Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах, моделирующие действие ДНК-лигаз тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

СКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ЭРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

ргб од

. ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

- о

На правах рукописи УДК 577.1 13.4

ДОЛИННАЯ Нина Германовна

МИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ В ДВУСПИРАЛЬНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТАХ, МОДЕЛИРУЮЩИЕ ДЕЙСТВИЕ ДНК-ЛИГАЗ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

Москва - 1993

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химиче ского факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научный консультант: доктор химических наук,

академик АЕН России, профессор 3 А. ШАБ АРОВ А

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

академик РАН, профессор Д.Г.КНОРРЕ

доктор физико-математических наук, профессор В.И.ИВАНОВ

доктор химических наук, профессор В.Н.ШИБАЕВ

Ведущая организация: Институт биоорганической химии РАН

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

Защита состоится 21 декабря 1993 года в 16 часов на заседании Специализированного Совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: Москва 1 19899, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501 .

* С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "18" ноября 1993, г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук ___, И.Г.Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Двойная спираль ДНК представляет собой уникальный пример самоорганизующейся системы. Комплементарные фрагменты • нуклеиновой кислоты (НК) однозначно собираются в водном растворе в дву— спиральную структуру, которая стабилизируется специфическими взаимодействиями гетероциклических оснований. Это фундаментальное свойство лежит в основе современного химико—ферментативного синтеза генов. При этом для ковалентного соединения олигонуклеотидных блоков используют фермент ДНК-лигазу, который in vivo репарирует одноцепочечные разрывы в ДНК.

Предпринятое в этой работе комплексное исследование химических реакций, моделирующих действие ДНК—лигазы — химическое лигирование (ХЛ), направлено на разработку высокоэффективных методов сборки генетических структур. Спектр использования синтетических ДНК в молекулярной биологии, в биотехнологической и медицинской практике чрезвычайно широк. Это и искусственные гены — продуценты труднодоступных белков и ферментов, регуляторы генной экспрессии, диагностихумы, высокоспецифичные фармакологические препараты, наборы уникальных субстратов для изучения различных аспектов белково-нуклеиновых взаимодействия, конформационных возможностей НК и др. Разрабатываемый подход позволит получать не только природные, но и модифицированные соединения, поскольку химическая природа активации реагирующих групп снимает ограничения, обусловленные требованиями субстратной специфичности фермента. ХА открывает широкие возможности дизайна НК с аномальной третичной структурой, дает возможность значительно расширить масштаб синтеза генетического материала, в сотни раз удешевить процесс сборки ДНК. Очевидно, что и проблема автоматизации синтеза генов может быть решена на чисто химической основе. Идея полностью химического синтеза протяженных НК давно привлекала внимание ученых. Еще в середине 60—х годов были сделаны .первые мало удачные попытки использовать химический реагент для конденсации гексатимидилатов на по— лиадениловой матрице {Naylor, Gilham, ¡966). В это же время было начато исследование матрично—направленной полимеризации рибонуклеотидов в плане моделирования пребиотического синтеза РНК (Sulston, Orgel et al., 1968). Однако проблема разработки ХЛ как альтернативного метода сборки генетических структур была впервые поставлена в Московском университете [Shabarova, Prokofiev, 1970). Здесь с конца 60-х годов было начато систематическое исследование закономерностей химических реакций в комплексах НК. Развитие ХЛ шло параллельно с совершенствованием методов синтеза элигодезоксирибонуклеотидов. Прогресс в этой области и успешная автома-

тизация олигонуклеотидного синтеза, осуществленная в Московском университете, сделали доступными для нас гетерогенные фрагменты ДНК уже в конце 70—х годов {Рогароу е( а!., 1979). В дальнейшем, логика исследований предопределила использование ХЛ не только как метода синтеза различных генетических структур, но и как инструмента исследования локальной кон-формации НК, в том числе и вблизи модифицированного участка. Следует отметить, что изучение химических превращений в пространственно-организованных НК, является одним из немногих направлений физико-химической биологии, развиваемых в России как оригинальные. В последние годы интерес к таким исследованиям был стимулирован работами по само— сплайсингу РНК, т.е. направленному расщеплению и образованию межнуклео— тидных связей без участия фермента.

Целью настоящего исследования являлась разработка химических методов сборки ДНК — наименее изученной стадии синтеза генов. Необходимые этапы этой работы включали выбор адекватных модельных систем, позволяющих охарактеризовать общие закономерности ХЛ; изучение свойств и структуры комплементарных комплексов, в составе ■которых протекает матричная конденсация олигонуклеотидов; поиск наиболее эффективных химических реагентов, активирующих фосфатную группу в условиях устойчивости двойной спирали. Очевидно, что эффективность химических реакций в самоорганизованных НК связана со структурными факторами: степенью сближения и ориентацией реагирующих групп. Поэтому самостоятельной задачей работы было изучение возможностей ХА как инструмента исследования локальной и общей Структуры мультитяжевых НК, в том числе модифицированных и аномальных. И наконец, представлялось целесообразным сравнить возможности химического и ферментативного лигированпя и сформулировать требования, предъявляемые к нуклеотидным комплексам — субстратам ДНК—лигазы и "химической лигазы".

Научная новизна и практическая ценность. В работе оформилось новое направление исследования биополимеров, базирующееся на изучении химических превращений в нуклеотидных комплексах. Разработанная структурно-кинетическая концепция ХЛ позволила расширить наши представления о стереохимии и кинетике таких энзимоподобных реакций, о степени заторможенности реагирующих групп. Сформулированы требования к методам активации и к конформации групп в реакционном узле, обеспечивающие эффективное образование межкуклеотидной связи, и на этой основе создана принципиально новая стратегия химической сборки генетических структур. Внедрен в практику работы новый эффективный реагент для ХЛ — бромистый циан, позволяющий осуществлять сверхбыстрые реакции в ДНК—дуплексах (1-3 мин) и инду—

цировать синтез как природных, так и модифицированных связей. На базе ХЛ осуществлен синтез протяженных функционально значимых ДНК—дуплексов, содержащих участки узнавания эндонуклеаз рестрикции и универсальные районы, про— и эукариотических промоторов. Были синтезированы РНК—ДНК гибридные дуплексы и 35—звенные концевые инвертированные повторы ISI—элемента — структуры, активно участвующей в транспозиции фрагментов клеточного генома. В заданное положение синтетических ДНК с помощью разработанных методов введены точечные модификации различной природы: новые типы межнук— леотидных связей — пирофосфатная и фосфоамидная, фосфодиэфирные связи между дезоксирибонуклеотидами и нуклеотидными звеньями с рибо—, арабино—, ксило—конфигурацией сахара, а также некомплементарные пары оснований, одноцепочечные делеции, вставки и др. Впервые экспериментально показано, что независимо от типа химического реагента (использовался набор водорастворимых карбодиимидов и BiCN) изменение параметров ХЛ коррелирует с изменением геометрии реакционного узла; на основании анализа кинетических данных сделаны выводы о конформации модифицированных звеньев, примыкающих к узлу лигирования. Показано и теоретически обосновано, что ХЛ фрагментов РНК менее эффективно, чем ДНК—аналогов. Впервые ХЛ было использовано для зондирования структуры трехспиральных PyrPuPyr комплексов. Обнаружена зависимость эффективности ХЛ от природы звеньев, между которыми образуется новая фосфодиэфирная связь; показана взаимосвязь между реакционной способностью взаимодействующих групп й секвенс— зависимой конформацией "сшиваемого" участка B-ДНК. Уникальные возможности ХЛ были подтверждены при разработке методов циклизации олигонуклео— тидов и получении таких топологически необычных структур, как разветвленные ДНК; с помощью этого метода целевые соединения получены с выходом близким к 100% (совместные работы с фирмами Genset, Франция, и Chiron Corp., США),

Развитый нами подход нашел применение в различных лабораториях мира и биотехнологических фирмах для получения аномальных и модифицированных ДНК. Разработанная стратегия сборки протяженных ДНК и принципов разбивки целевой последовательности на фрагменты послужили основой успешного полностью химического синтеза гена, содержащего 183 нуклеотидные пары (н.п.).

Синтезированные генетические структуры успешно используются для решения фундаментальных задач физико-химической биологии, а также в энзи— мологии, биотехнологической и вирусологической практике.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всесоюзном симпозиуме "Реализация наследственной информации" (Паланга, 1980), Международ—

ных симпозиумах по химии компонентов нуклеиновых кислот (Бехин, Чехословакия, 1981, 1984, 1990), 4-м двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома" (Ереван, 1981), Международных конференциях по синтезу и использованию олигонуклеотидов в молекулярной биологии (Эгерс— дорф, ФРГ, 1980; Кембридж, Англия, 1983), Всесоюзном симпозиуме "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов" (Рига, 1982), Двусторонних симпозиумах СССР—Франция "Структура и функция белков и НК" (Цхалтубо, 1982; Москва, 1986), Всесоюзных рабочих совещаниях по органической химии ДНК—дуплексов (Москва, 1983; Новосибирск, 1985; Тбилиси, 1987; Киев, 1989), 16-й конференции ФЕБО (Москва, 1984), 6—м симпозиуме по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985), V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), Международном рабочем совещании "Перспективы применения в терапии и диагностике производных олигонуклеотидов" (Новосибирск, 1988), 7—м Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Рига, 1989), Международной конференции по химии фосфора (Таллинн, 1989), I Всесоюзной конференции "Геном человека" (Москва, 1990), Международной конференции по химии нуклеиновых кислот (Нагойя, Япония, 1990), Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и перспективы практического применения" (Москва, 1991), III Симпозиуме "Олигонуклеотиды и их производные" (Кембридж, Англия, 1993).

Циклы работ, в которых были представлены отдельные этапы этого исследования, получили премии Минвуза СССР в 1979 и 1986 г.г. Часть представленного в диссертации материала получила II место в конкурсе на лучшую работу Химического факультета МГУ в 1982 г. к I место в конкурсе работ Межфакультетской лаборатории им. А.Н. Белозерского, МГУ, в 1989 г.

Диссертация обобщает данные 42 основных публикаций. Главные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в настоящем докладе. Работа выполнена в 1975-1993 г.г.; на разных этапах в ней принимали участие аспиранты и студенты МГУ, работавшие под руководством автора. Использованные в работе олигодезоксирибонуклеотиды синтезированы в лаборатории НК Химического факультета МГУ.

1. Дизайн и физико-химическое изучение модельных систем для ХЛ.

Общие закономерности химических реакций в ДНК-дуплексах

Разработка метода ХЛ шла по двум направлениям.

1. Дизайн и исследование физико-химических характеристик нуклеотид— ных комплексов — субстратов "химической лигазы". Формулирование требований к их термодинамическим и геометрическим параметрам.

Специфика систем для ХЛ состоит в том, что они содержат разрывы в утлеводофосфатном остове, значительно дестабилизирующие двойную спираль. Это приводит ¡с необходимости использовать протяженные гетерогенные по—• следовательности, обеспечивающие однозначное расположение блоков на матрице. Важность использование адекватных модельных систем при изучении ХЛ была ясно продемонстрирована в работах Кнорре и др. (1974), которые обнаружили образование 5'—5'—пирофосфатиыу: связей в трехспиральном комплексе оИдо(ёрА) -2ро1у(и) из—за нерегулярной ориентации "сшиваемых" компонентов.

2. Выбор наиболее эффективных методов активации фосфатного остатка, позволяющих осуществить синтез межнуклеотидной связи в условиях стабильности двойной спирали (водные растворы, 0+10°С, рН близкие к нейтральным). Их условно можно разбить на 3 категории.

а) Методы, в основе которых лежит использование водорастворимых реагентов, активирующих фосфатную группу непосредственно в составе комплементарного комплекса.

б) Использование долгоживущих активных производных олигонуклеотидов (азолиды, сложные эфиры), формирующих в дальнейшем двойную спираль.

в) Активирование производных по фосфатной группе после стадии ком— плексообразования с помощью внешних факторов — окисление, облучение и др. (так называемые "включаемые реагенты").

Наиболее перспективным для практической разработки нам представляется первый метод, включающий использование технологичных водорастворимых конденсирующих реагентов. Ниже приведена схема образования фосфоди-эфирной связи между сближенными на комплементарной матрице олигонуклео— тидами под действием гидрохлорида 1—этил—З-(З'-диметиламинопропил) кар— бодиимида (ЭДК) — реагента, который широко использовался в настоящей работе.

/

осн,

т

а-

/

•А-

2 3

II

/

и = -ос

сн

3

а-

-а-

1.1. ДНК-дуплексы с разрывами в одной из цепей

Первая сконструированная нами модельная система представляла собой двуспиральные комплексы тринуклеотидов гетерогенного состава с комплементарными олигомерами [1,3]. Одна из изученных структур представлена ниже (символ <1 здесь и далее опущен):

5' г-г-т-т—т-т-т-:

АССАССАСС Т С СрТ С врТ в Ср

3' <___I___I

Термодинамические параметры таких олигомерных комплексов были рассчитаны с помощью модели двух состояний, которая по ряду критериев (хорошая корреляция между значениями лН° и ДБ0, вычисленными по данным КД и УФ— спектроскопии, величина константы роста двойной спирали, Э> 10, и др.) является хорошим приближением для исследуемых систем. В рамках этой модели нами получено общее выражение для константы равновесия, К, комп— лексообразования олигомеров разной длины, включая системы с "отвисающими" концами.

к =

П2ш) (комплексы с полным заполнением

сп(1-Пп+1 матрицы) ,

где { — доля мононуклеотидных звеньев, участвующих в комплексообразова— нии; С — общая нуклеогидная концентрация (на мономер); т — количество нуклеотидных звеньев в более коротком компоненте комплекса; п — число молекул тримера, взаимодействующего с олигомерной матрицей.

