Особенности регуляции генной экспрессии в системе рестрикции-модификации Ssoll тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Федотова, Елена Александровна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2009
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова
ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ
На правах рукописи Ои^" "
Федотова Елена Александровна
ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ В СИСТЕМЕ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ взоН
02.00.10 - биоорганическая химия
автореферат 1 О ДЕК 2009
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
МОСКВА-2009
003487803
Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Научный руководитель:
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
доктор химических наук Кубарева Елена Александровна
доктор химических наук Туницкая Вера Леонидовна
доктор биологических наук Вейко Наталья Николаевна
Институт биологии гена РАН
Защита состоится 22 декабря 2009 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 20 ноября 2009 г.
Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук
Смирнова И.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Системы рестрикции-модификации (Р-М) широко распространены в бактериальных клетках и содержат гены, кодирующие ферменты рестрикции (эндонуклеаза, ЭР) и модификации (метилтрансфераза, МТаза). Системы Р-М могут выступать в роли дискретных форм жизни аналогично вирусам и транспозонам (Kobayashi et al., 2001). Эндонуклеаза рестрикции гидролизует вторгающуюся ДНК, не модифицированную должным образом, то есть система Р-М выполняет функцию примитивной иммунной системы, защищающей бактерию-хозяина от проникновения чужеродной ДНК. Также в некоторых случаях было показано, что системы Р-М могут вести себя как эгоистичные мобильные элементы и вызывать перестройку генома. После закрепления системы Р-М в геномной ДНК она становится жизненно важной для бактерии. При потере клеткой системы Р-М долгоживущая (по сравнению с метилтрансферазой) эндонуклеаза рестрикции неминуемо приведет к гибели клетки (Rocha et al., 2001). Нарушение функции специфического метилирования ДНК клетки-хозяина также может приводить к её гибели за счет расщепления собственной ДНК. В то же время, соотношение внутриклеточной активности МТазы и ЭР должно быть таким, чтобы ЭР могла гидролизовать чужеродную ДНК до того, как она будет специфически модифицирована МТазой. Таким образом, регуляция экспрессии генов ЭР и МТазы играет чрезвычайно важную роль при функционировании систем Р-М в клетках бактерий, что определяет актуальность всестороннего изучения этого процесса.
Исследования регуляции активности генов в системах Р-М, проведенные в последнее время, показали, что не существует универсального механизма этого процесса. Однако регуляция на уровне транскрипции, по-видимому, является определяющим механизмом координированной экспрессии генов систем Р-М. Выделяют 3 основных типа подобной регуляции систем Р-М: посредством С-белков (от английского слова «control»), посредством метилирования промоторной области системы Р-М МТазой, а также посредством взаимодействия МТаз с регуляторными последовательностями ДНК, отличными от участка метилирования. Последний тип регуляции характерен для С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз.
Объектом нашего исследования является система Р-М 11-го типа SsoII, обнаруженная в штамме Shigella sonnei 47. Эта система является уникальной среди других систем Р-М, для которых описана регуляция экспрессии генов посредством С5-цитозиновых ДНК-МТаз (M.Msp, M.EcoRII, M.ScrFI, M.LlaJI). Показано, что помимо авторегуляторной функции - ингибирования собственного синтеза - МТаза SsoII (М.SsoII) активирует транскрипцию гена ЭР SsoII (R.SsoII) (Karyagina et al., 1997). Регуляция в этой системе осуществляется благодаря специфическому взаимодействию N-концевой области M.SsoII (1-71 а.о.) с промоторной областью генов системы Р-М SsoII (Shilov et al., 1998). Основное число контактов с M.SsoII обеспечивает локализованный внутри промоторной области 15-звенный инвертированный повтор (регуляторный участок) (Воробьева и др., 2000). Несмотря на активное изучение
з
взаимодействия M.SsoII с регуляторным участком, непосредственно механизм регуляции экспрессии генов в системе Р-М M.SsoII оставался еще невыясненным. Вместе с тем, всестороннее исследование этого процесса, возможно, позволит выявить закономерности регуляции экспрессии генов в прокариотических клетках и глубже понять его основные аспекты.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в установлении особенностей механизма регуляции в системе рестрикции-модификации SsoII.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.
1. Изучить in vitro транскрипцию генов системы Р-М SsoII в присутствии и в отсутствие метилтрансферазы SsoII и SsoII-подобной МТазы Ecll8kl.
