Пространственная структура олигонуклеотидных дуплексов и их производных по данным двумерной ЯМР-спектроскопии и ограниченной молекулярной механики тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Биченкова, Елена Владимировна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Новосибирск МЕСТО ЗАЩИТЫ
1993 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Автореферат по химии на тему «Пространственная структура олигонуклеотидных дуплексов и их производных по данным двумерной ЯМР-спектроскопии и ограниченной молекулярной механики»
 
Автореферат диссертации на тему "Пространственная структура олигонуклеотидных дуплексов и их производных по данным двумерной ЯМР-спектроскопии и ограниченной молекулярной механики"

РГ6 од

»,Л 11 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

1 1\ ШОН 1993 СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУГ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.133.6.088.53:543.422.25

Биченкова Елена Владимировна

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ДУПЛЕКСОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ ПО ДАННЫМ ДВУМЕРНОЙ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ И ОГРАНИЧЕННОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МЕХАНИКИ

02.00.10 — биоорганическая химия, химия природных соединений и физиологически активных Веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск — 1993 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель - кандидат химических наук

A.В.Лебедев

Официальные оппоненты: доктор химических наук

B.Л.Флорентьев кандидат химических наук В.И.Маматюк

Ведущая организация: Московский институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина Российской академии наук

Защита состоится 1993 года в ** часов

на заседании Специализированного Совета К 003.52.. 01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирек-90, проспект акад. Лаврентьева, В.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан " «-¿¿¿¿сЛ-* 199g г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат химических наук

'¿лр^ О.С.Федорова

Актуальность проблемы. Одним из наиболее перспективных подходов направленного воздействия на генетический аппара? клетки, является метод комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот (НК) с помощью производных олигонуклеотидов, содержащих в своем составе ковалентяо присоединенные реакционноспособные группировки.

Среди большого разнообразия химических групп, используемых в составе олигонуклеотидных реагентов, наиболее широко применяется алкилирующая 4-(Ы-2-хлорэтил-Н-метиламино)фенильная группа. Ранее были исследованы химические и кинетические аспекты реакции внутри-комплексного алкилирования олигояуклеотидными производными, несущими в своей структуре ароматическую Н-2-хлорэтилачиногруппу на 5' или 3'-конце цепи. В то же время структурные аспекты подобных реакций практически не изучены. Мояно полагать, что существенную роль в эффективности и позиционной направленности комплементарно-адресованной модификации играет пространственная ориентация модифицирующей группировки в структуре дуплекса. Поэтому для более полного понимания механизма комплементарно-адресованной модификации НК необходимо детальное изучение конформации олигонуклеогидных комплексов, а также структуры образующихся продуктов реакций. Исследование конформэционных особенностей образующихся аддуктов актуально также с точки зрения последувдего узнавания модифицированных участков нуклеиновых кислот ферментами репарации и влияния структуры модифицированного узла на эффективность процесса репара--ции образующихся дефектных участков нуклеиновых кислот.

Стабильность комплексов "КК-мишень - олигонуклеотидный реагент" может быть значительно повышена путем присоединения к олиго-нуклеотиду пслиароматических гетероциклических группировок, таких как остатки акридина, фенантридина и феназияа. Было показано, что реакции внутрикомплексного алкилирования в подобных стабилизированных комплексах, протекают с высокой эффективностью и селективностью. В связи с этим повышается роль и актуальность исследования общих механизмов стабилизации НК-дуплексов с помощью ковалэнтно-присоединенных интеркалирующих группировок, что также невозможно без изучения особенностей их пространственной структуры. В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение пространственной структуры как продуктов реакции ьнутрикомплексного алкилирования, так и стабилизированных комплексов в водном растворе.

Цель работы. Целью настоящей работы было исследование пространственной структуры модельных дуплексов (d-i), (d-2) и (d-з ) методом 1Н-ЯМР-спектроскопии в комбинации с методом ограниченной молекулярной механики:

j--pd(CpCpApApApCpA)

R <1 ( CpGpGpTpTpTpGpTp )

I__J (D-l )

Phn-NH-(CH2)2-NH-pd(CpCpApApApCpA) pd(CpCpApApApCp)rA

d(CpCpGpTpTpTpGpTp) d(CpGpCpTpTpTpGpTp)

(D-2) (D-3)

где: R - остаток 4-[H-2-хлорэтил-М-метиламино]бензилвидного фрагмента; phn - остаток. 10-(2-гидроксиэтил)феназшия.

Дуплекс (о-1) является продуктом реакции внутрикомплексного алкилирования по N-3 положении нуклеотидаого звена с(8) октанукле-отида-мишени pd(TpGpTpTpTpGpCpC) с помощью 4-[N-2-хлорэтил-М-ме-тиламино]бензил-5'-фосфамидного производного гептануклеотида pd(срСрАрАрАрСрА). Дуплекс (D-2), содержащий ковалентно присоединенный по 5'-фосфатной группе гептануклеотида остаток ю-(2-гидроксиэткл)-феназиния, представляет собой модель стабилизированного феназином дуплекса.

Новизна работы. Новизна данной работы заключается в том, что в ней впервые комбинацией методов двумерной ЯМР-спектроскопии (2М-ЯМР) и ограниченной молекулярной механики (ОММ) исслед'ованы пространственные структуры продукта реакции внутрикомплексного алкилирования и стабилизированного олигонуклеотидного дуплекса с ковалентно -присоединенным остатком феназина в водном растворе; получены термодинамические характеристики исследуемых комплексов.

Практическая ценность. Предложены модели наиболее вероятных низкоэнергетических конформаций ковалентного аддукта (0-1), а также феназин-содержащего дуплекса (D-2) в водном растворе. Эти сведения важны для детального понимания общих механизмов внутри-комплексной комплементарно-адресованной модификации НК, а также процессов стабилизации НК-дуплексов с помощью ковалентно-прксоеднненных интеркалирующих группировок.

