Синтез биологически активных аналогов тимидина и их химическая модификация тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

БЕРЕЗОВСКАЯ ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ АНАЛОГОВ ТИМИДИНА И ИХ ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ

Специальность - 02.00.10 Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2003

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В. Ломоносова Научный

Ведущая организация: Химический факультет МГУ им. М.ВЛомоносова

часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова (119831, г. Москва, ул. М. Пироговская, д.1).

руководитель:

доктор химических наук,

профессор Юркевич Александр Морисович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор Ефимов Владимир Алексеевич

доктор химических наук,

профессор Граник Владимир Григорьевич

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Оооз~А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Структурные аналоги природных нуклеозидов используются для лечения некоторых видов вирусных заболеваний и, в частности, заболеваний, вызванных ретровирусами (например, ВИЧ). Эти соединения не имеют гидроксильной группы в 3'-положении дезоксирибозидного цикла и поэтому являются нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы (NIRT). Сегодня в медицине для лечения ВИЧ-инфекции широко используются несколько NIRT, среди них наиболее часто: зидовудин (азидотимидин; З'-азидо-З'-дезокситимидин; AZT, производитель - Glaxo Wellcome Inc.), ставудин (3'-дезокси-2'3'-дидегидротимидин; d4T, производитель - Bristol-Myers Squibb Со.) и диданозин (2',3'-дидезоксиинозин, ddl). К сожалению, эти нуклеозиды являются гидрофильными соединениями, их способность к пассивному транспорту через клеточную мембрану невысока, поэтому требуется достаточно высокая, приближающаяся к токсической, терапевтическая концентрация препарата в плазме. Кроме того, эти препараты обладают существенным недостатком, а именно, при их применении возникают штаммы ВИЧ, резистентные к ним. Для решения этих проблем, помимо поиска новых активных аналогов, в последнее время также ведется интенсивный поиск новых производных перечисленных выше нуклеозидов. Проводят многочисленные химические модификации этих аналогов нуклеозидов, в том числе путем создания производных с различными гидрофобными остатками. Использование различных по структуре производных нуклеозидов для создания систем комбинированной терапии ВИЧ, возможно, будет тормозить или блокировать возникновение резистентности вируса к лекарственному препарату.

Таким образом, проблема синтеза и изучения свойств как можно большего числа производных нуклеозидов с различными модификациями

актуальна и в настоящее время.

Задача получения большого числа новых соединений для масштабного поиска наиболее активных и наименее токсичных препаратов для терапии ВИЧ сделала актуальной разработку методов параллельного синтеза модифицированных производных нуклеозидов-фармакофоров с уже известной противовирусной активностью.

Работа выполнена при частичной поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований, грант № 97-03-32897а, и Международного Научно-Технического Центра, проект № 1781. Цели и задачи исследования:

1) Разработка методов параллельного синтеза производных известных лекарственных препаратов - нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ.

2) Разработка пригодных для параллельного синтеза синтонов фармакологически активных нуклеозидов.

3) Синтез на основе выбранных синтонов серий новых производных фармакологически активных нуклеозидов с различными физико-химическими свойствами.

4) Изучение поведения производных нуклеозидов в различных средах. Научная новизна и практическая значимость.

- Впервые показана возможность проведения параллельного синтеза для получения производных нуклеозидов.

- Получены пригодные для параллельного синтеза синтоны двух наиболее широко применяемых в анти-ВИЧ терапии нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ: зидовудина и ставудина.

- Изучена возможность применения для параллельного синтеза восьми различных синтонов, содержащих зидовудин и ставудин. На основе шести из них получены серии новых производных фармакологически активных нуклеозидов с различными физико-химическими свойствами.

- Изучена устойчивость некоторых полученных производных в физиологических и химических средах, их поведение при гидролитическом разложении.

За время выполнения работы синтезировано 68 новых соединений, 55 из них переданы для испытаний их противовирусной активности. Некоторые соединения продемонстрировали активность, сравнимую с активностью исходного нуклеозида, и более высокий индекс селективности. Положения, выносимые на защиту.

1. Разработка методов параллельного синтеза производных фармакологически активных нуклеозидов.

2. Синтез биодеградируемых модифицированных пролекарственных форм зидовудина и ставудина с измененными физико-химическими свойствами.

Апробация и публикация работы.

Материал, изложенный в диссертации, доложен и обсужден на следующих научных конференциях: XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, С.-Петербург, май 1998 г.; Всероссийской конференции «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, 28 мая - 2 июня 2000 г.; "Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники", Москва, 2001 год, 15-м Международном круглом столе по Нуклеозидам, Нуклеотидам и Нуклеиновым Кислотам, Лёвен, Бельгия, 10 -14 сентября 2002 г.; Отчетной конференции по подпрограмме № 203 «Химия и химические продукты» научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным отраслям науки и техники» Химия и химические продукты, Москва, 2002 год.

По материалам диссертационной работы опубликовано три работы в международных журналах: Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids; Химико-Фармацевтический Журнал.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на № страницах машинописного текста, содержит 38 схем, 15 рисунков, 25 таблиц и состоит из введения, литературного обзора, изложения и обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы наименований).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Традиционный подход к получению модифицированных производных предполагает последовательный постадийный синтез каждого индивидуального соединения, включающий уникальные процедуры обработки на каждой стадии. Стратегия параллельного синтеза строится на частичной унификации процедур, позволяющей стандартизовать некоторые стадии процесса и превратить синтез рядов производных из искусства в технологию. Необходимость такого подхода очевидно вытекает из современных масштабов работ по поиску и оптимизации новых лекарственных препаратов.

Главным условием реализации такой стратегии является сходство условий протекания реакций и их воспроизводимость на ключевых стадиях химического синтеза. В нашей работе такими ключевыми реакциями были выбраны амидирование и этерификация карбоновых кислот, а также реакция присоединения аминов к активированной двойной связи.

1. Синтез с!4Т.

Исходными фармакофорами для модификации были выбраны широко применяемые А2Т и с!4Т. А7Т является дешевым коммерчески доступным продуктом, а химически чистый, пригодный для синтеза <14Т относительно труднодоступен. Предварительным этапом работы явилась наработка необходимого количества этого вещества. Химические методы синтеза <34Т описаны ранее. В ходе работы нами были внесены некоторые изменения в

схему получения сМТ из тимидина, позволившие сократить количество стадий и повысить как общий выход, так и воспроизводимость этого метода (схема 1).

н3с

N(4

X

у

1. Р|УС1

пиридин 2 МбС!

78%

Н3С. Р|УО—

ын

НзС

№ОСН3

ОМР НО—, ^ ..

