Направленная модификация олигонуклеотидов в процессе химического синтеза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

рт и ип

. . . т

г;

московский ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ОРЕЦКАЯ Татьяна Семеновна

НАПРАВЛЕННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОЛИГОИУКЛЕОТИДОВ Б ПРОЦЕССЕ ХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химическо! факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор химических наук,

академик РАН, профессор Д.Г.Кнорре доктор химических наук,

профессор Э.Е.Нифантьев

доктор химических наук С.Н.Михайлов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биоорганической химии РАН

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

Защита состоится 3 июня 1997 года в 16 часов на заседании диссертационно совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственн< университете им. М.ВЛомоносова по адресу: Москва 119899, Воробьевы горы, МГ Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиоте Химического факультета МГУ.

Диссертация в виде научного доклада разослана 28 апреля 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И.Г.Смирнова

Актуальность проблемы. Широкое применение олигодезоксирибо-нуклеотидов, как инструментов молекулярно-биологических исследований, и возможность с ич помощью влиять на процессы реализации генетической информация стимулируют интерес к совершенствованию методологии и технологии синтеза нуклеиновых кислот, к созданию генетических структур по заранее разработанному плану, к трансформации нативной структуры ДНК путем направленных замен природных мономеров или их фрагментов различными аналогами. Введение модифицированных звеньев в синтетические олигонуклеотиды и придание им таким образом свойств, не присущих природным фрагментам ДНК. расширяет области использования модифицированных олигонуклеотидов для изучения НК-белковых взаимодействий, синтеза топологически необычных структур, создания на их основе терапевтических средств. Можно выделить три основных способа получения модифицированных олигонуклеотидов: а) использование в химическом олигонуклеотидном синтезе мономерного синтона, несущего предполагаемую модификацию; б) встраивание в олигочерную цепь соединения-предшественника, из которого целевое модифицированное звено получается при обработке синтезированного олигонуклеотида соответствующим реагентом до, в процессе или после удаления защитных групп: в) постсинтетическая модификация природного фрагмента ДНК. Возможности последнего способа весьма ограничены, так как он может быть использован лишь для получения олигонуклеотидных аналогов, имеющих, как правило, множественные статистические изменения (например, модифицированы идентичные гетероциклические основания). В первых двух вариантах та или иная модификация заранее заложена в схему химического синтеза олигонуклеотида посредством введения предварительно синтезированного звена в олигомерную цепь па заданной стадии. Процесс получения модифицированных о.шгодезокскрибонуклеотидое и их широкого использования начал активно развиваться с начала 80-х годов. Это произошло благодаря значительному усовершенствованию способов образования межнуклеотидной связи, развитию твердофазного метода синтеза, что привело в конечном счете к полной автоматизации процесса получения олиго- и полинуклеотидов. Тем не менее, внедрение каждой новой модификации в практику олигонуклеотидного синтеза связано с решением комплекса проблем как на __ стадии получения

модифицированного монрмерного компонента, который включается в олигонукле.отид на заданной стадии, так и при образовании иепи ДНК. Появление модифицированных аналогов субстратов интенсифицировало исследования белково-нуклеиновых взаимодействий, что в свою очередь стимулировало развитие методов синтеза таких аналогов с заданными свойствами. Таким образом,проблема автоматического химического синтеза направленно модифицированных фрагментов ДНК является в настоящее время актуальной.

Целью настоящего исследования явились дизайн и синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов, необходимых для решения конкретных молекулярно-биологических задач. Предполагаюсь получить фрагменты ДНК, модифицированные по гетероциклическому основанию или по углеводофосфатному остову, в рамках стандартной (в большинстве случаев амидофосфитной) схемы синтетических и постсинтетических процедур.

Необходимые этапы этой работы включали синтез модифицированных мономерных компонентов такого строения, которое предопределяло возможность их использования в автоматическом синтезе олигонуклеотидов, подбор регламента встраивания модифицированных звеньев в олигонуклеотидную цепь с последующим подтверждением их наличия в олигомере. Автоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов с З'-концевыми фосфатными группами потребовал создания такого полимерного носителя, который позволяет получать З'-фосфорилированные олигонуклеотиды при удалении целевого олигомера с полимера после завершения процесса синтеза. Самостоятельной задачей исследования было изучение влияния введенных аномальных звеньев на химические, физико-химические и субстратные свойства олигонуклеотидов и составленных из них ДНК-дуплексов. И, наконец, представлялось целесообразным показать возможность использования модифицированных олигонуклеотидов для синтеза топологически необычных структур - циклических олигонуклеотидов. ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями.

Научная новизна и практическая ценность. В работе оформилось новое направление исследования, посвященное дизайну и синтезу модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов путем включения в их состав модифицированных звеньев, не использовавшихся ранее при создании олигонуклеотидной цепи.

Продолжая традиции развития автоматического синтеза олигонуклеотидов в лаборатории химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ, модифицированные нуклеозилы или их аналоги встраивали в олигомерную цепь в процессе автоматического химического синтеза в большинстве случаев с сохранением стандартных синтетических процедур. Данный метод не лимитирует количество модификации, вводимых в олигонуклеотид. Модифицированное звено можсг быть включено в любое заданное положение олигонуклеотидной цепи. В рамках настоящего исследования впервые разработаны простые и универсальные методы получения олигодезоксирибонуклестияов с 3'- и/или 5'-кониевыми фосфатными группами. Полимерный носитель с р-оксиэтилсульфоновой якорной группой, предложенный для получения З'-фосфорилированных олигонуклеотидов. позволяет синтезировать также З'-алкилфосфаты олигорибо- и олигодезоксирибонуклеотилов. Предложены новые структуры олигонуклеотидных зондов, обладающих повышенной устойчивостью к действию экзонуклеаз и не нарушающих сродство к ДНК- и РНК-мишеням. Эту устойчивость им придают находящиеся на 3'- и 5-концах олигонуклеотида 1-(Р-0-3'-дезокси-треопентафуранозил)пиримидиновые звенья или 1-(р-0-2'-дезокситрео-пентафуранознл)ти мнн.

Впервые получены олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие 2'-амино-2'-дезоксинуклеозиды: 2'-амино-2'-дезоксиуридин, 2'-амино-2'-дезоксицитидин и 9-(р-0-2'-амино-2'-дезоксиара6инофуранознл)аденин. Продемонстрирована

высокая реакционная способность 2'-аминогрупп в составе олигонуклеотидов в реакциях с электрофильными реагентами и влияние 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов на температуру плавления ДНК-дуплексов с такими включениями. Предложен новый эффективный метод синтеза ДНК-дуплексов с ковхтентно связанными цепями на основе модифицированных олигонуклеотидов, один из которых содержит 2'-амино-2'-дезоксинуклеозид, а второй ненуклеозидную вставку с локализованной на ней карбоксильной группой. В оптимальных условиях выход ДНК-дуплексов с ковалентной связью между цепями достигает 85%.

Полученные в работе олигодезоксирибонуклеотиды, модифицированные по гетероциклическому основанию, углеводофосфатному остову, фосфорилированные по 3'- и 5'-кониам. значительно расширили возможности изучения НК-НК и

НК-белковых взаимодействий. Все синтезированные фрагменты ДНК с включениями модифицированных звеньев были успешно использованы в исследованиях сотрудников лаборатории химии нуклеиновых кислот химического факультета МГУ, а также в совместных работах с Гумбольдтским университетом (Берлин, Германия), фирмой Genset (Париж, Франция), Вейнским университетом (Детройт, США), Медицинским исследовательским центром (Кембридж, Англия) по изучению взаимодействия нуклеиновых кислот с ферментами рестрикции-модификации EcoBîl, M val, &oII, урацил-ДНК-гликозилазой, фактором транскрипции NF-кВ, РНКазой H из E.coli, регуляторными белками ВИЧ, по установлению закономерностей реакции химического лигирования, в том числе при введении в углеводофосфатный остов химически активных групп, способных к ковалентному взаимодействию с белками, а также синтезу с помощью этого метода протяженных ДНК. содержащих функционально значимые участки, и топологически необычных структур.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на 16-ой конференции ФЕБО (Москва, 1984), V-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), 5-ой Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических реактивов" (Рига, 1987), XI-ой Международной конференции по химии фосфора (Таллин, 1989), VII-ом Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Рига, 1989), на Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды; проблемы и перспективы практического применения" (Москва, 1991), Международной конференции "Антисенсовые олигонуклеотиды и рибонуклеаза Н" (Аркашон, Франция, 1992), на 3-ем Симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды и аналоги" (Кембридж, Англия. 1993), на 3-ем Международном совещании по биологической модификации ДНК (Вильнюс, 1994), на Международной конференции "Терапевтические олигонуклеотиды: от клетки к человеку" (Сейяк, Франция, 1995), на Симпозиуме по нуклеиновым кислотам (Лейден, Нидерланды, 1995).

Диссертация обобщает данные 53 основных публикаций. Главные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в настоящем докладе. Работа выполнена в 1980-1996 гг.; на разных этапах в ней принимали участие соискатели, стажеры, аспиранты и студенты МГУ, работавшие под руководством автора.

4

1. Ввеление модифицированных звеньев в олигодезоксирибонуклеотиды

В последние годы модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды находят применение для изучения механизмов действия НК-связываюших белков и закономерностей НК-белкового узнавания, для создания новых терапевтических средств. Наряду с такими физико-химическими методами исследования, как рентгеноструктурный анализ и ЯМР-спектроскопия, все более широкое распространение приобретает органохимический подход, связанный с использованием модифицированных олигонуклеотидов для изучения механизмов нзаимодействия белков с ДНК и РНК. Направленное изменение химической структуры НК в белково-нуклеиновых комплексах и изучение свойств сконструированных систем дает возможность получить информацию о пространственном строении таких комплексов и природе НК-белковых контактов. Актуальным является создание модифицированных олигонуклеотидов с заданными свойствами, такими как устойчивость к нуклеазной деградации, повышенная термодинамическая стабильность, способность к проникновению через Клеточные мембраны и к ковалентному связыванию с молекулами ДНК и белков. Стратегия введения в олигонуклеотид модифицированного звена независимо от его природы может быть представлена следующим образом.

Любая молекула, имеющая две реакционноспособные гидроксильные группы, потенциально может быть звеном в олигонуклеотидной цепи. Для этого необходимо, чтобы один из гидроксидов был фосфорилирован, а другой блокирован такой временной защитной группой, которая бы удалялась в нужный момент в мягких условиях для последующего фосфорилирования этого гидроксила нуклеотидом или его аналогом с целью создания межнуклеотидной связи. Это означает проведение ряда последовательных реакций, результатом которых было бы соединение, имитирующее 5'-зашищенньш З'-фосфорилированный нуклсозид (см. схему /).

Наличие только одной гидроксильной группы позволит ввести такую молекулу лишь на 5'- или З'-конец олигонуклеотида. Все остальные имеющиеся функциональные группы должны быть блокированы, а само соединение устойчиво

Префикс "<Г (дсзокси) при обозначении 2'-дезоксирибонуклеозидов и олигодезоксирибонуклеотидов опушен.

при многочисленных обработках, которым подвергается олигонуклеотидная цепь в процессе и после синтеза. Это путь к встраиванию в олигонуклеотидную цепь как модифицированных нуклеозидов, так и вставок ненуклеозидной природы. При использовании высоко реакционноспособных соединений трехвалентного фосфора образование межнуклеотидной связи проходит быстро и эффективно, а синтез олигомера на твердофазном носителе делает процесс технологичным и позволяет его автоматизировать.

Схема 1.

X, У - функциональные группы Я1, Я2 - защитные группы

Таким образом, основным направлением данной работы был автоматический химический синтез модифицированных олигодезоксирибо-нуклеотидов. Строение модифицированного звена определялось целью исследования, в котором в дальнейшем использовались модифицированные фрагменты ДНК. Независимо от природы соединения включению его в олигомер предшествует как правило многостадийный синтез мономерного синтона на его основе, а завершает процесс подтверждение наличия данной модификации в составе олигонуклеотида и демонстрация свойств полученных соединений. Мы стремились к минимальному изменению стандартного регламента

олигонуклеотидного синтеза при введении модифицированных звеньев, к но ¡мощности множественных включений, а также к сохранению стандартных п ос тс 11 и те г и ч ее к и х об работа к.

В обшем случае олигонуклеотид может быть модифицирован по гетероциклическим основаниям, по фосфатным группам, межнуклеотидным или кшшеным. ¡1 по углеводным остаткам. Основное внимание в данной работе мы уделили введению концевых фосфатных групп и модификации углеводного фрагмента, лишь упоминая об олигонуклеотидах с модифицированными гетероциклическими основаниями.

Синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов проводили триэфирным методом в растворе или на автоматах-синтезаторах "Виктория-4М" производства СКТБ специальной электроники и аналитического приборостроения СО АН СССР, разработанном с участием лаборатории химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ, и Applied Biosystems 380В (США). Использовалась стандартная амидофосфитная схема синтеза. Допускалось в некоторых случаях увеличение времени конденсации на стадии присоединения к растущей цепи модифицированного звена. Удаление защитных групп с гетероциклических основании и межнуклеотидных фосфатов проводилось в конц. растворе аммиака мри 50°С в течение 12 часов.

Анализ реакционных смесей, полученных при синтезе олигонуклеотидов, и выделение целевых продуктов, содержащих на 5'-конце диметокситритильную защитную группу, проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе Тгасог (Голландия). Использовали колонку 250x4 мм с сорбентом Диасорб С- 16-х-(размер частиц 7 мкм). Условия разделения: температура колонки 45°С, элюент -0.1 М раствор ацетата аммония, линейный градиент концентрации аиетонитрила -iMO'V- за 60 мин, расход элюента ! мл/мин.