Апробация работы. Результаты работа докладывались, на vi всесоюзной конференции "Спектроскопия биополимеров" (Харьков, 1988), международном симпозиуме "Синтез олигонуклеотидов: проблемы и границы практического применения" (Москва, 1991), vil всесоюзной конференции "Спектроскопия биополимеров" (Харьков, 1991), международной конференции "Терапевтические препараты на основе нуклеиновых кислот" (Clearwater Beach, Флорида, США, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ"!

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы из 134 наименований и содержит 19 таблиц и 40 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕРМОДИНАМИКИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ДУПЛЕКСОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Для выбора оптимальных условий исследования структуры дуплексов методом 2М-ЯМР были определены термодинамические параметры комплексообразования исследуемых дуплексов (o-i) - (D-з), а также pd(GCCAAAC)rA-pd(TGTTTGGC) ((D-4)), Исследование термической денатурации вышеуказанных дуплексов проводили спектрофотометрически.

На рис.1 представлены первые производные зависимости доли дуплекса от температуры для комплементарных комплексов (d-í )-(о-4). В табл.1 приведены значения тпд, а также термодинамические параметры АН, AS и AG (при 37°С) для этих дуплексов, рассчитанные на основании кривых денатурации. Анализ приведенных данных свидетельствует, что стабильность дуплекса (d-2), содержащего остаток фена-зина значительно выше, чем стабильность исходного дуплекса (D-З) и выше, чем стабильность октануклеотидного дуплекса (D-4). При этом феназиниевый остаток стабилизирует дуплекс (D-2) в основном за счет дополнительных взаимодействий, а именно, за счет стекинг-взаимодействия с парой (c-i)-(g-?) и возможных электростатических взаимодействий (преобладает, энтапьпийный вклад в изменение свободной энергии; дан составляет 11,4 ккал/моль). Дуплекс (d-1) показал высокую стабильность (ТПЛ=73°С) и- независимость его температуры плавления от концентрации в широком диапазоне от 0,5'10~5 до

0,5-Ю- М, что является критерием мономолекулярности процесса термической денатурации ковалентного аддукта. При этом наблщаемая высокая термическая стабильность дуплекса ю-1 ) имеет в значительной мере статистическую природу в связи с пространственной сближенностью двух комплементарных цепей в ковалентном аддукте.

Процесс термической денатурации был исследован также с применением 1н-ЯМР-спектроскопии на примере дуплекса <о-ч) с использованием данных по температурной зависимости химических сдвигов сигналов необмэниваодихся протонов каждой отдельной пары оснований. Установлено, что тпл для внутренних пар комплекса (Тпл 59 - г°с) в целом несколько выше, чем для концевых пар (Тпд - 57 - 2°С).

Рис.1. Кривые плавления, представленные в виде 1-ой производной доли дуплексной ■ формы'

дуплексов: 1-10-3), 1,0-10"

м

•0(1 -РЭ/иНКО) 5 \

г Л5 У 4 / \

* У \ / /\ \ \/ у / \ \ \ / \

3-(0-2), ПО'Ю'^М,

4-(0-1 ), 0,5-10_4М '

5-(0-1 ), 0,5-10_5Ме'""м и и "1« Буфер: 0.16М КаС1, о,01М натрий-фосфат, рн Т.о

Таблица. 1. Значения тпл и термодинамические параметры дн, дз и ДО для дуплексов (0-1), (0-2), (0-з> и (0-4).

(0-3) (0-4) Ю-2) (0-1 1

Т (° Г ) хпл 1 Л' 27,В 43,2 48. 1 73,0

йН ккал/моль -43,7 -60,1 -55,1 -51,1

¿Б кал/моль/К -124,2 -169,0 -150,3 -147,5

ДО (37°С) ккал/моль -5,2 -7,7 -8,4 -5,3

Точность измерения параметров: - 1; тп„ расчитаны из величин ДН, Дв и ас для концентрации дуплекса 1С Тй.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ОЛИГОНУКЛЕОШНЫХ ДУПЛЕКСОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Исследование пространственной структуры дуплексов (0-1)- Ю-3) выполнено методом 2М 1Н-ЯМР-спектроскопии в комбинации с методом ОММ. Конформационный анализ каждого модельного дуплекса включал в себя три основных этапа:

1) получение наиболее полной спектральной информации из 1м и гм-ЯМР-спектров (отнесение сигналов в спектрах ЯМР к соответствующим ядрам в молекуле НК, измерение их химических сдвигов, определение скоростей кроес-релаксации, измерение констант спин-спинового взаимодействия и т.д.);

2) расчет межпротонных расстояний по экспериментально измеренным величинам ЯЭО, а такке определение конформаций остатков дезоксирибозы в составе обоих олигонуклеотидных цепей по величинам констант спин-спинового взаимодействия;

3) расчет энергетически оптимальной-структуры молекулы методом ОММ , наилучшим образом удовлетворяющей набору полученных экспериментальных данных.

2.1. ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАВДИ НЕМОДИФИВДРОВАНКОГО ДУПЛЕКСА (0-3)

Исследование пространственной организации дуплекса ю-з) явилось важнейшим этапом работы, необходимым для последующего анализа модельных модифицированных дуплексов Ю-1) и (0-2). Корректная оценка степени конформационных изменений в модифицированных дуплексах, связанных с наличием ковалентной сшивки в случае (0-1) или наличием остатка феназина в случае (0-2), может быть сделана, только путем сравнения с конформацией немодифицированного дуплекса (0-3 1. Итоговая структура дуплекса Ю-З), полученная в результате оптимизации методом ОММ с учетам экспериментальных ограничений на межпротонные расстояния, была использована в дальнеГплем в качестве стартовой модели для олкгонуклеотидной части дуплексоз (0-2) и (0-1) в процессе их оптимизации.

