Амидофосфиты нуклеозидов, содержащие активированные линкерные группы - новые мономеры для синтеза модифицированных олигонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА

Амидофосфиты нуклеозидов^содержащие активированные линкерные группы - 'новые мономеры для синтеза модифицированных олигонуклеотидов

02.00.10 — биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск, 2006 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель:

д.х.н. Сильников В. Н.

Официальные оппоненты:

д.х.н. Ткачев А. В. к.х.н. Пышный Д. В.

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет

ОО

Защита состоится « Я0 » ¿У^И^^Р*^ 2006 г. в ^^ часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан ^ »

Учёный секретарь диссертационного совета д.х.н. а/ Фёдорова О.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтетические аналоги нуклеиновых кислот, содержащие различные функциональные группы, являются важнейшими инструментами в молекулярно-биологических исследованиях. Область их применения чрезвычайно широкая: фундаментальные исследования, направленные на изменив субстратной специфичности и механизма действия ферментов нуклеинового обмена и НК-связывающих белков; структурно-функциональные исследования биополимеров; регуляция экспрессии генетического материала, а также его направленная реконструкция. Олигонуклеотидные конъюгаты находят широкое практическое применение в медицинской ДНК-диагностике.

Введение каждой новой модификации в практику олигонуклеотидного синтеза связано с решением комплекса проблем как на стадии получения модифицированного мономера, так и при включении его в олигонуклеотидную цепь. Таким образом, актуальной становится задача поиска возможно более универсального метода синтеза модифицированных олигонуклеотидов.

Особый интерес представляет так называемая «прекурсорная стратегия», основанная на использовании в олигонуклеотидном синтезе мономеров, содержащих группы - предшественники, или прекурсорные группы, являющиеся основой для постсинтетической модификации. Введение в олигонуклеотидную цепь таких мономеров позволяет получать широкий спектр олигонуклеотидных конъюгатов на базе одного олигонуклеотида-предшественника.

В связи с этим важной задачей является поиск новых прекурсорных групп для постсинтетической модификации олигонуклеотидов. Создание набора мономеров, содержащих такие группы, будет являться одним из решений проблемы универсальности синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, а также позволит применять при их синтезе приемы и методы комбинаторной химии.

Целью настоящей работы является конструирование и синтез мономеров для амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза, содержащих в различных положения нуклеотидов активные линкерные группы и обеспечивающих получение широкого спектра олигонуклеотидных конъюгатов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) разработать простые препаративные методы синтеза 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов, которые являются базовыми соединениями для синтеза нуклеозидов с прекурсорными группами; 2) сконструировать активированные линкерные группы различной длины и жесткости, включая дендримерные линкерные группы с двумя и более функциональными остатками; 3) синтезировать мономеры для стандартного амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза, содержащих активные линкерные группы на основе моноамида монометилового эфира щавелевой кислоты и моноамидов моноцианметиловых эфиров янтарной, глутаровой и адипиновой

кислот; 4) продемонстрировать возможность использования полученных мономеров в синтезе олигонуклеотидных конъюгатов.

Научная новизна и практическая значимость. В работе получила развитие прекурсорная стратегия синтеза олигонуклеотидных конъюгатов с использованием модифицированных нуклеозидов, несущих активированные линкерные группы. При этом значительно расширены возможности метоксиоксалиламидной (МОХ) стратегии, основанной на использовании моноамидов метиловых эфиров щавелевой кислоты в качестве прекурсорных групп, как для синтеза производных нуклеозидов, несущих активированные линкерные группы в различных положениях углеводного фрагмента и гетероциклических оснований, так и для создания дендримерных конструкций, позволяющих вводить два и более функциональных остатка в один нуклеотидный фрагмент.

Разработаны препаративный метод синтеза 2'-амино-2'-дезоксиуридина и препаративные методы синтеза 5'-0(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2 -дезоксицитидина, 9-[5-6>-(4,4

диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-рЛ>рибофуранозил]-Л^-бензоил-аденина исходя из 2'-амино-2,-дезоксиуридина. Эти соединения являются удобными синтонами для введения активированных линкерных групп в 2'-положение нуклеозидов. Предложены активированные линкерные группы нового типа на основе моноцианметиловых эфиров моноамидов дикарбоновых кислот. Возможность их использования была продемонстрирована на примере синтеза мономеров, несущих такую группу в 2'-позициии, и последующего их применения для получения на постсинтетической стадии олигонуклеотидных конъюгатов. Впервые синтезированы 16 мономеров для фосфитамидного олигонуклеотидного синтеза, которые содержат различные активированные линкерные группы как в углеводном фрагменте, так и в гетероциклических основаниях 2-дезоксиуридина, 2-дезоксицитидина, 2-дезоксиаденозина, 5-метил-2-дезоксицитидина и тимидина. Предложенные соединения позволяют получать олигонуклеотидные конъюгаты, содержащие функциональные группы в одном или нескольких заданных положениях олигонуклеотида.

Ряд модифицированных мономеров был успешно использован при синтезе олигонуклеотидных конъюгатов с флюоресцентными, фотоактивируемыми и РНК-гидролизующими молекулами. Полученные олигонуклеотидные конъюгаты нашли применение в исследованиях сотрудников лаборатории биоорганической химии ферментов, лаборатории биохимии нуклеиновых кислот, лаборатории «Медиген» Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН и отдела протеомики Института биомедицинской химии РАМН.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты были представлены на 3-ем Международном конгрессе молодых ученых "Науки о человеке", Томск, 2002 г.; 15-м международном симпозиуме "Ыис1еоз1с1е8,

nucleotides and nucleic acids", Leuven, Бельгия 2002г.; 4-ом Всероссийском симпозиуме по органической химии «Органическая химия - упадок или возрождение?» Москва - Углич, 2003г.; Международном симпозиуме "Advances in Science for Drug Discovery", Москва, 2005г.; и медународных конференциях "Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference", Новосибирск, 2003г.; XX Украинская конференция по органической химии, Одесса, 2004г.; International Conference on Chemical Biology, Новосибирск, 2005г.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 157 страницах, содержит 5 рисунков, 91 схему и 2 таблицы. Библиография включает 233 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. 2 '-Амипопроизводные уридина, цитидина, и аденозина

2'-Аминонуклеозиды являются удобными базовыми соединениями для получения фосфамидитов, содержащих активированные группы -предшественники в 2'-положении. В качестве исходного соединения для введения активированных групп в 2-положение нуклеозидов был выбран 2'-амино-2'-дезоксиуридин, из которого легко могут быть получены 2'-аминопроизводное цитидина, и с помощью реакции перегликозилирования - 2-аминопроизводные пуриновых нуклеозидов.

