Термодинамика стабилизированных комплексов олигонуклеотидов: влияние интеркалирующих красителей и кооперативные взаимодействия тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

' } 5 * Р А г»

. 1 8 и.;

~ .'{¿Ц Б'СЗ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.133.6.088.53:543.422.25

Лохов Сергей Георгиевич

ТЕРМОДИНАМИКА СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ КОМПЛЕКСОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ: ВЛИЯНИЕ ИНТЕРКАЛИРУЮЩИХ КРАСИТЕЛЕЙ И КООПЕРАТИВНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных соединений и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск, 1995 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель - академик Кнорре Д.Г.

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Малыгин Э.Г кандидат физико-математических наук Полетаев А.И.

Ведущая организация : МГУ, институт физико-химической биологам им. A.M. Белозерского (г. Москва)

(3

Защита состоится: 27 декабря 1995 г. в \/ часов на заседании совета по защите диссертаций К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск -90, проспект акад. Лаврентьева 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан "А Ь " _1995 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат химических наук

, Федорова О.С.

ii<f<rt

Актуальность проблемы. Короткие олигонуклеотиды (адреса), и производные на их основе, несущие реакционноспособные группы, можно рассматривать в качестве перспективных молекулярных инструментов или зондов для направленного воздействия и изучения заданных участков ДНК- и РНК-мишеней. К основным недостаткам коротких олигонуклеотидов следует отнести: 1) низкую эффективность образования комплементарного комплекса адрес-мишень; 2) низкую сайт-специфичность взаимодействия с НК-мишенью, вследствие увеличения на мишени числа комплементарных адресу сайтов связывания. Решение первой проблемы заключается в ковалентном присоединении к олиго-нуклеотиду химических групп, имеющих высокое сродство к дуплексной структуре НК, в частности, интеркалирующих красителей. Решение проблемы сайт-специфичности комплексообразования было предложено в НИБХ СО РАН на основе принципиально нового, так называемого "эффекторного" подхода. Данный метод основан на кооперативном взаимодействии олигонуклеотидов-"эффекторов" с олигонуклеотидом-адресом, сайты связывания которых расположены "тандемом" на НК-мишени. Сочетание обоих подходов представляет собой перспективную стратегию развития направленного воздействия и изучения структуры НК.

Однако, как показали результаты экспериментов, термодинамическая стабильность подобных комплексов зависит от множества структурных параметров, характерных для каждого конкретного случая. Поэтому, создание целостной термодинамической картины влияния различных структурных факторов на стабильность дуплексов и "тандемных" комплексов, образованных с участием олигонуклеотидов, содержащих остатки полиароматических красителей представляет как теоретический, так и практический интерес. Цель работы. Целью данной работы являлось: 1) сравнительное исследование влияния остатков интеркалирующих красителей М-(2-гидроксиэтил)феназиния и 2-Ы-(3-амино-пропионил)этидня, ковалентно присоединенных к 5'- или З'-концевому фосфату олиго-дезоксирибонуклеотидов, на термодинамическую стабильность образуемых ими комплементарных дуплексов; 2) определение влияния остатков интеркалирующих красителей, присоединенных к олигонуклеотидам на термодинамические параметры кооперативного взаимодействия этих производных олигонуклеотидов при образовании "тандемного" ком-пекса с общим комплементарным олигонуклеотидом.

Научная новизна. Новизна результатов, полученных в диссертационной работе, состоит в следующем. Впервые проведено сравнительное количественное термодинамическое исследование влияния двух новых различных по структуре интеркалирующих красителей, ковалентно присоединенных к олигонуклеотидам, на комплексообразующие свойства последних. Впервые показана значимость концевого нуклеотида олигомера, к которому присоединен остаток красителя, для термодинамической стабилизации комплементарного комплекса олигонуклеотидного производного с ДНК-мишенью. Показано, что в дуплексе, образованном производным олигонуклеотида с более протяженной ДНК-мишснью взаимодействие положительно заряженного остатка красителя и длинного од-

ноцепочечного участка мишени имеет электростатическую природу. Определены термодинамические величины этого взаимодействия. Впервые разработан подход для определения термодинамических параметров кооперативного взаимодействия в дуплексах, образованных ДНК-мишенью с тандемом олигонуклеотидов, рассчитаны термодинамические параметры кооперативного взаимодействия олигонуклеотидных производных, несущих остатки этидия и феназиния. Впервые показан характер изменения этого взаимодействия в зависимости от длины одноцепочечного участка между соседними дуплексными структурами "тандемного" комплекса.

Практическая ценность. Выявлены количественные закономерности влияния кова-лентно присоединенных к олигонуклеотидам полициклических ароматических групп интеркалирующих красителей на термодинамическую стабильности олигонуклеотидных дуплексов и кооперативные свойства "тандемных" комплексов. Эти данные необходимы для разработки и создании новых олигонуклеотидных реагентов, а так же при оценке их количественных характеристик эффективности и селективности комплексообразования с модельными НК-мишенями.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на VI и VII всесоюзной конференциях "Спектроскопия биополимеров" (Харьков 1988, 1991), на международной конференции "Перспективы применения прозводных олигонуклеотидов в терапии и диагностике" (Новосибирск 1988).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текста, состоит из введения, семи глав, выводов и списка цитируемой литературы из 158 наименований, содержит 28 таблиц и 27 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертационная работа состоит из двух частей. Первая часть посвящена подробному исследованию комплексообразующих свойств феназиниевого производного гепта-дезоксирибонуклеотида в зависимости от места присоединения остатка феназиния ( 5'-или З'-концевой фосфат) числа метиленовых звеньев линкера. Вторая часть работы включает комплексное сравнительное исследование влияния остатков этидия и феназиния на термодинамику образования специально созданных модельных комплементарных комплексов модифицированных пентадезоксирибонуклеотидов и величину их кооперативного взаимодействия в "тандемных" трехкомпонентных комплексах. 1. Исследование термодинамики комплексообразования производных олигонуклеотидов с ковалентно присоединенными остатками феназиния

