Синтез и исследование свойств глицеролипидных производных нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ для повышения их биодоступности

Дьякова, Людмила Николаевна

Синтез и исследование свойств глицеролипидных производных нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ для повышения их биодоступности тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Дьякова, Людмила Николаевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез и исследование свойств глицеролипидных производных нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ для повышения их биодоступности»

Автореферат диссертации на тему "Синтез и исследование свойств глицеролипидных производных нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ для повышения их биодоступности"

На правах рукописи

ДЬЯКОВА ЛЮДМИЛА НИКОЛАЕВНА

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОЙАНИЕ СВОЙСТВ ГЛИЦЕРОЛИПИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НУКЛЕОЗИДНЫХ ИНГИБИТОРОВ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТ АЗЫ ВИЧ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИХ БИОДОСТУПНОСТИ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

21 моя 2013

005538713

МОСКВА - 2013

005538713

Работа выполнена на кафедре Биотехнологии и Бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Кандидат химических наук, доцент

Шастина Наталья Сергеевна

Официальные оппоненты:

Чупин Владимир Викторович - д.х.н., проф., ведущий научный сотрудник лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Есипов Дмитрий Станиславович - к.х.н., доцент кафедры биоорганической химии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Московский педагогический государственный университет

Защита диссертации состоится « 9 » декабря 2013 г. в !5.о0часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова (119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86).

Автореферат разослан « в » ноября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ* Актуальность проблемы. В настоящее время для лечения пациентов, инфицированных ВИЧ, применяется высокоактивная антиретровирусная терапия, основанная на использовании нескольких препаратов, направленных на различные стадии жизненного цикла вируса, в том числе на обратную транскрипцию. Нуклеозидные препараты, конкурируя с природными субстратами обратной транскриптазы, терминируют растущую цепь прав ярусной ДНК, препятствуя работе данного фермента. Однако применяемые в терапии вирусных заболеваний нуклеозидные соединения наряду с высокой эффективностью действия имеют существенные недостатки, связанные с их низкой биодоступностью, низкой способностью к трансмембранному транспорту, формированием резистентных вирусных штаммов, необходимостью использования высоких доз этих лекарственных соединений, что сказывается на проявлении ими токсических свойств.

Одним из подходов для преодоления вышеперечисленных недостатков является подход биоимитации, основанный на структурной модификации данных химиотерапевтических агентов с помощью создания конъюгатов анти-ВИЧ-активных нуклеозидов с веществами липидной природы (жирными кислотами, диацилглицеринами, фосфолипидами, холестерином). Данная стратегия, во-первых, позволяет значительно улучшить биотранспортные характеристики нуклеозидных препаратов за счёт придания им гидрофобных свойств, а кроме того дает возможность нацеливания анти-ВИЧ-нуклеозидов на лимфатическую систему (увеличения их лимфотропности), что обусловлено путями метаболизма соединений липидной природы в организме человека, при этом лимфатический транспорт позволяет избежать первичного метаболизма этих соединений в печени, таким образом повышая их биодоступность. Кроме того, он обеспечивает направленное воздействие модифицированных препаратов на вирусы, так как последние локализуются и распределяются в организме главным образом в лимфатической системе. Поэтому актуальными задачами являются разработка методов получения липидмодифицированных нуклеозидов, исследование их свойств в модельных буферных и клеточных системах, а также зависимости свойств липонуклеозидов от их структуры.

"Сокращения: ВИЧ - вирус иммунодефицита человека, ЦПД - цитопатическое действие вируса, А2Т -З'-азидо-З'-дезокситимидин, с!4Т — 2',3'-дидегидро-3'-дидезокситимидин, ОСС - N,>1'-дициклогексилкарбодиимид, ЭМАР - 4-диметиламинопиридин, вго - глицерин, 1т - имидазол, МТ-4 клетки - Т-лимфоидные клетки человека, РгеО - пивалоилхлорид, Ру - пиридин.

лимитирующей их действие: предварительное создание функциональной фосфорной связи может способствовать уменьшению промежутка времени от момента введения пролекарственного соединения в организм до момента начала его действия, снижению вводимой в организм дозы активного препарата и его токсичности.

Однако одним из недостатков фосфодиэфирных конъюгатов является их низкая мембранотропность, обусловленная депротонированием фосфорного центра при физиологическом значении рН 7.0-7.4. Для получения мембранопроницаемых фосфорсодержащих производных, способных успешно достигнуть внутриклеточных сайтов и расщепиться до монофосфатов нуклеозидов, фосфорные центры маскируют различными биодеградируемыми группами, получая фосфотриэфиры, амидофосфаты, или конструируют такие незаряженные производные, как фосфонатдиэфиры. Поэтому также перспективным направлением является создание пролекарственных соединений на основе веществ липидной природы, содержащих функциональные фосфорные связи.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Биотехнологии и Бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова, и выполнена при финансовой поддержке и в рамках АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы, 2011 г.» (проект № 2.1.1/9349), Гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-3468.2010.4, 2010-2011 гг.; НШ-4169.2012.4, 2012-2013 гг.), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.» (ГК № 14.740.11.0120, 2010-2012 гг.; ГК 14.В37.21.1925, 2012-2013 гг.).

Цель работы заключалась в разработке путей синтеза новых липофильных производных 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина (d4T) и З'-азидо-З'-дезокситимидина (AZT) на основе 1,3-диацилглицеринов и исследование их свойств.

Были поставлены следующие задачи:

- Синтез липофильных векторов для модификации d4T и AZT.

- Разработка методов и осуществление синтеза глицеролипидных конъюгатов анти-ВИЧ-активных нуклеозидов, в которых структурные фрагменты соединены между собой посредством сложноэфирных или функциональных фосфорных связей.

- Исследование чувствительности полученных соединений к действию химического и ферментативного гидролиза, изучение их противовирусных свойств.

соединения, последние могут содействовать увеличению внутриклеточной концентрации d4T и AZT. Использование Я-фосфонатного метода позволило осуществить синтез глицеролипидных соединений d4T и AZT с функциональными фосфорными связями. Ряд синтезированных коньюгатов проявил высокую ингибирующую активность в отношении вирусного штамма ВИЧ-1899А на МТ-4 клетках, что дает возможность рассматривать такие конъюгаты как перспективные фармакологически активные соединения для дальнейших исследований.

В ходе работы получено 25 новых соединений. Чистоту полученных производных подтверждали данными ТСХ-анализа, структуру доказывали с помощью физико-химических и спектральных методов.

Практическая ценность. На основе производных 1,3-диацилглицеринов разработан препаративный метод получения новых моно- и динуклеозидсодержащих конъюгатов d4T и AZT. Я-фосфонатный подход дал возможность с высокой эффективностью осуществить синтез промежуточных соединений и на их основе с высокими выходами получить ряд новых глицеролипидных производных d4T и AZT с функциональными фосфорными связями.

Исследование противовирусных свойств синтезированных конъюгатов в отношении ВИЧ-1899А на МТ-4 клетках выявило соединения, обладающие высокой ингибирующей активностью. Дальнейшее изучение их медико-биологических свойств открывает перспективные направления синтеза препаратов с высокой эффективностью терапевтического действия и пониженным побочным влиянием на организм.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Получение производных 1,3-диацилглицеринов с различными жирнокислотными остатками и спейсерными фрагментами как векторов для конструирования новых липофйльных производных анти-ВИЧ-активных нуклеозидов (d4T и AZT).

2) Разработка методов синтеза липофильных производных d4T и AZT на основе 1,3-диацилглицеринов со сложноэфирным связыванием структурных фрагментов для получения моно- и динуклеозидсодержащих пролекарственных соединений.

3) Разработка методов синтеза липофильных производных d4T и AZT на основе 1,3-диацилглицеринов с функциональными фосфорными связями между структурными фрагментами.

4) Проведение исследований по определению чувствительности пролекарственных AZT- и d4T-coдepжaщиx соединений к действию химического гидролиза, а также ферментативного гидролиза под действием панкреатической липазы свиньи.

5) Исследование анти-ВИЧ-активности синтезированных соединений в отношении вирусного штамма ВИЧ-1899А на МТ-4 клетках.