Н/Ох! 77% \_/

Схема 1 О

Ж

О

ОН

ОМэ

2. Получение производных на основе синтонов с двухосновными кислотами

Для синтеза данной серии синтонов были выбраны кислоты, отличающиеся как по длине углеродной цепи, так и по ее строению. Серию составили синтоны с двумя алифатическими дикислотами: янтарной и глутаровой, и с ароматической фталевой кислотой.

Создание синтонов с двухосновными кислотами позволяет использовать свободную карбоксильную группу синтона как для получения сложноэфирной связи с молекулой спирта-модификатора, так и амидной связи с амином-модификатором.

Схема 2

путь А

хг

о о

I! II

и-с-х-с-он синтон I

ЫисОН

О О

II II

Р-С-Х-С-ОЫис

путь В

хг

ЫисОН

О О II II ЫисО-С-Х-С-ОН

О О II II

МисО-С-Х-С-!*

Для синтеза производных с двухосновными кислотами использовали два подхода: путь А - получение сложного эфира модификатора (КН) и двухосновной кислоты с последующей конденсацией с молекулой аналога нуклеозида (ТЯисОН) (синтон I типа, схема 2); путь В - получение синтона аналога нуклеозида (ЫисОН) с двухосновной кислотой с последующей модификацией спиртами и аминами (ЯН) (синтон II типа, схема 2).

Схема 3 о

1Ь

юз к =

Используя путь А, получили моноэфир янтарной кислоты и терпеноида (гераниола или ретинола) (1а и 1Ь) с последующей конденсацией с аналогами нуклеозидов: AZT и с14Т. Синтез смешанного диэфира с нуклеозидами проводили по схеме, разработанной для конденсации кислоты и нуклеозида: реакцию проводили в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ЭСС) и каталитических количеств 4-М,М-диметиламинопиридина (БМАР) (схема 3).

Путь В использовали для получения из моноэфира янтарной кислоты и нуклеозида 2 смешанных эфиров с остатками дипальмитоилглицерина (201), дигексадецилглицерина (202) и триптамина (203) (Схема 4).

8

Схема 4

Н3а А.

кн

ОСС, ОМАР, (С2Н5)3Ы СН3СЫ

201 202 203

к- О О.о16и31 р.

О.Х15Н31

т

о

Несмотря на то, что получение широкого ряда производных возможно в обоих случаях, второй подход в большей степени отвечает цели данного исследования, так как позволяет на основе одного полученного синтона (И или, в частности, 2) проводить дальнейший параллельный синтез с различными модификаторами (11Н), используя функцию карбоксильной группы (см. схему 2).

Синтез синтонов 3-5 проводили конденсацией соответствующего аналога нуклеозида с циклическим ангидридом выбранной двухосновной кислоты. Для данных реакций были опробованы различные условия их проведения с целью достижения максимальных выходов продуктов, облегчения их выделения и очистки. Максимальное значение выхода -

91,4% было достигнуто для синтона с остатком фталевой кислоты 5 при проведении реакции в пиридине в присутствии каталитического количества 4-М,М-диметиламинопиридина (схема 5), очистка - колоночной хроматографией. Но при использовании такого метода синтеза в случае алифатических кислот усложняется выделение продукта, а синтон 4 вообще не удается выделить. Поэтому для получения синтонов 3 и 4 проводили реакции в присутствии 4-М,М-диметиламинопиридина в хлористом метилене с выходом 78.5% для 4 и 51.4% для 3 после кристаллизации последнего в виде соли 4-К,Ы-диметиламинопиридина (схема 5).

О:

О

X ' НООС^ А

I ИЛИ II

7

N3

—(СН2)2- — (СН2)3-

Реагенты: ¡) ОМАР, СН2С12 (для 3 и 4); и) ОМАР, пиридин (для 5)

Последующую модификацию синтонов 3 - 5 с остатками двухосновных кислот проводили реакцией ацилирования ряда вторичных аминов в условиях параллельного синтеза. Синтез конечных производных проводили с использованием 1 экв. ВОР (бензотриазол-1-ил-окси-трис(диметиламино)фосфонийгексафторфосфата) в качестве

конденсирующего агента и 3 экв. диизопропилэтиламина (01РЕА) в диметилформамиде (ВМР) (схема 6). Контроль за протеканием реакций

осуществляли с помощью ТСХ. Продукты очищали твердофазной экстракцией на обращенной фазе С18, а затем колоночной хроматографией на силикагеле. Очистку также контролировали ТСХ. Выход продуктов варьировался от 7 до 99% для различных производных. Структура синтонов 3-5 подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии. Структура конечных производных (301-313, 401-419,501-519) подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии.

U

ноос.хХ0^у\|

3-5

N3

RH

ВОР, DIPEA DMF/CH2CI2

RH -(СНгЬ- выход (%) -(СН2)3- выход (%) сх выход (%)

пиперидин 301 86 419 99 519 58

4-бензилпиперидин 302 93

1,2,3,4-тетрагидроизохинолин 303 94

цитизин 304 30

1 -фенилпиперазин 305 99 410 76 510 99

1 -(2,5 -диметилфенил)пиперазин 306 84

1 -(2,4-диметилфенил)пиперазин 307 80

1-(2-(6- метилпиридил))пиперазин 308 56

N-бензилметиламин 309 33 402 75 502 99

N-метилфенэтиламин 310 31 403 65 503 99

этил изонипекотат 311 24 405 77 505 82

этил нипекотат 312 18 406 75 506 90

1 -(2-метоксифенил)пиперазин 313 20 411 92 511 99

N-бензилэтиламин 401 76

ВЫХОД ,„„ - ВЫХОД I || выход -(СН2)2- -(С-Нг)з- (%) Ц^ч (%)

И-бугилбензиламин 404 60

1 -(2,3-диметилфенил)пиперазин 408 56

1 -(2-метилфенил)пиперазин 409 41

1 -(2-этоксифенил)пиперазин 412 87

1 -(З-метоксифенил)пиперазин 413 35

1 -(2-фторфенил)пиперазин 414 42

1 -(4-фторфенил)пиперазин 415 83

1-(3- трифторметилфенил)пиперазин 416 43

1 -(2-пиримидил)пиперазин 417 74

1 -(2-пиразинил)пиперазин 418 73

Ы-бензилфенэтиламин 501 99

N -мети л-1 -нафталинмети ламин 504 70

Ы-бепзилпиперазин 507 30

1 -(4-метилфенил)пиперазин 508 81

1 -бензгидрилпиперазин 509 99

1 -пиперони лпиперазин 512 13

1 -(4-метоксифенил)пиперазин 513 48

1-(3-хлорфенил)пиперазин 514 15

1 -(2-хлорфенил)пиперазин 515 12

1 -(4-хлорфенил)пиперазин 516 44

1 -(2-пиридил)пиперазин 517 57

1 -(4-пиридил)пиперазин 518 7

3. Получение производных на основе синтона с остатком хлоруксусной кислоты

Создание синтона с остатком хлоруксусной кислоты позволяет использовать галоген как уходящую группу в реакциях замещения, например, первичных и вторичных аминов. Синтез синтона 6 с остатком хлоруксусной кислоты осуществляли по схеме 7. Аналог нуклеозида конденсировали с избытком хлорацетилхлорида в хлористом метилене при охлаждении до -15 °С, в качестве основания использовали N,14'-

диметиламинопиридин. Продукт очищали хроматографией на открытой колонке. Выход синтона 6 составил 75%. Структура подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии. Полученный хлоруксусный эфир алкилирует вторичные амины, образуя эфиры Ы,Н-диалкилглицина (601). Данную реакцию проводили в присутствии диизопропилэтиламина в ацетонитриле, так как при использовании в качестве растворителей спиртов идет главным образом переэтерификация.