Моно- и ди-К-(2-гидроксиэтил)феназиниевые производные олигонуклеотидов были синтезированы методами, описанными в работах [Зарытова и др. , Биоорган, химия. 1986. Т. 12. № 7. С. 911-920; Изв. СО АН СССР сер. хим. наук. 1989. вып. 6. С. 3-9]. Структуры олигонуклеотидов, их производных и комплексов представлены на схеме 1.

Расчет термодинамических параметров образования комплементарных комплексов проводили в рамках модели "двух состояний" по оптическим кривым плавления согласно работе [Petersheim & Turner. Biochemistry. 1983. V. 22. P. 256-253]. Все экспериментальные данные получены с помощью специальной компьютеризированной установки, созданной на базе оптического детектора жидкостного хроматографа "МИЛИХРОМ", позволяющей снизить объем исследуемого раствора до 2 мкл.

Дуплексы D1-D4 Остаток феназиния

Phn

5' pAACCTGTTTGGC СНХН.ОН

3' pACAAACCp I

A, i, w

D1(R-|= H, R2= H); D2(Ri= Phn, R2= H); D3(R,= H , R2=Phn); D4(R-|=Phn, R2=Phn ) n,m =2.

На рис. 1 приведены первые производные оптических кривых плавления дуплексов D1-D4. Phn-производные пентануклеотида имеют линкеры с одинаковым числом метиленовых звеньев ( п,ш = 2). Результаты демонстрируют как значительный эффект стабилизации дуплексной структуры остатком феназиния, так и относительное преимущество по величине стабилизирующего эффекта 5'- Phn по сравнению с З'-Phn (кривые 2,3) и аддитивность влияния красителя в случае дифеназиниевого производного (кривая 4). Было показано, что полученные закономерности наблюдаются при любых длинах линкерных групп исследованных в данной работе.

Рис. 1. Первые производные оптических кривых плавления дуплексов 01(1), 1)2(2), ОЗ(З), Э4(4) (п,ш = 2 во всех случаях). Суммарная концентрация олигонуклеотидов при молярном соотношении 1/1 равна 5-Ю"5 М в буфере : 1,0 М ИаС1, 0,01 М ИагИРСМ , 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,3 .

Результаты расчетов термодинамических параметров (**) комплексообразования всей серии комплексов представлены в таблице 1. Данные таблицы 1 показывают, что увеличение термодинамической стабильности дуплексов, образованных с участием РЬп-нроизводных. во всех случаях сопровождается увеличением абсолютных значений А#уц, *) Префикс "с!" при обозначении олигодезоксирибонуклеотидов здесь и далее опущен. ") АНун,(ккал/моль); ДЗун,(кал/моль/К); ДСун,(к><ал'моль) ■ термодинамические параметры рассчитаны по уравнению Вант-Гоффа.

СХЕМА 1 (*)

олигометиленовые линкерные группы

R=-(CH2)nNH- (5') R= -(CH2)mO- (3-) n=2-7; m=2-5

ASvh- В заметно большей степени этот прирост наблюдается для 5'-концевого Phn, величины AAG которого примерно равны увеличению длины дуплекса на 2 AT или GC пары. Стабилизирующий эффект для 5';3'-ди-РЬп производного по величине-ДАО оказывается практически равным ДОун образования всего дуплекса D1, а величины ДДН, AAS близки по значению сумме вкладов этих величин в случае 5'- и З'-РЬп-производного (n,m=2) в дуплексах D2 и D3.

Таблица 1 Термодинамические параметры образования комплексов гептануклеотида с

ковалентно присоединенным остатком К-(2-гидроксиэтил)феназиния и ком_плементарного додекануклеотида

дуплекс AH VH(AAH ) ккал/моль ASVH(AAS ) кал/моль/К AGVH37 (AAG) ккал/моль ^max (A7"max) °C

D1 -37,3 -104,4 -4,93 27,2

D3 5'Phn п=2 5'Phn п=3 5'Phn п=4 5'Phn п=5 5'Phn п=6 5'Phn п=7 -52,5 (-15,2) -53,5 (-16,2) -60,0 (-22,7) -54,4 (-17,1) -53,1 (-15,8) -49,4 (-12,1) -142,5 (-38,1) -146,8 (-42,4) -166,1 (-61,7) -149,7 (-45,3) -146,0 (-41.6) -135,4 (-31,0) -8,30 (-3,37) -7,99 (-3,06) -8,52 (-3,59) -7,92 (-2,99) -7,76 (-2,83) -7,41 (-2,48) 47.4 (20,2) 45.0 (17,8) 47.1 (19,9) 44.5 (17,3) 43,7 (16,5) 41,9 (14,7)

D2 3'Phn m=2 3'Phn m=3 3'Phn m=4 3'Phn m=5 -48,6 (-11,3) -45,8 (-8,5) -46,2 (-8,9) -44,4 (-7,1) -134,2 (-29,8) -125,9 (-21,5) -126,9 (-22,5) -121,4 (-17,0) -6,99 (-2,06) -6,74 (-1,81) -6,84 (-1,91) -6,75 (-1,82) 39,6 (12,4) 37,7(10,5) 38,3 (11,1) 37,8 (10,6)

D4 5';3'-fln-Phn -66,7 (-29,4) -183,2 (-78,8) -9,89 (-4,96) 54,8 (27,6)

Ттах температура максимума первой производной оптической кривой плавления в виде йЬ с¡7 = Р(1/ 7") ((- доля олигонуклеотидов в дуплексной форме).