1.2. Синтез 2,-амино-2,-дезоксиуридина

Для получения 2'-амино-2'-дезоксиуридина (4) было необходимо разработать препаративный метод синтеза, позволяющий проводить крупномасштабное получение целевого соединения без применения хроматографии (описанные в литературе методы либо плохо воспроизводятся, либо требуют использования в качестве исходных высокотоксичных или дорогостоящих соединении). За основу была взята реакция раскрытия ангидроцикла 2,2-0-ангидро-1 -(ß-D-арабинофуранозил)урацила (2) азидом натрия (схема 1). Реакцию проводили в диметилацетамиде в узком температурном интервале HODS С, с добавлением дибензо-18-крауна-6. Несмотря на высокое содержание 2'-азидо-2'-дезоксиуридина в реакционной смеси (78 % по данным ВЭЖХ), без хроматографическои очистки выделить чистый продукт не удается. Предложенный нами подход - восстановление 2'-азидо-2'дезоксиуридина (3) в реакционной смеси каталитическим гидрированием и очистка образующегося 2'-амино-2'-дезоксиуридина (4) с помощью ионообменной смолы КРС-2п позволили получить чистый целевой продукт с выходом 43 % в расчете на уридин без применения хроматографических разделений реакционных смесей.

1.2. Синтез 5'-О-(4,4 '-димстоксшпритил)-2 '-аминов '-дезокси-уридина, 5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2 '-дезокси-цитидипа, 9-[5- О-(4,4 '-дцм етокситр итил)-2-ам ино-2-

дсзокс и-Р-И-рибо фур си юз ил]-]у-бепз оиладешпш и 9-[5-0-(4,4*-д1шетокситритил)-2-амино-2-дезокси-р-В-арабино-фуранозш]-№-бензоиладеншт

5'-(9-(4,4'-Диметокситр итил)-2'-амино-2'-дезоксиуридин (7) базовое соединение для введения активированных линкерных групп в 2'-положение уридина был получен с общим выходом 25 % из соединения (1), без применения хроматографического разделения реакционных смесей (схема 1).

Н NN2 4

Общий выход 43 %

Общий выход 25 %

Схема 1. Синтез 5'-<Э-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2'-дезоксиуридина. Синтез 5,-<9-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина

н\5

он».

ОМТгС!

ОМТг

_ | М*а81С| йМТг-О^ I РОС1» / 1,2,4-триазол

Мв3Б1-6 N1

Л

ОМТг-Оч. I МНд

М«)$1-0 А* 10

МН,

ОМТг-Ос I Н,/Рс1(С)

ОН N.

ОМТг

1Л1П,

онИн,

11

Общий выход 15 %

Схема 2. Синтез 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина.

(12) был осуществлен через триазолидное производное (10) с выходом около 15 % в расчете на азидоуридин (3), взятый из предыдущей реакционной смеси без предварительной очистки (схема 2).

Для синтеза 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-Р-В-рибофуранозил]-/г-бензоиладенина (16) была использована реакция перегликозилирования (схема 3). По окончании реакции перегликозилирования триметилсил ильные защиты снимались обработкой 1М раствором тетрабутиламмоний фторида в диоксане. После введения диметокситритильной защиты по 5'-гидроксильной группе получали соединение (15) с общим выходом 25 % в расчете на исходный 2'-аминоуридин (4). Бензилоксикарбонильную защиту удаляли каталитическим гидрированием на палладиевом катализаторе в диоксане. Целевое соединение (16) было получено с общим выходом 22 % в расчете на исходный 2-аминоуридин (4).

НН-Вг

(СвН4)(СН2)0С(0)С1

Н ЫНС(0)0СН2СвНв 13

Н ИНС(0)0СН2СвН5 14

ОМТгС!

ОМТг

Н2/5% Р<ИС

1Н МНС(0)0СН2СвНв 15

ОМТг

ЭН ГЧН2 16

Общий выход 22 %

Схема 3. Синтез 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-р-В-рибофуранозил]-Л^-бензоиладенина.

Помимо 2'-аминопроизводного 2-дезоксиаденозина (16) нами был полнен его арабиноаналог (24). В результате 7 - стадийного синтеза целевое соединение 9-[5-Р-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-Р-Б-арабинофуранозил]-Л^-бензоиладенин (24) было получено с выходом 30 % в расчете на исходный аденозин.

Полученные2-аминопроизводные уридина, цитидина, аденозина и арабиноаденозина использовались для синтеза фосфамидитов содержащих в 2'-положении активированные линкеры.

В качестве активированных линкерных групп применялись известные из литературы прекурсорные группы на основе моноамида монометилового эфира щавелевой кислоты (МОХ - группы).

НР

пиридин

ОМТг

ОМТг-1

{ 2 Н2/Рс1 (С)

>Н 24 Общий выход 30 */•

Схема 4. Синтез 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-р-В-арабинофуранозил]-Л'6-бензоиладенина.

2. Синтез фосфамидитов уридина цитидина, аденозина и арабиноаденозина с одной и двумя МОХ - группами в 2'-положении

Реакцией аминонуклеозида (7) с диметилоксалатом при 50 °С с выходом 52 % было получено соединение (25) (схема 5). Фосфитилирование соединения (25) проводили по стандартной методике. К раствору защищенного нуклеозида со свободной 3'-гидроксильнои группой и диизопропиламмоний-тетразолида в свежеперегнанном хлористом метилене при перемешивании добавляли 2-цианоэтил-ЛСЛ^А^',Л^-тетраизопропиламидофосфит. Таким образом, фосфамидит (26) был получен с выходом 64 %.

Нуклеозид (28) может быть получен из соединения (7) последовательным наращиванием линкерной цепи. Последовательные реакции нуклеозида (7) с диметилоксалатом, трис-(2-аминоэтил)амином и снова диметилоксалатом без выделения промежуточного соединения (27) позволили получить соединение (28) с общим выходом 30 %. Реакция диметилоксалата с аминогруппами линкера протекает значительно легче, чем первая реакция с аминогруппой в 2'-положении, возможно, из-за уменьшения стерических затруднений. Фосфитилирование соединения (28) по стандартной методике приводит к фосфамидиту (29) с выходом 92 %.