Синтез таких производных (пример см. на схеме 7) показал, что возможность применения данного синтона для параллельного синтеза маловероятна из-за лабильности сложноэфирной связи в целевых продуктах.

Схема 7

о о

НзС^Д, НзС^А^

\Ао счАС| я \А

N3 6 Мз

О

Н3СЧ

'Н3 СИ о II

СНз(СНг)17"% _ 1 3 1 0 м^о

~Б{рЁА СНз(СН2)17-'7

СН^ \-/

601 М3

4. Получение производных на основе синтонов с остатком акриловой кислоты

Синтез синтонов 7 и 8 (Схема 8) осуществляли реакцией соответствующего аналога нуклеозида с 2,5-кратным избытком акрилоилхлорида в ацетонитриле в присутствии триэтиламина при -5°С с выходом 85% для соединения 7.

Схема 8

О О

До ОС, ? 1л

ат - - С| - ^ А ^ А" °

но' ^ 7 «УН-ОзМ ^ ОТ

СН^

7

О

Н3С, А.

° Ч^п *Н . _ 1 _ °

О'

701-709

у—' сн3см ^—'

N3

8

ЯН

701 октадециламин

702 М-метилоктадениламин

703 триптамин

704 тирамин

705 бензиламин

706 пиперидин

707 морфолин

708

этил нипекотат

709 пирролидин

Синтон 7 показал возможность дальнейшей модификации в условиях реакции алкилирования первичных и вторичных аминов. Синтез производных 701 - 709 проводили в ацетонитриле, добавляя к эфиру акриловой кислоты эквивалентное количество соответствующего амина. Выделение продуктов 701 - 705 и 708 осуществляли колоночной хроматографией, соединения 706, 707 и 709 не требовали дополнительной очистки, кроме удаления растворителя. Выход продуктов составлял от 24% для соединения 705, до 98% для 707. Для синтона 8, содержащего в качестве нуклеозидного компонента остаток азидотимидина, провести аналогичную дальнейшую модификацию не удалось из-за неустойчивости данного соединения.

5. Изучение гидролитического разложения производных.

Гидролитическое разложение сложноэфирных производных, от которого зависит возможность их использования в качестве пролекарств, изучали на соединениях 702, 703, 707 и 708. Для этого соединения 702, 703, 707 и 708 инкубировали с бычьей эмбриональной сывороткой (FBS) при 37 °С. Для определения вклада химического гидролиза в процесс расщепления пролекарств проводили контрольные эксперименты: производные инкубировали в водных буферных системах при 37 °С в отсутствие FBS. Использовали две различные буферные системы: 50 мМ фосфатный буфер с рН 6,50 и 50 мМ Трис-буфер с рН 7,75 для определения степени химического гидролиза при рН ниже и выше 7.

Протекание ферментативного и химического гидролиза контролировали с помощью ТСХ, используя УФ-детектирование, по

15

расходованию изучаемого производного с высвобождением аналога нуклеозида с14Т в соответствующей среде. Наибольшую стабильность -

3 ч - в условиях ферментативного гидролиза показало производное 707, тогда как время полураспада при химическом гидролизе увеличивалось до

4 ч. Наименее устойчивым к ферментативному гидролизу оказалось самое гидрофобное производное 702, для него время полураспада менее 15 мин, а при химическом гидролизе - 15 мин (результаты представлены в таблице 1).

Таблица 1. Время полураспада производных 702,703,707 и 708 при рН 6,50 и 1,15 в присутствии и отсутствии эмбриональной бычьей сыворотки (РВБ) при 37 °С.

соединен loe Ра tl/2 (Ч)

ие FBS рН 6,50 рН 7,75

d4T -0,81 ст сть сть

702 8,66 <0,25 0,25 0,25

703 1,08 1 Нс Нс

707 -0,77 3 4 4

708 0,74 0,75 1 1

а log Р - показатель гидрофобности соединения - коэффициент распределения октанол/вода, рассчитывали с помощью программного пакета ACD (Advanced Chemistry Development, Inc.).

b стабильно в условиях гидролиза в течение 48 ч. с не определено.

Для всех изученных производных гидролиз в присутствии FBS проходил с большей скоростью, чем в буферных системах, что говорит о существенном вкладе ферментов сыворотки в расщепление сложноэфирной связи производных. В то же время, значение рН среды в выбранном

интервале не влияет на скорость химического гидролиза всех изученных производных.

5. Изучение противовирусной активности препаратов.

Противовирусную активность всех производных, полученных на основе синтонов с двухосновными кислотами, изучали на общепринятой стандартной лабораторной модели in vitro. Работа по изучению активности производных нуклеозидов проводилась в научно-исследовательском институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Исследования проводились на Т-лимфоидных клетках человека МТ-4, характеризующихся высокой чувствительностью к различным штаммам ВИЧ-1. Использовали вирус иммунодефицита человека 1-го типа, штамм IIIB (ВИЧ-1/ШВ). Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамин и 100 мкг/мл гентамицина. Свойства синтезированных производных сравнивали с соответствующими аналогами нуклеозидов: AZT и d4T.

Таблица 2. Физико-химические свойства и активность производных 102 и 203.

№ п/п соединение СС50, цМ ED50, цМ SI ■ log Р

1 AZT 3,5 0,0042 833 -0,88

2 d4T 5 0,001 5000 -0,81

3 102 1,988 0,060 33 3,42

4 203 1,717 0,043 40 0,63

СС50 - токсическая доза препарата, снижающая ростовые свойства клеток на 50% (определена по трипановому синему). ЕВ50 - эффективная терапевтическая доза, защищающая 50% клеток от цитопатического

действия вируса. SI - индекс селективности (SI -= CC50/ED50). log Р рассчитывали с помощью программного пакета ACD.

Некоторые синтезированные производные (табл. 2 и 3) показали активность, меньшую или сравнимую с активностью исходного нуклеозида, но в этих случаях производные были менее токсичны, что повышает значение терапевтического индекса (например, 402 и 502). Следует отметить, что гидрофобность наиболее активных соединений не слишком высока (log Р<1).

