Кооперативное взаимодействие олигонуклеотидов на комплементарных ДНК-последовательностях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

АДИНА-ЗАДА АБДУССАЛАМ

КООПЕРАТИВНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ НА КОМПЛЕМЕНТАРНЫХ ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель д.х.н. Фёдорова О. С.

V

Новосибирск-1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 3

Глава I. Физико-химические аспекты кооперативных взаимодействий в двух- и трехцепочечных комплексах нуклеиновых кислот (обзор литературы). 7

1. Количественные аспекты кооперативных взаимодействий в двуспиральных комплексах нуклеиновых кислот с одноцепочечным разрывом. 7

2. Изучение термодинамики образования трехцепочечных тандемных комплексов между олигонуклеотидами и ДНК с помощью метода "количественного аффинного расщепляющего титрования". 20

3. Заключение. 35

Глава II. Экспериментальная часть. 37

Глава III. Теоретические основы метода метода комплементарно-адресованного модифицирующего титрования (KAMT). 43

1. Специфичность узнавания нуклеиновых кислот олигонуклеотидами и

их производными. 43

2. Теоретические основы метода KAMT 45

3. Использование метода KAMT для определение параметров кооперативности.

49

Глава IV. Определение параметров кооперативного взаимодействия олигонуклеотидов методом комплементарно-адресованного модифицирующего титрования (KAMT).

1. Определение методом KAMT параметров кооперативности в тандеме из трех олигонуклеотидов с эффекторами, содержащими остатки N-(2-гидроксиэтил)феназиния). 57

2. Исследование процессов взаимодействия эффектора Ei с мишенью

(Т26) методами задержки в геле и термической денатурации. 64

3. Влияние структуры мишени на параметры кооперативности; контактная и неконтактная кооперативность. 67

4. Подтверждение особенностей вторичной структуры мишени с помощью самомодификации. 76

Глава V. Влияние модифицированных концевых нуклеотидов в области контакта олигонуклеотидов в тандемном комплексе и структуры мишени на величины параметров кооперативности. 82

1. Влияние структуры стыка олигонуклеотидов в тандемном комплексе

на величины параметров контактной кооперативности 82

2. Факторы, влияющие на величины контактной и неконтактной кооперативности; обсуждение возможности дискриминации ошибочных оснований в нуклеиновых кислотах с помощью тандемов олигонуклеотидов. 94

Выводы. 105

Список литературы. 107

ВВЕДЕНИЕ

Как известно, стэкинг-взаимодействие гетероциклических оснований нуклеиновых кислот дает существенный энергетический вклад при формировании двух- и трехцепочечной структуры олиго- и полинуклеотидов. Природа этих взаимодействий не зависит от длины нуклеотидной цепи. Так, в водных растворах даже мононуклеозиды способны образовывать "стопки" за счет "вертикальных" взаимодействий с характерными величинами изменения свободной энергии диссоциации, не превышающими 1.5 ккал/моль. Природа сил, способствующих стэкинг-взаимодействию, несомненно связана с взаимодействием индуцированных диполей, образованных системой я-электронов оснований. Поскольку стэкинг-структуры наиболее стабильны в водных растворах, то это приводит многих исследователей к выводу о том, что гидрофобные взаимодействия играют важную роль в стабилизации стэкинговых структур. С другой стороны, наличие собственных дипольных моментов и проявление лондоновских дисперсионных сил дают заметный эффект, который, в частности, определяет различие энергий взаимодействий различных пар оснований.

Уже в 1966 году было обнаружено, что пуриновые нуклеозиды могут образовывать тандемы на комплементарном полинуклеотиде [1]. Аналогичным образом тандемные структуры образуют олиго нуклеотиды [2]. Причиной образования тандемов являются кооперативные взаимодействия, обусловленные стэкингом гетероциклов соседних компонентов тандема. Это свойство было использовано Корана при создании им химико-ферментативного метода синтеза генов для соединения коротких олигонуклеотидов в один, более длинный с помощью ДНК-лигазы [3]. Разработанный им подход и на сегодняшний день лежит в основе завершающих этапов синтеза генов и их встраивания в плазмиды для последующего клонирования. В дальнейшем в большом цикле работ,