Контроль чистоты олигонуклеотидов после выделения, а также анализ реакционных смесей с участием модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов (например, контроль за процессом образования дуплексов с ковалентно связанными цепями) проводили методом ион-парной ВЭЖХ на хроматографе Waters (США) с шагом элюшш I или 2 нуклеотидных звена в минуту. Условия аналитического разделения: колонка 250x4 мм, сорбент Диасорб С- I6j (размер частиц 7 мкм), температура колонки 45°С, элюент - 48 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 2 мМ тетрабутиламмоний ди гидрофосфат, с

логарифмическим градиентом концентрации ацетонитрила 5-40%. расход элюента 1 мл/мин. Градиент концентрации ацетонитрила. удовлетворяющий эквидистантной элюции олигонуклеотидов. рассчитывается с помощью специальной компьютерной программы по результатам разделения тестовой смеси. Наличие модифицированного звена при условии его поглощения в УФ-области при 260 нм подтверждалось исчерпывающим ферментативным гидролизом олигонуклеотидов с последующим ВЭЖХ-анализом гидролизата и сравнением с контрольной смесью нуклеозидов. Нуклеотидную последовательность подтверждали секвенированием по Максаму-Гилберту. При получении модифицированных синтонов их реакционная способность и устойчивость в процессе синтеза демонстрировалась при получении модельных олиготимидилатов с включением одной или нескольких модификаций. Нуклеотидная последовательность целевых олигонуклеотидов задавалась в зависимости от того, какую проблему предполагалось решить (какой объект обследовать) с помощью данного модифицированного олигомера. Строение модифицированных нуклеозидов, амидофосфитных компонентов олигонуклеотидного синтеза на их основе, а также ненуклеозидных вставок, используемых в олигонуклеотидном синтезе, подтверждали данными ЯМР-, УФ- и ИК-спектроскопии.

2. Олигодезоксирибонуклеотиды с 3'- и/или 5-концевыми фосфатными группами

Постсинтетическая модификация олигонуклеотидов (получение производных олигонуклеотидов с молекулами спиртов, аминов, различными маркерами), их иммобилизация на носителях, а также сборка относительно коротких фрагментов НК в более протяженные требует наличия в олигомерах 3'- и/или 5'-концевых фосфатных групп.

Ограничениями возможностей ферментативных методов получения фосфорилированных олигонуклеотидов являются большие затраты фермента при работе с препаративными количествами вещества, сложная процедура ферментативного З'-фосфорилирования, а также непригодность ферментативных методов введения концевых фосфатных групп при наличии модифицированных звеньев по концам олигонуклеотидов.

К началу настоящей работы (80-е годы) простых и надежных методов получения олигодезоксирибонуклеотидов с концевыми фосфатами не существовало. Нами были предложены и осуществлены несколько методов

фосфорилирования олигонуклеотидов, три из которых доказали свою перспективность. Для получения З'-фосфорилированных олигонуклеотидов в рамках триэфирного метода синтеза мы пытались фосфорилировать олигонуклеотид или его З'-кониевой фрагмент либо смесью хлорокиси фосфора и триазола. либо р-цианэтилфосфатом в присутствии триизопропилбензол-сульфо,хлорида (см. схему 2).

Возможна также переэтерификация стандартной компоненты триэфирного синтеза с п-хлорфенильной защитной группой по атому фосфора на р-цианэтильную в присутствии хлористого цезия.

Схема 2.

ОМТгОМ*в... ^

о

1. МС(СН2)20-Р-ОН

он

2. НО(СН2)2СМ

1. РОС13, ТпН

2. НО(СН2)2СЫ

□МТгоМ*£ ... М*ОР(ОСН2СН2СЫ)2

I 1) Н+

] 2) ЫНз-ад

0

1

£ = 0=р—ОС6Н4С1-п

о

с6н5

ОМТг = С(С6Н40СН3-П)2

М*

- защищенный по экзоциклической аминогруппе нуютеозид

Однако для протяженных олигонуклеотидов эти методы оказались неприемлемыми а связи с тем, что при фосфорилировании происходила потеря нуклеотидного материала, а перенос этих методик на автоматический вариант синтеза и вовсе оказался нереальным.

В рамках сначала триэфирной, а затем амидофосфитной схем олигонуклеотидного синтеза получил свое развитие способ получения 3'- и/или 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов, основанный на введении концевых рибозвеньев, как потенциальных источников концевых фосфатов.

9

Олигонуклеотиды с концевыми рибозными звеньями после окисления рибозы и р-элиминкрования превращаются в олигонуклеотиды, фосфорилированные по 3'- и/или 5'-концам (см. схему 3).

Схема 3.

НО

ги(5-5')ЫЫ ... Ыги -рШ... Ыр

(_)—ЫНа

- карбоксилсодержащий полимерный носитель

,, -Кроме того после окисления рибозвена возможна иммобилизация таких олигомеров, несущих альдегидные группы, на полимерном носителе, содержащем аминофункцию, с образованием оснований Шиффа и последующим восстановлением.

Для получения олигонуклеотидов с концевыми фосфатными группами удобным реагентом оказался 2-[2-(4,4'-диметокситритилокси)этилсульфонил]этил-фосфит (I) или р-цианэтил-Ы,Ы-диизопропиламидофосфит (2) аналогичного строения (см. схему 4), которые вводятся в олигомерную цепь в стандартных условиях гидрофосфорильного или амидофосфитного синтетического цикла на первой или последней стадии в зависимости от требуемого положения концевой фосфатной группы. Удаление фосфорилированных олигонуклеотидов с полимерного носителя и деблокирование концевых фосфатных групп не требует дополнительной обработки. Эффективность стадии конденсации с такими компонентами составила 97-99%. Кроме того, при получении З'-фосфорилированных олигонуклеотидов синтез можно осуществлять на любом гидроксилсодержащем полимерном носителе, в том числе на носителях из стандартного набора с иммобилизованным на нем любым нуклеозидом. При использовании этих фосфитилируюших агентов в первом и последнем синтетическом цикле можно получать 3',5'-дифосфорилированные олигонуклеотиды (см. схему 4).

Схема 4.

0 0 о N(iPr)2

DMTrO(CH2)2S(CH2)2OPO" Et3N+H (1) DMTrO(CH2)2S(CH2)20Px (2)

он о och2ch2cn -

О о Гидрофосфсрильный i—i ill PvCI И " I—I олитонуклеотадный синтез H04S ' - - - DMTrO(CH2)2S(CH2)2OPO—[p] ---►

о H

О ООО + м* II м* 11 I! il г-—I H ; (1), PvCI - DMTrON OPO ... N OPO(CH?)2S(CH?)?OPO—j p I -

н н о H

ООО ООО

-- DMTrO(CH2)2S(CH2)2OPON*OPO... N*0P0(CH2)2S(CH2)20P0~v[Ei '2/Py/H?0

090 ООО

DMTrO(ch2)2s(ch2)2opon*opo... n*opo(ch2)2s(ch2)2opo—[el nh3'aq

Д i I I II I .

о о' О' О" о О

О О о

II .. II ., II

о--- o-p-o~Nopo N—о-р—о

II I. I "

Pv = (СНз)зС-С— о о О

н

При разработке универсальной схемы синтеза олигодезоксирибонуклеотид-З'-фосфатов в автоматическом режиме мы предложили прямой метод введения фосфата в олигонуклеотид на твердой фазе. Это представляется возможным при использовании такого полимера, присоединение к которому первого нуклеотидного звена можно проводить в автомате-синтезаторе, а отщепление олигонуклеотида с З'-концевой фосфатной группой с использованием реакции р-элиминирования. Оптимальным исходным полимерным носителем с точки зрения механических свойств и возможности модификации (загрузки первым нуклеозидом) оказался СРС-550. Модификацию носителя для получения З'-фосфорилированных олигонуклеотидов проводили в соответствии со схемой 5.

Схема 5.

О

НО.

N(042)2—Сере)

РМТгО(СН2)2502(СН2)20Н

О

н

(3)

1) н+

2) 0МТг0Ы*0Р;

Р(СН2)2СМ

0МТгО(СН2)2ЗО2(СН2)2О

о

/

>

\

М(СН2)2

Ы(1Рг)2

3) 12. Ру, н2о

М(СН2)2—1(сто) н

Контрольные эксперименты с полимером (4), имеющим р-оксиэтилсульфоновые якорные группы, показали, что растущая олигонуклеотидная цепь сохраняется на носителе в течение синтетического цикла. Удаление олигонуклеотида с полимерного носителя и отщепление этилсульфоновой группы от фосфата происходит в условиях удаления защитных групп.

Присутствие концевых фосфатов в олигонуклеотидах подтверждали реакцией ферментативного дефосфорилирования. Косвенным подтверждением наличия концевых фосфатных групп в олигонуклеотидах было их использование в реакции химического лигирования с применением в качестве конденсирующих реагентов водорастворимого карбодиимида (КДИ) или бромциана. Этим методом с использованием З'-фосфорилированных олигонуклеотидов были получены протяженные фрагменты ДНК, содержащие функционально значимые участки -концевые инвертированные повторы 151-элемента, последовательность, кодирующая полипептид (РИе-Азр),,. Впервые методом химического лигирования был осуществлен 'неэнзиматический синтез гена (183 и.о.), при транскрипции которого получается 130-звенная мРНК, кодирующая пептид из 16 аминокислот.

Если на первой стадии получения олигонуклеотидной цепи к полимерному носителю с р-оксиэтилсульфоновой якорной группой присоединяли не стандартный р-цианэтилфосфит нуклеозида, а его этилфосфит, то результатом

олигонуклеотилного синтеза являлся олигонуклеотид, имеющий на З'-конце этилированную фосфатную группу.

Пол>чение 3'- или 5'-алкилфосфатов олигояезоксирибонуклеотидов возможно также реакцией алкилирования олигонуклеотид-3'- (или 5'-) фосфатов спиртами в водно-буферных растворах (^апоУБкауа, е! а1. 1987). Проблемы в этом случае возникают при необходимости выделения целевого продукта, если в реакционной смеси остается исходное соединение. Для получения олигорибонуклеотид-З'-алкилфосфатов такой метод алкилирования в принципе непригоден, т.к. при активации З'-фосфатной группы для последующего алкилирования в качестве нуклеофила выступает не спирт, а соседний 2'-гидроксил, что приводит к образованию циклофосфата. а не З'-алкилфосфата.

Предложенный нами метод получения этилированных по З'-концевому фосфату олигодезоксирибонуклеотидов с использованием полимерного носителя с р-оксиэтилсульфоновой якорной группой оказался пригодным и для синтеза алкилфосфатов олигорибонуклеотидов. В качестве мономерной компоненты на первой стадии олигорибонуклеотидного синтеза в реакцию вводили 2'-трет.-6\тилдиметилсидил-3'-?ч'.Ы-диизопропилэтилфосфит рибонуклеозида (6) (см схему 6).

Схема 6.

В

В

ОМТгО

1) Те'.г 2} 12/Ру/Н20

о о—а—с(снз)з

о

н

В = ига. Су1Ч Ас1еЬг. Сиа|Ь

По окончании синтеза сначала олигорибонуклеотид отщепляется от полимера (NH3-aq/CH3OH), а затем происходит удаление защитной группы с 2'-гидроксила (Bu4N+F">.

При химическом лигировании З'-алкилфосфата олигонуклеотида с олигонуклеотид-5'-фосфатом на комплементарной матрице образуется ДНК-дуплекс, в одной из цепей которого содержится активная тризамешенная пирофосфатная группировка (см. схему 7).

Схема 7.

OEt О"

5--О—Р=0 0=Р—О-3'

о , j

О" О" 3--5'

C2H5N=C=N(CH2)3N(CH3)2' HCl pH 6.0

OEt О"

I I

5'-О—P—О—Р—О-3'

э II II J

О о

. 3,-5,

Доступность исходных алкилфосфатов и фосфатов олигонуклеотидов и превосходно отработанная в лаборатории реакция химического лигирования (Dolinnaya, Shabärova, 1995) сделали возможным получение целой серии аналогов субстратов с замещенной пирофосфатной группировкой для аффинной модификации ферментов рестрикции-модификации ЛоП, £ccRII, Mval и региоспецифического ковалентного связывания олигонуклеотидов с фактором транскрипции NF-кВ и регуляторными белками ВИЧ.

3. Олигодезоксирибонуклеотнды с включениями ненуклеозидной природы

Значительный интерес представляют исследования, посвященные созданию модельных систем с направленным введением ненуклеозидных участков в структуру ДНК путем химического синтеза, изучению физико-химических свойств таких модифицированных ДНК и их использованию в качестве аналогов

субстратов для выяснения влияния ненуклеозидных участков на действие полимера], рестриктаз и других НК-узнающих ферментов. Наиболее простыми с точки зрения легкости получения мономерных компонентов олигонуклеотилного синтеза явились лолиметилендиолы, полиэтиленгликоли, (2!?, 35)-2-оксиметил-тетрагидрофуранол-З (9) - структурный аналог 1,2-дидезоксн-0-рибофуранозы. Разработанный нами синтез соединения (9) и амидофосфитного производного на его основе (10) проводился в соответствии со схемой 8.

Схема 8.

сн2он

но

НО (?)

-он -он

2М НС1, 72 ч

СН2ОН (8) БМТгО

но-

но

(9)

1) ОМТгС!

0(СН2)2СЫ

2)С1-Р' Л

(10)

Единичная замена природного нуклеозида на 1,3-пропандиол или

производное тетрагилрофурана (9) в четырнадцатизвенном ДНК-дуплексе приводит к значительной его дестабилизации (понижение температуры плавления на 14- 18°С).