Публикации и апробации работы. По материалам диссертационной работы опубликовано 3 статьи и 8 тезисов. Результаты диссертации были представлены на следующих международных конференциях:

• XIII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2010» с элементами научной школы для молодежи «Инновации в химии: достижения и перспективы», 2010 г.

• VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2011 г.

• Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», 2012 г.

• XIV Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2012», 2012 г.

• VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2013 г.

Структура диссертации и объем работы. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего ¡5Б источников. Диссертация иллюстрирована рисунками и содержит 2.1 схем и /3 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нуклеозидные анти-ВИЧ-препараты, являющиеся основой высокоактивной антиретровирусной терапии, представляют собой небольшие по размеру хиральные молекулы, имеющие определённые преимущества перед другими классами соединений. Эти препараты в своих активных трифосфатных формах имитируют природные нуклеотиды и, конкурируя с ними, ингибируют действие обратной транскриптазы ВИЧ, терминируя элонгацию провирусной ДНК. Несмотря на положительный клинический эффект данные агенты имеют ряд серьёзных недостатков, усложняющих их применение. Из-за своей гидрофильности и малого размера они обладают незначительными мембранотропными, лимфотропными свойствами и ограниченной биодоступностью, а их длительное применение приводит к проявлению ими токсических свойств и формированию резистентных вирусных штаммов.

Для преодоления вышеперечисленных недостатков был предложен подход, основанный на моделировании оптимального пролекарственного средства, обеспечивающего доставку лекарственного препарата к клеткам-мишеням в составе

глицеролипидного конъюгата, стабильного в течение всего транспорта, но быстро деградирующего под действием клеточных ферментов с высвобождением активного соединения. Данный подход за счёт сродства пролекарственных соединений к липидному бислою способствует увеличению их мембранотропности, использованию преимуществ метаболизма природных и модифицированных липидов для преодоления мембранных барьеров, что приводит к повышению лимфотропности терапевтических средств и дает возможность избежать их первичного метаболизма в печени, тем самым увеличивая биодоступность анти-ВИЧ-активных препаратов.

В рамках выполнения работы нами были синтезированы глицеролипидные конъюгаты, общая структура которых представлена на рисунке 1. Выбранная структура обусловлена рядом требований, предъявляемых для получения оптимального пролекарственного средства.

-©-с^

RCOO

CD-

spacer

R-C5Hn ,Ci5H31

absent -(С H2)n-

n = 6 n = 12

Ci-

absent

N-4)

—О

н,со

Рисунок 1. Общая структура глицеролипидных производных d4T и AZT.

В качестве гидрофобных матриц использовались 1,3-диацилглицерины, во второе положение которых с помощью спейсерного фрагмента вводили остатки анти-ВИЧ-активных нуклеозидов (З'-азидо-З'-дезокситимидина, АХТ и 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина, с!4Т). При пероральном введении конъюгатов такого строения нуклеозидные агенты не высвобождаются в тонком кишечнике, так как известно, что природные триглицериды и их аналоги расщепляются под действием панкреатической липазы преимущественно по 1-му и 3-ему положению глицеринового остова с

дальнейшей доставкой их метаболитов по энтероцитопосредоваиному лимфатическому транспорту к органам и тканям организма.

Тип связи между лекарственным средством и производным 1,3-диацилглицерина, оптимальная скорость гидролиза такой связи in vivo, необходимая для создания терапевтической концентрации лекарственного средства в месте его действия, а также токсичность конструируемых модифицированных нуклеозидных препаратов являются важными характеристиками таких соединений. При этом учитываются возможные метаболические превращения получаемых пролекарственных веществ в ходе абсорбции и внутриклеточной трансформации в энтероцитах, лимфатического транспорта и других процессов, обеспечивающих их доставку к клеткам-мишеням.

Синтетические подходы к получению липофильных пролекарственных соединений чаще всего основаны на создании связей, биодеградируемых в организме человека: сложноэфирных, фосфодиэфирных. Использование последнего типа связи обеспечивает внутриклеточную доставку монофосфатной формы нуклеозидов, что приводит к более эффективному образованию их трифосфатов, чем посредством естественного метаболического пути, и более выгодно для тех препаратов, которые в своей исходной нуклеозидной форме гидролизуются быстрее, чем фосфорилируются клеточными киназами до дидезоксинуклеозидмонофосфатов.

Введение в структуру спейсерного фрагмента остатков многоатомных спиртов позволяет получить пролекарственные соединения с несколькими остатками фармакологически активных нуклеозидов, что может уменьшить эффективную дозу препарата и снизить его токсические свойства на здоровые клетки.

Таким образом, цель представленной работы заключалась в разработке путей синтеза глицеролипидных конъюгатов анти-ВИЧ-активных препаратов (З'-азидо-З'-дезокситимидина, AZT и 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина, d4T) для повышения эффективности действия данных нуклеозидов и снижения их токсических свойств. Представлены данные по изучению чувствительности полученных липонуклеозидов к действию химического и ферментативного гидролиза, исследованию их ингибирующих свойств в отношении штамма ВИЧ-Ц^д на МТ-4 клетках.

1. Синтез липофильных векторов для модификации d4Tu AZT

В качестве гидрофобных звеньев для модификации d4T и AZT использовались производные 1,3-дипальмитоил- и 1,3-дикапроноилглицеринов. Известно, что природные триглицериды и их аналоги с жирнокислотными остатками различной длины обладают чувствительностью к действию панкреатической липазы - основного фермента, участвующего в их метаболизме. Поэтому конструирование пролекарственных соединений на основе глицеролипидов как с длинноцепочечными, так и короткоцепочечными ацильными заместителями дает возможность нацеливания образующихся конъюгатов на энтероцитопосредованный лимфатический транспорт, при

этом в зависимости от липофильной основы такие конъюгаты могут обладать различными физико-химическими, абсорбционными, метаболическими, транспортными характеристиками.

1.1. Получение исходных производных глицерина

На первом этапе работы по известной методике [Bentley Р.Н. et al., 1970] был синтезирован 1,3-дипальмитоилглицерин 4Ь, 1,3-дикапроноилглицерин 4а получали аналогично, разработав методы выделения промежуточного и целевого соединений (схема 1).

ОН

НО

R-< 2 a,b

ОН

Ру

RCOO RCOO 3 а,Ь

NaBH4

RCOO RCOO 4 a,b

ОН

a R = C5Hn bR = C15H31

Схема 1. Синтез липофильных матриц 4а,Ь.

Для этого сначала ацилированием димера 1,3-дигидроксиацетона 1 (1 экв) избытком хлорангидридов капроновой или пальмитиновой кислот 2а,Ь (4.2 экв) в атмосфере азота в присутствии пиридина при комнатной температуре в течение 3 ч получали соединения За,Ь. Кетопроизводные За,Ь очищали перекристаллизацией с выходами 73.8% и 81.7%, соответственно. Дальнейшее восстановление кетонов За,Ь избытком боргидрида натрия (1.5 экв.) при температуре 5°С в течение 30 мин и обработка реакционных смесей приводили к 57.3% и 98.6% выходам 1,3-диацилглицеринов 4а,Ь, соответственно.

Физико-химические характеристики и данные элементного анализа подтвердили чистоту полученных соединений За,Ь и 4а,Ь.

1.2. Получение производных 1,3-диацилглицеринов с различными спейсерными фрагментами

На следующем этапе работы на основе полученных 1,3-диацилглицеринов нами были разработаны методы синтеза липофильных матриц с различными спейсерными фрагментами (рис. 2).

ясоо ясоо

^оЛ^он

5 а,Ь

КСОО ЯСОО

а Я = С5Н

ьа=с,5н

15"31

ясоо ясоо

— о

он

ба-с О

а И = С5Нц , п = б ЬК = С,5Н3|, п = 6 сК = С15Н31 , п= 12

7 а,Ь

Рисунок 2. Гидрофобные векторы на основе 1,3-диацилглицеринов.

Для осуществления связывания молекулярных фрагментов при синтезе пролекарственных соединений во второе положение гидрофобной матрицы вводили бифункциональный остаток янтарной кислоты. Кроме того, остаток янтарной кислоты легко разлагается внутри клетки, что способствует высвобождению лекарства, и естественным образом выводится из организма, не оказывая при этом токсического воздействия на клетку. По карбоксильной группе на свободном конце такого вектора можно проводить дальнейшее удлинение спейсерной части молекулы для повышения гидрофобности конъюгата и его предпочтительного транспорта по лимфатической системе.

