Синтез и изучение поведения в энзиматических реакциях Р-модифицированных фрагментов ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



российская академия наук ордена трудового красного знамеш институт биоорганической химии им м.М.шемякина

На правах рукописи

ШИБАНОВА Елена Витальевна

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ПОВЕДЕНИЯ В' ЭНЗИМАТИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ РАТИФИЦИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК:

02.00.10 - Биоорганкческая химия, хиккя природных и физиологически активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте бисоргашческой химии им.Н.М.Шемякина РАН

Научный руководитель -кандидат химических, наук В.Н.Добрынин

Официальные оппоненты -доктор химических нэук В.К.Потапов

кандидат химических наук В.Д.Сиирнсв

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии РАН.

¿7 .л .

Заидата состоится ЛЩ'-есС-Х' 1992 г. в ■ю час.

на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии и?,1.М.М.Шемякина РАН по адресу: 117871, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина РАН

(9

Автореферат разослан ' ^ 1932 г.

Ученый секретарь Специализированного совета ИБХ нм.М.М.ИеыккиЕа РАН

кандидат химических наук В.А.Несмеянов

___

McH.I

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

t Актуальность, проблемы. Совргьэннив истода химического 'скнтеза позволяли получать аналога нуклеияоЕих кислот, у которых могут быть направленно исмвнет« ра&гкиге участки молекул!: гетероциклические основания, сахарное остатки или фосфатные группы. Соединения с не природными меннуклеотидными фосфатами ( Р-чодифйщрсванные олигонухлеотяди ) - в которых один из песзязавеккшх атомов кислорода заменой ка атом серы, мзтильнуя, 0- или N-алкильную группы, облагают рядом интересных свойств.

Исследования показали, что Р-кодЕфнцарованные ■ аналоги ну:сле:гновых'- кислот • не утрачивают способности образовывать комллексы с комплементарными нуклеотидными последовательностями и приобретают устойчивость к расщеплению клеточными эн-до- и зкзонуклеазами. В результате устранения' отрицательных зарядов в сахаро-фссфатном остове в большинстве случаев облегчается преодоление липидеого барьера плазматической клеточной мембраны. Эти'свойства позволяют надеяться, что модифицированные по фосфатам аналоги нуклеиновых кислот, станут в будущем терапевтическими средствами нового поколения, воздействующими на ход клеточных событий путем антпемкеловой гибридизации с комплементарными РНК и ДНК.

' Аналоги олигонуклеотидов с модифицированными фосфатами . обладают ег,е одним интересным свойством. Астаметричноз замещение атома фосфора создает новый центр хиральности. При формировании • двухцепочечных комплементарных, комплексов заместитель, модифицирующий мешуклеотидннй фосфат, в зависимости от конфигурации последнего оказывается ориентированным либо в сторону глазной бороздки двойной спирали, либо наружу от сахаро-фосфзтного остова. Зто свойство используется при' '.исследовании геометрических и стерэохимич-зских параметров нуклеиново-белковых взаимодействий.

.Характер взаимодействия Р-модифицировззннх. олигонуклео--- тидов с клеточными ферментами 1л vivo до конца не выяснен, в связи с этим актуальной задачей является исследование субстратных свойств аналогов нуклеиновых кислот в модельных системах ln vltro. Кроме того, представляет интерес сведения о

- г -

том, какие сграяачения может накладывать модифяцнровэяннй

мешуклеотидный фосфат на протекание энзиматических реакций, широко используемо: при манипуляции 2 фрагмента:®! ДКК в гэн-но-инкэкерноа практике.

Изучению поведения амидофэсфапшг к теофосфатанх аналогов ДНК з реакциях, связанных с зкзимакгчвским синтеза?,; и расщеплением нуклеиновых кислот, посвящена настоящая работа, выполненная в груше химии генов ИЗХ жиМ.М. Шемякина РАК.

Нэль работы. На синтетических Р-шлифицирозаннах фрагментах ДНК

-исследовать влияние характера модификации, относительного расположения а стереохимии модафицированной кькнуклео-тидной группы на возможность протекания энзкметичзского ли-гирования;

-исследовать стероохимическке особенности Р-модефициро-ванной матрицы при копировании ее ДНК-поламэрэзой;

-исследовать взаимодействие двухцепочечшх ДНК, содер-иагщх агладофосфатвые связки, с эндонуклеазами рестрикции.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Химико-энзяматаяеским способом определены абсолютные конфигурации щжлогексиламидофосфатшгх аналогов олигояуклэо-тидов на основе корреляции с дапуклеозидтиофосфатанш конфигурационными стандартам:. Бпервне показано, что Т4 ДНК-лигаза различает Кр- и Бр- конфигурации амидофэсфатной группы, используя при этом в сшивке лишь тот стереомер. у которого модифицируема заместитель ориентирован в главку» бороздку двойной спирали.

На основе различного поведения Кр- и Бр- дизстереомэров в лигазной реакций предложен способ определения неизвестной абсолютной конфигурации практически любах езеошшх аналогов ДНК.

Впервые показано, что, используя прохиральнуя б'-тяофо- . сфатную группу, Т4 ДНН-дигаза создает малскуалеоткднуи тиофо-сфатную связь с Ир- конфигурацией.

Исследования матричных свойств амвдофосфатшх аналогов показали, что кешяная. модификация меяаукдеотидкой связи в случае Эр- стереозра замедляет, а б случае изомера препятствует образованию полноразмерного продукта достройки.

Апробация работа. Результаты исслздсезний были представлен; из международном симпозиуме "Синтетические олигонукле-откды: проблемы и перспект:ша практического применения" (Москва, ■I9SI г.).