Примером применения соединения (9) при синтезе циклических антксенсовых олигонуклсотидов может служить замена нуклеотидных остатков в незначащем участке олигомера-предшественника на остатки структурного аналога 1.2-дидезокси-0-рибофуранозы (9). При циклизации этого олигомера на комплементарной матрице с использованием в качестве конденсирующего агента бромистого циана в водном растворе можно избежать внутримолекулярных комплементационных взаимодействий, а конформационная подвижность модифицированного участка в этом случае облегчает образование цикла (см. схему 9).

Попытки применить для этих же целей гексаэтиленгликолевые мостики не были столь успешны. Выходы циклических олигонуклеотидов варьировались от 20 до 30% при использовании от 3 до 5 гексаэтиленгликолевых вставок вместо 15 нуклеозилных остатков против количественных выходов (90-95%) для олигонуклеотидов, содержащих включения производного тетрагидрофурана.

Схема 9.

Я

ятяятяятя

я

Аи с в У -Т-х-

а л7

А --СТССр и вАСО-

4,

с

А

о<£т

5*

хоссч с

« • • • г^

АССС

.Я

ят-

яятяятя

я-

т т

3' с 3-

°Т-А?ТГСр ° ААС-

я

я

и

т т

Xе--5'

ХОАв7- АС

• . . . А

АСТС

X = Т, рТ

; -О Я =

о-

о-

Стрелкой обозначено место образования фосфодиэфирной при Х=Т или пирофосфатной при Х=рТ связи.

Замена остатка нуклеозида на ненуклеозидную вставку, особенно на <2Я,35)-2-оксиметилтетрагидрофуранол-3, позволяет вычленить роль гетероциклических оснований при взаимодействии ферментов рестрикции-модификации с такими аналогами субстратов. С другой стороны роль углеводного фрагмента при НК-белковых контактах можно установить с помощью производных нуклеиновых оснований, содержащих заместитель

С

—СН20СН(СН20Н)2- Такие соединения можно рассматривать как | о

Л/

аналоги природных нуклеозидов, в которых сохранен фрагмент С

К числу таких пуриновых ациклических аналогов относится и глицерогуаниновое производное 9-[ Г-гидрокси-2'-(гидроксиметил)этокси]-метилгуанин (глицерометилгуанин или ганцикловир, glG). Наша задача заключалась в получении амидофосфитного производного и включении его в олигонуклеотиды в соответствии со стандартной синтетической схемой. Бензоилирование экзоциклической аминогруппы, тритилирование и

фосфитилирование для этого соединения оказалось возможным осуществить по классическим методикам синтеза защищенных нуклеозидов.

Необходимо отметить два свойства этого соединения, отличающих его от ^модифицированного нуклеозида. Амидофосфит glG, полученный фосфитилированием первичной гидроксильной группы, обладает высокой реакционной способностью и значительная его часть в процессе постсинтетических обработок переходит в гидрофосфорильное производное, что подтверждено данными -"Р-ЯМР-спектроскопии. Для пентануклеотида П^ГСТТ при анализе его обращенно-фазовой ВЭЖХ удается зафиксировать два диастереомера, обусловленные существованием хирального центра при С2'-атоме с дальней асимметрией (см.схему 10).

При единичной замене <Ю на

Схема 10. „

его ациклическии аналог giG

кооперативность процесса

плавления !2-звенного дуплекса

не нарушается. По-видимому,

g!G встраивается в дуплекс и

участвует в межплоскостных

взаимодействиях с соседними

основаниями. Значительная

дестабилизация двойной

спирали в данном случае

(понижение Т.пл. на 15°С),

вероятно, связана с

возможностью свободного

вращения гуанинового основания из-за ациклической природы углеводного

остатка, что может привести к частичному нарушению комплементационных

взаимодействий в сГС-С паре.

4. Олигодезоксирибонуклеотвды, содержащие модифицированные нуклеозкды

Модифицированные нуклеозиды известны давно и широко используются как противовирусные и противоопухолевые препараты. Многие из них могут быть успешно включены в олигонуклеотидную цепь, при этом изменяются физико-химические, химические и субстратные свойства природных фрагментов ДНК.

5-

\

I

О

д-р_0_.от Сиа

' ио^л о

о~р—о-

I

I

О"

о

о—р—о. I.

ТЬу

\

Существуют два основных подхода к получению модифицированных нуклеозидов: а) конденсация гетероциклического основания и сахара: б) модификация природного нуклеозида под действием различных химических агентов. Первый путь - наиболее сложный, приводящий, как правило, к многокомпонентной смеси продуктов, выделить из которой целевое соединение представляется сложной задачей. Стадии получения нуклеозида предшествует избирательное блокирование функциональных групп как гетероциклического основания, так и углеводного фрагмента, не участвующих в заключительной конденсации. Мы выбрали второй путь, как более технологичный, однако приводящий к целевому соединению в результате длинного ряда химических превращений.

4.1. Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие модифицированные гетероциклические основания

Первые работы, связанные с получением модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов, были осуществлены нами в 1982 г. Высокая эффективность блочного фосфотриэфирного метода синтеза в растворе была продемонстрирована на примере включения в олигонуклеотидную цепь наиболее простых модификаций по гетероциклическим основаниям. Были синтезированы три нонадезоксирибонуклеотида, содержащих 5-бром-2'-дезоксиуридин (dbr5U) и 5-метил-2'-дезоксицитидин (dmsC). Образование межнуклеотидной связи проходило в присутствии триизопропилбензолсульфохлорида и N-метилимидазола (Табл. 1).

Успешное использование автоматического амидофосфитного подхода при решении проблемы включения нуклеозидов с модифицированными основаниями в заданное положение олигонуклеотидной цепи было проиллюстрировано на примере синтеза олигодезоксирибонуклеотидов. содержащих Ы6-метил-2'-дезоксиаденозин (dm6A) и дезоксиинозин (dl).

Для получения dm6A мы выбрали широко используемый метод Робинса и Джонса (Jones, Robins. 1963), включающий метилирование dA йодистым метилом по N'-положению на первой стадии и щелочную перегруппировку Димрота (Engel, 1975) на второй стадии.

5'-0-Монометокситритилирование dl осуществлялось с некоторыми изменениями общепринятой методики. После экстракции продукта хлороформом с последующим концентрированием раствора искомый тритилированный

нуклеозид кристаллизовался, и его дополнительная очистка не проводилась. Ввиду плохой растворимости (11 в пиридине продукт тритилирования был получен с низким выходом (40%).

Таблица I.

Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие модифицированные гетероциклические основания

Нуклеозид Основание(В) Синтон и метод синтеза олигомеров Олигонуклеотиды 5' 3'

с!Ьг5и хУ 1 ММТЮ-1 В о р-а-ИЮ-Р-ОСНгСНгСЫ О Фосфотриэфирный растворный синтез ССЬг51ЮОААТТ

dm5C ЫНВг »К** 1 ш5ССТСОААТТ

ат6А Н.\' -СНз 1 ММТЮ-1 В -Цо^, 0 1 Рч СНзО/ ЧЫ(1Рг)2 Амидофосфитный автоматический синтез ТССАТССш'АССАССА

А] <х> АССТАССТЮТСОТ

Существуют различные точки зрения на необходимость блокирования б-оксогруппы ¿1. С учетом опыта лаборатории по синтезу олигодезоксирибо-нуклеотидов амидофосфитным методом, при использовании которого О6-атом дезоксигуанозина не защищался, и в случае сП защитная группа в положение О6 не вводилась. Поскольку 5'-0-монометокситритилированные производные (1т6А и <Н нерастворимы в хлористом метилене, обычном' растворителе при получении З'-амидофосфитов по Карузерсу (МаКеисЫ, СагиМеге, 1981), методика

фосфитилирования была модифицирована нами путем замены мористого метилена на ацетонитрил в качестве растворителя в обоих случаях (выходы 87-90%). Структуры амидофосфитных модифицированных синтонов представлены в таблице 1.

Включения в олигонуклеотиды единичных модифицированных звеньев -с1Ьг3и, с1т5С, с!т6А - не приводит к существенному изменению термической устойчивости дуплексов. Не выявлено каких-либо значительных изменений конформации двойной спирали вне места точечной модификации. Наиболее сильный дестабилизирующий эффект наблюдается при включении в ДНК-последовательность (11. Таким образом, все предложенные модификации не препятствуют образованию двуспирального комплекса и были использованы для выявления отдельных групп атомов оснований ДНК. образующих специфические контакты с белками, путем изучения связывания и расшепления эндонуклеазами рестрикции £соШ1, Муа\ и &оИ данных субстратов (Оготоуа, БЬаЬагоУа, 1990).

4.2. Олигодезоксирибонуклеозиды, содержащие модификации по углеводному фрагменту

При модификации углеводного фрагмента пиримидиновых нуклеозидов ключевой стадией синтеза являлось^ как правило, замыкание О2,2'- или 02,3'-ангидроцикла. Размыкание ангидроцикла в абсолютной среде происходит в результате атаки нуклеофила по атому углерода сахара. В водных растворах нуклеофильной атаке подвергается атом углерода во 2-ом положении гетероциклического основания, при этом происходит обращение конфигурации у 2'- или З'-атома углерода углеводного фрагмента. На схеме 11 в качестве примера приведены реакции, в результате которых получаются 2'-азидотимидин (13). ксилотимидин (14), 2'-фторуридин (17), 2'-азидоуридин (18). арабиноуридин (19).

За стадией синтеза модифицированного нуклеозида следует процесс его подготовки к олигонуклеотидному синтезу - блокирование функциональных групп и фосфорилирование соединениями пяти- или, в большинстве случаев, трехвалентного фосфора. Эти операции для всех модифицированных звеньев проводили по стандартным для природных нуклеозидов методикам с изменением в ряде случаев растворителя или времени реакции.

Схема II.

яо

яо-

о

нДг^

он П1)

1) СНзБОгС!

2) №ОН

Ут'

ИО—) о^ыг

Ч^ <12,

СНз

Ш3 дмф/

/

N304 чНгО/ЕЮН

Ж

РЮ

но он (15)

(С6Н50)2С0 О

1 (16) но

№ /

диоксан/

ига

Ш3 \ МаОК

дмф \н2оуеюн

ига

-, РУ ЯО-П он |Ьу ко ига ко уга _ ига

Цо^

N3 <13>

Я = Н, ОМТг

он Тьу ио-

(14) но р (17) но (18) (19)

4.2.1. Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие

2'-фтор-2'-дезокснпиримидиковые нуклеозиды Уникальна роль заместителя при С2'-атоме углеводных фрагментов нуклеиновых кислот, определяющего основное различие между ДНК и РНК. Этим обусловлена актуальность появления многочисленных исследований свойств нуклеозидов и олигонуклсотидов, содержащих заместители в этом положении.

Метоксигруппа и галоид в 2'-положении (аналогично 2'-гидроксилу) придают значительную жесткость СЗ'-эндо(М)-конформации углеводного кольца, что в значительной степени определяет конформацию поли- и олигонуклеотидов и обусловливает существование дуплекса (или его локальных участков) в А-форме. С другой стороны,такие 2-заместители (в отличие от 2-гидроксила) обеспечивают

устойчивость олигонуклеотидов при нейтральных и щелочных значениях рН, а также к рибонуклеазам, что упрощает синтез олигомеров и работу с ними.

2'-Фтор-2'-дезоксинуклеозиды - наиболее интересный объект для изучения, т.к. они в составе олигонуклеотидов сохраняют СЗ'-эндо рибозный тип конформации. При этом образуются дуплексы более стабильные, чем их рибо- и дезоксианалоги.

Как показано на схеме 11, синтез 2'-фтор-2'-дезоксиуридина (ил) (17) осуществляли из 02.2'-ангидроуридина. 4-Тетразолидное производное 2'-фторуридина при переаминировании, которое может проходить при удалении защитных групп с олигонуклеотида кони, раствором аммиака, приводит к образованию 2'-фтор-2'-дезоксицитидина (Сп) (см. схему 12). (Синтез 2'-фтор-2'-дезоксинуклеозидов проводился нами в лаборатории проф. Д. Цеха (Гумбольдтекий университет, Берлин)).

Необычное явление было отмечено при синтезе олигонуклеотидов, содержащих З'-кониевой ип. При получении олигомера АСООА1)п, после осуществления автоматического амидофосфитного синтеза в условиях удаления защитных групп с гетероциклических оснований олигомера (кони, аммиак, 55°С, 16 час.) образуется два олигонуклеотида примерно в равных количествах (два пика на профиле обращенно-фазовой ВЭЖХ). После гидролиза обоих соединений смесью фосфодиэстеразы (ФДЭ) и фосфомоноэстеразы (ФМЭ) змеиного яда и сравнения с контрольными смесями обнаружилось, что гидролизаты отличаются

Схема 12.

N-N

5'

тем. что в первом из них присутствует 2'-фтор-2'-лезоксиуридин, а во втором -арабиноуридин. Механизм этого превращения, мы полагаем, включает стадию образования ангидроуридина (см. схему 13).

Схема 13.

НО

Я - фрагмент олигонуклеотидной цепи

Таким образом, в результате проведенного синтеза удалось одновременно получить два гексануклеотида, содержащих на З'-конце модифицированные нуклеозиды - 2'-фтор-2'-дезоксиуридин (АСОСА1]л) и арабиноуридин (АСОСАаи).

Далее был осуществлен синтез олигонуклеотидных зондов с включениями от одного до четырех 2'-фторированных нуклеозидов (ип или Сп) в заданные положения олигонуклеотидной цепи. Во всех этих случаях после аммиачной обработки олигомеров были получены только целевые продукты с данными модификациями.