выполненных Шабаровой и сотрудниками, был разработан аналогичный метод химического лигирования олигонуклеотидов с помощью водорастворимых карбодиимидов или бромциана, позволивший в конечном итоге осуществить первый чисто химический синтез гена [4]. В работах Зарытовой с сотрудниками было показано, что эффективность модификации нуклеиновой кислоты-мишени реакционноспособными производными олигонуклеотидов (комплементарно-адресованной модификации) может быть существенно повышена, если фланкировать адресованный реагент производными олигонуклеотидов, комплементарными соседним участкам нуклеиновой кислоты-мишени и несущими стабилизирующие дуплекс остатки феназиния [5,6]. Такие вспомогательные производные олигонуклеотидов были названы эффекторами. При использовании для модификации алкилирующей группы - 1Ч-2-хлорэтиламино-]Ч-метиламинофенильной группы (далее ЯС1) на примере модификации 303-звенного однонитевого фрагмента ДНК, содержащего три одинаковых тетрануклеотидных последовательности было показано, что ЯО-производное комплементарного тетрануклеотида можно избирательно направить на любой из этих участков, варьируя набор добавляемых эффекторов в соответствии с последовательностями, прилегающими к идентичным сайтам модификации [7]. В дальнейшем тандемные системы были использованы для осуществления направленной модификации нуклеиновых кислот реагентами, содержащими фотоактивируемые группы [8] и каталитически активные в реакциях окисления молекулярным кислородом металлокомплексные группы: РеЕБТА [9] и Ре-блеомицин [10]. В работах Власова с сотрудниками было показано, что сближение на комплементарной матрице двух олигонуклеотидов, один из которых несет фотоактивную перфторазидо-бензоильную группу, а второй - фотосенсибилизирующий остаток пирена, позволяет осуществлять фотоафинную модификацию олигонуклеотида мишени с

существенно более высокой эффективностью и при использовании более длинноволнового облучения, чем при модификации одним фотоактивным реагентом [11, 12]. Недавно для секвенирования нуклеиновых кислот методом Сэнгера было предложено использовать тандемы коротких олигонуклеотидов в качестве "составных" праймеров [13, 14]. Таким образом, тандемные структуры, образуемые олигонуклеотидами или их производными на комплементарной матрице, уже нашли применение для решения ряда важных задач биоорганической химии.

При окислительной деструкции двунитевых ДНК с помощью Fe2+EDTA-

производными олигонуклеотидов, способных к образованию триплексов [15], и при алкилировании одноцепочечных мишеней RCl-производными [16] было обнаружено, что эти процессы в тандемах ошибок в матрице более чувствительны к наличию ошибок в матрице - мисмэтчей (от английского mismatch), чем при использовании единого протяженного олигонуклеотида, комплементарного тому же сайту.

Таким образом, как и любое другое фундаментальное явление, этот тип взаимодействий используется в различных прикладных молекулярно-биологических задачах. Одной из важнейших на сегодняшний день является задача создания технологичного и надежного метода диагностики геномных последовательностей с целью выявления одиночных мутаций. При использовании олигонуклеотидов в качестве адресующих частей биологически или химически активных коньюгатов основной проблемой является неоднозначность комплексообразования между олигонуклеотидным реагентом и мишенью (ДНК или РНК). Одним из путей решения этой проблемы является использование олигонуклеотидов-эффекторов (или любых других лигандов), создающих энергетические (за счет дополнительных стэкинг-взаимодействий) или

конформационные преимущества для реагента при связывании с НК мишенью в данном уникальном сайте. Определяемая общим понятием "кооперативная", эта система может быть количественно охарактеризована на основе общих термодинамических подходов. Систематизируя известные на сегодняшний день количественные данные по кооперативным свойствам комплексов нуклеиновых кислот как дуплексов, так и триплексов, можно сделать выводы о принципиальных возможностях данного подхода и оценить наиболее перспективные пути его развития.

Получение количественных характеристик кооперативных взаимодействий и исследование факторов, влияющих на эти характеристики, является важной физико-химической задачей. В настоящей работе для этой цели нами был разработан метод, основанный на комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот реакционноспособными производными олигонуклеотидов и исследованы некоторые факторы, влияющие на эффективность кооперативного взаимодействия олигонуклеотидов: структура области стыка олигонуклеотидов, наличие некомплементарных или химически модифицированных нуклеотидов.

Глава I

Физико-химические аспекты кооперативных взаимодействий в двух- и трехцепочечных комплексах нуклеиновых кислот (обзор литературы).