6

омтм

ЗН NN2 7

((РН)2мьро(СН2ЬСМ

(н^омтм^Г

гын2 *-\ж2

МТМХ Т ОМТМХ | ^ _ с

(Рг|)2м^'^чосн2сн2см (рньм^^оснгснгси ну-с^ н а

•>е „ о

Схема 5. Синтез фосфамидитов уридина с одной и двумя МОХ - группами в 2'-

положении

Реакция диметилоксалата с аминогруппой производного цитидина (12) идет при комнатной температуре, при этом экзоциклическая аминогруппа основания не затрагивается (схема 6).

он~йн2

-НО Н

12

30

ОМТг-СХ- ?"*

(рьсо)2О „¿^о^ ((РЛ»^)2РО(снгьсм

60 * (РН)2м^осн2сн2сы

31

омтг%ЛВ1

ОН 1ЧН2

16

омтг-а. t

44%

Е1,Ы

32

нб ниуЧ/

((Рг'ЬИ^РО^Н^СМ

75%

33

ОМТг-СЦ I

(РНь1>Н\)сн2сн2сы

34

65%

йМТг-Ос |

УНг

«Рг|)2МЬРО(СН2)2СМ ОМТГ-1

35

83%

«а:

36

Схема 6. Синтез фосфамидитов цитидина, аденозина и арабиноаденозина, содержащих МОХ - группы в 2'-положении.

Последующая защита этой аминогруппы с помощью бензойного ангидрида приводит к образованию соединения (31) с общим выходом 33 %. Фосфитилирование нуклеозида (31) по стандартной методике приводит к мономеру (32) с выходом 60 %.

Аналогичным образом были синтезированы производные аденозина (34) и арабиноаденозина (36).

Несмотря на то, что метоксиоксалиламидная группа зарекомендовала себя как хорошая прекурсорная группа, использование в олигонуклеотидном синтезе фосфамидитов, содержащих в 2'-положении такую группу, выявило ряд проблем. Для достижения приемлемых выходов олигонуклеотидных конъюгатов необходимо значительное увеличение времени конденсации и применение более активного катализатора - этилтиотетразола. При использовании мономера с арабиномодификацией подобных проблем не наблюдалось. Причина этого явления до конца не выяснена. В литературе высказано предположение о стерических затруднениях со стороны жесткой метоксиоксалиламидной группы в ¿'-положении. Возможно также, что низкие выходы связаны с внутримолекулярной дезактивацией амидофосфитной группы близко расположенной карбонильной группой метоксиоксалиламида. С целью уйти от жесткой конструкции МОХ - группы и одновременно разнести реакционно-способные центры, нами было предложено использовать в качестве активированных линкерных групп эфиры других алифатических дикарбоновых кислот.

3. Синтез фосфамидита 5 '-0-(4,4 '-д1шетокситритил)-2 метоксикарбонилметилкарбониламино-2'-дезоксиуридина

Реакционная способность диметилового эфира малоновой кислоты близка к реакционной способности диметилоксалата Это позволяет надеяться на то, что синтез целевого соединения (39) может быть осуществлен по аналогичной для диметилоксалата схеме (схема 7).

на. у Пуп. а но. и

^ СГ,СООС,Н,/Е1,Н ^—

¿н 1н, ¿Н нА

• ч '

но. и но. и омтг-о. и омтг-о. „

.4* . н

Схема 7. Синтез фосфамидита 5,-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-метоксикарбонилметилкарбониламино-2-дезоксиуридина.

Путь Б, состоящий из двух стадий, кажется более рациональным, однако реакция 2'-амино-2'-дезоксиуридина с диметиловым эфиром малоновой кислоты приводит к основному тоодокту, которому на основании спектральных характеристик Н-ЯМР, С-ЯМР и ЙК была присвоена структура циклического соединения (37).

В конечном итоге нуклеозид (39) был получен реакцией диметилмалоната с соединением (7), с выходом 30 %. Выход фосфитамидного мономера (40) составил 64 %.

Дополнительная метиленовая группа между двумя карбонильными атомами углерода незначительно снижает реакционную способность сложноэфирной группы по отношению к аминам. Обработка 10-кратным избытком пропилендиамина производных 2'-амино-2'-дезоксиуридина, содержащих остатки метиловых эфиров щавелевой и малоновой кислот, в течение часа приводит к количественному образованию соответствующих амидов.

С увеличением длины дикарбоновых кислот реакционная способность их метиловых эфиров снижается. Повысить реакционную способность до необходимого уровня удалось путем получения и использования не описанных ранее в литературе оис-цианметиловых эфиров соответствующих кислот.

4. Синтез фосфамидитов на основе 2'-аминоуридина и 2*-аминопроизводного арабиноаденозина, несущих цианметилоые эфиры янтарной, глутаровой и адипиновой кислот

Бис-цианметиловые эфиры янтарной (41), глутаровой (42) и адипиновой (43) кислот были приготовлены как показано на схеме 8 А и использовались без выделения в реакции с соединением (7).

нЛАн „с-ЛАг-с*

-»-4 СН'СМ 41.-1

42а >3 43 II ■ 4

ОМТг-Л V О О ОМТгОч. V

((РИ^РО^Н^аСН

¿»П.Н, "" ОН

44 в.» 40% А. 47 й ■ 2 40 %

4« II >130% Р»И)а>Г ^ОСН^СН^Н 44II >3*1%

«•"■««•* 49 й ■ 4 47 %

¿¡¡"~ N0---ог^ВзУ^см «Рг^ЬРОРгНаЬСМ Г

47% 30 % Т

« ,0 (Рг^^^ОСНзСН^М

11

Схема 8. Синтез фосфамидитов на основе 2'-аминоуридина и 2'-аминопроизводного арабиноаденозина, несущих цианметилоые эфиры янтарной,

глутаровой и адипиновой кислот.

Выходы в реакциях получения соединений (44), (45), (46) составили 40 %, 30 % и 46 % соответственно (схема 8 Б).