Наиболее перспективным подходом при решении проблемы региоспецифического расщепления РНК гибридазами представляется применение олигонуклеотидных зондов, позволяющих при комплексообразовании вычленить для направленного воздействия небольшой фрагмент макромолекулы РНК. Олигонуклеотиды, содержащие 2'-фтор-2'-дезоксинуклеозиды, были использованы в работах по поиску оптимальных структур зондов для региоспецифического расщепления РНК РНКазой Н из Е.соЧ на основе олигодезоксирибонуклеотвдов с минимальным числом модификаций углеводофосфатного остова зонда. Так, оказалось, что частичная замена 2'-дезоксинуклеозидов на 2'-фтор-2'-дезоксинуклеозиды (4 замены остатка ¿С на одиннадцатизвенный зонд) при сохранении четырехзвенного немодифицированного дезоксирибонуклеотидного блока обеспечивает региоспецифичность расщепления 5Б РНК рибосом Е.соИ

РНКазой Н (см. схему 14). Эффективность этого полхода была продемонстрирована также при направленном разрезании молекул 165 рибосомной РНК Е.со11. Олигонуклеотидные зонды, содержащие 2'-фтор-2'-дезоксинуклеозиды, имеют ряд преимуществ перед олигодезоксирибонуклеотидами с включениями рибозвеньев, использовавшимися нами для решения той же проблемы -региоспеиифического гидролиза 5Б РНК. Синтез 2'-фторсодержащих олигонуклеотидов относительно прост. Кроме того они обладают повышенной устойчивостью при щелочных и нейтральных значениях рН, а также к клеточным нуклеазам.

Схема 14.

(ИИ

5'г(. ,.ССиАОСССССиССиСС...)3' Т С в С О С С АС СА

1

У^.-ССиАОСОСООиСОиСС..,)]' Т С(Ю ОЮ ООА С С А

1

5' г(. ..АиСССАСАСиАССС...)3' С в С иле ипс А Т С

Стрелками обозначены гидролизуемые в РНК РНКазой Н фосфодиэфирные связи

4.2.2. Олигодезоксирнбонуклеотиды, содержащие иуклеозиды с обращенной конфигурацией заместителей при С2'- и СЗ'-атомах углеводного фрагмента

Комплексное решение проблемы антисенсовой биотехнологии подразумевает дизайн и синтез некоего олигонуклеотидного производного, которое давало бы устойчивый комплекс с НК-мишенью, проникало бы в клетку и существовало в ней определенное время и при этом не было бы токсичным. Кроме того желательно, чтобы синтез такого соединения был относительно простым. Наиболее распространенные в антисенсовой биотехнологии в настоящее время тио- и дитиофосфатные, алкилфосфонатные и амидофосфатные аналоги олигодезоксирибонуклеотидов наряду с положительными свойствами имеют ряд недостатков, таких как неспецифическое связывание с молекулами ДНК и белков

и сложность очистки для первых, плохая растворимость и чрезмерная гидролитическая устойчивость для вторых, чрезвычайно сложный синтез для третьих. Несмотря на то, что уже очень много модифицированных олигонуклеотидов претендуют на звание "антисенсов", идеального лекарства до сих пор не найдено. Мы предлагаем на наш взгляд более рациональный подход к решению одной из составляющих проблемы антисенсовой биотехнологии -устойчивости зондов к действию экзонуклеаз.

В ряду нуклеозидов с обращенной конфигурацией заместителей при СЗ'-атоме углеводного фрагмента 5'-0-диметокситритильное производное 1-(Р-0-2'-дезокситреопентафуранозил)тимина (хТ) (14) было получено из 5'-0-диметокситритилированного тимидина по методике, включающей промежуточную стадию образования, как было указано выше (см. схему II), 02,3'-ангидротимидина (12).

Синтез 1-(Р-0-3'-дезокситреопентафуранозил)пиримидиновых нуклеозидов (си и Ю описан японскими учеными (Ка\уапа ее а!., 1989), но задача получения компонентов олигонуклеотидного синтеза на основе Ш и 1С и включения их в олигонуклеотидную цепь в этой работе не ставилась. Нуклеозиды с инвертированной гидроксильной группой у С2'-атома при отсутствии ее у СЗ'-атома были получены в соответствии со схемой 15.

Схема 15.

р 2. М5С1 (20) НО ОН (21)

РуО-1 ?

Ь-О-^ КОН (МеОН)

у—р КаВН4 (МеОН)

М$0 ОРУ

НО—] ?

п

о о ок

м/ чх0

НО

в

О^

О

НО

и

в

, НО V

(22)

В = а) ига, Ь) Су*'

Ьг

Использование полученных из соединений' (14) и (22) амидофосфитных производных позволило синтезировать серию олигонуклеотидов, содержащих модифицированные звенья как по концам, так и внутри- олигомерной цепи.

Для успешного осуществления синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки хТ, Ш и 1С, время конденсации пришлось увеличить не только на стадии присоединения модифицированного звена, но и следующего за ним немодифицированного нуклеозид-З'-амидофосфита до 10 и 5 мин. соответственно (при стандартном времени конденсации - 1 мин.).

Таблица 2.

Некоторые характеристики ДНК-дуплексов, содержащих нуклеозиды с обращенной конфигурацией заместителей

у С2'- и СЗ'-атомов углеводного фрагмента

Шифр ДНК-дуплексы 5' З1 3- 5' Т.пл., °C (±1) h, % (±1)

I tUCACTTCTGAGtUT AGTGAAGACTC АА 45 18

U TCACTTCTGAGTT AGTGAAGACTCAA 48 23

ш tCCACCGCGtCT CCTGGTGGCGC GAGTG 55 12

[V tUACCACCGCGCtUC CCTGGTGGCGCG AGTG 58 16

V ACCACCGCGCT CCTGGTGGCGCGAGTG 63 14

VI tUCGTTCCTCCTGCGGGAAtUtU GTTGCAAGGAGGACGCCCTTTCCC 65 12

VII tUCGTTCCTCCTGCGGGAAtUtUT GTTGCAAGGAGGACGCCCTTTCCC 65 14

VIII CGTTCCTCCTGCGGGAAAG GTTGCAAGGAGGACGCCCTTTCCC 70 25

IX tUTTtUTTtUTTtUTTtUTTtUTT r (AAA AAA AAA AAA AAA AAA) 33 8

X Q^IJ*IJlf^ijl<JI Грip(pIJIIJIIJIJIIJIPp fp pip r (AAAAAAAAAAAAAAAAAA) 46 22

XI YTTTX^TT^TTTxTTTXTTTXT^T r (AAA AAA AAA AAA AAA AAA) 35 . 26

При попытке анализа нуклеотидной последовательности по методу Максама-Гилберта выяснилось, что олигонуклеотиды, содержащие З'-концевые нуклеозиды с инвертированными гидроксильными группами при атомах углерода сахарного остатка, не являются субстратами Т4-полинуклеотидкиназы и

5'-концевой гидроксил такого ол и го мера профосфорилировать не удается. Олигонуклеотиды, не несущие 5'-конневых модифицированных звеньев, фосфорилируются нормально. Эти модификации внутри олигонуклеотидной цепи при ссквенировании "не прочитываются". Радиоактивность отсутствует во всех четырех колонках геля.

Изучение термодинамической стабильности дуплексов с модифицированными звеньями в одном из тяжей (см. табл. 2) показало, что наличие концевых модификаций незначительно понижает Т.пл. дуплексов (сразн. дуплексы I и И, VII и VIII, табл. 2). Присутствие в олигонуклеотидной цепи множественных модифицированных звеньев хТ, tU приводит к существенной дестабилизации модифицированных дуплексов (сравн. дуплексы IX. X, XI, табл. 2).

Устойчивость олигонуклеотидов, содержащих концевые модификации, к действию нуклеаз в сравнении с немодифицированными олигодезоксирибо-нуклеотидами была изучена с использованием ферментов сыворотки крови, а также ФДЭ и ФМЭ змеиного яда. Степень гидролиза определяли методом ион-паркой 8ЭЖХ, используя в качестве внутреннего стандарта урияин. Ол'игомеры с концевыми модификациями в присутствии ферментов сыворотки крови за 3 ч гидролизуютея незначительно, в то время как контрольный ^модифицированный олигонуклеотид гидролизуется в этих условиях полностью.

На рис. 1 приведена типичная картина гидролиза ФДЭ змеиного яда модифицированного и немодифицированного олигонуклеотидов. При гидролизе природного субстрата через 25 минут образуются продукты частичного гидролиза при почтя полном исчезновении исходного олигонуклеотида. При ферментативном гидролизе модифицированного олигонуклеотида накопление частично гидролизованных продуктов не наблюдается и даже через три часа в реакционной смеси присутствует исходный олигомер.

Наличие (-ф-0-2'-дезокситреопентафуракозил)тимина и I-(P-D-3'-дезокситреопентафуранозил)пиримидиновых нуклеозидов на 3'- и 5'-кониах олигонуклеотидов повышает их устойчивость к действию экзонуклеаз, не препятствуя образованию устойчивого дуплекса с комплементарными участками мишеней. Таким образом, олигомеры, содержащие предложенные концевые модификации, приобретают свойства, необходимые для антисенсовых олигонуклеотидов.

Рис. 1. Контроль методом ион-парной ВЭЖХ процесса гидролиза ФДЭ змеиного яда олигонуклеотидов а) СОТТССТССТСССССАААО, б) ИДССТТССТССТССОООААШШТ. (Условия разделения см. стр. 7).

4.2.3. Олнгодезоксирибонуклеотиды, содержащие 2'-амино-2'-дезокскнуклеозиды

До сих пор речь шла о модифицированных нуклеозидах, которые будучи включенными в состав олигонуклеотидов, изменяли их физико-химические и биологические свойства, не меняя химических свойств олигомеров. В последнее время актуальной задачей становится получение одно- или двутяжевых ДНК, имеющих в своем составе группировку, реакционная способность которой отличалась бы от реакционной способности функциональных групп, присущих природным ДНК. Примером может служить замена природной межнуклеотидной диэфирной связи на тризамешенную пирофосфатную группировку, введение атома серы в гетероциклическое основание или концевых алифатических аминогрупп, присоединенных к олигонуклеотидам с помощью спейсеров различной длины. Пытаясь получить соединение с повышенной устойчивостью к экзонуклеазному гидролизу, которой обладают большинство 2'-модифицированных олигонуклеотидов, с одной стороны, и имеющее в своем составе химически активную группировку с другой, мы пришли к идее синтеза олигонуклеотидов,

содержащих 2'-ам«но-2'-дезоксинуклеознды. Синтез пиримидиновых 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов был описан (Hampton et al., 1966), однако уверенности в возможности получения олигонуклеотидов с такой модификацией у нас не было. Существовало опасение, что в условиях аммиачной обработки при удалении защитных групп 2'-аминогруппа будет реагировать с межнуклеотидным фосфатом, что приведет к разрыву фосфодиэфирной межнуклеотидной связи по аналогии с щелочным гидролизом олигорибонуклеотидов. Синтез в этом случае был бы осложнен подбором специфических защитных групп для 2'-аминофункции, стабильных к действию кони. аммиака. по аналогии с синтезом олигорибонуклеотидов. Тем не менее попытка получения олигодезоксирибо-нуклеотидов, содержащих 2'-амино-2'-дезоксиуридин (Un) и 2'-амино-2'-дезоксицитидин (С"), оказалась успешной. На схеме 16 приведена последовательность реакций, приводящих к образованию амидофосфитных производных 2'-амино-2'-дезоксипиримшшновых нуклеозидов, которые использовались в автоматическом олигонуклеотидном синтезе с увеличением времени присоединения этого модифицированного звена до (0 мин.

Схема 16.

носн2

но он

1) PMTrCI

2) (С6Н50)2С0

йМТЮСНг В

. к!^ 4) (cehsiap ii

НО NHz

3) LiN3

(20)

(23)

О

II

ОМТгОСНг

В

D CF3COC2H5

2) CI—Р:

bz

,N(iPr)2 "0(CH2)2CN

0 NHCCF3

1 11 P о

NC(CH2)20 N(iPr)2 (24)

В = ига, Су!

Полученные модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды представляют собой малоизученный класс соединений, и исследование их химических и физико-химических свойств представляет большой интерес, в том числе для определения возможных областей применения. Нами было обнаружено, что олигонуклеотиды, содержащие 2'-амино-2'-дезоксиуридин, устойчивы в условиях щелочного

гидролиза РНК (0,1 М №НС03, 5 мин, 95°, рН 11,25). По-видимому, аминогруппа 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов в отличие от 2-гидроксильной группы рибонуклеозидов не может атаковать атом фосфора с образованием циклического фосфамида. Этот факт подтверждается также устойчивостью 2'-аминосодержащих олигонуклеотидов в условиях их аммиачной обработки при удалении защитных групп.

Высокая реакционная способность 2'-аминогруппы урилина в составе олигонуклеотидов продемонстрирована реакциями данных олигомеров с флуоресцеинизотиоцианатом (Р1ТС) и ацилирования ангидридами карбоновой и дикарбоновой кислот. В результате реакции с Р1ТС были получены с выходами 90% производные олигонуклеотидов (ТТияТТ) и (ия1'111), имеющие характерные спектры в УФ-области с максимумами: 262,4; 475,6 и 264,4; 478,8 нм соответственно, что отвечает поглощению олигонуклеотидной и флуоресцеиновой частей.

Рис. 2. ВЭЖХ-анализ (ион-парный вариант) реакционной смеси, полученной при взаимодействии олигонуклеотида Тб(ипТ2)4 с FITC. (Условия см. стр. 7). Пики 1 - 4 соответствуют олигонуклеотидам, содержащим один, два. три и четыре остатка флуоресцеина. Условия реакции с FITC: к 2.0 ОЕгбо олигонуклеотида добавляли раствор 1 мг FITC в 150 мкл смеси 1М натрий карбонат-бикарбонатного буфера с рН 9,0, воды и диметилформамида в соотношении (5:8:2). Реакцию вели в течение 18 часов при комнатной температуре в темноте.