2.1.1. ОТНЕСЕНИЕ СИГНАЛОВ Е Ч-ЬЯМР-СПЕКТРАХ ДУПЛЕКСА (0-3)

В области резонанса протонов водородных связей дуплекса Ю-з) наблюдаются сигналы иминопротонов только внутренних пар оснований, идентификация которых проведена на основании сравнения соответствующих спектральных областей ЯМР-спектров дуплексов ю-з : и Ю-2). Сигналы иминопротонов концевых пар 1«гг-1 )-(га-7) и («из-? ;■ (¿0-1 ) в спектре отсутствуют вследствие их быстрого обмена с протонами растворителя.

Отнесение сигналов необменивапцихся протонов дуплекса (О-Э), осуществлено с использованием 1н-соеу и 1н-1ЮЕЗУ-спектров. На рис.2 приведен ЫОЕБУ-спектр дуплекса (о-з). Выделенные фрагменты спектра, обозначенные символами А. В и С, содержат Н6/Н8 - Н1'/Н5, Н6/И8 - Н2*/Н2' '/СН3 и Н1-/Н5 - Н2,/Н2"/СН3 - области резонанса, соответственно. Идентификацию кросс-пиков проводили в соответствии со стратегией отнесения, разработанной для правозакрученных форм ДНК. Этот метод основан на том, что в правозакрученной ДНК Н6/Н8 протон гетероциклического основания пространственно сближен с Н1*/Н2'/Н2'' протонами собственной дезоксирибозы, а также с Н1'/Н2'/Н2" протонами 5'-соседнего с ним нуклеотидного остатка:

--(Н6/Н8)1_1----(Н1 '/нг'/нг" )1_1----(Нб/Н8)1---(Н1'/Н2'/Н2"

Протоны НЗ' и Н4' были идентифицированы через ядерный эффект Овер-хаузера (ЯЭО) с Н1' протонами. Отнесение НЗ' подтверждали, используя их внутринуклеотидные ЯЭО-взаимодействиям с ароматическими и Н2'/Н2'' протонами а также ^взаимодействие (Н3')1 с (Н2"' ^ в «КУ-спектре. Правильность отнесения сигналов Н4' подтверждали, анализируя кросс-пики (Н4')1-(НЗ'в с сет-спектре.

2.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАССТОЯНИЙ МЕШУ ПРОТОНАМИ В ДУПЛЕКСЕ (0-3)

Для получения структурной информации был определен ряд расстояний между протонами дунлекса (0-3), сближенными в-пространстве: (Н6/Н8)1- (Н1')1; Ш6/Н8)1 - (Н1'»¿.'С, (Н6/Н8)± - (Н2* )._» (Нб/Нв)^ (Н2,,)1_1; (Н5/СНЭ)1 - (Нб/Нв)^,; (Щ/СН^ - (Н2* )1_1! (Н5/СН3)1 - (Нг")1и; (НГ)1 - {Н2"

На первом этапе определения расстояний для каждой пары протонов 1 и о была измерена скорость кросс-релаксации а^ между этими протонами по методу двуспиновой апроксимации с использованием приближения начальных скоростей:

ЯЭО^Ш ~ о^ 1 , при 1;—>0 (1)

Величину скорости кросс-релаксации определяли из начального линейного участка зависимости ЯЭО от времени облучения из соотношения:

ЯЭ0.(1)

а = —:3--12)

Диапазон времени насыщения сигналов составлял от о,05 до 0,20 с.

На следующем этапе работы для каждой пары протонов 1 и 3 вычисляли относительное расстояние г.. . из соотношения (3), используя известное межпротонное расстояние между базисной парой протонов к и 1 и полученные из серии -1М-ЯЭ0 экспериментов скорости

кросс-релаксации о^ и

ГИ 1/6

1Г- = < — ' (3)

В качестве гк1 использовали известные внутринуклеотидные расстояния. которые не зависят от пространственной структуры молекулы:

о

ГН2'-Н2".ГС(Н5!-С(Н6) и ГТ(СН3)-Т(Н6)' РаВНЫе 1'8' 2,5 И 2'7 А' соответственно. При этс;.: выбирали таким образом, чтобы межпротонные вектора 1—з" и к—1 имели примерно одинаковые времена корреляции т .

2.1.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ СПИН-СПИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ПРОТОНОВ УГЛЕВОДНЫХ ЦИКЛОВ

С целью исследования конформации углеводных циклов был проведен анализ вицинальных констант для протонов Н1', Н2', Н2" и НЗ' дуплекса (0-3): ^«з» ■ ••^•э» и ^»»з«' а также Г^ . < к

, • гДе = 1 ' 2'' ' ^2' = + ^'З'' ' '=

^■г" + 1Т2' '3'" Значения констант спин-спинового взаимо-

действия, а также £•],, и получали непосредственно из

профиля сечения соответствующего кросс-пика в фазочувствительном бог соэ'у-спектре.

2.1.4. ПОСТРОЕНИЕ СТРУКТУРЫ ДУПЛЕКСА (Р-З) В РАСТВОРЕ.

Построение структуры дуплекса Ш-З) в растворе проводили методом ОММ по программе, разработанной к.х.н. Воробьевым Ю.Н., при его активном участии, В качестве стартовой была Еыбрана В-подобная структура ДНК, структура 31, построенная с учетом зависимости спиральных параметров от последовательности оснований. Энергетическая оптимизация структуры была осуществлена по спиральным и торсионным параметрам а учетом экспериментально полученных ограничений на межпротонные расстояния. Оптимизацию проводили по функционалу Р , который является суммой полной энергии и геометрического штрафа отклонений расчетных расстояний от соответствующих расстояний, полученных из эксперимента:

{Г = Еполн + ЕЕяэо (4 1

Еполн включает одновременно энергии растяжения связей, энергии деформации валентных и торсионных углов, энергии электростатических и вандерваальсовых взаимодействий, энергии гидратаций и т.д. Геометрический штраф отклонений по межпротонным расстояниям Елэо описывается в виде гармонического псевдопотенциала ограничений ЯЭО:

?

= С_(г, . - г. .), если г?. > г..

10

'13

,(г13 - если < г..

