Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу, и получение конъюгатов на их основе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

1. УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ ЭЛЕКТРОФИЛЬНЫЕ ГРУППИРОВКИ (Литературный обзор)

3.1. Введение

3.2. Синтез олигонукпеотидов, содержащих 5'-концевую карбоксильную или альдегидную группу

3.3. Синтез олигонуклеотидов, содержащих З'-концевую карбоксильную или альдегидную группу

3.4. Синтез олигонуклеотидов, содержащих карбоксильную или альдегидную группу в середине цепи

3.4.1. Олигонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу в гетероциклическом основании

3.4.2. Олигонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу в составе звена ненуклеотидной природы

3.4.3. Олигонуклеотиды, содержащие альдегидную группу в составе апуринового сайта

3.4.4. Олигонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу в 2'-положении углеводного фрагмента

Химический синтез модифицированных олигонуклеотидов представляет собой наиболее интересную и сложную область исследований в органической химии нуклеиновых кислот (НК). Модифицированные фрагменты НК могут использоваться как для решения разнообразных задач молекулярной биологии, так и при создании эффективных диагностических и терапевтических препаратов для лечения различных вирусных и наследственных заболеваний.В этой связи важным является синтез олигонуклеотидных производных, обладающих рядом определенных химических, физико-химических и биологических свойств, необходимых для успешного использования полученных соединений и, далее, выявление взаимосвязи между их свойствами и строением.Для направленного изменения свойств НК-фрагментов необходима разработка методов, использование которых позволяет трансформировать структуру нуклеиновых кислот с помощью замен мономерных звеньев или их фрагментов различными аналогами. Кроме того, к олигонуклеотидам можно ковалентно присоединять различные реакционноспособные или репортерные группировки, интеркаляторы, биологически активные пептиды и ферменты. В связи с этим актуальной задачей становится получение одно- или двутяжевых молекул ДНК, имеющих в своем составе группировки, реакционная способность которых отличалась бы от реакционной способности функциональных групп немодифицированных ДНК. Именно введение новых реакционных центров в состав олигонуклеотидной цепи позволяет успешно осуществлять синтез различных гибридных молекул.Целью настоящего исследования является разработка эффективных методов синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих в своем составе альдегидную или карбоксильную группу, и изучение химических свойств полученных соединений. Важной частью настоящей работы также является получение конъюгатов с различными нуклеофильными агентами на основе модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов данного типа.Основными этапами работы были получение модифицированных мономерных компонентов такого строения, которое предопределяло возможность их использования в синтезе олигонуклеотидов по амидофосфитной схеме, подбор оптимальных условий для встраивания модифицированных звеньев в олигонуклеотидную цепь, и изучение взаимодействия полученных олигомеров с различными соединениями с целью получения широкого набора конъюгатов.В представленной работе предложены новые эффективные методы синтеза ранее неописанных олигодезоксирибонуклеотидов: 1. Олигомеров, содержащих включения 2'-0-карбоксиметиладенозина или 2'-0-карбоксиметилуридина; 2. Олигомеров, содержащих включения 2'-0-(2-оксоэтил)уридина; 3. Олигомеров, содержащих на б'-конце остаток 4-гидроксивалериановой кислоты.Введение химически активной группировки на 5'-конец олигонуклеотида, а также в 2'-положение углеводного остатка представляется предпочтительным вариантом по сравнению с модификацией гетероциклических оснований и межнуклеотидных фосфатов, так как в этом случае вероятное искажение структуры двутяжевых НК-фрагментов будет относительно незначительным.Кроме того, в случае модификации при С2'-атоме существует возможность встраивания как одного, так и нескольких модифицированных мономерных звеньев в любое заранее определенное положение олигомерной цепи.На примере реакций с различными нуклеофильными агентами продемонстрирована высокая реакционная способность модифицированных олигонуклеотидов, содержащих карбоксильную или альдегидную группу. В случае олигонуклеотидов с 5'-концевой карбоксильной группой был разработан общий метод получения олигонуклеотидопептидов - соединений, которые, согласно современным представлениям [1], могут способствовать проникновению в клетку антисмысловых олигонуклеотидов и, таким, образом, являться потенциальными терапевтическими агентами. Основная суть предложенного подхода к синтезу конъюгатов состоит в том, что образование амидной связи между заранее синтезированным пептидом с блокированной а-карбоксильной функцией и защищенным олигонуклеотидом, содержащим селективно деблокированную и предактивированную карбоксильную группу, осуществляют после завершения автоматического олигонуклеотидного синтеза, при этом фрагмент ДНК остается иммобилизованным на нерастворимом полимерном носителе.Работа включает обзор литературы, посвященный методам синтеза олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные электрофильные группировки.3. ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕАКЦИОННО-СПОСОБНЫЕ ЭЛЕКТРОФИЛЬНЫЕ ГРУППИРОВКИ (Литературный обзор) 3.1. Введение В настоящее время модифицированные олигонуклеотиды применяются как для решения разнообразных задач молекулярной биологии, так и при создании диагностических и терапевтических препаратов для лечения различных вирусных и наследственных заболеваний. В связи с этим необходимым представляется синтез конъюгатов олигонуклеотидов с другими соединениями, обладающими рядом уникальных свойств, то есть к фрагментам нуклеиновых кислот можно ковалентно присоединять репортерные молекулы, интеркаляторы, биологически активные пептиды и ферменты. Таким образом актуальной задачей становится получение одно- или двутяжевых молекул ДНК, имеющих в своем составе группировки, реакционная способность которых отличалась бы от реакционной способности функциональных групп природных ДНК. Именно введение новых реакционных центров в состав олигонуклеотидной цепи позволяет успешно осуществлять синтез различных гибридных молекул.На сегодняшний день существует большое число методов синтеза олигонуклеотидов, содержащих нуклеофильные группировки (амино- или тиогруппы [2]), реагенты для введения которых в большинстве случаев коммерчески доступны. В то же время, получение олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные электрофильные группы (карбоксильную или альдегидную) представляется достаточно сложной задачей. Поэтому количество литературных данных по этой тематике весьма ограничено. Часть работ по синтезу 5'-карбоксилили альдегидсодержащих олигонуклеотидов была кратко рассмотрена в обзоре [2], посвященном более широкой теме - синтезу различных производных фрагментов нуклеиновых кислот. Несмотря на это, необходимым представляется полный анализ и систематизация существующих работ, что, очевидно, будет способствовать дальнейшему развитию методов синтеза олигонуклеотидов данного типа.Введение карбоксильной или альдегидной функции может быть осуществлено в любое заранее заданное положение синтетического фрагмента ДНК, в том числе по 5'- либо З'-концам. Данный признак и был выбран в качестве основного при рассмотрении методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов. Нами кратко описаны эксперименты, подтверждающие реакционную способность введенных электрофильных группировок, и методы получения олигонуклеотидных конъюгатов. В разделе 4.1 приводятся данные по температурам плавления модифицированных ДНК-дуплексов.