2. Оценить эффективность комплексообразования МТазы и РНК-полимеразы Е. coli с фрагментами ДНК, содержащими регуляторные элементы генов системы Р-М SsoII.
3. Выяснить способность полипептида, представляющего собой N-концевую область M.SsoII (1-71 а.о.), выступать в роли фактора транскрипции, то есть связываться с промоторной областью генов системы Р-М SsoII и регулировать их экспрессию.
4. Исследовать роль отдельных аминокислотных остатков N-концевой области M.SsoII во взаимодействии с регуляторным участком и их влияние на транскрипционную активность фермента.
5. Установить, существует ли взаимосвязь между регуляторной и метилирующей функциями M.SsoII.
Научная новизна и практическая значимость работы. Показано, что M.Ecll8kI аналогично M.SsoII регулирует экспрессию генов in vitro в системе Р-М SsoII. Уровень синтеза транскрипта с промотора гена ЭР в отсутствие МТазы незначителен, однако он возрастает при добавлении в реакционную смесь МТазы (M.SsoII или M.EclI8kI). Синтез транскрипта с промотора гена МТазы в присутствии 4-кратного относительно РНК-полимеразы избытка M.SsoII или M.EcI18kI полностью подавляется. Установлено, что ингибирование транскрипции гена M.SsoII осуществляется за счет связывания МТазы с регуляторным участком вблизи собственного промотора. Эффективность данного взаимодействия выше, чем эффективность связывания РНК-полимеразы с промотором гена МТазы. Показано, что метилтрансфераза не мешает образованию открытого комплекса РНК-полимеразы Е. coli с промотором гена ЭР. Активация транскрипции гена ЭР происходит за счет снятия эффекта транскрипционной интерференции посредством блокирования МТазой собственного промотора.
Показано, что делеционная форма SsoII-подобной метилтрансферазы EclI8kI -A(72-379)Ecll8kI не взаимодействует с регуляторным участком в составе 31-звенного ДНК-дуплекса и фрагментов ДНК, содержащих межгенную область системы Р-М. Такой белок не способен регулировать экспрессию генов в системе рестрикции-модификации SsoII. Следовательно, наличие области, ответственной за метилирование, необходимо для связывания M.SsoII с регуляторным участком и выполнения функции фактора транскрипции.
Установлено, что мутаптные формы Ssoll-подобной МТазы Нс118к1: M.Ecll8ki(R35A) и M.Ecll8kI(R38A) практически не взаимодействуют с регуляторным участком как в составе 31-звснного дуплекса, так и в составе ДНК, содержащей межгенную область системы Р-М Ssoll. По-видимому, остатки Arg35 и Arg38 играют ключевую роль в связывании регуляторного участка. В экспериментах по транскрипции in vitro продемонстрировано, что M.Ecll8kI(R35A) и M.Ecll8kI(R38A) не способны регулировать транскрипцию. Отсутствие контактов лизина с углеводофосфатным остовом регуляторного участка ДНК было показано методом аффинной модификации белка 2'-альдегидсодержащими ДНК-дуплексами. Совокупность полученных данных в целом согласуется с нашими теоретическими предположениями, основанными па анализе модели комплекса N-концевой области М.Ssoll с регуляторным участком (Karyag'ma etal., 2003). Остатки Arg35 и Arg38 довольно «жестко закреплены» около ДНК, в то время как остальные аминокислотные остатки не столь критичны для взаимодействия с лигандом.
Нами впервые показано, что аминокислотные замены в N-концевой области SsoII-подобной МТазы EcllSkI влияют не только на ее способность регулировать транскрипцию в системе Р-М, но и на метилирующую активность фермента. В свою очередь замена Cys142 на Ala в области белка, ответственной за метилирование, приводит к увеличению его сродства к регуляторному участку в ДНК. Полученные данные свидетельствуют о существовании взаимосвязи между функционированием двух ДНК-связывающих центров Ssoll-подобных МТаз.
