Метилтрансфераза SsoII как регуляторный белок: регуляция в системе рестрикции-модификации SsoII тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ----------- --------ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА________

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 547.563.3

ШИЛОВ Илья Александрович

МЕТИЛТРАНСФЕРАЗА КАК РЕГУЛЯТОРНЫЙ БЕЛОК: РЕГУЛЯЦИЯ В СИСТЕМЕ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ 5*о11

Специальность 02.00.! О - биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: кандидат биологических наук, ведущий

научный сотрудник A.C. Карягина

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Е.А. Кубарева

Официальные оппоненты: доктор химических наук, ведущий

научный сотрудник Ю.Ф. Дрыгин

доктор биологических наук, профессор С.К. Завриев

Ведущая организация: ГНИИ Генетики и селекции

промышленных микроорганизмов

Защита состоится 25 ноября 1997 года в 16 часов на заседании Диссертационного Совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета

МГУ.

Автореферат разослан 24 октября 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Долгие годы основным аспектом исследования ферментов систем рестрикции-модификации ДНК 11-го типа являлось изучение белково-нуклеинового узнавания, связанного с выполнением их непосредственных функции -гидролиза ДНК или метилирования одного из основании в цепи ДНК в строго определенном месте. Однако, в последнее время системы рестрикции-модификации все больше привлекают исследователей с точки зрения характеристики регуляции экспрессии генов, которая играет чрезвычайно важную роль при функционировании этих систем в клетках бактерий. Это связано с тем, что эндонуклеазы рестрикции представляют собой белки, потенциально опасные для экспрессирующей их клетки-хозяина. Нарушение функции специфического метилирования ДНК клетки-хозяина может приводить к фрагментированию ДНК эндонуклеазами рестрикции и последующей гибели клетки. Поскольку многие системы рестрикции-модификации определяются автономно реплицирующимися элементами - плазмидами и вирусами, можно предположить, что при их переносе из одного организма в другой регуляция экспрессии генов метнлтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции должна осуществляться самой системой. Исследования систем рестрикции-модификации П-го типа, проводимые в последнее время, показали, что механизмы регуляции активности генов в этих системах различны и требуют детального изучения.

Объектом нашего исследования является система рестрикции-модификации SioII, обнаруженная в штамме Shigella sonnet 47. Отличительной особенностью системы Ssoll является дивергентное расположение генов эндонуклеазы рестрикции и метнлтрансферазы, которые разделены небольшим межгенным участком, что делает эту систему особенно привлекательной с точки зрения исследования регуляции экспрессии генов.

К началу выполнения настоящей работы была показана авторегуляторная роль метнлтрансферазы £coRII и было высказано предположение о том, что метнлтрансферазы dem и Mspl также могут выполнять регуляторную функцию (Som et al., 1994). Этот факт расширяет существующие воззрения на узнавание метилтрансферазами последовательностей ДНК, и позволяет предположить существование двух типов ДНК-белковых взаимодействий метилтрансфераз - с участком метилирования и с промоторной областью собственного гена. Несмотря на то, что

генетическая организация этих систем рестрикции-модификации различна, узнаваемые в двутяжеиой ДНК последовательности всех трех метилтрансфераз - £coRII (5-...CCa/tGG...-3'), dem (5'-...CCa/tGG...-3') и Msp\ (54..CCGG...-3'), похожи на участок узнавания метилтрансферазы SjoII (5'-...CCNGG...3', где N - А, G, Т или С), и все три фермента модификации, также как и метилтрансфераза .SioII, метилируют внутренний иитозин узнаваемой последовательности с образованием 5-метилцитозина (5МЦ). Более того, аминокислотные последовательности этих метилтрансфераз высокогомологичны. На основании этих данных можно предположить возможность регуляции экспрессии генов, основанной на авторегуляторной функции метилтрансферазы, для системы рестрикции-модификации &о11. Актуальным является выяснение вопроса о существовании общего механизма регуляции экспрессии генов у ряда родственных систем рестрикции-модификации, в основе которого лежит взаимодействие метилтрансферазы с промоторной областью собственного гена. Такая регуляция может быть существенна как при проникновении системы рестрикции-модификации в клетку, так и в последующем - для выполнения функции защиты клетки бактерии-хозяина от проникновения чужеродной неметилированной ДНК.

Цель работы. Изучение механизма регуляции в системе рестрикции-модификации SsoII, исследование взаимодействия метилтрансферазы S.roll с межгенной областью этой системы.

Научная новизна и практическая ценность. Исследована регуляция экспрессии генов в системе рестрикции-модификации &оН. Показано, что метилтрансфераза 5joII (M.S.soU) может выполнять регуляториую функцию: снижать экспрессию собственного гена и повышать экспрессию гена, кодирующего эндонуклеазу рестрикции SioII (R.SsoII). Установлено, что регуляторная функция M.SiolI определяется Н-концевым доменом. В этой части молекулы с помощью компьютерного анализа с высокой вероятностью предсказан потенциальный участок связывания ДНК, представляющий собой модуль "спирапь-поворот-спираль", характерный для многих ДНК-связываюших белков. Показано, что М.&о11 способна формировать специфический и стабильный комплекс с межгенной областью системы рестрикции-модификации &о11. Локализован участок ДНК, с которым взаимодействует фермент, а также выявлены нуклеотидные остатки ДНК, которые вовлечены во взаимодействие или сближены с M.SjoII. Предложен метод определения констант равновесного ДНК-белкового связывания, основанный на вытеснении специфического ДНК-дуплекса с известной константой

связывания _ неспецифическими - ДНК-дуплексамиили ^ДНК-дуплексами с модифицированным участком связывания. Анализ подученных в работе данных позволяет предположить существование общего механизма регуляции у ряда родственных систем рестрикции-модификации ДНК. В основе этого механизма лежит специфическое взаимодействие метилтрансферазы с собственной промоторной областью, которое обеспечивает репрессию синтеза метилтрансферазы а процессе функционирования системы рестрикции-модификации в клетке.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были представлены на конференции FASEB "Ферменты. действующие на нуклеиновые кислоты" (Вермонт, США, 1996) и 4-ом рабочем совещании New England Biolabs по биологической модификации ДНК (Игле, Австрия, 1997).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на^^страницах

машинописного текста и содержит следующие разделы: обзор литературы (посвящен регуляции экспрессии генов прокариот, опосредованной ДНК-белковыми взаимодействиями), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы (172 ссылки), содержит 44 рисунка и S таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1. Исследование регуляции экспрессии генов в системе рестрикции-

модификации SsüII in vivo.