Во всех обсуждаемых работах олигонуклеотиды были синтезированы автоматическим тведофазным амидофосфитным методом по стандартному регламенту [2,3] Мы не рассматриваем методы получения олигонуклеотидов, содержащих диальдегидную группировку, поскольку именно этой теме посвящен обзор [4]. Также за рамками обзора остались подтверждение строения промежуточных и целевых соединений, так как в абсолютном большинстве работ осуществлен корректный анализ с использованием современных физикохимических методов (ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии), и методы выделения модифицированных олигонуклеотидов (обращенно-фазовая, ионообменная ВЭЖХ, гель-электрофорез в ПААГ), если они стандартны.3.2. Синтез олигонуклеотидов, содержащих 5'-концевую карбоксильную или альдегидную группу Для введения карбоксильной группировки на 5'-конец олигонуклеотида обычно используют модифицированное звено ненуклеозидной природы, которое присоединяют к растущей олигонуклеотидной цепи на последней стадии автоматического синтеза. При этом желательно, чтобы карбоксильная функция в процессе твердофазного синтеза была защищена, для чего ее превращают в сложный эфир.Реакционную способность введенной алифатической карбоксильной группы подтверждали взаимодействием с аминами в присутствии 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (DEC) (5 мМ раствор аминокомпонента, рН 4.0) [5]. Авторы отмечают, что при конденсации с нуклеофилами в этих условиях также происходит образование Л/-ацилмочевины. Попытки избежать образования данного продукта за счет увеличения концентрации амина до 100 — 500 мМ или рН до 5.5 - 6.7 оказались неудачными. Авторы предполагают, что это происходит из-за недостаточной концентрации свободной аминогруппы при таких значениях рН. Проблему удалось решить путем добавления в реакционную смесь имидазола, который взаимодействует с О-ацилмочевиной с образованием активного промежуточного соединения - имидазолида кислоты, затем реагирующего с амином. Более быстрое образование имидазолида предотвращает протекание перегруппировки О-ацил- в /V-ацилмочевину. Таким образом [5] были получены конъюгаты 5'-карбоксилсодержащего олигонуклеотида с аминами с количественным выходом.Авторы отмечают, что попытка синтезировать амидофосфит бромацетамидного производного (10Ь) приводит к образованию продуктов реакции Михаэлиса-Арбузова, как было показано с помощью 31Р-ЯМРспектроскопии. Кроме того, наличие в целевом амидофосфите (11) эк нуклеофильного, так и электрофильного реакционных центров делает его нестабильным при хранении, поэтому соединение (11) сразу же после его получения растворяли в абсолютном ацетонитриле (концентрация - 0 15 М) и вводили в автоматический олигонуклеотидный синтез.Авторы [7] синтезировали модельные олигонуклеотиды следующего строения (12). Их постсинтетическая обработка раствором лизина в присутствии основания (DBU), а затем концентрированным водным раствором аммиака, позволяет получать олигомеры с 5'-концевой карбоксильной функцией (13). Стоит отметить, что из производных (12) можно синтезировать модифицированные олигонуклеотиды, содержащие различные функциональные группировки Схема 3 H,N (9) (Юа, Ь) (10а)Х = С1 (10Ь)Х = Вг CI I NC(CH2)20 N(iPr)2 для (10а) автоматический олигонуклеотидный синтез Гс блокированный I олигонуклеотид f О и -О-РI О. Оригинальным является метод получения модифицированных олигонуклеотидов, содержащих на 5'-конце иминодикарбоновую кислоту [9].Авторы синтезировали амидофосфитное производное (20), используя в качестве исходного соединения 5'-азидо-5'-дезокситимидин (17) (Схема 5).Алкилирование 5'-аминогруппы нуклеозида (18) этиловым эфиром бромуксусной кислоты и дальнейшее фосфитилирование приводило к 5'-модифицированному амидофосфиту (20), который был использован в стандартном автоматическом олигонуклеотидном синтезе. После окончания автоматического синтеза этиловый эфир гидролизовали водным раствором гидроксида натрия.Безусловно, введение альдегидной группы на 5'-конец олигонуклеотида можно осуществить с использованием другого подхода, то есть не синтезируя предварительно карбоксилсодержащий олигомер. Для этого в олигонуклеотидную цепь на последней стадии автоматического синтеза включают амидофосфитные производные либо альдегидсодержащего нуклеозида (или звена ненуклеозидной природы), либо так называемого соединения-предшественника - виц-диола, из которого альдегидная функция генерируется с помощью дальнейшего окисления уже синтезированного олигонуклеотида периодатом натрия Очевидно, что в первом случае карбонильная группа должна быть блокирована, так как в процессе самого синтеза и при стандартных постсинтетических обработках концентрированным водным раствором аммиака будет происходить образование побочных продуктов. К настоящему времени предложена лишь одна - 1,3-ди(м-хлорфенил)имидазолидиновая защитная группа [10], удовлетворяющая требованиям, предъявляемым к защитным группам в автоматическом олигонуклеотидном синтезе, однако она не получила широкого распространения.Проблем, связанных с протеканием побочных реакций по альдегидной группе, можно избежать, используя второй подход. Так, авторы [11] осуществили синтез олигонуклеотидов, содержащих альдегидную функцию на 5'-конце. Для этого первоначально ими было синтезировано амидофосфитное производное соединения-предшественника (31) (Схема 7) Гидроксильную группу (26) превращали в mpem-бутилдиметилсилиловый эфир с использованием трет-бутилдиметилсилилхлорида и имидазола, после чего производное (27) окисляли тетраоксидом осмия в присутствии /V-оксида Л/-метилморфолина до виц-диола (28), который затем обрабатывали бензоилхлоридом. Трет-бутилдиметилсилильную защитную группу удаляли тетрабутиламмонийфторидом и далее фосфитилировали соединение (30).Полученное амидофосфитное производное (31) авторы [11] вводили в автоматический олигонуклеотидный синтез. После окончания синтеза модифицированные олигонуклеотиды, содержащие виц-диольную группу, обрабатывали концентрированным водным раствором аммиака в стандартных условиях. Окисление данных олигомеров периодатом натрия так же, как и в работе [5], проводили непосредственно перед дальнейшими превращениями альдегидной функции.Метод синтеза олигонуклеотидов, содержащих 5'-концевую альдегидную группу, предложенный Д.Форже и сотр. [12], также предполагает введение модифицированного амидофосфита (34) в автоматический синтез на последней стадии. Авторы отмечают, что выбранная ими схема синтеза соединения (34) является более простой и удобной по сравнению с предложенной в работе [11] (Схема 8).Схема 7 TBDMS-CI, ,ОН имидазол „OTBDMS (26) Os04 (кат.), N-оксид N-метил-морфолина OTBDMS (27) BzCI (28) BzO OBz (29) „OTBDMS TBAF BzO OBz (30) N(iPr)2 NC(CH,),0' 4N(iPr)2 N-N N"H2N*V. .iPr iPr BzO Целевой амидофосфит (34) был получен в две стадии из коммерчески доступного 1,2,6-гексантриола (32). Виц-диольный фрагмент селективно блокировали 4-метоксибензилиденовой защитной группой под действием диметилацеталя 4-метоксибензальдегида в присутствии каталитических количеств л-толуолсульфоната пиридиния (PPTS) Данная защитная группировка остается стабильной в условиях автоматического олигонуклеотидного синтеза и деблокируется 80%-ным водным раствором уксусной кислоты в течение часа.Кроме того, гидрофобные свойства такой защитной группы позволяют использовать ее в качестве аналога диметокситритильной группировки при выделении целевых олигомеров в условиях обращенно-фэзовой ВЭЖХ. Обработка деблокированных олигонуклеотидов 50-кратным избытком периодата натрия (30 мин., комн. темп.) позволила получить модифицированные олигонуклеотиды, содержащие альдегидную функцию на 5'-конце (36). Авторы также получили ряд конъюгатов синтезированных олигомеров с пептидами [12] и сахарами, содержащими аминооксигруппу [13].Синтез модифицированных олигонуклеотидов (40) был осуществлен по следующей схеме превращений (Схема 9). На последней стадии автоматического олигонуклеотидного синтеза в олигомерную цепь вводили коммерчески доступный амидофосфит, содержащий линкер с аминогруппой, блокированной монометокситритильной защитой. После завершения синтеза монометокситритильную защитную группу удаляли раствором трихлоруксусной кислоты в хлористом метилене и ацилировали свободную аминогруппу ангидридом диацетилвиннои кислоты в присутствии лутидина с образованием олигомера (38).