При взаимодействии 20-звенного олигонуклеотида Т8(ипТ2)4, содержащего четыре 2'-амино-2'-дезокеиуридиновых звена, с Р1ТС образуются четыре продукта, которые соответствуют реакции Р1ТС с одной, двумя, тремя и четырьмя аминогруппами олигонуклеотида, в соотношении 4, 11; 40; 45% соответственно (см. рис. 2).

Таблица 3.

Некоторые характеристики ДНК-дуплексов, содержащих

2'-амино-2'-дезоксинуклеозиды

Шифр ДНК-дуплексы 5' 3' 3' 5' Т.пл., °С (±1) И. % (±1)

XII АССАСпСССвСпТ сстввтс всвсс АвТО 58 20

хш АССАС"СССпвСпТ сстввтс вСО СО АСТС 48 12

XIV АССАСпспсспссПТ ССТССТС С СС Св АвТС 40 15

XV АССАССОСССТ сстсстссссссастс 63 14 •

XVI стасипсипссс ввАТСА вА вСвТ 31 13

XVII стасипсипССгС ссатса са сс ст 24 8

XVIII стастстсвс ссатсасассст 50 16

XIX САСТипСипсга АСТОАА СА С ТСАА - 15

XX САСипипСипсга автса а са с тсаа - ¡2

XXI САСТТСТСАС АСТСААСАСТСАА 48 23

ххи Т8(ипТ2)4/А22 22 24

XXIII та(ип*т2)^/а22 16 14

XXIV те (ип**т2) а22 28 11

XXV стасасассс ссатстстссст 53 14

XXVI СТАСаАпСаАпССС вСАТС Т С Т вСвТ 40 13

ип * - ацетилированный по 2'-аминогруппе 2'-амино-2'-дезоксиуридин I)" ** - флуоресцеиновое производное по 2'-аминогруппе 2'-амино-2'-дезоксиуридина

Ацилирование 2'-аминосодержащих олигонуклеотидов проводили уксусным ангидридом в боратном буфере (рН 8.5). Контроль за ходом реакции осуществляли с помощью ВЭЖХ в ион-парном варианте. В этих условиях 2'-аминогруппа 2'-амино-2'-дезоксиуридинсодержащих олигонуклеотидов ацилируется полностью, контрольный ^модифицированный олигонуклеотид остается без изменений.

Для характеристики внутримолекулярного стэкинг-взаимолействия в модифицированных олигонуклеотидах были изучены КД-спектры динуклеозидфосфатов 11"рТ и Три". Спектр 1_)"рТ (см. рис. 3) близок к суммарному спектру составляющих его мономеров, что свидетельствует о почти полном отсутствии межплоскостных взаимодействий гетероциклических оснований. Напротив, спектр Три" (см. рис. 3) имеет характерный экситонный тип, отличный от спектра невзаимодействующих компонентов. Эти результаты подтверждают дестабилизирующую роль 2'-аминонуклеозидов, включенных внутрь олигонуклеотидной цепи. Влияние 2'-аминогрупп в составе олигонуклеотидной цепи, приводящее к дестабилизации ДНК-дуплекса, может быть обусловлено их способностью протонироваться и образовывать внутреннюю соль с соседней межнуклеотидной фосфатной группой.

Рис. 3. Спектры КД: 1 - Три"; 2 - II "рТ; 3 - (11п+рТ). Температура 20°С; 5БС - буфер (0,15 М №С1. 0,015 М цитрат натрия. рН 7,25).

Для проверки данной гипотезы мы изучили термодинамическую устойчивость дуплексов при повышенном значении рН и с блокированными 2'-аминогруппами. Значения рКа аминогрупп 2'-амино-2'-дезоксиуридина и 2'-амино-2'-дезоксицитидина, полученные методом титрования, равны 7,4 (по более поздним данным П.Миллера (Miller et al., 1993) рКа аминогруппы в составе динуклеозидфосфата U"pU, определенное с помошью ЯМР-спектроскопии. равно 6.0). При исследовании термодинамической устойчивости этих дуплексов при рН 8,5 принципиальных изменений характера кривых плавления не наблюдалось. Далее рН буферного раствора не повышали, так как это снизило бы устойчивость дуплекса из-за сдвига равновесия между таутомерными формами гетероциклических оснований. В пользу предположения об образовании внутренней соли, как одной из возможных причин дестабилизирующего эффекта 2'-аминонуклеозидов в составе ДНК-дуплекса, говорит факт понижения температуры плавления дуплекса при снижении значения рН буферного раствора до 5,0 (Miller et al., 1993).

При блокировании аминогруппы оказалось, что 2'-ацетамидная 'группа не способствует стабилизации модифицированной двойной спирали (дуплекс XXIII. табл. 3). Дуплекс (XXIV, табл. 3), содержащий остаток флуоресцеина по 2'-аминогруппе 2'-амино-2'-дезоксиуридина, термодинамически более устойчив, т.е. флуоресцеин выступает в роли интеркапятора.

Природу дестабилизирующего влияния 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов на температуру плаааения ДНК-дуплексов могло бы прояснить в какой-то степени изменение конфигурации заместителей у С2'-атома углеводного фрагмента. С этой целью, а также для изучения влияния ориентации аминогруппы на ее реакционную способность мы осуществили синтез 9-((5-D-2'-aMHHO-2'-дезоксиарабинофуранозил)аденина (2'-аминоарабиноаденозина. аАп).

Синтез исходного нуютеозида и его амидофосфитного производного проводили в соответствии со схемой 17. Восстановление аз идо группы (29 —► 30) проводили с использованием в качестве восстановителя трифенилфосфина и последующим разложением реакционной смеси водой при нагревании. Этот факт важно отметить, т.к. в этих условиях реакция проходит наиболее эффективно, практически без образования побочных продуктов. Амидофосфит (34) был успешно введен в олигонуклеотидный синтез. При сравнении свойств

2'-аминоуридина, 2'-аминоцитидина и 2'-аминоарабиноаденозина в составе олигонуклеотидоз оказалось, что в реакциях с электрофильными реагентами (РТТС, уксусный ангидрид) они ведут себя одинаково активно.

Схема 17.

ьг 'Рг\

тгн Ade ^^ Ade л-»-« ^ Adebг

носнг уис1. (сн^а носн, , о ^.¿¡_осн .

2.СвН5СОС| и-О-д >Рг-.а-С1 • ■ - I

(25)

X

но он

3. ЫНдОН

но он

¡Рг

(26)

¡Рг—О ОН

(СРзБОгЬО

(27)

¡Рг

~р\ Ас1е

¡Рг-а—оснз |

Абе

Ч Ас1еЬг Ч

¡Рг-а—ОСНг N3 I ¡Рг—а—ОСНг МНа I

6 ]0 , о кз^ -

¡Рг-в!—О ОЭОгСРз ¡Рг——О

¡р! (28) ,р1 (29) „! (30)

¡Рг

НОСНг

ЫНг

Ьг

Ade

ОМТгОСНг

ОМТгС!

НО

(31)

Ade

ОМТгОСНг О

ЫНг| О | С^С-НН

СРаСОС2Н5

Ade

Ьг

НО <32)

НО (33)

омгюсн2 о

Г.Р.Г-ЫИ ! N

о

А

¡РггЫ 0(СН2)2СМ

МС(СН2)2Ох ¡РггЫ''

:Р—С!

¡Рг2МС2Н5

Было обнаружено, что наличие 2-аминоарабиноаденозина в составе олигонуклеотида обусловливает некоторое понижение температуры плавления ДНК-дуплекса по сравнению с ^модифицированным аналогом. Так, температура плавления десятизвенного дуплекса (40°С) оказалась на 13°С ниже температуры плавления соответствующего немодифицированного дуплекса (сравн. дуплексы XXV и XXVI, табл. 3). Сравнение влияния включений 2'-амино-2'-дезоксиуридина и 2'-аминоарабиноаденозина на термодинамическую устойчивость дуплекса показало, что последний вносит меньшие искажения в структуру ДНК-дуплекса:

температура плавления дуплекса той же первичной структуры, но с 2'-амино-2'-дезоксиурнднноиыми вставками оказалась на !9°С ниже температуры плавления природного дуплекса (сравн. дуплексы XVI и XVIII. табл. 3).

5. ДНК-дуплексы с ковалентно связанными цепями

Высокая реакционная способность 2'-аминогрупп в составе олигонуклеотидов натолкнула нас на идею, что такие структуры можно исполыовать не только для нерадиоактивного мечения олигонуклеотидов и присоединения различных репортерных групп, но и для соединения цепей ДНК-дуплекса прочной ковалентной связью. Дуплексы с ковалентно связанными цепями могут найти применение во многих молекулярно - биологических исследованиях, в том числе для изучения НК-белковых взаимодействий в тех случаях, когда функционирование фермента связано с расплетанием двойной спирали ДНК, для конструирования "ловушек" ДНК-связывающих белков. На сегодняшний день получение таких соединений сопряжено с рядом проблем: часто связи между тяжами нестабильны либо нарушают структуру' двойной спирали ДНК. Бифункциональные реагенты, используемые для образования связи между цепями дуплекса (например, псоралены. производные пирролов), обладают высокой химической активностью, но мной селективностью и сиквенс-специфичностью, дают примеси побочных продуктов, способны образовывать внутрицепочечные связи. Существует ряд трудностей и при получении ковалентно замкнутых по концам ДНК-дуплексов (гантелеобразных структур) - ближайших аналогов дуплексов с ковалентно связанными цепями.

Для соединения цепей дуплекса нами была выбрана реакция между 2'-аминогруппой, локализованной в одном из тяжей, и карбоксильной группой, вводимой ацилярованием ангидридом дикарбоновой кислоты 2'-амино-2'-дезоксин>клеозида комплементарной цепи, приводящая к образованию амидной связи и присутствии водорастворимого карбодиимида (см. схему 18).

Оказалось. однако, что получение 2'-амино-2'-дезоксипуриновых нуклеозидов является сложной задачей. Синтез таких нуклеозидов описан в литературе (Imasawa, Eckstein, 1979), их получали реакцией транс-гликозилирования (замещения гетероциклического .основания) из предварительно синтезированного 2'-амино-2'-дезоксиуриднна. Протекание данной реакции

неизбежно связано с образованием сложной смеси продуктов и, как следствие, с крайне низким выходом целевого соединения.

Схема 18.

Я10

0=Р—О"

Руг

Я30

I

0=Р—О"

1

+ но-с-(сн2)2-с~ын-(сна)2-с-<н ]

0 ЫНг

1

0=р—о" оя2

Я10

I

0=р—о о

о

0=Р-0'

' ,4

оя

с2н5м=с=ы(сн2)зы(снз)2- нс! рНб.О

я3о

I

0=Р—О"

I

0 ын—с—(снг)2—с—nn—(сньь-с-

о=р—о" о о о

1 2 оя2

Я1 - И.4 - фрагменты олигонуклеотидных цепей

0=Р-0'

I 4

ОЯ

Обойти эту проблему мы решили следующим образом. Вместо 2'-амино-2'-дезоксипуриновых нуклеозидов была использована ненуклеозидная вставка (см. схему 18). В данном случае приходилось считаться с некоторым искажением геометрии двойной спирали и, как следствие, снижением ее прочности, что связано с нарушением водородных связей в паре, где отсутствует одно из гетероциклических оснований. С другой стороны, использование такой замены нуклеозида дает ряд преимуществ. В отличие от 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов предложенное соединение - З-диметокситритилокси-г-ЛГ^-^-флуоренилметокси-карбонил)-2-аминопропионил)амино}пропанол-1 (39) можно синтезировать, используя совокупность простых химических реакций, протекающих с высокими выходами (см. схему 19).

Схема 19.

ЫН2-{СН2)2-С-ОН (35) | 0

1) РтосО-Г<.

О

С-СН2

С-СН2

«

О

2) НО—^^—N02

РтосЫН-(СН2)2-С-0

II

О

(37)

но—сн?—сн—сн2—он

' i

(36) ын2

1) СР3СООС2Н5

2) ОМТгС!

Ы02 + ОМТЮ-СН2—СН—СН2—ОН (38) 1ЧН2

ОМТЮ—СН2—СН—СНг—ОН

!

РтосЖ— (СН2)2-С-ЫН О

Немаловажным является также условие сохранения в структуре ненуклеозидной вставки расстояния в три углеродных атома между фосфатными группами (см. схему 18), что характерно для природных олигонуклеотидов, а также устойчивость данного соединения в процессе синтетических и постсинтетических обработок оли гону клеотида.

Карбоксильную группу вводили ацилированием ангидридом дикарбоновой кислоты предварительно включенной в состав олигонуклеотида аминогруппы. На основании анализа данных молекулярного моделирования было принято решение использовать янтарный ангидрид.

Первоначально попытка получения ДНК-дуплекса с ковалентно связанными цепями была предпринята с использованием двух 20-звенных ДНК-дуплексов (XXVIII). (XXIX) (см. схему 20). Различие между данными дуплексами заключается в том, что при образовании связи между тяжами в дуплексе (XXVIII) ацилированию подвергалась 2'-аминогруппа 2'-амино-2'-дезоксицитидина. тогда как в дуплексе (XXIX) в реакцию вступала аминогруппа, локализованная на ненуклеозидной вставке.

3'-TAGGATATTACGCGGGACGT-5' 5'-ATCCTATAATGCGCCCTGCA-3'

Схема 20. (XXVII)

3 - TAGGATATTACGC-0-CH2—CH-CH2-0-GGACGT -5'

NH 0 0

I II »

0=C-CH2-CH2-NH-C-CH2-CH2-C-0H

5 - ATCCTATAATGCG—O.