Гены метилтрансферазы (ssoI/M) и эндонуклеазы рестрикции (ssoí/R) в системе рестрикции-модификации SioII транскрибируются дивергентно. Длина межгенного участка составляет 109 нуклеотидных пар (н.п.)

109 н.п.

ssoIIR ssolIM

Для исследования регуляции экспрессии генов в системе рестрикции-модификации SsoII in vivo были сконструированы две плазмиды - pACYC-SsoítM и pACYC-SsoíIR, в которых межгенная область системы рестрикции-модификации &о11 была клонирована в обеих ориентациях непосредственно перед полноразмерным геном р-галактозидазы (lacZ).

Конструирование этих плазмид проводили в два этапа. Фрагмент ДНК данной 140 н.п., соответствующий межгенной области системы рестрикции-модификации SroII, был синтезирован с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для синтеза использовали плазмиду pMS2 (Karyagina et al., 1993), содержащую полную нуклеотидную последовательность системы рестрикции-модификации Svoll. Праймеры, использованные для ПЦР, имели следующие последовательности:

5'-CTTAAGGATCCCATAAAAAATAACCTTTTATATC-3' и ВатШ

5'-CTGCGATATCAGATCTCATGCATGTCTACCAGAA-3'.

EcoKV Bgäl

соответственно. Тринуклеотиды CAT, выделенные жирным шрифтом, представляют собой инициагорные кодоны (в комплементарной цепи ДНК) генов ssoIIR (верхний праймер) и ssoIIM (нижний праймер), соответственно. Участки узнавания эндонуклеаз рестрикции Bgl51, EcoKV and ВитШ были введены в праймеры для удобства клонирования. Амплифицированный фрагмент ДНК клонировали в плазмиде pACYC184 в обеих ориентациях. В первом случае вектор pACYC184 и клонируемый фрагмент были обработаны Ват Hl и EcoRV; во втором - плазмида pACYC184 была гидролизована BamHl и обработана щелочной фосфатазой, а клонируемый фрагмент обработан %Л1 и BamHl. После лигирования ДНК была трансформирована в штамм Е. coli NW-22. Отбирали клоны с фенотипом CmRTcs (клетки, устойчивые к хлорамфениколу и чувствительные к тетрациклину), поскольку в результате клонирования промоторной области системы рестрикции-модификации SsoII в плазмиду pACYC184 ген устойчивости к тетрациклину оказывался нарушенным. На втором этапе полученные плазмиды гидролизовали рестриктазами Bgfll и Hindill или Ват HI и HindlU, соответственно, и лигировали с ВатШ-Hindlll фрагментом плазмиды р10 (производной плазмиды pCL47 (Zabeau et al., 1982)), содержащим полноразмерный ген ß-гапактозидазы (lacZ). В результате клонирования бьши получены плазмиды pACYC-SsoIIM и pACYC-SiolIR (рис. 1, А).

В плазмиде pACYC-SrolIM ген ß-галактозидазы находится под контролем промотора метилтрансферазы SsoII (Рмет), а в плазмиде pACYC-SsolIR - под контролем промотора эндонуклеазы рестрикции SroII (Pre).

Колонии клеток Е. соИ NW-22, несущих эти рекомбинантные плазмиды, имеют различную окраску на агаризованной среде," содержащей 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-Р--- -О-галактопиранозид (Х^а1). Клетки, содержащие плазмиду рАСУС-ЛоНМ, образует темно-синие колонии, что свидетельствует о высоком уровне синтеза ¡5-галактозидазы с

Рис. 1. Рекомбинантные плазмиды, используемые для исследования регуляторной функции M-SíoII в экспериментах in vivo. А. Плазмиды pACYC-&olIM и pACYC-SíolIR, несущие репортер-ный ген lacZ под контролем промоторов метилтрансферазы Stoll (Рмет) и эндонуклеазы рестрикции 5joII (Pre), соответственно. Б. Плазмидные конструкции, содержащие производные генов sso/lM и ntaXиспользуемые для трансформации клеток Е. coli. несущих плазмиду pACYC-.SíoHM или pACYC-5í()lIR: плазмида pMS2 содержит ген метилтрансферазы ■V.voll под контролем собственною промотора; в плазмидах серии pQM гены метилтрансфераз находятся под контролем искусственного 1ас/Т5 промотора.

промотора М&оН (Рмет)- И, напротив, клетки, содержащие плазмиду pACYC-SvoIIR. образуют белые колонии, что свидетельствует о слабой экспрессии этого репортерного гена, когда он находится под контролем промотора R.SsoIJ (Pre)- После количественной оценки уровня экспрессии р-галактозидазы в этих клетках было установлено, что уровень активности |}-галактозидазы в клетках, несущих плазмиду pACYC-.^vollM. в 540 раз выше, чем уровень активности в клетках с плазмидой pACYC-&roIIR (Табл. 1). С точки зрения функционирования систем рестрикции-модификации в клетках бактерий такое соотношение активностей может отражать ситуацию, возникающую сразу после проникновения системы рестрикции-модификации в новую клетку. При этом избыточный уровень синтеза метилтрансферазы по отношению к низкому уровню синтеза эндонуклеазы рестрикции обеспечивает метилирование ДНК клетки-хозяина и предупреждает ее гидролиз соответствующей зняонуклеазой рестрикции.

При введении в клетки дополнительной плазмиды рМБ2 (рис. I, Б), обеспечивающей конститутивный синтез М.&о11, уровень синтеза р-галактозидазы увеличивается в 8 раз в клетках, несущих плазмиду рАСУС-&оШ1, и уменьшается в 20 раз в клетках с плазмидой рАСУС-5'.«Л1М (Табл. 1). Такая ситуация, по всей видимости, соответствует последующим стадиям существования системы рестрикции-модификации в клетке, когда ДНК клетки-хозяина уже прометилирована, и для защиты клетки от чужеродной ДНК необходимо поддерживать повышенный уровень синтеза эндонуклеазы при достаточно низком уровне синтеза метилтрансферазы. Таким образом, М.&оН проявляет функции регуляторного белка, снижающего уровень синтеза М.&оИ и повышающего уровень синтеза Я.&оИ в клетке.

Важные результаты были получены при введении в клетки, несущие рАСУС-5!го11М или рАСУС-ЛдаНЛ, плазмиды рС>МЫ1аХ (рис. 1, Б). Эта гашмида определяет синтез метилтрансферазы Л7аХ (МЛ7аХ) имеющей высокую гомологию аминокислотной последовательности с метилтрансферазой &оП и узнающей в двутяжевой ДНК ту же нукпеотидную последовательность.