Схема 9 CPG блокированный олигонуклеотид -NH-MMTr (37) 1.С13ССООН 2. Ангидрид диацетилвиннои кислоты, 2,6-лутидин /С ОАс О CPG) i блокированный *,,, олигонуклеотид) (38) | NH3*aq ОАс 3' 5' НО 1 олигонуклеотид j NH (39) NalO, ОН О 3' НО олигонуклеотид NH (40) Соединение (38) деблокировали концентрированным водным раствором аммиака, причем было показано, что амидная связь в олигонуклеотиде (38) остается стабильной в условиях стандартного аммонолиза. 5'-Концевую глиоксиламидную группу получали с помощью окислительного расщепления периодатом натрия виц-диола (39) (1.7 экв, рН 6.6). Полученные модифицированные олигомеры (40) были далее использованы для получения олигонуклеотидопептидных конъюгатов.3.3. Синтез олигонуклеотидов, содержащих З'-концевую карбоксильную или альдегидную группу В настоящее время синтез олигонуклеотидов с З'-концевой карбоксильной или альдегидной функцией чаще всего также осуществляют за счет введения дополнительного звена ненуклеотидной природы. Первоначально это звено, содержащее гидроксил, блокированный диметокситритильной защитной группой, присоединяют к полимерному носителю. После проведения олигонуклеотидного синтеза в процессе химического либо фотолитического расщепления ковалентной связи между полимером и линкером на З'-конце олигонуклеотида возникает реакционноспособная электрофильная группировка. Другой вариант предполагает введение карбоксильной или карбонильной функции уже после автоматического синтеза и отщепления олигонуклеотида от полимерного носителя. В целом, методы получения олигонуклеотидов с З'-концевыми реакционноспособными электрофильными группировками обладают существенным недостатком - сам принцип введения функциональной группы не позволяет проводить дальнейшие взаимодействия с нуклеофильным компонентом на твердой фазе.Авторы [15] синтезировали динуклеотид СС (41) (Рис.1), содержащий на З'-конце как фотолабильную о-нитробензильную группу, так и карбоксильную функцию, которая в дальнейшем использовалась для присоединения аминосоединений.В работе [16] авторы предложили синтезировать карбоксилсодержащие олигонуклеотиды на определенным образом модифицированном полимере (42), от которого олигонуклеотид отщепляется под действием облучения с длиной волны -400 нм (Схема 10).Первоначально [19] авторы использовали подход, при котором первое нуклеозидное звено было присоединено к твердой фазе через фотолабильный о-нитробензильный линкер (Рис. 2). Выход модифицированных олигомеров, синтезированных с использованием данного полимерного носителя (44), составил не более 62%, что объясняется, по-видимому, деструкцией целевого продукта при облучении, время которого в данном случае составляет 3 ч Схема 10 <CPG 1 автоматический олигонуклеотидный синтез 2 h\ 3 80%АсОН 4 NH3*aq 5' 3' НО—[олигонуклеотид]—О—Р—О—(CH2)-q—^ О О О (43) DMTrO — NH Для уменьшения времени фотолиза авторами была предпринята попытка получения олигонуклеотидов на полимере (42), где также варьируется длина линкера между первым нуклеозидным звеном и фотолабильной группой (п = 1 - 4) (Схема 11). Выход модифицированного олигонуклеотида определяли как отношение количества модифицированного олигомера, полученного после фотолиза и деблокирования концентрированным водным раствором аммиака, к количеству такого же олигомера, полученного после аммиачной обработки без предварительного облучения.Схема 11 сно сно сно н3со 3-бромпропанол, К,СО, н,со HN03, АсОН (лед) Н3СО 2 TBDMS-CI,jiMnfla3on ОАс СНО Н3СО NaBH,, ЕЮН OTBDMS H3CO DMTrO_ OTBDMS ОН DCC (50) DMTrO 1 TBAF.AcOH 2 PDC 3 2,4,5-трихлорфенол, DCC OTBDMS H3C0 C P G — NH2 CPG (42) PDC - дихромат пиридиния Синтез полимерного носителя (42) осуществляли конденсацией соответствующей карбоновой кислоты (50) с бензиловым спиртом (49) в присутствии дициклогексилкарбодиимида. Соединение (49) (Схема 11) было синтезировано исходя из ванилина (45), причем нитрование (46) проводили в ледяной уксусной кислоте с одновременным образованием О-ацетильного производного (47). Иммобилизацию соединения (52) на полимерном носителе осуществляли на последней стадии синтеза, чтобы минимизировать образование возможных побочных продуктов, причем непрореагировавшие аминогруппы полимера ацилировали по стандартной методике.Использование полимерного носителя (42) позволило добиться количественных выходов целевых олигонуклеотидов, содержащих карбоксильную функцию на З'-конце. Также было найдено, что с увеличением времени фотолиза выход модифицированных олигомеров уменьшается Полученные олигонуклеотиды далее применялись для синтеза олигонуклеотидопептидных конъюгатов в органической среде без удаления защитных групп олигонуклеотида [17, 20]. Конъюгаты с пептидами и флуоресцентными метками были получены с высокими выходами (85-100%) в органической среде в присутствии смеси Л/-гидроксибензотриазола (НОВТ), гексафторфосфата 0-(бензотриазол-1-ил)-Л/,Л/;Л/',Л/'-тетраметилурония (HBTU) (10 экв смеси HBTU:HOBT, 1:1) и диизопропилэтиламина при 5-кратном избытке соответствующего аминокомпонента.В публикации [18] Гринбергом и сотр. для осуществления синтеза олигонуклеотидов с З'-концевой карбоксильной группой также был предложен полимерный носитель (57) с линкерным звеном (Схема 12), содержащим в своем составе аллиловый эфир, который селективно расщепляется под действием палладиевого катализатора [21]. Это свойство позволяет удалять модифицированный олигонуклеотид с полимерного носителя без деблокирования функциональных групп.Схема 13 DMTrO CPG DMTrO (57) 1. автоматический олигонуклеотидный синтез т2 . Pd2(dba)3*CHCI3, Ph3P _ 3 ' О блокированный олигонуклеотид (58) - О - Р - 0 „ ОСН, ОН 5' 1. NH3*aq.2. 80% АсОН О II НО олигонуклеотид '—О—Р—Ov (59) В работе [8] З'-концевую карбоксильную функцию вводили в олигонуклеотид постсинтетически (Схема 14). Авторы использовали модифицированный полимер (60), отщепление целевого продукта с З'-концевым фосфатом от которого происходит под действием 0.1 М раствора дитиотреитола (DTT) в концентрированном водном растворе аммиака за счет разрыва S-S связи и последующей внутримолекулярной атаки образующегося сульфид-иона по атому углерода. Введение карбоксильной функции осуществляли реакцией активированного деблокированного З'-фосфорилированного олигонуклеотида (61) с со-аминокарбоновой кислотой.Схема 14 .(C H2b ,S О (CH,)2 м ы — ( S ) о о (60) 11 автоматический I олигонуклеотидныС' синтез |2 0 1 М DTT в NH3*aq НО [олигонуклеотид J—о—Р-ОН (61) i .О НОВТ, DEC О II НО [олигонуклеотид]—О—Р—0-N О N=N (62) NH2(CH2)nCOOH 5' 3' о II о >»-/ НО 1 олигонуклеотид—О—P-NH—(СН2)п 6" о (63) (S)—NH — = аминопропилфрактозил-500 11=5,10 Авторами [22, 23] также был предложен метод синтеза олигонуклеотидов, содержащих на З'-конце карбоксильную функцию. Учитывая то, что на З'-конец функциональные группировки вводятся за счет расщепления сложноэфирной связи между твердой фазой и собственно олигомером, к полимерным носителям такого рода предъявляются достаточно жесткие требования в отношении стабильности и реакционной способности сложноэфирной группировки. Для определения полимерного носителя, который наилучшим образом отвечал бы поставленным условиям, авторами была сконструирована серия гомологичных полимерных носителей следующего строения (64a-d, 65) (Рис. 3).Далее полимерные носители (64a-d, 65) были использованы для синтеза ряда олигонуклеотидов амидофосфитным методом. Отщепление олигомеров (71а-е) от твердой фазы и деблокирование межнуклеотидных фосфатов проводили под действием 0.1 М водного раствора гидроксида натрия или 0.5 М водного раствора DBU. Дальнейшая обработка концентрированным водным раствором аммиака в стандартных условиях давала полностью деблокированные целевые олигонуклеотиды, содержащие З'-концевую карбоксильную группу (72а, Ь) (Схема 17).