrase-defective human immunodeficiency virus type 1 in human primary macrophages but not T lymphocytes. // Virology, 1995, 208,242-248;
3. FDA approves raltegravir tablets. // AIDS Patient Care STDS, 2007,21(11), 889.
4. Приказчикова Т.А., Сычева A.M., Агапкина Ю.Ю., Александров Д.А., Готтих М.Б. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1 как новый компонент противовирусной терапии. // Успехи химии, 2008, 77(5), 445-459.
5. Farnet C.M., Wang В., Lipford J.R., Bushman F.D. Differential inhibition of HIV-1 preintegration complexes and purified integrase protein by small molecules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93(18), 9742-9747.
6. Neamati N., Mazumder A., Zhao H., Sunder S., Burke T.R. Jr., Schultz R.J., Pommier Y. Diarylsulfones, a novel class of human immunodeficiency virus type 1 integrase inhibitors. // Antimicrob. Agents Chemother., 1997, 41(2), 385-393.
7. Simon V., Ho D.D., Abdool Karim Q. HIV/AIDS epidemiology, pathogenesis, prevention, and treatment. И Lancet, 2006, 368(9534), 489-504.
8. Turner B.G., Summers M.F. Structural biology of HIV. II J. Mol. Biol., 1999, 285, 1-32.
9. Miller M. D., Farnet С. M., Bushman F. D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. // J. Virol., 1997, 71, 5382-5390.
10. Piller S.C., Caly L., Jans D.A. Nuclear import of the pre-integration complex (PIC): the achilles heel of HIV? // Cur. Drug. Targets, 2003, 409-429.
11. Li L., Olvera J., Yoder K., Mitchell R.S., Butler S.L., Lieber M., Martin S.L., Bushman F.D. Role of non-homologous end joining pathway in early steps of retroviral infection. // EMBO J., 2001,20, 3272-3281.
12. Farnet C.M., Bushman F.D. HIV-1 cDNA integration: requirement of HMG I(Y) protein for function of preintegration complen complexes in vitro. // Cell, 1997, 88, 483-492.
13. Lin C.W., Engelman A. The barrier-to-autointegration factor is a component of functional HIV type 1 preintegration complexes. II J. Virol., 2003, 77, 5030-5036.
14. Marcelin A.G., Ceccherini-Silberstein F., Perno C.F., Calvez V. Resistance to novel drug classes. // Curr. Opin. HIV AIDS, 2009, 4(6), 531-537.
15. Al-Mawsawi L.Q., Al-Safi R.I., Neamati N. Anti-infectives: clinical progress of HIV-1 integrase inhibitors. I I Expert Opin. Emerg. Drugs, 2008,13(2), 213-225.
16. Агапкина Ю. Ю., Приказчикова Т. А., Смолов M. А., Готтих М. Б. Структура и функции интегразы ВИЧ-1. // Yen. Биол. Хим., 2005,45, 87-122.
17. Engelman A., Cherepanov P. The lentiviral integrase binding protein LEDGF/p75 and HIV-1 replication. /I PLoSPathog., 2008, 4(3), el000046.
18. Delelis О., Carayon К., Saib A., Deprez E., Mouscadet J.F. Integrase and integration: biochemical activities of HIV-1 integrase. // Retrovirology, 2008, 5, 114.
19. Zheng R., Jenkins T.M., Craigie R. Zinc folds the N-terminal domain of HIV-1 integrase, promotes multimerization, and enhances catalytic activity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93(24), 13659-13664.
20. Gallay P., Hope Т., Chin D., Trono D. HIV-1 infection of nondividing cells through the recognition of integrase by the importin/karyopherin pathway. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 94, 9825-9830.
21. Podtelezhnikov A.A., Gao K., Bushman F.D., McCammon J.A. Modeling HIV-1 integrase complexes based on their hydrodynamic properties. // Biopolymers., 2003, 68(1), 110-120.