Фосфамидиты соответствующих нуклеозидов (47), (48) и (49) были приготовлены по стандартной методике с выходами 40 %, 88 %, 47 %. Аналогичным образом реакцией бис-цианметилового эфира глутаровой кислоты (42) с аминопроизводным арабиноаденозина (24) был получен нуклеозид (50) с выходом 47 %. Фосфамидит (51) был синтезирован с выходом 30 %.

Использование таких мономеров в олигонуклеотидном синтезе позволило увеличить выход олигонуклеотидных конъюгатов в сравнении с мономерами, содержащими МОХ - группы.

Синтез фосфамидитов на основе тимидинау цитидина и аденозина, несущих линкеры с МОХ - группами в гетероциклических основаниях

В ряде случаев, когда допустимо введение заместителей в гетероциклическое основание, для постсинтетической модификации олигонуклеотидов могут быть использованы фосфамидиты, содержащие линкерные группы в гетероциклах. Такие модифицированные звенья также можно вводить в различные положения олигонуклеотида.

Схема 9. Синтез фосфамидитов на основе тимидина, цитидина, несущих линкеры с МОХ - группами в гетероциклических основаниях.

Для введения активированных линкерных групп в 5-положение тимидина предварительно, на основе описанных в литературе методик, было синтезировано соединение (52), которое содержит 5-(3-аминопропил)оксиметильный остаток (схема 9).

Для сокращения числа стадий синтеза производного тимидина с двумя метоксиоксалиламидными группами нами был синтезирован трис-(метоксиоксалиламидоэтил)амин (53). Реакция нуклеозида (52) с соединением (53) приводит к нуклеозиду (54) с выходом 57 %, соответствующий фосфамидит (56) был получен с выходом 81%.

В случае 2-дезоксицитидина введение алкильного заместителя по У -положению не приводит к значительной потере способности образовывать водородные связи при комплементарном взаимодействии. С помощью реакции переаминирования из соответствующего Л^-бензоил-производного цитидина нами был получен нуклеозид (57).

На следующем этапе в нуклеозид (57) вводили линкер с выходом нуклеозида (58) 55 %. Фосфамидит (59) получен с 88 % выходом.

В различных молекулярно-биологических исследованиях широко используются олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие 5-метил-2-дезоксицитидин. Для расширения спектра возможных олигонуклеотидных конъюгатов мы также синтезировали фосфамидит (62), отличающийся от мономера (59) только метильной группой в 5-положении гетероцикла.

Схема 10. Синтез фосфамидитов на основе цитидина и аденозина, несущих линкеры с МОХ - группами в гетероциклических основаниях.

Модифицированный фосфамидит на основе цитидина, не содержащий заместителей по экзоциклической аминогруппе (67), был получен исходя из нуклеозида (63), который, в свою очередь, был получен из производного тимидина (52) (схема 10).

С целью расширения спектра модифицированных нуклеозидов нами было получено также производное 2'-дезоксиаденозина. Соединение (68) синтезировали через триазолидное производное из дезоксиаденозина. Целевой фосфамидит (70) был получен после введения линкера и фосфитилирования продукта (69).

6. Синтез фосфамидитов, несущих дендримерные конструкции

Отдельный интерес представляет синтез конъюгатов, содержащих несколько функциональных групп. Одним из подходов к решению этой задачи является синтез дендримерных конструкций. Синтез такого сорта соединений не только позволит получать конъюгаты с большим числом однотипных функциональных групп, но и, используя приемы и методы комбинаторной химии, получать конъюгаты, содержащие разнородные лиганды.

мох

¿ж оя

он

67

71 Я-Н

72 Я ■ Р[0(СН2)2СМ]М(Рг')2

^ЯОХ

ох

мох

73 Я- Н

74 Я ■ Р[0(СН2)2СМ^(Рг')2

Схема 11. Синтез фосфитамидного мономера на основе производного цитидина, несущего линкер с четырьмя МОХ — группами.

Ранее уже обсуждался синтез мономеров, содержащих две метоксиоксаламидных группы. Та же идеология была использована для синтеза на основе производного цитидина (57) нуклеозида, несущего линкер с четырьмя МОХ - группами и соотвествующего фосфамидита (74) (схема 11).

В процессе исследования было обнаружено, что прямое наращивание дендримера приводит к значительному уменьшению выходов на каждой стадии, поэтому имеет смысл разумно сочетать количество прекурсорных групп в фосфамидитном мономере с последующим наращиванием активных линкерных (функциональных, каталитических) групп на постсинтетической стадии.

Примером такого сочетания является синтез олигонуклеотидного конъюгата имеющего в своем составе модифицированное звено М с 10 имидазольными группами (схема 12).

Схема 12. Пример получения путем постсинтетической модификации олигонуклеотида АОСАСТСТО{М}ТССТТТСОА, несущего дендримерную конструкцию с десятью

имидазольными остатками.

Как крайний вариант такого подхода дендримерная конструкция (76) может быть собрана, используя ту же МОХ - стратегию, отдельно и целиком введена в олигонуклеотид на постсинтетической стадии. На

ни

'"Л.

АССАСТСТС{М}ТССТТТССА

схеме 13 приведен пример получения дендримера (75) с использованием твердофазного метода синтеза. Вместо диметилоксалата в таких синтезах могут быть использованы бисцианметиловые эфиры дикарбоновых кислот. Пример такого дендримера также представлен на схеме 13.

•ОТ-'

о

«На

1.5% СР,СООН 1п СН2С|2

" л

НзЧ

"(СНа),,

Дендримерная конструкция на основе цианметиловых эфиров дикарбоновых кислот о о _

____-1У1Н

НН"

--•«^гУ---"А^^-х-О

П-2-4

о^ -с

Ж

'-Л о

V _ н V ____ Л

у

г1 °

К-

и" а НМ-Ч-Ы О

\

75

NN

0^°

Схема 13. Примеры синтеза дендримерных конструкций для постсинтетической

модификации олигонуклеотидов.

Синтезированные нами фосфитамидные мономеры, несущие активированные линкерные группы в различных позициях нуклеозидов, использовались в синтезе олигонуклеотидных конъюгатов с флуоресцентными метками, фотоактивируемыми и другими реакционноспособными группами (некоторые примеры представлены на схеме 14).

Полученные конъюгаты использовались в исследовательских работах лаборатории биоорганической химии ферментов, лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, лаборатории «Медиген» Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, отделом протеомики Института биомедицинской химии РАМН.