1.1. Количественные аспекты кооперативных взаимодействий в двуспиральных комплексах нуклеиновых кислот с одноцепочечным разрывом.

В настоящее время очень мало статей посвящено определению количественных термодинамических характеристик кооперативных взаимодействиях в дуплексах с одноцепочечным разрывом. Практически все величины кооперативности получены косвенным путем по измерению температурных зависимостей различных физических параметров дуплексов. Модель "двух состояний" в данном случае не может быть использована в принципе. В противном случае результаты отражают несоответствие формальной модели реальной исследуемой системе [17].

В работе [18] исследовались как термодинамические, так и структурные свойства "тандемного" дуплекса. Изучались характеристики различных дуплексов, в частности, интактного и "тандема", образованных олигонуклеотидами I, pi (с 5'-фосфатом), II, III, 1*11 (сшитый pi и II). Химсдвиг ароматических протонов в 2D-ЯМР-спектрах в зависимости от температуры позволил рассчитать термодинамические параметры комплексообразования в рамках модели "двух состояний" с учетом стэкинга оснований олигонуклеотидов в одноцепочечном состоянии.

III

II

1 3 5 7 9 11 5' d(AGCCGTACTGCA) 3' d(TCGGCATGACGT) 24 22 20 18 16 14

d(TGACGT) 5' 5' d(AGCCGTACTGCA) 3' d(TCGGCA)

1*11

I или pl

Интерпретация результатов была усложнена образованием частично самокомплементарного дуплекса с двумя СТ-мисматчами, концевые АА- пары которого вносят существенный стабилизирующий эффект.

Кооперативное взаимодействие проявлялось в изменении доли димера III в форме (III+III) относительно дуплексов (III+I), (III+II) и полного "тандема" (III+I+II), а именно, 15, 30 и 0%, соответственно. "Тандем" полностью подавлял образование несовершенного самокомплементарного дуплекса (III+III) в результате проявления кооперативности. Анализ ЯМР-спектров исследованных комплексов показал, что наибольшие изменения химсдвигов ароматических протонов наблюдаются для оснований, фланкирующих одноцепочечный разрыв в "тандеме". В целом его структурные параметры близки к B-форме ДНК, причем искажения существенно меньше для (III+pI+II)- с 5'-фосфатом, чем (Ш+1+И)-"тандема" по сравнению с интактным дуплексом (Ш+1*И).

Авторами получены следующие величины АН и АS комплексообразования "тандемного" (III+I+II) и интактного (111+1*11) дуплексов, равные -312 и -356

5' d(AGC-C-GTAC-T-GCA) (III+III) 3' d(ACG-T-CATG-C-CGA)

кДж/моль; -869 и -984 Дж/моль/К, соответственно. Разница в изменении энтальпии (+44 кДж/моль) означает фактически полное отсутствие стэкинга в разрыве, что демонстрирует также несоответствие расчетной модели (рассматриваются равновесные состояния только полного "тандема" и свободных олигонуклеотидов) реальной системе.

В работе [19] представлены калориметрические и спектральные данные для вторичной структуры олигонуклеотида типа "гантель" или двойная шпилька с одноцепочечным разрывом в дуплексной части.

24-мер "гантель"

5

Ф 'Г

ТТССТТТТ ООААТТСС ТТТТ ООАА ^^ т ^АА-ТТСС Т

ТтССТТ АА£ЮтТ \

Микрокалориметрическими измерениями было показано, что АНкал образования "гантели" равна -54 ккал/моль, а дуплекса, образуемого самокомплементарным октануклеотидом ё(ССТТААОО), структурно соответствующим центральной части "гантели", -58 ккал/моль. Такие же величины получены из оптических кривых плавления. На основании этих данных сделан вывод о существовании стэкинг-взаимодействия оснований в одноцепочечном разрыве. При фосфорилировании 5'-конца 24-мера энтальпия комплексообразования "гантели" резко снижается до -45 ккал/моль (данные получены только из оптических кривых плавления). Термостабильность "гантели" после фосфорилирования также снижается на величину АТт, которая линейно уменьшается с ростом в

диапазоне -3 4- 0 :

с!ДГт/с11ё[Ма+] = -1,9 (°С). (1)