Таблица 1. Влияние генов ssoIIM и ttlaXM и их производных на экспрессию (J-галактозндазы в модельной системе ш vivo.

Штамм Введенные плазмиды Активность Р-галактозидазы в единицах Миллера (в процентах) Цвет колоний на чашках с Х-да1

Е. coli NW-22 [pACYC-SsoIIM] — 269(100) темно-синий

pMS2 13,5(5) голубой

pQMSsoII 130,7 (49) темно-синий

pQMNlaX 288,6(107) темно-синий

pQMSsoNlaX 232.7(86) темно-синий

pQMASsoII 254,2 (95) темно-синий

Е coli NW-22 [pACYC-SsoIIR] — 0,5(100) белый

pMS2 4,1 (820) голубой

pQMSsoII 10,8 (2160) голубой

pQMNlaX 1,2 (240) белый

pQMSsoNlaX 12.2(2440) голубой

pQMASsoII 0,61 (122) белый

Единственным существенным отличием М.ЛУаХ от М.&оП является отсутствие в структуре М.Л'АзХ Ы-концевой области длиной 72 аминокислотных остатка, предшествующей первому консервативному блоку аминокислот 5МЦ-метнлтрансфераз.

Оказалось, что в отличие от MSjoíI, экспрессия M.NlaX не влияет на уровень синтеза (V- - -галакгозидазы как в штамме с гогазмияой pACYC-S-oIIM, так и в штамме с плазмидой ' pACYC-SsoIIR (Табл. 1). На основании этих данных можно предположить, что именно N-концевая область М.&о11 определяет способность этого белка взаимодействовать с промоторным участком системы рестрикции-модификации Хк>П и, тем самым, регулировать экспрессию генов.

Подтверждением этого служат также данные, полученные при трансформации штаммов, содержащих конструкции pACYC-SsoIIM иди pACYC-SroHR, шшзмидами, обеспечивающими синтез гибридной метилтраисферазы SsoWNlaX (состоящей из первых 72-х аминокислот M.SíoII и полной аминокислотной последовательности M.NlaX), а также делеционного производного M.&oII, в котором отсутствуют первые 72 аминокислоты (М.Д&о11) (рис. 1, Б). Экспрессия М.SsoWNlaX имела эффект, сходный с действием, вызываемым нативной M.SsoH в то время как М.ДйоП, также как и M.NlaX, не оказывала воздействия на уровень [J-галактозидазной активности в клетках (Табл. 1).

Таким образом, на основании исследования с использованием модельной системы in vivo было показано, что M.&oII обладает регуляторной функцией - повышает уровень экспрессии эндонуклсазы рестрикции SsoII и снижает уровень экспрессии метилтраисферазы SsoII в клетках. За регуляторную функцию отвечает N-концевая область M.S.voII.

1.2. Исследование равновесного связывания ДНК-метилтрансферазы 5íoII с промоторной областью системы рестрикции-модификации SíoII in vitro.

Для изучения взаимодействия M.&oll с фрагментом ДНК, содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации SsoII, был использован метод "торможения" в геле, позволяющий регистрировать образование ДНК-белковых комплексов с помощью радиоавтографии.

Фрагмент ДНК, содержащий промоторную область системы рестрикции-модификации SsolL, был синтезирован с помощью ПЦР с использованием тех же праймеров. которые применялись для амплификации этого участка ДНК для клонирования (см. раздел 2.1). Таким образом, с учетом 5'- концевых областей праймеров, некомплементарных участкам промоторной области системы рестрикции-модификации SxoU, длина полученного фрагмента ДНК составляла 140 н.п. В ДНК-дуплекс вводили 52Р-метку, очищали в полиакриламидном геле и использовали для

равновесного связывания с МЛлоП in vitro. На рис. 2, А приведена радиоавтограмма разделения реакционных смесей, полученных в результате равновесного связывания различных количеств M.&0II со 140-звенным фрагментом ДНК, содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации Ssoll, методом "торможения" в геле.

Рис. 2. Анализ равновесного связывания М.5Ы1 (А) и MJV/aX (Б) со 140-звенным фрагментом ДНК, содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации &о11 методом "торможения" в геле. К фиксированному количеству (413 нМ) 32Р-меченого 140-звенного фрагмента ДНК добавляли различные количества гомогенных препаратов М.&оЦ (А) и MJV/oX. (Б). ДНК-белковые комплексы обозначены как CI, С2, СЗ и С4, соответственно. Цифрами над каждой дорожкой обозначены молярные соотношения белка и ДНК.

В довольно широком диапазоне концентраций М.&о11 - от 0,13 до 0,78 мМ - наблюдается один основной ДНК-белковый комплекс, обозначений на рис. 2, А как комплекс С2. Если концентрация МЛоН в реакционной смеси выше, чем 1,3 мМ, то образуется, по крайней мере, шесть ДНК-белковых комплексйв;(риС. 2, А).

Для доказательства'специфической природы комплекса С2 были проведены эксперименты по конкурентному вытеснению 140-звенного фрагмента ДНК, содержащего промоторную область системы рестрикции-модификации &о11, из комплекса с М.£кЛ1. качестве конкурентных субстратов использовали фрагмент ДНК . той же нуклеотидной последовательности, а также неспецифический фрагмент ДНК -140-звенный ДНК-дуплекс, содержащий промоторный участок вируса лейкоза коров (ВЛК). Следует отметить, что в неспецифическом 140-звенном фрагменте ДНК не наблюдается сколько-нибудь выраженной гомологии нуклеотидной последовательности с промоторным участком системы рестрикции-модификации &оП, а также отсутствуют . участки узнавания М.&о11.

ДНК (140 » п.)

Piic. 3. Анализ конкурентного

связывания специфического и

^специфического ДНК-субстратов с M.S.toll методом "торможения" в геле. M.Ssoll (130 нМ) и специфический 1гР-меченыи МО-звенный фрагмент ДНК (25 нМ) инкубировали в присутствие различных концентраций немеченых специфического (Л) и несиецифического (Б) 140-звенных фрагментов ДНК. Цифрами нал каждой дорожкой обозначены соотношения меченого и немеченого фрагментов ДНК.

При использовании в качестве конкурентно связывающейся ДНК немеченого фрагмента той же нуклеотидной последовательности полное вытеснение меченой ДНК из комплекса С2 происходит уже при добавлении 16-кратного избытка субстрата-конкурента (рис. 3, А). В то же время, даже 96-кратнын молярный избыток несиецифического 140-звенного фрагмента ДНК не влияет на формирование комплекса С2 (рис. 3, Б). Это позволяет говорить о том. что образование комплекса С2 обусловлено специфическим взаимодействием M.S.voH с промоторной областью системы рестрикции-модификации S.mll.