ЯСОО ЯСОО

ОН

4 а,Ь

тг;

БМАР.Ру

ясоо-ясоо-

-О' 5 а,Ь

а Я = С5НП ЬК = С15Н3,

Схема 3. Синтез 1,3-диацил-2-0-сукцинилглицеринов 5а,Ь.

По методике \Scriba & е/ а1, 1993] бьш синтезирован 1,3-дипальмитоил-2-0-сукцинилглицерин 5Ь, 1,3-дигексаноил-2-0-сукцинилглицерин 5а получали аналогично, разработав его метод выделения.

Синтез 1,3-диацил-2-0-сукцинилглицеринов 5а,Ь осуществляли ацилированием 1,3-диглицеридов 4а,Ь избытком янтарного ангидрида 8 (3 экв) при каталитическом действии И^-диметиламинопиридина (ОМАР) (схема 3). Соединение 5а очищали флэш-хроматографией, соединение 5Ь - перекристаллизацией, выходы составили 87.1% и 57.4%, соответственно. Структуры сукцинильных эфиров 1,3-диглицеридов 5а,Ь были подтверждены физико-химическими характеристиками и данными 'Н-ЯМР-спектроскопии: в спектрах наблюдались сигналы протонов всех функциональных групп этих производных.

Как известно, фосфорилирование является лимитирующей стадией внутриклеточной модификации нуклеозидов перед тем, как они начнут выполнять свои функции - встраиваться обратной транскриптазой в цепь ДНК. Наличие же свободной гидроксильной группы в соединениях, получающихся при модификации спейсера спиртами, даёт возможность образования между ними и противовирусными нуклеозидами функциональных фосфорных связей, то есть получения пролекарственных соединений, в составе которых уже имеется фосфорный центр. Такой пронуклеотидный подход позволит уменьшить промежуток времени от момента введения пролекарственного соединения в организм до момента начала его действия. Поэтому следующей задачей являлось введение в структуру спейсерной части молекулы соединения 5а,Ь остатков многоатомных спиртов.

ксоо ясоо

НО—(СН2)п-ОН

10п==612 КС0°

5а,Ь

ОСС, ОМАР СН2С12

КСОО

О—(СН2)п—ОН

ба-с О

яЯ = С5Н|] ,п = б ЬК = С„Н3,,п = 6 сК = С]5Н3] ,п = 12

5 а,Ь

12 а,Ь

аК = С5Нц ЬЯ = С15Н31

Оошех, Н

КСОО

ОН

7 а.Ь

Схема 4. Введение в состав спейсера остатков многоатомных спиртов.

Этерификацию а,ю-диолов (1,6-гександиола 9 и 1,12-додекандиола 10) липофильными векторами 5а,Ь осуществляли при активирующем действии ОСС и БМАР при комнатной температуре с образованием соединений ба-с (схема 4). Выделение целевых продуктов ба-с из реакционной смеси проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, выходы составили 81.0%, 58.6% и 77.2 %, соответственно. Структуры полученных соединений ба-с были установлены с помощью данных 'Н-ЯМР спектров, в которых появились сигналы протонов остатков многоатомных спиртов.

Введение в структуру спейсера остатка глицерина позволит не только использовать вышеперечисленные преимущества спиртовых компонентов, но также и даст возможность включить в состав пролекарственных соединений несколько остатков фармакологически активных агентов, что может способствовать увеличению бионакопления лекарства в клетках-мишенях, снижению дозы пролекарственного препарата, а значит и снижению побочного воздействия препарата на здоровые клетки.

Синтез глицеролипидных производных 12а,Ь проводили аналогично получению соединений ба-с из 1,2-изопропилиден-гас-глицерина 11 (1 экв), сукцинильных эфиров 5а,Ь (1 экв), БСС (1.2 экв) и ОМАР (1.5 экв) (схема 4). Целевые продукты 12а,Ь выделяли из реакционной смеси хроматографией на силикагеле с выходами 63.4% и 49.7%, соответственно. Спектральные характеристики смешанных сукцинатов 12а,Ь соответствовали предложенной структуре - например, в 'Н-ЯМР-спектре соединения 12а появились сигналы протонов изопропилиденглицеринового остатка (8, м.д.): 1.34, 1.49 (2с, 6 Н, СМе2), 3.61-3.70 (м, 1 Н, СН, Ого-2), 4.04-4.38 (м, 2 СН2,Ого-2).

Удаление изопропилиденовой защиты смешанных сукцинатов 12а,Ь осуществляли в присутствии смолы Dowex в метаноле. Спустя 3 ч по данным ТСХ-анализа наблюдали полную конверсию исходных соединений 12а, Ь, смолу отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле. Выходы смешанных сукцинатов 7а,Ь составили 94.6% и 90.4%, соответственно. Предполагаемые структуры соединений 7а,Ь были подтверждены с помощью данных спектра 'Н-ЯМР, в котором исчезли синглетные сигналы протонов изопропилиденовой группы.

Таким образом, были получены липофильные матрицы 5а,Ь, ба-с, 7а,Ь, которые могут использоваться для конструирования глицеролипидных конъюгатов анти-ВИЧ-активных нуклеозидов, что позволит придать этим препаратам новые улучшенные свойств.

2. Синтез глицеролипидных пролекарственных соединений й4Т и

лгт

2.1. Конъюгирование липофильных матриц с нуклеозидными агентами посредством сложноэфирных связей

Использование сложноэфирных связей - самый очевидный подход в синтезе пролекарственных соединений данного вида. Эти связи встречаются во многих природных веществах, являются биодеградируемыми под действием эстераз и липаз и в большинстве случаев нетоксичными для организма человека.

0 ЛОН 13,14 о

С15Нз,СОО— о СІІ2СІ2 С15Н3іСОО^^ О

5 Ь 15,16

13,15 Я = /

ш Ш

14,16 Я=/>

№

Схема 5. Получение глицеролипидных конъюгатов 15,16.

Сначала на основе сукцннильного эфира 1,3-диацилглицерина 5Ь были синтезированы глицеролипидные пролекарственные соединения 15 и 16, в которых А£Т и с14Т по 5'-гидроксильной группе конъюгированы с липофильным вектором (схема 5). Для их получения проводили этерификацию с!4Т 13 и AZT 14 сукцинилдиглицеридом 5Ь в присутствии ОСС и ОМАР. Целевые соединения 15 и 16 очищали хроматографией на силикагеле с выходами 68.9% и 49.7%, соответственно. Ожидаемые структуры пролекарственных веществ 15 и 16 были подтверждены их спектральными характеристиками: в 'Н-ЯМР-спектре появились характерные сигналы протонов нуклеозидных остатков.

Для того чтобы связать с14Т 13 и АТТ 14 с глицеролипидными матрицами, содержащими гидроксильные группы, посредством сложноэфирной связи, осуществляли синтез сукцинильных эфиров 17 и 18.

О о

V ° лмдр О ^

із 0 8 • 1/2 ОМАР 17 0

| Ж II 5м

ОМАР О N О

но, І +

N • ОМАР N3

3 14 8 18

Схема 6. Синтез сукцинильных эфиров (14Т 17 и А2Т 18.

Согласно методу \Berezovskaya Уи. е/ а1, 1998] ацилированием с!4Т 13 янтарным ангидридом 8 при активирующем действии БМАР в присутствии триэтиламина с

последующей кристаллизацией получали диметиламинопиридиниевую соль сукцинильного эфира (14Т 17 с выходом 38.8% (схема 6).

Диметиламинопиридиниевую соль сукцинильного эфира А2Т 18 синтезировали в соответствие с методикой [Вотпа Г. е1 а1., 2002]. Ацилирование АСТ 14 янтарным ангидридом 8 проводили при перемешивании при комнатной температуре в хлористом метилене при активирующем действии ЭМАР в течение 24 ч (схема 6). После хроматографической очистки выход сукцинильного эфира 18 составил 91.3%. Структуры соединений 17 и 18 были подтверждены данными 'Н-ЯМР-спектроскопии и элементного анализа, которые совпали с литературными данными.