Схема 16 О (69) DMAP/ Ру Конечной целью данной работы являлось получение конъюгатов модифицированных олигонуклеотидов с а,ю-диаминоалканами. Для этого олигомеры, иммобилизованные на модифицированных носителях (64a-d, 65), обрабатывали раствором соответствующего аминокомпонента. Однако, действие таких реагентов на блокированные олигодезоксирибонулеотиды сопровождается переаминированием /V-блокированных остатков цитидина. Поэтому авторы [23] использовали предварительное селективное удаление бензоильных защитных групп гетероциклических оснований цитидина и аденозина раствором гидразина в уксусной кислоте. Было показано, что в этих условиях олигонуклеотиды остаются присоединенными к полимерным носителям (64а, 65). Последние и были использованы в дальнейшем для получения конъюгатов с различными диаминами.Схема 17 (64a-d), (65) Номер (71 а) (71b) (71с) (71d) (71e) HO- блокированный олигонуклеотид автоматический олигонуклеотидный синтез NC —О-Р-О—[спейсер!—NH ( S (71а-е) INaOH 2. NH3*aq 5'.. ._.. 3' О НО—\_ олигонуклеотид [ Q — P - O О (72а,Ь) О' полимерный носитель S=CPG S=CPG S=CPG S=CPG S=PS В работе [9] описан синтез модифицированных олигонуклеотидов, содержащих на З'-конце остаток иминодиуксусной кислоты. Данными олигонуклеотидами может осуществляться связывание ионов металлов, которые стабилизируют работу некоторых белков. В качестве исходного нуклеозидного материала использовали З'-азидо-З'-дезокситимидин (73) (Схема 18).Последующее удаление диметокситритильной группировки и окислительное расщепление с помощью периодата натрия дает возможность получать олигонуклеотиды с З'-концевой альдегидной группой. Авторами [25] также были получены с общими выходами около 50% конъюгаты с аминооксипроизводными ряда пептидов. Конъюгацию проводили в водном растворе, используя избыток аминооксикомпонента (3 экв, рН 4.5, 2 ч).3.4. Синтез олигонуклеотидов, содержащих карбоксильную или альдегидную группу в середине цепи Олигонуклеотиды, содержащие реакционноспособную группу в середине цепи, являются наиболее перспективными аналогами природных фрагментов нуклеиновых кислот для их использования в молекулярно-биологических исследованиях. Такой тип модификации представляется предпочтительным, поскольку оставляет свободными концы олигомерной цепи, что позволяет вводить радиоактивную или флуоресцентную метку на 5'-конец, а также осуществлять дальнейшие превращения функциональной группировки на полимерном носителе, если ее можно селективно деблокировать. Активная функция может быть введена в любое заранее заданное положение олигонуклеотидной цепи, в гетероциклическое основание, 2'-положение углеводного фрагмента или по межнуклеотидной фосфатной группе. Наличие в цепи реакционноспособной функциональной группировки влияет на термическую стабильность ДНКдуплексов, образованных модифицированным олигомером и комплементарной НК-матрицей.3.4.1. Олигонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу в гетероциклическом основании Получение олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособную электрофильную группировку в гетероциклическом основании, предполагает введение в автоматический олигонуклеотидный синтез модифицированного амидофосфитного производного, в котором карбоксильная или альдегидная группа блокирована, либо может образоваться при постсинтетической обработке олигомера. Наиболее удобным положением для модификации представляется 5-метильная группа тимидина. С использованием последнего подхода авторы [27] синтезировали модифицированные олигонуклеотиды, содержащие 5-карбокси-2'-дезоксиуридин (88) (Схема 21).Введение карбоксильной функции в 5-положение тимина производили окислением тимидина 2-метил-1,4-нафтохиноном (менадионом) на воздухе при облучении светом с длиной волны 350 нм в течение 16 ч. Алкилирование этиловым спиртом карбоксильной группы соединения (86) осуществляли с помощью карбодиимида и 1-гидроксибензотриазола в абсолютном этаноле без промежуточной защиты гидроксильных групп сахарного остатка. Далее соединение (87) превращали в модифицированное амидофосфитное производное (88), которое встраивали в олигонуклеотидную цепь в процессе автоматического синтеза. Гидролиз этилового эфира 5-карбокси-2'-дезоксиуридина одновременно с удалением всех остальных защитных групп и отщеплением целевого продукта от твердой фазы проводили с использованием 0.2 М метанольного раствора гидроксида натрия.0 ' О I . p . (88) Для исследований структуры и биологических свойств антикодонового домена tPHKlys Е. Coli Дэвисом и сотр. [28,29] предложен метод синтеза модифицированных фрагментов РНК, содержащих карбоксильную группу в Соположении уридина и Л^-положении аденозина.В работе [28] описан синтез модифицированных олигорибонуклеотидов, содержащих 5-метоксикарбонилметилуридин или 2-тио-5-метоксикарбонилметилуридин. Исходные вещества для синтеза амидофосфитов (92 а, Ь) (Схема 22) авторы синтезировали методом гликозилирования по Форбрюггену [30] из соответствующих дисилильных производных 2-тио-5-метоксикарбонилметилурацила и 5-метоксикарбонилметилурацила действием 1-0-ацетил-2,3,5-три-0-бензоил-[3-0-рибофуранозы. Последующие превращения были осуществлены по стандартным методикам получения амидофосфитных производных рибонуклеозидов.Той же группой американских исследователей описан синтез олигорибонуклеотидов, содержащих включения модифицированного рибонуклеозида (96) (Схема 23) [29].Одновременное введение карбоксильной и вторичной гидроксильной группы было осуществлено действием L-треонина на соединение (94). Для блокирования введенных функций были выбраны триметилсилилэтильная и третбутилдиметилсилильная защитные группы, соответственно. Эти защиты могут быть удалены после автоматического синтеза и полного деблокирования модифицированного олигорибонуклеотида с помощью Et3N*3HF.С использованием амидофосфита (97) авторами была синтезирована олигорибонуклеотидная последовательность фрагмента tPHKlys E.Coli.Интересный метод синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки 5-метоксикарбонилметилуридина, описан в работах [31, 32] (Схема 24).Ключевой стадией получения модифицированного амидофосфитного производного 5-метоксикарбонилметилуридина (104) является конденсация диметил-2-бромметилфумарата и арабиноаминооксазолина (99), синтезированного из D-арабинозы под действием цианамида и 6 М водного аммиака.Обработка 02,2'-ангидро-5-метоксикарбонилметилуридина (100) раствором аммиака в метаноле приводил к образованию модифицированного нуклеозида (89Ь), который может быть использован в качестве исходного соединения для синтеза модифицированных олигорибонуклеотидов.Раскрытие ангидроцикла (100) под действием бромистого водорода в трифторуксуснои кислоте или ацетилбромида в ацетонитриле происходило с образованием 2'-бром-2'-дезокси-3',5'-ди-0-ацетил-5-метоксикарбонилметилуридина (101), восстановление которого водородом на палладии или гидридом трибутилолова в присутствии азоизобутиронитрила давало соединение (102).С использованием амидофосфитного производного (104) авторами [32] были синтезированы модифицированные олигонуклеотиды, содержащие карбоксильную группу в Соположении гетероцикла. Так как основной целью работы было получение конъюгатов таких олигомеров с диаминоалканами, вместо стандартного амидофосфита Л/4-бензоил-2'-дезоксицитидина, который в условиях конденсации образует продукт Л/4-переаминирования, авторы использовали амидофосфит Л/4-ацетил-2'-дезоксицитидина.Наличие модифицированного звена в олигонуклеотидной цепи подтверждали анализом результатов ферментативного гидролиза под действием фосфодиэстеразы змеиного яда и щелочной фосфатазы Синтезированные модифицированные олигонуклеотиды на твердой фазе обрабатывали 50%-ным раствором диаминов в этаноле при комнатной температуре и получали соответствующие производные. Однако, авторы [32] отмечают, что метиловый эфир 5-карбоксиметильной группы является не очень активным, поэтому время реакции с аминокомпонентом составляет 12 ч.Целевой амидофосфит (108) был получен, исходя из диацетильного производного (102). Ключевой стадией синтеза является этерификация свободной карбоксильной функции соединения (106) бромацетонитрилом в присутствии карбоната калия в гексаметилфосфотриамиде. Выход продукта (107) составил 70%. Увеличение времени реакции или использование смеси хлорацетонитрила и триэтиламина вместо вышеописанных условий [33] приводит к снижению выхода эфира (107) до 30% за счет образования Л/3-цианметильного производного.