Картины образования множественных комплексов, получающиеся при взаимодействии М..V/aX со 140-звенным фрагментом, содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации £$оГГ. (рис. 2, Б), а также при взаимодействии M.SayjH и М.Л'/aX с фрагментом промоторной области ВЛК очень похожи между собой и характерны для неспецифических ДНК-белковых взаимодействий (Taylor et al.. 1991). Во всех этих случаях количество образующихся комплексов пропорционально зависит от количества добавляемого в пробу белка. Более того, концентрация белка, требующаяся для формирования множественных комплексов лишь незначительно превышает концентрацию, требующуюся для образования первого комплекса (С1).

Для определения константы связывания (К,/) комплекса M.S.roll со 140-звенным фрагментом ДНК. содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации &о11. была изучена зависимость отношения связанной и свободной форм ДНК ([ED]/[D]) от концентрации ДНК (D0) при постоянной концентрации фермента (Еп) (рис. 4).

-ДНК

-днк

Рис. 4. Определение константы связывания (К«) комплекса \tSsoll со 140-звенным фрагментом ДНК, содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации &оН.

Величина 1/К<1 соответствует тангенсу угла, образуемого прямой, представляющей собой линейную экстраполяцию зависимости [Е0]/[0] от [ЕО], и осью абсцисс. Рассчитанная таким

о

4

5

[ED], нМ

образом величина Kj составила 15±7 нМ (рис. 4).

Таким образом, результаты исследования связывания M.Sroll с различными фрагментами промоторных областей in vitro свидетельствуют о том, что эта метилтрансфераза способна специфически связываться с фрагментом ДНК, соответствующем промоторной области системы рестрикции-модификации SsoII.

1.3. Экспериментальное определение участка промоторнои области системы рестрикции-модификации &оН, вовлеченного в специфическое взаимодействие с

Участок ДНК, вовлеченный в специфическое взаимодействие с М&оН, был идентифицирован методом футпринтинга ДНК-белкового комплекса ДНКазой I. Для этого "Р-меченый по 5'-концу нижней или верхней цепи 140-звенный фрагмент ДНК, содержащий промоторную область системы рестрикции-модификации 5ло11, инкубировали с М.&о11. ДНК-белковый комплекс обрабатывали ДНКазой I так, чтобы этот фермент статистически вносил один разрыв на молекулу ДНК. Контрольную реакцию проводили без добавления М.&оН. Полученные фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) и определяли участки нуклеотидной последовательности, защищаемые МЗдоИ от гидролиза ДНКазой I (рис. 5).

Из анализа полученных радиоавтограмм видно, что М.&о11 защищает участок ДНК размером 48 нуклеотидов в верхней цепи и 52 нуклеотида в нижней цепи ДНК. Область, защищаемая М.5м>11 от гидролиза ДНКазой I, включает в себя предположительные участки связывания с рибосомой (РСУ) и, частично, -10 регуляторную последовательность гена мо//Л/, а также -10 и -35 области гена ш)//Л (рис. б).

М-ЛоН.

Рис, 5. Футприитинг ДНКазой I комплекса М.&оП с промоторной областью системы рестрикции-модификации йо11. 140-звеннмй ДНК-дуплекс, меченный ->2р по 5'. концу нижней (Л) или верхней (В) цепи, инкубировали с М.ЛоН, обрабатывали ДНКаюй I и полученные фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в 10%-ном ПЛАГ, содержащем 7М мочевину (дорожки Б). Дорожки К соответствуют разделению продуктов статистического гидролиза ДНКазой I 140-звенного ДНК-дуплекса в отсутствие дорожки И, О+Л, А+С. С+Т и Т -продуктов реакций химической модификации исследуемого фрагмента ДНК методом Максама-Гилберта. Области, защищенные М.5>о11 от гидролиза ДНКазой ), обозначены на рисунке вертикальными линиями.

-35 -10

5'-САТААААААТААССТТТТАТАТСТАСТТСАААСТТТТТТСАТССАССТТСАТААТТ 3' -СТАТТТТТТДТТССААААТАТАСАТСААСТТТСААААААСТАССТССААСТАТТАА Я-ЛоИ РСУ -10

\ Ц I РСУ МА,)11—►

ОО^АТСААААСАОСТСАААТТ<7ГССТААААССААСАСТТДДТТСТебТДСАСАТССАГ6-3 ' ССТТАСТТТТСТССТОТТТААСА5Са.ТТТТССТТСТСААТТААСАССАТСТСТАССТАС - 5 ' Р -35 П

Рис, 6. Межгенная область системы рестрикции-модификации Результаты

футпринтннга ДНКазой I и диметилсульфатом. Серым фоном обозначена область, защищаемая МАо11 от гидролиза ДНКазой 1. Стрелками обозначены гуаниповыс остатки, вовлеченные по взаимодействие с М.&оЛ; величина стрелок соответствует степени их защиты от метилирования диметилсульфатом. Треугольником обозначена позиция тиминового остатка, при замене которого на 5-бром-2'-дезоксиуридин получен максимальный выход ковалентно-связанного комплекса с М.&оН (см. ниже). Жирным шрифтом обозначены предполагаемые участки связывания с рибосомой (РСУ) и нннцнаторные кодоны генов ио//Д и тоИМ.

1.4. Идентификация гуаниновых остатков ДНК, вовлеченных во взаимодействие с МЛоН.

Для того чтобы идентифицировать гуаниновые остатки ДНК, вовлеченные во взаимодействие с М.£го11, был проведен футпринтинг ДНК-белкового комплекса диметилсульфатом. Этот химический реагент при определенных условиях метилирует гуаниновые остатки по атому N7, экспонированному в большую бороздку ДНК. Сравнительный анализ метилирования ДНК в присутствии и в отсутствие белка позволяет получить информацию о взаимодействии этих функциональных групп с аминокислотными остатками белка в ДНК-белковом комплексе.

Комплекс М.&оН с содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации &о11 140-звенным фрагментом ДНК, меченным 32Р по 5'-концу верхней или нижней цепи, обрабатывали диметилсульфатом так, чтобы статистически модифицировалось одно основание на молекулу ДНК. Контрольную реакцию проводили в аналогичных условиях в отсутствие М.&оН. После гидролиза модифицированных цепей ДНК пиперидином фрагменты ДНК анализировали электрофорезом в денатурирующем ПААГ (рис. 7).