В результате реакции этерификации 1,3-диацилглицеринов 6Ь,с полученными сукцинильными эфирами с14Т 17 и 18 в присутствии БМАР и БСС (схема 7) были синтезированы пролекарственные соединения 19, 20, которые очищали хроматографией на силикагеле, выходы составили 40.8% и 62.1%, соответственно.

С1!Нз1СОО-/ I СН2С12 С15Н„СОО^ о

6 Ь п = 6 19.20

6с"-12 19 Л = висссМТ, п = 6

20 Я = виссАгТ, п = 12

ОН

17,18

ЦСС, ОМАР СН,С1,

ясоо

.0^

7 а Я = С5Нц 7Ы1 = С„Н„

22 Я = С5Н,Я' = Я" = ьиссАгТ

23 Я = СиНз[ Я' = Я" = яиссс14Т

24 Я = С]5Нзи Я' = Я" = БиссАгТ

25 Я = С15Н31' Я' = Н, Я" = 5иссА7/Г

Схема 7. Синтез липонуклеозидов 19-25 на основе гидроксилсодержащих гидрофобных матриц.

Введение в структуру пролекарственных соединений 21-24 двух остатков анти-ВИЧ-активных нуклеозидов осуществляли этерификацией гидрофобных векторов 7а,Ь 4-х кратным избытком сукцинильных эфиров с14Т 17 и АТ1 18 при активирующем действии БСС и ОМАР (схема 7). После хроматографической очистки выходы целевых липонуклеозидов 21-24 составили 84.4%, 81.4%, 57.8%, 63.4%, соответственно. Конъюгат 25, содержащий один остаток сукцинильного эфира А2Т, получен аналогично из смешанного сукцината 7Ь, соединения 18 (2 экв) с выходом 60.7%.

Ожидаемые структуры пролекарственных соединений 19-25 были подтверждены спектральными характеристиками: в 'Н-ЯМР-спектрах появились характерные сигналы протонов сукцинильных эфиров нуклеозидов.

Таким образом, был получен ряд новых глицеролипидных конъюгатов <14Т и А2Т, содержащих один или два остатков фармакофоров, в которых анти-ВИЧ-активные нуклеозиды присоединены к гидрофобным матрицам посредством сложноэфирных связей.

2.2. Конъюгирование липофильных матриц с нуклеозидными агентами посредством функциональных фосфорных связей

Как известно, лимитирующей стадией внутриклеточной биотрансформации нуклеозидов перед тем, как они начнут ингибировать обратную транскриптазу вируса, является фосфорилирование, следовательно, актуальным подходом в синтезе липонуклеозидов является получение таких конъюгатов, в которых анти-ВИЧ-активные соединения связаны с производными 1,3-диацилглицеринов через функциональные фосфорные связи, то есть получение пролекарственных соединений, в составе которых уже имеется фосфорный центр. Для образования Я-фосфонат- и фосфодиэфирных связей в структуре пролекарственных соединений нами был выбран Я-фосфонатный метод.

Я-фосфонатный метод довольно прост в экспериментальном исполнении, ключевые интермедиа™ - моноэфиры фосфористой кислоты в Я-фосфонатной форме -устойчивы к влаге и окислению воздухом и могут долго храниться без химической деградации. Конденсация фосфитмоноэфира и гидроксилсодержащего компонента при правильном подборе конденсирующего реагента протекает быстро и селективно, предъявляются менее жесткие, чем в фосфиттриэфирном методе, требования к отсутствию следов воды.

ясоо

I—' с\

.0-(СН2)6-0Н

1.(РС13 + 1т)

СН2С12 ясоо

I—' Г \

0-(СН2)6-0-Р-Н

исоо

6 а,Ь

2.Е13НН2О ЯСОО

26 а,Ь

N1^

а Я = С5Нц

ьк=с15н31

1) 14, РгеС1

2) 12_ Ру/Н20

27,28

27К = С5Ни 11' = А2Т 28 Я = С15Н31 К' = АгТ

15м31,

Схема 8. Получение фосфодиэфирных конъюгатов 27,28.

Сначала с использованием Н-фосфонатного метода проводили получение ключевых интермедиатов - Н-фосфонатмоноэфиров 26а, Ь. Фосфитилирование

смешанных триглицерндов 6а,b проводили реакцией с избытком полученного in situ трис(имидазолил)фосфина в присутствии триэтиламина в хлористом метилене с последующим гидролизом бис(имидазолил)фосфина (схема 8). //-фосфонаты 26а,Ь, полученные в виде триэтиламмониевых солей, очищали хроматографией на силикагеле, выходы составили 49.2% и 95.5%, соответственно. Строение соединений 26а,b подтверждалось данными 'Н-ЯМР-спектров, в которых присутствовали сигналы протонов всех функциональных групп молекул, в том числе и протонов Р-Н связи в области спектра 6.55 м.д. и 6.65 м.д., соответственно, с характерными константами спин-спинового взаимодействия (JP>H 600,0 Гц и 640 Гц), а также данными 31Р-ЯМР-спектроскопии (5 3.44 м.д. и 3.88 м.д.), свидетельствующими об отсутствии побочных продуктов.

Следующий этап работы состоял в разработке методов получения фосфодиэфирных производных AZT 27, 28. Конденсация промежуточных Н-фосфонатмоноэфиров 26а,b (1 экв) и AZT 14 (2 экв) при комнатной температуре в течение 20 мин в присутствии в качестве активирующего агента пивалоилхлорида (3 экв) с последующим окислением получающихся Я-фосфонатдиэфиров раствором йода (2 экв) в смеси пиридин-вода (v/v 98:2) приводила к образованию фосфодиэфиров 27, 28 (схема 8). AZT-содержащие соединения 27, 28 очищали хроматографией на силикагеле с выходом 51.1% и 57.2%, соответственно. Их структуру подтверждали данными 'Н- и 31Р-ЯМР-спектров, в 'Н-ЯМР-спектре наблюдалось необходимое соотношение нуклеозидных протонов и протонов гидрофобных фрагментов, а в 31Р-ЯМР-спектре присутствовал сигнал в области - 0.51 м.д. и -0.77 м.д., соответственно (рис. 3).

•«WM

"Л Я 4

26 а

5 3.44 м.д.

5-0.51 м.д.

6 8.54, 9.24 м.д.

5 8.12, 8.35 м.д.

Рисунок 3. Фрагменты Р-ЯМР спектров на примере производных 1,3-дикапроноилглицерина 26а, 27,30,35.

Так как фосфодиэфирные конъюгаты противовирусных нуклеозидов могут обладать низкой мембранотропностью в силу ионизации фосфорной группировки, то для получения мембранопроницаемых пролекарственных соединений применяются подходы, призванные маскировать заряд на фосфорном центре с помощью различных биодеградируемых защитных групп. Также повышенную способность к преодолению клеточных мембран могут иметь Л-фосфонатдиэфирные производные, которые к тому

же могут отличаться по метаболическим свойствам и путям внутриклеточной трансформации, что может придать полезные свойства модифицированным препаратам.

Для синтеза Я-фосфонатдиэфиров 29-32 проводили конденсацию //-фосфонатмоноэфиров 26а,Ь с нуклеозидами 13 или 14 в описанных ранее условиях (схема 9), выделение полученных липонуклеотидов осуществляли с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, в результате чего выход данных веществ составил 47.3%, 61.1%, 75.7% и 79.2%, соответственно. Данные 'Н- и 31Р-ЯМР-спектроскопии свидетельствовали об образовании Н-фосфонатдиэфирной связи между гидрофобными матрицами и остатками анти-ВИЧ-активных нуклеозидов.

ксооТ0^о-(сн2)6-оХн ксо°-| 0^0(сн2)60-!-0-к'

ЯСОО-1 О еО Р!уС1 ЯСОО-1 О н

26 а,Ь 29-32

а: R= С5НП

b: R= С,5Н3, CCl4/Et3N/H20/CH3CN

29,34R = C5H11>R' = d4T RCOO- °

nh2- HCl О

сн3о

"10JC-YO(CH2)60—P-O-R' n NH

30.35 R = С5Нц R' = AZT

31.36 R = C15H3) R' = d4T RCOO ' R' = AZT

34"37 CH,Ö

32,37 R = Ci5H31 R' = AZT ч_0

Схема 9. Получение мембранопроницаемых производных нуклеозидных препаратов.