При проведении конъюгации на полимерном носителе с несколькими аминами было показано, что цианметиловый эфир карбоксиметильной группы является более реакционноспособным, чем метиловый, и использование олигонуклеотидов данного типа позволяет сократить время реакции до 1ч, а концентрацию аминокомпонента уменьшить до 0.6-1.0 М. Однако, реакция с тирамином проходила количественно лишь за 5 дней, что может быть объяснено плохой растворимостью данного соединения в органических растворителях и также низким значением рКа его аминогруппы. Было найдено, что добавление в реакционную смесь каталитических количеств триазола существенно увеличивает скорость реакции аминолиза.Наличие модификации в олигомерной цепи подтверждали ферментативным гидролизом под действием нуклеазы Р1 и щелочной фосфатазы.Далее различие в реакционной способности метилового и цианметилового эфиров 5-карбоксиметильной функции было использовано для одновременного получения конъюгатов олигонуклеотидов с двумя разными аминокомпонентами [34]. Авторами были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие остатки как 5-метоксикарбонилметил-, так и 5-цианометоксикарбонилметилуридина (Схема 26).Олигонуклеотиды данного типа (109) были синтезированы с использованием амидофосфитных производных (104), (108) аналогично работам [32, 33]. Введение двух разных функциональных группировок было осуществлено следующим образом, исходя из подобранных ранее условий присоединения аминокомпонента [32,33]: первоначально олигонуклеотид (109), иммобилизованный на твердой фазе, обрабатывали тирамином в присутствии триазола (3 дня, комн. темп.), за это время происходит селективное взаимодействие с цианметиловым эфиром, после чего полимер отмывали и добавляли 50% раствор трис-(2-аминоэтил)амина в этаноле, достигая полного аминолиза олигомера (110) с образованием производного (111).Схема 26 4CPG y HN 5^d (109) 'OCH,CN О HN O ^ N V о VCPG; осн.Наличие обеих модификаций в соединении (111) подтверждали ферментативным гидролизом выделенного олигонуклеотида под действием фосфодиэстеразы змеиного яда, щелочной фосфатазы и нуклеазы Р1 Методы синтеза олигонуклеотидов, содержащих альдегидную группу в гетероциклическом основании, чаще всего также предполагают мягкое окисление 5-метильной группировки тимина. Так, в публикациях [10,35] описан синтез модифицированных олигомеров, содержащих остатки 5-формил-2'-дезоксиуридина (Схема 27). Ключевой стадией синтеза является окисление блокированного тимидина (120) с помощью персульфата калия в присутствии сульфата меди и 2,6-лутидина с хорошим выходом (52%). Интересно отметить, что в данных работах [10, 35] авторы также предлагают использовать для блокирования альдегидной функции 1,3-дифенилимидазолидиновую защитную группировку [36] (116a-d), которая остается стабильной в щелочных условиях и удаляется кислотой. Вводя в бензольное кольцо соединений (114a-d) различные электроноакцепторные заместители, можно изменять рК аминогруппы и, тем самым, регулировать скорость отщепления защитной группировки (116b-d) под действием кислоты.Другой метод синтеза олигонуклеотидов, содержащих остатки 5-формилуридина, описан в работе [37]. В олигонуклеотидный синтез вводили амидофосфитное производное соединения-предшественника (121) (Схема 28).Постсинтетической обработкой олигонуклеотида, содержащего виц-диольное производное, периодатом натрия генерировали карбонильную функцию.Схема 30 о но нО 0 ^ N ОН осн 3 (127) l? CAN АсОН \ НО О HN CAN ОН ОСН3 (128) см Схему 28 DMTrO О ОАс О OCH, Р ,- \ •N О. ОАс (129) CN CAN - гексанитратоцеррат аммония Предложенная схема [38] (Схема 30) в целом аналогична описанной в работе [37], однако исходным материалом являлся коммерчески доступный 02,2'-ангидроуридин Иодирование производного (127) позволяет получить 2'-0-метилнуклеозид (128), который далее превращали в амидофосфитное производное (129). После автоматического олигонуклеотидного синтеза и полного деблокирования модифицированного олигонуклеотида виц-диольный фрагмент окисляли периодатом натрия. Было показано, что введение подобной модификации практически не влияет на связывание модифицированного олигомера с фактором транскрипции.Модифицированное амидофосфитное производное 5-(1,2-дигидроксиэтил)-2'-дезоксицитидина встраивали в олигонуклеотидную цепь без изменений стандартного регламента автоматического синтеза. После деблокирования олигонуклеотидов и окислительного расщепления виц-диольного фрагмента периодатом натрия авторами [40] были определены некоторые физикохимические параметры синтезированных олигомеров: рКа модифицированного остатка dC, а также температуры плавления ДНК-дуплексов, образованных модифицированными олигонуклеотидами и комплементарной им НК-матрицей.Было показано, что введение данной модификации практически не оказывает влияния на термическую стабильность модифицированного дуплекса.Для исследования ДНК-связывающего домена протоонкогена c-myb были синтезированы модифицированные олигомеры, содержащие 6-формил-2'-0-метилцитидин [41] (Схема 32). Учитывая тот факт, что 6-(1,2-диацетоксиэтил)-2'-дезоксиуридин не стабилен при комнатной температуре [37], авторы использовали блокированный 6-(1,2-диацетоксиэтил)-4-этокси-1-(2-0-метил-5-0-диметокситритил-р-0-рибофуранозил)пиримидин-2-он (135) как соединение-предшественник 6-формил-2'-0-метилцитидина.В качестве исходного нуклеозидного материала был выбран 2'-0-метилуридин (127), после чего было проведено ацилирование гидроксильных групп сахарного остатка, а последовательное действие тионилхлорида, смеси раствора алкоголята натрия в этиловом спирте, и далее mpem-бутилдиметилсилилхлорида приводило к образованию производного (132). Ключевые стадии синтеза: введение винильного фрагмента и его последующее окисление оксидом осмия (VIII) в присутствии Л/-оксида Л/-метилморфолина осуществляли аналогично [37].Далее соединение (135) было использовано для получения соответствующего амидофосфитного производного, которое встраивали в олигонуклеотидную цепь в процессе автоматического синтеза. Стандартные постсинтетические обработки и окисление периодатом натрия приводили к получению целевых олигомеров, содержащих 6-формил-2'-0-метилцитидин.3.4.2. Олигонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу в составе звена ненуклеотидной природы М. Эндо с соавторами [45] получили амидофосфит ненуклеозидной природы (142), содержащий блокированную карбоксильную группу, для введения его как в середину цепи, так и на 5'-конец олигонуклеотида (Схема 34).Другой метод введения блокированной карбоксильной функции в состав олигонуклеотида был предложен Н. Гебертом и сотр. [46]. Были синтезированы модельные динуклеозидфосфаты с использованием амидофосфитного производного (149). В качестве исходного соединения для получения данного амидофосфита авторы использовали 4-гидрокси-£-пролин (146) (Схема 35).Схема 35 1. Fmoc-CI 2. BH3-Me2S DMTrO (146) DMTrO (148) OFm Fmoc I 1 пиперидин 2 о но OFm DCC, HOBT V OH (147) DMTrO N(iPr)2 I NC(CH2)20 ^N(iPr) "••.. -^ N-N N'H2I< iPr Введение альдегидной функции в олигонуклеотидную цепь было осуществлено группой бельгийских ученых [47,48]. В автоматический олигонуклеотидный синтез вводили амидофосфиты ненуклеозидной природы, содержащие ei/ц-диольный фрагмент (154а,Ь) (Схема 36). Первоначально авторами [47] было синтезировано амидофосфитное производное (154а), полученное исходя из коммерчески доступного дезоксирибофуранозилхлорида (150). Введение дец-9-енильного фрагмента было осуществлено аналогично [49] с помощью соответствующего кадмийорганического соединения, после чего было проведено разделение эпимеров (151а). Было показано, что эпимеры образуются в соотношении (R) - 65%, (S) - 35%, но несмотря на более высокий выход (R) продукта, для дальнейшей модификации был выбран (в)-эпимер. Авторы объясняют этот выбор тем, что лишь модифицированные олигонуклеотиды, синтезированные с использованием последнего, способны образовывать стабильный дуплекс с мРНК, т.к. конфигурация (З)-эпимера соответствует природной реконфигурации аномерного центра природного мономерного звена.