Рис. 7. Футпринтинг диметилсульфатом комплекса МЛо11 с промоторной областью системы рестрикции-модификации &о11. 140-звенный ДНК-дуплекс, меченный згР по 5'-концу верхней (А) или нижней (Б) цепи, инкубировали с М.&оП и обрабатывали диметилсульфатом. После гидролиза модифицированных цепей ДНК пиперидином полученные фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в 10%-ном ПААГ, содержащем 7М мочевину (дорожки Б). Дорожки К соответствуют разделению продуктов гидролиза пиперидином 140-звенного ДНК-дуплекса, модифицированного диметилсульфатом в отсутствие М.5лоН. Гуаниновые остатки, вовлеченные во взаимодействие с МАоП, обозначены стрелками.

Из анализа полученных радиоавтограмм видно, что М.&а11 в различной степени защищает от метилирования семь гуаниновых остатков - четыре в верхней цепи и три - в нижней цепи ДНК, что свидетельствует об их взаимодействии с М.5ло11. Поскольку атомы N7 гуаниновых остатков экспонированы в большую бороздку ДНК, то можно предположить, что М.&оН взаимодействует с большой бороздкой этого участка ДНК. Шесть из семи идентифицированных гуаниновых остатков расположены внутри

15-звенного инвертированного повтора, обозначенного на рис. 6 сходящимися стрелками. Центром симметрии инвертированного повтора является центрхтьная Л-Т пара, причем вовлеченные во взаимодействие 1~уашшовые остатки расположены симметрично внутри повтора. Идентифицированный повтор, вероятно, представляет собой участок ДНК, обеспечивающий максимальное количество специфических контактов с МЛг>11 при формировании комплекса.

1.5. Анализ in vitro связывания метилтрансферазы S4r>II с синтетическими ДНК-дуплексами, содержащими инвертированный повтор, выявленный в участке связывания.

Дальнейшие исследования особенностей взаимодействия М.&оН с ДНК проводились с использованием коротких синтетических ДНК-дуплексов. В качестве исходного был выбран 31-звенный ДНК-дуплекс, последовательность которого включала в себя описанный выше инвертированный повтор (ДНК-дуплекс I):

5'-ATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAA-3' -* *-

3'-TAGTTTTGTCCTGTTTAACAGGATTTTGGTT-5'

В дальнейшем цепь ДНК-дуплекса, содержащего в центре инвертированного повтора остаток dA будет называться Л-иепыо, а цепь ДНК, содержащая остаток dT - Т-цепыо. Константа связывания комплекса М.ХлоП с ДНК-дуплексом I, рассчитанная по методу Скэтчарда составила 9,4+!,9 нМ, что хорошо совпадает с величиной константы связывания, рассчитанной для комплекса M.SsoII со специфическим 140-звенным фрагментом ДНК (15±7 нМ). Это свидетельствует об адекватности выбора 31-звенного ДНК-дуплекса 1 для исследования взаимодействия M.SsoII с регуляторной областью системы рестрикции-модификации 5.м11.

Данные футпринтинга комплекса М.&о11 с промоторной областью системы рестрикции-модификации Ssoll диметилсульфатом свидетельствуют об образовании контактов аминокислотных остатков M.&oII с атомами N7 гуаниновых остатков, входящих в состав инвертированного повтора, и расположенных в большой бороздке ДНК.

Для идентификации возможных контактов М.&оН с 2-аминогруппами гуаниновых остатков, экспонированными в малую бороздку ДНК, было проведено исследование равновесного связывания М.&оИ с синтетическими ДНК-субстратами, в которых остаток сЮ в различных положениях инвертированного повтора был заменен на остаток 2'-дезоксиинозина ((II). Как видно из Таблицы 2, значительного снижения ДНК-связывающей активности МЛо11 при взаимодействии с <31-содержащими ДНК-дуплексами не наблюдается (разброс значений степени связывания не превышает погрешности метода - 30%). Вероятно, М.&оН не образует контактов с 2-аминогруппами гуаниновых остатков, экспонированными в малую бороздку ДНК, в пределах последовательности инвертированного повтора, или эти контакты не вносят существенного вклада во взаимодействие с М.ЛоН.

Таблица 2. Равновесное связывание ^-содержащих ДНК-дуплексов с М.&оН.

№ ДНК-дуплекс % связывания

I 5' - ...АССАСАААТТСТССТ... - З'а 3' - ...ТССТСГТТААСАССА... - 5' 41

II 5' - ...А1САСАААТТСТССТ... - 3' 3' - . ..ТССТСТТТААСАС1А. .. - 5' 48

III 5' - ...А1САСАААТТСТССТ... - 3' 3' - . ..ТССТСГТТААСАССА. .. - 5' 44

IV 5' - ...АС1АСАААТТСТССТ... - 3' 3' - ...ТССТСТТТААСА1СА... - 5' 42

V 5' - ...АС1АСАААТГСТССТ... - 3' 3' - ...ТССТСГТТААСАССА... - 5' 48

VI 5' - ...АССАСАААТТ1ТССТ... - 3' 3' - . ..ТССТ1ТТТААСАССА... - 5' 32

VII 5' - ...АССАСАААТТ1ТССТ... - 3' 3' - ...ТССГСТТТААСАССА... - 5' 34

VIII 5' - ...АССАСАААТТСТССТ... - 3' 3' - ...ТССТСТТТААСАС1А... - 5' 33

IX 5' - ...АССАСАААТТСТССТ... - 3' 3' - ...ТССТСТТТААСА1СА... - 5' 30

X 5' - ...АССАСАААТТСТССТ... - 3' 3' - ...ТССТ1ТТТААСАССА... - 5' 30

3 Показаны только 15-звенные центральные участки 31-звенных ДНК-дуплексов. Фланкирующие последовательности дуплексов И-Х такие же. как и в дуплексе I (см. выше).

С целью получения более подробной информации об особенностях взаимодействия М.ЗхоП с областью инвертированного повтора было проведено зондирование тиминовых остатков, пространственно сближенных с аминокислотами

М.ХтоН при образовании белково-нуклеинового комплекса. Для этого использовали метол ковалентного присоединения к МАоН ДНК-дуплексоп. в которых с1Т в определенных положениях нуклеотидной последовательности был заменен на 5-бром-2'-дезоксиуридин (Ьг'сШ) (Табл. 3). ДНК-белковые комплексы облучали ультрафиолетовым светом с длиной волны 302 нм и полученные реакционные смеси анализировали методом электрофореза в денатурирующем ПААГ (рис. 8).