СОДЕРЖАНКЕ РАБОТЫ 1. С-интзз Рчлодифидкрозаших слигодозскгсопбонуклзоткдов

Выполнение работы базировалось на ^^пользовании Р-ко-лйЗзшнрозазвых адьтодезоксирибонуклесхядсз с заранее заданна« распгшязкйв.« дадафщарованного мзану2Ж>отЕ£Кого фосфата. Это обусловило разработку синтетичоского подхода для получения различных олигонуклеотидов с демриазфОЕЗнакм размещением аетдофосфатных или тиофосфатэж модифицированных ^жуклеотдагк групп. Такой синтетический подход основывался на комОикашз: фосфитакиднсго и Н-фосфскптиого методов построения олигонуклеотадаой цени (рисл). Бее использовавшиеся в работе амщгофос£|атше производные опгонуклеотвдов были юхучевн твзрдюфазкшл способом путем нзращшзанкя цс-пи от 3*-конце фосфатемэддом методом вплоть до :кста, где планировалось создать модифицированную связь. Дзлзе посредство;/! Н-фзефонатной кокдзпеащш создавалась гцдро^осфорильная дкзфк-рзгя мег.:нуклеотвдная связь, которая в результате окислительного зчидирования соответствующим smkeom в.условиях реакции Атертона - Тодда ггаэвращалась в гюрЯолидсфосфатпую, цикло-гексиламидофосфатную или е-аминогексилагадофосфатнув. В последнем случае е-амикогруппа модифицированного мегкнуклеотид-ного фосфата перед продолжением наращивания олигонуклеотид-ной цепи блохагровалась реакцией с йпэей. Завершалось по-_стрсеш:з олегонуклеотидной цепи, как прегсхло, фоейиташдным кзтсдсм. Из;с;дэчеш?е составила блоки, содержащие амидофосфат-нуга группу мозззу первда ч вторни ( считая от 5'-конца ) звенья:.?!. .Поскольку при такой локнлнзащш модифицированного звена 5нзи.:атичэс1;ое фоссЪрглтаовзкие не гакзт бить реализовано, мн прдбеглп к химическим методам вездзеия 5'-концевой фосфатной группы путем коядепсацгк с п-ннхрофэнклэтил-Н-фос-фонгтом, окисления и элиминирования п-нитрастирола.

СНТг

а о

-) ОИТгО,

-0-1-Ч 1 0«.

( \ 'Ь

ок.

БНТ

¡Ьи Ьг ^

с ~ А о в' о II

а'

ок.

I Ьи Ьх

I

1 ° 1 ° Т 0 £1

в' о е

I Ьи

(44-14*

о II

-р—о.

оя.

В О в 0

ок,.

1 1(5)

АЬ= Ф О в'

0(?± ■ -

•Г-

Д ф о 0

ок.

о II

и | и 1 и и

К2 " • о

в

Рис.1. Схема синтеза олигонуклеотидов с амидофосфатными грушами. 1. наращивание, цепи амидофосфитным методом; 2. ШЕг1ЬгС(О)РН(О)0~КдИ+ > Ви*С0С1; 3. СС1Л, Ру, Е^Й, цикло-

гексиламин, морфолин или 1,6-диаминогексан ( е-аминогруппу блокировали в условиях 4 ); 4. Гпюсй, Ру, Н-Ме1т; если т=0, то 5'-фосфатную группу вводали в условиях 5; 5. 1102СеН4(СНг )г0РН(0)СГ Еу^, Вц*С0С1, Ь, + ^О/Ру; 6. Шз или + ВВЦ; й, = -С^ или -СН, СН, ОТ; В, = -1Щ Ц1 ,

-М(С2Н4)г0 или -ИН(СН2)6Ш2; Я3= БМТг- или, если гп=0, Ш2С6Н4(СН2)2аР(0)0-; 1?4= Н или Р032~;

Олитонуклеотида, содержащие межнуклеотидные тиофосфат-ные группы, синтезировали исключительно фосфитамидным способом. Тиофосфатные группы создавались посредством окисления мекнуклеотидного фосфиттриэфира серой в безводном пиридине.

Параллельно с синтезом Р-модифицированных олигонуклеотидов выполнялся синтез немодифицированннх соединений с той же нуклеотидной последовательностью. Наличие немодифицированннх соединений всегда помогало ориентироваться при выделении аналогоз, и, кроме того, немодифицврованные олигомеры играли роль контрольных образцов' при оценке поведения Р-модифицированных блоков в энзиматических реакциях.

Выделение Р-модифицированных олигонуклеотидов осуществляли посредством обращенн'о-фазовой ВЭЖХ. либо электрофореза в ПААГ. Амидированные олитонуклеотида имеют больше времена удерживания в условиях обращенно-фазовоЯ ВЭЖХ и меньшую электрофоретическую подвижность по сравнению с немодифициро-ванныш олигомерами того ке состава.

В результате появления дополнительного хирального центра Р-модифицированные олитонуклеотида представляют собой смесь диастереомеров, различающихся пространственной ориентацией модифицирующего заместителя относительно атсма фосфора. Ставя перед собой задачу проследить влияние абсолютной конфигурации модифицированного фосфата на результат энзиматических реакций, мы стремились получить каидый из стерео-мерных олигонуклеотидов в индивидуальном гаде. В большинстве случаев разделение на диастереомеры достигалось после 5'-деблокирования. Были подобраны условия для выделения сте-рэомеров в индивидуальном виде. В зависимости от порядка элюции с колонки они были маркированы как I (быстрый) и б (медленный). Эффективность разделения Р-модифицированных

олигонуклеотидов на диастереомеры зависела от двух факторов: характера заместителя ( тио- или амидо- ) и его расположения по отношению к 5*- или 3'-концу.-Наличие объемного амидного заместителя значительно облегчало разделение на даастереомеры по сравнению с изоионными тиофосфатнши аналогами. Как правило, с удаленьем модифицированной ыеануклеотидной связки от 5'- или 3'-конца олигонуклеотида разделение затруднялось.

