Пространственная структура олигонуклеотидных дуплексов и их производных по данным двумерной ЯМР-спектроскопии и ограниченной молекулярной механики тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
Биченкова, Елена Владимировна
АВТОР
|
||||
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
Новосибирск
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
1993
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
РГ6 од
»,Л 11 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
1 1\ ШОН 1993 СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУГ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
На правах рукописи УДК 577.133.6.088.53:543.422.25
Биченкова Елена Владимировна
ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ДУПЛЕКСОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ ПО ДАННЫМ ДВУМЕРНОЙ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ И ОГРАНИЧЕННОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МЕХАНИКИ
02.00.10 — биоорганическая химия, химия природных соединений и физиологически активных Веществ
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Новосибирск — 1993 г.
Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН
Научный руководитель - кандидат химических наук
A.В.Лебедев
Официальные оппоненты: доктор химических наук
B.Л.Флорентьев кандидат химических наук В.И.Маматюк
Ведущая организация: Московский институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина Российской академии наук
Защита состоится 1993 года в ** часов
на заседании Специализированного Совета К 003.52.. 01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирек-90, проспект акад. Лаврентьева, В.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.
Автореферат разослан " «-¿¿¿¿сЛ-* 199g г.
Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат химических наук
'¿лр^ О.С.Федорова
Актуальность проблемы. Одним из наиболее перспективных подходов направленного воздействия на генетический аппара? клетки, является метод комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот (НК) с помощью производных олигонуклеотидов, содержащих в своем составе ковалентяо присоединенные реакционноспособные группировки.
Среди большого разнообразия химических групп, используемых в составе олигонуклеотидных реагентов, наиболее широко применяется алкилирующая 4-(Ы-2-хлорэтил-Н-метиламино)фенильная группа. Ранее были исследованы химические и кинетические аспекты реакции внутри-комплексного алкилирования олигояуклеотидными производными, несущими в своей структуре ароматическую Н-2-хлорэтилачиногруппу на 5' или 3'-конце цепи. В то же время структурные аспекты подобных реакций практически не изучены. Мояно полагать, что существенную роль в эффективности и позиционной направленности комплементарно-адресованной модификации играет пространственная ориентация модифицирующей группировки в структуре дуплекса. Поэтому для более полного понимания механизма комплементарно-адресованной модификации НК необходимо детальное изучение конформации олигонуклеогидных комплексов, а также структуры образующихся продуктов реакций. Исследование конформэционных особенностей образующихся аддуктов актуально также с точки зрения последувдего узнавания модифицированных участков нуклеиновых кислот ферментами репарации и влияния структуры модифицированного узла на эффективность процесса репара--ции образующихся дефектных участков нуклеиновых кислот.
Стабильность комплексов "КК-мишень - олигонуклеотидный реагент" может быть значительно повышена путем присоединения к олиго-нуклеотиду пслиароматических гетероциклических группировок, таких как остатки акридина, фенантридина и феназияа. Было показано, что реакции внутрикомплексного алкилирования в подобных стабилизированных комплексах, протекают с высокой эффективностью и селективностью. В связи с этим повышается роль и актуальность исследования общих механизмов стабилизации НК-дуплексов с помощью ковалэнтно-присоединенных интеркалирующих группировок, что также невозможно без изучения особенностей их пространственной структуры. В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение пространственной структуры как продуктов реакции ьнутрикомплексного алкилирования, так и стабилизированных комплексов в водном растворе.
Цель работы. Целью настоящей работы было исследование пространственной структуры модельных дуплексов (d-i), (d-2) и (d-з ) методом 1Н-ЯМР-спектроскопии в комбинации с методом ограниченной молекулярной механики:
j--pd(CpCpApApApCpA)
R <1 ( CpGpGpTpTpTpGpTp )
I__J (D-l )
Phn-NH-(CH2)2-NH-pd(CpCpApApApCpA) pd(CpCpApApApCp)rA
d(CpCpGpTpTpTpGpTp) d(CpGpCpTpTpTpGpTp)
(D-2) (D-3)
где: R - остаток 4-[H-2-хлорэтил-М-метиламино]бензилвидного фрагмента; phn - остаток. 10-(2-гидроксиэтил)феназшия.
Дуплекс (о-1) является продуктом реакции внутрикомплексного алкилирования по N-3 положении нуклеотидаого звена с(8) октанукле-отида-мишени pd(TpGpTpTpTpGpCpC) с помощью 4-[N-2-хлорэтил-М-ме-тиламино]бензил-5'-фосфамидного производного гептануклеотида pd(срСрАрАрАрСрА). Дуплекс (D-2), содержащий ковалентно присоединенный по 5'-фосфатной группе гептануклеотида остаток ю-(2-гидроксиэткл)-феназиния, представляет собой модель стабилизированного феназином дуплекса.
Новизна работы. Новизна данной работы заключается в том, что в ней впервые комбинацией методов двумерной ЯМР-спектроскопии (2М-ЯМР) и ограниченной молекулярной механики (ОММ) исслед'ованы пространственные структуры продукта реакции внутрикомплексного алкилирования и стабилизированного олигонуклеотидного дуплекса с ковалентно -присоединенным остатком феназина в водном растворе; получены термодинамические характеристики исследуемых комплексов.
Практическая ценность. Предложены модели наиболее вероятных низкоэнергетических конформаций ковалентного аддукта (0-1), а также феназин-содержащего дуплекса (D-2) в водном растворе. Эти сведения важны для детального понимания общих механизмов внутри-комплексной комплементарно-адресованной модификации НК, а также процессов стабилизации НК-дуплексов с помощью ковалентно-прксоеднненных интеркалирующих группировок.
Апробация работы. Результаты работа докладывались, на vi всесоюзной конференции "Спектроскопия биополимеров" (Харьков, 1988), международном симпозиуме "Синтез олигонуклеотидов: проблемы и границы практического применения" (Москва, 1991), vil всесоюзной конференции "Спектроскопия биополимеров" (Харьков, 1991), международной конференции "Терапевтические препараты на основе нуклеиновых кислот" (Clearwater Beach, Флорида, США, 1991).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ"!