Для конструирования амидофосфатных пролекарственных соединений проводили реакцию Н-фосфонатдиэфиров 29 — 32 (1 экв) с гидрохлоридом метилового эфира Д ¿-аланина 33 (1.2 экв) при 0 °С в смеси растворителей триэтиламин - четыреххлористый углерод - вода - ацетонитрил (v/v 1:1:1:10) с последующим перемешиванием в течение 10 мин при комнатной температуре. Конъюгаты 34-37 очищали колоночной хроматографией на силикагеле, выходы составили соответственно 48.8%, 61.1%, 73.3% и 82.9%. Данные !Н- и 3|Р-ЯМР-спектроскопии показали наличие характерных сигналов протонов, подтверждающих структуры полученных конъюгатов 34-37 (рис. 3).

В результате, с помощью Я-фосфонатного метода с высокими выходами осуществлён синтез новых d4T- и AZT-содержащих глицеролипидных пролекарственных соединений 27-32, 34-37 с функциональными фосфорными связями, которые после изучения их медико-биологических свойств могут привести к разработке эффективных препаратов для терапии ВИЧ-инфекции.

3. Исследование свойств глицеролипидных конъюгатов й4ТиА2Т

3.1. Исследование чувствительности конъюгатов к действию ферментативного и химического гидролиза

Доставка терапевтических препаратов внутрь клетки-мишени в составе пролекарственных соединений зачастую сопряжена со значительным метаболизмом последних во время абсорбции и распределения в организме. Для успешной доставки глицеролипидные производные должны быть устойчивы к гидролизу во время этих процессов, в то же время, обладая чувствительностью к специфическому гидролизу под действием панкреатической липазы кишечника для нацеливания на энтероцитопосредованный лимфатический транспорт. Для исследования воздействия химического и ферментативного гидролиза на полученные конъюгаты изучали их устойчивость в модельных буферных системах.

время, ч.

- Боратный буфер рН 9.5 -•- Трис-буфер рН 8.5 -

- Фосфатный буфер рН 7.3

-СІ4Т

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 время, мин

- предположительно псевдомоноглицерид с одним остатком <14Т

-предположительно псевдомоноглицерид с двумя остатками Й4Т

Рисунок 4. Экспериментальные данные исследования чувствительности конъюгатов к действию: а) химического гидролиза (на примере конъюгата 19); б) ферментативного гидролиза (на примере конъюгата 21).

Кинетику гидролиза синтезированных на основе d4T и AZT пролекарственных соединений 15, 16, 19-25, 27-32, 34-37 исследовали в различных буферных растворах, моделирующих рН физиологических сред. Гидролиз конъюгатов осуществляли при 37 °С в водных буферных растворах: Na-фосфэтном буфере (рН 7.3), ТРИС-буфере (рН 8.5), Na-борэтном буфере (рН 9.5), за кинетикой процессов следили с помощью ТСХ. По полученным графикам зависимости концентрации глицеролипидов от времени гидролиза определяли время их половинного гидролиза (табл. 1). Стабильность конъюгатов 15, 16, 19-25, в которых структурные фрагменты соединены посредством сложноэфирных связей, увеличивалась в нейтральных условиях (рН 7.3), в основных условиях (рН 9.5) время половинного гидролиза уменьшалось (рис.4а).

Соединения 27-32, 34-37, содержащие функциональные фосфорные связи, оказались достаточно устойчивыми в ТРИС-буфере (рН 8.5), амидофосфаты 34-37 были более лабильны в Ыа-фосфатном буфере (рН 7.3), а Н-фосфонаты 27-32 также и в Ыа-боратном буфере (рН 9.5).

Так как пролекарственные средства конструируются на основе подхода биоимитации физико-химических и метаболических характеристик природных триглицеридов, то они должны быть чувствительны к действию панкреатической липазы тонкого кишечника человека.

Известно, что деградация глицеролипидных конъюгатов под действием панкреатической липазы проходит в соответствии с метаболизмом природных триацилглицеринов с образованием 2-ацилглицеринов и жирных кислот. Модель липидного расщепления является широко используемым подходом для оценки липидных систем доставки лекарств in vitro. Липолиз пролекарственных средств конъюгатов 15,16, 19-25, 27-32, 34—37 под действием панкреатической липазы свиньи (ЕС 3.1.1.3) и исследование кинетики гидролиза осуществляли инкубированием липонуклеозидов с ферментом с активностью 375 U/мл при 37 °С в PIPES-буфере, рН 6.5 в присутствии тауродезоксихолата натрия в качестве кофактора фермента. Отбираемые аликвоты охлаждали до 0°С, за кинетикой процессов следили с помощью ТСХ, контролируя как деградацию исходных соединений, так и накопление промежуточных продуктов гидролиза (предположительно 2-псевдомоноглицеридов), d4T или AZT; образование сукцинильных эфиров d4T и AZT в случае гидролиза конъюгатов 21-25, происходило в следовых количествах. Время половинного гидролиза пролекарственных соединений, а также накопление и деградацию продуктов их гидролиза оценивали по графикам зависимости концентрации соответствующих веществ от времени (рис. 46). Полученные данные (табл. 1) позволяют говорить о достаточно высокой чувствительности конъюгатов 15, 16, 19-25, 27-32, 34-37 к действию панкреатической липазы свиньи, что может позволить им имитировать природные триацилглицерины и транспортироваться к клеткам-мишеням по лимфатической системе.

Таблица 1. Кинетические данные химического и ферментативного гидролиза конъюгатов 15, 16, 19-25,27-32,34-37.

Химический гидролиз Ферментативный гидролиз

Пролекарственное Ч мин

соединение рН 7.3 рН 8.5 рН 9.5 Панкреатическая липаза, рН 6,5

Конъюгаты со сложноэфирным связыванием структурных фрагментов

15 7.0 6.0 2.5 23.0

16 >26.0 18.0 14.2 8.5

19 9.5 6.0 3.0 15.0

20 >28.0 20.0 15.0 17.0

21 8.0 3.5 2.0 6.0

22 27.0 26.5 25.0 7.0

23 18.5 17.0 8.0 3.0

24 23.0 16.5 13.0 5.0

25 29.0 27.5 26.0 0.5

Конъюгаты с функциональными фосфорными связями

27 >20.0 >20.0 8.0 2.0

28 >22.0 18.0 7.5 2.5

29 1.0 1.0 0.25 1.0

30 0.5 3.0 0.5 0.5

31* н.о. н.о. н.о. 1.0

32 0.5 1.5 0.5 0.5

34 9.0 >20.0 15.0 2.0

35 3.0 >20.0 >20.0 0.5

36 10.0 >23.0 21.0 1.0

37 2.0 >20.0 >20.0 0.5

♦химический гидролиз не проводился, поскольку при исследовании чувствительности конъюгата 31 к действию ферментативного гидролиза он подвергался быстрому неспецифическому расщеплению с высвобождением (14Т.

3.2. Изучение противовирусной активности1

Нами была исследована активность конъюгатов 15, 16, 19-25, в которых структурные фрагменты соединены посредством сложноэфирных связей, и 27, 28, 30-32, 35, 37, содержащие функциональные фосфорные связи, в отношении вируса

1 Данная работа выполнена в сотрудничестве с коллегами из ФГБУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского" Минздрава РФ

иммунодефицита человека 1 типа (табл. 2, 3). Испытана принципиальная схема введения препаратов - одновременно с заражением клеток вирусом.

В качестве источника вируса использовали штамм ВИЧ-1899А из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Для исследования цитотоксического действия липофильных конъюгатов 15, 16, 19-25 препараты вводили в культуральную среду неинфицированных клеток в концентрации от 0.4-0.5 мкг/мл до 50 мкг/мл (табл. 2). При высоких концентрациях соединения 15,16,19 и 21 проявили токсические свойства. Противовирусная активность в отношении ВИЧ была отмечена у соединений 20,22, 24 и 25 в концентрациях от 0.5 до 50.0 мкг/мл. Наиболее активными среди исследуемых конъюгатов оказались липонуклеозиды 20 и 25: 91.0% и 87.0%-я защита от цитопатического действия вируса наблюдалась при концентрациях 0.5 мкг/мл и 50.0 мкг/мл, соответственно.