где;

и г1;. - экспериментальные и расчетные значения межпротонных расстояний; с_>+ - силовые константы, значения которых зависят от погрешности определения расстояний г?..; к - постоянная Больцма-на, т- абсолютная температура; Э - масштабный фактор, равный 2;

погрешность определения расстояния

'/СН3 и Н1'/Н5

' /СН3

области резонанса, соответственно.

Рис. 2. 1Н-Ю1£У-спектр дуплекса ю-З). Выделенные■ фрагменты спектра, обозначенные символами А. В и С, содержат Н6/Н8 НГ/Н5, Н6/Н8 Н2'/Н21

НЭ' /Н2'

| ъ?

< 1 • » 4>

• • ■! <. 1 • с %

и «. < • •1 [ е'- 'в * (

| м

— 1 ?! ✓

1 •

, * <1 сЭ

'Ь • • 1 £ • с

л Ч •'-Л - - ■

А' Г**

3 "7 * — • . - *

I

м-а-

•3.0

5.0

7.0

9-0

8.5

6.5

4.5

2.5

Рис.3. Стереопара итоговой структуры дуплекса ю-З), полученной в результате энергетической оптимизации стартовой структуры Б1 с учетом ЯМР-данных.

В результате оптимизации получена итоговая структура б1* 'рис.зи соответствующая минимуму функционала метода ОММ и в целом удовлетворяющая полученному из ЯМР-эк'сперимента набору межпротсн-

ных расстояний. Сравнение расчетных констант спин-спинового взаимодействия, полученных для конформаций рибозы в итоговой-структуре 31*. с результатами независимого определения этих констант из эксперимента показало , что в целом между расчетными и экспериментальными значениями и Зд1>2-' имеется удовлетворительное соответствие со средним квадратичным отклонением порядка погрешности эксперимента 1 Гц). Значения фазовых углов псевдовращения Р для углеводных циклов итоговой структуры * в целом соответствуют области 2'-эндо-конформации фуранозного кольца с интервалом угла псевдовращения от 135° до 194°.

2.2. ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЩИ ДУПЛЕКСА (0-2)

Изучение особенностей пространственной структуры стабилизированных комплексов в настоящей работе проведено на примере дуплекса (11-2), содержащего ковалентно присоединенный по 5'-фосфатной группе гептануклеотида остаток ю-(2-гидроксиэтил)феназиния.

2.2.1. ОТНЕСЕНИЕ СИГНАЛОВ В 1Н-ЯМР-СПЕКТРАХ ДУПЛЕКСА (0-2)

Анализ области резонанса иминопротонов водородных связей дуплекса (о-2) показал, что наличие остатка Р1ш в его составе приводит к появлению в спектре дополнительного интенсивного сигнала иминопротона пары (с«»-7)-(<1С-1 ), а также к увеличению интенсивности сигналов иминопротонов пар (<*»-2) • (ас-б) и («ю-б )• (<«-2) по сравнению с дуплексом (0-3). Это свидетельствует о повышенной прочности дуплекса (0-2) и о замедлении.обменных процессов иминопротонов с протонами растворителя.

На рис.4 представлен полный 1Н-1)0ЕЗУ-спектр дуплекса (0-2). Сравнение соответствующих областей ШЕЗУ-спектров дуплексов (о-2) и Ю-з) показало, что наличие остатка Р1т на 5'-концевом фосфате гептануклеотида не вносит принципиальных изменений в пространственную структуру дуплекса, которая также описывается В-подобной формой ДНК. Поэтому идентификация сигналов в 2М-ЯМР-сг.ектре дуплекса (о-2) была проведена по аналогии с отнесением сигналов в спектре дуплекса (о-з).

Отнесение сигналов протонов красителя проводили, используя 1Н-С03¥, 1Н-М0ЕВУ и 1Н,13с-соз?-спектры дуплекса ю-2), а также сравнивая их с соответствующими спектрами 2-диметиламино-ю-(2-гидроксиэтил)феназиния и 1Р1т)-Ш-(СНг)2-ЫН-р<1(ССАААСА).

2.2.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОТОНОВ КРАСИТЕЛЯ С ПРОТОНАМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

Анализ ЫОЕЗУ-спектра дуплекса (0-2) позволил выявить ЯЭО-

взаимодействия между протонами феназина и протонами ближайших к нему нувлеотидннх звеньев dc-1, dG-7 и dC-8. Так, з Н1'-Н6/Н8-06ласти спектра (рис.4)" наблюдается два кросс-пика (обозначены символами а и ь), отражающие ЯЭО-взаимодействие протона Hi'(dG-7) с н(5) и н(б) протонами феназиневого красителя. Эти se протоны феназина в H2'/H2"- н6/н8-области спектра образуют кросс-

Рис. 4. 1K-NOESY-cneKTp дуплекса (D-2). Кросс-пики между протонами Pirn me) - сипя,, hls)- ci12)h2, hit) - 0(11 )h2, h(7j - c(12)hg, h(1) - с (11 )hp, h(1) - c(12)h2, h(1) - c!13)h2, h; 1 i - clujh,, on2)h? - с(1 з)hp, ci11ih, - c(13)h2, h«1) - h'b) обозначены символами 1-11, соответственно. Кросс-пики, отражающие взаимодействие протонов Fhn и -Ш1-(СН2)2-Ш-группы с протонами олигонук-леотидов, обозначены символами а - а': <* ' Hi"(G-~; - Н(6); ь h1mg-7) - н15 ); с - н2' /н2' ' (0-7 ) - н(6>; d - h2'/h?'mg-7 1 -Н(5): h - c(13)hp - hblc-1); h' - ci 14)h„ - h6(c-1)i 9 - c(13>hp -HRlP-1 l.-o" - с! 1 4 )h„ - H5!C-i )• "

пики о и а, связывающие их с Н2'~ и (или) Н2''- протонами <«-7 (значения химических сдвигов сигначов Н2' и Н2''!сЮ-7) совпадают). Важно отметить, что ЯЭО-взаимодействие между Н1', Н2' и Н2" протонами сЮ-7 и Нб протоном 3'-соседнего с ним еС-8, характерное для правоспиральной ДНК, в данном случае отсутствует. На основании полученных данных сделан вывод о том, что остаток феназина интер-калирует между сю-7— и ас-8-звеньями олигонуклеотидной цепи, вытесняя нуклеотидный остаток ас-З из структуры дуплекса.