14

Схема 14. Олигонуклеотидные конъюгаты, синтезированные с применением фосфамидитов урвдина, аденозина, цитидина, и тимидина, несущих в различных положениях нуклеозида активированные линкерные группы.

Основываясь на приведенных выше примерах, можно утверждать, что предложенные в данной работе мономеры являются удобным инструментом для конструирования и синтеза широкого спектра олигонуклеотидных конъюгатов. Введение в олигонуклеотид нескольких модифицированных мономеров либо использование мономеров, несущих дендримерные конструкции, позволят применить при синтезе олигонуклеотидных производных приемы и методы комбинаторной химии.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 04-04-48566, 03 04-48562, 02-04-48664.

выводы

1. Разработан препаративный метод синтеза 2'-амино-2'-дезоксиуридина, позволяющий проводить крупномасштабное получение целевого соединения без применения хроматографии. Предложены препаративные методы синтеза 5'-<3-(4,4'-диметокси-тритил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина, 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-Р-0-рибофуранозил]-Л^-бензоиладенина исходя из 2-амино-2'-дезоксиуридина.

2. Предложен подход к созданию конъюгатов олигонуклеотидов с различными лигандами, содержащими алифатические аминогруппы, базирующийся на использовании нуклеозидов, несущих моноамиды моноцианметиловых эфиров дикарбоновых кислот в качестве новых активированных линкерных групп.

3. На основе диметилового эфира щавелевой кислоты и не описанных ранее бисцианметиловых эфиров дикарбоновых кислот созданы дендримерные конструкции, обеспечивающие введение двух и более функциональных остатков в один нуклеотидный фрагмент.

4. Впервые синтезированы 16 мономеров для фосфитамидного олигонуклеотидного синтеза, которые содержат различные активированные линкерные группы как в углеводном фрагменте, так и в гетероциклических основаниях 2-дезоксиуридина, 2-дезоксицитидина, 2-дезоксиаденозина, 5-метил-2'-дезоксицитидина и тимидина. Предложенные соединения позволяют получать олигонуклеотидные конъюгаты, содержащие функциональные группы в одном или нескольких заданных положениях олигонуклеотида, что было продемонстрировано на примере синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с флуоресцентными, фотоактивируемыми и РНК-гидролизующими молекулами.

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1. Т.В. Абрамова, C.B. Васильева, Т.М. Иванова, Г.В. Шишкин, В.Н. Сильников. Мономеры для олигонуклеотидного синтеза, несущие активированные линкерные группы. I. Синтез производных

16

дезоксинуклеозидов с реакционноспособными метокси-оксалиламидными группами в гетероциклических основаниях. // Биоорган. Химия. 2004. Т. 30. № 3. С. 254-263.

С.В. Васильева, Т.В. Абрамова, Т.М. Иванова, Г.В. Шишкин, В.Н. Сильников. Мономеры для олигонуклеотидного синтеза, несущие активированные линкерные группы. II. Синтез фосфорамидитов на основе уридина и цитидина, содержащих в 2'-положении метоксиоксалиламидные группы. И Биоорган. Химия. 2004, Т. 30. № 3. С. 264-272.

S.V. Vasilyeva, T.V. Abramova, V.N. Silnikov. Synthesis of Monomers Bearing at the 2-Position Cyanomethoxycarbonyl Group for Phosphoramidite Oligonucleotide Synthesis. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2004.V. 23. N. 6-7. P. 993-998.

H.A. Лебедева, E.A. Мальцева, И.Ю. Гарипова, С.В. Васильева, E.A. Белоусова, И.О. Петрусева, Н.И. Речкунова,

B.Н. Сильников, О.И. Лаврик. Исследования репликативного белка А с фотоактивными структурами ДНК. // Биохимия. 2004. Т. 69. вып. 2. С. 260-269.

C.В. Васильева, И.С. Дулепов, В.Н. Сильников. Конструирование и синтез фосфитамидного мономера, несущего бифункциональную линкерную группу в 5-положении 2'-дезоксиуридина. // Сборник трудов конференции «Физико-химическая биология» Новосибирск. 2006. С. 92-93.

Подписано к печати 25 августа 2006 г. Формат бумаги 60x84, 1/16 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1797. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Прекурсорная стратегия синтеза олигонуклеотидных конъюгатов. Методы синтеза аминомодифицированных по сахарному остову нуклеозидов - базовых соединений для реализации прекурсорной стратегии (обзор литературы)

1.1. Подходы к получению модифицированных олигонуклеотидов

1.1.1. Реакционноспособные (прекурсорные) группы для постсинтетической модификации олигонуклеотидов. Группы, требующие защиты в условях оли гонуклеотидного синтеза

1.1.1.1. Аминогруппа: методы защиты и получения конъюгатов

1.1.1.2. Тиольная группа: методы защиты и получения конъюгатов

1.1.1.3. Методы защиты и модификации карбоксильной и альдегидной групп

1.1.2. Активированные линкерные группы-предшественники

1.1.2.1. Прекурсорная модификация гетероциклических оснований

1.1.2.2. Мономеры ненуклеозидной природы, несущие активированные линкерные группы

1.1.2.3. Прекурсорные группы в 2'-положении рибозы

1.1.2.4. Прекурсорные группы в реакциях циклоприсоединения Дильса-Альдера и 1,3-диполярного азид-алкинового циклоприсоединения

1.2. Методы синтеза модифицированных по сахару нуклеозидов

1.2.1. Основные методы введения аминогруппы по углеводному фрагменту природных нуклеозидов

1.2.1.1. Нуклеофильное замещение сульфоэфиров

1.2.1.2. Раскрытие реакционноспособных О2,2'-, О2,У-или

О ,5'-ангидроциклов пиримидиновых нуклеозидов азид-ионом

1.2.1.3. Раскрытие реакционноспособных О2,2'- ,02,3'- или 02,5'-ангидроциклов пиримидиновых нуклеозидов другими нуклеофилами

1.2.1.4. Раскрытие реакционноспособных О8,2'-; 08,3'-; 08,5'-циклов пуриновых нуклеозидов

1.2.1.5. Реакция Мицунобу (замещение гидроксильной группы на нуклеофил в присутствии пары: диэтилазодикарбоксилат - трифенилфосфин)

1.2.2. Синтез нуклеозидов, исходя из гетероциклических оснований и модифицированного рибозного остатка. Реакция гликозилирования/перегликозилирования