Величины параметров ДНун. ДЗун приведены с точностью, превышающей среднеарифметическое отклонение результатов параллельных экспериментов (±3% ) для аккуратного расчета ДСун при Т#37 °С . Цифры в скобках - разность величин термодинамических параметров образования 0(2-4) и ^модифицированного П1.

Стабилизирующий эффект остатка феназиния проявляется в большей степени при длине линкера с числом метипеновых звеньев равных 2 и 4 (рис 2).

22 Рис.2. Зависимость стаби-

20 лизирующего эффекта

«t. |H 5'- и З'-Phn остатков в

производых гекса-

16 CT нуклеотида от числа

14 ~ метиленовых звеньев

12 линкерной группы

10 (таблица 1).

Этот эффект обусловлен: 1) увеличением степеней свободы остатка РЬп при увеличении числа метиленовых звеньев; 2) благоприятной информацией самого линкера; 3) кон-формацией остатка РЬп в составе дуплекса, зависящей от линкерной группы.

Достоверность величин, характеризующих стабилизирующее влияние остатка РЬп, была показана независимыми экспериментами на примере дуплексов Р-5, имеющих аналогичную дуплексу 01 последовательность пар оснований (схема 2). С использованием этой же модели была впервые показана стабилизирующая роль ковалентно присоединенного к олигонуклеотиду остатка 2-Г>НЗ-аминопропионил)этидия (Е1с1) в составе дуплекса Р7 (структуру Е1с) см. на схеме 3).

СХЕМА 2

05 06,07

5' ртетТТСЮС рТсПТОЮС ое и = -ЫН(СН2)2-РЬП

3' АСАААССр АСАААССр-Г? 07 Р? = -ЫН(СН2)2С(0)-Е1<1

В результате исследования получены данные, представленные в таблице 2. Для дуплекса Юб значения величин А АС и Д7"тах практически совпадают с аналогичными величинами для дуплекса РЗ (п=2). Этот факт связан с тем, что ближайшее структурное окружение группы феназиния в обоих дуплексах идентично. Следует отметить, что полученные величины стабилизирующих эффектов ( в том числе и для остатка этидия) являются максимальными по сравнению с аналогичными данными, известными в литературе.

Таблица 2 Термостабильность дуплексов Р5, Рб, Р7

дуплекс ДСун37(МС) ккал/моль ^тах(А7"гт1ах) "С

Р-б -5,20 27,2

Р-7 (б'-РЬп) -8,44 (-3,24) 47,5 (20,3)

Р-8 (5'-Е1<1) -8,82 (-3,62) 49,4 (22,2)

(условия проведения экспериментов аналогичны описанным в рис.1).

Поскольку представленные результаты получены для конкретных олигонуклеоти-дов с различными 5'- и З'-концевыми основаниями, был разработан и осуществлен следующий этап работы, в котором на универсальной симметричной по последовательности оснований олигонуклеотидной модели исследованы основные аспекты взаимодействия в дуплексе производных олигонуклеотидов, содержащих остатки этидия и феназиния.

2. Сравнительное исследование влияния этидия и феназиния, ковалентно присоединенных к 5'- или З'-концу пентануклеотидов рСАААС или рСТТТС, на термодинамику комплементарного и кооперативного взаимодействия

На данном этапе работы определено влияние на стабилизацию дуплекса и термодинамику комплексообразования: 1) ориентации интеркалятора относительно концевой пары дуплекса; 2) концевых неспаренных оснований и/или одноцепочечного фрагмента

комплементарного олигонуклеотида, фланкирующих дуплексный участок, и их взаимной ориентации с остатком интеркагитора; 3) положение остатков этидия и феназиния на 5'-или З'-конце пентануклеотида; 4) положительного заряда интеркапятора. Кроме того, было исследовано влияние дополнительных некомплементарных дезоксицитидипов в ДНК-мишени, разделяющих сайты связывания пентануклеотида и положительного заряда интеркапятора на термодинамику кооперативного взаимодействия производных пепта-нуклеотидов при образовании "тандемных" трехкомпонентных комплексов.

Структуры модельных олигонуклеотидных дуплексов с участием пентануклеотидов, модифицированных остатками этидия и феназиния представлены на схеме 3. Присоединение этидия осуществляли согласно работе [Кошкин A.A. и др.// Биоорг. химия. 1993. Т. 19. № 5. 570-582].

СХЕМА 3

5'

3'

pGAAAG (L) СТТТСр (М)

pGAAAG ТССТТТССТ (М')

5' 3'

pGAAAG ТССТТТССССТССТ

(Mr)

pGAAAG ТССТССССТТТССТ (Ml)

5' pGAAAG pGAAAG 3' TCCTTTC CTTTCCT (MnM) Сп

5' Etd-pGAAAG

(E,dL);

5'

GAAAGp-Etd (L );

GAAAGGAAAG TCCTTTCCTTTCCT (M-M)

5'Phn-pGAAAG (PhnL); 5' GAAAGp-Phn (L j; 5'Etd-pCTTTC (EWM);

5' CTTTCp-Etd (MEtd); 5'Phn-pCTTTC

(PhnM).