Cyt -NH2

—CCTGCA -3'

(XXVIII)

NJ

З'-TAGGATATTACGC-O—CH2-CH-CH2-O-GGACGT -5'

NH

I

0=C-CH2-CH2-Nhfe

Cvt О О

y II II

—NH—С—CH2-CH2-C-OH

5'-ATCCTATAATGCG—O^ —CCTGCA -3'

З'-TAGGATATTACGC—0-CH2-CH-CH2-0-GGACGT -5'

NH

I

0=C—CH2-CH2—NH

cyt 9 ?=0

(XXIX)

(XXVIIIе1)

5'-ATCCTATAATGCG—0

NH—C-CH2--CH2 [-CCTGCA-3'

N

При анализе методом ВЭЖХ в обоих случаях наблюдали появление продукта, по времени удерживания приблизительно соответствующего олигонуклеотиду, длина которого равна сумме длин двух исходных олигонуклеотидов. Продуктом реакции между цепями в каждом из дуплексов (XXVIII) и (XXIX) является один и тот же дуплекс (XXVIIIе1)* с ковалентно связанными цепями (см. схему 20). Однако в зависимости от структуры исходных олигонуклеотидов выход дуплекса (XXVIIIе1) существенно различался: в случае использования исходного дуплекса (XXIX) выход составил 3%, а когда реакция

* Надстрочный индекс "cl" (cross-linked) использован для обозначения ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями.

проводилась между олигонуклеотидами в дуплексе (XXVIII) - 26%. Существенное различие в выходе целевого продукта связано с тем, что рКа ¿'-аминогруппы 2'-амино-2'-дезоксицитидина в составе олигонуклеотида значительно ниже (см. стр. 33), чем рКа обычной первичной алифатической аминогруппы. В связи с этим в условиях реакции между цепями 2'-аминогруппа 2'-амино-2'-дезоксицитидина в значительной степени остается в непротонированной форме, что сказывается на ее нуклеофильности.

Для изучения влияния на эффективность реакции между тяжами в ДНК-дуплексе положения модифицированных звеньев друг относительно друга, их количества. нуклеотидного окружения, термодинамической устойчивости д\плекса-прелшественника были выбраны две базовые системы, образованные 25-звенными олигонуклеотидами (ДНК-дуплексы (XXX) и (XXXVI), таблица 4). Из синтезированных олигонуклеотидов были составлены восемь модифицированных ДНК-дуплексов (XXXI) - (XXXV) и (XXXVII) - (XXXIX) (см. таблицу 4) В одной из чепеи каждого дуплекса содержался 2'-амино-2'-дезок.синуклеозид. а во второй, комплементарной цепи, - ненуклеозидная вставка с локализованной на ней карбоксильной группой.

В оптимальных условиях (см. подпись к рис. 4) выход дуплексов (XXXIе1) -(XXXVе1). (XXXVIIе1) - (XXXIXе1) с ковалентно связанными тяжами для отдельных систем достигал 85%. Типичный профиль хроматографического разделения реакционной смеси после реакции между цепями дуплекса (XXXIII) приведен на рис. 4.

Значительное различие в выходе целевого продукта для 20-звенной и 25-звенных систем (26% и 85% соответственно) объясняется тем, что эффективность реакции образования дуплекса с ковалентно связанными цепями зависит в значительной степени от термодинамической устойчивости модифицированного дуплекса-предшественника. Выход дуплекса с ковалентно соединенными тяжами существенно выше при более высокой температуре плавления исходного модифицированного дуплекса. Действительно, если при температуре плавления дуплекса (XXVIII), равной 34°С, выход дуплекса (XXVIIIе1) составил 26%, то при температуре плавления дуплексов (XXXI) - (XXXV), (XXXVII) - (XXXIX) около 75°С выход дуплексов (XXXIе1) - (XXXVе1), (XXXVIIе') -(XXXIXе1) составил в среднем 80% (см. таблицу 4).

Таблица 4.

Исходные дуплексы Дуплексы с ковалентно связанными цепями

Обозначение 5' 3' 3' 5' Тпл, °С Обозначение Выход продукта, % Тпл, °С

XXVII ТССАССССССАТТАТАССАТ АССГССССССТААТАТССТА 63 - ~

XXVIII ТССАССг^СССАТТАТАССАТ АСаТСССпвСаТААТАТССТА 34 (XXVIIIе') 26 67

XXX ССаТАСАССССАСТТТСССАСТССС СССАТСТССССТСАААСССТСАССв 77 "

XXXI СССТАСАССССАСТТТСССАг^ТССС СССАТСТССССТСАААСССТипАССС 74 (XXXIе1) 52 84

XXXII СССТАСАССССАСТТТСССА г'-тссс СССАТСТССССТСАААСССТаАпАССС " (XXXIIе1) 55 ~

XXXIII СССТгЧЗАССССАСТТТСССАСТССС СССАипСТССССТСАААСССТСАССС 74 (XXXIIIе1) 82 85

XXXIV СССТ2"САССССАСТТТСССА2"ТССС СССАипСТССССТСАААСССТипАССС 70 (XXXIVе') 67. 87

XXXV ССвТА С2иССССАСТТТСССАСТССС СССАЦ"СТ ССССТвАЛАСССТСАССв 75 (XXXVе') 84 88

XXXVI СССТАСАССТСАСТТТСССАСТОаС СССАТСТСйАСТвАААСССГСАССС 78 -

XXXVII СССТАаАССТСАСТТТСССАг^ТССС СССАТСГССАСТСАААСССТипАССС 72 (XXXVIIе1) 40 85

XXXVIII СССТг^АССТСАСТТТСССАСТССС СССАХ)аС таЗАСТСАААСССТСАССС 73 (XXXVIIIе1) 75 86

XXXIX СССТ2°САС?СТСАС'ГТТСССА21;ТССС вСС Аи"С ГССАСТСАААСССТипАССС 69 (XXXIXе1) 62 88

Участок узнавания эндонуклеазы рестрикции А1н\ выделен курсивом.

С" - 2'-амиио-2'-дезоксицитидш1 2.с - иеиуклеозидная вставка с карбоксильной группой

У" - 2'-амиио-2'-дезоксиурилин аА" - 2'-амино-2,-дезоксиарабиноалсиозин

t. мин

Рис. 4. ВЭЖХ-анализ (ион-парный вариант): I) реакционной смеси, полученной при синтезе ДНК-дуплекса (XXXIIIе1) с ковалентно связанными цепями. 2) ДНК-дуплекса (ХХХШ) без добавления КДИ. Условия реакции между цепями: по 0,1 ОЕгьо комплементарных олигонуклеотидов растворяли в 37 мкл 0,05М МЭС-содержащего буфера, (pH 5,0, 0,02М хлорид магния), нагревали до 95°С, медленно охлаждали до 20°С и добавляли 37 мкл 0,4М раствора 1-этил-3-(3-диметиламино)пропилкарбодиимида в том же буфере. Реакцию вели в течение 48 часов при 20°С в темноте. (Условия разделения см. стр. 7).

Оказалось, что сдвиг модифицированных звеньев на два нуклеозида друг относительно друга в сторону З'-конца (сравн. дуплексы (XXXIIIе1) и (XXXVе1)) существенно не сказывается на эффективности реакции. Это означает, что в обоих случаях возникает благоприятная для протекания процесса ориентация реагирующих групп в едином реакционном "центре. С другой стороны, последовательность нуклеотидов, фланкирующая модифицированные звенья,

заметно влияет на выход целевого продукта (напр.. сравн. выходы дуплексов (XXXIе1) и (XXXIIIе1), (XXXVIIе1) и (XXXVIIIе1), см. таблицу 4). Причина этого явления, вероятно, связана с локальными сиквенс-зависимыми микроискажениями параметров двойной спирали исходного модифицированного ДНК-дуплекса, которые оказывают влияние на пространственное расположение реагирующих групп.

Замена 2'-амино-2'-дезоксиуридина на 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозин (инверсия аминогруппы в 2'-положении углеводного фрагмента, дуплекс (XXXII)) существенно не сказывается на выходе дуплекса с ковалентно связанными цепями.

Термодинамическая устойчивость дуплексов с включениями модифицированных звеньев во всех случаях оказалась пониженной по сравнению с немодифицированными дуплексами соответствующей первичной структуры (см. таблицу 4). Из данных таблицы 4 видно, что степень снижения температуры плавления модифицированных дуплексов по сравнению с природными аналогами зависит от длины и первичной структуры олигонуклеотидов, образующих дуплекс. Для дуплексов с ковалентно связанными цепями, напротив, наблюдали увеличение температуры плавления, которая оказалась выше температуры плавления не только соответствующих модифицированных дуплексов, но и немодифииированных дуплексов аналогичной первичной структуры.

Чем ниже термодинамическая стабильность модифицированного дуплекса, тем большее различие наблюдается в величинах температуры плааления между соответствующими модифицированными дуплексами и дуплексами с ковалентно связанными цепями.

Устойчивость дуплексов с ковалентно связанными цепями к действию смеси ФДЭ и ФМЭ змеиного яда в условиях исчерпывающего ферментативного гидролиза (56°С, 180 минут) оказалась существенно повышенной по сравнению с немодифицированными дуплексами и дуплексами, составленными из модифицированных олигонуклеотидов. При анализе гидролизата методом ион-парной ВЭЖХ было обнаружено, что в одинаковых условиях как природные, так и модифицированные дуплексы полностью гидролизуются до нуклеозидов, тогда как дуплексы с ковалентно связанными цепями не менее чем на 70% сохраняются без изменения. Столь незначительная степень гидролиза является результатом упрочняющего эффекта связи между цепями.

Для более полного исследования этого процесса было проведено сравнительное изучение реакции ферментативного гидролиза фосфодиэстеразой змеиного яла дуплекса (XXXIе1) с ковалентно связанными цепями и немодифицированного дуплекса (XXX) аналогичной первичной структуры (см, таблицу 4). Анализ реакционных смесей проводили метолом ион-парной ВЭЖХ, в качестве внутреннего контроля использовали уридин.

Пиролиз одноцепочечных олигонуклеотидов. в том числе модифицированных, в выбранных условиях (см. подпись к рис. 5) протекает с большой скоростью, модифицированные звенья не препятствуют гидролизу, происходит промежуточное накопление многочисленных продуктов частичного гидролиза различной длины, которые во времени также подвергаются ферментативному гидролизу.

В отличие от одноцепочечных олигонуклеотидов, хроматографический анализ смеси комплементарных олигонуклеотидов - компонентов дуплекса (XXX) осложнен неравновесным процессом ассоциации-диссоциации цепей (см. рис. 5а). Это проявляется в появлении двух уширенных пиков, один из которых соответствует смеси диссоциированных олигонуклеотидов, а другой ДНК,-дуплексу. В процессе ферментативного гидролиза наблюдается уменьшение илошадей обоих пиков с одновременным образованием многочисленных продуктов гидролиза различной длины. Таким образом, ферментативный гидролиз дуплекса (XXX) также протекает достаточно эффективно, хотя и несколько медленнее гидролиза одноцепочечных олигонуклеотидов.

Характер ферментативного гидролиза дуплекса (XXXIе') с ковалентно связанными цепями принципиально отличается как от гидролиза одноцепочечных олигонуклеотидов. так и от гидролиза немодифицированного дуплекса (XXX) (см. рис. 5а). Это выражается как в значительно меньшей скорости гидролиза, так и в накоплении продуктов частичного гидролиза определенной длины. Полного гидролиза дуплекса с ковалентно связанными цепями не происходит даже за три часа. Как оказалось, происходит сравнительно легкое отщепление двух - трех звеньев и накопление продуктов частичного гидролиза, укороченных только на три - восемь звеньев (см. рис. 56). Отсутствие более коротких продуктов гидролиза в течение трех часов свидетельствует о том, что процесс затормаживается после отшепления максимум восьми звеньев. В пользу такого предположения говорит также тот факт, что сумма площадей пиков исходного ДНК-дуплекса и продуктов

его частичного гидролиза, укороченных на три - восемь звеньев, убывает крайне незначительно в ходе всего процесса (3 11аса). Таким образом, наличие связи между цепями вызывает существенное торможение процесса ферментативного гидролиза ДНК-дуплекса.

Рис. 5. ВЭЖХ-анализ (ион-парный вариант) продуктов ферментативного гидролиза ДНК-дуплексов фосфодиэстеразой змеиного яда. (а) Ферментативный гидролиз немодифицированного дуплекса (XXX).

1 - исходный дуплекс, 2 - время гидролиза 5 минут, 3 - 10 минут, 4-20 минут, 5-40 минут, (б) Ферментативный гидролиз дуплекса (XXXIе1) с ковалентно связанными цепями. 1 - исходный дуплекс,

2 - время гидролиза 1 минута, 3-5 минут, 4-10 минут, 5-20 минут. 6-40 минут, 7-60 минут, 8-90 минут, 9 - ¡80 минут. Условия ферментативного гидролиза: 0,2 ОЕ260 олигонуклеотидного материала и 1,0 ОЕ260 уридина растворяли в 16 мкл 0,2 М Трис-НС1 буфера (рН 8,5, 0,04М МеС12х6Н20), добавляли 4 мкл раствора фосфодиэстеразы змеиного яда (1,0-10"4 ед.акт./мл). Реакционную смесь инкубировали при 37°С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы объемом по 4- мкл, реакцию в которых терминировали охлаждением жидким азотом. (Условия аналитического разделения см. стр. 7).

Сайт-специфичное расщепление ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями эндонуклеазой рестрикции А1и\, узнающей последовательность 5'-АОСТ/3'-ТССА и расщепляющей фосфодиэфнрную связь между дезоксигуанозином и дезоксицитидином, проводили для доказательства

44

способности полученных соединений выступать субстратами для ферментов, связывающихся с уникальными нуклеотидными последовательностями ДНК. а также для подтверждения структуры синтезированных соединений. Участок узнавания эндонуклеазы рестрикции Alul был заложен в первичную структуру дуплексов (XXXVI) - (XXXIX) (см. табл. 4). Положение связей между цепями относительно участка узнавания эндонуклеазы рестрикции Altil в ДНК-дуплексах определяет состав гидролизата. Образование олигонуклеотидов - продуктов гидролиза различной длины при расщеплении дуплексов (XXXVIIе1), (XXXVIIIе'), (XXXIXе1) с ковллентно связанными цепями и нативного дуплекса (XXXVI) иллюстрируется схемой 21.