Для исследования цитотоксического действия фосфорсодержащих соединений 27, 28, 30, 32, 35, 37 препараты вводили в культуральную среду неинфицированных клеток в концентрации 0.5-10.0 мкг/мл, а конъюгат 31 — в концентрации 0.4-100.0 мкг/мл. Соединение 31 при концентрации 0.4-100 мкг/мл проявило высокую токсичность. Противовирусная активность в отношении ВИЧ была отмечена у соединений 27,30,32 в концентрациях 0.5, 1.0, 5.0 и 10.0 мкг/мл. Наиболее активным среди исследуемых конъюгатов оказался липонуклеотид 30: 96.5%-я защита от цитопатического действия вируса наблюдалась при концентрации 0.5 мкг/мл, что сопоставимо с данными для А27. Соединения 27, 32 максимальную противовирусную активность (94.1% и 88.1%, соответственно) проявляли при концентрации 10.0 мкг/мл (табл. 3).

Для конъюгатов 27, 28, 30, 32, 35 и 37 проводился учет уровня вирусного антигена р24 методом ИФА, который показал, что соединения 27 и 32 в концентрации 10.0 мкг/мл и конъюгат 30 в концентрации 0.5 мкг/мл приводили к его снижению на 88.1, 94.1 и 89.5%, соответственно.

Исследование противовирусной активности пролекарственных соединений показало, что введение в их структуру остатков различных жирных кислот, а также наличие различного типа связывания между структурными фрагментами, может модулировать ингибирующие свойства глицеролипидов представленного ряда.

Таблица 2. Противовирусная активность конъюгатов 15, 16, 19-25 в отношении штамма ВИЧ-1899а на МТ-4 клетках.

Конъюгат № п/п Концент рация, мкг/мл Токсичность Защита, % Конъюгат № п/п Концент рация, мкг/мл Токсичность Защита %

Жизнеспособность, % Жизнеспособность, %

AZT 1.0 95.1 96.9 d4T 0.4 80.4 71.6

15 50.0 65.9 2.1 23 50.0 68.9 -

25.0 71.3 4.3 25.0 69.1 3.8

10.0 75.0 17.6 10.0 79.3 12.7

5.0 72.1 15.4 5.0 79.3 23.1

1.0 78.7 9.0 1.0 89.1 23.0

0.5 78.8 9.6 0.5 93.8 8.3

16 50.0 69.5 39.2 24 50.0 62.0 51.0

25.0 71.4 37.5 25.0 64.1 43.5

10.0 74.2 34.0 12.5 65.6 41.2

5.0 74.6 30.0 6.25 66.8 40.5

1.0 79.7 28.1 3.12 67.6 28.7

0.5 77.3 25.7 1.8 68.3 16.1

19 50.0 68.1 - 0.8 69.0 11.1

25.0 68.5 - 0.4 70.8 1.7

10.0 70.8 - 25 50.0 76.1 87.0

5.0 74.2 - 25.0 76.3 81.5

1.0 75.9 2.0 12.5 76.9 77.3

0.5 76.5 1.3 6.25 77.0 56.1

20 50.0 70.3 45.8 3.12 77.1 53.4

25.0 70.6 61.6 1.8 77.8 48.1

10.0 71.3 66.0 0.8 78.5 14.8

5.0 78.1 71.1 0.4 78.6 13.0

1.0 84.1 78.0 Примечание: - сильная токсичность - токсичность

0.5 98.5 91.0

21 50.0 51.5 -

25.0 54.2 30.0

12.5 62.2 34.1

6.25 64.0 37.5

3.12 65.1 35.3

1.8 67.4 35.7

0.8 68.5 6.0

0.4 70.0 -

22 50 60.2 25.1

25 62.0 33.4

12.5 65.0 43.0

6.25 65.1 43.7

3.12 65.9 50.0

1.8 66.1 50.7

0.8 66.2 49.5

0.4 67.4 48.3

Таблица 3. Противовирусная активность конъюгатов 27, 28, 30-32,35, 37 в отношении штамма ВИЧ-1899А на МТ-4 клетках.

Конъюгат, № п/п Концентрация, мкг/мл Токсичность Вивусная инЛекиия. % зашиты

Жизнеспособность, %* По количеству живых клеток По вирусному антигену (р24)**

лгт 1.0 95.1 96.9 93.5

с14Т 0.4 80.4 71.6 н.о.

27 10.0 77.8 94.1 88.1

5.0 79.8 82.1 86.0

1.0 79.9 73.7 79.7

0.5 80.2 67.7 80.9

28 10.0 70.6 0.9 64.2

5.0 75.8 0.1 25.0

1.0 81.2 - 25.5

0.5 94.1 0.7 16.6

30 10.0 62.1 45.8 90.7

5.0 75.2 75.2 89.9

1.0 83.3 84.2 89.4

0.5 84.4 96.5 94.1

31 100 58.0 33.4 н.о.***

50.0 62.6 57.1 н.о

25.0 64.5 2.3 н.о

12.5 66.0 - н.о

6.25 66.6 - н.о

3.12 68.5 - н.о

1.6 71.3 - н.о

0.8 71.8 - н.о

0.4 72.5 - н.о

32 10.0 78.2 88.4 89.5

5.0 78.8 80.7 89.3

1.0 80.5 81.6 84.2

0.5 83.4 74.5 87.0

35 10.0 74.9 13.3 12.8

5.0 80.9 9.1 0

1.0 85.1 0.2 0

0.5 97.9 0 0

37 10.0 81.8 0 0

5.0 86.0 18.6 0

1.0 90.3 31.6 0

0.5 96.0 15.0 0

Примечание: *- жизнеспособность клеток по отношению к интактному контролю клеток, %;

**- по данным метода ИФА определения антигена р24 ВИЧ-1 в культуральной жидкости ВИЧ-инфицированных клеток; *** - не определяли

выводы

1. Осуществлен синтез производных 1,3-диацилглицеринов с различными жирнокислотными остатками и спейсерными фрагментами - ключевых векторов для получения моно- и динуклеозидсодержащих липофильных конъюгатов d4T и AZT.

2. Разработаны методы синтеза новых глицеролипидных пролекарственных соединений d4T и AZT, в которых конъюгирование липофильных матриц с одним или двумя остатками нуклеозидов осуществлялось посредством сложноэфирных связей, выходы целевых конъюгатов составили 60-80%.

3. С использованием Я-фосфонатного подхода с высокой эффективностью (50-80%) получены новые липофильные производные анти-ВИЧ-активных нуклеозидов с функциональными фосфорными связями между структурными фрагментами (Н-фосфонатдиэфиры, фосфодиэфиры, амидофосфаты).

4. Исследование устойчивости синтезированных конъюгатов в условиях рН-зависимого гидролиза показали, что конъюгаты, в которых структурные фрагменты соединены посредством сложноэфирных связей, стабильны в нейтральных условиях (рН 7.3), в основных условиях (рН 9.5) время половинного гидролиза уменьшалось; конъюгаты с функциональными фосфорными связями оказались достаточно устойчивыми при рН 8.5, амидофосфаты были более лабильны при рН 7.3, а Н-фосфонаты также при рН 9.5. Данные ферментативного гидролиза свидетельствуют о достаточно высокой чувствительности всех синтезированных конъюгатов к действию панкреатической липазы свиньи.

5. Исследование противовирусной активности ряда липофильных d4T- и AZT-содержащих соединений в отношении штамма ВИЧ-1899А на МТ-4 клетках выявили наиболее активные конъюгаты 20, 25, 27, 30 и 32: защита от цитопатического действия вируса составила 91.0%, 87.0%, 94.1%, 96.5% и 88.4% при концентрациях 0.5, 50.0, 10.0,0.5,10.0 мкг/мл, соответственно.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1) Шастина Н.С., Мальцева Т.Ю., Дьякова JI.H., Лобач О.А., Чатаева М.С., Носик Д.Н., Швец В.И. Синтез и анти-ВИЧ-активность новых липофильных конъюгатов З'-азидо-З'-дезокситимидина, содержащих функциональные фосфорные связи // Биоорган, химия. - 2013. - Т. 39, № 2. - С. 184-193.