Связующий этилендиаминовый фрагмент взаимодействует с ароматическими протонами кошевого дезоксицитидина ас-1. Так, метиленовые протоны СН?яЗ) в ыогву-спектре образуют интенсивные кросс-пики ъ и ч с Кб и Н5 протонами ас-1. Вторая метиленовая группа с(14>Н2 взаимодействует с этими протонами слабее, образуя кросс-пики ь' и ч" меньшей интенсивности.

2.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАССТОЯНИЯ МЕЖДУ ПРОТОНАМИ ДУПЛЕКСА (0-2)

Методика определения межпр.-тонных расстояний внутри олигонук-леотидного фрагмента дуплекса 0-2) была такой же, как и в случае дуплекса (О-З). При определении расстояний между протонами модифи-цирущей группировки и протонами :'лигонуклестидов для выбора стандартного вектора были определены гс для некоторых пар олигонуклео-тидных протонов, а также для протонов феназина. Значения т^ получали из соотношения 1.4}:

Юг6., 1Г;" 1+4О?Х2 ' 1С с

где: ^ - экспериментальная скорость кросс-релаксации для протонов з. и л, т - эффективное время корреляции вектора между протонами 1 и г.. - расстояние между этими протонами, и - рабочая частота прибора (в рад-сек ); г - гиромагнитное отношение и й -постоянная Планка, деленная на 2я. Было установлено, что феназини-евый фрагмент и этилендиаминовая группа являются более подвижными ,:тс Н(6)-Н(7)=0'79'1сг9сек 11 С. и т2-н^/н8= о.бЗ-Ю-^ею. чем гетероциклические основания внутренних остатков олигонуклеотидов |г~ НСИС )-кб (С) = 1 10~'сек 1 ■ На основании этого расстояния НрЬп - Ир>-и! • Нр^ _ Ндщ определяли из соотношения (4Ь используя время корреляции ароматических протонов феназина. При определен::;! расстояний С(13,14Ш2 - НрЬп и С 13,14)Нр - Н^ использовали время корреляции между ароматическими и метиленовыми протона",РЬп. Значения расстояний между протонами феназиниевого фрагмента и олигонуклеотидными протонами приведены в табл.2.

2.2.4.ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ СПИН-СПИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОТОНОВ И КОНФОРМАЦИИ УГЛЕВОДНЫХ ЦИКЛОВ ДУПЛЕКСА (D-2).

Величины констант спин-спинового взаимодействия для дуплекса (d-2) определяли тем же методом, что и в случае дуплекса (d-i), используя фазочувствительные COSY DQF спектры. Анализ данных показал, что разница в значениях констант для дуплексов (d-2 j и (q-з) в основном не превышает предела экспериментальной ошибки. Таким образом, наличие остатка феназина в составе дуплекса не влияет на конформационное состояние всех углеводных циклов, которое также описывается 2'-эндо-типом конформации дезоксирибозн.

о

Таблица 2. Значения расстояний (А, экспериментальные и расчетные)

для пар протонов Hphn - Hphn, Hpim -'Н^, Hphn -с (13,1 4 )н ^ и нд^ - с(13,14)н2 дуплекса (d-2 ),

Hi - Hi г..расч. "Г Hd ri;j.pac4. rin

S(Phn)5* эк сп. S(Phn)5* эк сп.

Н(5 )-Н1 ' (G-7 ) 2,81 3,4 Н(1 )-С(14)Н2 4,56 3,23 2,9

* Н(5)-Н2'/Н2" (С-7) 2,76 1 ,75 3,9 Н(8) -С(12)Н2 3.82 2,60 2,4

Н(6)-Н1 • (G-7) 3,15 3,2 Н5(С-1)-С(13)Н2 3,21 3,01 2,6

ж: Н(6)-Н2'/Н2" (G-7) г 4,37 2,62 2,9 Н5(С-1)-С(14)Hg 4,55 6,10 2,8

Н(1) -С(12)Н2 2,60 3,82 2,4 Н6(С-1)-С(13)Н2 3,37 3,86 2,7

Н(1 ) —С (13) Н^ 2,92 4,12 2,8 Нб(С-1)-С(14IHg 4,32 4,70 2,9

^Сигналы Н2' и Н2" (dG-7) в Н-ЯМР-спектре совпадают.

2.2.5.ПОСТРОЕНИЕ СТРУКТУРЫ ДУПЛЕКСА (0-2) В РАСТВОРЕ.

Построение структуры дуплекса (0-2) в растворе проводили тем же методом, что и в случае дуплекса (0-3). В качестве стартовой конформации для олигонуклеотидного фрагмента'молекулы рассматривали структуру Б1*, полученную при оптимизации исходного немодифиш-г рованного дуплекса (э-з). На ее основе были сконструированы раз-

личные варианты конформаций дуплекса (0-2), которые отличаются различным положением феназиниевого фрагмента в структуре молекулы. Однако, данные по ЯЭО между протонами феназиниевого фрагмента и ближайших куклеотидаых звеньев позволили из ьсего набора энергетически возможных конформаций выбрать для дальнейшей оптимизации стартовые конформации только двух структур, s(Phn)3 и S(Phn)5. Обе структуры характеризуются ингеркаляцией полициклической системы феназина между dG-7- и dc-8-звеньями олигонуклеотидной цепи и различаются ориентацией плоскости красителя, а именно поворотом плоскости полициклической системы феназина на 180° вокруг связи С(2)-М. Оптимизацию проводили по спиральным и торсионным параметрам феназина, линкера, соединяющего остаток феназина с дуплексом, и ближайших к феназину нуклеотидных звеньев (dc-1, dG-7 и dc-8) с учетом экспериментальных ограничений на расстояния.