Схема 21.

а) б) в) г)

Дуплекс (XXXVI) Дуплекс (XXXVIIе1) Дуплекс (XXXVIIIе1) Дуплекс (XXXIXе1) Alu I Alu I Alul Alu I

25

P*-

50 P*-

50 p*-

T~T

-p*

+ Alu /

+ Alu /

+ Alu I

+ Alul

S p-

8 p*

+ +

+ +

-P*

■P*

p* - l3-Pj фосфат

Продукты реакции ферментативного гидролиза анализировали методом электрофореза в 20% ПАЛ Г в денатурирующих условиях. При гидролизе ферментом А1и\ немодифицированного 25-звенного дуплекса (XXXVI) (схема 21а) образуются два 8-звенных и два 17-звенных олигонуклеотида. Поскольку оба олигонуклеотида, составляющие дуплекс, содержали 5'-кониевую 32Р-метку, на радиоавтографе наблюдали две полосы, соответствующие 8-звенному и 17-звенному о л! I го ну кл е от и д а м. При гидролизе дуплекса (XXXVIIе1) на радиоавтографе наблюдали 8-звенные и 34-звенные олигонуклеотиды (схема 216,

рис. 6, 3), при гидролизе дуплекса (XXXVIIIй) - 16 -звенные и 17-звенние олигонуклеотиды (схема 21в, рис. 6, 5), а при гидролизе дуплекса (xxxix1') -16-звенные и 34-звенныс олигонуклеотиды (схема 21г. рис. 6, 7). Как видно, состав реакционных смесей для всех дуплексов соответствует теоретической схеме 2!. Таким образом, показано, что присутствие ковалентных связей между цепями в полученных ДНК-дуплексах не препятствует их расщеплению эндонуклеазои рестрикции А1и[. Состав гидролизата подтверждает наличие поперечных связей между тяжами дуплекса и их положение относительно участка узнавания фермента.

12 3 4 5 6 7

-а

1 *

хс

е врв

Рис.6. Радиоавтограф

(электрофорез и 20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину) реакционных смесей, полученных при растеплении дуплексов (XXXVIIе1) (3), (XXXVIIIе1) (5). (XXXIXе1) (7) эндонуклеазон рестрикции А1и1. 1 - 25-звенный олигонуклеотид, 2, 4, 6 - дуплексы (XXXVII), (XXXVIII). (XXXIX) (контроли). Реакцию с

эндонуклеазон рестрикции А1и\ проводили в 20 мкл 0,01 М Трис-НС1 буфера (15 мМ МвС12, 0,15 М №С1, I мМ дитиотреитол). 0,03 ОЕ260 дуплекса нагревали до 95°С, медленно охлаждали до 20°С и инкубировали 2 ч при 37иС в присутствии 25 ед.акт. А1иI.

Данные о повышенной термодинамической стабильности синтезированных соединений и их устойчивости к нуклеазному гидролизу позволяют рекомендовать ДНК-дуплексы с ковалентно связанными цепями в качестве "ловушек" для НК-связывающих белков.

6. Заключение

Области использования полученных в работе модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов кратко суммированы в таблице 5.

Таблица 5.

Модифицированное звено, включенное в олигодезоксирибонуклеотид Области применения модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов

Полкэтиленгликоли, полиметилендиолы, производное тетрагидрофурана Выяснение роли отдельных гетероциклических оснований лвутяжевой последовательности ДНК во взаимодействии с ферментами рестрикции-модификации ficoRII. Mva\, 5joI1. Получение циклических олигодезоксирибонуклеотидов при соединении концов синтетических линейных олигодезоксирибонуклеотидов лигиро-ванием на комплементарной матрице.

5-метил-2'-дезоксицитидин, 5-бром-2'-дезоксиуридин, Ы6-метил-2'-дезоксиаденозин, 2'-дезоксиинозин Выявление возможных контактов при взаимодействии ферментов рестрикции £coRII. Mva\, 5joII с модифицированными участками узнавания.

2'-фтор-2'~дезоксиуридин, 2'-фтор-2'-дезоксицятидин, 1-(Р-0-3'-дезокситреопента- фуранозил)пиримидиновые звенья, 1-{|3-0-2'-дезокси- треопентафуранозил)тимин Конструирование олигонуклеотидных зондов для региоспецифического гидролиза РНК РНКазой Н из E.coli. Выяснение влияния концевых модификаций на устойчивость к действию экзонуклеаз.

2'-амино-2'-дезоксиуридин, 2'-амино-2'-дезоксицитидин, 2'-амино-2'-дезоксиарабино-аденозин Получение флуоресцентномеченных олиго-нуклеотидов. Синтез ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями.

3'- и/или 5'-концевые фосфатные группы Установление закономерностей химического лигирования под действием бромииана и карбодиимида, синтез функционально значимых протяженных фрагментов ДНК, синтез производных олигонуклеотидов по концевым фосфатным группам (алкил- и амидофосфатов), введение нерадиоактивных меток. Получение олигодезоксирибо- и олигорибонуклеотидов с активной тризамешенной пирофосфатной группировкой.

Таким образом, успешное развитие молекулярной биологии, генетической инженерии, создание лекарственных препаратов нового поколения невозможно на настоящем этапе без синтетических олигонуклеотидов, что стимулирует прогресс в методологии и технологии олигонуклеотидного синтеза. С другой стороны фантазия химиков, воплощающаяся в синтезе все более экзотических структур, инициирует развитие биохимических исследований на молекулярном уровне. Несмотря на то, что в данной работе приведено ограниченное число возможных модификаций из существующих в настоящее время и сфера их использования в прикладных областях не слишком широка, тем не менее взаимостимулируюшее влияние синтез - применение даже на примере данной работы становится очевидным.

7. Выводы

1. Разработана стратегия и создана синтетическая база для получения модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов. Разработана универсальная схема введения модифицированных звеньев в олигодезоксирибонуклеотиды в процессе автоматического химического синтеза. Модифицированные нуклеозиды или их аналоги встраивались в любое заданное положение олигомерной цепи с сохранением стандартных синтетических процедур без ограничения количества включаемых модификаций.

2. Предложены и разработаны методы получения олигодезоксирибонуклеотидов с 3'- и/или 5'-концевыми фосфатными группами. Полимерный носитель с р-оксиэтилсульфоновой якорной группой, сконструированный для этой цели, позволяет получать не только З'-фосфорилированные олигонуклеотиды, но и З'-алкилфосфаты олигорибо- и олигодезоксирибонуклеотидов.

3. Простые и надежные способы получения олигодезоксирибонуклеотидов с 3'- и 5'-концевыми фосфатными группами способствовали развитию метода химического лигирования, с помощью которого удалось синтезировать протяженные функционально значимые фрагменты ДНК, а также получить олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие химически активные тризамещенные пирофосфатные группировки, способные к ковалентному взаимодействию с молекулами белков.

4. Впервые получены олигодезоксприбонуклеотнды, содержащие остатки

1-([5 -П-3'-дезокситреопентафуранозил)пиримидиновых нуклеозидов. Введение таких модификаций, а также 1-([}-0-2'-дезокситреопентафуранозил)тимина по концам олигомерон повышает их устойчивость к действию экзонуклеаз и не приводит к существенной дестабилизации дуплексов модифицированных олигончклеотилов с комплементарными матрицами.

5. Разработаны методы эффективного синтеза и впервые получены олигодсзоксирибонуклеотиды. содержащие 2'-амино-2'-дезоксинуклеозиды: 2'-амино-2'-дезоксиуридин, 2'-амино-2'-дезоксицитидин и 9-((3-0-2'-амино-2'-дезоксиарабинофуранозил)аденин. Продемонстрирована высокая реакционная способность 2'-аминогрупп в составе олигонуклеотидов в реакциях с электрофильными реагентами. Показано дестабилизирующее влияние 2'-аминонуклеозилов на термодинамическую устойчивость ДНК-дуплексов.

6. Предложен новый эффективный метод синтеза ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями на основе модифицированных олигонуклеотидов. один из которых содержит 2'-амино-2'-дезоксинуклеозид. а второй - нснуклеозидную вставку с локализованной на ней карбоксильной группой. В оптимальных условиях выход ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями достигает 85ес. Показано, что:

а) разработанным методом можно получать ДНК-дуплексы с цепями, связанными в заранее заданных положениях двойной спирали, в том числе возможно получение ДНК-дуплексов с несколькими связующими звеньями между тяжами;

б) термодинамическая стабильность ДНК-дуплексов с ковалентно

связанными цепями и их устойчивость к действию экзонуклеаз существенно повышены по сравнению с немодифииированными аналогами;

в) наличие поперечных связей между тяжами ДНК-дуплекса не препятствует функционированию эндонуклеазы рестрикции А1и\, набор образующихся продуктов подтверждает наличие и положение связей между тяжами в полученных ДНК-дуплексах.

7. На примере получения олигодезоксирибонуклеотидов. содержащих 5-метил-2'-дезоксицитидин, 5-бром-2'-дезоксиуридин. М6-метил-2'-дезокси-аденозин и 2'-дезоксиинозин, продемонстрирована эффективность триэфирного и амидофосфитного методов для синтеза модифицированных по гетероциклическому основанию олигомеров.

8. Разработаны методы синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих ненуклеозидные вставки полиметилендиолов, полиэтиленгликолей. структурного аналога 1,2-дидезокси-0-рибозы - (2Я,3$)-2-оксиметилтетрагидрофуранола-3 и ациклического аналога 2'-дезоксигуанозина - 9-[Г-гидрокси-2'-(гидрокси-метил)этокси]метилгуанина. Показано дестабилизирующее влияние таких модифицированных звеньев на структуру ДНК-дуплексов.

9. Синтезирована серия олигонуклеотидных зондов, содержащих 2'-фтор-2'-дезоксипиримидиновые нуклеозиды. Показано, что 2'-фтор-2'-дезоксинуклеозиды эффективно включаются в олигомерную цепь стандартным амидофосфитным методом. Использование олигонуклеотидных зондов с включениями данных модифицированных звеньев позволило решить проблему региоспецифического расщепления РНК РНКазой Н из Е.соИ.

10. Все полученные в работе модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды оказались универсальными инструментами исследования механизмов действия НК-узнаюших белков: ферментов рестрикции-модификации £со1Ш, Mva\, &о11, урацил-ДНК-гликозилазы. транскрипционного фактора №-кВ, РНКазы Н из Е.соИ.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Потапов В.К., Вейко В.П., Волков Е.М.. Орецкая Т.С., Телеснина Т.Р., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Твердофазный триэфирный синтез олигонуклеотидов с использованием Ы.Р-защишенных дезоксирибонуклеозид-З-фосфатов. // Докл. АН СССР, 1981, Т. 260. N 3. С. 640-642.

2. Вейко В.П., Орецкая Т.С., Волков Е.М., Метелев В.Г., Романова Е.А., Потапов

В.К. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих З'-концевую фосфатную группу. // Химия природн. соедин.. 1984, N 5. С. 637-64!.

50

3. Rosenthal A.. Cech D„ Veiko V.P., Orezkaja T.S., Romanova EA., Elov A.A., Metelev V.G.. Gromova E.S., Shabarova Z.A. Chemische synthese von nonadesoxyribonucleotiden mit den abgewandelten basen uracil, 5-bromuracil und 5-methylcytosin nach dem triester verfahren. // Tetrahedron Letters. 1984, V. 25, N

39. p. 4353-4356.

4. Rosentha! A.. Shubert F.. Cech D.. Orezkaja T.S., Kuznetsova S.A., Shabarova Z.A.

Chemische synthese, Isolierung und Sequenzierung von tetradecadesoxyribonucieotiden mit den abgewandelten basen 5-fIuoruracil und 5-methylcytosin.// Biomed. Biochem. Acta, 1985, V. 44, N 10. P. 75-83.

5. Волков E.M., Ореикая T.C., Потапов B.K. Гидрофильные полимеры для обратимой иммобилизации олигонуклеотидов. // Химия природн. соедин., 1985, N 6, С. 849-850.

6. Krynetskaya N.F., Zayakina G.V., Oretskaya T.S., Volkov EM., Shabarova Z.A 01igodeoxyribonucleotide-3'-phosphate synthesis by selective cleavage of 3'-terminal uridine. // Nucleosides and Nucleotides, 19S6, V. 5, N 1, P. 33-43.

7. Грязнова О.И.. Долинная H.Г., Соколова H.И., Исагулянц М.Г., Метелев В.Г.,

Ореикая Т.С., Удллов Н.И., Шабарова З.А. Синтез и изучение термической устойчивости олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов со структурными аномалиями. // Биоорган, химия. 1986, Т. 2, N 1. С. 124-131. S. Королева О.Н.. Потапов В.К., Грязнов С.М., Ореикая Т.С., Метелев В.Г., Шабарова З.А. ДНК-полобные дуплексы, содержащие повторы. ХШ. Химико-энзиматический и химический синтез полимеров, кодирующих полипептид (Phe-AspV // Молекулярн. биология. 1986, Т. 20, вып. 2, С. 489-501. 9. Волков Е.М., Грязнов С.М., Крынецкая Н.Ф., Орецкая Т.С., Потапов В.К. Сравнительная характеристика методов получения олигорибонуклеотид-З'-фосфатов. // Химия природн. соедин., 1986, N 2. С. 228-234. ¡0. Шабарова З.А.. Вейко В.П., Долинная Н.Г., Друца В.Л., Метелев В.Г.. Ореикая Т.С., Пурмаль A.A. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. 111. Синтез концевых инвертированных повторов ISI-элемента. // Биоорган, химия. 1987. Т. 13. N 5. С. 628-642. 11. Исагулянц М.Г.. Ивановская М.Г., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. IV. Сравнительная характеристика образования природных и модифицированных

межнуклеотидных связей при матричной конденсации фосфоимидазолидов олигонуклеотидов. // Биоорган, химия, 1987, Т. 13, N 6, С. 777-785.