Оказалось, что тример без пропусков заполняет матрицу, образуя достаточно стабильный комплекс (Т^ -22°С для додекануклеотидной двойной спирали). Для этих систем было экспериментально показано, что наличие разрывов в одной из цепей не сказывается существенно на термодинамических параметрах спирали [3]. А обнаруженное сходство спектров КД комплексов с!(рССТ).с1(АСС)4 и с!(рА)3 «1(рТ)12 со спектрами ДНК с 64% и 33% содержанием в-С—пар соответствено (рис. 1) свидетельствовало о том, что внутренние, зависящие от иуклеотидного состава геометрические характеристики спирали сохраняются, несмотря на наличие одноцепочечных разрывов

ш-

В дуплексе с!(ТССр) .<1(рАСС)^ был проведен первый успешный опыт по ХЛ в гетерогенных системах [5]. Выход гекса— и нонануклеотидов под действием л—голуолсульфоната И—циклогексил—Ы'—2-(4-метилморфолиний) этилкарбо—

диимида (ЦМЭК) составил 25 и 10% соответственно.

-1

-3-

1

-г

Рис. 1. (А) Спектры КД комплексов d(pGGT).d(pACC)4(l) и d(pA)3 .d(pT)12

(2) при 2°С. (Б) Спектры КД ДНК из Pseudomonas aeruginosa (64% G-C—пар) (1) и из Staphilococcus aureus (33% G-C-пар) (2). Фосфатный буфер, pH 7, 0,2 NaCl, 0,075 М МдС12.

1.2. Конкатемерные дуплексы с несовпадающими разрывами в комплементарных цепях

Подлинный прорыв в изучении основных закономерностей ХЛ связан с открытием и описанием свойств нового класса синтетических .ДНК—подобных дуплексов, содержащих повторяющиеся олигонуклеотидные последовательности [6,7]. Такие конкатемеры образуются из одного (или ограниченного числа) олигонуклеотидов специфической первичной структуры, так что инициат орный дуплекс имеет "липкие" концы, стимулирующие дальнейший рост двойной спи—

Следует отметить, что физико-химические свойства нуклеотидных комплексов с "разорванным" сахаро-фосфатным остовом практически не изучены, хотя подобные структуры широко используются при сборке искусственных генов. В рамках этой работы с помощью УФ—спектроскопии и кругового дихроизма (КД) было показано, что образующийся при взаимодейстзии одного или

рали:

5' TGGCCAAGCTp 3'

двух олигонуклеотидов конкатемер является межмолекулярным двуспиральным комплексом, геометрия которого подобна геометрии ДНК в В-форме [6,8,9]. Длина образующихся самоассоциатов была оценена с помощью седиментацион— ного анализа. Так, двуспиральный конкатемер, образованный сЦТССССААССТр), содержит в среднем 6—8 молекул декануклеотида (коэффициент седиментации равен 2,7±0,2 Б, что характерно для фрагмента ДНК с 32—35 н.п.).

Для термодинамического описания процесса конкатемеризации мы использовали модель, согласно которой взаимодействие олигомеров приводит к образованию набора структур от димера до длинных полимеров [6].

**, ГГТТТТП Кд , 1М11М1 11М1М1 1'1 1' 1 '1 - 11111111 -

Обозначим через с^ концентрацию олигомера, находящегося в составе конка— темера из 1 молекул. Тогда концентрации свободных, Сс, и участвующих в комплексообразовании, с^ олигомеров могут выражаться как:

Сс = С1+ С2 + ... + Сп.

С. = С, + 2С, +• ЗС. + ... + (и—1 |С . п 2 3 4 п

Полагая, что константы равновесия каждой ступени комплексообразования,

К. (1 = 2,...,п), не зависят от длины конкатемеров и равны между

1-1 1

собой (К|= К), можно представить концентрацию С1 как С( = к С, и най-

ти выражения для Сс и С^:

1 - (КС,)"

с - с.--: с = кс 2

с 1 1 - кс, " 1

I - (КС^П 1 (п—1) {КС, )П 1

1

(1 - КС^ 1 - КС,

При условии, что КС,< 1 и п велико, из равенства с^ = С£ в точке плавления получаем формулу для константы равновесия: 2

К где Со — общая концентрация олигонуклеотидов (Со = Сс + Сь).

о

Полученное выражение совпадает с найденным РогвсПке, Еддегв (1972) для изодес.мической модели.

Константа равновесия образования п—мера, К , представляет собой произведение индивидуальных констант К.:

К* = К_К,.....К = КП_1 = <2/С)П~1.

2 3 П о

На основании этой модели рассчитаны значения энтальпии и энтропии

образования усредненной нуклеотидной пары при конкатемеризации ДГГССАСА-

ТС) [6] и ё(ТССССААССТр) (9]. Значения Ш° хорошо согласуются с термодинамическими параметрами перехода спираль—клубок в ДНК с тем же содержанием й-С—пар, полученными прямыми калориметрическими измерениями.

Особые черты вторичной структуры конкатемерных комплексов очень, удобны для изучения матрично-направленных реакций. На этих системах была показана возможность эффективной поликонденсации олигонуклеотидов под действием ЦМЭК и более реакционноспособного ЭДК (рис. 2) и найдены оптимальные условия этой реакции [7,8,9,11—14,].

А

260

1,0 - 1 ДЕНЬ -

0.5 -

I 1 1 1

1.0 4ДНЯ

0.5 - 1 -

>>п 1

150 300

0,3

0,1 0,3

0,1 450 МЛ

Е

0

1

о 9г

г о.

ии

£6-О 1П

з:

О-

сс <

о г:

Рис. 2. Хроматографическое разделение (колонка с Аминосилохромом, Иа—фосфатный буфер, рН 7,0 в 7 М мочевине)

_3

реакционной смеси, содержащей 10 М аСГССССААССТр), 0,02 М ЭДК в 0,05 М МЭС, рН 6,1, 0,02 М МдС12 после 1 й 4 суток реакции. Пик 1 соответствует исходному декануклеотиду, пики 2,3, 4,....,п — продуктам полимеризации.

Впервые экспериментально показано, что эффективность ХЛ (а для кон— катемеров она прямо пропорциональна длине образующихся полимеров) зависит от устойчивости исходного олигонуклеотидного комплекса. Табл. 1, в

Таблица 1. Результаты ЭДК-индуцированнон поликоиденсации

олигонуклеотидов

Строение конкатемерного ДНК—дуплекса

пл 1 °С±2

Степень превращения оли г онук-леотида, % ±3

Степень полимеризации, п

С

пггсхтмттаг

□а

пс

СПС

□ЕЕПЕМШаС

11ТТТС6АСТТС6Ар|Г

1

3-5

31

18

38

70 90 85 97

2-7 2-25 2-20 10-30

которой схематически показаны разные типы изученных конкатемерных комплексов с выделенными исходными одним или двумя олигонуклеотидами, иллюстрирует этот тезис.

Если в первичную структуру исходных олигонуклеотидов заложены уна— стки узнавания эндонуклеаз рестрикции, например:

Ball Aim I Ball Alul

Г г 1 r~v"ilr—' 1 Г—^—11

5 ...T-G-G-C-C-A-A-G-C-TpT-G-G-C-C-A-A-G-C-Tp...

3' ...A-C-C-G-G-TpT-C-G-A-A-C-C-G-G-TpT-C-C-A ...

L_'_J I________!J L_t_J I________1 .

BsuRl j Hindin BsuRi I Hind III

то образующиеся в результате XA (стрелки указывают участок лигирования) олигомеры с повторяющейся нуклеотидной последовательностью полностью расщепляются соответствующими ферментами до декаиуклеотидов (место расщепления обозначено треугольником). Это является хорошим подтверждением структуры образующихся соединений и отсутствия продуктов карбодиимидной модификации [9].

Для комплексов одинаковой устойчивости на эффективность реакции влияет электрофильность активированного фосфата и нуклеофильность атакующих его групп. Ниже приведен изученный на конкатемерных системах ряд нуклеофильных групп, расположенных в порядке увеличения эффективности лигирования (9,11,18): О

3'—ОН < 5'—ОН <<—Р-О-.£—NH9. Следует подчеркнуть, что в результате ¿-

атаки фосфатной и амино—группы образуются соответственно неприродные пи-рофосфатная и фосфоамидная связи. Скорость реакции с участием этих сильных нуклеофилов возрастает в 20—30 раз, а средняя длина пирофосфат— содержащих полимеров составляет 200—220 звеньев, в то время как для кон-катемеров с фосфодиэфирным типом связи она равна 60—70 звеньям [18]. На конкатемерных системах показано также,, что ЭДК в используемых для ХА концентрациях понижает Т^ нуклеотидных комплексов лишь на несколько градусов, причем дестабилизирующий эффект тем слабее, чем выше содержание G-C—пар [9]. Полученные 20—200—звенные ДНК—дуплексы, содержащие тан демно—повторяющиеся фрагменты про— и зукариотических промоторов и участки узнавания эндонуклеаз рестрикции, в том числе модифицированные [12-14], были успешно использованы для изучения различных аспектов бел-ково—нуклеиновых взаимодействий.

1.3. Протяженные ДНК-дуплексы, построенные из олигомеров различной нуклеотидной последовательности

Несмотря на успешную поликонденсацию олигонуклеотидов в конкатемер— ных комплексах, оставался открытым вопрос, можно ли при химической сборке уникальных фрагментов ДНК из олигонуклеотидов с разной первичной структурой добиться эффективного протекания всех актов матричного "сшивания", какие факторы влияют на образование межолигомерных связей с участием слабого нуклеофила — гидроксильной группы. Чтобы ответить на этот вопрос, были синтезированы олигонуклеотидные фрагменты, формирующие 35— звенные ДНК—дуплексы I и II; "верхние" тяжи этих дуплексов соответствуют фрагментам концевого инвертированного повтора IS1— элемента [20].

abc d

f 1 f 1 f 1 f 1

5 GATCCGGTGATGCTGCCAACTTACTGATTTAGTGTATGA Дуплекс I

3' GCCACTACGACGGTTGAArGACTAAATCACATACTTCGA

L_______Jl________Jl________JI________J

h g f e

k 1 m

r----------1 f------------и------------]

5 TCGACCATAAAACACTATCAATAAGTTGGAGTCATTACCG Дуплекс II

3' GGTATTTTGTGATAGTTATTCAACCTCAGTAATGGCCTAG

L_____________J L____________J [_________J

p on

Варьирование длины перекрывающихся блоков позволяло контролировать термическую устойчивость образующихся двойных спиралей. Оказалось, что в отличие от конкатемерных систем в смеси разных по составу олигомеров перекрывание в 4—6 звеньев (дуплекс I) недостаточно для формирования устойчивых при температурах >0° комплексов (возникновение "слабых" мест из—за неоднородности концов). Ддя образования стабильных двуспиральных структур (Тпл -30°) необходимо перекрывание в 7-8 н.п. (дуплекс II). Независимо от числа компонентов такие ДНК—дуплексы плавятся одноступенчато; удлинение двуспирального кора за счет присоединения следующих молекул олигонуклеотидов не вызывает заметного изменения термической устойчивости и гипохромии комплексообразования. Как и следовало ожидать, индуцируемое ЭДК лигирование 5'—фосфорилированных компонентов дуплекса I протекает малоэффективно (степень превращения < 5%). В то же время в смесях, составленных из компонентов устойчивого в условиях реакции дуплекса И, выход продуктов ХЛ значительно выше, причем он изменяется от 14 до 60% в зависимости от природы нуклеотидных звеньев, между которыми обра—

зуется новая фосфодиэфирная связь (изучались отдельные акты ХЛ на трех-компонентных системах). Для сборки каждого полного однотяжевого фрагмента дуплекса II составляли смеси нефосфорилированных концевого и "матричных" олигонуклеотидов с фосфорилированными олигонуклеотидами собираемой цепи (рис, 3). Выходы конечных продуктов - тримеров — достигали 32 и 49% соответственно для "нижней" и "верхней" цепей двойной спирали [20].

НИШНЯЯ ЦЕПЬ .1 1

ВЕРХНЯЯ ЦЕПЬ

5' н 3'

1, сушки [-

И, сушки

т.

5' 3

-р-

т

Рис. 3. Индуцируемая ЭДК сборка "нижней" и "верхней" цепи дуплекса II.

32

Исходный Р—меченный олигомер (1), промежуточный димер (2), полный фрагмент (3). Стрелкой обозначено добавление новой порции реагента. Внизу приведена схема сборки фрагментов.

Полученные результаты поставили нас перед необходимостью систематически исследовать зависимость эффективности ХЛ от природы соединяемых звеньев, чтобы путем рациональной разбивки целевого дуплекса на блоки сделать высокопродуктивной каждую стадию химической сборки. Очевидно, что изучение отдельного акта ХЛ с целью выявления стереохимических и кинетических закономерностей реакции будет способствовать созданию технологичной схемы синтеза природных и модифицированных ДНК заданного состава. Актуален также поиск более эффективных конденсирующих реагентов способных образовывать новую межнуклеотидную связь со скоростью, близко» к скорости ферментативных процессов.