2. Энзиматачэское лигировашэ олигонуклеотидов, содериацих'кежнуклеотиднне амидофосфатннэ или тиофосфатные связи

При изучении поведения Р-кодифицированных олигодвзокси-рибонуклэотадов в реакции энзиыатического лигпрования была поставлена цель ваяснить влияние следующих факторов на результат реакции:

- расположение единичного модифицированного фосфата относительно З'-гадроксилъной или 5'-фосфатной групп, участвующих в образовании новой мегпуклеотидной связи;

- характер модифицирующего заместителя. Исследовалась субстратная специфичность олигонуклеотидов, содержащих замену мекнуклеотидной фосфатной группы на амидофосфатную ( ыор-фолидо-, циклогексиламидо- или е-ашногексилашдрфосфатную ) или тиофосфатную в определенном положении цепи. Тяофосфаты сохраняют изоиоквнй характер межнуклеотидной группы,' амидо-фосфаты устраняют отрицательней заряд, превращая мекнуклео-тидную связь в негонную, либо в положительно заряженную ( в случае производных диамина ).

- абсолютная конфигурация при атоме фосфора в модифицированной межнуклеотидной связке и, следовательно, относительная ориентация заместителя по отношению к двойной спирали ДНК.

Для решения данной задачи был синтезирован набор Р-мо-дкфицированных и шмодафицированных олигонуклеотидов, составляющих модельнув двухцепочечную ДНК с сайтами эндонуклеаз lokl и EcoHI (рис-ZA). При этом было предусмотрено несколько вариантов располозвния модифицированного звена как в фосфатном, так и в гидроксильном кошонентах, участвующих в лигаз-

А.

Fokl EcdBI

la, Ib, Ic R

5't- (t)5-g-g-a-t-g-t-t-t-t-t-t-c-c-g*a-a-t-t-c-c-t-t-t-t-t

3' a- (a) 5-c-c-t-a-c-a-a-a-a-a-a-g-g-c-t-t-ft-;arg-g-a-a-a-a-a

lia, Ilb, lio *

Б.

III _ I7a,I7c

Г\

s:t-(t)3-g-g-fa-t-c-t-t-t-t-t-t-c-c g-í-a-a-v-t-c-c-t-t-t-t-t

У tta,YIb,VIc

5'г-(t)5-g-g-a-t-g-t-t-t-t-t-t-c c-gja-a-t-t-c-c-t-t-t-t-t

VII • r Villa,VIIIc

Fv

5 ' t- (r) 5-g-g-a-t-g-t-t-t-t-t-t c-c-g-'-a-a-t-t-c-c-t-t-t-t-t

IX la,Ib,xa

3' A- (A)-5-C-C-T-A-c-A-A"A-A-a-A-G-G-c-T-T-A ajS-G-a-a-a-a-a

R

XI Ша, Xllb, XII с, Xlld

3' A-(A)^-c-C-T-A-C-a-A-A-A-a-A-g-G-c-t-t a-ajg-g-a-a-a-a-a

R

XIII XIYa, X'Wd , XIV с

3' A- (A) 5-f;-c-t-A-C-a-A-A-A-a-a-G-G-c-T v-a-ajg-G-a-a-a-a-a

Fue.2. Строение Р-шдзфщировгшных олитснуклеотидов- А. -шдгфэдкрагашгеЯ 31-шранЯ дуплекс с сайтгмк узнавания Рсй1 л EcoKL; Б. - ргзбизка верхней и гапией цепей на блоки, ис-сдедоЕзнггае в качестве субстрзтоз для Т4 ЛЕК-литгзы.. Соединения. содержащие в качестве заместитетл (R) морфолидаую 'группу, обозначены буквой "а", =-гг.ашогекгаламиднуп - буквой "'Ь^цжлот-екснлвгддаую - буквой "с", тясфосфатные аналоги (R=S) буквой "й".

ных реакциях (рис.2Б).

ДНК-лигаза бактериофага Т4 катализирует при участии АТР образование мекнуклеотидной связи между 5'-фосфатной группой одного компонента и З'-гидроксильной группой другого компонента, когда они оба правильно расположены друг относительно друга на комплементарной матрице. В связи с этим соединения, которым отводилась роль фосфатных компонентов в лигазных реакциях, а именно (IX), (XI), (XIII), а такжь индивидуальные диастереомеры соединений (Vla-c) и (VIIIa,c), были подверг- . нуты ферментативному 5*-фосфорилированшо. Подобным образом были фосфоршшрованы и немодифицированные олигонуклеотиды, служащие контрольными образцами. Фосфоршшрованные производные соединений (IVa,c) были получены химическим путем ( см. выше ).

Для исследования поведения Р-модифицированных аналогов ДНК в реакции, катализируемой Т4 ДНК-лигазой, использовался прием лигирования по цепям: в сшивке участвуют фосфатный и гидроксильный компоненты лишь одной цепи, компоненты противоположной цепи не фосфоршшрованы и выполняют роль комплементарных подложек. Это дает возможность отделить продукт сшивки от не вступивших в реакцию олигонуклеотидов и вспомогательных подложек посредством электрофореза в ПААГ. Результаты этих реакций оценивались в непосредственном сопоставлении с результатами сшивки немодифицированных олигомеров на тех же олигонуклеотидных подложках.