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы из 134 наименований и содержит 19 таблиц и 40 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕРМОДИНАМИКИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ДУПЛЕКСОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ
Для выбора оптимальных условий исследования структуры дуплексов методом 2М-ЯМР были определены термодинамические параметры комплексообразования исследуемых дуплексов (o-i) - (D-з), а также pd(GCCAAAC)rA-pd(TGTTTGGC) ((D-4)), Исследование термической денатурации вышеуказанных дуплексов проводили спектрофотометрически.
На рис.1 представлены первые производные зависимости доли дуплекса от температуры для комплементарных комплексов (d-í )-(о-4). В табл.1 приведены значения тпд, а также термодинамические параметры АН, AS и AG (при 37°С) для этих дуплексов, рассчитанные на основании кривых денатурации. Анализ приведенных данных свидетельствует, что стабильность дуплекса (d-2), содержащего остаток фена-зина значительно выше, чем стабильность исходного дуплекса (D-З) и выше, чем стабильность октануклеотидного дуплекса (D-4). При этом феназиниевый остаток стабилизирует дуплекс (D-2) в основном за счет дополнительных взаимодействий, а именно, за счет стекинг-взаимодействия с парой (c-i)-(g-?) и возможных электростатических взаимодействий (преобладает, энтапьпийный вклад в изменение свободной энергии; дан составляет 11,4 ккал/моль). Дуплекс (d-1) показал высокую стабильность (ТПЛ=73°С) и- независимость его температуры плавления от концентрации в широком диапазоне от 0,5'10~5 до
0,5-Ю- М, что является критерием мономолекулярности процесса термической денатурации ковалентного аддукта. При этом наблщаемая высокая термическая стабильность дуплекса ю-1 ) имеет в значительной мере статистическую природу в связи с пространственной сближенностью двух комплементарных цепей в ковалентном аддукте.
Процесс термической денатурации был исследован также с применением 1н-ЯМР-спектроскопии на примере дуплекса <о-ч) с использованием данных по температурной зависимости химических сдвигов сигналов необмэниваодихся протонов каждой отдельной пары оснований. Установлено, что тпл для внутренних пар комплекса (Тпл 59 - г°с) в целом несколько выше, чем для концевых пар (Тпд - 57 - 2°С).
Рис.1. Кривые плавления, представленные в виде 1-ой производной доли дуплексной ■ формы'
дуплексов: 1-10-3), 1,0-10"
м
•0(1 -РЭ/иНКО) 5 \
г Л5 У 4 / \
* У \ / /\ \ \/ у / \ \ \ / \
3-(0-2), ПО'Ю'^М,
4-(0-1 ), 0,5-10_4М '
5-(0-1 ), 0,5-10_5Ме'""м и и "1« Буфер: 0.16М КаС1, о,01М натрий-фосфат, рн Т.о
Таблица. 1. Значения тпл и термодинамические параметры дн, дз и ДО для дуплексов (0-1), (0-2), (0-з> и (0-4).
(0-3) (0-4) Ю-2) (0-1 1
Т (° Г ) хпл 1 Л' 27,В 43,2 48. 1 73,0
йН ккал/моль -43,7 -60,1 -55,1 -51,1
¿Б кал/моль/К -124,2 -169,0 -150,3 -147,5
ДО (37°С) ккал/моль -5,2 -7,7 -8,4 -5,3
Точность измерения параметров: - 1; тп„ расчитаны из величин ДН, Дв и ас для концентрации дуплекса 1С Тй.
2. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ОЛИГОНУКЛЕОШНЫХ ДУПЛЕКСОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ
Исследование пространственной структуры дуплексов (0-1)- Ю-3) выполнено методом 2М 1Н-ЯМР-спектроскопии в комбинации с методом ОММ. Конформационный анализ каждого модельного дуплекса включал в себя три основных этапа:
1) получение наиболее полной спектральной информации из 1м и гм-ЯМР-спектров (отнесение сигналов в спектрах ЯМР к соответствующим ядрам в молекуле НК, измерение их химических сдвигов, определение скоростей кроес-релаксации, измерение констант спин-спинового взаимодействия и т.д.);
2) расчет межпротонных расстояний по экспериментально измеренным величинам ЯЭО, а такке определение конформаций остатков дезоксирибозы в составе обоих олигонуклеотидных цепей по величинам констант спин-спинового взаимодействия;
3) расчет энергетически оптимальной-структуры молекулы методом ОММ , наилучшим образом удовлетворяющей набору полученных экспериментальных данных.
2.1. ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАВДИ НЕМОДИФИВДРОВАНКОГО ДУПЛЕКСА (0-3)
Исследование пространственной организации дуплекса ю-з) явилось важнейшим этапом работы, необходимым для последующего анализа модельных модифицированных дуплексов Ю-1) и (0-2). Корректная оценка степени конформационных изменений в модифицированных дуплексах, связанных с наличием ковалентной сшивки в случае (0-1) или наличием остатка феназина в случае (0-2), может быть сделана, только путем сравнения с конформацией немодифицированного дуплекса (0-3 1. Итоговая структура дуплекса Ю-З), полученная в результате оптимизации методом ОММ с учетам экспериментальных ограничений на межпротонные расстояния, была использована в дальнеГплем в качестве стартовой модели для олкгонуклеотидной части дуплексоз (0-2) и (0-1) в процессе их оптимизации.
2.1.1. ОТНЕСЕНИЕ СИГНАЛОВ Е Ч-ЬЯМР-СПЕКТРАХ ДУПЛЕКСА (0-3)
В области резонанса протонов водородных связей дуплекса Ю-з) наблюдаются сигналы иминопротонов только внутренних пар оснований, идентификация которых проведена на основании сравнения соответствующих спектральных областей ЯМР-спектров дуплексов ю-з : и Ю-2). Сигналы иминопротонов концевых пар 1«гг-1 )-(га-7) и («из-? ;■ (¿0-1 ) в спектре отсутствуют вследствие их быстрого обмена с протонами растворителя.