В результате оптимизации структуры S(Phn)3 не удалось получить соответствия между расчетными и экспериментальными данными. По этой при ¡ине указанная структура была исключена из дальнейшего рассмотрения. Структура S(Phn)5* (рис.5), полученная в результате оптимизации S(Phn)5, с одной стороны, соответствует минимуму энергии, а с другой стороны, в целом удовлетворяет полученному из эксперимента набору межпротонных расстояний.• Основновной особенностью оптимизированной структуры S(Fhn)5* является то, что феназиновое

кольцо .дуплег/ч D-2 > находится в стэкинге с последней парой осно-

о

ваний (dc-1 i-i.<ю-7) на расстоянии примерно 4А и на расстоянии око-о

ло 5А от неспаренного нуклеозидкого звена <эс-8.

Рис.

Стереопара итоговой

структуры э (РЪи )5 дуплекса Ю-2), полученной в результате энергетической оптимизации стартовой структуры Б1РЬп)5 с учетом ЯМР-данных.

S|Phn)5'

2.3. ШО.ТЩОВАНИЕ КОНФОРМАЦИИ КОВАЛЕНТНОГО АДДУКТА {0-1 )

Исследование конформации продуктов комплементарно-чдресованной модификации проведено на примере ковалентного аддукта ■о-!). Доказательство структуры ю-1) основано на его свойствах.

Пониженная электрофоретическая подвижность продукта алкилирования, его высокая термическая стабильность по сравнению с немодифициро-ванным дуплексом (d-з). а также тот факт, что процесс термической денатурации (D-i) протекает по механизму внутримолекулярной реакции, доказывает напичие ковалентной сшивки между двумя цепями оли-гонуклеотидов. Точка алкилирования доказана экспериментами по расщеплению (D-1 i в условиях лабильности алкилированного по N-3 положению дезоксицигидина.

2.3.1.ОТНЕСЕНИЕ СИГНАЛОВ ПРОТОНОВ ДУПЛЕКСА (d-t).

Практически полное совпадение спектров дуплексов (D-1) и (d-з) в области резонанса обменивавшихся протонов водородных связей позволило принять для сигналов иминопротонов дуплекса (D-1) то же самое отнесение, что и для сигналов немодифицировэнного дуплекса (0-3). Полученные данные свидетельствуют о том, чтб наличие ковалентной сшивки в дуплексе (d-i) не препятствует интенсивному обмену прогонов водородных связей с растворителем, что согласуется со статистической природой стабилизации дуплекса (о-i), обусловленной пространственной сближенностью двух комплементарных цепей в ковалентном аддукте.

Анализ 1Н-ЫОЕЗУ-спектра дуплекса (.d-i ) показал (рис.6), что остаток бензиламида, ковалеятно связанный с нуклеозидными звеньями dc-1 и dc-8, не вносит существенных изменений в структуру двойной спирали. Поэтому идентификация сигналов в 2М-ЯМР-спектре дуплекса (d-i ) была проведена по аналогии с отнесением сигналов дуплекса (о-з). Установлено, что сигналы протонов ñb и нб алкилированного 3'-концевого нуклеозида dc-8 ковалентного аддукта (0-1) существенно смешены в область сильного поля по сравнению с соответствующими сигналами дуплекса (d-з). Вероятно, это связано с тем, что нуклео-зидное звено dC-e, не участвующее в комплементарном связывании в составе дуплекса (d-з), при алкилировании в составе дуплекса (d-1) теряет свою конформационную подвижность и включается в стэкинг-взаимодействие с предыдущей парой оснований.

Отнесение сигналов бензиламидного фрагмента* осуществляли с использованием 1н-созу-спектра, а также 1Н-Ы0ЕЗУ-спектра, анализируя ЯЭО-взаимодэйствия в соответствии со схемой i.

* -

Сигналы протонов на и На', также как и протонов нь и НЬ' совпадают по своему химическому сдвигу, что свидетельствует об их эквивалентности, вероятно.вследствие вращения фенильного кольца. Магнитоэк-вивалентными оказались также протоны групп C(1)1L>, С(?)И2 и CÍ3)H3>

Схема 1.

С(1)Нг-С(2)Н2~

2.3.2.ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЕЕНЗИЛАМЩНОГО ФРАГМЕНТА С ПРОТОНАМИ ДУПЛЕКСА.

Совокупность данных по ЯЭО между протонами модифицирующей группировки и протонами олигонуклеотидов свидетельствует о пространственной сближенности бензиламидного фрагмента и 5'-концевого звена гептануклеотидной цепи <*:-1 в дуплексе (0-1). Так, в ШЕБУ-спектре ковалентяого аддукга (рис.6) обнаружены

Рис.6. 1Н-ШЕЗУ-спектр дуплекса (о-1 >. Указаны положения диагональных сигналов протонов бензиламидного фрагмента. Кросс-пики между взаимодействующими протонами внутри бензиламидного фрагмента обозначены 1 - 11; кросс-пики между взаимодействующими протонами бензиламидного фрагмента и протонами нуклеозидных остатков обозначены а - 1: (1 I - На/На'-НЪ/НЪ'; (2) - С(1 Ц^-С(2Ш^, (3) -

С С1 Ж^-С О )Н3; (4) - С 12 )Н0

: (3 ж-,

(5)

На/На'

-С(1)Н2; (6) -

На/На'-С(2)Н~

(7) - На/На'-С(3 )Н.

3'

(8) - НЬ/НЬ'-С(1 Ж2; (9)

КЬ/НЬ' -С (2 Ш^/С (4 !Н'; ! 10) -(а) - 0-1 <НГ ¡-НЬ/НЪ'; (Ь) -(Г) - С-1(Н6'-0!4)Н; (д) -(I | - 0-1<Н5'-С>4Ф.'.