6. ВЫВОДЫ

1. Впервые синтезированы модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную функции в 2'-положении углеводного фрагмента.

2. Разработаны эффективные схемы синтеза мономерных компонентов автоматического олигонуклеотидного синтеза - амидофосфитных производных Л/6-бензоил-9-(2-0-метилоксикарбонилметил-5-0-диметокситритил-|3-0-рибо-фуранозил)аденина, 1-(2-0-аллилоксикарбонилметил-5-0-диметокситритил-(З-О-рибофуранозил)урацила, 1-(2-0-бензилоксикарбонилметил-5-0-ди-метокситритил-р-0-рибофуранозил)урацила, 1-(2-0-(2,3-дибензоилокси-пропил)-5-0-диметокситритил-р-0-рибофуранозил)урацила

3. Продемонстрирована высокая реакционная способность электрофильных группировок полученных модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов в реакциях с нуклеофильными агентами.

4. Предложен и синтезирован мономерный компонент для введения карбоксильной функции на 5'-конец олигонуклеотидной цепи - 0-[1-метил-3-(2-хлортритилоксикарбонил)пропил]-0'-2-цианэтил-А/)А/-диизопропиламидо-фосфит.

5. Разработан эффективный метод твердофазного синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, основанный на использовании олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 5'-концевую карбоксильную функцию

1. Д.А. Стеценко, АА. Арзуманов, В.А. Коршун, М. Дж. Гейт. Пептид-олигонуклеотидные конъюгаты как смысловые агенты нового поколения. Молекулярн. биология, 34, С. 998-1006 (2000)

2. S.L. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick, R.A. Jones. Current protocols in nucleic acid chemistry. J. Wiley & Sons, Inc.,USA (2000)

3. Oligonucleotides and analogues. A practical approach. (Ed. F. Eckstein). Oxford University Press, USA (2000)

4. O.M. Гриценко, E.C. Громова. Диальдегидсодержащие нуклеиновые кислоты и их компоненты: синтез, свойства, афинная модификация белков. Успехи химии, 68, С. 267-278 (1999)

5. J.N. Kremsky, J.L. Wooters, J.P. Dougherty, R.E. Meyers, M. Collins, E.L. Brown. Immobilization of DNA via oligonucleotides containing an aldehyde or carboxylic acid group at the 5'-terminus. Nucl. Acids Res., 15, P. 2891-2909 (1987)

6. J. Hovinen, A. Guzaev, A. Azhayev, H. Lonnberg. Novel non-nucleosidic phosphoramidite building blocks for versatile functionalization of oligonucleotides at primary hydroxy groups. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 19, P. 2745-2749 (1994)

7. A. Guzaev, M. Manoharan. Conjugation of oligonucleotides via an electrophilic tether: N-chloroacetamidohexyl phosphoramidite reagent. Bioorg. Med Chem Lett 8, P. 3671-3676 (1998)

8. M. Gottikh, U. Asseline, N.T. Thuong. Synthesis of oligonucleotides containing a carboxyl group at either their 5' and or their 3' end and their subsequent derivatization by an intercalating agent. Tetrahedron Lett., 31, P. 6657-6660 (1990)

9. M.D. Jonklaas, R.R. Kane. The synthesis of 3'- and 5'-iminodiacetic acid derivatives of thymidine and their incorporation into synthetic oligonucleotides. Tetrahedron Lett., 41, P. 4035-4037 (2000)

10. A. Matsuda, M. Inada, H. Nara, E. Ohtsuka, A. Ono. Synthesis and properties of oligonucleotides containing 5-formyl-2'-deoxyuridine. Bioorg. Med. Chem. Lett, 3, P. 2751-2754 (1993)

11. D. Forget, D. Boturyn, E. Defrancq, J. Lhoninie, P. Dumy. Highly efficient synthesis of peptide-oligonudeoti'cfe"conjugates: chemoselective oxime and thiazolidine formation. Chem. Eur. J., 7, P. 3976-3984 (2001)

12. D. Forget, O. Renaudet, E. Defrancq, P. Dumy. Efficient preparation of carbohydrate-oligonucleotide conjugates (COSs) using oxime bond formation. Tetrahedron Lett., 42, P. 7829 -7832 (2001)

13. N. Ollivier, Ch. Olivier, C. Gouyette, T. Huynh-Dinh, H. Gras-Masse, O. Melnyk. Synthesis of oligonucleotide-peptide conjugates using hydrazone chemical ligation. Tetrahedron Lett., 43, P. 997-999 (2002)

14. F. Hausch, A. Jaschke. A novel carboxy-functionalized photocleavable dinucleotide analog for the selection of RNA catalysts. Tetrahedron Lett., 39, P. 6157-61581998)

15. D.J. Yoo, M.M. Greenberg. Synthesis of oligonucleotides containing 3'-alkyl carboxylic acids using universal, photolabile solid phase synthesis supports. J. Org. Chem., 60, P. 3358-3364 (1995)

16. J.D. Kahl, M.M. Greenberg. Solution-phase bioconjugate synthesis using protected oligonucleotides containing 3'-alkyl carboxylic acids. J. Org. Chem., 64, P. 507-5101999)