Отнесение сигналов необменивапцихся протонов дуплекса (О-Э), осуществлено с использованием 1н-соеу и 1н-1ЮЕЗУ-спектров. На рис.2 приведен ЫОЕБУ-спектр дуплекса (о-з). Выделенные фрагменты спектра, обозначенные символами А. В и С, содержат Н6/Н8 - Н1'/Н5, Н6/И8 - Н2*/Н2' '/СН3 и Н1-/Н5 - Н2,/Н2"/СН3 - области резонанса, соответственно. Идентификацию кросс-пиков проводили в соответствии со стратегией отнесения, разработанной для правозакрученных форм ДНК. Этот метод основан на том, что в правозакрученной ДНК Н6/Н8 протон гетероциклического основания пространственно сближен с Н1*/Н2'/Н2'' протонами собственной дезоксирибозы, а также с Н1'/Н2'/Н2" протонами 5'-соседнего с ним нуклеотидного остатка:
--(Н6/Н8)1_1----(Н1 '/нг'/нг" )1_1----(Нб/Н8)1---(Н1'/Н2'/Н2"
Протоны НЗ' и Н4' были идентифицированы через ядерный эффект Овер-хаузера (ЯЭО) с Н1' протонами. Отнесение НЗ' подтверждали, используя их внутринуклеотидные ЯЭО-взаимодействиям с ароматическими и Н2'/Н2'' протонами а также ^взаимодействие (Н3')1 с (Н2"' ^ в «КУ-спектре. Правильность отнесения сигналов Н4' подтверждали, анализируя кросс-пики (Н4')1-(НЗ'в с сет-спектре.
2.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАССТОЯНИЙ МЕШУ ПРОТОНАМИ В ДУПЛЕКСЕ (0-3)
Для получения структурной информации был определен ряд расстояний между протонами дунлекса (0-3), сближенными в-пространстве: (Н6/Н8)1- (Н1')1; Ш6/Н8)1 - (Н1'»¿.'С, (Н6/Н8)± - (Н2* )._» (Нб/Нв)^ (Н2,,)1_1; (Н5/СНЭ)1 - (Нб/Нв)^,; (Щ/СН^ - (Н2* )1_1! (Н5/СН3)1 - (Нг")1и; (НГ)1 - {Н2"
На первом этапе определения расстояний для каждой пары протонов 1 и о была измерена скорость кросс-релаксации а^ между этими протонами по методу двуспиновой апроксимации с использованием приближения начальных скоростей:
ЯЭО^Ш ~ о^ 1 , при 1;—>0 (1)
Величину скорости кросс-релаксации определяли из начального линейного участка зависимости ЯЭО от времени облучения из соотношения:
ЯЭ0.(1)
а = —:3--12)
Диапазон времени насыщения сигналов составлял от о,05 до 0,20 с.
На следующем этапе работы для каждой пары протонов 1 и 3 вычисляли относительное расстояние г.. . из соотношения (3), используя известное межпротонное расстояние между базисной парой протонов к и 1 и полученные из серии -1М-ЯЭ0 экспериментов скорости
кросс-релаксации о^ и
ГИ 1/6
1Г- = < — ' (3)
В качестве гк1 использовали известные внутринуклеотидные расстояния. которые не зависят от пространственной структуры молекулы:
о
ГН2'-Н2".ГС(Н5!-С(Н6) и ГТ(СН3)-Т(Н6)' РаВНЫе 1'8' 2,5 И 2'7 А' соответственно. При этс;.: выбирали таким образом, чтобы межпротонные вектора 1—з" и к—1 имели примерно одинаковые времена корреляции т .
2.1.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ СПИН-СПИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ПРОТОНОВ УГЛЕВОДНЫХ ЦИКЛОВ
С целью исследования конформации углеводных циклов был проведен анализ вицинальных констант для протонов Н1', Н2', Н2" и НЗ' дуплекса (0-3): ^«з» ■ ••^•э» и ^»»з«' а также Г^ . < к
, • гДе = 1 ' 2'' ' ^2' = + ^'З'' ' '=
^■г" + 1Т2' '3'" Значения констант спин-спинового взаимо-
действия, а также £•],, и получали непосредственно из
профиля сечения соответствующего кросс-пика в фазочувствительном бог соэ'у-спектре.
2.1.4. ПОСТРОЕНИЕ СТРУКТУРЫ ДУПЛЕКСА (Р-З) В РАСТВОРЕ.
Построение структуры дуплекса Ш-З) в растворе проводили методом ОММ по программе, разработанной к.х.н. Воробьевым Ю.Н., при его активном участии, В качестве стартовой была Еыбрана В-подобная структура ДНК, структура 31, построенная с учетом зависимости спиральных параметров от последовательности оснований. Энергетическая оптимизация структуры была осуществлена по спиральным и торсионным параметрам а учетом экспериментально полученных ограничений на межпротонные расстояния. Оптимизацию проводили по функционалу Р , который является суммой полной энергии и геометрического штрафа отклонений расчетных расстояний от соответствующих расстояний, полученных из эксперимента:
{Г = Еполн + ЕЕяэо (4 1
Еполн включает одновременно энергии растяжения связей, энергии деформации валентных и торсионных углов, энергии электростатических и вандерваальсовых взаимодействий, энергии гидратаций и т.д. Геометрический штраф отклонений по межпротонным расстояниям Елэо описывается в виде гармонического псевдопотенциала ограничений ЯЭО:
?
= С_(г, . - г. .), если г?. > г..
10
'13
,(г13 - если < г..
где;
и г1;. - экспериментальные и расчетные значения межпротонных расстояний; с_>+ - силовые константы, значения которых зависят от погрешности определения расстояний г?..; к - постоянная Больцма-на, т- абсолютная температура; Э - масштабный фактор, равный 2;
погрешность определения расстояния
'/СН3 и Н1'/Н5
' /СН3
области резонанса, соответственно.