Таблица 3. Физико-химические свойства и активность производных 301-307, 309,401-403, 409 и 501-511.

№ п/п соединение СС50, цМ ED50, цМ SI logP

1 AZT 39,8 0,063 632 -0,88

2 301 794 - н/а 1,52

3 302 63,1 - н/а 3,51

4 303 158,5 - н/а 2,41

5 304 794,3 - н/а 0,66

6 305 35,5 - н/а 1,72

7 306 177,8 - н/а 2,64

8 307 5,0 - н/а 2,64

9 309 2511,9 - н/а 0,58

10 401 100 0,436 229 ! 1,33

11 402 316 0,1 3160 : 0,80

12 403 39,8 0,141 282 1Д1

13 409 141,25 74,13 1,91 2,40

14 501 107 - н/а 3,14

15 502 138 0,056 2464 0,92

16 503 44,6 10 4,46 1,34

№ п/п соединение СС50, цМ ED50, цМ SI log Р

17 504 10 - н/а 2,15

18 505 354,8 5,01 70,8 0,13

19 506 141,2 0,56 252 0,17

20 507 70,8 0,7 101 0,92

21 508 63,09 1,26 50 0,81

22 509 14,1 5,3 2,66 2,76

23 510 223,9 14,1 15,9 0,35

24 511 14,12 2,8 5,04 1,06

СС50 - токсическая доза препарата, снижающая ростовые свойства клеток на 50% (определена по трипановому синему). ED50 - эффективная терапевтическая доза, защищающая 50% клеток от цитопатического действия вируса. SI - индекс селективности (SI = CC5o/ED5o). log Р рассчитывали с помощью программного пакета ACD.

Выводы

1. Разработан метод параллельного синтеза производных нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ зидовудина и ставудина.

2. Получены синтоны фармакологически активных нуклеозидов, зидовудина и ставудина, пригодные для параллельного синтеза.

3. На основе выбранных синтонов получепы пять рядов новых производных зидовудина и ставудина с разной степенью гидрофобности.

4. Показано, что гидролиз сложноэфирных производных протекает быстрее в присутствии ферментов.

5. Получены предварительные результаты оценки противовирусной активности ряда синтезированных производных.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Yu. Berezovskaya, М. Chudinov, Yu. Kirillova, N. Shastina, V. Shvets and A. Yurkevich. Design of the new molecular transport systems for the nucleosides-pharmacophores carrying. // Nucleosides & Nucleotides. - 1998. -Vol. 17.-No. 9-1 J. - P. 2127-2133.

2. Ю.В. Березовская, M.B. Чудинов, Л.М. Селимова, А.Ф Бобков, В.И. Швец, A.M. Юркевич. Создание новых систем молекулярного транспорта для нуклеозидов-фармакофоров. Синтез смешанных сукцинатов дезоксинуклеозидов. И Химико-Фармацевтический Журнал. - 2001. -Т.35.-№ З.-С. 14-18.

3. Yu. Berezovskaya, М. Chudinov, A. Yurkevich. Combinatorial optimization of antiviral prodrugs properties. // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. -2003. - Vol. 22. - No. 5-8. - P. 837-839.

4. Ю.В. Березовская, M.B. Чудинов, Ю.Г. Кириллова, A.M. Юркевич. Гидрофобные производные для мембранного транспорта нуклеозидных анти-ВИЧ препаратов. // XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - С.-Петербург, 25-28 мая 1998 г. - Сборник тезисов докладов. - С. 14.

5. М.В. Чудинов, Ю.В. Березовская, A.M. Юркевич. Использование комбинаторного подхода для оптимизации транспорта фармакологически активных соединений в клетке. // Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии». - Пущино, 28 мая - 2 июня 2000 г. -Сборник тезисов докладов. - С. 109-110.

6. Yulia V. Berezovskaya, Mikhail V. Chudinov, Alexander M. Yurkevich, and Vitaly I. Shvets. Combinatorial Optimization of Antiviral Prodrugs Properties. XV International Round Table "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids". - Leuven, Belgium, September 10-15, 2002. - Сборник тезисов докладов. - P. P-58.

7. Mikhail V. Chudinov, Yulia V. Berezovskaya, Alexander M. Yurkevich, and Vitaly I. Shvets. Novel З'-Subsituted Thymidine Analogs. XV International Round Table "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids". -Leuven, Belgium, September 10-15,2002. - Сборник тезисов докладов. - P. P-ll.

8. Ю.В.Березовская, А.Е.Степанов, М.В.Чудинов, Н.С.Шастина, Эйнисман Л.И., А.М.Юркевич. Разработка методов направленной структурной модификации полиолов и нуклеозидов с целью поиска новых соединений с антивирусной и противоопухолевой активностью. Отчетная конференция за 2001 год «Химия и химические продукты». - РХТУ им. Д.И. Менделеева, Москва, 2002 г. - С. 39.

9. А.М.Юркевич, А.Е.Степанов, М.В.Чудинов, Н.С.Шастина, Ю.В.Березовская, О.А.Тучная. Разработка методов направленной структурной модификации полиолов и нуклеозидов с целью поиска новых соединений с антивирусной и противоопухолевой активностью. Отчетная конференция за 2002 год «Химия и химические продукты». -РХТУ им. Д.И. Менделеева, Москва, 2003 г. - С. 44.

I.

Автор выражает благодарность к.х.н. Чудинову М.В. за неоценимые консультации, компании "СЬетВпс1§е Согр." и лично Свиридову С.И., а также родителям за материальную поддержку в период выполнения работы.

»1 5 8 66 л

f Ii

Список сокращений

Введение

I Литературный обзор

1. Молекулярные системы комбинированной терапии на основе нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы

1.1. Системы с ингибиторами протеазы

1.2. Системы с полисахаридами

1.3. Системы с пептидами

1.4. Другие системы

2. Молекулярные системы транспорта нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы

2.1. Системы неспецифического транспорта

2.2. Системы направленного транспорта нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы

2.2.1. Системы доставки нуклеозидов на основе никотиновой кислоты

2.2.2. Системы доставки нуклеозидов с аминокислотами, пептидами и белками

2.2.3. Системы доставки нуклеозидов с углеводами

II Обсуждение результатов

1. Синтез d4T (2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина)

2. Получение производных на основе синтонов с остатком акриловой кислоты

3. Получение производных на основе синтона с остатком хлоруксусной кислоты

4. Получение производных на основе синтонов с двухосновными кислотами

5. Изучение гидролиза производных

6. Изучение противовирусной активности препаратов

III Экспериментальная часть

IV Выводы

V Литература 121 Благодарности

Список сокращений

AZT З'-азидо-З'-дезокситимидин

Вое трет-бутилоксикарбонил

ВОР бензотриазол-1 -ил-окси-тер мс(диметил амино)фосфонийгексафторфосфат

СС50 50%-ная цитотоксическая доза: концентрация, которая необходима для уменьшения жизнеспособности инфицированных клеток на 50%