17. T.J. Matray, D.J. Yoo, D.L. McMin, M.M. Greenberg. Synthesis of oligonucleotides containing 3'-alkyl carboxylic acids using a palladium labile oligonucleotide solid phase synthesis support. Bioconjugate Chem., 8, P. 99-103 (1997)

18. M.M. Greenberg. Photochemical release of protected oligonucleotides containing 3'-giycolate termini. Tetrahedron, 51, P. 29-38 (1995)

19. D.L. McMinn, M.M. Greenberg. Postsynthetic conjugation of protected oligonucleotides containing 3'-alkylamines. J. Am. Chem. Soc., 120, P. 3289-3294 (1998)

20. F. Guibe. Allylic protecting groups and their use in a complex environment. Part II: Allylic protecting groups and their removal through catalytic palladium p-allyl methodology. Tetrahedron, 54, P. 2967-3042 (1998)

21. J. Hovinen, A. Guzaev, A. Azhayev, H. Loennberg. Synthesis of 3'-functionalized oligonucleotides on a single solid support. Tetrahedron Lett., 34, P. 8169-8172 (1993)

22. H. Urata, M. Akagi. A convenient synthesis of oligonucleotides with a 3'-phosphoglycolate and 3'-phosphoglycaldehyde terminus. Tetrahedron Lett., 34, P. 4015-4018 (1993)

23. D. Forget, O. Renaudet, D. Boturyn, E. Defrancq, P. Dumy. 3'-Oligonucleotides conjugation via chemoselective oxime bond formation. Tetrahedron Lett., 42, P. 9171-9174 (2001)

24. P.S. Nelson, M. Kent, S. Muthini. Direct labeling of oligonucleotides employing a novel, non-nucleosidic, 2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone. Nucl. Acids Res. 23, P. 6253-6259(1992)

25. T. Berthod, Y. Petillot, A. Guy, J. Cadet, D. Molko. Synthesis of oligonucleotides containing 5-carboxy-2'-deoxyuridine at defined sites. J. Org. Chem., 61, P. 60756078 (1996)

26. A.C. Bajji, D.R. Davis. Synthesis and biophysical characterization of tRNAlys3 anticodon stem-Loop RNAs containing the mcmVu nucleoside. Org. Lett., 2, P. 3865-3868 (2000)

27. H. Vorbruggen, C. Ruh-Ponlenz. Synthesis of nucleosides. (Ed. by Leo A. Paquette et al.) J. Wiley & Sons, Inc., USA (2000)

28. H. Sawai, A. Nakamura, S. Sekiguchi, K. Yumoto, M. Endoh, H. Ozaki. Efficient synthesis of new 5-substituted uracil nucleosides useful for linker arm incorporation. J. Chem. Soc., Chem. Commun., P. 1997-1998 (1994)

29. K. Shinozuka, A. Umeda, T. Aoki, H. Sawai. Facile post-synthetic derivatization of oligodeoxyribonucleotide containing 5-methoxycarbonylmethyl-2'-deoxyuridine. Nucleosides Nucleotides, 17, P. 291-230 (1998)

30. A. Ono, T. Okamoto, M. Inada, H. Nara, A. Matsuda. Synthesis and properties of oligonucleotides containing 5-formyl-2'-deoxyuridine. Chem. Pharm. Bull., 42, P. 2231-2237 (1994)

31. R.S. Ranganathan, G.H. Jones, J.G. Moffat. J. Org. Chem. 39, 290 (1974)

32. H. Sugiyama, S. Matsuda, K. Kino, Q.-M. Zhang, S. Yonei, I. Saito. New synthetic method of 5-formyluracil-containing oligonucleotides and their melting behavior. Tetrahedron Lett., 37, P. 9067-9070 (1996)

33. H. Kasai, A. lida, Z. Yamaizumi, S. Nishimura, H. Tanooka. 5-Formyldeoxyuridine: a new type of DNA damage induced by ionizing radiation and its mutagenicity to salmonella strain TA102. Mutation Res., 243, P. 249-253 (1990)

34. N. Karino, Y. Ueno, A. Matsuda. Synthesis and properties of oligonucleotides containing 5-formyl-2'-deoxycytidine: in vitro DNA polymerase reactions on DNA templates containing 5-formyl-2'-deoxycytidine. Nucl. Acids Res., 29, P. 2456-2463 (2001)

35. A. Kittaka, T. Kuze, M. Amano, H. Tanaka, T. Miyasaka, K. Hirose, T. Yoshida, A. Sarai, T. Yasukawa, S. Ishii. Introduction of 6-formylcytidine into a Myb binding sequence. Nucleosides Nucleotides, 18, P. 2769-2784 (1999)

36. E. Trevisiol, A. Renard, E. Defranq, J. Lhomme. The oxyamino-aldehyde coupling reaction: an efficient method for the derivatization of oligonucleotides. Tetrahedron Lett., 38, P. 8687-8690 (1997)

37. A. Laayoun, J.-L. Decout, E. Defranq, J. Lhomme. Hydrolysis of oligonucleotides containing 8-substituted purine nucleosides, a new route for preparing abasic oligodeoxynucleotides. Tetrahedron Lett., 35, P. 4991-4994 (1994)

38. E. Trevisiol, A. Renard, E. Defrancq, J. Lhomme. Fluorescent labelling of oligodeoxyribonucleotides by the oxyamino-aldehyde coupling reaction. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 19, P. 1427-1440 (2000)

39. M. Endo, Y. Saga, M. Komiyama. A novel phosphoramidite for the site-selective introduction of functional groups into oligonucleotides via versatile tethers. Tetrahedron Lett., 35, P. 5879-5882 (1994)

40. N. Hebert, P.W. Davis, E.L. DeBaets, O.L. Acevedo. Synthesis of N-substituted hydroxyprolinol phosphoramidites for the preparation of combinatorial libraries. Tetrahedron Lett., 35, P. 9509-9512 (1994)

41. M. Dechamps, E. Sonveaux. Aldehydo-oligonucleotides for bioconjugation. Nucleosides Nucleotides, 17, P. 697-710 (1998)

42. J.-M. Tilquin, M. Dechamps, E. Sonveaux. Incorporation of an aldehyde function in oligonucleotides. Bioconjugate Chem., 12, P. 451-457 (2001)

43. P. Francois, P. Muzzin, M. Dechamps, E. Sonveaux. The incorporation of flexible hydrophobic chains into double-stranded DNA. New J. Chem., 18, P. 649-657 (1994)

44. J.-J. Vasseur, D. Peoc'h, B. Rayner, J.-L. Imbach. Derivatization of oligonucleotides through abasic site formation. Nucleosides Nucleotides, 10, P. 107-117 (1991)

45. J.-J. Vasseur, B. Rayner, J.-L. Imbach, S. Verma, J.A. Mc Closkey, M. Lee, D.K. Chang, J.W. Lown. Structure of the adduct formed between 3-aminocarbazole and the apurinic site oligonucleotide model d(Tp(Ap)pT). J. Org. Chem., 52, P. 49944998 (1987)

46. J.-J. Vasseur, B. Rayner, J.-L. Imbach. Apurinic DNA reactivity: modélisation of apurinic DNA breakage with phenylhydrazine and formation of a pyrazole adduct. J. Heterocyclic Chem., 25, P. 389-392 (1988)

47. J.R. Bertrand, J.-J. Vasseur, A. Gouyette, B. Rayner, J.-L. Imbach, C. Paoletti, C. Malvy. Mechanism of cleavage of apurinic sites by 9-aminoellipticine. J. Biol. Chem., 264, P. 14172-14178 (1989)

48. D. Proudnikov, A. Mirzabekov. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling. Nucl. Acids Res., 24, P. 4535-4542 (1996)