2. В1С1Ч - новый эффективный реагент для ХЛ

Положительным тестом на пригодность реагента к матрично-направленно» конденсации олигонуклеотидов является образование под его действием-

2',3'—циклофосфата из рибонуклеозид—3'-фосфата в водной среде. Поскольку ВхСЫ удовлетворял этому критерию, было предложено использовать его в качестве реагента для ХЛ [Соколова и др., 22]. Отработка условий реакции проводилась на простой модельной системе, позволяющей детально обследовать единичный акт "сшивания" двух олигонуклеотндов на комплементарной матрице. Варьируя состав и емкость буферного раствора, рН, температурный режим, удалось добиться того, что выход продукта с фосфодиэфирной связью приближается к 100% [22,24,26]. Основными преимущесгвами ВК^ являются значительно более высокая скорость реакции (1—3 мин. по сравнению с несколькими часами и да^же сутками для ЭДК) и отсутствие побочных продуктов, вызванных модификацией нуклеотидов. Почти в то же самое время появилось сообщение об использовании ВгСЫ для конденсации оНдо(рА) на по— лиуридиловой матрице (Капауа, Уападамга, 1986). Реакция протекала 20—25 час. при 25° и только в присутствии имидазола и ионов двухвалентных металлов. Авторы полагают, что реальными конденсирующими реагентами в этой реакции являются ЬГ,М'—имикодиимидазол и Г^-циакимидазол. В предложенном нами способе ХЛ с использованием ВгСЫ реакция идет намного быстрее и в отсутствие имидазола. Это свидетельствует о совершенно ином механизме активации нуклеотидного компонента. Контрольные эксперименты в дуплексах, содержащих в участке лигирования две фосфатные или две гидроксиль— ные группы, показали, что конденсация идет только в дуплексе с фосфомо— ноэфирными группировками, то есть именно они активируются ВгСЫ. Для изучения механизма взаимодействия BrCN с дезоксинуклеотидами в условиях ХЛ 31

был использован метод Р—ЯМР—спектроскопии. На основании проведенных экспериментов предложена следующая схема превращений исходного с1рА:.

11 ВгГ№

НО-Р-САйе

ОН

Вг 0 0 П

I о II

НоИ-С-0-Р-0Айе-«»- ИСО-Р-ОАйе

II 1

ОН он он J

АБСЛ.ИФ \ АБС. ЭТАНОЛ 0

0 0 0 II II II II

НО-Р-ОАйе АйеО — Р-0-Р-0А[)е С,Нг-0-Р-0Ас1е

1 II

ОН ОН ОН ОН

В среде абс. ДМФ реакция активированного неустойчивого интермедиата (в скобках) с наиболее сильным нуклеофилом в реакционной среде — фосфатной группой другой молекулы (1рА, приводит к образованию пирофосфата и трипо— лифосфата мононуклеотида. Эта реакция подавляется в абс. этаноле; основным продуктом в этом случае является этиловый эфир <1рА. В водной среде

чрезвычайно быстро идет гидролиз активированного бромцианом фосфатного производного с регенерацией исходного нуклеотида. И только в двойной спирали активированный фосфат может реагировать с гидроксильной группой пространственно сближенного олигонуклеотида с образованием новой межнук— леотидной связи.

3. Сравнение конденсирующей способности и субстратной специфичности водорастворимого карбодиимида и BrCN

Серия ДНК—дуплексов с одним одноцепочечным разрывом, различающихся природой и ориентацией реагирующих групп, была сконструирована с целью корректного сравнения эффективности образования природных и модифицированных связей под действием обоих конденсирующих реагентов [15,21] (табл. 2). Дуплексы Illa—р построены по общему принципу: матрица и один из комплементарных ей олигомеров остаются неизменными, а второй олигомер отличается только нуклеотидным остатком, примыкающим к разрыву. Модификации з реакционном центре включали замену гидроксильной группы амино— или фосфатной группой, концевого dT—остатка на dA или dC (дуплексы III e,f с АА или АС неканоническими парами), на rU или нуклеотидные остатки с обращенной конфигурацией при С2'— или С3'—атомах, пропуск нуклеотидно— го остатка. Выбор нуклеотидной последовательности и места одноцепонечно— го разрыва продиктован тем, что в первичную структуру дуплекса заложен участок узнавания эндонуклеазы рестрикции ЕсоЮ! (CC^GG), причем модификации непосредственно примыкают к расщепляемой связи.

Необходимый предварительный этап — изучение термической устойчивости модифицированных дуплексов, содержащих одноцепочечный разрыв (ник). Только дуплексы, в которых все нуклеотидные пары канонические, плавятся как единая кооперативная система. Наличие в нике двух фосфатных групп, аминогруппы, а также остатков с обращенной конфигурацией при С2'— или С 3'—атомах фурэнозы не влияет на Тдл спиралей рассматриваемого типа. Для дуплексов с другими типами структурных аномалий характерно двухступенчатое плавление (рис. 4А): первая ступень соответствует диссоциации менее прочно связанного модифицированного гексануклеотида, вторая — плавлению комплекса, образованного ундекануклеотидом и матрицей. Наибольшее дестабилизирующее влияние оказывает отсутствие нуклеотидного остатка в месте разрыва, затем следуют некомплементарные АС— и АА—пары. В наименьшей степени нарушает структуру спирали гибридная rU-dA-napa [15,27]. Полученный ряд полностью совпадает с ожидаемым на основании литературных данных по устойчивости интактных олигомерных дуплексов со структурными

Таблица 2. Конденсация олигонуклеотидов в дуплексах Ша-р 3' С-С-С-Т-А-С-С-Т-С-С-Т-С-А-С 5' А-С С-С-А-Х У-С-А-С-С-А-С-Т-С-А-С

под действием химического реагента или Т4-ДНК-лигазы

Номер Структура Выход продукта Номер Структура Выход продукта

Дуп- реакцион конденсации, % ±2 дуп-. реакцион- конденсации, % ±2

лекса ного узла * ** лекса ного узла * **

ЭДК BrCN ДНК-лиг аза ЭДК BrCN ДНК-лиг аза

•А-5- -Т-А-С

Illa 4Р HOÍ- 95 - Illh А С 25 4 Р . ноЬ 10 -

-А--G- -т—A- G

шь Т С 4он р|» 80 35 95 Шк А С 4он pJ- 8 V 5 0

А-G- -T-A-G

lile т с 97 86 0 lili Á с 85 16 0

4Р П к»

—ü" A G

Illd т с 95 67 0 Шт 0 С 75 73 -

«4Р Р J- ЧР HOÍ-

- £— A G

Ше А С 32 5 0 Шп Ú & " 23 10 0

*4он РЬ H°Í0H p|

_ А-G- A G Т С

ПН С ¿ 50 7 0 Шо " 18 26 —

4ou PJ~ Р4 tíoi f

- A G

IHg и-(Г -íou pj- 28 16 80 Шр Т С 12 4 5

ы но] pií

* 0,2 М ЭДК, Со=10"3 М, 0,05 МЭС, рН 6,0, 0,02 М МдС12, 0°С, время

реакции от 6 час. до 6 суток. **0,2—0,5 М ВгСЫ, С0= 10"^ М, 0,25 М МЭС, рН 7,5 [(С2Н5)3Ы], 0,02 М МдС^, 0°С, время реакции 3-5 мин.

аномалиями [30]. Для всех изученных комплексов были рассчитаны термодинамические параметры конформационных переходов, включая двухступенчато-плавящиеся системы [27].

Рис. 4. Кривые плавления в дифференциальной форме ник—содержащих (А) и лигированных (Б) дуплексов III. Структуру дуплексов см. в табл.2; их буквенные обозначения указаны на кривых.

Проведенное исследование показало, что при температуре < 10° все дуплексы термодинамически устойчивы и могут служить моделями для изучения стереохимических аспектов ХЛ. Выходы продуктов BrCN— и ЭДК—индуцируемого лигирования суммированы в табл. 2. Первичная структура "сшитых" олиго— нуклеотидов подтверждена анализом по Максаму—Гилберту, природа образовавшихся пирофосфатной и фосфоамидной связей доказана их селективным расщеплением трифторуксусным ангидридом или 15% уксусной кислотой соответственно [16,36,38]. Природа связи, образованной 3'—концевым rU (IHg) и нуклеотидными остатками с инвертированными гидроксильными группами при С2'— или СЗ'—атомах фуранозы (Ulm-р) доказана щелочным и ферментативным гидролизом соответствующих олигомеров [34,37].

Межнуклеотидная связь под действием обоих реагентов образуется более эффективно, если реагирующая фосфатная группа находится на 3'—конце олигомера (ср. III а и Ъ, а также III h и к в табл 2) [27,28]. Это, по-видимому, объясняется большей реакционной способностью 5'—гидроксильной группы и фиксированным положением 3'—фосфата. С другой стороны, локализация фосфатной группы на 5'—конце олигомера предполагает его значительную конформационную свободу и, следовательно, легкость гидролиза активированного аддукта. Замена гидроксильной группы более нуклеофильными ами— но— и фосфатными группами (Illc, d) резко интенсифицирует ЭДК—индуцированное лигирование, так что реакция заканчивается не через 6 дней, как

для дуплексов IIIa,b, а через б часов; причем выходы продуктов ХЛ составляют 95—97% [27,38]. В случае BrCN как конденсирующего агента лиги— рование тех же дуплексов идет менее эффективно. Это может объясняться побочной реакцией BrCN с концевой аминогруппой гексануклеотида (IIIc) или блокированием нуклеофильной атаки из—за накапливания активных производных сразу по двум фосфатным группам (Hid) [36]. Изменение в ориентации и сближенности реагирующих групп, вызванное некомплементарными парами (III e,f), пропуском звена (III h-1), изменениями конформации (Шд) или конфигурации сахара (III ш—р), значительно уменьшает выход продукта лигирования (табл. 2) [28,36]. Из приведенных данных видна определенная корреляция б действии ЭДК и BrCN, позволяющая сделать следующий вывод. Независимо от природы реагентов, выход продуктов ХЛ определяется главным образом реакционной способностью групп (при варьировании природы нуклео-фила) или их конформацией в узле сшивания (при взаимодействии групп одинаковой химической природы). По—видимому, существенное значение при этом имеет степень доступности активированного производного молекулам воды. Как видно из табл 2, понижение выхода, вызванное нарушением структуры участка лигирования, гораздо более значительно при использовании BrCN как конденсирующего реагента. Полученные данные показывают, что каждый реагент имеет свои преимущества и недостатки. Так, для синтеза неприрод— ной межнуклеотидной связи целесообразно использовать ЭДК. При сборке протяженных ДНК природного строения следует выбрать BrCN, используя в качестве субстратов 3'—фосфорилированные олигонутслеотиды.

Располагая уникальным набором мономодифицированных двуспиральных ДНК, мы изучили их физико-химические свойства [27]. Профили плавления некоторых "сшитых" дуплексов приведены на рис. 4Б. Как и следовало ожидать, они существенно стабильнее аналогов, содержащих одноцепочечный разрыв, и их кривые плавления одноступенчаты. Специфические модификации

уменьшают Т "сшитых" дуплексов, причем степень дестабилизации согласу—

о

ется с таковой для ник-содержащих предшественников. Рассчитанные ДН ин— тактных дуплексов практически совпадают с суммой величин лН° отдельных переходов "несшитых" дуплексов. Спектры КД мономодифицированных двойных спиралей близки между собой и имеют характеристические черты, свойственные ДНК в В—форме, причем наличие разрыва практически не сказывается на виде спектра. То есть, конформационные изменения двойной спирали, вызванные точечными модификациями изученного типа, имеют локальный характер. Полученные данные, касающиеся структуры и энергетики несовершенных ДНК, имеют самостоятельное значение. Увеличивающийся спрос на моднфици—

рованные ДНК—фрагменты, выступающие в качестве инструментов исследования процессов мутагенеза, репарации и биосинтеза НК, а также аналогов субстратов или ингибиторов при изучении белков нуклеинового обмена, стимулирует развитие эффективных методов их синтеза. В этом аспекте ХЛ может рассматриваться как метод модификации полинуклеотидной цепи в определенном месте в процессе сборки ДНК-дуплексов.

4. Структурно-кинетический аспект ХЛ.

4.1. Кинетическое описание реакции

ПоАученные на модифицированных дуплексах с единичным разрывом результаты показали определенную заторможенность реагирующих групп в двойной спирали, а также способность ХЛ дискриминировать отклонения их кон-формации от канонической. В следующем цикле работ сделана попытка установить взаимосвязь между кинетическими параметрами ХЛ и структурой реакционного узла. Предварительно дано теоретическое описание кинетики конденсации двух олигонуклеотидов на комплементарной матрице, проанализирована возможность определения констант скорости отдельных стадий реакции и правомерность принятых допущений [33,37]. За основу была взята кинетическая схема Меламеда и др. (1974), предложенная для описания ЦМЭК— индуцируемого лигирования в трехспиральных олигомер—полимерных комплексах. Рассматриваемые нами ДНК—дуплексы с одним разрывом представляют гораздо более удачную модель, допускающую количественную интерпретацию экспериментальных данных.

к2

к!

5+Х

I ч 3

III

Б + У

Р + У

к4

У

IV

где в — двуспиральный комплекс с разрывом в одной из цепей; Р — продукт конденсации ("сшитый" комплекс); X — активирующий агент; У - продукт гидратации активирующего агента; эх — активированный аддукт.

Данной схеме соответствует система из пяти уравнений, полное решение которой невозможно без некоторых допущений. Интересно рассмотреть два крайних случая. Когда лимитирующими являются стадии I и IV, т.е. реакции с нухлеофилами, и когда лимитирующими являются стадии II и III

(распад активированного аддукта). Известно, что лимитирующей стадией реакции карбодиимидов с эфирами фосфорной кислоты является взаимодействие протонированной формы карбодиимида и дважды ионизованной формы нуклео— тида. Поэтому в нашем описании подробнее рассмотрим кинетические следствия первого допущения. При этом концентрацию ЭХ можно считать квази— стационарной. Решение кинетической задачи приводит к следующему выра—

181 к,1X1 к

жению: Ьп--? ---? * -^— • (1 - е К4*| .