22. Wielens J., Crosby I.T., Chalmers D.K. A three-dimensional model of the human immunodeficiency virus type 1 integration complex. // J. Comput. Aided Mol. Des., 2005, 19(5), 301-317.
23. Ren G., Gao K., Bushman F.D., Yeager M. Single-particle image reconstruction of a tetramer of HIV integrase bound to DNA. II J. Mol. Biol., 2007, 366(1), 286-294.
24. Hare S., Gupta S.S., Valkov E., Engelman A., Cherepanov P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. II Nature, 2010, 464(7286), 232-236.
25. Sinha S., Pursley M.H., Grandgenett D.P. Efficient concerted integration by recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase without cellular or viral cofactors. // J. Virol., 2002,76,3105-3113.
26. Van Maele В., Debyser Z. HIV-1 Integration: an interplay Between HIV-1 Integrase, Cellular and Viral Proteins. II AIDS Rev., 2005, 7, 26-43.
27. Yu F., Jones G.S., Hung M., Wagner A.H., MacArthur H.L., Liu X., Leavitt S., McDermott M.J., Tsiang M. HIV-1 integrase preassembled on donor DNA is refractory to activity stimulation by LEDGF/p75. // Biochemistry, 2007,46(10), 2899-2908.
28. Marchand C., Zhang X., Pais G.C.G., Cowansage K., Neamati N., Burke T.R., Pommier Y. Structural determinants for HIV-1 integrase inhibition by p-diketo acids. // J. Biol. Chem., 277, 2002, 12596-12603.
29. Billich A. S-1360 Shionogi-GlaxoSmithKline. // Curr. Opin. Investig. Drugs, 2003, 4(2), 206-209.
30. Schafer J.J., Squires K.E. Integrase inhibitors: a novel class of antiretroviral agents. // Ann. Pharmacother., 2010, 44(1), 145-156.
31. Menard A., Solas C., Mokthari S., Bregigeon S., Drogoul M.P., Tamalet C., Lacarelle В., Martin I.P. Etravirine-raltegravir, a marked interaction in HIV-1-infected patients: about four cases. II AIDS, 2009, 23(7), 869-871.
32. FDA notifications. Raltegravir indication extended for treatment-naive patients. // AIDS Alert, 2009, 24(8), 93.
33. Serrao E., Odde S., Ramkumar K., Neamati N. Raltegravir, elvitegravir, and metoogravir: the birth of "me-too" HIV-1 integrase inhibitors. // Retrovirology, 2009, 6, 25.
34. Correll Т., Klibanov O.M. Integrase inhibitors: a new treatment option for patients with human immunodeficiency virus infection. И Pharmacotherapy, 2008, 28(1), 90-101.
35. DeJesus E., Berger D., Markowitz M., Cohen C., Hawkins Т., Ruane P., Elion R., Farthing
36. Ceccherini-Silberstein F., Malet I., D'Arrigo R., Antinori A., Marcelin A.G., Perno C.F. Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation. II AIDS Rev., 2009, 11(1), 17-29.
37. Goethals O., Clayton R., Van Ginderen M., Vereycken I., Wagemans E., Geluykens P., Dockx K., Strijbos R., Smits V., Vos A., Meersseman G., Jochmans D., Vermeire K., Schols
38. D., Hallenberger S., Hertogs K. Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors. II J. Virol., 2008, 82(21), 10366-10374.
39. Min S., Song I., Borland J., Chen S., Lou Y., Fujiwara Т., Piscitelli S.C. Pharmacokinetics and safety of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor, in healthy volunteers. /I Antimicrob. Agents Chemother., 2010, 54(1), 254-258.
40. Ramkumar K., Serrao E., Odde S., Neamati N. HIV-1 integrase inhibitors: 2007-2008 update. II Med. Res. Rev., 2010, 30(5), 750-814.
41. Di Francesco M.E., Pace P., Fiore F., Naimo F., Bonelli F., Rowley M., Summa V. Development of 2-t butyl-N-methyl pyrimidones as potent inhibitors of HIV integrase. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18(8), 2709-2713.