49. D. Boturyn, E. Defrancq, V. Ducros, C. Fontaine, J. Lhomme. Quantative one step derivatization of oligonucleotides by a fluorescent label through abasic site formation. Nucleosides Nucleotides, 16, P. 2069-2077 (1997)

50. J. Arpalahti, R. Kaeppi, J. Hovinen, H. Loennberg, J. Chattopadhyaya. The effect of metal ion complex formation on acidic depurination of 2'-deoxyadenosine and 2'-deoxyguanosine. Tetrahedron, 45, P. 3945-3954 (1989)

51. H. Ozaki, S. Momiyama, K. Yokotsuka, H. Sawai. Post-synthetic functionalization of oligodeoxyribonucleotides at the 2'-position. Tetrahedron Lett., 42, P. 677-680 (2001)

52. J.B.J. Pavey, I .A. O'Neil, R. Cosstick. 4th Cambridge Symposium "Oligonucleotide Chemistry and Biology". 31 August 3 September, Cambridge, UK, P. 71 (1997)

53. A.J. Lawrence, J.B.J. Pavey, I .A. O'Neil, R. Cosstick. Synthesis and properties of 2'-deoxy-2'-a-C-branched nucleosides and nucleotides. J. Org. Chem., 61, P. 92139222 (1996)

54. A. De Mesmaeker, J. Lebreton, P. Hoffman, S.M. Freier. Stereocontrolled synthesis of 2'-a-C-branched nucleoside analogues and their incorporation into oligodeoxyribonucleotides. Synlett., P. 677-680 (1993)

55. Т.Н. Keller, R. Haner. A general method for the synthesis of 2'-0-modified ribonucleosides. Helv. Chim. Acta, 76, P. 884-892 (1993)

56. A.M. Kawasaki, M.D. Casper, T.P. Prakash, S. Manalili, H. Sasmor, M Manoharan, P.D. Cook. Synthesis, hydbridization, and nuclease resistance properties of 2'-0-aminooxyethyl modified oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides, 18, P. 1419-1420 (1999)

57. A.M. Kawasaki, M.D. Casper, T.P. Prakash, S. Manalili, H. Sasmor, M. Manoharan, P.D. Cook. Synthesis, hybridization, and nuclease resistance properties of 2'-0-aminooxyethyl (2'-0-A0E) modified oligonucleotides. Tetrahedron Lett., 40, P. 661-664(1999)

58. K. Seio, T. Wada, K. Sakamoto, S. Yokoyama, M. Sekine. Chemical synthesis and properties of conformationally fixed diuridine monophosphates as building blocks of the RNA turn motif. J. Org. Chem., 63, P. 1429-1443 (1998)

59. M. Grotli, M. Douglas, B. Beijer, R.G. Garcia, R. Eritja, B. Sproat. Protection of the guanine residue during synthesis of 2-O-alkylguanosine derivatives. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, P. 2779-2788 (1997)

60. T.C. Зацепин, E.A. Романова, T.C. Орецкая. Синтез 2'-0-алкилнуклеозидов. Успехи химии, 71, С. 586-608 (2002)

61. R. Schwesinger, Н. Schlemper. Peralkylierte Polyaminophosphazene extrem starke neutrale Stickstoffbasen. Angew. Chem., 99, P. 1212-1214 (1987)

62. R.A. Jones. Preparation of protected deoxyribonucleotides. // Oligonucleotide synthesis: a practical approach. (Ed. M.J. Gait). Oxford, Washington DC: IRL Press, P. 23-34 (1984)

63. W.T. Markiewicz. Tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl, a group for simultaneous protection of 3'- and 5'-hydroxy functions of nucleosides. J. Chem. Res. Synop. 1979. P. 24-25.

64. Sproat B.S., Lamond A.I. 2'-0-Methyloligoribonucleotides: synthesis and applications. II Oligonucleotides and analogues: a practical approach. (Ed. F, Eckstein). Oxford, New York, Tokyo: IRL. Press, P. 49-86 (1991)

65. M. Sekine, T. Hata. Synthesis of short oligoribonucleotides bearing a 3'- or 5'-terminal phosphate by use of 414',4"-tris(4,5-dichlorophthalimido)trityl as a new 5'-hydroxyl protecting group. J. Am. Chem. Soc., 108, P. 4581-4586 (1986)

66. M. Grotli, R. Eritja, B. Sproat. Solid-phase synthesis of branched RNA and branched DMA/RNA chimeras. Tetrahedron, 53, P. 11317-11346 (1997)

67. M. Sekine. General method for the preparation of N3- and 04-substituted uridine derivatives by phase-transfer reactions. J. Org. Chem., 54, P. 2321-2326 (1989)

68. J. Heikila, N. Balgobin, J. Chattopadhyaya. The 2-nitrophenylsulfenyl (Nps) group for the protection of amino functions of cytidine, adenosine, guanosine and their 2'-deoxysugar derivatives. Acta Chem. Scand., 37, P. 857-862 (1983)

69. Deoxyuridine derivatives for internal modification. Glen Reports, 6 (1993)

70. A. Niewczyk, A. Krzyzaniak, J. Barciszewski, W.T. Markiewicz. Studies on the synthesis of O-ribosyl-adenosine a new minor nucleoside of tRNA. Nucleosides Nucleotides, 10, P. 635-638 (1991)

71. S.N. Mikhailov, A. DeBryun, P. Herdewijn. Synthesis and properties of some 2'-0-D-ribofuranosylnucleosides. Nucleosides Nucleotides, 14, P. 481-484 (1995)

72. S.N. Mikhailov, E.V. Efimtseva, G.V. Gurskaya, M.V. Fomitcheva, S.V. Meshkov. An efficient synthesis and physico-chemical properties of 2'-0-D-ribofuranosylnucleosides, minor tRNAcomponents. J. Carbohydr. Chem., 16, P. 7592 (1997)

73. M. Manoharan, C.J. Guinosso, P.D. Cook. Novel functionalization of the sugar moiety of nucleic acids for multiple labeling in the minor groove. Tetrahedron Lett., 32, P. 7171-7174 (1991)

74. H.K. Кочетков, Э.И. Будовский, Е.Д. Свердлов, Н.А. Симукова, М.Ф. Турчинский, В.Н. Шибаев. Органическая химия нуклеиновых кислот. М., «Химия». С. 333334. (1970)

75. S. Iwai. Synthesis and thermodynamic studies of oligonucleotides containing the two isomers of thymine glycol. Chem. Eur. J., 7, P. 4343-4351 (2001)

76. M. Scroder. Osmium tetraoxide in cis-hydroxylation of unsaturated substrates. Chem. Rev., 80, P. 187-213 (1980)

77. A. Holy, M. Soucek. Benzoyl cyanide a new benzoylating agent in nucleoside and nucleotide chemistry. Tetrahedron Lett., 12, P. 185-188 (1971)

78. A.D. Barone, J.-Y. Tang, M.H. Caruthers. In situ activation of bis-dialkylamino-phosphines a new method for synthesizing deoxyoligonucleotides on polymer supports. Nucl. Acids Res., 12, P. 4051-4061 (1984)

79. Ю.С. Шабаров. Органическая химия. M., «Химия», 1, С. 202 (1994)

80. B.S. Sproat, A.I. Iribarren, R.G. Garcia, B. Beijer. New synthetic routes to synthons suitable for 2'-0-allyloligoribonucleotide assembly. Nucl. Acids Res., 19, P. 733-738 (1991)

81. S.L. Beaucage. Protocols for oligonucleotides and analogs, synthesis and properties. (Ed. S. Agrawal) Humana Press Inc. New Jersey 07512. P. 33-63 (1993)