Модификация межнуклеотидных связей, непосредственно примыкающих к 5'-фосфатной или З'-гидроксильной грушам, участвующим в образовании новой мекнуклеотидной связи, выявила зависимость результата лигазной реакции от характера модафщирунцего заместителя.

Xa.Xb II III pIYa,c

R R

5'N...N-N^N pN-N.. .N 3" 5'N...N-N pN^N-N..-N 3'

( Здесь л далее при схематическом изображении вариантов ли-шрования компоненты, составляющие комплементарную подложку, опущены. )

Олигонуклеотиды (р1Уа,о) и (Ха,Ь) с незаряженными ами-дофосфатными грушами, примыкающими к месту сшивки, не являются субстратами для Т4 ДНК-лигазы, независимо от абсолютной конфигурации при атоме фосфора.

Замена в соединении (X) неионной амидофосфатной группы на тиофосфатную позволяет стереомерам (XI)'участвовать в ли-гировании. Можно предположить, что для фермента, катализирующего образование новой фосфодиэфирной связи, существенным является ионный' характер связей, примыкающих к 5'- и З'-концам. В этом отношении Т4 ДНК-лигаза, по-видимому, имеет сходство с Т4 цолинуклеотидкиназой, дата которой необходима ионизованная связь, примыкающая к 5'-гидроксильной группе.

Когда место модификации удалено на одно звено от 3'-

Ша-й XI 7 У1а-о

к к

5'рН-Н..^ 3' 5'М...Н-М рН-гДм-М. - .Ы 3"

к

3' Н'М.-.Ы-М-М-М^М-М.-.М 3'

На-й . 1а-с

или 5*-конца, то модифицированные фосфатный и гидроксильный компоненты сшивкк, соответственно (У1а-с) и (ХИа-й), ведут себя 'в реакции по-разному. Оба изомера акидировэнных соединений У1(а-с), выполняющих роль фосфатного компонента, независимо от характера заместителя, вовлекаются в экзиматичес-кое лигирование. Когда же место модификации в гидроксильном компоненте удалено на одно звено от 3'-конца, в лигазной сшивке•с (рХ1) способен участвовать лишь один из стереокер-'ннх морфэлидянх производных (ХНа) с- меньшей хроматографи-ческой подвижностью. Стереомер с большей хроматографяческой подвезностбв в тех же условиях сказался не способным сшиваться. Подобным кэ образом ведут себя в лигазной реакции цкклогексилачиднке и е-амшогвксиламддные аналоги. Таким образом, данное, положение модифицированного фосфата как в

фосфатном, так и е гидроксильном компонентах не является "запрещенным" для проведения .цитирования, хотя в последнем случае Т4 ДНК-лигаза "различает" абсолютную конфигурацию амидофосфатной группы.

Когда амидофосфатная груша отделена от 3'- или 5'-конца двумя немоди^гщированными фосфатами, то такие олигонук-леотиды являются субстратами в энзиматической реакции, независимо от характера заместителя и абсолютной конфигурации.

Ша-с XIII VII Villa, с

R R

5'N...N-N^N-N-N pN-N...N 3' 5'N...N-N pN-N-NVN. . .N V

i I'

R R 5" N___N-M-IN-N-N-H---N 3" 5" N---N-N-N-N^N-N___N 3'

Ila-c la,с

Отделение амидофосфатной группы одним немодифицирован-ным звеном от 3'-конца выявило зависимость результата энзи-матичзской реакции от конфигурации хирального атома фосфора. Что же препятствует дотированию - оккупирование амидным заместителем главной бороздки ДНК или его направленность в солъватный объем, иэруку от сахаро-фосфатного остова? Чтобы ответить на этот вопрос необходимо было приписать конфигурации стереомерным соединениям, отлкчащимся временами удерживания в условиях обращешо-фазовой хроматографии. К, моменту получешм наших результатов в литературе не было сведений об абсолютной конфигурации эмидофосфатшх аналогов ДНК. поэтому необходимо было разработать метод для ее определения. Стратегия отнесения абсолютной конфигурации амидофосфаяйк оли-гонуклеотадов сводилась к энзиматической деградации их до негидролизуемых димерыых блоков и отнесению неизвестной конфигурации амвдофос&атов к известной конфигурации ткофосфстов на основе химических превращений, протекающих с известной стереоспецифичность». В основе своей этот подход имеет сходство с подходом, шааменяЕпшмся ранее при изучении стереохимии фосфотриэфирншс аналогов ДНК.

Индивидуальные циклогексиламидные 9-меры (ХПс-П и (XIIс-з) были гидролизованы по немодифицированным межнуклео-тидннм фосфатным связям с помощью фосфодаэстеразы змеиного яда (БУРБЕ) и щелочной фосфатазы (ВАР) и соответственно образовавшиеся амидированные динуклеозидфэсфаты (XVIIс-з) и (ХУПс-Г) были отделены хроматографически от монсмерных про-' дуктов (рис.4).

Для корреляции абсолютной конфигурации тио- и амидофос-фатов были использованы полностью защищенные циклогексилеми-' дотиофосфатные блоки (ХУс-Г) и (ХУс-з). Дяастереомеры (ХУс) были получены в растворе обработкой циклогексиламшюм динук-лэсзкдтиофосфатов, активированных ГХЗКТ и П-метилимидазолом, с последующим разделением обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис.3).

ОНТгО,

¡Ьи Е О д

II

-О-Р-О. I \

н

Ьг

N

¡Ьи С з Д

Ь2

—ОАс

-> ОНТгО,

Ч

I!