42. Jin H., Wright M., Pastor R., Mish M., Metobo S., Jabri S., Lansdown R, Cai R., Pyun P., Tsiang M., Chen X., Kim C.U. Tricyclic HIV integrase inhibitors: potent and orally bioavailable C5-aza analogs. И Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18(4), 1388-1391.
43. Marinello J., Marchand C., Mott B.T., Bain A., Thomas C.J., Pommier Y. Comparison of raltegravir and elvitegravir on HIV-1 integrase catalytic reactions and on a series of drug-resistant integrase mutants. // Biochemistry, 2008, 47(36), 9345-9354.
44. Nakahara K., Wakasa-Morimoto C., Kobayashi M., Miki S., Noshi Т., Seki Т., Kanamori-Koyama M., Kawauchi S., Suyama A., Fujishita Т., Yoshinaga Т., Garvey E.P., Johns B.A.,
45. Foster S.A., Underwood M.R., Sato A., Fujiwara T. Secondary mutations in viruses resistant to HIV-1 integrase inhibitors that restore viral infectivity and replication kinetics. // Antiviral Res., 2009,81(2), 141-146.
46. Deprez E., Barbe S., Kolaski M., Leh H., Zouhiri F., Auclair C., Brochon J.-C., Le Bret M., Mouscadet J.-F. Mechanism of HIV-1 integrase inhibition by styrylquinoline derivatives in vitro. И Mol. Pharmacol., 2004, 65 (1), 85-98.
47. Pannecouque C., Pluymers W., Van Maele В., Tetz V., Cherepanov P., De Clercq E., Witvrouw M., Debyser Z. New class of HIV integrase inhibitors that block viral replication in cell culture. II Curr. Biol., 2002, 12(14), 1169-1177.
48. Al-Mawsawi L.Q, Fikkert V., Dayam R., Witvrouw M., Burke Jr. T.R., Borchers C.H., Neamati N. Discovery of a small-molecule HIV-1 integrase inhibitor-binding site. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103(26), 10080-10085.
49. Al-Mawsawi L.Q., Christ F., Dayam R., Debyser Z., Neamati N. Inhibitory profile of a LEDGF/p75 peptide against HIV-1 integrase: insight into integrase-DNA complex formation and catalysis. И FEBSLett., 2008, 582(10), 1425-1430.
50. Puras Lutzke RA, Vink C, Plasterk RH. Characterization of the minimal DNA-binding domain of the HIV integrase protein. II Nucleic Acids Res., 1994, 22(20), 4125-4131.
51. Приказчикова Т.А. Интеграза ВИЧ-1: Ингибнрование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами. Дисс. канд. хим. наук. МГУ, Москва, 2007.
52. Engelman A., Cherepanov P. The Lentiviral Integrase Binding Protein LEDGF/p75 and HIV-1 Replication. II PLoS, 2008, 4, 1-9.
53. Cherepanov P., Maertens G., Proost P., Devreese В., Van Beeumen J., Engelborghs Y., De Clercq E., Debyser Z. (2003): HIV-1 integrase forms stable tetramers and associates with LEDGF/p75 protein in human cells. II J. Biol. Chem., 278, 372-381.
54. Cherepanov P., Ambrosio A.L., Rahman S., Ellenberger Т., Engelman A. Structural basis for the recognition between HIV-1 integrase and transcriptional coactivator p75. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005,102(48), 17308-17313.
55. Nazabal A., Wenzel R.J., Zenobi R. Immunoassays with direct mass spectrometric detection. II Anal. Chem., 2006, 78, 3562-3570.
56. Смолов M.A. Изучение молекулярных основ взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК. Дисс. канд. хим. наук. МГУ, Москва, 2006.
57. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М: ФАИР-ПРЕСС, 1999.
58. Busschots К., Vercammen Jo, Emiliani S., Benarous R., Engelborghs Y., Christ F., Debyser Z. The interaction of LEDGF/p75 with integrase is lentivirus-specific and promotes DNA binding. II J. Biol. Chem., 2005, 280, 17841-17847.