^-N-C(Cht)2NH-

CH2CH3

Phn- СН2СЦ20Н

R=-(Cht)2NH- (5'-p) R=4Cht)20- (З'-р)

2.1 Исследование влияния ориентации интеркалятора относительно концевой пары на термодинамику образования дуплекса

Известно, что 5'-концевые фосфаты и "свисающие" основания стабилизируют дуплексные структуры олигонуклеотидов эффективнее располагаясь рядом с пирими-диновым основанием. Результаты наших исследований показали, что интеркаляторы проявляют аналогичную закономерность (таблица 3).Согласно данным таблицы 3 можно записать следующий ряд термостабильности комплексов

^Ш» > Е1ЙЬМ > ЬМНс1 > МЬЕМ то есть> стабилизирующий эффект интеркалятора

I' максимально проявляется при присоединении

Р|1ПМЬ > РНпЬМ к 5'-коицевому фосфату дезоксицитидина .

При этом термостабильность дуплексов коррелирует с абсолютными значениями энтальпии и энтропии комплексообразования. Случай равенства термодинамики образования комп-лсксов Мь и МЬ, как показали дальнейшие исследования, оказался единственным. При появлении свисающих оснований в ДНК- мишени и в случае "тандем-ных" комплексов преимущество Е1с1, ковалентно присоединенного к олигонуклеотиду, стало очевидно.

Таблица 3. Термодинамические параметры комплексообразования пентануклеотидов с

Дуплекс обознач. АНун ЛЭун ДСун37 Гтах (°С)

5' рвАААС 3' СТГТСрЕЬб -36,7 -100,4 -5,60 31,8

5' Бга-рСАААС 3' СТТТСр Е,"ьм -36,1 -99,7 -5,17 28,2

5' рСАААС 3' Etd-pCTTTC ЬМЕ,<1 -34,2 -94,5 -4,93 25,8

5' САААСр-Е1<1 3' СТТТСр мь*" -30,7 -84,6 -4,41 19,9

5' рСАААв 3' СТТТСр-РЬп Р|1Пмь -37,6 -103,1 -5,67 32,5

5' РЬп-рСАААО 3' СТТТСр РМпьм -32,2 -88,0 -4,94 25,2

фере 1 М №С1, 0,01 М Ма2НР04, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,3 , Комплекс ^модифицированных пентануклеотидов имеет очень низкую термостабильность, 7мах « 0 °С, его термодинамические параметры образования не рассчитывали.

2.2 Сравнительное исследование влияния концевых неспаренных оснований и/или одноцепочечного фрагмента комплементарного олигонуклеотида, фланкирую-ющих дуплексный участок, и их взаимной ориентации с интеркалятором на термодинамику комплексообразования

Дуплекс, образованный олигонуклеотидом-реагентом и более протяженной НК-мишсныо, фланкирован неспаренными основаниями. Как известно, эти основания (особенно на 5'-конце) являются существенным фактором , стабилизирующим дуплексную структуру. Однако, как показали проведенные нами исследования, протяженный одмопе-почсчный участок, фланкирующий дуплекс, обладает дестабилизирующим влиянием. При наличии в структуре олигонуклеотида остатка этидия или феназиния это влияние коренным образом изменяется. Наиболее выгодной, с точки зрения термостабильности комплекса, оказывается ситуация, при которой остаток красителя на конце дуплексного участка направлен в сторону длинного одноцепочечного фрагмента (см, схему 3, рис. 3), независимо от места присоединения по 5'- или 3'-концевому фосфату. Свидетельствующие об этом термодинамические данные по всем типам комплексов пен-тануклеопшов и их производных с олигонуклеотидами: 5' ТССТТТССТ М' ; 5' ТССТССССТТТССТ М[?; 5' ТССТТТССССТССТ М|_ представлены в таблице 4.

Стабилизирующее влияние концевых неспаренных оснований проявляется при сравнении параметров комплексов ЬМ и ЬМ' с участием пента- и нонануклеотида рСТТТС (таблица 3) и ТССТТТССТ. соответственно (таблица 4). Видно, что при появлении неспаренных концевых оснований (комплекс ЬМ') возросли абсолютные величины всех параметров комплексообразования: энтальпия на 5 + 10 ккал/моль, энтропия на 17 -г 21 кал/моль/К , свободная энергия на 1,5 4- 1,6 ккал/моль и 7"та* на 9 + 15 "С. 5'-производные этидия и феназиния обладают большим стабилизирующим эффектом по сравнению с З'-производными. При этом, остаток этидия, как стабилизатор дуплекса, обладает заметным преимуществом перед РЬп-остатком.

Дестабилизирующая роль семизвенного одноцепочечного фрагмента проявляется при сравнении стабильности дуплексов ЬМд, 1<М[_ с дуплексом ЬМ' (рис. 3, верхний ряд). В то же время, дуплексы З'РЬп-, 5'Е1с1- и 3'Е1с1-производных (исключая 5'РЬп), при ориентации красителя в сторону длинного одноцепочечного фрагмента, более термостабильны, чем комплексы с нонануклеотидом М'. Термодинамические параметры комплексов, в которых остаток красителя направлен к центру тетрадекануклеотидов Мл, М|. и обладающих высокой термостабильностью, выделены в таблице 4 фоном. Величины ДДСп/н37 и АГтах превышают значения этих параметров для олигонуклеотида М' в среднем на 0,65 ккал/моль и 6 "С, соответственно. В то же время, при ориентации красителя к краю тетрадекануклеотидов М^, М|_ термостабильность этих дуплексов заметно ниже, чем с М' , а стабилизирующий вклад остатка красителя практически такой же. В этом случае проявляется дестабилизирующая роль одноцепочечного фрагмента.