—О—Р—Оч

I N

0"руН*

2,3 -ОДс ->

I Ьи

Ьз:

2,3

-> ОИТгО,

N

II

—О—Р—о I \ ННСвН^

—ОАс

(17с-/;, ("ХУс-з;

Рис.3. Схема синтеза циклогексиламидотиофосфатов (ХУс). 1. Бд/?у; 2. МБИТ +.Ме1га; 3. циклогекскламин

Каждое из этих соединений было подвергнуто ряду превращений (рис.4). С одной стороны, из соединения (ХУс-Г) путем его деблогафовшшя и последующей десульфурнзащш с помощью 3% Н202 получена агядарованная двойка (ХУПс-±), а из блока с меньшей хрсматографической годвихностьп (ХУс-э) тем же путем ■получено соединение (ХУПс-з). С другой стороны, диастерео-мерк (ХУс-Г) и (ХУс-з) Сил:! оСргботакн кзоаьилнитрптом в сред? уксусная кислота - Кфидия. Продуты превращений стере-омерных ншслогексилзждотиофосфатоБ идентщицирсвались путем

"cyO-dG sr \>-dA

Rp*-cm-f)

1 .2

íyO-dG

~ar \j-dA Sp*-(XVI-a)

í

1 ,2

RHNy jO-dG1 buC DMT г Э S^O-dA^CAcJ

Ep-:(H-3)

2,3

X-dGlbuCDMTr> -dAbzCAc3 . Sp-(XV-f)

2,3

RHN^ J3-dG

l/xi-dA Rp**-(XVIIc-s)

NHf?

aaaaagg f-p-) aa II O

CyO-dG RHfT Sj-dA

sp**-(mic-f)

O

r 11 -л aaaaagg [-p-j aa

NHR

Rp (Xllc-f)

Sp (XIIC-S)

Рис.4. Схема про гранений, с помощью которых осуществлена корреляция абсолютной конфигурации тиофосфатов (XVI) и цик-логексиламидофосфатов (XVII). 1. IC^H^NOg + - АсОН/Ру; 2. Ш3, затем Н+; 3. £,0,,; 4. SYPDE + ВАР; R=C6Hn; * - Р(0"; 0-СН2(5'); О-СН(З'); S) - возрастаний порядок расположения заместителей у хирального атома фосфора в тиофос-фатах;

** - PCNHR; 0=; О-С^б'); О-СН(З')) - возрастающий, порядок расположения зам&статалей у хирального атома фосфора-в ами-дофосфатах.

совместной элюции с индивидуальными образцами диастереомеров тио- или амидофосфэтов, полученными прямым синтезом и последующим хроматографическим разделением. ВЭЯХ-анализ показал, что с выходом 30% произошло превращение. (ХУс-Г) в соединение, дагацее после деблокирования индивидуальный тиофосфат (Х71-а). Аналогично из блока с меньшей хроматографической подвижностью (Х7с-б) было получено соединение (ХУ1-Г). Соотношение ' мевду абсолютными конфигурациями дануклеозидтиофос-~ фатов и их хроматографическими подвижностями известно. С учетом того, что обе реакции, и дезаминирования, и десульфу-'ризации, протекают с сохранением конфигурации при атомэ фосфора, сделано отнесение неизвестной конфигурации амидофосфэтов. к известной конфигурации тиофосфатов. На этом основании Э-мэру (ХПс-Г) с большей хроматографической подвижностью приписана Нр-конфигурация, а стереомеру с меньшей подвижностью - Бр-конфигурация. ' •

Выполненние стереохимические отнесения позволили однозначно трактовать те случаи, когда один из стереомеров вовлекался в лигазнув реакцшо, а другой - нет. Мы пришли к заключению, что лигазная реакция протекает с Бр-стэреомером ( его модифицирующий заместитель ориентирован в сторону главной бороздки дуплекса ). Направленный наружу от двойной спирали амидный заместитель ( стереомер с Нр-конфигураци-ей ) вероятно, создает пространственные затруднения в налаживании контакта между ферментом и дуплексом.

Одинаковым образом ведут себя в лигазной реакции все исследованные амвдофосфатные аналоги 9-меров (XII), независимо от характера амидного заместителя,. - только один из стереомеров в каждом случае служит субстратом для Т4 ДНК-лигазы. Сходство их поведения в реакции энзиматического ли-гирования дало основание приписать абсолютные конфигурации стереомерным фосфоморфолидам и е-аминогексиламидофосфатам, не прибегая каздый раз к химическим превращениям. Исчерпывающий гидролиз'" ЗТРБЕ и ВАР продуктов лигазной реакции с участием смеси диастереомерных олигонуклеотидов (Х11а) или (ХГО>) пдаво^ыл- получить эталонные динуклеозидамидофосфаты Зр-конфш^вщш, а паре вар не вслнэдиих в реакцию компонентов - соответствующее амидсфосйаты Ир-конфигурации (табл.).

соединение димерный .продукт энзиматиче ского-гидролиза (SVPDE + ВАР) время удерживания в условиях ВЭЖХ * мин

XIIa(I,s)+XI=IIa XVIIa (Sp) 42,3

ОН-компонент, не mía (Rp) 42,8

вступизш. в реакцию

XIIb(f,s)+XI=IIb XVIIb (Sp) 32,5

ОН-компонент, не XYIIb (Rp) 31,0

вступивш. в реакцию -

XHc(í,s)+XI=IIc XYIIc (Sp) 45,0 •

ОН-компонент, ке XVIIc (Rp) 45,5

вступивш. в реакцию

Таблица. Абсолютные конфигурации и хроматографическая подвижность стареомарных динуклеозидамидофосфатоз G(0)(R)A, R= -М(С2Нд)20(а), -Ш(СН2)6Ш2(Ъ), -KHCgH^íc): . * - колонка Ultrasphere ODS(4-16*250 мм), градиент ацетонит рила от 0 до 10% за 25 мш, затем от 10 до ЗОЯ за 20 мин в ОДМ ТЕААс(рН 7,0) при скорости потока I мл/мин.