В качестве контрольного использовали 31-звенный ДНК-дуплекс с

чередующимися АТ-повторами. содержащий остаток Ьг'сШ вместо одного из остатков (1Т

в центральной части одной из цепей (ДНК-дуплекс XIX):

5'- ССАТАТАТАТАТАТАЬг5аиАТАТАТАТАТАТСС - 3' 3'- СйТАТАТАТАТАТАТ—А--ТАТАТАТАТАТАСС - 5'

Рис. 8. Анализ ковалентного присоединения Ьг'сШ-содержаишх ДНК-дуплексов к М.&о11 методом электрофореза в денатурирующем 12.5%-ном ПААГ. Дорожки 1 - 8 соответствуют разделению реакционных смесей, полученных в результате копалс/тюю присоединения МАо11 к ДНК-дуплексам XI - XVIII, меченным 32Р по 5'-конну цепи, содержащей остаток Ьг'сШ (Табл. 3); дорожки К и Б соответствуют свободным ДНК и белку, соответственно. Положение ковалентного ДНК-белкового комплекса, обозначено стрелкой.

Образование продуктов ковалентного присоединения М.ХгоП к ДНК наблюдалось во всех случаях (ДНК-дуплексы XI - XVIII), кроме контрольного (неспецифического) ДНК-дуплекса XIX (Табл. 3). Это свидетельствует о том, что все исследованные тимнновые остатки сближены с М.&о11 в ДНК-белковом комплексе.

Интересным является тот факт, что для всех ДНК-дуплексов, содержащих модификацию в Т-цепи инвертированного повтора, характерна более высокая эффективность образования ковалентно-связанных комплексов по сравнению с остальными ДНК-дуплексами (рис. 8). Кроме того, выход реакции ковалентного присоединения М.5до11 к ДНК-дуплексу XVII в 2-5 раз выше по сравнению с другими дуплексами, в частности, по сравнению с ДНК-дуплексом XIII, несущим симметричную модификацию (рис. 8, Табл. 3).

Таблица 3. Ковалентное присоединение Ьг5<Ш-содержаших субстратов к М.ХгаП.

№ ДНК-дуплекс % ковалентного присоединения

XI 5' - . .АССАСАААЬг5аиТ6ТССТ. . . - З'а 2

3' - . . . ТССТСГТТ—А—АСАСвА. . . - 5'

XII 5' - . . АССАСАААТЬг5СШСТССТ . . - 3' 4

3' - . ..ТССТСТТТА—А--САССА.. . - 5'

XIII 5' - . . АССАСАААТТСЬг5сШССТ . . - 3' 3

3' - . . .ТССТСГТТААС—А—СвА. . . - 5'

XIV 5' - . . ,АССАСАА--А--ТТСТССТ.. . - 3' 3

3' - . . ТССТСТТЬг5сШААСА66А. . - 5'

XV 5' - . . . АСвАСА—А—АТТСТССТ. . . - 3' 6

3' - . . .ТССТСТЬГ5£ШТААСАССА. . - 5'

XVI 5' - . ..АбСАС—А--ААТТСТССТ.. . - 3' 6

3' - . . .ТССГСЬгМиТТААСАССА. . - 5'

XVII 5' - . ..АСС--А—САААТТСТССТ.. . - 3' 10

3' - . . . ТССЬг5аиСТТТААСАССА. . - 5'

XVIII 5' - . ..--А--вСАСАААТТСТССТ. . . - 3' 5

3' - . . .Ьг^иССТаТТТААСАСвА. . - 5'

XIX 5' - . . . ТАТАТАТАЬгъсШАТАТАТ . . - 3' 0

3' - . ..АТАТАТАТ—А--ТАТАТА.. . - 5'

3 Показаны только 15-звенные центральные участки 31-звенных ДНК-дуплексов. Фланкирующие последовательности дуплексов Х1-ХУ111 такие же, как и в дуплексе I (см. выше). Верхние цепи ДНК-дуплексов соответствуют А-цепи, а нижние - Т-цепи дуплекса I. Полная последовательность дуплекса XIX была приведена выше.

Возможно, это свидетельствует о том, что тиминовый остаток в этой позиции инвертированного повтора непосредственно вовлечен в образование контакта с МЛоН. Таким образом, полученные данные по ковалентному присоединению МЛ50Н к ДНК-дуплексам XI - XVIII свидетельствует о неэквивалентном характере взаимодействия фермента с разными половинами инвертированного повтора в участке связывания. Это подтверждается также наличием в верхней цепи ДНК седьмого несимметричного гуанинового остатка, участвующего во взаимодействии с М.ХгоП и находящегося за пределами области инвертированного повтора (рис. 6), и большей степенью защиты от метилирования диметилсульфатом гуашшовых остатков верхней цепи участка связывания М.&о11 (рис. 7, А). В целом, при формировании специфического комплекса М АоИ с ДНК более прочные межмолекулярные контакты образуются с левой половиной участка связывания.

Явление неэквивалентного связывания с двумя половинами симметричного участка ДНК было также недавно обнаружено для транскрипционного фактора СорИ.

(81еттееег е1 а1., 1997). Относительно высокие константы связывания (1,5х10'8 М для

М.5лЛ1 и 2х10"6М для СорЯ) отличают эти белки от типичных факторов транскрипции.

Таким образом, анализ взаимодействия МЛо11 с различными модифицированными субстратами позволяет заключить, что связывание этого белка с промоторной областью системы рестрикции-модификации &о11, вероятно, осуществляется через контакты с основаниями в большой бороздке участка ДНК, содержащего инвертированный повтор, и носит асимметричный характер.

1.6. Исследование вклада левой и правой половин инвертированного повтора во взаимодействие с М-&<?11.

Для того чтобы исследовать возможность специфического взаимодействия М.&о11 с каждой из половин участка связывания, были определены константы связывания комплексов МЗдаН с ДНК-дуплексами, содержащими только одну из половин участка связывания, а также с ДНК-дуплексом, не содержащим участок связывания. В качестве неспецифического был выбран ДНК-дуплекс, состоящий из 13-ти АТ-пар. фланкированных йС- и Сй-парами (Табл. 4, дуплекс XX). Два других ДНК-дуплекса состояли из левой или правой половин исходного ДНК-дуплекса I и соответствующей половины неспецифического ДНК-дуплекса XX (Табл. 4, дуплексы XXI и XXII).

В процессе исследования взаимодействия М.ЛоН с ДНК методом "торможения" в геле мы столкнулись с рядом специфических проблем, связанных с тем, что этот белок наряду со специфическим обладает способностью к эффективному неспецифическому связыванию с ДНК (рис. 2, А), а также склонностью к агрегации. Эти особенности привели к необходимости усовершенствования существующих стандартных методов для расчета констант связывания ДНК-белковых комплексов.