(в] к4 к2 * к3

Скорость накопления продукта лигирования определяется как отношением констант к( и к4 (показывающим какая часть реагента используется, чтобы активировать фосфатную группу в нике), так и отношением ^н^ (показывающим какая часть активированного аддукта вх распадается по продуктивному пути). Рассмотрим возможность определения констант скоростей отдельных стадий реакции. к4 определяется в независимом опыте, к, можно определить с помощью модельных систем, например, нуклеотида или фосфори— лированного олигонуклеотида, фосфатная группа в которых не претерпевает дальнейших превращений. В пределах принятых допущений определение абсолютных значений констант скорости распада активированного аддукта, к^ и к3, невозможно. Однако, по тангенсу утла наклона прямой в координатах

| _ь »

Ьп (1Я]о — РЧ/^] ) уэ —¡р1х1 Iе 4 ~ Ч можно определить эффективную

4

константу скорости ХЛ к^Лк^ к^). Зная к,, легко рассчитать соотношение к3/(к2+ к3), характеризующее долю активированного аддукта, распадающегося с образованием продукта ХЛ. Общая картина изменения концентрации реагирующих веществ в реакционной смеси, когда лимитирующей является стадия образования активированного аддукта, показана на рис. 5А в условных единицах.

Было рассмотрено также бторое допущетге, когда лимитирующей является стадия распада активированного аддукта, т.е. (к2 + к3)«к^в]« к4- Это возможно, если активирующий реагент очень реакциокноспособен и быстро реагирует с нуклеофилами. Можно предположить, что прототипом такого реагента является ВгСЫ, период полураспада которого в водной среде . 1 мин. Изменение концентрации веществ в реакционной смеси при данном условии представлено на рис. 5Б (для удобства анализа схема разбита на этапы). На начальных этапах изменение концентрации активирующего агента определяется в основном скоростью некаталитического гидролиза; на последнем этапе концентрация реагента практически равна нулю. Концентрации ЭХ и "несшитого" дуплекса э меняются более сложно. В начальный мо—

ВРЕМЯ

ВРЕИЯ

Рис. 5. Изменение концентрации реагирующих веществ в процессе ХЛ. Лимитирующей является стадия образования активированного аддукта ЭХ (А) или его распад (Б). Для обозначений см. схему на стр. 18. с1[51

мент времени - = кЛЭЦХ]. На втором этапе |Э] станет близкой к ну—

<» 1

лю, а [ЭХ] будет практически равной 1Э|о. Наиболее интересен третий этап — распад активированного аддукта по двум направлениям. После преобразо—

[ЯХ]

получаем уравнение: 1.п-=(к2 + к3)Это уравнение позволя-

вания

I5»,

ет рассчитать (к2 + к3) по тангенсу утла наклона прямой в координатах 1л[5Х] Ув I, а также определить абсолютные значения К^ и к3- Интересно отметить, что это уравнение пригодно и для случая, когда активация фосфатной группы проводится вне комплекса.

Из рассмотренного видно, что выход продукта конденсации мало зависит от начальной концентрации активирующего реагента и, в основном, определяется свойствами дуплекса, т.е. соотношением констант к3/(к2 + к3). Проанализируем факторы, влияющие на это соотношение. В процессе распада вх активированный фосфат может участвовать в двух конкурирующих реакциях - с гид— роксильной группой соседнего олигонуклеотида и с молекулами воды. Очевидно, что значения к2 и к3 пропорциональны частичному положительному заряду на атоме фосфора и нуклеофильиости реагирующих групп. При использова—

нии различных конденсирующих реагентов абсолютные значения констант будут меняться, но если реакционная способность атакующих групп неизменна и не происходит существенных искажений в структуре узла "сшивания", соотношение констант к^) для данного комплекса будет постоянным.

4.2. Взаимосвязь между кинетическими параметрами ХЛ в модифицированных ДНК-дуплексах и структурой реакционного узла

Для доказательства того, что ^/(к^ + к3( не зависит от строения

конденсирующего реагента был использован набор из восьми синтетических

водорастворимых карбодиимидов (КДИ) Я^—МСЫ-К^, различающихся природой 1 о

заместителей Я и Я (их синтез осуществлен М.Н.Герцюкон, Институт Био— органической химии АН Украины [32]). Из литературы известна способность ЭДК претерпевать в водных растворах таутомерное превращение в циклическую форму. Внесенные структурные изменения — уменьшение размеров цикла

о

за счет уменьшения числа метиленовых звеньев в заместителе Я , блокирование возможности циклизации при замене третичного амина на остаток четвертичного и др. — позволяют выявить роль обеих таутомерных форм в реакциях ХЛ. В качестве "субстратов" были использованы дуплексы 1УЬ (см. ниже) (образование фосфодиэфирной связи) и аналогичный дуплекс 1УЬ', в котором контактируют две фосфатные группы (образование пирофосфатной связи). Анализ полученных данных позволил сделать следующие выводы [33,37].

1. В реакциях ХЛ участвует линейная форма КДИ.

2. Наблюдается явная зависимость кинетических параметров реакций — констант скорости гидратации и эффективных констант реакций ХЛ, от строения КДИ.

3. Значение + к3) для одного и того же дуплекса, но разных КДИ близки и составляют -0,004 для 1УЬ и -0,13 для 1УЬ', т.е. соотношение констант, характеризующих распад активированного аддукта по продуктивному и непродуктивному пути, мало зависит от природы активирующего реагента и может служить инвариантом данного дуплекса.

4. Лишь незначительная часть КДИ расходуется на активацию фосфомо— ноэфирной группы (-7% для ЭДК). В ходе ХЛ с образованием пирофосфатной связи -15% ЭХ распадается по продуктивному пути; при образовании фосфодиэфирной связи эта доля уменьшается до 0,4%. Таким образом, нуклеофиль— ность атакующих активированный фосфат гидрсксила и фосфомоноэфирной группы различается в 30 раз.

Далее были изучены кинетические аспекты ХЛ в дуплексах III а, Ь, д, ш — р (табл. 2) и IV а — { с вариабельным реакционным узлом, причем использовали такие типы модификаций, которые меняли бы относительное расположение групп при сохранении их химической природы.

5' А-АС-С-Т-А-С

У TG-G-AT-S G-A-G С-А-С-С-А

X-VG4G-T-6-G-T

"tiI

d: jC-T-A^pG G-Á - ¿

b: C-T»pG G-Á-С

е:4с-т-т' G-Á

3

c: jcWpGf G-Ä - ¿J

f:4G-T^pG ■ G-Ä - ¿

Дуплекс IV (в квадратах расшифрована структура реакционного узла)

В двух семействах дуплексов III и IV, различающихся формой спирали (В— и А—подобные) и природой "сшиваемых" звеньев, варьировалось положение фосфатной группы, концевой dT был заменен на rU (Illg) или на нук— леотид с обращенной конфигурацией при атомах С2' или СЗ' фуранозы, причем такое звено могло быть как акцептором, так и донором фосфатной группы (III ш-р). В IV f G.С —пара, отстоящая на одно звено от места разрыва, была заменена на некомплементарную GG —пару; дуплексы IV d, е содержали "лишний" мономер пуриновой или пиримидиновой природы [34,37]. ЭДК—индуцированная реакция, как оказалось, идет во всех изученных системах, но с разной эффективностью. Линейные анаморфозы некоторых кинетических кривых представлены на рис. 6.

По тангенсу угла наклона прямых на подобных графиках вычислены соотношения констант k„/|l^+k3) (табл.3). Видно, что этот параметр сильно варьируется для различных дуплексов. Анализируя совокупность ре-

Рис. 6. Линейные анаморфозы кривых накопления продуктов ХЛ в дуплексах Illa (1), Illb (2) и Illg (3).

зультатов для серии систем и литературные данные, можно получить нетривиальную информацию о влиянии разных модификаций на локальную структуру двойной спирали. Так, величина + к3) практически совпадает для

IVb и IVf, т.е. искажение структуры, вызываемое GG — парой, не влияет на ориентацию реагирующих групп соседнего звена и, следовательно, носит локальный характер. Интересно, что выходы продуктов лигирования в IV b и f под действием BrCN также совпадают. Лишнее нуклеотидное звено (дуплексы IV d,e) понижает эффективность и скорость ХЛ, что связано с изменением расстояния между реагирующими группами и искажением структуры спирали

Таблица 3. Кинетические параметры реакции ХЛ в дуплексах III (табл. 2) и IV (стр. 22).

Дуплекс III

Реакционный узел

h2 + k3

3 МО 3

Дуплекс IV

Реакционный узел

к2 +кз

*10

а -dTpMC- 25,8±8,0

b -dT'pdC- 1 8,5±0,9

g -rU*pdC- 2,93±0,45

m -aUpJdC-** 8,2i2,0

n -aUipdC- l,39i0,48

о -dxTpMC-" l,02i0,38

P -dxT'pdC- 0,72±0,22

b -dTlpdG- 4,75±0,28

с -rU'pdG- l,75t0,54

d -dTA'pdG- 2,35±0,80

e -dTT^pdG- 2,15±0,48

f -dGTipdG- 4,12±0,41

к3 — суммарная константа скорости образования 3'-5'— и 2'-5'— фосфоди— эфирных связей.

**

а17 — 1 —(?—/>—арабинофуранозилурацил. с!хТ - 1— (р—О—2-дезокси—шрео—пентофуранозил)тимин.

Важно и нетривиально то обстоятельство, что параметры лигирования отличаются для немодифицированных дуплексов двух семейств (табл. 3). Это может объясняться разной природой соединяемых звеньев — сГГ и (1С в ШЬ и с1Т и сЮ в 1УЬ, а также разной вторичной структурой двойных спиралей. Предположение о наличии в структуре дуплексов IV элементов Л—формы было сделано на основании анализа спектров КД и литературных данных [34]. Связано ли это с падением эффективности лигирования в 1УЪ? Вдвое меньшая доступность атомов кислорода фосфатных групп растворителю (и конденсирующему реагенту) в А—форме по сравнению с В—формой существенно влияет на

значение kj. Форма спирали должна сказываться и на соотношении констант k3/(k2 + k3). Так, в дуплексах Шд и 1Ус, в которых dT на 3'—конце заменен на rU, эффективность лигирования заметно падает по сравнению с дуплексами Illb и IVb, содержащими только дезоксирибонуклеотидные звенья. Можно предположить, что это связано с изменением конформации З'-концевого звена. Известно, что для В—ДНК характерна С2'—эндо (S) кон-формация фуранозных циклов с аксиальным положением З'-гидроксильной группы (схема 1).

СХЕМА 1 S N

Ъ

ДЕ30КСИРИБ03А РИБОЗА

В то же время б гибридном РНК-ДНК дуплексе рибонуклеотидные звенья из—за своего структурного консерватизма сохраняют СЗ'—эндо(М) конформацию, характерную для А—формы спирали. При этом З'-гидроксильная группа занимает экваториальное положение, что может стерически затруднять ее взаимодействие с фосфатной группой соседней молекулы. Отсюда следует, что ХА в нуклеотидном дуплексе, имеющем А—форму спирали, будет гораздо менее эффективно, чем в B-ДНК. Это предсказание было подтверждено в ряде экспериментов с синтетическими фрагментами РНК (см. ниже). Структурная неравноценность дуплексов III и IV отражается также в различном процентном содержании 3'—5'— и 2'—5'—связанных изомеров: 87% природной связи в "сшитом" участке дуплекса Шд и -35% в дуплексе IVc. Следует отметить, что тот же процент природного изомера (86%) был найден в продукте BrCN—индуцируемого лигирования в Illg. Очевидно, что активированный фосфат находится в различной позиции но отношению к 3'— и 2'-гидроксилам в двух семействах дуплексов [37].

Остановимся на данных, полученных для арабинозилсодержащих систем [34,35,37]. Величина инварианта дуплекса с aU—звеном на З'-конце, акцептирующем фосфатную группу (Illn), на порядок ниже, чем для немодифициро— ванного дуплекса (табл. 3). В то же время, когда арабино—производное является донором фосфатной группы (дуплекс Шш, содержащий фрагмент aUp), значение k3/(k2+ k3) сравнимо с таковым для немодифицированного дуплекса Ша. Известно, что в отличие от природных мономеров для арабино— содержащих нуклеотидов характерна доминирующая конформация фуранозного цикла в зависимости от положения фосфатной группы. Так, для раА предпоч—

тительнее N —тип, а для аАр— S—тип. Эта закономерность сохраняется на олигомерном уровне: динуклеозидфосфат аАраА является смешанным S — N — конформером. Опираясь на результаты ХЛ и литературные данные, можно постулировать для paU— звена дуплекса Шп конформацию N — типа с экваториальным расположением 3'—гидроксильной группы (схема 2).

СХЕМА 2

О

"0-Р=0 АРАЬМНСВА ОН

В том случае, когда арабинопроизводное является донором фосфатной группы (дуплекс Шш), конформация аномальной фуранозы меняется с N на S, что обусловливает оптимальное для взаимодействия аксиальное расположение реагирующей группы (схема 2). Этот вывод не противоречит данным по расщеплению ЕсоШ ДНК—дуплекса, содержащего в расщепляемом участке аА— звено, для которого Ohtsuka et al. (1984) постулируют S — конформацию.