Таким образом, стабилизирующий эффект концевого остатка красителя обусловлен суммой взаимодействий с крайней парой оснований дуплекса, по-видимому, за счет дополнительного стэкинг-взаимодействия, и взаимодействия с протяженным одноцепочеч-ным фрагментом. Как показали дополнительные исследования (см. п. 2.4), это взаимодействие имеет электростатическую природу и сопровождается определенным структурированием оснований одноцепочечного фрагмента. Разностный КД-спектр дуплексов , образованных с участием 5'Е1(1-производного олигонуклеотида показал наличие новой интенсивной полосы с максимумом 262 нм, отсутствующей в КД-спектрах олигонуклеотидов . Данная полоса проявляется только в том случае, когда остаток красителя ориентирован в сторону одноцепочечного фрагмента, то есть в дуплексе Е1аЬМ|_ , а также в наиболее структурированных "тандемных" комплексах, термодинамические характеристики которых описаны в следующем разделе.

Таблица 4. Термодинамические параметры образования комплексов пентануклеотидом рОАААв и его производными с олигону-

клеотидами М', Мр, М^, имеющими одно место комплементарного связывания

5' ТССТТТССТ М' 5' ТССТССССТТТССТ мк 5' ТССТТТССССТССТ М|

дНун Д5уН ЬГ 37 Дб ун 7"тах ДНун ДЭун Абун 7"тах АН уН ДБ уН дса' 7~тах

ь -32,2 -91,8 -3,74 15,0 -30,9 -89,5 -3,19 9,4 -31,5 -90,7 -3,40 _11,7

РИпь -38,5 (-6,3) -104,9 (-13,1) -6,02 (-2,28) 35,5 (20,5) -35,0 (-4,1) -94,9 (-5,4) -5,62 (-2,43) 31,9 (22,5) -37,0 (-5,5) -100,4 (-9,7) -5,86 (-2,46) 34,2 (22,5)

ЬРИп -37,4 (-5,2) -103,5 (-11,7) -5,30 (-1,56) 29,6 (14,6) -37,0 (-6,1) -101,8 (-12,3) -5,48 (-2,29) 31,0 (21,6) -35,0 (-3,5) -96,4 (-5,7) -5,11 (-1,71) 27,6 (15,6)

ЕМь -44,3 (-12,1) -120,9 (-29,1) -6,78 (-3,04) 41,1 (26,1) -41,3 (-10,4) -112,7 (-23,2) -6,36 (-3,17) 38,1 (28,7) -46,9 (-15,4) -128,4 (-37,7) -7,09 (-3,69) 42,9 (31,2)

-46,0 (-13,8) -129,0 (-37,2) -6,02 (-2,28) 35,8 (20,8) -47,3 (-16,4) -133,0 (-43,5) -6,08 (-2,89) 36,2 (26,8) -42,2 (-10,7) -117,8 (-27,1) -5,70 (-2,30) 33,5 (21,8)

Суммарная концентрация олигонуклеотидов 1-10"4 М в буфере 1 М ЫаС1, 0,01 М Ыа2НР04, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,3 . Цифры в со скобках - разность величин термодинамических параметров комплексообразования производного и немодифицированного лентануклеотида.

немодифицированный пентануклеотид

ГГП

5'

- I м' I ' II I I I I I I I I ' ' I ' I ' I I ' ' I ''" 11111

иг мдЬ Рис.3 Сравнительная термостабильность комплексов пентануклеотидов

и их производных с олигонуклеотидами М', Мк, Мь в зависимости от вза-

5'-лроизводное имного расположения ковалентно присоединенного интеркалирую-

| I I I ! ' I м I I I I I I I I I ' ! ! I* I м | I I I 1111 11* I шего красителя (*) и одноцепочечного фрагмента ДНК-мишени, фланки-

*Ш|. *1дг рующего дуплекс.

З'-производноо

3' *! I I I I ^ *| I 11 I ^ *| | | | |

5' мм.......... <х м I м I м I V I I М I I I 11 I I III

1>*М(. Ь*М' МяЬ*

2.3 Исследование кооперативных свойств "тандемныых" комплексов пентануклео-тидов и их производных с олигонуклеотидами МПМ , имеющими два сайта связывания

Количественную оценку кооперативных свойств "тандемных" комплексов проводили на основе анализа равновесного распределения олигонуклеотидов между всеми формами на примере комплекса ЬМ-МЬ согласно следующей схеме:

где Кц., К-т - равновесные константы присоединения одного пентануклеотида к "левому" и "правому" комплементарному сайту тетрадска-нуклеотида М-М соответственно; А^ь Кгя -равновесные константы присоединения второго пентануклеотида к "левому" и "правому" комплементарному сайту тетрадекануклеотида М-М в присутствии занятого соседнего сайта первым пентануклеотидом. Исходя из известного уравнения, величину константы кооперативного взаимодействия двух пентануклеотидов Кь можно определить

Кк = / КЩ = ^21. / ^11. = [ЬМ-МЬ1 [М] / ( [ЬМ-М] [М-МЬ] ) (1)

Уравнение (1) было преобразовано в вид. использованный для рассчета величин Кк.