В настоящей работе предложен метод определения констант равновесного ДНК-белкового связывания, основанный на вытеснении специфического ДНК-дуплекса с известной константой связывания неспецифическими ДНК-дуплексами или ДНК-дуплексами с модифицированным участком связывания. Этот метод разрабатывался совместно со ст. научн. сотр. кафедры ХПС Химического факультета МГУ Ташлицким В.Н. •

Константа связывания (К,) ДНК-дуплекса XX, рассчитанная с помощью метода неспецифического вытеснения, составляет 322 нМ, что в 34 раза превышает К^ специфического комплекса (9,4+1,9 нМ) (Табл. 4).

Таблица 4. Константы связывания МЛоН с ДНК-дуплексами, определенные методом Скэтчарда"' и неспецифического вытеснения"'.

№ ДНК-дуплекс K/Kd '*» IQ, Ki, HM

I 5' -ATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAA-3' 31-TAGTTTTGTCCTGTTTAACAGGATTTTGGTT-5' 0,94±0,27 9,411,9''.

XX 5'-GCATATATATATATATATATATATATATCG-3' 3'-CGTATATATATATATATATATATATATAGC-5' 34,3±4,7 322

XXI 5 ' -ATCAAAACAGGACAAATATATATATATATCG-3' 3'-ТAGTТТТGTCCTGTTTATATATATATATAGC-5' 14,5+2,8 136

XXII 5' -GCATATATATATATAATTGTCCTAAAACCAA-3' 3'-CGTATATATATATATTAACAGGATTTTGGTT-5' 13,5±1,6 127

Примечание. Инвертированный повтор и его половины, присутствующие в дуплексах XXI и XXII. выделены жирным шрифтом.

Оба ДНК-дуплекса с половинным участком связывания (дуплексы XXI и XXII) характеризуются примерно одинаковыми значениями К,. При этом их сродство к M.SsoII в 13-15 раз ниже, чем у природной последовательности и всего в 2 раза выше по сравнению с неспецифическим дуплексом XX. Таким образом, оба ДНК-дуплекса, включающие'В себя лишь одну из половин инвертированного повтора, представляют собой неспецифические субстраты для связывания с M.SsoII. Вероятно, необходимым условием для обеспечения специфического взаимодействия с МАоИ является одновременное присутствие в ДНК-субстрате обеих половин инвертированного повтора.

1.7. Предсказание структурного модуля "спираль-поворот-спираль" в N-концевой области M-SioII и других 5МЦ-ДНК-мстилтрансфераз.

Все 5МЦ-ДНК-метилтрансферазы имеют общую структуру белковой молекулы -по длине аминокислотной последовательности расположено 10 консервативных блоков аминокислот, называемых блоками I - X (Posfai et al., 1989). В структуре некоторых 5МЦ-метилтрансфераз имеется длинная N-концевая часть, предшествующая первому консервативному блоку аминокислот. К таким метилтрансферазам относятся, в частности, MAoII, M.£coRII, M.dcm и MMspl.

Для выявления участков белковой молекулы, которые могут определять специфическое взаимодействие с промоторной областью системы рестрикции-модификации &о11, была проанализирована структура М.&оЦ. Использование специальной компьютерной программы (Dodd and Egan, 1990) позволило с высокой

вероятностью предсказать присутствие модуля "спираль-поворот-спирапь" в Ы-концевой части М.ЛоН. которая, как было экспериментально доказано, существенна для проявления регуляторной функции этим белком. Анапогичные модули "спнраль-поворот-спираль" были выявлены в структурах других 5МЦ-ДНК-метилтрансфераз (рис. 9, А).

Модуль "спирать-поворот-спираль" был выявлен только в 5МЦ-метилтрансферазах. обладающих длинной N-кoнцeвort частью, предшествующей первому консервативному блоку аминокислот, причем, он был обнаружен в восьми из десяти известных к настоящему времени последовательностей таких белков.

А

|{|1Я1ИИ(

четмлтранеферазы и

Поспеловател1иосг»

Предполагаемый модуль "спирал w-no ворот-спираль*

Фактор вероятности

I

OCWeC

С.ОЧгС

OOSf с

еССО

CcNGG

CcNC-G

CrUGO

5m I

5^/961

Eco-im

Msp\

5c^I:!A

SsoW

Dcm

EcoRU

I

Vr/IA

10V

v с. \| I. G I.

0 * V R т м С К J «SO

\, Г М f М» St»

L Я W D ^ 1 St)

т W О 0 w F «:

G О 1 J CD

Г. [) R Т Ш « R ) sr>

N н W «га - 0 7 4»

Г. ]т 1. N Я NV \ N

Спирать "Узнзюшдя" спираль

TATTGACTATAAAACGCACTTGGTACATAATTTTGTTTCCAATTGGAAACAAAAAGAATGCATG AAAAATAGTGTTTATTATATAATAAACTTTGGATAGGGTTATGTGTATAGGAGGTAGTTTAGTG

GATAACCATGATCAATGTTTGACAAAGCACATGTAAACCCATACAGTAGTAACCATGACTAATG GAAAGATTGACTTATAATGTTTATTACGGATAATTAGGAAAATTATAGATTTTGACCGCAAATG AATTAGTGTCAATCAGAGGACAAAAAGTCCTTATAAAAACACTTTATGAGAAAGGATTTATATG TTCATAATTGGAATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAACACTTAATTCTGGTAGACATG TGGCCCTAAATGGCTGTAATTATGTTAACCTGTCGGCCATCTCAGATGGCCGGTGAAATCTATG AACATTCAATCTGGGTCAAATGAGTGATACAGTTTCACCCATAAGACCCAATGGAGGCAATATG

к

Рис. 9. Потенциальные участки ДНК-белкового взаимодействия в комплексах метилтрансфераз с ДНК. Л. Выровненные последовательности предполагаемых модулей "спираль-поворот-спирачь" в N-конпевых частях 5МЦ-ДНК-четилтрансфераз, предсказанных методом Додда-Эгана (Dodd and Egan, 1990). Характеристические аминокислоты выделены жирным шрифтом и обведены в рамки. Метилируемые цитозины в узнаваемых последовательностях 5МЦ-ДНК-метилтрансфераз обозначены прописными буквами. Б. Нуклеотидные последовательности промоторных областей генов различных 5МЦ-ДНК-метилтрансфераз. Обнаруженные в них инвертированные повторы различной длины обозначены сходящимися стрелками.