CDI 1Ч,М-карбонилдиимидазол d4T 2' ,3 '-дидегидро-3 '-дезокситимидин

DCC N,N' -дициклогексилкарбодиимид

DCHA дициклогексиламин

DIPCDI 1,3-диизопропилкарбодиимид

DIPEA диизопропилэтиламин

DMAP 4-Ы,М-диметиламинопиридин

DMF диметилформамид

DMSO диметилсульфоксид

ЕС50 5 0%-ная противовирусная эффективная доза: концентрация, которая уменьшает на 50% индуцируемый вирусом цитопатический эффект

FBS бычья эмбриональная сыворотка

FLT З'-фторо-З'-дезокситимидин

Fmoc флуоренилметоксикарбонил

HOBt N-гидроксибензотриазол

HOSu N-гидроксисукцинимид

MBzl napa-метоксибензил m-CPBA .ме/яа-хлорнадбензойная кислота

NAD никотинамидадениндинуклеотид

NADH восстановленная форма NAD

NIRT нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы

Nuc-OH нуклеозид

SI индекс селективности: отношение СС50 к ЕС50.

11/2 время полураспада

TBAF тетрабутиламмоний фторид

TBDMS га/?ет-бутилдиметилсилил

TBTU 0-( 1 Н-бензотриазол-1 ^)-N,N,N' ,N' -тетраметилуронийтетрафторборат

Tempo* свободный радикал: 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси

TFA трифторуксусная кислота

THF тетрагидрофуран

TMSC1 триметилсилилхлорид

ВИЧ вирус иммунодефицита человека

ГЭБ гематоэнцефалический барьер

МАТ моноклональное антитело

МТТ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид

СПИД синдром приобретенного иммунодефицита

ТСХ тонкослойная хроматография

ЯМР ядерный магнитный резонанс

При описании ЯМР-спектров: с синглет д дублет т триплет кв квартет м мультиплет дд дублет дублетов дт дублет триплетов уш. уширенный м.д. миллионная доля

Структурные аналоги природных нуклеозидов используются для лечения некоторых видов вирусных заболеваний и в частности заболеваний, вызванных ретровирусами (например, ВИЧ), а также онкологических заболеваний. Эти соединения не имеют гидроксильной группы в 3'-положении дезоксирибозидного цикла и поэтому являются ингибиторами обратной транскриптазы (NIRT) и синтеза нуклеиновых кислот. Специфичность их фармакологического действия зависит от химической структуры, наличия тех или иных заместителей в молекуле, при этом все они в той или иной степени токсичны. Сегодня в медицине для лечения ВИЧ-инфекции широко используются несколько NIRT, среди них наиболее часто: зидовудин (азидотимидин; З'-азидо-3'дезокситимидин; AZT, производитель - Glaxo Wellcome Inc.), ставудин (З'-дезокси-2'3'дидегидротимидин; d4T, производитель - Bristol-Myers Squibb Со.) и диданозин (2',3'-дидезоксиинозин, ddl), обладающие наилучшим в этом классе соединений индексом селективности. К сожалению, эти нуклеозиды являются гидрофильными соединениями, их способность к пассивному транспорту через клеточную мембрану невысока, поэтому требуется достаточно высокая, приближающаяся к токсической, терапевтическая концентрация препарата в плазме. Кроме того, эти препараты обладают еще одним существенным недостатком, а именно, при их постоянном применении возникают различные штаммы ВИЧ, резистентные к ним. Для решения этих проблем, помимо поиска новых активных аналогов, в последнее время также ведется интенсивный поиск новых производных перечисленных выше нуклеозидов. Проводят многочисленные химические модификации этих аналогов нуклеозидов, в том числе путем создания производных с различными гидрофобными остатками.

Как установлено, первой стадией метаболизма этих соединений в клетке является фосфорилирование по 5'-гидроксильной группе дезоксирибозильного кольца, а во взаимодействие с обратной транскриптазой или клеточными ДНК-полимеразами вступают 5'-трифосфаты нуклеозидов. Поэтому в течение длительного времени основной стратегией модификации было получение различных производных 5'-фосфатов этих соединений. К сожалению, многие из таких препаратов, демонстрируя превосходную активность in vitro, оказались малоактивными in vivo. Связано это, по-видимому, с тем, что, проникая в клетку, такие производные подвергаются дефосфорилированию клеточными ферментами, утрачивая, таким образом, свое преимущество над исходными препаратами. Кроме того, гидрофильная по природе фосфатная группировка никак не улучшает транспорт препарата через гидрофобные клеточные мембраны. Поэтому представляется перспективным использование других биодеградируемых модифицирующих групп, обладающих дополнительными возможностями транспорта через мембрану (например, сродством к тем или иным клеточным рецепторам) или дополнительными фармакологическими свойствами (стратегия так называемых double drug, «двойных лекарств»).

Настоящая работа посвящена разработке методов синтеза подобных препаратов, модифицированных по 5'-положению дезоксирибозидного цикла.

Использование различных по структуре производных нуклеозидов для создания систем комбинированной терапии ВИЧ, возможно, будет тормозить или блокировать возникновение резистентности вируса к лекарственному препарату. Гидрофобные производные легче диффундируют через клеточные мембраны, и, следовательно, требуют более низкой терапевтической концентрации, а производные, обладающие сродством к специфическим рецепторам, легче проникают через гематоэнцефалический барьер или целенаправленно доставляют препарат к другим органам-мишеням.

Работы этого направления активно развиваются в последние годы. Охватить весь их спектр в рамках одного литературного обзора весьма затруднительно, поэтому далее описываются только сложноэфирные и карбонатные производные наиболее широко применяемых NIRT - азидотимидина и ставудина.

Литературный обзор

Этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), относящийся к классу ретровирусов. В настоящее время для терапии ВИЧ-инфекции широко применяются две группы антиретровирусных препаратов, действующих на разных стадиях жизненного цикла вируса. В первую группу входят ингибиторы обратной транскриптазы вируса (эти агенты также делят на нуклеозидные и ненуклеозидные), а во вторую ингибиторы протеазы. Далее речь пойдет о различных производных нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (NIRT).

Исторически NIRT являются первыми лекарствами, применяемыми в терапии ВИЧ [1]. В 1987 году был зарегистрирован первый антиретровирусный препарат Азидотимидин (AZT, Зидовудин, 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин) [2-7], который применялся в терапии наиболее широко. Позднее фирма «Bristol Myers Squibb» выпустила на рынок препарат Ставудин (d4T; 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидин) [5, 8-11], обладающий менее выраженной токсичностью по отношению к стволовым клеткам костного мозга и в меньшей степени подавляющий репликацию митохондриальной ДНК.