НЪ/НЬ'-С(3)Н3; С-1(Н57-НЬ/НЬ'; 0-1(Н6)-С(4)Н';

(11) - НЪ/НЬ'-С(4)Н; (с) - С-1 (Н6)-НЪ/НЪ*; (к; - С-1(Н5)-С(4)Н;

2

3

7

4

Рис. ?. Стереопара итоговой структуры s(Aik)8* дуплекса (D-1), полученной в результате энергетической оптимизации стартовой структуры s(Alk)8* с учетом ЯМР-данных

кросс-пики между ароматическими протонами НЬ/НЪ' бензиламидного фрагмента и протонами Н1', Н5 и Нб нуклеотидного ЗЕена dC-1 (пики а, ь и с, соответственно). Метиленовые протоны групп С(4)н и с(4)Н' пространственно сближены с Нб и Н5 протонами этого же нуклеотидного остатка, о чем свидетельствуют кросс-пики г, д, к и i, соответственно. Полученные данные позволяют сделать вывод, что бензиламидннй остаток алкилирувдей группировки локализован в области недостающего звена гептануклеотидной цепи, вблизи от нуклео-зидного звена dC-1 и алкилированного основания нуклеозидного звена dc-в из противоположной цепи.

3.3.3.ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАССТОЯНИЙ МЕЖЦУ ПРОТОНАМИ ДУПЛЕКСА (O-i).

Расстояния между сближенными в пространстве олигонуклеотидны-ми протонами дуплекса (D-1) определяли также, как и в случае дуплекса (о-з). Анализ времени корреляции ароматических протонов модифицирующей группировки показал = 0>?8 что оно

заметно короче, чем т для внутренних дезоксицитидинов dc-г и dc-б

—Q

^гн5(с)-нб(с) = 10 °сновании этого, расстояния между

протонами модифицирующей группировки и протонами олигонуклеотидов определяли из соотношения (4), используя самое короткое (для данной пары протонов) время корреляции. Е случае метиленовых протонов бензиламидного фрагмента использовали хс метиленовых протонов углеводных циклов. Значения расстояний между протонами бензиламидного фрагмента и протонами ближайших нуклеотидных звеньев представлены в табл.з.

3.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ СПИН-СПИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И КОНФОРМАЦИИ УГЛЕВОДНЫХ ЦИКЛОВ ДУПЛЕКСА (D-1).

Величины констант спин-спинового взаимодействия определяли тем же

методом, что и в случае дуплекса (И-з), используя фазочувствительные cosy dqf спектры. Результаты показали, что различие в значениях констант для дуплексов (d-3) и (d-i ) в основном не превышает предела экспериментальной ошибки. Таким образом, наличие ковалентного мостика между нуклеозидными звеньями dc-1 и dc-8 практически не влияет на конформационное состояние их углеводных циклов, которое также соответствует 2'-эндо-конформа-ции дезоксирибозы.

о

Таблица 3.Значения расстояний (А, экспериментальные и расчетные) для структуры s(Alk)8* между протонами бензиламидного фрагмента и некоторыми протонами олигонуклеотидов .дуплекса.

Hi- Hj 0 эксп. r±.U) расчета.

dC- ■1 (H6) - Hb/Hb' 3,2 4.34:3,80

dC- 1(H5) - Hb /Hb' 3,4 3,1 4!5,89

dC- 1 (H1 ' )- Hb/Hb' 3,5 4.54;5,44

dC- 1(H6) - C(4)H 2,3 3,00;

dC- 1(Hb) - С(4)H' 3,3 4,27

dC- 1 (H5)" - С (4 )H 3,7 3,00

dC- HH5) - C(4)H' 4,4 4,62

3.3.5.ПОСТРОЕНИЕ СТРУКТУРЫ ДУПЛЕКСА (D-1) Б РАСТВОРЕ.

Построение структуры дуплекса (D-i ) в растворе проводили тем же методом, что и в случае дуплексов (D-з) и (D-2). В качестве стартовой конформации для олигонуклеотидного фрагмента молекулы (□-1 ) рассматривали структуру S1*, перченную при оптимизации исходного немодифицированного дуплекса (D-3). На ее основе было сконструировано 6 стартовых структур (S(Aik)l - S(Aik)8), представляющих два конфермационных семейства дуплекса ю-1) с различным положением бензиламидного фрагмента в структуре молекулы. Отличие заключается в различной ориентации метальной группы с(з , которая может еыть направлена в сторону большой бороздки (стуктуры SlAlk ) 1-S(Alk)4> или малой сорозлки (структуры S(Alk)5-S(Alk)8) дуплекса. Конформационные различия структур внутри каждого из указанных семейств сЕязано с различной ориентацией протонов мети-

леновой группы с (4 )lt,. Б оптимизацию были включены спиральные и торсионные параметры бензиламидной группировки и ближайших к ней звеньев (dC-1, dG-7, dc-8). Б результате оптимизации были получены итоговые структуры S(Aik)i* - s(Aik)8*. Анализ конформационных и энергетических параметров показал, что структура s(Alk)8 является наиболее низкоэнергетической и характеризуется удовлетворительным соответствием между расчетными и экспериментальными значениями межпротонных расстояний (табл.3). На основании этого структура s(Alk)8* (рис.7) была выбрана в качестве модели, наиболее адекватно описывающей конформацисданое состояние дуплекса (d-i) в растворе. Основной особенностью этой структуры является то, что гетероциклическое основание алкилированного дезоксицитидина dc-8 располагается параллельно плоскости, образуемой (dG-7)-(dC-i)- парой

о

оснований, на расстоянии около ЗА от нуклеозидного остатка (dG-7).

Плоскость фенильного кольца бензиламидного фрагмента образует угол

величиной примерно ю° с плоскостью пары оснований (<ю-7) • (dc-1) и

о

находится на расстоянии около 3.7 А от нуклеозидного остатка С-1.

вывода

1. Осуществлен синтез ковалентного аддукта (D-i >, являшегося продуктом реакции внугрикомплексного алкилирования по N-3 положению нуклеотидного звена С (8) октануклеотида-мишени pd(TpGpTpTpTpGpGpC) .с помощью 4-[ы-2-хлорэтил-ы-метиламино] бензил-5'-фосфамидного производного гептануклеотида

р<1(СрСр/5рДр<5рСрА).