0,5 ( Цт / [Ц-Ц Кц_ + КшН Ь] + 2) - (Км + КщН Ь] - 1

Кк --------------------------------------------------------------------------------- (2)

/Си • АГш -I Ь|2

Вместо неизвестных величин Кн., К-т подставляли К\_. Кк . рассчитанные по термодинамическим параметрам дуплексов, образованных пентануклеотидом и его производными с Мь Мр( (таблица 4). [Ь]т - суммарная концентрация пентануклеотидов. Текущую концентрацию [Ь| определяли по оптическим кривым плавления "тандемных" комплексов (рис 4).

Прямая положительная кооперативность "тандемных" комплексов (Кк>1) проявляется в увеличении их тсрмостабильности (особенно в случае М-М комплемента) относительно комплексов с одним сайтом связывания пенгануклеотида. При появлении дополнительных дезоксицитидинов (п=1-нЗ) между сайтами связывания пентануклеотидов тсрмостабильпость "тандема" последовательно снижается до уровня дуплексов тина ЬМ|_, ЬМд. Как показали расчеты, это является следствием уменьшения кооперативного взаимодействия пентануклеотидов. При п=3 Ак=1, то оси, при отсугспши кооперативного взаимодействия, связывание каждого пентануклеотида происходи! независимо от "соседа".

Результаты расчетов констант кооперативное™ Кк для всех вариантов "тандемных"

комплексов представлены графически па рис.5 (а,б) в виде функции 1пА"к =/(1/7" ).

Характер этих зависимостей в случае (а) ("тандемы" образованы нсмодифшшроваппым

. ,, Е1с1, РЬп, х ,

пентануклеотидом Ь и его 5-производными 1>, Ь ) (мннок к линейному, чго ночво-

ьм-м + ь

К2Я н \\ К^

ЬМ-МЬ М-М + ь + ь

к21 \\ пкт

М-МЬ + ь

ляст использовать уравнение Вант-Гоффа для рассчета линейным рс!рсссионным анализом (пунктир) термодинамических параметров кооперативного взаимодействия пентануклеотидов в "тандеме" (таблица 5).

Таблица 5. Термодинамические параметры кооперативного взаимодействия пентанукле-

отидов Ь, рЬ"Ь и в комшюксс с ТССТТТССТТТССТ (*ЬМ-М*Ь)

5'-концевая группа(*) Л" УН ДЭ уН Ав ун37

Р -13,5 ±2 -37,4 ± 4 -1,9 ±0,2

р-РИп -11,7±2 -30,3 ±4 -2,3 ±0,2

р-ЕМ -10,3 ±2 -22,5 ± 4 -3,2 + 0,2

Анализ данных в таблице 5 показывает, что энтальпия кооперативного взаимодействия двух немодифицированных пентануклеотидов в комплексе ЬМ-МЬ соответствует энтальпии взаимодействия двух соседних -ОС-/-СС- пар в дуплексной структуре НК. Были проведены контрольные эксперименты по определению термодинамических параметров образования декануклеотидного дуплекса Ь-ЬМ-М, являющегося аналогом "тандемного" комплекса ЬМ-МЬ по последовательности оснований. Показано: 3' САААСИ}АААСгр ДНуН= -74,8 ккал/моль; АЭун = -209,6 кал/моль/К; 5' ТССТТТССТТТССТ ДСун37=-9,77 ккал/моль; Ттах= 50,5 °С (Ст = 5-Ю"5 М). Сумма энтальпий образования отдельных составляющих комплекса ЬМ-МЬ равна: ДН\,н(ЬМ(0+ДНун(1<М|.)+ЛНун( кооператива) = (-31,5)+(-30,9)+(-13,5)= -75,9 ккал/моль. Это значение практически совпадает с энтальпией образования дуплекса Ь-ЬМ-М (-74,8 ккал/моль), что свидетельствует о формировании в точке одноненочечного разрыва между пентануклеотидами полного стэкинг-взаимодействия концевых дезоксигуанозинов, которое, однако, не может компенсировать разрыв фосфодиэфирной связи. На рис. 4 видно, что только 5'Ек)-производное, образуя наиболее стабильный "тандемный" комплекс ЕМЬМ-МЕМЬ из всей серии исследованных "тандемов", имеет величину 7"мах=51°С, равную 7~Мах контрольного декануклеотидного дуплекса 1>-ЬМ-М. Таким образом, стабилизирующий эффект остатка этидия и положительное кооперативное взаимодействие этидиевых производных пентануклеотида компенсирует по термостабильности одноцепочечный разрыв между 0(5) и О(б) декануклеотида в комплексе Ь-ЬМ-М. Величина Кк 5'Е[с1-производного в 10 раз больше таковой для немодифицированного пентануклеотида, в 5 раз больше величины Къ 5'Р(ш-производного и составляет 190 (37 °С). Величина Кк 3'Еи1-производного равна 100 (37 °С). Из этого следует, что пента-нуклеотид ё(рСАААО), "зажатый" с двух сторон олигонуклеотидами-"эффекторами" на НК-мишени, несущими в одном случае на 5'- а в другом на З'-конце ковалентно присоединенные остатки этидия, направленные в сторону пентануклеотида, по эффективности комплексообразования будет равен декануклеотиду.