Другие кинетические закономерности наблюдаются для дуплексов III о,р, содержащих dxT-остатки [34,37]. Эффективность ХЛ меняется незначительно при варьировании положения фосфата в узле "сшивания", оставаясь существенно ниже, чем для немодифицированных дуплексов (табл. 3). Это указывает на сохранение одной и той же конформации 3'—концевого звена (S) неблагоприятной для ХЛ, либо на стерические затруднения, связанные с инверсией 3'—гидроксила (фосфата).

Использование ХЛ для определения локальной структуры НК основано на том, что различные конформационные изменения в месте разрыва в разной степени отражаются на эффективности реакции, не блокируя ее полностью. Этот подход, дополняя традиционные физико-химические методы и кон— формационный анализ, позволяет более надежно оценить конформацию остатков при нике и даже внутри интактной двойкой спирали.

5. Химическая сборка РНК-ДНК-гибридных комплексов

Возможность использования ЭДК и BrCN для конденсации .двух фрагментов РНК или РНК с ДНК на комплементарной матрице изучали на серии гибридных РНК—ДНК—дуплексов (табл 4). Соединяемые олигонуклеотиды отличались числом рибонуклеотидных звеньев (от одного до полной рибонуклеотид— ной последовательности) и положением фосфатных групп [29,36].

Казалось бы ХЛ с участием рибо—звеньев должно идти более эффективно, чем конденсация дезокси—аналогов в силу большей реакционной способности гидроксильных групп рибонуклеотидов по сравнению с дезоксирибонук— леотидами. Однако выход продукта реакции в дуплексе Шд, содержащем в качестве акцептора фосфата г1), более чем в 2 раза ниже, чем в соответст—

Таблица 4. Выход продуктов химического лигирования в гибридных • РНК-ДНК-дуплексах, %

Номер дуплекса

Состав дуплекса

#

Ко нденсирующи и _реагент

BrCN

ЭДК

I I I ь

5' ACGGAT1 pCCAGGAGTGAC 3' GCCTA-GGTCCTCAC

35 (67)

7 5

I Ilg

ACGGA(U)4 pCCAGGAGTGAC GCCT A- GGTCCTCAC

16

35

I I Ir

p ACGGA (Up 11CCAGGAGTGAC GCCT A — GGTC С ТС AC

<5

< 5

Ills

p ACGGA (Up И pCCAGGAGTGAC GCCT A--GGTCCTCAC

4 2

AATGG* ( pAAAAC С CAUG ) TTTACC-TTTTGGGTACC

1 0

VI

p AATGGp (AAAACC С AUG ) TTTACC -TTTTGGGTACC

40 (74)

90

VI I

( AAUGG) * ( pAAAACCCAUG) ГГТАСС -TTTTGGGTACC

4

1 6

8

7

* Символ <1 опущен; рибонуклеотидные звенья (блоки) даны в скобках;

звездочкой обозначено положение радиоактивного фосфата. ##

Время реакции: 3 мин. для ВгСЫ и 6 дней для ЭДК; выход продукта поо трехкратного добавления ВгСЫ указан в скобках.

вующем ДНК—ДНК—дуплексе [27]. Как указывалось выше, это может объясняться разницей в конформации между рибо— и дезоксирибонуклеотидными звеньями в двойной спирали. Дополнительной причиной понижения эффективности лигирования в дуплексе Шд под действием ВгСЫ может быть модификация гидроксильных групп 3'—концевого уридина. Возможность этой побочной реакции была подтверждена контрольным экспериментом. Локализация фосфат^ ной группы на 3'—конце рибо-фрагмента (Шг в табл. 4) также не способствует интенсификации ХЛ. Активация 3'—фосфата рибонуклеотида индуцирует протекание двух конкурирующих реакций: межмолекулярного соединения олигомерных компонентов (путь а) и внутримолекулярного образования 2'-З'-циклофосфата (путь б).

-А U

3DK

ОН ОН

/

ЬО-Р-ОН но.

II

о

нон -оч

BrCN

[-ОН 9 [-0Н'

-4-0 — Рч- о J-ov

-А_^Q^

и с

Ь Нон

—А -

и

ОН If о

— G-V С

I-0H 0^0^

Последний, не являясь достаточно активным интермедиатом ХЛ, тем не менее может реагировать с 5'—концевой группой соседнего олигомера, давая смесь 2'-5- и 3'-5'—связанных изомеров. Введение второй фосфатной группы (дуплекс Ills) несколько увеличивает выход продукта с пирофосфатной связью (до 42%), хотя он и далек от 100%—ного, легко достигаемого при ХЛ соответствующих ДНК—блоков.

Как и ожидалось, в дуплексах V, VI, в которых рибо- и дезоксири— бонуклеотидные фрагменты соединяются на ДНК—матрице, ХЛ протекает наиболее эффективно для комбинации: 3'—фосфорилированный ДНК—блок и оли— горибонуклеотид, несущий 5'—гидроксильную группу (VI). Однако в целом выход продуктов ХЛ в таких гибридах ниже, чем в ДНК—аналогах. Вероятно, изгиб спирали на границе двух конформаций; В—формы для ДНК—ДНК части дуплекса и А-формы для РНК-ДНК гибрида слегка уменьшает эффективность блок—конденсации. При трехкратной обработке BrCN удается существенно повысить выход продуктов реакции (табл. 4).

Матрично—направленное соединение РНК-фрагментов довольно неэффек—

тивно (VII в табл. 4). Этот результат, согласуясь с описанными выше данными, объясняется тем, что рибонуклеотидные звенья плохие акцепторы активированной фосфатной группы. В двойной1 спирали они принимают СЗ'—эндо конформацию, неблагоприятную для химических реакций. Нельзя также исключать влияние вторичной структуры дуплексов на эффективность соединения РНК-фрагментов (см. выше). Очевидно, что если фосфатная группа локализована на 3'-конце олигорибонуклеотида, то соединение олигомеров будет сопровождаться побочной реакцией образования 2',3'—циклофосфата, т.е. фактически блокироваться, как в дуплексе Шг. Анализ продукта лигирования в дуплексе VII — AAUGGAAACCCAUG — с помощью РНКазы Т2 показал, что образующийся олигомер 3'—5'—связан, причем природная связь образуется под действием обоих реагентов.

Таким образом, фундаментальные различия между типами двойных спиралей и химической природой РНК и ДНК не позволяют разработать эффективный метод соединения цепей РНК с помощью химических реагентов. Возможно, детальное изучение влияния ионов двухвалентных металлов на стереохимию реакции позволит решить эту проблему. ХЛ оказалось довольно эффективным при синтезе блоксополимеров ДНК и РНК. При этом надо иметь в виду, что высокий выход продуктов ХЛ может быть достигнут только тогда, когда 3'—фосфорилированный олигодезоксирибонуклеотид является 5'—концевым

фрагментом блоксополимера: 5' ——р --—.

6. Химическое лигированпе как энзимоподобная реакция. Сравнение субстратных свойств и "ферментативной" активности

"химической лигазы" и Т4-ДНК-дигазы Для глубокого понимания кинетических и структурных особенностей реакций в комплексах НК плодотворным представляется сравнительное изучение химического и ферментативного лигирования, их общих закономерностей и различий. Матрично—направленные реакции можно рассматривать как относительно простую химическую модель энзиматического процесса, в котором используются принципы, действующие в активных центрах ферментов. Действительно, как и при сорбции субстрата на ферменте, в комплементарном комплексе за счет слабых многоточечных взаимодействий фосфатная и гидрохсильная группы сближаются на расстояние ковалентной связи. При этом погашено поступательное движение групп друг относительно друга и в некоторой степени фиксирована их взаимная ориентация. Кроме того, как и в ферментативных системах, микросреда и сольватационные условия в комплементарном комплексе существенно отличаются от таковых в растворе.

Таким образом, комплементарный комплекс можно рассматривать как своеобразный комплекс Михаэлиса, в котором свободная энергия кокплексооб— разования тратится на понижение барьера свободной энергии активации последующей химической реакции. Одним из факторов, приводящих к ускорению ферментативного процесса на 3—4 порядка, является усиление реакционной способности реагирующих групп за счет взаимодействия с функциональными группами белка по механизму общекислотного и общеосновного катализа. При ХЛ увеличение реакционной способности реагирующих групп может быть достигнуто только за счет внешних изменений: либо усиления электрофильности фосфомоноэфира при использовании более активных конденсирующих реагентов, либо увеличения нуклеофильности групп, взаимодействующих с активированным фосфатом. Как уже было продемонстрировано, оба эти фактора существенно меняют эффективность ХЛ. Далее, на скорость ферментативных процессов очень сильно влияет сближение и взаимная ориентация реагирующих групп субстрата в активном центре. И в системах, моделирующих ферментативный акт, изменение конформационной ситуации в реакционном узле за счет введенных дефектов приводит к замедлению реакции конденсации.

Тем не менее, возможности химического и ферментативного лигирования и требования, предъявляемые к ДНК—дуплексам — субстратам, сильно различаются [25,27].

Для успешного протекания ХЛ основным требованием является наличие термодинамически стабильного двуспирального комплекса. Для образования фосфодиэфирных связей лучшая комбинация реагирующих групп в нике: 3'—фосфат и 5'—гидроксил. Химический метод чувствителен к нуклеотидной последовательности вблизи репарируемого участка. С его помощью можно получать с достаточно высокой эффективностью межнуклеотидные узлы с широким спектром модификаций сахаро—фосфатного остова, в том числе неприрод— ные связи [27,36]. Скорость их образования сильно зависит от нуклеофильности групп, атакующих активированный фосфат, а при одинаковой химической природе взаимодействующих групп — от степени их сближения и характера взаимной ориентации, т.е. локальной конформации участка "сшивания". Скорость образования фосфодиэфирной связи может быть существенно выше (ВгСЫ) или ниже (ЭДК) скорости ферментативной реакции.

Для Т4—ДНК—лигазы не столь существенна термостабильность двойной спирали. Фермент может работать при температуре как ниже, так и выше Т^ дуплекса, взаимодействуя в этом случае не с реальным устойчивым дуплексом, а с "виртуальным" [20]. Эффективность литерования зависит от физи—

ческих размеров дуплекса: минимальный ник—содержащий субстрат должен иметь 9 н.п. Фермент мало чувствителен к нуклеотидной последовательности и катализирует исключительно образование природной межнуклеотидной связи. Из всего набора модифицированных дуплексов (табл. 2) только в дуплексе Шд, содержащем в участке лигирования 3'-концевое rU—звено, реакция конденсации была эффективной — 80—95%. В некоторых дуплексах, содержащих в качестве 3'—концевого звена —'T"NH (IIIc), -Тр (Illd) или -dxT

(IIIpí, наблюдается накопление интермедиатных продуктов — 5'-аденилиро— ванны;: олигомеров. В дуплексах III е, f, к, п и IV f отсутствуют как продукты реакции, так и интермедиатные структуры [27,25,37]. Видимо, отбраковка таких субстратов происходит уже на стадии образования фермент-субстратного комплекса. На основании результатов лигирования в дуплексах с неканоническими парами оснований можно заключить, что область двойной спирали, пространственная структура которой важна для функционирования фермента, н.п. в компоненте, акцептирующем фосфат, и <3 н.п. в донор-ном компоненте. Обнаружена возможность "сшивания" Т4—ДНК—лигазой одно-цепочечных разрывов в дуплексах IV d, е с "лишним" нуклеотидным звеном в реакционном узле (выход продукта в -2 раза ниже, чем в немодифициро— ванном дуплексе). При этом стадии образования фосфодиэфирной связи предшествует стадия элиминирования "лишнего" звена, т.е. фермент может самостоятельно устранять некоторые дефекты двойной спирали [25].

7. Влияние секвенс-зависимой вариабельности конформации В-ДНК на эффективность ХЛ

Как показано ранее на ограниченном экспериментальном материале (сборка 35—звенного дуплекса), метод ХЛ чувствителен к природе соединяемых нуклеотидных остатков. Феномен зависимости эффективности химических матричных реакций от нуклеотидной последовательности имеет как теоретическое, так и чисто практическое значение — выяснение принципов рациональной разбивки целевой двуспиральной ДНК на блоки. В этой части работы нами предпринято сравнительное изучение ХЛ для большинства комбинаций нуклеотидных контактов в двойной спирали ДНК (14 из 16 возможных). Для этого были использованы трехкомпонентные комплексы, состоящие из матричного олигомера и двух комплементарных ему олигонуклеотидов, причем нуклеотидные последовательности, фланкирующие участок лигирования, были различны. В параллельных сериях экспериментов использовали оба конденсирующих реагента - ЭДК и BrCN. Для того, чтобы приблизить наши модельные системы к реальной ситуации сборки протяженных ДНК, мы раз—

бивали на фрагменты 1—18 реальный ген, содержащий 183 н.п., таким образом, чтобы в месте стыковки олигомеров контактировали различные нуклео— тидные остатки. Ряд контактов был проверен повторно с использованием более длинных матриц {блоки а-Ь).

Г"

-1-

5' ССТТААСАССВТСрССТСТТС-АСТАТГТТрАССТСТОССС-ОТСАТААТСОАТССр 3' АТГСТСССАС-ССАСААСрТСАТАААЛ-ТССЗАСАССССрСАСТ \TTACCTAGG

I-18--1 I-17-1 I-15-

I-Ь-1 !-

Г"

АТСТАСТААСС-АВСТАССАТССССЕрТАОЗСАТАТ-ССАТАААСССТрС ТССТСв ТАСАТСАТГССрТССАТССТАССССС-АТСГСТАТАрССТАТТТСССА-САССЛСС --1 I-15-1 I-14---

АССССТАТ-ССТСТСТАСАрССАТАСАТСТ-ТАСАССГСрСАААТТСАССТССЛ-АТ ТССССАТАрССАСАСАТСТ-СеТАТСТАСАрАТСТССАС-СТТТААСТСОАССТрТА -1 I-13-1 I-12-1 Ь.