2. Методом термической денатурации по оптическим кривым плавления и(или)- по зависимости химических сдвигов сигналов ряда протонов в спектрах 1Н-ЯМР от температуры исследована в рамках модели двух состояний термодинамика дуплексов:

- pd(TpGpTpTpTpGpGpC) pd(GpCf>CpApApApCp)rA (D-4),

- pd(TpGpTpTpTpGpGpC) -pd(CpCpApApApCpA) (D-3 ), а также термодинамика его производных:

- ковалентного аддукта (D-i),

- дуплекса (D-2), являющегося комплексом pd(TpGpTpTpTpGpGpC) и гептануклеотида рьп-ин-(сн2)2-мн-ра(срсрдрдрдрсрд), содержащего ковалентно присоединенный по 5'-фосфатной группе остаток 10-(г-гидроксиэтил)феназиния.

Установлено, что стабильность дуплекса (D-2), содержащего остаток феназина значительно выше (Т = 48°С), чем стабильность

исходного дуплекса (о-З, Тпл= 28°С) и выше, чем стабильность октануклеотидногг дуплекса (0-4, Тпд= 43°С). Показано, что феназинневый остаток стабилизирует дуплекс (о-2) в основном за счет дополнительных взаимодействий (преобладает, энтальпийный вклад в изменение -свободной энергии). В то же время, повышенная стабильность ковалентного аддукта (0-1, Тпд= 73°С) связана в основном со статистическим фактором, т.е. сближенностью комплементарных цепей.

3. Методами двумерной ЯМР спектроскопии в сочетании с методом ограниченной молекулярной механики определена низкоэнергетическая простанственная конформация дуплекса (0-3) в водном растворе, удовлетворяющая экспериментальным данным ЯМР. Установлено, что дуплекс (о-З) формирует В-подобную правозакрученную спираль ДНК с 2'-эндо-конформацией углеводных фрагментов.

4. С помощью вышеуказанной методологии исследована пространственная структура комплекса (0-2). Определена наиболее вероятная низкоэнергетическач конформация (о-2). Показано, что:

(а) наличие феназиниевого красителя не вызывает существенных изменений структуры дуплекса в целом, которая соответствует правсзакрученной В-форме ДНК с 2'-эндо-конформацией углеводных циклов;

(б) полициклическая система феназина интеркалирует между с(7) и С(8) - звеньями окгануклеогида, вытесняя нуклеотидный остаток с(8) из структуры дуплекса.

5. Исследована пространственная структура ковалентного аддукта (0-1 ) в водном растворе. Предложена наиболее вероятная низкоэнергетическая конформация дуплекса (0-1). Показано, что;

(а) наличие N-3-[С(8)]-этилен-[4-м-метиламино]бензил-5■-[С(1)]-фосфамидной ковалентной сшивки не приводит к существенным изменениям структуры основного фрагмента дуплекса, который сохраняет все особенности правозакрученной В-формы ДНК с 2'-эндо-конформацией углеводных циклов.

(б) бензильный остаток ковалентного мостика локализован в дуплексе в области недостающего звена гептануклеотидной цепи

о

на расстоянии около 3.7А от нуклеозидного остатка С(1).

Материалы диссертации опубликованы в следущих работах:

1. Бауск (Еиченкова) Е.В., Горн В.В., Лебедев A.B. Унифицированный вариант твердофазного триэфирного синтеза 5'-фосфорилированных олигодезоксинуклеотидов на основе ß-цианэтиловых, р-хлорфешловых эфиров Ы-ацилнуклеозид-5'-фосфатов.// Биоорган. химия. 1985. 1.11. № 6. С. 815-820.

2. Биченкова Е.В., Денисов А.Ю., Кутявин И.В.. Лебедев A.B. Исследование термической денатурации комплементарного комплекса d(pTGTTTGGC ) d(pGCCAAAC)А в водном растворе методом 1н-ЯМР.// Биоорган. химия. 1986. Т. 12. #1.1. С. 1493-1507.

3.Биченкова Е.В., Воробьев D.H., Кутявин И.В., Лебедев A.B., Мальцева Т.В., Тэннэ Е.Ю. Исследование пространственной структуры дуплекса d(pTGT?TGGC)'d(pCCAAAC)A в водном. растворе методом одно- и двумерной ^-ЯМР-спектроскопии и ограниченной молекулярной механики.// Биоорган. химия. 1990. Т.16. N9, С.1236-1258.

4. Биченкова Е.В., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М..Лебедев A.B., Мальцева Т.В.", Сальников Г.Е. Исследование структуры дуплекса (Phn-UHCCHg JNHj, )pd(cCÄAACAi pd(TGTTTGGC) с ковалентно присоединенным 10-(2-гидроксиэтил)феназинием в водном растворе методом 2М-1Н-ЯМР-спектроскопии.// Биоорган, химия. 1992. Т.18. КЗ. С. 398-412.

5. Биченкова Е.В., Горенштейн Л.А., Воробьев Ю.Н., Тэнне Е.Ю., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Мальцева Т.В., Лебедев A.B. Исследование пространственной структуры дуплекса (Piin-NHCCHg )HHg )pd (ссааасд) 'pd(TGTTTGGC) с ковалентно присоединенным ю-(2-гидроксиэтил)феназинием в водном растворе методом 2М-%-ЯМР-спектроскопии и методом ограниченной молекулярной механики. //Битаорган, химия. 1992. Т. 18. J67. С.901-910.

6. Биченкова Е.В., Абрамова Т.В., Мальцева Т.В., Лебедев A.B. Внутршсомплексное алкилированиа октануклеотида pd[tgtttggc] 5' - [ 4-И-2-метил-Л- (2-хдорэтил) амино ] бензилфосфамидным производным гептануклеотида р0[ссдааса]. Получение ковалентного аддукта и исследова1ше его пространственной структуры в. водном растворе методом двумерной 1Н-ЯМР-спектроскопии.// Биоорган, химия. 1992, Т.18, £9. С.1199-1213.