Следует отметить, что падение величины А*к при появлении дополнительного -С-между сайтами связывания в комплементе М-|М для всех типов модификации пентануклеотида соответствует уменьшению свободной энергии кооперативного взаимодействия на величину -0,6-^-0,9 ккал/моль.

Подписи к рисункам:

Рис. 4. Первые производные кривых плавления "тандемных" комплексов ХЛЯпЕП» (а). РИп1>МпМРНп1« (б), ЬРЬпМпМЬРЬп (в), ^МпМ^ (г), ЬЕММГИЬЕМ (д), где п=0*3 ,

кривые 1-г4 соответственно.

Рис. 5. Графики зависимости 1п К^ =/(1/Г) "тандемных" комплексов олигонуклеотидов МПМ с пентануклеотидом и его производными соответтвенно для а) : Ь (1-ь4) , р,тЬ(5+8) , Емь (9т-12) ; б) ЬРЬп (5-8) , ЬЕИ (9-5-12) . [Ь] т=510-5 М,' [МпМ]т= 2,5-10"5 М в буфере 1 М ЫаС1, 0,01 М Ыа2НР04 , 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,3 .

Для немодифицированных пентануклеотидов аналогичное изменение примерно в 2 раза больше. Это означает, что остаток красителя занимает промежуток между крайними гуанозинами напротив -С- в "тандемном" комплексе с М^М и способствует сохранению кооперативного взаимодействия.

5.2.3 Исследование влияния положительного заряда ингеркалятора на термодинамику комплементарного и кооперативного взаимодействия на примере производного пентануклеотида 5' Etd-pGAAAG

Известно, что положительный заряд интеркалятора является фактором, стабилизирующим дуплексную структуру. При этом наблюдается уменьшение зависимости 7"т от ионной силы раствора вследствие уменьшения разности числа связанных противо-ионов М+ олигонуклеотидами в дуплексе и одноцепочечном состояниях (Ai) согласно уравнению: (д LnК /д Ln[M+])T =4i, где К -равновесная константа образования дуплекса.

Исследование было проведено в буферных растворах аналогичного состава по п. 2.2, 2,3 с варьированием [NaCl]: 1 М(1), 0,4 М(2), 0,16 М(3) и 0,1 М(4) на примере 5'Е1с1-производного пентануклеотида в комплексах EtdLI.li_, EWI«Mr и "тандемном" MLM-MEtdL. Термодинамические параметры образования комплексов рассчитывали по концентрационной зависимости I/rMax=/(Ln Cj), пример которой для дуплекса EMLMl представлен на рис. б.

0.0034 0.00335 | 0.0033

t 0 00325 Рис- ® Концентрационная

зависимость 1/Гмах=/(ЬпСт) EtdT ,,

для дуплекса LM[_ в буферных растворах (1-4) соответственно.

Ln С т

Аналогичные зависимости получены для комплекса ewlmr . Величины термодинамических параметров использованы для расчета зависимостей 7т и Lai от ионной силы раствора линейной аппроксимацией (рис 7). Получены результаты, которые указывают на очень слабую зависимость термостабильности данных дуплексов от ионной силы раствора (в 2,5 раза меньшую, чем для ^модифицированных дуплексов).

Наблюдаемое различие

между дуплексами EtdLML и отражает внугриком-плексное электростатическое

E,dLML E,dLMR

d Tm / d Lg[Na+] (°C) 6,0 8,2

{dLnKId Ln[Na+] )37 -c 0,54 0,80

взаимодействие положительного заряда остатка этидия и отрицательных зарядов одноце-почечного фрагмента, ориентированных навстречу друг другу в дуплексе ЕИ1«М1.. При этом, величина ДА1 = 0,8 - 0,54 = 0,26 практически совпадает с остаточным нескомпен-сированным зарядом одного межнуклеотидного фосфата ДНК-дуплекса в В-форме (0,24).

12.00 -r

11.00 -

P

Г-

ГЛ 10.00

*

с

-4 9.00

8.00

а д

.-а

д2 ■ 3

□ 4

j 38

- 36

- 34

- 32

- 30 rï

28

26

4 24

-9.2Е-01

-7.5Е-01 -3.8Е-01

LntNa*]

8.6Е-03

Рис. 7 Зависимость Тт и Laif от логарифма [Na+J дуплексов (1,3) и

(2,4), соответственно, в буферных растворах 1-4 .

Расчет констант кооперативного взаимодействия 5'Е1(1-производных в "тандемном" комплексе ЕИЬМ-МЕМЬ при различных ионных силах раствора проводили аналогично п. 2.3 . Значения Кц , представленные в виде функции ЪпК^ =/( 1/7" ) для буферных растворов 1-4 показаны на рис 8.

3.1Е-03

3.2Е-03 3.3E-03

11T

Рис. 8 Графики зависимости логарифма констант кооперативное™ от температуры

в тандемном E,dLM-MBdL I растворах 1 -4 .

комплексе буферных

Наклон графиков линейной аппроксимации кривых 1-4 / с1(1/7* ), оказывается

одинаковым и равным -10,6 ± 2 ккал/моль в терминах ДЯ\/н • Наблюдается небольшое увеличение свободной энергии кооперативного взаимодействия при уменьшении ионной силы раствора, приблизительно равное вкладу 5'-концевого фосфата в стабилизацию НК-дуплекса. Наклон зависимости (3 ЬпА"к / д Ьп[Ма+] )з7°с = Д1к является величиной приблизительно постоянной в диапазоне температур 304-50 °С и равной -0,21 ± 0,02 . Это может означать, что в "тандемом" комплексе присходит вытеснение противоионов из зоны взаимодействия концевых оснований и остатка этидия в области одноцепочечного разрыва.