ТСАААСрССТССТГТТССА-СССТТТТТТТТТ 3' АСТТТС-ССАСОААААССТрСССАААААААААН 5 '

--11-1 I-10-1

Во всех участках лигирования сближены 3'—фосфатная и 5'—гидроксильная группы. Результаты ХЛ приведены на рис. 7 А Видно, что выходы продуктов реакции колеблются от 17 до 94% в зависимости от природы звеньев, между которыми образуется новая фосфодиэфирная связь [40]. В некоторых случаях удлинение матрицы понижает выход продукта, что, вероятно,связано с наличием внутримолекулярных структур в компонентах комплекса. Важно отметить, что оба реагента показывают одинаковую секвенс-специфическую тенденцию (рис. 7А), несмотря на различия в скоростях реакций. Совокупность этих данных позволяет предположить, что колебания в выходе продуктов ХЛ могут объясняться различной ориентацией реагирующих групп, связанной, в свою очередь, с секвенс—зависимыми модуляциями локальной структуры В— ДНК. Наличие таких модуляций обнаружено с помощью рентгено—структурного анализа (РСА) монокристаллов олигонуклеотидов. Высказывается несколько гипотез о причинах конформационного полиморфизма ДНК. Наиболее популярная модель (Са11ас11ле, 1982) объясняет вариабельность структуры локальными конформационными подстройками, смягчающими энергетически невыгодные столкновения пуриновых оснований противоположных цепей в малой бороздке (наиболее неблагоприятные столкновения наблюдаются для 5'-РугРи-3' последовательности). На первый Взгляд кажется, что наличие од— ноцепочечного разрыва приведет к грубому нарушению тонких структурных

модуляций ч ДНК, увеличивая степени свободы коЕалентно не связанных фрагментов углеводофосфатного остова. Однако недавние исследования с помощью РСА и ЯМР высокого разрешения ник-содержащих и интактных ДНК-дуплексов показали, что одноцепочечный разрыв вызывает только незначительные искажения структуры, и внутренне присущие секвенс—зависимые

свойства проявляются в дефектных спиралях так же ярко, как и в совер— 31г

шенных. Поскольку

изучения конформационной гетерогенности

41

провели сравнительный анализ данных Р-ЯМР (Согел5<ет е( а1., 1988)

Р-ЯМР-спектроскопия является мощным инструментом с.ахаро-фосфаткого остова, мы

и

результатов ХЛ для одинаковых нуклеогидных кош'актов в двойной спирали

ЮОп

о - ВгСЫ (3 мин.) л " ЭДК ( 5 дней) р

Ср'С ТрА Ср'с СрА ТрС йрТ СрА Тр'й АрС Ар/» СрО ТрТ вр\з СрТ

К §

о

« а,

хп и

О) ПЗ

V ^

К (О

х 5

-5,0

-4,5

-4,0 -

-3,5

—1-1-.--1-1-1-т-1-1-1-г"-1-1-1-1-'

СрС ТрА СрС СрА ТрС СрТ СрА Трв АрС АрА СрО ТрТ СрО СрТ АрС ЛрТ

Рис. 7. А. Выход продуктов ХЛ в зависимости от природы звеньев, между которыми образуется новая фосфодиэфирная связь; направление цепи 5'—3'. Отрезками прямой соединены усредненные значения выходов для различных дуплексов с одинаковым участком лигирования. Б. Зависимость химических сдвигов сигналов от природь

звеньев, окружающих данную фосфодиэфирную связь в В-ДНК. Отрезками прямой соединены усредненные значения химических сдвигог .для семи олигонуклеотидных дуплексов (СогеШет е< а!., 1388). (рис. 7Е). Хорошо видна общая тенденция в изменении эффективности ХЛ у

32

химических сдвигов сигналов индивидуальных фосфатов олигонуклеотидных дуплексов, связанных с торсионными углами фосфодиэфирных связей и локальными геометрическими параметрами спирали: сдвиг в слабое поле ре— 31

зонансного сигнала Р и понижение эффективности лигирования для последовательности 5'-РутРи-3'', сдвиг в сильное поле и параллельное увеличение выхода продукта лигирования для динуклеотидных комбинаций: 5'-

СрТ-З', 5'-ТрТ-3' и 5'-СрТ-3'. График позиционной зависимости химиче— 31

ского сдвига сигнала Р содержит данные для 5'-АрТ-3' и 5'-АрС-3', отсутствующие на рис. 7А. Учитывая их, можно предсказать выход продуктов ХЛ для контакта АрТ — 80-90% и для контакта Ар О — 40-50%. Дополнительные эксперименты (Меренкова и др., 1993) показали хорошее совпадение с этими предсказаниями. Корреляция между сравниваемыми параметрами прослеживается и на других системах. Так, известно, что В -► А переход сопровождается расплетанием двойной спирали и уменьшением угла спирального

вращения с 36,0 до 32,7°. Это проявляется в кооперативном сдвиге сиг-31

налов Р в слабое поле на 0,2—0,3 млн. долей и падении выхода продуктов ХЛ в 2—3 раза при замене олигодезоксирибонуклеотидов фрагментами РНК (см. выше). Прямое сравнение эффективности лигирования различных комбинаций нуклеотидных остатков с экспериментально полученными (РСА) или рассчитанными значениями углов спирального вращения в сЦССССААТТСССС) также показывает параллелизм в вариациях этих параметров [40].

Полученные результаты показывают прямую корреляцию между реакционной способностью и взаимной ориентацией реагирующих групп, обусловленной общей и локальной структурой двойной спирали. ХЛ оказалось чувствительным даже к относительно слабым секвенс—зависимым модуляциям конформации НК. Этот вывод весомо поддерживается тем фактом, что отмеченная корреляция практически не зависит от природы конденсирующего реагента. Полученные результаты подтверждают, что одноцепочечные разрывы мало искажают локальную структуру участка и "разорванные концы" заморожены в конформа— циях, диктуемых секвенс—зависимыми свойствами ДНК. В первом приближении реакционная способность двух нуклеотидных остатков может быть предсказана на основе модели "ближайших соседей", которая описывает спиральные параметры в терминах структуры комплементарных динуклеотидов, пренебрегая дальнодействующими эффектами. Действительно, различные нуклеотидные последовательности, фланкирующие динуклеотидные контакты, не нарушают отмеченные закономерности. Эти находки открывают путь к химическому зондированию тонкой структуры необычных форм нуклеиновых кислот — триплек— сов, тетраплексов, параллельных дуплексов и др., а также особенностей

локальной конформации сахаро-фосфатного остова природных и модифицированных спиралей ДНК (РНК). Наконец, в практическом плане знание ряда ди-нуклеотидных контактов в порядке увеличения эффективности лигирования дает возможность провести оптимальную разбивку целевого ДНК—дуплекса на блоки. Опираясь на полученные закономерности, 183—звенный ген был разбит на 8 фрагментов и успешно собран с помощью ВгСК (5ЛаЬаго1га е( а!., 1992).

8. Зондирование структуры тройных спиралей с помощью ХЛ

Учитывая высокую чувствительность ХЛ к ориентации реагирующих групп, закрепленной вторичной (третичной) структурой ДНК—спиралей, мы попытались использовать этот метод для мониторинга изменений в сахаро— фосфатном остове при образовании необычных форм нуклеиновых кислот. Наше внимание привлекли трехспиральные РутРиРуг ДНК, интерес к которым связан с их предполагаемой ролью в регуляции эукариотического генома (Н—форма ДНК). Кроме того, изучение тройных спиралей интересно в плане конструирования олигонуклеотидных лигандов, узнающих двуспиральные мишени. Такие лиганды могут служить искусственными репрессорами генов и ДНК— расщепляющими агентами. Полагают, что тройные спирали принимают А-фор-му, причем пуриновый и один из пиримидиновых тяжей связываются Уотсон-Криковскими парами, а второй пиримидиновый тяж, лежащий в большой бороздке двойной спирали параллельно пуриновому тяжу, связан с последним Хугстеновскими парами. Для изучения молекулярной структуры гриплексов наряду с физическими методами довольно широко использовались химические подходы: резистентность трехспиральных участков к химическим модификациям и специфическое расщепление двойной спирали. Недавно было показано, что двуспиральная ДНК может служить матрицей для конденсации гомопи-римидиновых фрагментов третьего тяжа (IиеЬке, Оетш, 1989). В настоящей работе была сконструирована серия ДНК—дуплексов и триплексов, в том числе содержащих одноцепочечные разрывы (схема 3), которая позволила проследить за изменениями в сахаро-фосфатном остове при конверсии ДНК-дуплекса в триплекс и за связыванием третьей цепи [39].

Из—за того, что два гомопиримидиновых тяжа триплекса антипараллель— ны, они не могут заменять друг друга в тройных спиралях с нерегулярной последовательностью оснований. Это позволяет независимо наблюдать ЭДК— индуцированное лигирование в обоих пиримидиновых тяжах и сравнивать реакционную способность и, следовательно, взаимное расположение взаимодействующих фосфатных и гидроксильных групп в триплексе и в исходном дуплексе. Выбор нуклеотидной последовательности олигомеров диктовался кодом

связывания третьей цепи (протонированный С узнает С-С—пару, а 'Г узнает А-Т— пару). Предварительное изучение КД и термической устойчивости сконструированных комплексов подтвердило образование тройных спиралей в изученных системах. Все триплекс—образующие смеси показывают двухступенча—

(5'—3') тстстсстс!гтссстс --

(3'—5' ) А^А^^АА^А^ «-

(3'—5 ' ) АТСТСТССТСТТСССТСА «/W/W

-el

VIII X XII

Pi-

li 6%)

:|рт

(14%)

IX XI хш

[18%)

ТР | Р<Л/~ \r\*r |yv/\A-

(90%)

Схема 3. Трехспиральные PyrPuPyr комплексы.

Вертикальные стрелки отмечают участок соединения олигомерных

блоков. Пиримидиновый (-) и пуриновый (-) олигоме—

ры соединены Уотсон-Криковскими парами; олигомер 'V^VVAV4 — связанная Хугстеновскими парами третья цепь. Ниже схематически изображены изученные тройные спирали; выделены нуклеотидные остатки в реакционном узле. Выход продукта ХЛ указан в скобках.

тое плавление (рис. 8), причем первая ступень соответствует диссоциации компонента, связанного менее прочными Хугстеновскими парами. Разрыв в третьей цепи значительно понижает температуру ее диссоциации (ср. рис. 8а и Ъ).

Эффективность конденсации пиримидиновых олигонуклеотидов, связанных Уотсон—Криковскими парами, и в дуплексе VIII, и триплексе IX примерно одинакова (схема 3). Этот результат показывает, что существенных структурных перестроек сахарофосфатного остова при присоединении третьей цепи не происходит, поскольку разница в конформации сахара — N (А—форма) и S (В—форма), сильно повлияла бы на эффективность ХЛ (выход продуктов лиги— рования существенно ниже для А—формы спирали). Низкий уровень лигирова— ния (16—18%) свидетельствует о том, что исходный дуплекс, возможно, уже находится в А—подобной конформации, адаптированной для связывания треть—

ей цепи. По результатам лигирования в триплексах X и XI (схема 3) можно констатировать, что реагирующие группы сближены за счет связывания "разорванной" третьей цепи с исходным дуплексом. Интересно, что выходы

продуктов лигирования в различных пиримидиновых тяжах одного и того же

*

'—V— 41 а /1 / г.

\

1 - / К / ч / 1 1—1 1 ч _ ч 1

ЙА | А260 ¿И

А 260 0,6

0.5

Рис. 8. Профили плавления трехспираль— ных ДНК в 0,05 М МЭС, рН 6,0, 20 мМ МдС12, С0= 0,5'Ю-4 М. Кривые в дифференциальной форме показаны пунктирными линиями.

70 10 ТЕМПЕРАТУРА, °С

триплекса одинаковы (ср. система IX и X на схеме 3); следует отметить, что в обоих случаях "сшиваются" идентичные нуклеотидные остатки: —СЗ' и 5'рТ—. Эти данные можно интерпретировать следующим образом. В обоих пиримидиновых тяжах трехспирального комплекса расположение реагирующих групп одинаково, несмотря на разницу в типе спаривания с центральным пу— риновым тяжем. Эти результаты согласуются с данными диффракции рентгеновских лучей и ЯМР-спектроскопии, касающимися конформации фуранозных остатков в тройной спирали.

9. ХЛ в разветвленных ДНК

В практическом плане ХЛ представляется перспективным для дизайна структур необычной топологии, поскольку в этом случае энзиматический подход может оказаться непригодным из—за пространственных затруднений или неканонической геометрии субстратов. В этом разделе представлены результаты конструирования длинных разветвленных олигонуклеотидов (РО) с помощью техники ХЛ. Интерес к таким соединениям связан с возможностью многократного увеличения чувствительности определения НК с помощью гиб— ридизационных проб за счет амплификации сигнала. РО должны содержать фрагмент уникальной первичной структуры (взаимодействующий с определяв—

мой ДНК), ковалентно связанный с несколькими копиями другой последовательности, гибридизующейся с фермент-меченными зондами. Схематически их можно изобразить в виде гребенки ( 1X11). Современный уровень олиго— нуклеотидного синтеза позволяет получить на ДНК—синтезаторе РО только с короткими "зубцами", содержащими не более 6 нуклеотидных остатков. Задача заключается в том, чтобы присоединить 24—звенную последовательность к каждому из пяти "зубцов" исходной структуры. При разработке стратегии сборки и конструировании участка лигирования были приняты во внимание все факторы, позволяющие интенсифицировать матричную реакцию: существование стабильного комплекса, обеспечивающего сближение реагирующих групп на матрице, локализация фосфатной группы на 3'—конце олигонуклеотида, оптимальная комбинация взаимодействующих нуклеотидных остатков, введение более нуклеофильных групп — акцепторов активированного фосфата, использование различных активирующих реагентов с учетом их недостатков и прей—

3' TCCGTATCCTGGGCACAG111111 ITT- Е -ТТ - Е - ТТ- Е - ТТ - Е- TTGTCAGX 5 1

I I I I

G

*->«-]£! а)

X = H2HV<4J {2)

0

х=но-р-о

1

о

0-V

G G G G

Т Т Т Т

С С С С

А А А А

G G G G

X X X X

5 ' 5 ' 5 ' 5

Сз)

5 ' GATGTGGTTGTCGTACTTGCGTAGp 3 ' (4 ) 5' CAGTCACTACGC 3' (S)

н3с.