При экстраполяции этой зависимости до |ТУа+] = 1 М величина А Тт становится

близкой к нулю. На основании этого авторы сделали вывод об электростатической природе дестабилизирующего влияния 5'-концевого фосфата на структуру в области разрыва. Более подробные заключения следуют из термодинамических данных. Разность числа связанных противоионов М+ олигонуклеотидами в комплементарном комплексе и одноцепочечном состояниях (Дп) зависит от равновесной константы комплексообразования К согласно уравнению [20]:

(дЫК / д 1п[М+])Т = Дп . (2)

Уравнение (2) может быть преобразовано к виду:

йТт /ё 1ё[М+] = (2,ЗКГт2/Д# °пара)Д1 , (3)

где АН °пара" изменение энтальпии при комплексообразования двух соседних пар;

А[ - изменение числа ассоциированных противоионов в пересчете на один межнуклеотидный фосфат дуплексной части. Формула (3) была применена для анализа термодинамических параметров, полученных из оптических кривых плавления (таблица 1). Согласно этим данным, 5'-концевой фосфат не включен в структуру дуплекса. Более того, термодинамические данные и расчеты методом молекулярной механики показывают, что вне стэкинга в разрыве находится и 5'-концевой тимидин. За счет этого снижается энтальпия комплексообразования на 6 ч- 9 ккал/моль и свободная энергия - на 0,4 0,5 ккал/моль при физиологической ионной силе раствора.

Таблица 1. Термодинамические параметры образования двойной "шпильки" дефосфорилированным 24-мером (-) и содержащим 5'-фосфат (+) [19].

мМ Тщ °с -АН ун, ккал/моль -Ав УН, кал/моль/К ЛС37, ккал/моль М

+ + + + +

2.44 37.1 31.6 51.5 42.2 166.0 138.8 -0.04 +0.83 0.090 0.083

8.40 42.9 38.2 55.0 44.8 174.0 143.9 -1.06 -0.19 0.092 0.085

33.6 49.4 46.3 57.4 47.2 178.0 147.7 -2.22 -1.41 0.092 0.085

100 55.3 53.9 53.3 49.4 162.3 151.0 -2.99 -2.59 0.083 0.085

300 61.2 60.5 55.5 49.7 166.0 149.0 -4.04 -3.51 0.083 0.082

Факт дестабилизации З'-концевым фосфатом отмечен и в случае образования конкатемеров олигомером ё(ТОСАТТАТАА) (термодинамические исследования не проводились) [21]. Неоднозначность выводов о влиянии концевого фосфата на кооперативные свойства дуплексов с одноцепочечным разрывом и данные о стабилизирующих свойствах концевого фосфата в обычном дуплексе свидетельствуют о сложном комплексе взаимодействий в "тандемных" структурах, связанных не только с электростатическими силами, но и с гидрофобными свойствами оснований, стэкингом и обменом иминопротонов концевых пар с растворителем.

С точки зрения строгости подходов к расчету термодинамических параметров комплексообразования кооперативных комплементарных комплексов типа олигомер-полимер большой интерес представляет экспериментальная работа Тс'о и соавторов [22]. Данная статья содержит практически полный экспериментальный материал, позволяющий получить величины констант комплементарного и кооперативного взаимодействий в системе о%о-(1)б_ ] з+ро1у-(С). Расчеты

основаны на теоретических разработках Дэймла [23] и Крозерса [24], описывающих методами статистической термодинамики образование олигомер-полимерных комплексов. Методами УФ- и КД-спектроскопии была показана идентичность вторичной структуры вышеуказанных комплексов и полимер-полимерного аналога. Используя УФ-кривые плавления в качестве исходных данных, авторы рассчитали величины равновесной константы К, изменения энтальпии и энтропии (АН, АЗ) образования одной комплементарной пары и константу образования первой пары олигомера на полимере рядом "стык в стык" с уже образованным ранее двуспиральным участком К'.

......I 1 I I I I К'К ...... ^^^ к ^гГО

ММ11 + ^ 1111М гОх в 11ММ гТ^ I г г I I I И I I I 1 I I I ГI Г ГI ГI I I I I I I I Г I' Г Г Г ГI" ГI I I I

Очень кратко методы расчетов можно описать следующим образом. Зависимость Гт от концентрации несвязанных олигонуклеотидов Ст и длины олигонуклеотида

п описывается уравнениями:

1 !Тт = МТ\ + Я Ьп(Х'Ст)/пАЯ, (4)

(д Ьп(Ст)/ 5 п)Тт = -Ъп(Кт), (5)

где Т\ - температура, при которой К = 1 ( поскольку процесс �