Рис. 2. 1Н-Ю1£У-спектр дуплекса ю-З). Выделенные■ фрагменты спектра, обозначенные символами А. В и С, содержат Н6/Н8 НГ/Н5, Н6/Н8 Н2'/Н21
НЭ' /Н2'
| ъ?
< 1 • » 4>
• • ■! <. 1 • с %
и «. < • •1 [ е'- 'в * (
| м
— 1 ?! ✓
1 •
, * <1 сЭ
•
'Ь • • 1 £ • с
л Ч •'-Л - - ■
А' Г**
3 "7 * — • . - *
I
м-а-
•3.0
5.0
7.0
9-0
8.5
6.5
4.5
2.5
Рис.3. Стереопара итоговой структуры дуплекса ю-З), полученной в результате энергетической оптимизации стартовой структуры Б1 с учетом ЯМР-данных.
В результате оптимизации получена итоговая структура б1* 'рис.зи соответствующая минимуму функционала метода ОММ и в целом удовлетворяющая полученному из ЯМР-эк'сперимента набору межпротсн-
ных расстояний. Сравнение расчетных констант спин-спинового взаимодействия, полученных для конформаций рибозы в итоговой-структуре 31*. с результатами независимого определения этих констант из эксперимента показало , что в целом между расчетными и экспериментальными значениями и Зд1>2-' имеется удовлетворительное соответствие со средним квадратичным отклонением порядка погрешности эксперимента 1 Гц). Значения фазовых углов псевдовращения Р для углеводных циклов итоговой структуры * в целом соответствуют области 2'-эндо-конформации фуранозного кольца с интервалом угла псевдовращения от 135° до 194°.
2.2. ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЩИ ДУПЛЕКСА (0-2)
Изучение особенностей пространственной структуры стабилизированных комплексов в настоящей работе проведено на примере дуплекса (11-2), содержащего ковалентно присоединенный по 5'-фосфатной группе гептануклеотида остаток ю-(2-гидроксиэтил)феназиния.
2.2.1. ОТНЕСЕНИЕ СИГНАЛОВ В 1Н-ЯМР-СПЕКТРАХ ДУПЛЕКСА (0-2)
Анализ области резонанса иминопротонов водородных связей дуплекса (о-2) показал, что наличие остатка Р1ш в его составе приводит к появлению в спектре дополнительного интенсивного сигнала иминопротона пары (с«»-7)-(<1С-1 ), а также к увеличению интенсивности сигналов иминопротонов пар (<*»-2) • (ас-б) и («ю-б )• (<«-2) по сравнению с дуплексом (0-3). Это свидетельствует о повышенной прочности дуплекса (0-2) и о замедлении.обменных процессов иминопротонов с протонами растворителя.
На рис.4 представлен полный 1Н-1)0ЕЗУ-спектр дуплекса (0-2). Сравнение соответствующих областей ШЕЗУ-спектров дуплексов (о-2) и Ю-з) показало, что наличие остатка Р1т на 5'-концевом фосфате гептануклеотида не вносит принципиальных изменений в пространственную структуру дуплекса, которая также описывается В-подобной формой ДНК. Поэтому идентификация сигналов в 2М-ЯМР-сг.ектре дуплекса (о-2) была проведена по аналогии с отнесением сигналов в спектре дуплекса (о-з).
Отнесение сигналов протонов красителя проводили, используя 1Н-С03¥, 1Н-М0ЕВУ и 1Н,13с-соз?-спектры дуплекса ю-2), а также сравнивая их с соответствующими спектрами 2-диметиламино-ю-(2-гидроксиэтил)феназиния и 1Р1т)-Ш-(СНг)2-ЫН-р<1(ССАААСА).
2.2.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОТОНОВ КРАСИТЕЛЯ С ПРОТОНАМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
Анализ ЫОЕЗУ-спектра дуплекса (0-2) позволил выявить ЯЭО-
взаимодействия между протонами феназина и протонами ближайших к нему нувлеотидннх звеньев dc-1, dG-7 и dC-8. Так, з Н1'-Н6/Н8-06ласти спектра (рис.4)" наблюдается два кросс-пика (обозначены символами а и ь), отражающие ЯЭО-взаимодействие протона Hi'(dG-7) с н(5) и н(б) протонами феназиневого красителя. Эти se протоны феназина в H2'/H2"- н6/н8-области спектра образуют кросс-
Рис. 4. 1K-NOESY-cneKTp дуплекса (D-2). Кросс-пики между протонами Pirn me) - сипя,, hls)- ci12)h2, hit) - 0(11 )h2, h(7j - c(12)hg, h(1) - с (11 )hp, h(1) - c(12)h2, h(1) - c!13)h2, h; 1 i - clujh,, on2)h? - с(1 з)hp, ci11ih, - c(13)h2, h«1) - h'b) обозначены символами 1-11, соответственно. Кросс-пики, отражающие взаимодействие протонов Fhn и -Ш1-(СН2)2-Ш-группы с протонами олигонук-леотидов, обозначены символами а - а': <* ' Hi"(G-~; - Н(6); ь h1mg-7) - н15 ); с - н2' /н2' ' (0-7 ) - н(6>; d - h2'/h?'mg-7 1 -Н(5): h - c(13)hp - hblc-1); h' - ci 14)h„ - h6(c-1)i 9 - c(13>hp -HRlP-1 l.-o" - с! 1 4 )h„ - H5!C-i )• "
пики о и а, связывающие их с Н2'~ и (или) Н2''- протонами <«-7 (значения химических сдвигов сигначов Н2' и Н2''!сЮ-7) совпадают). Важно отметить, что ЯЭО-взаимодействие между Н1', Н2' и Н2" протонами сЮ-7 и Нб протоном 3'-соседнего с ним еС-8, характерное для правоспиральной ДНК, в данном случае отсутствует. На основании полученных данных сделан вывод о том, что остаток феназина интер-калирует между сю-7— и ас-8-звеньями олигонуклеотидной цепи, вытесняя нуклеотидный остаток ас-З из структуры дуплекса.