В консервативных и вариабельных областях этих и других 5МЦ-ДНК-метилтрансфераз, а также в N4- и Сб-адениновых метилтрансферазах модуль "спираль-поворот-спираль" не идентифицируется. Можно предположить, что именно этот модуль ответственен за обеспечение специфического ДНК-белкового взаимодействия в комплексах М.ХтоН, М.&оКИ, и, возможно, других метилтрансфераз этого типа с промоторными

последовательностями.

При анализе нуклеотидных последовательностей, предшествующих гену метилтрансферазы во всех восьми анализируемых системах рестрикции-модификации было выявлено наличие инвертированных повторов различной длины (рис. 9, Б). По аналогии с данными, полученными для метилтрансферазы &о11, можно предположить, что эти участки ответственны за взаимодействие с И-концевой областью соответствующей метилтрансферазы. Ранее было показано, что авторегуляторная функция М.£со1Ш определяется И-концевым доменом этого белка. Кроме того, инвертированный повтор, идентифицируемый в промоторной области гена М.ЕсоКИ, расположен в области, защищаемой этим ферментом от гидролиза ДНКазой I (Бош е1 а1., 1994). Сравнение аминокислотных последовательностей метилтрансфераз &о11 и 5сгР1А, узнающих и метилирующих один и тот же участок узнавания в ДНК, показало, что максимальная консервативность последовательностей Ы-концевых участков наблюдается именно в области предполагаемого модуля "спираль-поворот-спираль". Аналогичная ситуация выявилась при сравнении нуклеотидных последовательностей, предшествующих генам этих метилтрансфераз - максимальная степень гомологии наблюдается в области, соответствующей инвертированному повтору (участку связывания №&о11) и все нуклеотиды, вовлеченные во взаимодействие с М.&о11, инвариантны. Это с большой вероятностью указывает на то, что метилтрансфераза ЗоПА, аналогично М.&о11, может осуществлять авторегуляцию экспрессии собственного гена, основанную на взаимодействии с промоторной областью, причем в обоих случаях во взаимодействие вовлечены одни и те же структуры белков и промоторных участков. Сопоставление данных, касающихся всей группы 5МЦ-ДНК-метилтрансфераз с выявленным модулем "спираль-поворот-спираль" в Ы-концевой области, позволяет предположить общий механизм регуляции экспрессии гена метилтрансферазы в соответствующих системах рестрикции-модификации, что может быть обусловлено общим эволюционным происхождением этих систем. Все рассмотренные метилтрансферазы, помимо выполнения функции метилирования

специфических последовательностей ДНК, вероятно, представляют собой транскрипционные факторы, способные взаимодействовать с регуляторными участками, расположенными непосредственно перед кодирующей областью собственного гена, тем самым подавляя его экспрессию. Такая регуляция, поддерживая некоторый, весьма ограниченный, уровень мегилтрансферазной активности в процессе функционирования системы рестрикции-модификации, может иметь существенное значение для выполнения функции защиты от проникновения чужеродной неметилированной ДНК в клетку бактерии-хозяина.

ВЫВОДЫ

1. Исследована регуляция экспрессии генов в системе рестрикции-модификации Ssoü. Показано, что метилтрансфераза &oü осуществляет регуляторную функцию.

Метилтрансфераза Лт>!1 снижает экспрессию собственного гена и повышает экспрессию гена, колирующего эндонуклеазу рестрикции S.voII.

2. Регуляторная функция метилгрансферазы &o!i определяется N-концевым доменом. В этой части молекулы с высокой вероятностью предсказан потенциальный участок связывания ДНК. представляющий собой модуль "спираль-поворот-спираль", характерный для многих регуляторных белков.

3. Показано, что метилтрансфераза &о11 способна формировать специфический и стабильный комплекс с цромоторной областью системы рестрикции-модификации ¿soll. Локализован у исто к ДНК длиной 48 - 52 нуклеотидных пар, с которым взаимодействует метилтрансфераза &о11.

4. В участке связывания метилтрансферазы SsoII выявлены 7 остатков гуанина, N7 атомы которых взаимодействуют с белком в большой бороздке ДНК. Шесть из них расположены симметрично в пределах 14-¡венного инвертированного повтора, идентифицированного в промогорной области системы рестрикции-модификации Ssall. 2-аминогруппа этих гуаниновых остатков, экспонированная в малую бороздку ДНК. не вносит существенного вклада во взаимодействие с метилтрансферазой &о11. Показано, что метилтрансфераза SroII асимметрично взаимодействует с остатками ДНК, входящими в состав инвертированного повтора, идентифицированного в участке связывания; однако, для обеспечения специфического связывания с М.&гоП необходимо наличие обеих половин инвертированного повтора.

5. Анализ полученных нами данных позволяет предположить существование общего механизма регуляции ряда родственных систем рестрикции-модификации ДНК. В основе этого механизма лежит специфическое взаимодействие метидтрансферазы с собственной промоторной областью, которое обеспечивает репрессию синтеза метидтрансферазы в процессе функционирования системы рестрикции-модификации в клетке.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. В.Л. Друца, В.Р. Кабердин, О.Н. Королева, И.А. Шилов. Эффективный метод

направленного введения мутаций в плазмиды и клонирования однотяжевых фрагментов ДНК. Биоорган, химия, 1991, т. 17, № 11, с. 1487-1494.

2. Anna Karyagina, Vladimir Lunin, llya Shilov and Marat Khodoun. Study of the transcription regulation in restriction-modification system SsoII. FASEB Summer Research Conference "Enzymes that act on nucleic acids", Saxtons River, Vermont, USA, June 15-20. 1996. Abstract Book, p. 24.

3. Anna Karyagina, llya Shilov. Vadim Tashlitskii, Marat Khodoun, Sergey Vasil'ev, Peter

C.K. Lau and Irene Nikolskaya. Specific binding of SyoII DNA methyltransferase to its promoter region provides the regulation of SsoII restriction-modification gene expression. Nucl. Acids Res.. 1997. v. 25. №. 11, p. 2114-2120.

4. Anna Karyagina, llya Shilov. Elena Kubareva. Marat Khodoun and Sergey Vasil'ev.

Regulation of gene expression in restriction-modification system SsoU. 4th New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification. Innsbruck - Igls (Austria), September 2-7, 1997. Abstract Book, p. 17.

5. llva Shilov. Vadim Tashlitskii, Marat Khodoun, Sergey Vasil'ev, Yakov Alekseev, Alexey

Kuzubov, Elena Kubareva and Anna Karyagina. DNA-methyltransferase SsoII binds asymmetrically to the promoter region binding site! Biol. Chem., 1998, v. 379. № 2 (in press).