Принимая во внимание значительную структурную гомологию всех С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, включая эукариотические, результаты, полученные для М.Ssoll и M.EcllBkl, могут быть использованы для анализа принципов организации, структуры и механизма функционирования этих ферментов, а также для конструирования новых регуляторных белков, обладающих направленным влиянием на процесс регуляции в системах Р-М.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российских и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на конференции «Ломоносов-2006» (Москва, Россия, апрель 2006 г.), конференции «Ломоноеов-2007» (Москва, Россия, апрель 2007 г.), конференции «Offspring-Meeting of the International Research Training Group GicGen/Marburg-Moscovv» (Москва, Россия, февраль 2008 г.), конференции Spring-Meeting and Workshop «Proteinprotein interactions» (Раушхольцхаузен, Германия, март 2008 г.), IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008 г.) и конференции «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, апрель 2009 г.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен регуляции экспрессии генов в системах рестрикции-модификации прокариот на уровне транскрипции), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 84 рисунками, 5 схемами, 15 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 95 цитированных работ.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 07-04-00545 и программы РФФИ-ННИО «Международные исследовательские группы с участием молодых ученых» (гранты 08-04-91973 ННИОМа и IRTG GRK 1384).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Гены МТазы и ЭР системы Р-М Ssoll расположены в природной плазмиде Р4 (4250 н.н.) штамма Shigella sonnei 47. и направлены дивергентно; межгенная область составляет 109 н.н. (Karvagina et al., 1997). Описано, по крайней мере, еще десять Ssoll-подобных систем Р-М: Ecll8kl, Kpn2kl, StyD4L SenPI, BadAORF1283P, FpsJIPORF2150P, NlaCORFPP, PpuGBORF4748P, NlaXP, PspGl (http://tools.neb.com/), выделенных из различных бактериальных штаммов. Ферменты этих систем Р-М отличаются друг от друга 1-2 аминокислотными заменами, их генетическая организация практически идентична. В данной работе исследовано влияние М.Ssoll. SsoII-подобной М.Ecl 18kl и их мутантных форм на транскрипцию генов ферментов Р-М в системе Ssoll in vitro".
М.Ecl 18kl из штамма Enterobacter cloacea узнает в двутяжевой ДНК ту же пентануклеотидную последовательность, что и М.Ssoll (5'-CCNGG-3'/3'-GGNCC-5'), и в присутствии кофактора S-аденози л- L- метион ина (AdoMet) также метилирует внутренний остаток С в этой последовательности с образованием 5-метил-2'-дезоксицитидина (Denjmukhametov et al., 1998). Метилтрансфераза Ecíl8kl отличается от М.Ssoll только одной аминокислотой: в позиции 56 M.EcííSki содержит Met, а М.Ssoll -Не.
Мы изучили связывание М. Ecl 18kl с 31 -звенным синтетическим лигаидом -фрагментом промоторных областей Ssoll-подобных систем Р-М, содержащим регуляторный участок, установленный для М.Ssoll (выделен) (Воробьева и др., 2000).
5'-ATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAA-3' 3 1 -TAGTTTTGTCCTGTTTAACAGGATTTTGGTT-5' (дуплекс I)
Показано, что Kj комплекса М.Ecl 18kl с дуплексом 1 равна 224 ± 24 нМ и совпадает в пределах ошибки с Kd комплекса М.Ssoll с этим дуплексом (248 ± 33 нМ).
Для изучения транскрипции генов в системе Р-М Ssoll in vitro нами методом ГИДР был получен ДНК-фрагмент II длиной 247 н.п., содержащий межгенную область и участки начала обоих генов (представлен на рис. 1). Используя его в качестве матрицы,
" MHcllSkI, ее делеционная и мутантные формы любезно предоставлены Проценко A.C.. Захаровой М.В. и Солониным A.C. (ИБФМ РАН). М.Ssoll, M.Ssol)(CI42A) п M.NlaX - Карягмной A.C.. Лавровой H.B. (НИИЭиМ РАМН), Рязановой Е.М. и Тихоновой Т.В. (ВНИИСБ РАСХН). Фрагменты ДНК, в том числе модифицированные, синтезированы сотрудниками НИИФХБ и химического факультета МГУ Романовой Е.А. и Зацепиным Т.С. под руководством проф. Орецкой Т.С. Часть работы выполнялась в Институте биохимии Университета им. 10. Либиха (г. Г'иссен, Германия) под руководством проф. Фридхофа П. в рамках программы РФФИ-ННИО «Международные исследовательские группы с участием молодых ученых».