Связующий этилендиаминовый фрагмент взаимодействует с ароматическими протонами кошевого дезоксицитидина ас-1. Так, метиленовые протоны СН?яЗ) в ыогву-спектре образуют интенсивные кросс-пики ъ и ч с Кб и Н5 протонами ас-1. Вторая метиленовая группа с(14>Н2 взаимодействует с этими протонами слабее, образуя кросс-пики ь' и ч" меньшей интенсивности.
2.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАССТОЯНИЯ МЕЖДУ ПРОТОНАМИ ДУПЛЕКСА (0-2)
Методика определения межпр.-тонных расстояний внутри олигонук-леотидного фрагмента дуплекса 0-2) была такой же, как и в случае дуплекса (О-З). При определении расстояний между протонами модифи-цирущей группировки и протонами :'лигонуклестидов для выбора стандартного вектора были определены гс для некоторых пар олигонуклео-тидных протонов, а также для протонов феназина. Значения т^ получали из соотношения 1.4}:
Юг6., 1Г;" 1+4О?Х2 ' 1С с
где: ^ - экспериментальная скорость кросс-релаксации для протонов з. и л, т - эффективное время корреляции вектора между протонами 1 и г.. - расстояние между этими протонами, и - рабочая частота прибора (в рад-сек ); г - гиромагнитное отношение и й -постоянная Планка, деленная на 2я. Было установлено, что феназини-евый фрагмент и этилендиаминовая группа являются более подвижными ,:тс Н(6)-Н(7)=0'79'1сг9сек 11 С. и т2-н^/н8= о.бЗ-Ю-^ею. чем гетероциклические основания внутренних остатков олигонуклеотидов |г~ НСИС )-кб (С) = 1 10~'сек 1 ■ На основании этого расстояния НрЬп - Ир>-и! • Нр^ _ Ндщ определяли из соотношения (4Ь используя время корреляции ароматических протонов феназина. При определен::;! расстояний С(13,14Ш2 - НрЬп и С 13,14)Нр - Н^ использовали время корреляции между ароматическими и метиленовыми протона",РЬп. Значения расстояний между протонами феназиниевого фрагмента и олигонуклеотидными протонами приведены в табл.2.
2.2.4.ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ СПИН-СПИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОТОНОВ И КОНФОРМАЦИИ УГЛЕВОДНЫХ ЦИКЛОВ ДУПЛЕКСА (D-2).
Величины констант спин-спинового взаимодействия для дуплекса (d-2) определяли тем же методом, что и в случае дуплекса (d-i), используя фазочувствительные COSY DQF спектры. Анализ данных показал, что разница в значениях констант для дуплексов (d-2 j и (q-з) в основном не превышает предела экспериментальной ошибки. Таким образом, наличие остатка феназина в составе дуплекса не влияет на конформационное состояние всех углеводных циклов, которое также описывается 2'-эндо-типом конформации дезоксирибозн.
о
Таблица 2. Значения расстояний (А, экспериментальные и расчетные)
для пар протонов Hphn - Hphn, Hpim -'Н^, Hphn -с (13,1 4 )н ^ и нд^ - с(13,14)н2 дуплекса (d-2 ),
Hi - Hi г..расч. "Г Hd ri;j.pac4. rin
S(Phn)5* эк сп. S(Phn)5* эк сп.
Н(5 )-Н1 ' (G-7 ) 2,81 3,4 Н(1 )-С(14)Н2 4,56 3,23 2,9
* Н(5)-Н2'/Н2" (С-7) 2,76 1 ,75 3,9 Н(8) -С(12)Н2 3.82 2,60 2,4
Н(6)-Н1 • (G-7) 3,15 3,2 Н5(С-1)-С(13)Н2 3,21 3,01 2,6
ж: Н(6)-Н2'/Н2" (G-7) г 4,37 2,62 2,9 Н5(С-1)-С(14)Hg 4,55 6,10 2,8
Н(1) -С(12)Н2 2,60 3,82 2,4 Н6(С-1)-С(13)Н2 3,37 3,86 2,7
Н(1 ) —С (13) Н^ 2,92 4,12 2,8 Нб(С-1)-С(14IHg 4,32 4,70 2,9
^Сигналы Н2' и Н2" (dG-7) в Н-ЯМР-спектре совпадают.
2.2.5.ПОСТРОЕНИЕ СТРУКТУРЫ ДУПЛЕКСА (0-2) В РАСТВОРЕ.
Построение структуры дуплекса (0-2) в растворе проводили тем же методом, что и в случае дуплекса (0-3). В качестве стартовой конформации для олигонуклеотидного фрагмента'молекулы рассматривали структуру Б1*, полученную при оптимизации исходного немодифиш-г рованного дуплекса (э-з). На ее основе были сконструированы раз-
личные варианты конформаций дуплекса (0-2), которые отличаются различным положением феназиниевого фрагмента в структуре молекулы. Однако, данные по ЯЭО между протонами феназиниевого фрагмента и ближайших куклеотидаых звеньев позволили из ьсего набора энергетически возможных конформаций выбрать для дальнейшей оптимизации стартовые конформации только двух структур, s(Phn)3 и S(Phn)5. Обе структуры характеризуются ингеркаляцией полициклической системы феназина между dG-7- и dc-8-звеньями олигонуклеотидной цепи и различаются ориентацией плоскости красителя, а именно поворотом плоскости полициклической системы феназина на 180° вокруг связи С(2)-М. Оптимизацию проводили по спиральным и торсионным параметрам феназина, линкера, соединяющего остаток феназина с дуплексом, и ближайших к феназину нуклеотидных звеньев (dc-1, dG-7 и dc-8) с учетом экспериментальных ограничений на расстояния.