В настоящее время в медицинской практике используют комбинированную терапию ВИЧ. Применяют различные комбинации NIRT и их сочетания с отличными по действию агентами. Так, наиболее широко распространенной комбинированной терапией является применение ингибиторов обратной транскриптазы в сочетании с ингибиторами протеазы. Также используют соединения, обладающие другими видами активности: иммуноактивные вещества (пептиды и полисахариды); соединения, влияющие на устойчивость вирусной частицы (например, бицикламы); антагонисты рецепторов клеток-мишеней ВИЧ (пептиды). Для комбинированной терапии предлагается использовать так называемые double drug, которые при попадании в физиологическую среду будут разрушаться клеточными ферментами на два действующих агента. Таким производным двух основных нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (AZT и d4T) посвящен первый раздел данного обзора.

Второй раздел содержит данные о другом виде модификации NIRT. AZT и d4T являются гидрофильными соединениями и не могут свободно проходить сквозь клеточные мембраны и, особенно, преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и проникать в ткани мозга, а, следовательно, не могут подавлять репликацию вируса в этих клетках. Для увеличения проникающей способности гидрофильных молекул нуклеозидов и увеличения их терапевтической эффективности получают различные их производные. Такие соединения относят к классу prodrug, это означает, что такое соединение, преодолев биологический барьер, будет разрушено клеточными ферментами на активное лекарство и транспортный остаток, не обладающий ярко выраженным негативным физиологическим действием. Для модификации используют: а) гидрофобные молекулы, облегчающие свободную диффузию лекарства через мембраны; б) биологически активные соединения, использующие активные транспортные системы клеточных мембран.

Наиболее простым и удобным способом модификации является использование свободной 5'-гидроксильной группы нуклеозидов [12]. Поскольку после попадания такого производного в клетку исходное лекарство должно высвобождаться из транспортной формы или два лекарства должны отделиться одно от другого, то связь между нуклеозидом и модифицирующим остатком должна легко разрушаться клеточными ферментами. Описано значительное количество производных МЯТ, содержащих в 5'-положении фосфатную или фосфонатную группу, имитирующую природную структуру нуклеотида. Однако в данном обзоре речь пойдет о менее изученной группе производных по 5'-положению нуклеозида - сложноэфирных и карбонатных. Наиболее широко исследуется возможность применения сложноэфирной связи, так как последняя легко разрушается эстеразами с высвобождением лекарства/лекарств.

Выводы

1. Разработан метод параллельного синтеза производных нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ: зидовудина и ставудина.

2. Получены синтоны фармакологически активных нуклеозидов, зидовудина и ставудина, пригодные для параллельного синтеза.

3. На основе выбранных синтонов получены пять рядов новых производных зидовудина и ставудина с разной степенью гидрофобности.

4. Показано, что гидролиз сложноэфирных производных протекает быстрее в присутствии ферментов.

5. Получены предварительные результаты оценки противовирусной активности ряда синтезированных производных.

1. Rideout, J.L.; Barry, D.W.; Lehrman, S.N.; St. Clair, M.H.; Furman, P.A.; Beacham, L.M.,1.I; LeBlanc, H.S.; Freeman, G.A. Therapeutic nucleosides. 1986. Wellcome Foundation Ltd., UK. EP 199451.

2. Chen, B.-C.; Quinlan, S.L. Process for preparing AZT. 1995. Bristol-Myers Squibb Co., USA. EP 653437.

3. Czernecki, S.; Valery, J.M. Preparation of AZT (3'-azido-3'-deoxythymidine) and related compounds. 1991. Universite Pierre et Marie Curie, Fr. EP 427587.

4. Klaveness, J.; Rise, F.; Undheim, K.; Hatlelid, J. Preparation of 2',3'-dideoxy- or 3'-azido-2',3'-dideoxynucleosides for the treatment of human immunodeficiency virus (HIV) infection. 1990. Nycomed A/S, Norway. EP 362967.

5. Wilson, J.D. Preparation of 3'-azido-3'-deoxythymidine. 1990. Burroughs Wellcome Co., USA. US 4921950.

6. Wilson, J.D.; Almond, M.R.; Rideout, J.L. Preparation of zidovudine by improved processes not requiring thymidine. 1988. Wellcome Foundation Ltd., UK. EP 295090.

7. Chen, B.-C.; Stark, D.R.; Baker, S.R.; Quinlan, S.L. Preparation of 2',3'-didehydro-3'-deoxythymidine from 5-methyluridine. 1997. Bristol-Myers Squibb Co., USA. US 5672698.

8. Spector, R.H.; Chen, B.-C.; Quinlan, S.L. Preparation of d4T (2',3'-didehydro-3'-deoxythymidine) from 5-methyluridine. 1996. Bristol-Myers Squibb Company, USA. EP 735044.

9. Chen, B.-C.; Stark, D.R.; Baker, S.R.; Quinlan, S.L. Preparation of 2',3'-didehydro-3'-deoxythymidine D4T. 1995. Bristol-Myers Squibb Co., USA. EP 653436.

10. Kiso, Y.; Matsumoto, H.; Yamaguchi, S.; Kimura, T. Design of small peptidomimetic HIV-1 protease inhibitors and prodrug forms. Lett. Pept. Sci. 1999, 6(5-6), 275-281.

11. Kiso, Y.; Fujino, M. Preparation of multidrug-bonded compounds as anti-HIV agents. 2000. Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan. JP 2000309598.

12. Van Calenbergh, S. and Nair, V. Synthesis of a nucleoside bioconjugate system as a potential anti-HIV agent. Nucleosides & Nucleotides, 1999, 18(4&5), 737-738.

13. Gao, Y., Katsuraya, K., Kaneko, Y., Mimura, T., Nakashima, H., and Uryu, T. Synthesis of azidothymidine-bound curdlan sulfate with anti-human immunodeficiency virus activity in vitro. Polymer Journal, 1998, 30(1), 31-36.

14. Gao, Y., Katsuraya, K., Kaneko, Y., Mimura, T., Nakashima, H., and Uryu, T. Synthesis, enzymatic hydrolysis, and anti-HIV activity of AZT-spaser-curdlan sulfates. Macromolecules, 1999, 32(25), 8319-8324.

15. Gao, Y., Katsuraya, K., Kaneko, Y., Mimura, T., Nakashima, H., and Uryu, T. Synthesis of azidothymidine-bound sulfated alkyl oligosaccharides and their inhibitory effects on AIDS virus infection in vitro. Polymer Journal, 1998, 30(3), 243-248.

16. Vlieghe, P.; Kraus, J.-L.; Clerc, T.; Salles, J.-P. Preparation of nucleoside-carrageenan conjugates as antiviral and antitumor agents. 2000. Laboratoires Laphal S.A., Fr. WO 0077019.