2) Дьякова JI.H., Шастина Н.С., Швец В.И. Лимфотропные пролекарственные производные 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина: синтез и исследование чувствительности к гидролизу// ЖОрХ. -2011. - Т. 47, № 10. - С. 1558-1563.

3) Шастина Н.С., Баранова Е.О., Дьякова JI.H., Лоншаков Д.В., Швец В.И. Липидная стратегия повышения биодоступности нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ // Вестник МИТХТ. - 2011. - Т. 6, № 2. - С. 71-80.

4) Дьякова Л.Н., Шастина Н.С., Швец В.И. Синтез глицеролипидных производных 2\3'-дидегидро-3'-дезокситимидина для повышения его биодоступности //

III Молодежная Научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2009». - Москва, 13-14 ноября 2009. - С. 41.

5) Дьякова Л.Н., Шастина Н.С., Швец В.И. Синтез и изучение свойств липофильных конъюгатов 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина на основе модифицированных полиолов // XIII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2010» с элементами научной школы для молодежи «Инновации в химии: достижения и перспективы». - Суздаль, 29 июня-2 июля 2010.-С. 243.

6) Дьякова Л.Н. Разработка методов синтеза и изучение свойств глицеролипидных производных 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина для повышения его биодоступности // 62-ая Научно-техническая конференция студентов МИТХТ. - 2010. - С. 35-39.

7) Мальцева Т.Ю., Дьякова Л.Н., Шастина Н.С., Швец В.И. Синтез и антивирусные свойства пронуклеотидных производных З'-азидо-З'-дезокситимидина //

IV Молодежная Научно-технической конференция «Наукоемкие химические технологии-2011». - Москва, 9-10 ноября 2011. - С. 38.

8) Дьякова Л.Н., Шастина Н.С. Синтез и исследование свойств новых липофильных производных 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина для повышения его пероральной биодоступности // VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 21-25 марта 2011. -Т. 1,-С. 417-418.

9) Дьякова Л.Н. Разработка новых препаратов на основе глицеролипидных конъюгатов З'-азидо-З'-дезокситимидина и 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина и исследование их анти-ВИЧ-активности // Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». - Москва, 20-22 марта 2012. - С. 225-226.

10) Сударикова К.Н., Дьякова Л.Н., Шастина Н.С., Швец В.И. Разработка противовирусных препаратов с повышенной биодоступностью на основе З'-азидо-З'-дезокситимидина и производных 1,3-диацилглицеринов //XIV Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2012» с элементами научной школы для молодежи. - Тула, 21-25 мая 2012. - С. 248.

11) Дьякова Л.Н., Шастина Н.С. Синтез и исследование свойств динуклеозидсодержащих липофильных конъюгатов З'-азидо-З'-дезокситимидина и 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина на основе модифицированных полиолов //

VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 19-22 марта 2013. - Т. 1. - С. 86-87.

Дьякова Людмила Николаевна Синтез и исследование свойств глицеролипидных производных нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ для повышения их биодоступности Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 30.10.2013 Заказ № 113 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Дьякова, Людмила Николаевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ТОНКИХ ХИМИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

04201365*74

ДЬЯКОВА ЛЮДМИЛА НИКОЛАЕВНА

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ГЛИЦЕРОЛИПИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НУКЛЕОЗИДНЫХ ИНГИБИТОРОВ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИЧ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИХ БИОДОСТУПНОСТИ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Шастина Наталья Сергеевна

Москва - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................................11

1. Вирус иммунодефицита человека: ключевые ферменты и противовирусные препараты, одобренные управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. Дизайн новых анти-ВИЧ-активных нуклеозидных соединений..................................................................................12

1 1 Основные ферменты ВИЧ и их ингибиторы, одобренные для клинического использования 12

1 2 Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ), механизм их действия и недостатки 15

1 3 Разработка новых анти-ВИЧ-активных нуклеозидов 18

1 3 1 Модификация углеводного фрагмента 18

1 3 2 Модификация нуклеиновых оснований 21 1 3 3 Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, находящиеся на разных стадиях

клинических исследований 23

2. Стратегии для повышения пероральной биодоступности нуклеозидных препаратов. Конструирование пролекарственных соединений с использованием липидной стратегии.....................26

2 1 Пролекарственные соединения на основе жирных кислот 31 2 2 Пролекарственные соединения на основе фосфолипидов 34 2 3 Пролекарственные соединения на основе холестерина 36 2 4 Пролекарственные соединения на основе 1,3-диацилглицеринов 37

3. Преимущества метаболических путей природных триглицеридов. Разработка новых пролекарственных производных фармакологически активных соединений на основе 1,3-диацилглицеринов..................................................................................................................................................39

4. Конструирование новых противовирусных и противоопухолевых препаратов на основе пронуклеотидного подхода. Способы получения пронуклеотидных производных НИОТ......................46

4 1 Получение заряженных фосфорсодержащих пролекарственных средств 47

4 2 Биолабильные конструкции для получения мебранопроницаемых пронуклеотидных соединений 48 4 2 1 Дизайн амидо-, фтор- и боранфосфатов 48

4 2 2 Использование маскирующих групп 53

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ................................................................................................ 58

1. Синтез липофильных векторов для модификации (14Т и AZT..................................................................61

1 1 Получение исходных производных глицерина 62

1 2 Получение производных 1,3-диацилглицеринов с различными спейсерными фрагментами 62

2. Синтез глицеролипидных пролекарственных соединений с!4Т и АХТ.....................................................67

2 1 Конъюгирование липофильных матриц с нуклеозидными агентами посредством сложноэфирных связей

2 2 Конъюгирование липофильных матриц с нуклеозидными агентами посредством функциональных фосфорных связей 71

3. Исследование свойств глицеролипидных конъюгатов d4T и AZT...........................................................77

3.1. Исследование чувствительности конъюгатов к действию ферментативного и химического гидролиза ..77

3.2. Изучение противовирусной активности..........................................................................................................80

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.....................................................................................................................84

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................105

ПУБЛИКАЦИИ............................................................................................................ 107

БЛАГОДАРНОСТИ...................................................................................................... 110

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................................................... 111

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЗТС - 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин ABC - абакавир Ade - аденин Ar - арил

ага-С - l-ß-D-арабинофуранозилцитозин

AZT - З'-азидо-З'-дезокситимидин

AZTTP - 5'-трифосфат З'-азидо-З'-дезокситимидина

Вое - отре/я-бутилоксикарбонил

ВОР - бис(2-оксо-3-оксазолидинил)фосфин

CCR5 - хемокиновый рецептор макрофаготропных штаммов ВИЧ

CDI -1,1 '-карбонилдиимидазол

СЕМ - лейкемические лимфоидные клетки человека

CXCR4 - хемокиновый рецептор Т-тропных штаммов ВИЧ

cycloSal - циклосалицил

Cyd - цитидин

d4T - 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидин DBU - 1,8-диазабицикло[5.4.0]-ундец-7-ен DCC -N, N '-дициклогексилкарбодиимид ddC - 2',3'-дидезоксицитидин ddl - 2',3'-дидезоксиинозин dFdC - гемцитабин

DMAN - 1,8-бис(диметиламино)нафтален DMAP - 4-диметиламинопиридин DMF - диметилформамид

DTE - 5'-[(2-гидроксиэтил)сульфидил]-2-тиоэтил

ЕС50 (ЕС25) - эффективная концентрация (доза, ингибирующая вирусное цитопатическое

действие на 50% и 25% соответственно)

EDCI - 1-(3'-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид

FDA - Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и

медикаментов (США)

FTC - эмтрицитабин

GABA - гамма-аминомасляная кислота

gp41, gpl 20 — поверхностные белки, участвующие в проникновении ВИЧ в клетку

Guo- гуанозин

HEL - эритролейкемическая линия клеток человека HeLa - линия раковых клеток человека hex - гексан

AtOH- 1-гидрокси-7-азабензотриазол 'Bu - изобутил 'Рг - изопропил

Iva - остаток изовалериановой кислоты

log Р - логарифм коэффициента распределения в системе октанол - вода Me - метил

МТ-4 - Т-лимфоидные клетки человека

NDP - нуклеозиддифосфат

Nie - норлейцин

Nue - нуклеозид

NVP - невирапин

Pg - защитная группа

Ph - фенил

РОМ - пивалоилоксиметил

Ру - пиридин

SI - индекс селективности

Sta - статин

Suc - сукцинил

TBDMS - т£>еот-бутилдиметилсилил

THF - тетрагидрофуран

Thy - тимин

ТК - тимидинкиназа

TZM-bl -производные клеток Hela, которые экспрессируют высокий уровень CD4 и CCR5 вместе с эндогенной экспрессией CXCR4 UD50 - 50%-ная ульцерогенная доза АДФ, АТФ - аденозинди- и трифосфат