мы провели эксперименты по транскрипции в отсутствие и в присутствии M.SsoII или M.Ecll8kl. Для этого РНК-полимеразу Е. coli (РНКП) вначале инкубировали при 37°С с ДНК-фрагментом II в присутствии эквимолярного белку количества гепарина для предотвращения образования неспецифических комплексов, а затем добавляли в реакционную смесь четыре нуклеозид-5'-трифосфата (в том числе [a-32P]UTP). Было показано, что и M.SsoII, и M.Ecll8kI регулируют экспрессию генов в системе Р-М Ssoll (рис. 2). Уровень синтеза транскрипта с промотора гена ЭР в отсутствие МТазы невысок, однако при добавлении в реакционную смесь M.SsoII или M.Ecll8kI он возрастает. Синтез транскрипта с промотора гена МТазы в присутствии 4-кратного избытка M.Ecll 8kl или M.SsoII по отношению к РНК-полимеразе (в единицах активности) полностью подавляется. Полученные результаты дают основания говорить об общности механизмов функционирования систем Р-М Ssoll и Ecll8kl.
ДНК-фрагмент II (247 н.п.)
Res -ю 7Г~*
5'-TTGAGTCATA TGAAGTCTTT СТСТТТТТТС TTTGATTGTT GCTGCGATAT TATCAGTGAT GCATGTCTAC CAG|AATTAÄG|
M.SsoII
З'-AACTCAGTAT ACTTCAGAAA GAGAAAAAAG АААСТАДСАА CGACCCT AT А ATflGTCafÖTflj CGTACAGATG GT|gTTjWfcl
Res
-35 -IP *
ftGTTGGTTTT AGGACAATTT GTCCTgTTTT GRTTCCRRTT ATGUiftCglGC RTGARAAÄAC TTTCASGTñG KTRTAAAAGG
.............ЕХВ
1йСДДССДДДД TÍ\'Tt,TTMA С.АЖЖЛАДА UTftAflGTTAAl ГАГТТАСЛПС TflCTTTTTTG AAACTTCA1C £'ATM'ITXXJC ^_ti -10 -35
Met
ТТЙТТТТТ'1[Л TGfcAAAGATT AAGTCCTGGT GAATTTflftAA CTCTAATTTC TAAAGflCAGA AAGTCGCATT TTATTACGCC ATTTGCT-3'
R.SsoII
ftATRRflAAAT ftCGTTTCTAA ТТСЙДСЛССА СТТАЙАГТТТ ейЕМПМДе MTTCTCTCI TTCaCCGTAA UMMaGQGG ^HMCSfc-5'
Рис. 1. ДНК-фрагмент II, содержащий промоторную область генов системы Р-М Ssoll. Направления генов M.SsoII и R.SsoII показаны тонкими черными стрелками, начала кодирующих их последовательностей подчеркнуты, инициаторные кодоны отмечены прямоугольниками. Место посадки M.SsoII выделено серым цветом. Красным шрифтом и красными стрелками отмечен регуляторный участок M.SsoII, представляющий собой инвертированный повтор. Экспериментально установленные точки инициации транскрипции генов МТазы и ЭР выделены розовым цветом, промоторные области для них - синим. Теоретически предсказанная точка инициации транскрипции ЭР и промоторные области для нее отмечены фиолетовым цветом.
M.Ecll8kI
M.Sson
- РНК-200 ДНК 247 H. a
— РНК-120
Рис. 2. Анализ РНК-транскриптов с ДНК-фрагмента II (247 н.п.), содержащего межгенную область системы Р-М SsoII и участки начала генов ЭР и МТазы SsoII. А. Радиоавтограф 5%-го ПААГ после электрофореза в денатурирующих условиях. Б. Фотография геля после окрашивания раствором Sybr Gold. 1,4 — Продукты транскрипции в присутствии 4-кратного избытка M.EcllSkI или М. SsoII по отношению к РНК-полимеразе, 2, 3 — продукты транскрипции в отсутствие M.Ecll8kI или М.SsoII. R - РНК-транскрипт с промотора гена ЭР, М - РНК-транскрипт с промотора гена МТазы соответственно. РНК-М - РНК-маркер, длина фрагментов указана в нукпеотидных остатках (н.о.) справа.