В результате оптимизации структуры S(Phn)3 не удалось получить соответствия между расчетными и экспериментальными данными. По этой при ¡ине указанная структура была исключена из дальнейшего рассмотрения. Структура S(Phn)5* (рис.5), полученная в результате оптимизации S(Phn)5, с одной стороны, соответствует минимуму энергии, а с другой стороны, в целом удовлетворяет полученному из эксперимента набору межпротонных расстояний.• Основновной особенностью оптимизированной структуры S(Fhn)5* является то, что феназиновое
кольцо .дуплег/ч D-2 > находится в стэкинге с последней парой осно-
о
ваний (dc-1 i-i.<ю-7) на расстоянии примерно 4А и на расстоянии око-о
ло 5А от неспаренного нуклеозидкого звена <эс-8.
Рис.
Стереопара итоговой
структуры э (РЪи )5 дуплекса Ю-2), полученной в результате энергетической оптимизации стартовой структуры Б1РЬп)5 с учетом ЯМР-данных.
S|Phn)5'
2.3. ШО.ТЩОВАНИЕ КОНФОРМАЦИИ КОВАЛЕНТНОГО АДДУКТА {0-1 )
Исследование конформации продуктов комплементарно-чдресованной модификации проведено на примере ковалентного аддукта ■о-!). Доказательство структуры ю-1) основано на его свойствах.
Пониженная электрофоретическая подвижность продукта алкилирования, его высокая термическая стабильность по сравнению с немодифициро-ванным дуплексом (d-з). а также тот факт, что процесс термической денатурации (D-i) протекает по механизму внутримолекулярной реакции, доказывает напичие ковалентной сшивки между двумя цепями оли-гонуклеотидов. Точка алкилирования доказана экспериментами по расщеплению (D-1 i в условиях лабильности алкилированного по N-3 положению дезоксицигидина.
2.3.1.ОТНЕСЕНИЕ СИГНАЛОВ ПРОТОНОВ ДУПЛЕКСА (d-t).
Практически полное совпадение спектров дуплексов (D-1) и (d-з) в области резонанса обменивавшихся протонов водородных связей позволило принять для сигналов иминопротонов дуплекса (D-1) то же самое отнесение, что и для сигналов немодифицировэнного дуплекса (0-3). Полученные данные свидетельствуют о том, чтб наличие ковалентной сшивки в дуплексе (d-i) не препятствует интенсивному обмену прогонов водородных связей с растворителем, что согласуется со статистической природой стабилизации дуплекса (о-i), обусловленной пространственной сближенностью двух комплементарных цепей в ковалентном аддукте.
Анализ 1Н-ЫОЕЗУ-спектра дуплекса (.d-i ) показал (рис.6), что остаток бензиламида, ковалеятно связанный с нуклеозидными звеньями dc-1 и dc-8, не вносит существенных изменений в структуру двойной спирали. Поэтому идентификация сигналов в 2М-ЯМР-спектре дуплекса (d-i ) была проведена по аналогии с отнесением сигналов дуплекса (о-з). Установлено, что сигналы протонов ñb и нб алкилированного 3'-концевого нуклеозида dc-8 ковалентного аддукта (0-1) существенно смешены в область сильного поля по сравнению с соответствующими сигналами дуплекса (d-з). Вероятно, это связано с тем, что нуклео-зидное звено dC-e, не участвующее в комплементарном связывании в составе дуплекса (d-з), при алкилировании в составе дуплекса (d-1) теряет свою конформационную подвижность и включается в стэкинг-взаимодействие с предыдущей парой оснований.
Отнесение сигналов бензиламидного фрагмента* осуществляли с использованием 1н-созу-спектра, а также 1Н-Ы0ЕЗУ-спектра, анализируя ЯЭО-взаимодэйствия в соответствии со схемой i.
* -
Сигналы протонов на и На', также как и протонов нь и НЬ' совпадают по своему химическому сдвигу, что свидетельствует об их эквивалентности, вероятно.вследствие вращения фенильного кольца. Магнитоэк-вивалентными оказались также протоны групп C(1)1L>, С(?)И2 и CÍ3)H3>
Схема 1.
С(1)Нг-С(2)Н2~
2.3.2.ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЕЕНЗИЛАМЩНОГО ФРАГМЕНТА С ПРОТОНАМИ ДУПЛЕКСА.
Совокупность данных по ЯЭО между протонами модифицирующей группировки и протонами олигонуклеотидов свидетельствует о пространственной сближенности бензиламидного фрагмента и 5'-концевого звена гептануклеотидной цепи <*:-1 в дуплексе (0-1). Так, в ШЕБУ-спектре ковалентяого аддукга (рис.6) обнаружены
Рис.6. 1Н-ШЕЗУ-спектр дуплекса (о-1 >. Указаны положения диагональных сигналов протонов бензиламидного фрагмента. Кросс-пики между взаимодействующими протонами внутри бензиламидного фрагмента обозначены 1 - 11; кросс-пики между взаимодействующими протонами бензиламидного фрагмента и протонами нуклеозидных остатков обозначены а - 1: (1 I - На/На'-НЪ/НЪ'; (2) - С(1 Ц^-С(2Ш^, (3) -
С С1 Ж^-С О )Н3; (4) - С 12 )Н0
: (3 ж-,
(5)
На/На'
-С(1)Н2; (6) -
На/На'-С(2)Н~
(7) - На/На'-С(3 )Н.
3'
(8) - НЬ/НЬ'-С(1 Ж2; (9)
КЬ/НЬ' -С (2 Ш^/С (4 !Н'; ! 10) -(а) - 0-1 <НГ ¡-НЬ/НЪ'; (Ь) -(Г) - С-1(Н6'-0!4)Н; (д) -(I | - 0-1<Н5'-С>4Ф.'.