ГЛАВА 2. Результаты и их обсуждение

2.1. Синтез 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов

2.1.1. Препаративный синтез 2'-амино-2'-дезоксиуридина. Синтез 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2'-дезоксиуридина

2.1.2. Синтез 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина

2.1.3. Синтез 9-[5-(9-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-Р-Б-рибофуранозил]-Д/6-бензоиладенина (2'-амино-2'-дезоксиаденозина)

2.1.4 Синтез 9-[5-<9-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-р-0-арабино фуранозил]-А'6-бензоиладенина

2.2. Синтез фосфамидитов на основе 2'-аминопроизводных уридина, цитидина и аденозина, содержащих в 2'-положении линкеры с одной (двумя) метоксиоксалиламидными (МОХ) группами

2.2.1 .Синтез 5'-(9-(4,4'-диметокси'гритил)-3|-(2-цианоэтокси-.¥,Лг-диизопрогшл-аминофосфинил)-2'-метоксиоксалиламидо-2'-дезоксиуридина и 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3,-(2-цианоэтокси-М А/-диизопропиламинофосфинил)-2'-[#,7У-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]амидооксалиламидо-2'-дезоксиуридина

2.2.2. Синтез А^-бензоил-5'-(9-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-//,7Удиизопропиламинофосфинил)-2'-метоксиоксалиламидо-2'-дезоксицитидина, 9- [5-0-(4,4' -диметокситритил)-3-(2-цианоэтокси-./Ч//-диизопропиламинофосфинил)-2-метоксиоксалиламидо-2-дезокси-|3-В-рибофуранозилЗ-А^-бензоиладенинаи 9-[5-<9-(4,4'-диметокситритил)-3-(2-цианоэтокси-Лг,Аг-диизопропиламинофосфинил-2-метоксиоксалиламидо-2-дезокси-(3-Б-арабинофуранозил]-Л'б-бензоиладенина

2.3. Синтез фосфамидитов уридина и арабиноаденозина, несущих в рибозном фрагменте активированные линкерные группы различной длины на основе дикарбоновых кислот

2.3.1. Синтез фосфамидита 5'-С-(4,4'-диметокситритил)-2'-метоксикарбонилметил-карбониламино-2'-дезоксиуридина

2.3.2. Синтез фосфамидитов 5'-(3-(4,4'-диметокситритил)-2'-[2-(цианметокси-карбонил)этилкарбониламино]-2'-дезоксиуридина, 5'-<9-(4,4'-диметокситритил)-2'-[3-(цианметоксикарбонил)пропилкарбониламино]-2'-дезоксиуридина, 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-[4-(дианметоксикарбонил)бутилкарбониламино]-2'-дезоксиуридина и 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2- {З-(цианметоксикарбонил)-пропилкарбониламино}-Р-0-арабинофуранозил]-7\/6-бензоиладенина

2.4. Синтез фосфамидитов на основе тимидина, цитидина и аденозина, несущих линкеры с МОХ-группами в гетероциклических основаниях

2.4.1. Синтез 5'-(4,4,-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-Лг,Лг-диизопропил-аминофосфинил)-5-{3-[7У,Аг-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]-амидооксалиламидопропил}оксиметил-2'-дезоксиуридина

2.4.2. Синтез А/4-{3-[А^,Л''-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]амидо-оксалиламидопропил}-5'-<9-(4,4,-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-А'',Л/'-диизопропилшинофосфинил)-2'-дезоксицитидина

2.4.3. Синтез ТУ4-{З-ДОМ-ди -(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]амидо-оксалиламидопропил}-5,-0-(4,4,-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-ДЛг-диизопропиламинофосфинил)-5-метил-2'-дезоксицитидина

2.4.4. Синтез /Лбензоил-5- {3-[Лг,тУ-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]-амидооксалиламидопропил}оксиметил-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-дианоэтокси-/У,Аг-диизопропиламинофосфинил)-2'-дезоксицитидина

2.4.5. Синтез А'6-{3-[Л^/\/'-ди-(2-метоксиоксалилшидоэтил)аминоэтил]амидо-оксалиламидопропил}-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3,-(2-цианоэтокси-Л/',7\'-диизопропиламинофосфинил)-2'-дезоксиаденозина

5. Синтез фосфамидитных мономеров, несухцих дендримерные конструкции с метоксиоксалиламидными (или су-цианметоксикарбонилалкил-карбониламино)-группами

2.5.1. Синтез уУ4-(3-метоксиоксалиламидопропил)-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-А/',]У-диизопропиламинофосфинил)-2|-дезоксицитидина и Л^-{3-[ДЛ'-ди-(7^Лг-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил)амидо-оксалиламидоэтил]амидооксаламидопропил-5'-<9-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-Лг,Лг-диизопропиламинофосфинил)-2'-дезоксицитидина

6. Конструирование и синтез дендримерных конструкций с активированными линкерными группами для постсинтетической модификации олигонуклеотидов

2.6.1. Синтез Аг-(12-аминододецил)-//'-{2-[бис-(2-{[2-(1Я-имидазол-4-ил)-этиламинооксалил]амино}этил)амино]этил}оксалилдиамида

2.6.2. Синтез трис {2- [бис-(2-метоксиоксалиламидоэтил)амино]этилоксалил-амидоэтил} амина

7. Синтез олигонуклеотидных конъюгатов, несущих активированные линкерные группы и последующая постсинтетическая модификация по ним флуоресцентными метками и другими реакционноспособными группами

2.7.1. Сравнение степени включения в олигонуклеотид арабино- и рибомодифици-рованных мономеров

2.7.2. Применение 5'- О- (4,4'-диметокситритил)-3'- (2 -цианоэтокси-Лг, М-диизопропиламинофосфинил)-2'-метоксиоксалиламидо-2'-дезоксиуридина для синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, несущих фотоактивируемую группу

2.7.3. Применение 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-К,М-диизопропиламинофосфинил)-2'-[3-(цианметоксикарбонил)-пропилкарбониламино]-2'-дезоксиуридина для синтеза олигонуклеотидных конъюгатов

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 105,.