12. Кубарева Е.А., Громова Е.С., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации £coRH с синтетическими фрагментами ДНК. X. Гидролиз субстратов со структурными аномалиями. // Биоорган, химия, 19S7, Т. 13, N 9, С. 1205-1211.

13. Орецкая Т.С., Кубарева Е.А., Грязное С.М., Ломакин А.И., Потапов В.К. Изменение в регламенте синтеза олигодезоксирибонуклеотидов на автоматах синтезаторах "Виктория-2" и "Виктория-4М". // Химия природн. соедин.. i9s7, N 1, С. 153-155.

14. Кузнецова С.А., Кубарева Е.А., Орецкая Т.С., Долинная Н.Г., Крынецкая Н.Ф., Громова Е.С., Шабарова ЗА., Цех Д. Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации £coRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания. // Биополимеры и клетка, 1987, Т. 3, N 6. С. 283-289.

15. Орецкая Т.С., Крынецкая Н.Ф., Романова Е.А. 5'-Фосфоуридин как источник концевых фосфатных групп в олигонуклеотидах. // Химия природн. соедин., 1987, N 5, С. 731-734.

16. Pein C.D., Cech D„ Gromova E.S., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A., Kubareva E.A. Interaction of the Mva\ restriction enzyme with synthetic DNA fragments. // Nucleic Acids Res., 1987, Simp. Ser. N 18, P. 225-228.

17. Цытович A.B., Орецкая T.C., Долинная Н.Г., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Синтез олигонуклеотидов, содержащих З'-концевые нуклеозиды с обращенной конфигурацией сахара. // Химия природн. соедин., 1987, N 3, С. 421-425.

18. Cech D., Pein C.-D., Kubareva E.A., Gromova E.S., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A. The influence of modifications on the cleavage of oligonucleotide duplexes by fcoRII and Mva\ endonucleases. // Nucleosides and Nucleotides, 1988. V. 7. N 5,6, P. 585-588.

19. Metelev V.G., Zayakina G.V., Ryabushenko I.L., Krynetskaya N.F.. Romanova E.A., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A. Influence of probe structure on unique (regiospecific) cleavage of RNA by RNase H. // FEBS Letters, 1988, V. 226, N 2, P. 232-234.

20. Волков E.M., Романова E.A., Круг А., Орецкая T.C.. Потапов В.К.. Шабарова З.А. Автоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов с концевыми фосфатными группами. // Биоорган, химия, 1988, Т. 14, N 8, С. 1034-1039.

s?

2!. Krug A., Oretskaya T.S., Volkov E.M., Cech D., Shabarova Z.A., Rosenthal A. The behaviour of 2'-deoxy-2'-fluorouridine incorporated into oligonucleotides by the phosphoramidite approach. // Nucleosides and Nucleotides. 1989, V. 8, N 8. P. 1473-14S3.

22. Реинтамм Т.. Меллер У., Орецкая Т.С., Шабарова З.А., Ломакин А.И. Полуавтоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов с концевыми фосфатными группами гидрофосфорильным методом. // Биоорган, химия, 1990. Т. 16, N 4. С. 524-530.

23. Волков Е.М., Кубарева Е.А., Сергеев В.Н., Орецкая Т.С. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 1,2-дидезокси-0-рибофуранозу. // Химия природн. соедин., 1990, N 3, С. 417-419.

24. Романова Е.А.. Орецкая Т.С., Сухомлинов В.В., Крынецкая Н.Ф., Метелев

B.Г., Шабарова З.А. Гибридазное расщепление РНК. II. Автоматический синтез смешанных олигонуклеотидных зондов. // Биоорган, химия, 1990, Т. 16. N 10, С. 1348-1354.

25. Шабарова З.А., Меренкова И.Н., Орецкая Т.С., Соколова Н.И. Химические реакции в ДНК-дуплексах. XII. Новая стратегия сборки гена. // Биоорган, химия. 1990, Т. 16. N 9, С. 1287-1289.

26. Кубарева Е.А., Громова Е.С., Романова Е.А., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Особенности расщепления эндонуклеазами рестрикции Mval и £coRII субстратов, модифицированных по аминогруппам гетероциклических оснований. // Биосрган. химия. 1990, Т. 16, N 4, С. 501-506.

27. Меренкова И.Н.. Романова Е.А.. Соколова Н.И., Долинная Н.Г.. Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Получение ДНК-дуплексов, содержащих 2'-дезокси-2'-фторуридин и арабинозилурацил. // Химия природн. соедин., 1991, N 2.

C. 263-267.

28. Шмидт С., Кузнецова Л.Г., Романова Е.А., Ниманн А., Орецкая Т.С., Крынецкая Н.Ф.. Метелев В.Г., Шабарова З.А. Гибридазное расщепление РНК. IV. Олигонуклеотидные зонды, содержащие 2'-дезокси-2'-фторнуклеозиды и арабинофуранозилцитозин. // Биоорган, химия, 1991, Т. 17, N 6, С. 823-830.

29. Kubareva Е.А., Gromova E.S., Pein C.-D., Krag A., Oretskaya T.S., Cech D„ Shabarova Z.A. Oligonucleotide cleavage by restriction endonucleases Mva\ and £coRII: a comprehensive study on the influence of structural parameters on the

enzyme-substrate interaction. // Biochimica et Biophysica Acta. 1991. V. 10SS. P. 395-400.

30. Кузнецова Л.Г., Волков Е.М.. Романова Е.А., Ташлицкий В.Н., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 2'-амино-2'-дезоксиуридиновые звенья. // Биоорган, химия, 1991, Т. 17, N 9, С. 1289-1291.

31. Романова Е.А., Кузнецова JI.Г., Кубарева Е.А., Цытович А.В., Меренкова И.Н., Орецкая Т.С., Громова Е.С., Шабарова З.А. Синтез и свойства ДНК-дуплексов, содержащих 9-[ Г-гидрокси-2'-(гидроксиметил)этокси]метилгуанин. // Биоорган, химия, 1991, Т. 17, N 12, С. 1640-1648.

32. Волков Е.М., Кубарева Е.А., Ташлицкий В.Н., Орецкая Т.С. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 4-Ы-(£-аминогексил)-5-метилдезоксицитидин. // Химия природн. соедин., 1991, N 5, С. 698-704.

33. Shabarova Z.A., Merenkova I.N., Oretskaya T.S., Sokolova N.I., Skripkin E.A.. Alexeyeva E.V., Balakin A.G., Bogdanov A.A. Chemical ligation of DNA: the first non-enzymatic assembly of a biologically active gene. // Nucleic Acids Res., 1991. V. 19, N 15, P. 4247-4251.

34. Romanova E.A., Volkov E.M., Kuznetsova L.G., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A. Incorporation of point modifications into oligonucleotides during automatic synthesis. // Nucleic Acids Res., 1991, Symp. Ser., N 24, P. 232.

35. Кубарева E.A., Романова E.A., Орецкая T.C., Громова Е.С., Шабарова З.А. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 5-фтор-2'-дезоксицитидин. // Биоорган, химия, 1992, Т. 18, N 5, С. 748-750.

36. Schmidt S., Niemann A., Krynetskaya N.F., Oretskaya T.S., Metelev V.G., Suchomlinov V.V., Shabarova Z.A., Cech D. The use of oligonucleotide probes containing 2'-deoxy-2'-fluoronucleosides for regiospecific cleavage of RNA by Rnase H from Escherichia coli. // Biochimica et Biophisica Acta, 1992. V. ¡130, P. 41-46.

37. Меренкова И.Н., Долинная Н.Г., Орецкая T.C., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. XIV. Эффективность образования фосфодиэфирных связей между различными нуклеотидными звеньями. // Биоорган, химия., 1992, Т. 18, N 1, С. 85-91.

38. Кузнецова Л.Г., Романова Е.А.. Волков Е.М., Ташлицкий В.Н., Орецкая Т.С., Крынецкая Н.Ф., Шабарова З.А. Олигодезоксирибонуклеотилы, содержащие 2'-амино-2'-дезоксипиримидиновые нуклеозиды. // Биоорган, химия, 1993, Т. 19, N 4, С. 455-466.

39. Dolinnaya N.G.. Blumenfeld М., Merenkova I.N., Oretskaya T.S., Krynetskaya N.F., ivnnovskaya MG., Vasseur M., Shabarova Z.A. Oligonucleotide circularization by template-directed chemical ligation. // Nucleic Acids Res., 1993, V. 20, N 23, P. 5403-5407.

40. Мсренкова H.H., Орецкая T.C., Соколова H.H., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. XV. Влияние локальной структуры ДНК на эффективность химического лигирования. // Биоорган, химия, 1993, Т. 19, N 12, С. 1205-1214.

41. Орецкая Т.С., Долинная Н.Г., Меренкова И.Н., Крынецкая Н.Ф., Романова Е.А.. Волков Е.М., Блюменфельд М, Вассер М., Шабарова З.А. Синтез циклических олигодезоксирибонуклеотидов с ненуклеотидными вставками. // Биоорган, химия. ¡994, Т. 20, N 1, С. 63-66.

4?.. Королева О.Н.. Волков Е.М.. Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. XVI. Синтез ДНК-дуплексов, содержащих регулярно повторяющиеся поперечные ковалентные сшивки. // Биоорган, химия, 1994, Т. 20, N 1, С. 40-49.

43. Крынецкая Н.Ф., Чеботарь O.A., Ибрагим Х.К.Х., Романова Е.А., Ташлицкий В.Н., Орецкая Т.С., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Антисенсовые олигонуклеотиды. содержащие по 3'- и 5'-концам 1-(р-0-2'-дезокситрео-пентафуранозил)тимин. // Биоорган, химия, 1994, Т. 20, N 6, С. 669-675.

44. Орецкая Т.С., Ибрагим Х.К.Х., Волков Е.М., Романова Е.А., Ташлицкий В.Н., Шабарова З.А. Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие 1-(р-0-2'-дезокси-треопентафуранозил)пиримидиновые звенья. // Биоорган, химия. 1994, Т. 20, N S-9. С. 967-974.

45. Крынецкая Н.Ф., Алексеев Я.И., Белков В.М., Ибрагим Х.К.Х.. Ташлицкий

B.Н., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Взаимодействие РНКазы Н из E.coli с модифицированными гибридными дуплексами. 1. Дуплексы, содержащие модификации по углеводному остатку. // Биоорган, химия, 1994, Т. 20, N И,

C. 1218-1225.

46. Petrauskene O.V.. Gromova E.S., Romanova E.A., Volkov E.M., Oretskava T.S.. Shabarova Z.A., DNA duplexes containing methylated bases or non-nucleotide inserts in the recognition site are cleaved by recognition endonuclease R.£ccRII in the presence of canonical substrate. // Gene. 1995, V. 157, N 1 and 2, P. 173-176.

47. Sheflyan G.Ya., Kubareva E.A., Volkov E.M., Oretskaya T.S., Gromova E.S.. Shabarova Z.A. Chemical cross-linking of Aival and £coRM enzymes to DNA duplexes containing a monosubstituted pyrophosphate internucleotide bond. // Gene,

1995, V. 157, N 1 and 2, P. 187-190.

48. Анцыпович С.И., Волков Е.М., Ореикая Т.С.. Романова Е.А., Ташлицкий В.Н.. Блюменфельд М., Шабарова З.А. Синтез модифицированных олигонуклеотидов и получение из них дуплекса с ковалентно связанными цепями. //Биоорган, химия, 1995, Т. 21, N 10, С. 774-780.

49. Бревнов М.Г., Кубарева Е.А., Волков Е.М., Романова Е.А., Ореикая Т.С.. Громова Е.С., Шабарова З.А. Влияние точечных модификаций углеводофосфатного остова ДНК на функционирование эндонуклеаз рестрикции fcoRII, Aival, BstNl. // Молекулярн. биология, 1995, Т. 29, N 6, С. 1294-1300.

50. Antsypovich S.I., Oretskaya T.S., Volkov Е.М., Romanova E.A., Tashlitsky V.N., Blumenfeld M., Shabarova Z.A. Synthesis of modified oligonucleotides and production of duplexes with covalently linked chains. // Nucleosides and Nucleotides.

1996, V. 15, N 4, P. 923-936.

51. Анцыпович С.И., Орецкая T.C., Романова E.A., Волков Е.М., Ташлицкий В.Н.. Вассер М., Шабарова З.А. Синтез и свойства ДНК-дуплексов с ковалентными связями между тяжами. // Биоорган, химия, 1996, Т. 22, N 4, С. 264-268.

52. Antsypovich S.I., Oretskaya T.S., Romanova Е.А., Volkov E.M., Tashlitsky V.N., Vasser M., Shabarova Z.A. Synthesis and properties of cross-linked DNA duplexes. // FEBS Letters, 1996. V. 378, P. 224-226.

53. Alexeev Y.I., Krynetskaya N.F., Tashlitsky V.N., Oretskaya T.S, Dolinnaya N.G., Morvan F„ Rayner В., Malvy C., Shabarova Z.A. Interaction of E.coli RNAse H with hybrid duplexes containing 2'-deoxyxylothymidine, 2'-deoxy-2'-F- or alpha-thymidine. // Nucleosides and Nucleotides, 1996, V. 15, N 9. P. 1545-1558.