Следует отметить, что исчерпывающий .гидролиз е-амино-гексиламкдшх производных до негидролизуемых димерных блоков затруднен по сравнению с морфолидными и циклогзксиламидными аналогаш и требует для полного прохождения увеличения Бремени инкубации и количества фосфодизстеразы. Это связано, по-видимому, с положительным зарядом модифицированного мэж-нуклеотидного звена.

На оснозавыи ферментативного расщепления остальных F-аудированных олигонуклеотидоЕ, результатов БЗИЖ-анзлкза продуктов расщепления и- сопоставления их хромнтографкчоских характеристик с характеристиками эталонных двоек были найдены 'корреляции мекду абсолютной конфигурацией и хроыатогпафи-

ческой подвижностью в ряду амидофосфатных аналогов ДНК: Ир-амидофосфатные аналоги олигонуклеотидов обладают меньшим временем удерживания в сравнении с Зр-стереомерами.

Способность Т4 .ДНК-лигазы "различать" пространственную ориентацию модифицирующего заместителя в гидроксильном компоненте независимо от его химической природа позволяет распространить наш подход к определении абсолютной конфигурации амидофосфатов на другие аналоги ДНК с объемными модифицирующими заместителям:! при атоме .фосфора, например, алкилфосфо-натные, фосфотриефпрные.

В отличие от гмидированшх олигонуклеотидов (Ж1а-с), оба стереомера тиофосфатного Э-мера (ХГМ) являются субстратам! для Т4 ДНК-лигазы.

3. Знзиматическое лигированиэ аналогов ДНК, содержащих 5'-тиофосфатную группу

Отдельное внимание было уделено исследованию стереона-празленного действия Т4 ДНК-лигазы в ходе образования мехну-клэотидной сзязи. Удобной моделью для этого служат олигону-клеотида, содержащие 5'-тиофосфатнуа группу, которая, сохраняя ионный характер оксофосфзта, является прохиральной.

Из литературных данных было известно, что Т4 ДНК-лигаза способна попользовать в качество субстратов 5'-тйсфэсфэри~ лирозагаше олтагонуклеотидз. В задачу нашего исследования входило 1 ) установить! является ли образующаяся мзжнуклео-тидная связь тиофосфатной я, если реакция действительно приводит к образованию нового хиралкного центра, то 2) установить его конфигурацию.

ь'л использовали модель, состоящую из трех слзгонуклзо-твдоз: соединениям (XVIII) 'л (ХЕХэ) отведана роль сливаемых компонентов в лптазной реакции, а соединению (XX) - роль комплементарной «азряцн. Место датирования было запланирова-ео мзяду звеньями ей и р(Б)(1А с тем условием, чтобы мокно было выявить конфигураций образующегося межпуклеотядяога ЗЕена путем сопоставления с Нр- и Зр- дануклеозидмонотиофос-фатагш <1((Зр(3)А), испо.'ьзовапннми нами ранее в качестве эталонов с известной абсолютной конфигурацией ( см. выше ).

X

II _

НО-Р-О

XVIII -„„¿. ПХа.Ъ I I

Т-Т-Т-С-С-Т-С-Т-Т-С А-А-Т-Т-С-С-Т-Т-С

XX

Т-Т-Т-С-С-Т-С-Т-Т-Ср (X )Д-А-Т-Т-С-С-Г-Т-С

а: 1=5; Ъ: Х=0

Олигонуклеотиды (XVIII) - (XX) были синтезированы ами-дофосфитным методом из цианзтиловых синтонов. При синтезе соединения (Х1Ха) тиофосфатную группу вводит по завершении всех синтетических циклов по следующей схеме: еще но снятый с носителя 8-мер превратили в 5'-концевой Н-фосфонат, который подвергли силилировакшо и последующему окислению серой в .абсолютном пиридине. После отделения от твердой фазы и К,Р--деблокирования тиофосфат (Х1Ха) выделили' с помощью денатурирующего гель-электрофореза с последующей очисткой обращен-.но-фазовой ВЭЖХ. Параллельно с соединением (Х1Ха) был синтезирован 5'-фосфатный 8-мер (ХШ>) путем химического фосфори-лирования. Продукты лигазных реакций', (Х?Ш+Х1Ха=ХХ1а) и (Хтаи+Х1ХЬ=ХХ1Ь)1 были выделены электрофорезом в денатурирующих условиях, гомогенность каждого из'щ£ анализировалась обращенно-фазовой ВЭ8Х. Было установлено, что цроду^ст лигаз-ной реакции с участием тиофэсфата (ХИа) содержал главнае и минорный компоненты в соотношении, близком-6:1, призам-ки-. корный компонент обладал большей хршатогргфкческой: подвижностью, идентичной квалифицированному 18-меру (ХХ1Ь).