НЪ/НЬ'-С(3)Н3; С-1(Н57-НЬ/НЬ'; 0-1(Н6)-С(4)Н';
(11) - НЪ/НЬ'-С(4)Н; (с) - С-1 (Н6)-НЪ/НЪ*; (к; - С-1(Н5)-С(4)Н;
2
3
7
4
Рис. ?. Стереопара итоговой структуры s(Aik)8* дуплекса (D-1), полученной в результате энергетической оптимизации стартовой структуры s(Alk)8* с учетом ЯМР-данных
кросс-пики между ароматическими протонами НЬ/НЪ' бензиламидного фрагмента и протонами Н1', Н5 и Нб нуклеотидного ЗЕена dC-1 (пики а, ь и с, соответственно). Метиленовые протоны групп С(4)н и с(4)Н' пространственно сближены с Нб и Н5 протонами этого же нуклеотидного остатка, о чем свидетельствуют кросс-пики г, д, к и i, соответственно. Полученные данные позволяют сделать вывод, что бензиламидннй остаток алкилирувдей группировки локализован в области недостающего звена гептануклеотидной цепи, вблизи от нуклео-зидного звена dC-1 и алкилированного основания нуклеозидного звена dc-в из противоположной цепи.
3.3.3.ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАССТОЯНИЙ МЕЖЦУ ПРОТОНАМИ ДУПЛЕКСА (O-i).
Расстояния между сближенными в пространстве олигонуклеотидны-ми протонами дуплекса (D-1) определяли также, как и в случае дуплекса (о-з). Анализ времени корреляции ароматических протонов модифицирующей группировки показал = 0>?8 что оно
заметно короче, чем т для внутренних дезоксицитидинов dc-г и dc-б
—Q
^гн5(с)-нб(с) = 10 °сновании этого, расстояния между
протонами модифицирующей группировки и протонами олигонуклеотидов определяли из соотношения (4), используя самое короткое (для данной пары протонов) время корреляции. Е случае метиленовых протонов бензиламидного фрагмента использовали хс метиленовых протонов углеводных циклов. Значения расстояний между протонами бензиламидного фрагмента и протонами ближайших нуклеотидных звеньев представлены в табл.з.
3.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ СПИН-СПИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И КОНФОРМАЦИИ УГЛЕВОДНЫХ ЦИКЛОВ ДУПЛЕКСА (D-1).
Величины констант спин-спинового взаимодействия определяли тем же
методом, что и в случае дуплекса (И-з), используя фазочувствительные cosy dqf спектры. Результаты показали, что различие в значениях констант для дуплексов (d-3) и (d-i ) в основном не превышает предела экспериментальной ошибки. Таким образом, наличие ковалентного мостика между нуклеозидными звеньями dc-1 и dc-8 практически не влияет на конформационное состояние их углеводных циклов, которое также соответствует 2'-эндо-конформа-ции дезоксирибозы.
о
Таблица 3.Значения расстояний (А, экспериментальные и расчетные) для структуры s(Alk)8* между протонами бензиламидного фрагмента и некоторыми протонами олигонуклеотидов .дуплекса.
Hi- Hj 0 эксп. r±.U) расчета.
dC- ■1 (H6) - Hb/Hb' 3,2 4.34:3,80
dC- 1(H5) - Hb /Hb' 3,4 3,1 4!5,89
dC- 1 (H1 ' )- Hb/Hb' 3,5 4.54;5,44
dC- 1(H6) - C(4)H 2,3 3,00;
dC- 1(Hb) - С(4)H' 3,3 4,27
dC- 1 (H5)" - С (4 )H 3,7 3,00
dC- HH5) - C(4)H' 4,4 4,62
3.3.5.ПОСТРОЕНИЕ СТРУКТУРЫ ДУПЛЕКСА (D-1) Б РАСТВОРЕ.
Построение структуры дуплекса (D-i ) в растворе проводили тем же методом, что и в случае дуплексов (D-з) и (D-2). В качестве стартовой конформации для олигонуклеотидного фрагмента молекулы (□-1 ) рассматривали структуру S1*, перченную при оптимизации исходного немодифицированного дуплекса (D-3). На ее основе было сконструировано 6 стартовых структур (S(Aik)l - S(Aik)8), представляющих два конфермационных семейства дуплекса ю-1) с различным положением бензиламидного фрагмента в структуре молекулы. Отличие заключается в различной ориентации метальной группы с(з , которая может еыть направлена в сторону большой бороздки (стуктуры SlAlk ) 1-S(Alk)4> или малой сорозлки (структуры S(Alk)5-S(Alk)8) дуплекса. Конформационные различия структур внутри каждого из указанных семейств сЕязано с различной ориентацией протонов мети-
леновой группы с (4 )lt,. Б оптимизацию были включены спиральные и торсионные параметры бензиламидной группировки и ближайших к ней звеньев (dC-1, dG-7, dc-8). Б результате оптимизации были получены итоговые структуры S(Aik)i* - s(Aik)8*. Анализ конформационных и энергетических параметров показал, что структура s(Alk)8 является наиболее низкоэнергетической и характеризуется удовлетворительным соответствием между расчетными и экспериментальными значениями межпротонных расстояний (табл.3). На основании этого структура s(Alk)8* (рис.7) была выбрана в качестве модели, наиболее адекватно описывающей конформацисданое состояние дуплекса (d-i) в растворе. Основной особенностью этой структуры является то, что гетероциклическое основание алкилированного дезоксицитидина dc-8 располагается параллельно плоскости, образуемой (dG-7)-(dC-i)- парой
о
оснований, на расстоянии около ЗА от нуклеозидного остатка (dG-7).
Плоскость фенильного кольца бензиламидного фрагмента образует угол
величиной примерно ю° с плоскостью пары оснований (<ю-7) • (dc-1) и
о
находится на расстоянии около 3.7 А от нуклеозидного остатка С-1.
вывода
1. Осуществлен синтез ковалентного аддукта (D-i >, являшегося продуктом реакции внугрикомплексного алкилирования по N-3 положению нуклеотидного звена С (8) октануклеотида-мишени pd(TpGpTpTpTpGpGpC) .с помощью 4-[ы-2-хлорэтил-ы-метиламино] бензил-5'-фосфамидного производного гептануклеотида
р<1(СрСр/5рДр<5рСрА).