ВЫВОДЫ

1. На базе специально созданной в НИБХ СО РАН уникальной компьютеризированной установки для исследования в микромасштабе ( обьем образца 2 мкл ) термической денатурации биополимеров в растворе, отработана методика регистрации оптических кривых плавления комплексов олигонуклеотидов и алгоритмы расчета термодинамических параметров комплексообразования в рамках модели "двух состояний".

2. Проведено систематическое исследование комплексообразующих свойств производных олигонуклеотидов, несущих ковалентно присоединенные к 5'- или 3'-концевому фосфату остатки интеркалирующих красителей феназиния или этидия, на основе термодинамических данных, полученных обработкой оптических кривых плавления комплексов. Показано :

а) Присоединение красителя к олигонуклеотиду стабилизирует комплементарный комплекс за счет увеличения энтальпии комплексообразования, вследствие дополнительного стэкинг-взаимодействия между полициклической ароматической группировкой красителя и ближайшей концевой комплементарной парой.

б) Стабилизирующий эффект выше в том случае, когда краситель присоединен к 5'-концевому фосфату (ДДОз7= -2,4 -3,6 ккал/моль), и если ближайшим концевым основанием является пиримидин (44Сз7= 0,25 -г€,7 ккал/моль).

в) Длинный одноцепочечный фрагмент ДНК-мишени дестабилизирует образуемый им комплементарный комплекс с более коротким олигонуклеотидом. Положительно заряженный остаток красителя производного олигонуклеотида, направленный в сторону этого фрагмента не только устраняет его дестабилизирующее влияние, но электростатически взаимодействует с ним. Наибольший стабилизирующий эффект вследствие данного взаимодействия наблюдается для остатка этидия (ДДСз7= -1,0 ккал/моль, 0,1 М КаС1).

3. Предложен экспериментальный подход для определения величин термодинамических параметров кооперативного взаимодействия олигонуклеотидов, разделенных одноцепо-чечным разрывом в комплементарном комплексе с общей олигонуклеотидной матрицей ("тандемных" комплексах). Показано:

а) Природа кооперативного взаимодействия пентануклеотидов d(pGAAAG) в "тандемном" комплексе - дополнительный стэкинг между 5'- и З'-концевыми дезоксигуанозинами, фланкирующими одноцепочечный разрыв (ДСз7= -1,9 ккал/моль). Энтальпия кооперативного взаимодействия пентануклеотидов d(pGAAAG) в "тандемном" комплексе и двух соседних -GC-/-GC- пар в нативном дуплексе равны.

б) Кооперативное взаимодействие производных пентануклеотида d(pGAAAG) выше, чем немодифицированного пентануклеотида. Дополнительный вклад этидия в кооперативный эффект (ДСз7= -1.3 ккал/моль) больше, чем феназиния (ДСз7= -0,4 ккал/моль).

в) Константа кооперативного взаимодействия всех исследованных "тандемных" комплексов при увеличении числа дополнительных нуклеотидных звеньев в ДНК-мишени от 0 до 3, разделяющих сайты связывания пентануклеотидов, последовательно уменьшается. Три дополнительных звена практически устраняют кооперативное взаимодействие, величина константы кооперативного взаимодействия близка к 1.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1) Лохов С.Г., Кошкин А.А., Кугявин И.В., Митякин М.П., Подыминогин М.А., Лебедев А.В. Влияние интеркалирующих красителей этидия и феназиния ковалентно присоединенных к 5'- или З'-концу пентануклеотида d(pGAAAG) на термодинамику комплементарного и кооперативного взаимодействия.//Биорган. хим.1995.Т.21.С.19б-203.

2) Koshkin А.А., Kropachev K.Yu., Mamaev S.V., Bulychev N.V., Lokhov S.G., Vlassov V.V. and Lebedev A.V. Ethidium and Azidoethidium Oligonucleotide Derivtives: Synthesis, Complementary Complex Formation and Sequence-Specific Photomodification of the Single-Stranded and Double - Stranded Target Oligo- and Polynucleotides. // J. of Mol. Recognition. 1994. V. 7. P. 177-188.

3) Lokhov S.G., Podyminogin M.A., Sergeev D.S., Silnikov V.N., Kutyavin I.V., Shishkin G.V., Zarytova V.P. Synthesis and High Stability of Complementary Complexes of N-(2-Hydroxyethyl)phenazinium Derivatives of Oligonucleotides. // Bioconjugate Chem. 1992. V. 3. P. 414-419.

4) Зарытова В.Ф., Кугявин И.В., Лохов С.Г., Сергеев Д.С. Модификация нуклеиновых кислот в стабилизированных комплементарных комплексах. V. Термодинамические параметры комплексообразования олигонуклеотидов с ковалентно присоединенным остатком 1Ч-(2-оксиэтил)феназиния. // Сибирск. химич. ж. 1991. Вып. 3. С. 24-29.

5) Абрамова Т.В., Горн В.В., Кутявин И.В., Лебедев А.В., Лохов С.Г., Подымишлин М.А. Кооперативное взаимодействие олигонуклеотидов в дуплексах с одноцсиочсчщлм разрывом.//Докл. Акад. наук СССР. 1990. Т. 315. № 6. С. 1485-1488.

16 С'