3.1. Реактивы и материалы

3.2. Методы

3.3. Органический синтез

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Синтетические аналоги нуклеиновых кислот, содержащие различные функциональные группы, являются важнейшими инструментами в молекулярно-биологических исследованиях. Область их применения чрезвычайно широкая: фундаментальные исследования, направленные на изучение субстратной специфичности и механизма действия ферментов нуклеинового обмена и НК-связывающих белков; структурно-функциональные исследования биополимеров; регуляция экспрессии генетического материала, а также его направленная реконструкция. Большое практическое применение модифицированные олигонуклеотиды находят в медицинской ДНК-диагностике [2-4].

Особый интерес вызывает синтез модифицированных олигонуклеотидов с различными заданными свойствами не присущими природным фрагментам ДНК и РНК, такими как устойчивость к нуклеазной деградации, способность к проникновению через клеточные мембраны, к ковалентному связыванию с молекулами ДНК и белков, а также содержащие в своем составе группы, которые по реакционной способности значительно отличались бы от природных.

Введение каждой новой модификации в практику олигонуклеотидного синтеза связано с решением комплекса проблем как на стадии получения модифицированного мономера, так и при включении его в олигонуклеотидную цепь.

В настоящее время наибольшее распространение получили три основных способа получения модифицированных олигонуклеотидов:

1) Постсинтетическая модификация функциональных групп, исходно присутствующих в олигонуклеотиде;

2) Использование в химическом или ферментативном олигонуклеотидном синтезе мономерных синтонов (фосфамидитов или трифосфатов соответственно), несущих предполагаемую модификацию;

3) Встраивание в олигонуклеотидную цепь одного или нескольких мономеров, несущих группы-предшественники, которые могут образовывать целевые конъюгаты на различных этапах олигонуклеотидного синтеза.

Возможности первого метода ограничены получением олигонуклеотидных аналогов, имеющих множественные модификации (например, модифицированные экзоциклические аминогруппы цитидина). Исключением является избирательная модификация концевой фосфатной группы окислительно-восстановительной парой трифенилфосфин/дипиридил-дисульфид в присутствии нуклеофильных катализаторов или особые случаи, когда модифицируемый нуклеозид присутствует в олигонуклеотиде в единственном числе.

Второй и третий способы подразумевают синтез соответствующих мономерных синтонов, вводимых на той или иной стадии олигонуклеотидного синтеза. При этом второй метод подразумевает синтез фосфамидита (или трифосфата в случае ферментативного синтеза) с заранее введенными функциональными группами, что делает подход к синтезу каждого олигонуклеотидного конъюгата индивидуальным, начиная со стадии конструирования соответствующего мономерного звена. В то же время последний метод позволяет получать широкий спектр олигонуклеотидных конъюгатов на базе одного мономера, что, безусловно, делает такой подход чрезвычайно перспективным.

В связи с этим, особый интерес приобретает как поиск новых функциональных групп, являющихся основой для постсинтетической модификации олигонуклеотидов, так и создание на базе таких групп-предшественников мономеров, позволяющих получать олигонуклеотидные конъюгаты с широким спектром структурных параметров. Создание ограниченного набора таких мономеров не только будет являться одним из решений проблемы универсальности синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, но и позволит применять при их синтезе приемы и методы комбинаторной химии.

Целью настоящей работы является конструирование и синтез мономеров для стандартного амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза, содержащих в различных положения нуклеотидов активные линкерные группы и обеспечивающих получение широкого спектра олигонуклеотидных конъюгатов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) разработать простые препаративные методы синтеза 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов, которые являются базовыми соединениями для синтеза нуклеозидов с прекурсорными группами;

2) сконструировать активированные линкерные группы различной длины и жесткости, включая дендримерные линкерные группы с двумя и более функциональными остатками;

3) синтезировать мономеры для стандартного амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза, содержащие активные линкерные группы на основе моноамида монометилового эфира щавелевой кислоты и моноамидов моноцианметиловых эфиров янтарной, глутаровой и адипиновой кислот;

4) продемонстрировать возможность использования полученных мономеров в синтезе олигонуклеотидных конъюгатов.

выводы

1. Разработан препаративный метод синтеза 2'-амино-2'-дезоксиуридина, позволяющий проводить крупномасштабное получение целевого соединения без применения хроматографии.

Предложены препаративные методы синтеза 5'-С-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина, 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-|3-0-рибофуранозил]-А^-бензоиладенина исходя из 2'-амино-2'-дезоксиуридина.

2. Предложен подход к созданию конъюгатов олигонукпеотидов с различными лигандами, содержащими алифатические аминогруппы, базирующийся на использовании нуклеозидов, несущих моноамиды моноцианметиловых эфиров дикарбоновых кислот в качестве новых активированных линкерных групп.

3. На основе диметилового эфира щавелевой кислоты и неописанных ранее бисцианметиловых эфиров дикарбоновых кислот созданы дендримерные конструкции, обеспечивающие введение двух и более функциональных остатков в один нуклеотидный фрагмент.

4. Впервые синтезированы 16 мономеров для фосфитамидного олигонуклеотидного синтеза, которые содержат различные активированные линкерные группы, как в углеводном, фрагменте, так и в гетероциклических основаниях 2'-дезоксиуридина, 2'-дезоксицитидина, 2'-дезоксиаденозина, 5-метил-2'-дезоксицитидина и тимидина. Предложенные соединения позволяют получать олигонуклеотидные конъюгаты, содержащие функциональные группы в одном или нескольких заданных положениях олигонуклеотида, что было продемонстрировано на примере синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с флуоресцентными, фотоактивируемыми и РНК-гидролизующими молекулами.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность своей свекрови Людмиле Петровне, а также супругу и своим родителям за поддержку, помощь и проявленное терпение.

Автор благодарен всем коллегам, оказавшим содействие в выполнении данной работы: Т.В. Абрамовой, Т.М. Ивановой, A.A. Дониной, И.Г. Серпокрыловой, Е.А. Бураковой, H.A. Лебедевой, О.И. Лаврик (ИХБФМ); Е.Е Красноусовой, С.П. Коваленко (лаб. «Медиген» ИМББ СО РАМН); В.В. Кандауровой (НИОХ).

Особую благодарность автор выражает научному руководителю Сильникову Владимиру Николаевичу за безграничное терпение, проявленное при обучении автора, за идеи, всемерную поддержку и личное участие в выполнении данной работы.