2. Методом термической денатурации по оптическим кривым плавления и(или)- по зависимости химических сдвигов сигналов ряда протонов в спектрах 1Н-ЯМР от температуры исследована в рамках модели двух состояний термодинамика дуплексов:
- pd(TpGpTpTpTpGpGpC) pd(GpCf>CpApApApCp)rA (D-4),
- pd(TpGpTpTpTpGpGpC) -pd(CpCpApApApCpA) (D-3 ), а также термодинамика его производных:
- ковалентного аддукта (D-i),
- дуплекса (D-2), являющегося комплексом pd(TpGpTpTpTpGpGpC) и гептануклеотида рьп-ин-(сн2)2-мн-ра(срсрдрдрдрсрд), содержащего ковалентно присоединенный по 5'-фосфатной группе остаток 10-(г-гидроксиэтил)феназиния.
Установлено, что стабильность дуплекса (D-2), содержащего остаток феназина значительно выше (Т = 48°С), чем стабильность
исходного дуплекса (о-З, Тпл= 28°С) и выше, чем стабильность октануклеотидногг дуплекса (0-4, Тпд= 43°С). Показано, что феназинневый остаток стабилизирует дуплекс (о-2) в основном за счет дополнительных взаимодействий (преобладает, энтальпийный вклад в изменение -свободной энергии). В то же время, повышенная стабильность ковалентного аддукта (0-1, Тпд= 73°С) связана в основном со статистическим фактором, т.е. сближенностью комплементарных цепей.
3. Методами двумерной ЯМР спектроскопии в сочетании с методом ограниченной молекулярной механики определена низкоэнергетическая простанственная конформация дуплекса (0-3) в водном растворе, удовлетворяющая экспериментальным данным ЯМР. Установлено, что дуплекс (о-З) формирует В-подобную правозакрученную спираль ДНК с 2'-эндо-конформацией углеводных фрагментов.
4. С помощью вышеуказанной методологии исследована пространственная структура комплекса (0-2). Определена наиболее вероятная низкоэнергетическач конформация (о-2). Показано, что:
(а) наличие феназиниевого красителя не вызывает существенных изменений структуры дуплекса в целом, которая соответствует правсзакрученной В-форме ДНК с 2'-эндо-конформацией углеводных циклов;
(б) полициклическая система феназина интеркалирует между с(7) и С(8) - звеньями окгануклеогида, вытесняя нуклеотидный остаток с(8) из структуры дуплекса.
5. Исследована пространственная структура ковалентного аддукта (0-1 ) в водном растворе. Предложена наиболее вероятная низкоэнергетическая конформация дуплекса (0-1). Показано, что;
(а) наличие N-3-[С(8)]-этилен-[4-м-метиламино]бензил-5■-[С(1)]-фосфамидной ковалентной сшивки не приводит к существенным изменениям структуры основного фрагмента дуплекса, который сохраняет все особенности правозакрученной В-формы ДНК с 2'-эндо-конформацией углеводных циклов.
(б) бензильный остаток ковалентного мостика локализован в дуплексе в области недостающего звена гептануклеотидной цепи
о
на расстоянии около 3.7А от нуклеозидного остатка С(1).
Материалы диссертации опубликованы в следущих работах:
1. Бауск (Еиченкова) Е.В., Горн В.В., Лебедев A.B. Унифицированный вариант твердофазного триэфирного синтеза 5'-фосфорилированных олигодезоксинуклеотидов на основе ß-цианэтиловых, р-хлорфешловых эфиров Ы-ацилнуклеозид-5'-фосфатов.// Биоорган. химия. 1985. 1.11. № 6. С. 815-820.
2. Биченкова Е.В., Денисов А.Ю., Кутявин И.В.. Лебедев A.B. Исследование термической денатурации комплементарного комплекса d(pTGTTTGGC ) d(pGCCAAAC)А в водном растворе методом 1н-ЯМР.// Биоорган. химия. 1986. Т. 12. #1.1. С. 1493-1507.
3.Биченкова Е.В., Воробьев D.H., Кутявин И.В., Лебедев A.B., Мальцева Т.В., Тэннэ Е.Ю. Исследование пространственной структуры дуплекса d(pTGT?TGGC)'d(pCCAAAC)A в водном. растворе методом одно- и двумерной ^-ЯМР-спектроскопии и ограниченной молекулярной механики.// Биоорган. химия. 1990. Т.16. N9, С.1236-1258.
4. Биченкова Е.В., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М..Лебедев A.B., Мальцева Т.В.", Сальников Г.Е. Исследование структуры дуплекса (Phn-UHCCHg JNHj, )pd(cCÄAACAi pd(TGTTTGGC) с ковалентно присоединенным 10-(2-гидроксиэтил)феназинием в водном растворе методом 2М-1Н-ЯМР-спектроскопии.// Биоорган, химия. 1992. Т.18. КЗ. С. 398-412.
5. Биченкова Е.В., Горенштейн Л.А., Воробьев Ю.Н., Тэнне Е.Ю., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Мальцева Т.В., Лебедев A.B. Исследование пространственной структуры дуплекса (Piin-NHCCHg )HHg )pd (ссааасд) 'pd(TGTTTGGC) с ковалентно присоединенным ю-(2-гидроксиэтил)феназинием в водном растворе методом 2М-%-ЯМР-спектроскопии и методом ограниченной молекулярной механики. //Битаорган, химия. 1992. Т. 18. J67. С.901-910.
6. Биченкова Е.В., Абрамова Т.В., Мальцева Т.В., Лебедев A.B. Внутршсомплексное алкилированиа октануклеотида pd[tgtttggc] 5' - [ 4-И-2-метил-Л- (2-хдорэтил) амино ] бензилфосфамидным производным гептануклеотида р0[ссдааса]. Получение ковалентного аддукта и исследова1ше его пространственной структуры в. водном растворе методом двумерной 1Н-ЯМР-спектроскопии.// Биоорган, химия. 1992, Т.18, £9. С.1199-1213.