Каждый из выделенных продуктов легирования был подвергнут энзиматическому расщеплению (БУ?БЕ+ВА?), а продукты расщепления, в-свою очередь, - анализу ЕЭйХ. Результаты проведенного анализа, для немодафицированног-о соединения

(ХХ1Ъ) и минорного продукта оказались одинаковыми, - в обоих случаях соотношение <1С:<Ю:с1&:сД? было близко к 6:1:1:10. При хроматографическом анализе компонентов гидролизата главного продукта лигиров'ания (Х7Ш+Х1Ха) был выявлен негидролизо-ванный динуклеозидтиофосфат й(Ср(Б)А) с временем удерживания на колонке, точно совпадающим с временем удерживания для йр-стереомера. Кроме него обнаружены в незначительных количествах йС -и р (Б )<1А, а также йС и сИ ( последние в соотношении 3:1 ). Динуклеозидтиофосфата с Бр-конфигурацией среди продуктов гидролиза обнаружено не было. Известно, что расщепление БУРИЕ тиофосфатной двойки с йр-конфигурашей сильно замедлено в сравнении с ее оксоаналогом, тогда как Бр-стерео-мер проявляет абсолютную устойчивость в отношении БУРБЕ. Действительно, более продолжительные условия ферментативного гидролиза соединения (ХХ1а) привели к исчезновению динуклеозидтиофосфата и возрастанию количества йС и р(5)4А. Нуклео-тидная последовательность соединения (ХХ1а) была подвервдена секвенированием по методу химической модификации.

Из результатов анализа соединения (ХНа) следует, что Т4 ДКК-лигаза, вовлекая в сшивку прохиральную 5'- тиофосфат-ную группу, стереонаправленно ■ создает межнуклеотидную тио-фосфатнута связь с Ир-конфигурацией. Однако образование двух продуктов лигазной реакции, (ХХ1а) и (ХХ1Ь), не давало оснований для заключения об однозначности протекания активации 5*-тиофосфатной группы в активном центре Т4 ДНК-лигазы. Причины появления ^модифицированного 18-мера в условиях нашего .эксперимента могли быть обусловлены как присутствием в препарате 5'-тиофосфата (ХПСа) примеси б'-оксофосфата (Хт>), так и образованием разных по структуре АМР-тиофосфатов на ферментативной стадии, (XXII) и (XXIII), способных давать с З'-ОН-группой гидроксильного компонента тиофосфатное и оксо-фосфатное соединения (Х1Ха) и (Х1ХЬ), соответственно.

о э XXII

гА(5' ) -0-Р-0-Р-0-(5' )<*(ДАТТССТТС)

о о

О О ШП

гД (5" ) -0-Р-3-Р-0- (5' ) Ы (АДТТССТ ТС)

I- I-О О

Для того, чтобы исключить первую причину, препарат 5'-тиофосфата (Х1Ха) был подвергнут обработке ВАР, поскольку этот фермент гидролизует лишь моноэфиры фосфорной кислоты, е то время как мокоэфир тиофосфорной кислоты устойчш к его действию. Было установлено, что лигазная реакция с олигонук-леотид 5.'-тиофосфатом- предварительно обработанным ВАР, протекает исключительно с образованием соэданения (ХХ1а)к и, следовательно, никаких превращений, связанных с утрачиванием атома серы, Т4 ДНК-лигаза с 5'-тиофосфатом•не производит.

Таким образом, используя в качестве субстрата 5'-тио-фосфатный аналог ДНК, Т4 ДНК-лигаза образует ыежнуклвотидную тиофосфатную связь с Нр-кснфигурзцией.

А. Матричные свойства амадофосфзтных аналогов ДНК

Сведения, добытые при исследован®! субстратных свойств амидофосфатных аналогов ДНК в реакции лигиоозания. слукат основанием для получения протякеншх фрагментов ^ обладащих ме:шуклеотидной хпральной фосфатной группой с заданной абсолютной кощнгурацяей. Полученные сведения были использованы для хшуико-знзкмэаъческой сборки 31-члвншх Нр- и Sp-емкдо-фосфатных ( циклогексялаыидо- я ' е-аг.5иногвкс!шаш-;дофосфат-ных ) олпгонуклеотидов (ХП¥Ъ,с),' ксследэв'анпых в качестве кюрец в реакции полимеризация, кателкБируемой ДНК-полкмэразой I E.colt (Фрагмент Кленов^).

ХХТТЪ, с

R

5' аттастггссддат ícctttgggttctctgttc к''

дасссаазасасалл-г32 s'

ХГ,7

Р. - цкклогексЕлаюдаый кла е-аг-икогексиломгиннЯ заместитель

Праймером слугал олигонуклеотид (XXV). помеченный по 5'-концу радиоактивным фосфатом.

Продукты достройки через определенные интервалы времени разделяли в условиях денатурирующего гель-электрофореза и визуализировали посредством радиоавтографии. В качестве контрольной матрицы использовали немодифшхированный 31-мер (XXIV).

Было установлено, что неионная амидофосфатная модификация мекнуклеотидаой связи в матрице нэ является абсолютны?,! препятствием для фермента. В случае Бр-стереомерных матриц наблюдалось образование полноразмерого продукта достройки, хотя скорость его образования была значительно ниже, чем при использовании нвмодифицировакной матрицы. В случае же Rp-изомеров мы наблюдал-: образование продуктов, отличающихся по подвижности от 31-мера, независимо от времени инкубации и количества фермента. Сопоставление размеров продуктов элонгации праймера (XXIII) на Нр-матрицэ с продуктами частичного SVPDE гидролиза поляоразмзрной копии, полученной при считывании немодифицированной матрицы показало, что фэркент на Нр-матрнце делает несколько остановок: первая - непосрздст-взвно перед модифицированным звеном, вторая - через два нук-леотидкых звзна, и еще две, - каждая через два звена. Максимальная длина продукта элонгации составила ке 31, а лишь 29 звеньев.

По-видгаясму, характер препятствий, привносимых амядофо-сфатной модификацией мзжнуклеотидаой связи, является сходным для Т4 ДНК-лигазы и ДНК-полимеразы I 'S.coli. В обоих случаях Нр-изомеры создают большие препятствия по сравнению с Sp-стереомерами.