Е =

nh •

5' GATGTGGTTGTCGTACTTTTT; Е - TTGCGTAGp 3' 0 £ j.' CGCATCACTGAC 5'

■ 0-Р-0-~ (6) тттт

о-

(0-(з)

(5)

(4|

X

'X

(в)

<1>- (з) 1

X

X

Схема 4. Химическая сборка разветвленных ДНК.

(1)—(6) — олигонуклеотидные компоненты реакционных смесей. Ниже схематически изображены дуплексы на основе РО, обеспечивающие сближение реагирующих групп.

муществ. Наращивание вторичных последовательностей РО показано на схеме 4. Для стабилизации комплементарного комплекса было использовано химерное разветвленное соединение (6) (схема 4), представляющее собой кова— лентно—связанные матрицу (5) и "входящий" олигомер (4).

На первой стадии эта сложная система была промоделирована простым трехкомпонентным комплексом, составленным из олигомеров (4), (5) и 37— звенного линейного олигонуклеотида, имитирующего одну ветвь разветвленных структур (1)—(3). Эксперименты показали, что 24 — и 37—меры могут очень эффективно конденсироваться на 12—звенной матрице, давая 80—85% продукта с природной и >95% продуктов с пирофосфатной или фосфоамидной связями. При этом для образования фосфодиэфирной связи использовали BiCN, а модифицированные связи образовывались под действием ЭДК. Отработанные условия были использованы для присоединения 24—меров к каждому из пяти ответвлений исходного РО. Перед добавлением химического реагента проводился 2—3 часовой "отжиг" реакционных смесей, с последующим их анализом капиллярным электрофорезом в 8% ПААГ. Это позволяло получать количественные данные по распределению моно —пента замещенных производных. Наиболее благоприятное распределение продуктов ХЛ было достигнуто в пи— рофосфат-связанных РО (рис.ЭА); 17% три—, 43% тетра— и 39% пентазамещен— ных соединений. Для фосфоамид—связанных РО соотношение продуктов состав-

Рис. 9. Капиллярный гель—электрофорез продуктов ХЛ в разветвленных ДНК.

А. ЭДК—индуцированное образование производных с пирофосфатными связями ((3)+(4)+(5) на схеме 4); 16 час. инкубации при 0°. Б. ВгСИ—индуцируемая реакция в смеси олигомеров (1)+(4)+(5) (образование фосфодиэфирной связи); 5 мин. инкубации при 0°. Пики 1,2 и 3 соответствуют 12—звенной матрице, 24—меру и исходному РО с 5 "зубцами"; остальные пики — моно-пентазамещенные РО.

ляло соответственно 31, 39 и 19%, и 9% приходилось на долю дизамещенного производного. Наименее эффективно конденсация проходила в случае атаки активированного фосфата 5'—гидроксильной группой; основным продуктом являлось дизамещенное соединение (33%) (рис.ЭБ). Интересно, что в пике, соответствующем монозамещенному производному, можно ясно видеть более тонкую структуру, указывающую на наличие различающихся по подвижности в геле позиционных изомеров.

Использование в качестве наращиваемого компонента гибрида, совмещающего в себе матрицу и вторичную последовательность РО ((6) на схеме 4), значительно интенсифицирует ХЛ. Так, в амплификационном мультимере с фосфодиэфирными и фосфоамидными связями основную часть составляют тетра— и пентазамещенные производные, а основным пирофосфатсодержащим продуктом является пентазамещенный РО. Этот эффект достигается за счет образования более стабильных комплексов при такой необычной комбинации внутри и межмолекулярных комплементационных взаимодействий.

Блестящие возможности ХЛ были продемонстрированы при получении РО с 15 боковыми "зубцами". В пирофосфат—связанном продукте основную часть составляют более чем 12-ти замещенные разветвленные ДНК. Соединения, образовавшиеся в результате параллельного протекания более, чем 12 актов ХЛ, содержат около 1400 нухлеотидных остатков.

10. Циклизация олигонуклеотидов с помощью ХЛ

Другим примером необычной структуры, успешно полученной с помощью ХЛ, являются циклические олигодезоксирибонуклеотиды (ЦО). Интерес к использованию таких соединений в качестве антисенсов обусловлен их устойчивостью к экзонуклеазной деградации. Некоторые особенности дйзайна линейных предшественников ЦО были предсказаны нами априори. Так, их длина должна быть достаточной для образования стабильного дуплекса с перекрыванием не меньше 6+6 н.п., при этом огибающая область должна содержать примерно 22 нуклеотидных остатка; фосфатная группа должна находиться на 3'—конце олигонуклеотида, а в участке лигирования — контактировать наиболее "реакционноспособные" нуклеотиды —Ср1Т— или —Тр'Т—; для образования фосфодиэфирной связи следует использовать ВгСЫ. Согласно этим требованиям была сконструирована модельная система XIV, на которой были выяснены основные закономерности химической циклизации олигонуклеотидов. Показано, что увеличение нуклеотидной концентрации способствует образованию димера исходного олигонуклеотида в конкурирующей с циклизацией реакции конкатемеризации. При С0= 10—^М выход циклического продукта,

39

„СССАСлАСТСССАС-, „ТЕИТКИТКНТКК—

ГС ТС _А к

Т XIV Т СГ XV к

Тт 3' I 5 ' ГТ Т 3' 15 ' .С

тсссстаср1тсаст?^ 5'

3'ССССАТС-АСТСАС ААОСАСС - АСССССТ

имеющего электрофоретическую подвижность в 20% ПААГ промежуточную

между подвижностями линейного предшественника и его димера, составил

80-90% [42]. Циклическая природа продукта ХЛ доказана его устойчивостью

к действию смеси ферментов — фосфодиэстеразы змеиного яда и бактери—

32

альной щелочной фосфатазы, резистентностью к введению 5 — Р метки и

необычным характером расщепления (анализ по Максаму—Гилберту) по одному оо

из оснований (5'— Р метка должна содержаться в линейном предшественнике до циклизации; при этом в результате ХЛ образуется пирофосфатная связь). Последний оригинальный подход дает возможность однозначно идентифицировать исходный олигонуклеотид дающий нормальный набор полос, соответствующий положению данного основания в цепи (рис. 10), и цикличе—

Рис. 10. Авторадиограмма электрофореза в 20% ПААГ линейного предшественника (2) и продукта его циклизации в дуплексе XIV (4); их расщепление по остаткам <Ю в условиях анализа по Максаму—Гилберту (1 и 3) соответственно.

ский олигонуклеотид, электрофоретическая подвижность которого после первого же разрыва цепи скачкообразно меняется, совпадая с подвижностью исходного олигомера, а нуклеотидную последовательность невозможно "прочитать" из—за того, что радиоактивная метка находится не на конце, а внутри анализируемой цепи (рис. 10).

Исследование других олигонуклеотидиых систем показало, что длина

40

линейного предшественника должна более, чем вдвое превосходигь длину матрицы. Важнейшим фактором, влияющим на эффективность циклизации, является вторичная структура исходного олигонуклеотида. Для обеспечения высокого выхода кольцевых продуктов необходимо наличие внутримолекулярной "шпильки", оставляющей свободными концевые участки молекулы. 3'— или 5'—спаренные концы практически полностью ингибируют химическую циклизацию. Ясно, что при длине линейного предшественника в 30—40 звеньев трудно избежать неблагоприятных внутримолекулярных взаимодействий. Одним из путей ограничения конформационных проблем может быть замена незначащих последовательностей в исходном олигомере на ненук— \еотидные вставки. Этот прием также уменьшает возможность неспецифи— 1еских взаимодействий зонда с НК клетки, что представляет основную троблему для терапевтического применения антисенсовых олигонуклеотидов. J качестве таких вставок было предложено использовать чередующиеся остатки 1,2—дидезокси—2>-рибофуранозы (В) и тимидина (Орецкан и др. [41]). RRT)S были вставлены в олигонуклеотид, концевые фрагменты которого должны образовать после циклизации 18-звенный участок, специфически :вязывающийся с РНК вируса простого герпеса. В условиях, оптимальных для деклизации нуклеотидных аналогов, смешанный олигомер в присутствии 14— (венной матрицы (дуплекс XV) образует циклическую структуру с выходом Злизким к 100% (BrCN—индуцируемое ХЛ).

Таким образом, ХЛ оказалось эффективным методом циклизации олиго— [уклеотидов не только в составе трехспиральных комплексов (Prakash, Cool, 1991), но и в стандартных двойных спиралях.

ВЫВОДЫ

1. Разработана' принципиально новая стратегия быстрой химической борки природных и модифицированных ДНК и ДНК—РНК гибридных дуплексов, ткрывающая новые практические возможности направленного синтеза генети— еских структур (химическое лигирование, ХЛ). Предпосылками ее создания вилось фундамента\ьное исследование органической химии двуспиральных уклеиновых кислот, в частности, химических реакций, моделирующих дейст— ие ДНК—лигазы, разработка методов химической активации олигонуклеотидов

водной среде, изучение свойств комплементарных комплексов. Для матрич— о—направленного соединения фрагментов ДНК использовали технологичные одорастворимые конденсирующие реагенты.

2. Показано, что BrCN является высокоэффективным реагентом для ХЛ,

41

позволяющим осуществлять сверхбыстрые реакции в ДНК—дуплексах (1—3 мин.)

31

и не дающим побочных продуктов. На основании данных Р - ЯМР— спектроскопии предложен механизм активации бромцианом фосфомоноэфирной группы нуклеотидов.

3.А. Методами КД и УФ—спектроскопии исследованы термическая устойчивость и структурные особенности широкого спектра ДНК— подобных дуплексов с разрывами в цепи фосфодиэфирных связей; рассчитаны термодинамические параметры комплексообразования.

Б. Охарактеризован новый класс двуспиральных ДНК, содержащих повторяющиеся олигонуклеотидные последовательности, — конкатемеры; дано термодинамическое описание перехода спираль — клубок в этих системах и рассчитаны термодинамические параметры перехода.

В. Изучено влияние точечных модификаций разного рода, расположенных вблизи места одноцепочечного разрыва, на общую и локальную структуру двойной спирали, термодинамические параметры комплексообразования, величину конформационной трансмиссии.

4.А. Создана общая структурно—кинетическая картина лигирования оли— гонуклеотидов в комплементарных комплексах. Показано, что отношение кинетических констант скорости продуктивного и непродуктивного распада активированного фосфомоноэфирного производного, к3/(к2 + к31, связано со структурой реакционного узла; для конкретного дуплекса величина + к3) не зависит от природы конденсирующего реагента (показано для серии водорастворимых карбодиимидов).

Б. Изучено влияние природы заместителей при N1 и N3 атомах водорастворимых карбодиимидов на кинетические параметры ХЛ. Показано, что в реакции участвует линейная форма карбодиимида.

В. Установлена общая для бромциана и водорастворимых карбодиимидов зависимость эффективности ХЛ от природы и конформации реагирующих групп. Показано, что выход продукта гораздо выше, если фосфатная группа находится на 3'—конце "сшиваемых" олигонуклеотидов; замена гидроксильной группы на более нуклеофильные фосфатную и аминогруппы в 20—30 раз увеличивает скорость реакции; любые нарушения локальной структуры участка репарации приводят к резкому падению эффективности лигирования.

Г. На основании анализа кинетических данных сделаны предположения о конформации фуранозы в рибо— и арабинонуклеотидных звеньях, включенных в ДНК—дуплексы (модифицированные звенья примыкают к месту одноцепочечного разрыва).

Д. Теоретически обосновано и доказано, что ХЛ фрагментов РНК

42

гораздо менее эффективно, чем ДНК—аналогов, что связано с неблагоприятной для реакции СЗ'—эндо- конформацией, которую принимают рибонук— леотидные звенья.

5. Экспериментально доказано, что природа соединяемых нуклеотидных остатков является одним из основных факторов, определяющих эффективность ХЛ (проанализировано 14 из 16 возможных комбинаций нуклеотидных контактов в двойной спирали); в зависимости от их природы выход продуктов изменяется от 17 до 94%. Установлена взаимосвязь между реакционной способностью взаимодействующих групп и секвекс—зависимой локальной конформацией участка лигирования в В—ДНК. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что одноцепочечный разрыв незначительно искажает локальную структуру двойной спирали.

6. Впервые ХА было использовано для зондирования структуры PyrPu— Руг тройных спиралей. Доказано, что двуспиральная ДНК может служить матрицей для конденсации пиримидиновых фрагментов.