17. McDougal, J.S.; Kennedy, M.S.; Sligh, J.M.; Cort, S.P.; Mawle, A., and Nicholson, J.K.A. Binding of HTLV-III/LAV to T4+ T cells by a complex of the viral protein and the T4 molecule. Science, 1986, 231, 382-385.

18. Uchiyama, Т.; Yoshino, H.; Takemoto, M.; Achiwa, К. Synthesis of the 2',3'-dideoxynucleoside derivatives of the specific binding peptide part of CD4. Chem. Pharm. Bull. 1991,39(11), 3091-3093.

19. Ряховский, B.B.; Малекин, С.И.; Носова, B.M.; Кисин, А.В.; Кругляк, Ю.Л.; Курочкин, В.К. Конъюгаты 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина с тимогеном. Синтез, анти-ВИЧ-активность. Биоорг. Химия, 1999, 25(7), 499-504.

20. Schols, D., Este, J.A., Henson, G., and De Clerq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents are targeted at the HIV coreceptor Fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 1997, 35(3), 147-156.

21. Dessolin, J.; Vlieghe, P.; Bouygues, M.; Medou, M.; Quelever, G.; Camplo, M.; Chermann, J.C., and Kraus, J.L. Tri-N-Boc-tetraazamacrocycle-nucleoside conjugates: synthesis and anti-HIV activities. Nucleosides & Nucleotides, 1998, 17(5), 957-968.

22. Dessolin, J.; Galea, P.; Vlieghe, P.; Chermann, J.-C., and Kraus, J.-L. New bicyclam AZT conjugates: design, synthesis, anti-HIV evaluation, and their interaction with CXCR-4 coreceptor. J. Med. Chem. 1999, 42, 229-241.

23. Cheng, Q.; Oritani, Т.; Horiguchi, Т.; Yamada, Т.; Mong, Y. Synthesis and biological evaluation of novel 9-functional heterocyclic coupled 7-deoxy-9-dihydropaclitaxel analogue. Bioorg. Med Chem. Lett. 2000, 10(5), 517-521.

24. Zahran, M.A.; Kovacs, L.; El Sakka, I.; Pedersen, E.B.; Nielsen C. The potential of aspirin in pro-drug synthesis. A new potential delivery system of AZT and FLT. Arch. Pharm. (Weinheim, Ger.) 1996, 329(8-9), 417-420.

25. Kawaguchi, Т.; Ishikawa, K.; Seki, Т.; Juni, K. Ester prodrugs of zidovudine. J. Pharm. Sci. 1990, 79(6), 531-533.

26. Seki, Т.; Kawaguchi, Т.; Juni, K. Enhanced delivery of zidovudine through rat and human skin via ester prodrugs. Pharm. Res. 1990, 7(9), 948-952.

27. Kawaguchi, Т.; Endoh, Т.; Seki, Т.; Juni, K. Plasma concentrations of zidovudinein rats via oral administration of its ester prodrugs. J. Pharm. Sci. 1991, 80(4), 404-405.

28. Parang, K.; Wiebe, L.I.; Knaus, E.E. In vitro anti-hepatitis B virus activities of 5-O-myristoyl analogue derivatives of 3'-fluoro-2',3'-dideoxythymidine (FLT) and 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine (AZT). J. Pharm. Pharm. Sci. 1998, 1(3), 108-114.

29. Horrobin, D.F.; Stewart, J.C.M.; Winther, M.D. Preparation of fatty acid derivatives of nucleosides or acylic nucleosides as antiviral agents. 1990. Efamol Holdings PLC, UK. EP 393920.

30. Boerretzen, B.; Dalen, A.; Myhren, F.; Stokke, K.T. Preparation of nucleoside analog fatty esters as antiviral compounds. 1994. Norsk Hydro A/S, Norway. WO 9422887.

31. Bradley, M.O.; Shashoua, V.E.; Swindell, C.S.; Webb, N.L. Nucleoside analog compositions and uses thereof. 1999. Neuromedica, Inc., US. WO 9926958.

32. Yatvin, M.B.; Stowell, M.H. Covalent polar lipid conjugates with antimicrobial and antineoplastic drugs for targeting to biological protected sites. 2000. Oregon Health Sciences University, US. WO 0033883.

33. Aggarwal, S.K., Gogu, S.R., Rangan, S.R.S., and Agrawal, K.C. Synthesis and biological evaluation of prodrugs of zidovudine. J. Med. Chem. 1990, 33, 1505-1510.

34. Agrawal, K. AZT analogs for treatment of retrovirus infections. 1990. Tulane Educational Fund, Inc., USA. WO 9004969.

35. Bailey, J.M.; Nelson, K.A.; Lightfoote, M.; Mook, R.A. Antiviral action & tissue uptake of AZT-sterol dicarboxylates. Biochem. Soc. Trans. 1998, 26(4), S390.

36. Hussain, R., Toth, I., and Gibbons, W.A. Synthesis and structural elucidation of lipophilic azidothymidine conjugates. Liebigs Ann. Chem. 1992, 169-171.

37. Whittaker, R.G.; Bender, V.J.; Reilly, W.G.; Moghaddam, M. Therapeutic compound — fatty acid conjugates. 1999. Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation, Austral. US Pat. 5952499.

38. Sergheraert, C., Pierlot, C., Tartar, A., Henin, Y., and Lemaitre, M. Synthesis and anti-HIV evaluation of d4T and d4T 5'-monophosphate prodrugs. J. Med. Chem. 1993, 36, 826-830.

39. Hammer, K., Hatlelid, J., Grotli, M., Arukwe, J., Klaveness, J., Rise, F., and Undheim, K. Ether, carbonate and urethane deoxynucleoside derivatives as prodrugs. Acta Chem. Scand. 1996, 50, 609-622.

40. Pochet, S.; Kansal, V.; Destouesse, F.; Sarfati, S.R. Alkylglycoside carbonates of 3'-azido-3'-deoxythymidine. Tetrahedron Lett. 1990, 31(42), 6021-6024.

41. Vlieghe, P.; Kraus, J.-L.; Clerc, T.; Salles, J.-P. Preparation of esters derived from nucleosides as antiviral agents. 2001. Laboratoires Laphal S.A., Fr. WO 0104134.

42. Vlieghe, P.; Kraus, J.-L.; Clerc, T.; Salles, J.-P. Preparation of nucleosides as antiviral agents. 2000. Laboratoires Laphal S.A., Fr. WO 0077020.

43. Torrence, P.F.; Kinjo, J.; Lesiak, K.; Balzarini, J.; De Clercq, E. AIDS dementia: synthesis and properties of a derivative of 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT) that may become 'locked* in the central nervous system. FEBS Lett. 1988, 234(1), 135-140.