5. Взаимодействие Р-модифицированннх ДНК с эндояуклеазами рестрикции ScoRI и FoftI

Результатом исследования датирования амидировенных оли-гонуклеотидов явились индивидуальные 31-мерные олигомеры 1(а-с) и Il(a-c), содержащие единичную амидофосфатнуга группу с установленной абсолютной конфигурацией атома фосфора, а также ^модифицированные олигонуклеотиды I и II (рис.2А).

Рестриктаза Ток! узнает в одной из цепей последовательность ССАТС и расцепляет фосфодиэфирную связь на расстоянии 9 нук-леотидных звеньев от этой последовательности, в другой цепи фермент узнает комплементарную последовательность САТСС и расщепляет сахаро-фосфатный остов мевду 13 и 14 звеньями, предшествующими этой последовательности. ЕсоМ узнает гекса-нуклеотидную последовательность СААТГС и гидролизует обе цепи мевду С и А. В запланированной ДНК сайты узнавания эндо-нуклеаз рестикции расположены таким образом, что места их расщепления оказались совмещенными. Именно эти фосфодиэфир-ные связи были модифицированы за счет введения морфолидного, циклогексиламидного или е-аминогексиламидного остатков. Все полученные одвоцепочечные фрагменты были помечены по 5'-концу радиоактивным фосфатом с помощью Т4 полинуклеотид-киназы и 17~зг]АТР. Меченые олитонуклеотиды были использованы в различных комбинациях при формировании дуплексных ДНК. Результаты расщепления оценивались с помощью электрофореза в ПААГ и радиоавтографии. Как и ожидалось, обе рестриктазы не способны расщеплять дуплексы составленные из обеих модифицированных цепей, независимо от конфигурации Р-хиральных центров. Исследуя поведение дуплексов, составленных из ^модифицированной и одной Р-модифицированной цепей,.можно было ожидать, что ферменты проявят способность к расщеплению немоди-фщированьэй цепи, как зто наблюдалось для тисфосфатных аналогов. Действительно, смешанные дуплексы составленные с участием Бр- стереомеров, способны предоставить для расщепления рестриктазам свои немодифицированные цепи. Когда же дуплексы формировались с участием Нр-изомеров, то наблюдалось характерное различие: фермент РоЫ расщеплял немодифи-цированную цепь, тогда как эндонуклеаза ЕсоН1 не оказалась способна это сделать.

ВЫВОДЫ

1. Исследована способность олигодезсксирибонуклеотидов, содержащих модифицированную мзляуклеотидную фосфатную группу (амидо- или тисфосфатную) в определенном положении цепи, чествовать в реакции, катализируемой ?4 ДНК-лпгазой. Установлено", что амидофосфатные аналоги ДКК, модифицированные по звеньям, примыкающим к 5'-фосфатной или З'-ги-дроксильнсй группам, не могут служить ни фосфатным, ни гидроксилышм компонентами лигазной реакции;' наличие не менее 'одного немодифицированного мехнуклеотидного фосфата

• кезду амидофосфатной .связкой и концевыми З'-гидроксильной.

. '■ или 5*-фосфатной группами создает возможность каждой из них участвовать в образовании продуктов лигазной реакции.

2. Разработана химико-энзиматическая схема для определения абсолютной, конфигурации циклогексиламидофосфатных аналогов ДНК.;;-

3. Впервые показано, что Т4 ДНК-лигаза различает Ир- и Зр-конфиг'урации амидофосфатной группы, когда последняя отделена от З'-конца одним ^модифицированным звеном. При этом в лигировании участвует лишь тот стереомер, у которого модифицирующий заместитель ориентирован в главную бороздку двойной спирали.

. 4. Используя в сиивке прохиральную ,5'-тиофосфатную группу, Т4 ДНКт-лигаза' создает меннуклеотидную тиофосфатную связь с Нр-конфигурациэй.

&. Исследование амидофосфатных аналогов в качестве матриц в реакции, катализируемой ДНК-полимеразой I (фрагмент Кле-нова), показало, что модификация межнуклеотидной связи в случае Бр-стереомера замедляет, а в случае Яр-изомера препятствует образованию полноразмерпого продукта достройки.

6. Рестриктаза ЕсоНТ не способна расщеплять немодифицирован-ную цепь в дуплексе, составленном из одной модифицированной и другой немодифицированной цепей, если амидный заместитель ориентирован наружу от дуплекса, в отличие от рестриктазы ТоЖ, способной расщеплять немодифицированную цепь при любой ориентации модифицирующего заместителя.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЖКОВАШ Б (ЖДУЩИХ РАБОТАХ

1. Шабанова Е.В., [¥йлиипов С.Т7], Егапов Д.С., Коробко В.Г., Добрынин В.Н. Энзиматическое .цитирование фрагментов ДНЕ-;, содеркадих фосфаюгдную модификацию мокнуклеотидных связей. - Биоорган, химия, IS9J, т.Г?, K.I, с.93-106.

2. Шибанова Е.В., Есшов Д.С., Болдырева Е.Ф., Корооко В.Г., Добрынин В.Н. Легирование ДНК, содержащих Б'-концевую тиофосфатнуы группу, Т4 ДНй-лигазой. - Биоорган, химия, IS3I, Т.17, N.8,. С.104о-1050.

3. Sh.lbar.ova E.Y.. Koronko Y.G., Dobrynin Y.K. -т4 D1IA ligase distinguishes between Rp- and Sn- configuration at phosphorus chiral atom in phosphoraiclcate DV.A analogs. - Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 19Э1 , R.24, p.279.