ВИЧ-1, ВИЧ-2 - вирус иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДОФА - диоксифенилаланин

ЖК - жирная кислота

НПВС - нестероидные противовоспалительные средства РНК - рибонуклеиновая кислота

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита человека

ТК ~ - клетки, дефицитные по тимидинкиназе

ЦМВ - цитомегаловирус

ЦНС - центральная нервная система

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время для лечения пациентов, инфицированных ВИЧ, применяется высокоактивная антиретровирусная терапия, основанная на использовании нескольких препаратов, направленных на различные стадии жизненного цикла вируса, в том числе на обратную транскрипцию. Нуклеозидные препараты, конкурируя с природными субстратами обратной транскриптазы, терминируют растущую цепь провирусной ДНК, препятствуя работе данного фермента. Однако применяемые в терапии вирусных заболеваний нуклеозидные соединения наряду с высокой эффективностью действия имеют существенные недостатки, связанные с их низкой биодоступностью, низкой способностью к трансмембранному транспорту, формированием резистентных вирусных штаммов, необходимостью использования высоких доз этих лекарственных соединений, что сказывается на проявлении ими токсических свойств.

Для присоединения анти-ВИЧ-активного нуклеозида к гидрофобной матрице часто выбирают сложноэфирную или фосфоэфирную связи. Использование последнего типа связи вызвано необходимостью преодоления стадии первичного фосфорилирования данных противовирусных соединений внутриклеточными киназами, лимитирующей их действие: предварительное создание функциональной фосфорной связи может способствовать уменьшению промежутка времени от момента введения

пролекарственного соединения в организм до момента начала его действия, снижению вводимой в организм дозы активного препарата и его токсичности.

Были поставлены следующие задачи:

- Синтез липофильных векторов для модификации d4T и AZT.

Научная новизна. Разработаны методы синтеза новых пролекарственных соединений d4T и AZT на основе 1,3-диацилглицеринов с различными жирнокислотными остатками. При конъюгировании структурных фрагментов посредством сложноэфирных связей были получены моно- и динуклеозидсодержащие соединения, последние могут содействовать увеличению внутриклеточной концентрации d4T и AZT. Использование Н-фосфонатного метода позволило осуществить синтез глицеролипидных соединений d4T и AZT с функциональными фосфорными связями. Ряд синтезированных конъюгатов проявил высокую ингибирующую активность в отношении вирусного штамма ВИЧ-1899А на МТ-4 клетках, что дает возможность рассматривать такие конъюгаты как перспективные фармакологически активные соединения для дальнейших исследований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 1 Основные ферменты ВИЧ и их ингибиторы, одобренные для клинического использования

Синдром приобретенного иммунодефицита человека, вызванный патогенным ретровирусом ВИЧ, считается одним из самых опасных и распространенных заболеваний человечества на протяжении последних 26 лет [1,2]. Высокая смертность ВИЧ-инфицированных пациентов и постоянные мутации вируса стимулируют разработку новых эффективных противовирусных соединений, действующих на разных этапах жизненного цикла ВИЧ (рис.1) [3-9].

В настоящее время насчитывается 25 анти-ВИЧ-

активных препаратов [10], одобренных управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для использования в клинике (табл. 1). Современная высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) включает в себя, по крайней мере, комбинации из трех различных противовирусных соединений. Данные лекарственные вещества являются ингибиторами основных ферментов вируса, обратной транскриптазы, протеазы и интегразы. В последнее время к этому списку добавились ингибитор слияния вируса с клеткой (Энфувиртид®) и блокатор ко-рецептора CCR5 (Маравирок®) [4,11].

смертности и возникновения оппортунистических заболеваний у ВИЧ-инфицированных пациентов. Однако, несмотря на все усилия ученых и врачей данный вирус продолжает уносить жизни нескольких миллионов людей по всему миру каждый год

Применение ВААРТ способствует уменьшению

Рисунок 1. Репликативный цикл ВИЧ

Мишень действия Класс соединений Одобренные препараты Коммерческое название (компания производителя) Дата утверждения

Обратная транскриптаза > Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ^ Пиримидиновые Зидовудин, азидотимидин, AZT, ZDV Ретровир® (GlaxoSmithKline) 19 марта 1987

Зальцитабин, дидезоксицитидин, ddC* Хивид® (Hoffmann - La Roche) 19 июня 1992

Ставудин, d4T Зерит® (Briston Myers-Squibb) 24 июня 1994

Ламивудин, ЗТС Эпивир (GlaxoSmithKline) 17 ноября 1995

Эмтрицитабин, FTC Эмтрива (Cilead Sciences) 2 июля 2003

пуриновые Диданозин, дидезоксиинозин, ddl Видекс (Briston Myers-Squibb) 9 октября 1991

Абакавир, ABC Зиаген® (GlaxoSmithKline) 17 декабря 1998

> Нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы Тенофовир, TDF Виреад® (Cilead Sciences) 26 ноября 2001

Фосфазид, Ф-АЗТ Никавир® (A3T- Фарма ООО) Одобрен в РФ 5 февраля 2010

> Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы Невирапин, NVP Вирамун® (Boehringer Ingelheim) 21 июня 2006

Делавиридин, DLV Рескриптор® (Pfizer) 4 апреля 1997

Эфавиренз, EFV Сустива® (Boehringer Ingelheim) 17 сентября 1998

Этравирин, ТМС125 Интеленс® (Tibotec, J&J) 18 января 2008

Рилпивирин, ТМС278 Эдурант (Janssen) 20 мая 2011

Саквинавир, SQV Инвираза® (Hoffmann - La Roche) 6 декабря 1995

Ритонавир, RTV Норвир® (Abbott Labs) 1 марта 1996

Индинавир, IDV Криксиван® (Merck & Co.) 13 марта 1996

Нелфинавир, NFV Вирасепт (Pfizer) 14 марта 1997

Протеаза Ингибиторы протеазы Ампренавир, APV Агенеразе® (GlaxoSmithKline)** 15 апреля 1999

Атазанавир, ATV Реатаз ® (Bristol Myers Squibb) 20 июня 2003

Фосампренавир, FOS-APV Лексива® (GlaxoSmithKline) 20 сентября 2003

Типранавир, TPV Аптивус® (Boehringer Ingelheim) 22 июня 2005

Дарунавир, ТМС114 Презиста® (Tibotec, J&J) 23 июня 2006

Вирусные и клеточные Ингибиторы проникновения Маравирок*** Селзентри® (Pfizer) 6 августа 2007

гликопротеины Энфувиртид, Т-20 Фузеон (Hoffmann - La Roche) 13 марта 2003

Интеграза Ингибиторы интегразы Ралтегравир Исентресс® или MK-0518 (Merck & Co.) 12 ноября 2007

*производство зальцитабина прекращено 31.12.2006 **производство ампренавира прекращено 31.12.2004 ***блокатор корецептора CCR5

1.2. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ), механизм их действия и недостатки

Нуклеозидные анти-ВИЧ-препараты (рис. 2) являются аналогами природных нуклеозидов - тимидина, цитидина, аденозина, гуанозина - и составляют основу высокоактивной антиретровирусной терапии. Действие данных агентов направлено на вирусную РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу). Данный фермент является ключевым в применяемой ВААРТ, и совместные усилия ученых многих стран направлены на разработку и поиск новых эффективных нуклеозидных препаратов, направленных на ингибирование его действия.

Пиримидиновые НИОТ

НО

N3 АТТ1

N О

О-

с1сЛ 6

НО

с!4ТЗ Пуриновые НИОТ

'Д «3

N м

НО^

-О

но

ин

N О

НО

А,

N О

(НС 2

НО

КН

1МН,

N О

РТС 5

N Т^Г^ тмн2

АВС 7

Рисунок 2. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы.

Существует три класса анти-ВИЧ-активны