59. Agapkina J., Smolov M., Barbe S., Zubin E., Zatsepin Т., Deprez E., Le Bret M., Mouscadet J.-F., Gottikh M. Probing of HIV-1 integrase-DNA interactions using novel analogs of viral DNA. II J. Biol. Chem., 2006, 11530-11540.
60. Esposito D., Craigie R. Sequence specificity of viral end DNA binding by HIV-1 integrase reveals critical regions for protein-DNA interaction. // EMBOJ., 1998, 17, 5832-5843.
61. Kachalova A.V., Zatsepin T.S., RomanovaE.A., Stetsenko D.A., Gait M.J., Oretskaya T.S. Synthesis of modified nucleotide building blocks containing electrophilic groups in the 2'-position. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2000, 19, 1693-1707.
62. Chiu Т.К., Davies D.R. Structure and function of HIV-1 integrase. // Curr. Top. Med. Chem., 2004, 4, 965-977.
63. Heuer T.S., Brown P.O. Mapping features of HIV-1 integrase near selected sites on viral and target DNA molecules in an active enzyme-DNA complex by photo-cross-linking. // Biochemistry, 1997,36, 10655-10665.
64. Engelman A, Craigie R. Identification of conserved amino acid residues critical for human immunodeficiency virus type 1 integrase function in vitro. // J. Virol., 1992, 66(11), 63616369.
65. Johnson A.A., Marchand C., Patil S.S., Costi R., Di Santo R., Burke T.R.-Jr., Pommier Y. Probing HIV-1 integrase inhibitor binding sites with position-specific integrase-DNA cross-linking assays. // Mol. Pharmacol., 2007, 71(3), 893-901.
66. Semenova E.A., Johnson A.A., Marchand C., Davis D.A., Yarchoan R., Pommier Y. Preferential inhibition of the magnesium-dependent strand transfer reaction of HIV-1 integrase by alpha-hydro xytropolones. I I Mol. Pharmacol., 2006, 69(4), 1454-1460.
67. Ghosh P., Ternai В., Whitehouse M. Benzofurazans and benzofiiroxans: biochemical and pharmacological properties. // Med. Res. Rev., 1981, 1(2), 159-187.
68. Medana C, Di Stilo A, Visentin S, Fruttero R, Gasco A, Ghigo D, Bosia A. NO donor and biological properties of different benzofiiroxans. // Pharm. Res., 1999,16(6), 956-960.
69. Ata A., Udenigwe С.С. The Discovery and Application of Inhibitors of Glutathione S-Transferase as Therapeutic Agents. // Current Bioactive Compounds, 2008, 4(1), 41-50.
70. Mouscadet J.-F., Carteau S., Goulaouic H., Subra F., Auclair C. Triplex-mediated inhibition of HIV DNA integration in vitro. И J. Biol. Chem., 1994, 269, 21635-21638.
71. Zakharova O.D., Baranova S., Parissi V., Ryabinin V.A., Sinyakov A.N., Litvak S., Litvak L.T., Nevinsky G.A. HIV-1 integrase inhibition by pyrrole/imidazole-containing polyamides. II J. Pept. Res., 2005, 66, 138-145.t
72. Streltsov S.A., Gromyko A.V., Oleinikov V.A., Zhuze A.L. The Hoechst 33258 covalent dimmer covers a total turn of the double-stranded DNA. // J. Biomol. Struct. Dyn., 2006, 24(3), 285-302.
73. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М: Мир, 1979.
74. Stensballe A., Jensen O.N., Olsen J.V., Haselmann K.F., Zubarev R.A. Electron capture dissociation of singly and multiply phosphorylated peptides. // Rapid Commun. Mass Spectrom., 2000, 14, 1793-1800
75. Rappsilber J., Mann M., Ishihama Y. Protocol for micro-purification, enrichment,pre-fractionation and storage of peptides forproteomics using StageTips. // Nature Protocols, 2007, 2, 1896-1906.