7.А. С помощью разработанного метода получены функционально—значимые 17—200 звенные двуспиральные ДНК, в том числе 35— звенный ДНК-дуплекс, соответствующий концевому инвертированному повтору IS 1— элемента; введен широкий спектр точечных модификаций в ДНК—дуплексы: неприродные фосфоамидные и пирофосфатные связи, "конформационно— измененные" фосфодиэфирные связи между дезоксинуклеотидными и рибо— нуклеотидными остатками, а также звеньями с обращенной конфигурацией при С2'— и СЗ'—атомах фуранозы, некомплементарные пары, одноцепочечные де— леции и вставки; получены ДНК—РНК блоксополимеры.

Б. Уникальные возможности ХЛ продемонстрированы при разработке методов циклизации олигодезоксирибонуклеотидов и получении таких топологически необычных структур, как разветвленные ДНК. С помощью этого метода целевые соединения (перспективные генетические лекарства и гиб— ридизационные зонды) были получены с выходом близким к 100%.

8. Показано, что Т4—ДНК—лигаза эффективна только при получении немодифицированных ДНК и РНК-ДНК-гибридов и не катализирует образование неприродных й "конформационно измененных" межнуклеотидных связей. Доказано существование у Т4—ДНК—лигазы аномальной активности при дотировании дуплексов с "лишним" звеном в реакционном узле; стадии образования межнуклеотидной связи предшествует стадия элиминирования неспаренного остатка.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Долинная Н.Г., Громова Е.С., Ильина Е.В., Сергеева Н.Ф., Шабарова

3.А., Прокофьев М.А. Изучение комплементарных комплексов, образованных олигодезоксирибонуклеотидами различной длины. II Биоорган, химия. 1975. Т. 1. N 9. С. 1296-1302.

2. Соколова Н.И., Каграманова В.К., Долинная Н.Г. Специфическое комп-лексообразование в водных растворах с участием моно— и олигонуклеотидов (обзор). И Успехи химии. 1975. Т. XIV. N 1. С. 104-133.

3. Долинная Н.Г., Громора Е.С., Михайлов С.Н., Шабарова З.А. Комплемен— тационные взаимодействия тридезоксирибонуклеотидов с олигодезоксири— бонуклеотидными матрицами разной длины. // Биоорган, химия. 1978. Т.

4. N 4. С. 535-548.

4. Долинная Н.Г., Громова Е.С. Изучение комплементарных комплексов нук— леотидной природы методом кругового дихроизма. II В кн. Физико-химические методы молекулярной биологии. / Под ред. И.В.Березина. М.: МГУ. 1978. С. 136-144.

5. Долинная Н.Г., Шабарова З.А. Матричная химическая конденсация гетерогенных олигонуклеотидов. // Биоорган, химия. 1980. Т.6. N 2. С. 209-215.

6. Shabarova Z.A., Dolinnaya N.G., Turkin S.I., Gromova E.S. DNA-like duplexes with repetitions. I. Properties of concatemer duplexes formed by d(T-G-C-A-C-A-T-G). // Nucleic Acids Res. 1980. V. 9. N 11. P. 2413-2429.

7. Шабарова 3.A., Волков E.M., Орецкая T.C., Туркин С.И., Долинная Н.Г Каграманова В.К., Прокофьев М.А. ДНК—подобные дуплексы, содержащие повторы. Синтез и химическое лигирование декануклеотида d(T-G-G-C-C-A-A-G-C-Tp). // Докл. АН СССР. 1981. Т. 258. N 4. С. 914-917.

8. Dolinnaya N.G., Drutsa V.L., Shabarova Z.A. Chemical template-guided polymerization of decanucleotide d(TGGCCAAGCTpj. The properties of DNA-duplexes with repetitions. // Nucleic Acids Res., Symposium Series. 1981. N 9. P. 255-257.

9. Shabarova Z.A., Dolinnaya N.G., Drutsa V.L., Melnikova N.P., Purmal A.A. DNA-like duplexes with repetitions. III. Effecient template-guided chemical polymerization of d(TGGCCAAGCTp). // Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. N 21. P. 5747-5761.

10. Долинная Н.Г., Громова Е.С. Комплементационные взаимодействия олигонуклеотидов (обзор). // Усйехи химии. 1983. Т. LII. N 1. С. 138-167.

44

11. Долинная Н.Г., Ивановская М.Г., Пурмаль A.A., Метелев В.Г., Горкун А.Ф., Вейко В.П., Потапов В.К., Шабарова З.А. ДНК-подобные дуплексы с повторами. XI. Химический синтез фрагментов ДНК, содержащих в заданном положении фосфоамидную мсжнуклсотидную связь.// Рукопись представлена Моск. ун-том. Деп. в ВИНИТИ 25.10.83, N 1393.

12. Королева О.Н., Друца В.Л., Долинная Н.Г., Цытович A.B., Шабарова З.А ДНК—подобные дуплексы, содержащие повторы. VII. Химико-ферментативный синтез полимеров с фрагментами природных промоторов. // Молеку— ляр. биология. 1984. Т. 18. N 1. С. 146-160.

13. Громова Е.С., Виноградова М.Н., Елов A.A., Вейко В.П., Долинная Н.Г., Друца В.Л., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. ДНК-подобные дуплексы с повторами. VIII. Синтез и свойства фрагментов ДНК - субстратов эндонухлеазы рестрикции EcoRIl. II Молекуляр. биология. 1984. Т. 18. N 2. С. 370-381.

14. Долинная Н.Г., Королева О.Н., Пурмаль A.A., Друца В.Л. Химико—ферментативный и полностью химический синтез протяженных ДНК—дуплексов. //В кн. Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот. / Под ред. М.АПрокофьева. М.: МГУ. 1985. С. 121—130.

15. Грязнова О.И., Долинная Н.Г., Исагулянц М.Г., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Удалов Н.И., Соколова Н.И., Шабарова ЗА Синтез и изучение термической устойчивости олигодезоксирибонухлеотидных дуплексов со структурными аномалиями. // Биоорган, химия. 1986. Т. 12. N 1. С. 124-131.

16. Долинная Н.Г., Грязнова О.И., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. I. Химическое ли— гирование как метод введения фосфоамидных и пирофосфатных связей в ДНК-дуплексы. 1/ Биоорган.химия. 1986. Т. 12. N 6. С. 755-763.

17. Долинная Н.Г., Грязнова О.И., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. II. Введение точечных модификаций в сахарофосфатный остов ДНК. // Биоорган, химия. 1986. Т. 12. N 7. С. 921-928.

18. Долинная Н.Г., Пурмаль АА, Друца В.Л., Шабарова З.А. Синтез и свойства конкатенерпых ДНК—дуплексов с модифицированными межнуклео— тидными связями. /'/ Вест. Моск. у-та. Сер. 2. Химия. 1986. Т. 27. N 5. С. 520-524.

19. Соколова Н.И., Крынецкая Н.Ф., Суханова Л.Л., Долинная Н.Г., Шабарова З.А. Синтез и свойства динуклеозидфосфатов, содержащих арабино— и дезоксиксилонуклеозиды. // Биоорган, химия. 1987. Т. 13. N 3. С.

45

379-385.

20. Шабарова ЗА, Вейко В.П., Долинная Н.Г., Друца В.Л., Метелев В.Г., Орецкая Т.С.. Пурмаль А.А. Химические реакции в двуспиралъных нуклеиновых кислотах. III. Синтез концевых инвертированных повторов ISI—элемента. //Биоорган, химия. 1987. Т. 13. N 5. С. 628-642.

21. Цытович А.В., Орецкая Т.С., Долинная Н.Г., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Синтез. олигонуклеотидов, содержащих 3'—концевые нуклеозиды с обращенной конфигурацией сахара. // Химия природн. соедин. 1987. N 3. С. 421-425.

22. Соколова Н.И., Аширбекова Д.Т., Долинная Н.Г., Шабарова ЗА. Химические реакции в двуспиралъных нуклеиновых кислотах. 'IV-Бромциан — высокоэффективный реагент при конденсации олигодезоксирибонуклеотидов. // Биоорган, химия. 1987. Т. 13. N 9. С. 1286-1288.

23. Кузнецова С.А., Кубарева Е.А., Орецкая Т.С., Долинная Н.Г., Крынец— кая Н.Ф., Громова Е.С., Шабарова З.А., Цех Д. Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации. EcoRII с синтетическим фрагментом ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания. // Биополимеры и клетка. 1987. Т. 3. N 6. С. 283-289.

24. АС. N 1387384 (СССР). Соколова Н.И., Долинная Н.Г., Аширбекова Д.Т. Шабарова З.А. Способ получения двуспиралъных ДНК из олигодезоксирибонуклеотидов. Заявл. 3.06.86. N 4105383/31-13.

25. Цытович А.В., Долинная Н.Г., Шабарова З.А Т4—ДНК—лигаза: субстратные свойства синтетических ДНК—дуплексов со структурными аномалиями. // Молекуляр. биология. 1988. Т. 22. N 3. С. 690-699.

26. Sokolova N.I., Ashirbekova D.T., Dolinnaya N.G., Shabarova Z.A. Chemical reactions within DNA duplexes. Cyanogen bromide as an effective oligonucleotide coupling agent. // FEBS Letters. 1988. V. 232. N 1. P. 153-155.

27. Dolinnaya N.G., Sokolova N.I., Gryaznova O.I., Shabarova Z.A. Site-directed modification of DNA duplexes by chemical ligation. // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. N 9. P. 3721-3738.

28. Аширбекова Д.Т., Соколова Н.И., Долинная Н.Г., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиралъных нуклеиновых кислотах. VII. Сравнительная характеристика конденсации олигонуклеотидов под действием бром— циана и водорастворимого карбодиимида. J J Биоорган, химия. 1989. Т. 15. N 2. С. 166-174.

29. Долинная Н.Г., Аширбекова Д.Т., Соколова Н.И., Шабарова З.А Химические реакции в двуспиралъных нук\еиновых кислотах. VIII. Сборка гиб—

46

ридных РНК—ДНК—дуплексов с использованием водорастворимых конденсирующих агентов. // Биоорган, химия. 1989. Т. 15. N 10. С. 1346—1354.

30. Долинная Н.Г., Грязнова О.И. Комплексы олигс(поли)нуклеотидоз со структурными аномалиями (обзор). // Успехи химии. 1989. Т. LVIII. N 8. С. 1318-1353.

31. Sokolova N.I., Dolinnaya N.G., Krynetskaya N.F., Shabarova Z.A. Di-nucleoside phosphates containing arabinose or deoxyxylose. Hydrolysis by exonucleases and stacking properties. 11 Nucleosides and Nucleotides. 1990. V. 9. N 4. P. 515-531.

32. Герцюк M.H., Сергеев B.H., Цытович A.B., Долинная Н.Г., Кухарь В.П. Синтез и реакционная способность новых водорастворимых карбодиими— дов. // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. N 9. С. 1268-1276.

33. Долинная Н.Г., Цытович А.В., Сергеев В.Н., Герцюк М.Н., Шабарова ЗА Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. X. Кинетика конденсации олигомеров под действием синтетических водорастворимых карбодиимидов. // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. N 9. С. 1183—1194.

34. Долинная Н.Г., Цытович А.В., Тевосян С.Г., Сергеев В.Н., Шабзрова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. XI. Взаимосвязь между кинетическими параметрами химического лигирования в модифицированных ДНК—дуплексах и структурой реакционного узла. // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. N 9. С. 1195-1209.

35. Меренкова И.Н., Романова Е.А., Соколова Н.И., Долинная Н.Г., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Получение ДНК—дуплексов, содержащих 2'—дезокси—2'—фторуридин и арабинозилурацил. // Химия природн. со— един. 1991. N 2. С. 263-267.

36. Dolinnaya N.G., Sokolova N.I., Ashirbekova D.T., Shabarova Z.A. The use of BrCN for assembling modified DNA duplexes and DNA-RNA hybrids; comparison with water-soluble carbodiimide. // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. N 11. P. 3067-3072.

37. Dolinnaya N.G., Tsytovich A.V., Sergeev V.N., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A. Structural and kinetic aspects of chemical reactions in DNA duplexes. Information on DNA local structure obtained from chemical ligation data. // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. N 11. P. 3073-3080.

38. Shabarova Z.A., Dolinnaya N.G., Sokolova N.l. DNA duplexes with pyrophosphate, phosphoamide and phosphoricdiester bonds between ribo-and deoxyribonucleotide units. // In Nucleic acid chemistry. Improved and new synthetic procedures, methods and techniques. PT 4. Eds.

47

L.B.Townsend and RS.Tipson. J. Wiley and Sons. Inc. 1991. P. 348353.

39. Dolinnaya N.G., Pyatrauskene O.V., Shabarova Z.A. Probing DNA triple helix structure by chemical ligation. // FEBS Letters. 1991. V. 284. N 2. P. 232-234.

40. Меренкова И.Н., Долинная Н.Г., Орецкая T.C., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. XIV. Эффективность образования фосфодиэфирных связей между различными нуклеотидными звеньями. П Биоорган, химия. 1992. Т. 18. N 1. С. 85-

41. Орецкая Т.С., Долинная Н.Г., Меренкова И.Н., Крынецкая Н.Ф., Романова Е.А., Волков Е.М., Блюменфельд М., Вассер М., Шабарова З.А. Синтез циклических олигодезоксирибонуклеотидов с ненуклеотидными вставками. // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. N 1, в печати.

42. Dolinnaya N.G., Blumenfeld М., Merenkova I.N., Oretskaya N.S., Kry-netskaya N.F., Ivanovskaya M.G., Vasseur M., Shabarova Z.A. Oligonucleotide circularization by template-directed chemical ligation. // Nucleic Acids Res. 1993, in press.

91.