44. Agrawall, K. AZT analogs for treatment of retrovirus infections. 1990. Tulane Educational Fund, Inc., USA. WO 9004969.

45. Palomino, E.; Kessel, D.; Horwitz, J.P. A dihydropyridine carrier system for sustained delivery of 2',3'-dideoxynucleosides to the brain. J. Med. Chem. 1989, 32(3), 622625.

46. Lee, B.-H.; Lim, M.-K.; Shin, J.-H.; Jang, T.-S.; Park, J.-S.; Kang, S.-W. Synthesis and antitumor activity of 2',3'-didehydro-3'-deoxythymidine and its derivative. Bull. Korean Chem. Soc. 1997, 18(7), 711-714.

47. Gogu, S.R., Aggarwal, S.K., Rangan, S.R.S., and Agrawal, K.C. A pro-drug of zidovudine with enhanced efficacy against human immunodeficiency virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989, 160(2), 656-661.

48. Little, R.; Bailey, D.; Brewster, M.E.; Estes, K.S.; Clemmons, R.M.; Saab, A; Bodor, N. Improved delivery through biological membranes. XXXIII. Brain-enhanced delivery of azidothymidine (AZT). J. Biopharm. Sci. 1990, 1(1), 1-18.

49. Brewster, M.; Anderson, W.R.; Webb, A.I.; Pablo, L.M.; Meinsma, D.; Moreno, D.; Derendorf, H.; Bodor, N.; Pop, E. Evaluation of a brain-targeting zidovudine chemical delivery system in dogs. Antimicrob. Agents Chemother. 1997, 41(1), 122-128.

50. Pop, E.; Liu, Z.Z.; Vlasak, J.; Anderson, W.; Brewster, M.E.; Bodor, N. A dihydroisoquinoline targetor-based acid resistant chemical delivery system of azidothymidine (AZT). Drug Delivery 1993, 1(2), 143-149.

51. Pop, E.; Liu, Z.Z.; Vlasak, J.; Anderson, W.R.; Brewster, M.E.; Bodor, N.S. Synthesis and evaluation of a novel chemical delivery system of zidovudine with increased stability at lowpH. Pharm. Sci. 1995, 1(6), 265-269.

52. Han, H.-K.; Oh, D.-M.; Amidon, G.L. Cellular uptake mechanism of amino acid ester prodrugs in Caco-2/hPEPTl cells overexpressing a human peptide transporter. Pharm. Res. 1998, 15(9), 1382-1386.

53. Beauchamp, L.M.; Orr, G.F.; de Miranda, P.; Burnette, T.; Krenitsky, T.A. Amino acid ester prodrugs of acyclovir. Antiviral. Chem. Chemother. 1992, 3, 157-164.

54. Hidalgo, I.J.; Raub, T.J.; Borchardt, R.T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology 1989, 96, 736-749.

55. De Bethune, M.P.; De Clercq, E.D.A.; Dejonghe, J.P.; Pauwels, R.W.J.; Trouet, A. 3'-Azido-3'-deoxythymidine (AZT) derivatives active against the AIDS virus. 1990. IRE-Celltarg S. A., Belg. EP 357495.

56. Tadayoni, B.M.; Friden, P.M.; Walus, L.R.; Musso, G.F. Synthesis, in vitro kinetics, and in vivo studies on protein conjugates of AZT: evaluation as a transport system to increase brain delivery. Bioconjugate Chem. 1993, 4, 139-145.

57. Friden, P.M., Walus, L., Musso, G., Taylor, M., Malfroy, В., and Starzyk, R. Anti-transferrin receptor antibody and antibody-drug conjugates cross the blood-brain barrier. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88, 4771-4775.

58. Miles-Brown, J. Therapeutic agents, and intermediates for the synthesis thereof. 1991. Oxford Virogy PLC, GB. WO 9112021.

59. Pochet, S.; Kansal, V.; Destouesse, F.; Sarfati, S.R. Alkylglycoside carbonates of 3'-azido-3 '-deoxythymidine. Tetrahedron Lett. 1990, 31(42), 6021-6024.

60. Balkenhohl, F., von dem Bussche-Htinnefeld, С., Lansky, A., Zechel, C. Combinatorial synthesis of small organic molecules. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 2288-2337.

61. Nezi, A., Ostresh, J.M., Houghten, R.A. The current status of heterocyclic combinatorial libraries. Chem. Rev. 1997, 97, 449-472.

62. Ellman, J.A. Design, synthesis, and evaluation of small-molecule libraries. Acc. Chem. Res. 1996, 29, 132-143.

63. Gordon, E.M., Gallop, M.A., Patel, D.V. Strategy and tactics in combinatorial organic synthesis. Application to drug discovery. Acc. Chem. Res. 1996, 29, 144-154.

64. Terret, N.K. Combinatorial chemistry. 1998. Oxford University Rress.

65. Horwitz, J.P., Chua, J., Da Rooge, M.A., Noel, M., Klundt, I.L. The formation of 2',3'-unsaturated pyrimidine nucleosides via a novel p-elimination reaction. J. Org. Chem. 1966, 31, 205-211.

66. Бергман, Э.Д., Гинзбург, Д., Паппо, Р. Реакция Михаэля. Сборник «Органические реакции», 1963, М. «Издательство иностранной литературы», 10, 181.

67. Berezovskaya, Yu., Chudinov, М., Kirillova, Yu., Shastina, N., Shvets, V., Yurkevich, A. Design of the new molecular transport systems for the nucleosides-pharmacophores carrying. Nucleosides & Nucleotides. 1998,17(9-11), 2127-2133.

68. Berezovskaya, Yu., Chudinov, М., Yurkevich, A. Combinatorial optimization of antiviral prodrugs properties. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2003, 22(5-8), 837-839.

69. Neises, В., Sterlich, W. Simple method for the esterification of carboxylic acids. Angew. Chem. Int. Ed. 1978,17(7), 522-524.

70. Castro, В., Dormoy, J.R., Evin, G., Selve, C. Tetrahedron Lett. 1975, 1219.

71. Castro, В., Evin, G., Selve, C., Seyer, R. Peptide coupling reagents; VIII. A high yield preparation of phenyl esters of amino acids using benzotriazolyloxytris-dimethylamino.phosphonium hexafluorophosphate (BOP reagent). Synthesis, 1977, 6, 413.

72. Meitzer, M.S., Skillman, D.R., Hoover, D.L., Hanson, B.D., Turpin, J.A., Kalter, D.C., Gendelman, H.E. Macrophages and the human immunodeficiency virus. Immunol. Today, 1990, 77,217-223.1. Благодарности

73. Автор выражает благодарность к.х.н. Чудинову М.В. за неоценимые консультации, компании "ChemBridge Corp." и лично Свиридову С.И., а также родителям за материальную поддержку в период выполнения работы.