1. Правила для авторов. // Изв. АН, Сер. Хим. 2001. Т. 1. С. 156-167. Правила дляавторов 2005. // Биоорган. Химия. 2005. Т. 31. С. 667-672.

2. Клогге D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova O.S. Design andtargeted reactions of oligonucleotide derivatives. CRC, Baco Raton, 1994.

3. Agrawal S. Antisense oligonucleotides: towards clinical trials // Trend. Biotechnology.1996. V. 14. P. 376-388.

4. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века. // Вестник РАН. 2003. Т. 73. С. 412.

5. Зацепин Т.С., Романова Е.А., Орецкая Т.С. Нуклеозиды и олигонуклеотиды с реакционноспособнымй группами при С(2')-атоме: синтез и применение. И Успехи химии. 2004. Т. 73. С. 757-791.

6. Masud М.М., Ozaki-Nakamura A., Kuwahara М., Ozaki Н., Sawai Н. Modified DNA bearing 5-(methoxycarbonylmethyl)-2'-deoxyuridine: preparation by PCR with thermophilic DNA polymerase and post-synthetic derivatization. // ChemBioChem. 2003. V. 4. P. 584-588.

7. Goodchild J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides', a review oftheir synthesis and properties. // Bioconjugate Chem. 1990. V. 1. P. 165-187.

8. Aurup H., Williams D.M., Eckstein F. 2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. // Biochemistry. 1992. V. 31. P.9636-9641.

9. Hopman, A.H., Wiegant, J., Tesser, G.I., VanDuijn P. A non-radioactive in situ hybridization method based on mercurated nucleic acid probes and sulfhydrylhapten ligands. // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 6471-6487.

10. Tchen P., Fuchs R.P.P., Sage E., Leng M. Chemically modified nucleic acids as immunodetectable probes in hybridization experiments. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1984. V. 81. P. 3466-3470.

11. Eshaghpour H., Soil D., Crothers D.M. Specific chemical labeling of DNA fragments. // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. P. 1485-1495.

12. Coleman R.S., Kesicki E.A. Synthesis and postsynthetic modification of oligodeoxynucleotides containing 4-thio-2'-deoxyuridine (dS4U). // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 11636-11642.

13. Polushin N.N. The precursor strategy: terminus methoxyoxalamido modifiers for single and multiple functionalzation of oligodeoxyribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P.3125-3133.

14. Dombi K.L., Steiner U.E., Richert C. Rapidly measuring reactivities of carboxylic acids to generate equireactive building block mixtures: a spectrometric assay. // J. Comb. Chem. 2003. V. 5. P. 45-60.

15. Насонов А.Ф., Коршунова Г.А. С-Алкилирование пиримидиновых нуклеозидов и их аналогов. // Успехи химии. 1999. Т. 68. С. 532-554.

16. Tierney М.Т., Grinstaff M.W. Synthesis and stability of oligonucleotides containing C8-labeled 2'-deoxyadenosine: novel redox nucleobase probes for DNA-mediated charge transfer studies // Org. Lett. 2000. V. 2. P. 3413-3416.

17. Rosemeyer H., Ramzaeva N., Becker E.M., Feiling E., Seela F. Oligonucleotides incorporating 7-(aminoalkynyl)-7-deaza-2'-deoxyguanosines: duplex stability and phosphodiester hydrolysis by exonucleases. // Bioconjugate Chem. 2002. V. 13. P. 12741285.

18. Manoharan M. 2'-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1489. P. 117-130.

19. Орецкая T.C. Направленная модификация олигонуклеотидов в процессе fj^ химического синтеза. // Автореферат Дис. Докт. Хим. Наук: 02.00.10. Москва.1997. С. 28.

20. Splendid gifts from microorganisms. Ed. Satoshi Omura, Kyoiku Koho-sha. Tokyo. 2003. P. 38.

21. Golisade A., Van Calenbergh S., Link F. 2'-Amino-2'-deoxy-7V6- (1-naphthylmethyl)adenosine as novel scaffold for a polymer-assisted amidation protocol. // Tetrahedron. 2000. V. 56. P. 3167-3172.

22. Miller P.S., Bhan P., Kan L.S. Syntheses and interactions of oligodeoxyribonucleotides containing 2'-aminodeoxyuridine. // Nucleosides Nucleotides. 1993. V. 12. P. 785-792.

23. Sproat B.S., Beijer B., Rider P. The sythesis of protected 5'-amino-2',5'-dideoxyribonucleoside-3'-phosphoramidites; applications of 5'-amino-oligodeoxiribonucleotides. 11 Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 6181-6196.

24. Beigelman L., Karpeisky A., Matulik-Adamic J., Haerberli P., Sweedler D., Usman N.

25. Synthesis of 2'-modified nucleotides and their incorporation into hammerhead ribozymes. II Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4434-4442.

26. Gibson K.J., Benkovic S.J. Synthesis and application of derivatizable oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 6455-6467.

27. Allen D.J., Darke P.L., Benkovic S.J. Fluorescent oligonucleotides and deoxynucleotide triphosphates: preparation and their incorporation with the large (Klenow) fragment of Escherichia coli DNA polymerase I. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4601-4607.

28. Zubin E.M., Romanova E.A., Volkov E.M., Tashlitsky V.N., Korshunova G.A., Shabarova Z.A., Oretskaya T.S. Oligonucleotide-peptide conjugates as potential antisense agents. IIFEBSLett. 1999. V. 456. P. 59-62.

29. Sigurdsson S.T., Eckstein F. Site specific labeling of sugar residues in ^ oligoribonucleotides: reactions of aliphatic isocyanates with 2'-amino groups. // Nucleic

30. Acids Res. 1996. V. 24. P. 3129-3133.

31. Hwang J.T., Greenberg M.M. Synthesis of 2'-modified oligonucleotides via on-column conjugation. II J. Org. Chem. 2001. V. 66. P. 364-369.

32. Greiner B., Pfleiderer W. Nucleotides. Part LVII. Synthesis of phosphoramidite building blocks of 2'-amino-2'-deoxyribonucleosides: new compounds for oligonucleotide synthesis. // Helv. Chim. Acta. 1998. V. 81. P. 1528-1544.

33. Polushin N.N., Smiraov I.P., Verentchikov A.N., Coull J.M. Synthesis of oligonucleotides containing 2'-azido- and 2'-amino-2'-deoxyuridine using phosphotriester chemistry. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. P. 3227-3230.