1. Механизм регуляции транскрипции генов в системе Р-М SsoII
На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей родственных систем Р-М были теоретически предсказаны точки инициации транскрипции и промоторные области генов М.SsoII и R.SsoII (Karyagina et al, 1997) (рис. 1). Используя в качестве матрицы ДНК-фрагмент II длиной 247 н.п., содержащий межгенную область и начала участков обоих генов, мы провели эксперименты по транскрипции in vitro и оценили длины транскриитов генов ssoIIM и ssoJIR с помощью РНК-маркера (рис. 2). Оказалось, что длина транскрипта с промотора гена МТазы (-120 н.о.) сравнима с ожидаемой (111 н.о.), а длина транскрипта с промотора гена ЭР значительно больше (-200 н.о. вместо 122 н.о., предсказанных теоретически). По-видимому, точка инициации транскрипции гена R.SsoII удалена от точки инициации транскрипции гена М.SsoII. Для проверки этой гипотезы нами были синтезированы два фрагмента ДНК, содержащие предполагаемую точку инициации транскрипции гена ЭР: дуплекс III длиной 86 н.п. (включающий участок начала гена МТазы) и дуплекс IV длиной 110 н.п. (включающий и участок начала гена МТазы, и регуляторный участок) (рис. 3, А). Оба фрагмента ДНК в условиях образования открытого комплекса (в присутствии гепарина) связывались с РНК-полимеразой (рис. 3, Б). Следовательно, реальная точка инициации транскрипции гена ssollR действительно не соответствует предсказанной теоретически и расположена в области начала гена МТазы. Полученные нами результаты согласуются с опубликованными в 2009 г. данными Проценко и соавт., которые определили точки инициации транскрипции в SsoII-подобной системе Р-М Ecll8kl.
А Б 12 3 4
РНКП — + + —
_ _ ............v" -ДНК + РНКП
III * (86 н.п., ■Л™
^КН-в — лик™
iv + ДНК(Ш)--ЦНИИГ^^^^ 110r.ii.
(110 Н.П.! ШШШШО 86 и.л.
Выход комплекса
ДНК+РНКП, % 8 17
Рис. 3. А. Фрагменты ДНК длиной 86 н.п. (III) и 110 н.п. (IV). Стрелками показаны направления генов МТазы (М) и ЭР (R) Ssoll. Черным прямоугольником отмечен регуляторный участок M.SsoII. 1>. Анализ комплексообразовання ДНК-фрагментов III и IV (концентрация 15 нМ) с РНК-полимеразой Е. coli (концентрация 60 нМ) методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле (дорожки 2 и 3 соответственно). Дорожки I и 4-исходные фрагменты ДНК. Реакционные смеси содержали гепарин (300 нМ). Выходы ДНК-белковых комплексов приведены под дорожками геля.
Близкое расположение регуляторного участка и точки инициации транскрипции гена МТазы. и, более того, перекрывание последней с местом посадки M.SsoII, позволило нам предположить, что ингиброваиие МТазой транскрипции собственного гена обусловлено конкуренцией РНК-полимеразы и МТазы за участок связывания. Методом Скэтчарда мы определили константы диссоциации комплексов РНК-полимеразы и M.EcllSkl с ДНК-фрагментом V длиной 116 н.п., содержащим и регуляторный участок, и точку инициации транскрипции, и промоторные области гена ssoIIM (рис. 4). К^ комплекса РНК-полимеразы Е. coli с дуплексом V (25±1 нМ) оказалась в 2 раза больше, чем Ki( комплекса M.EcllSkl с этим ДНК-фрагментом (12±1 нМ). Поскольку ингибирование МТазой транскрипции собственного гена происходит при избытках фермента то, по-видимому, данного различия в эффсктивностях связывания с ДНК оказывается достаточно, чтобы конкуренция за участок узнавания смещалась в сторону МТазы, Такое соотношение констант диссоциации комплексов белков с ДНК, вероятно, поддерживает оптимальное функционирование системы Р-М в клетке, позволяя предотвратить преждевременное ингибирование собственного синтеза МТазы и обеспечивая специфического метилирование клеточной ДНК.
ДЬЖ-фрагмеш- Л' 11бн.п.
Я
шшпшшшшв
5' . . .-------АвЗЖСААГГТЗТССТ---------------------------------------------. . .3'
3' . . .-------тсстеттдмсавва-----с------таатас-----------------aaastt----. . .5'
+1 -10 -35
м
Рис. 4. ДНК-фрагмент V данной 116 и.п., содержащий межгенную область системы Р-М Ssoll (направления генов указаны стрелками М и R). Точка инициации транскрипции гена ssoIIM отмечена стрелкой с подписью +1 и М. -10 и -35 промоторные области выделены черным цветом. Серым шрифтом и соединяющимися стрелками отмечен регуляторный участок М.Ssoll.
Для того чтобы понять возможный механизм активации транскрипции гена ЭР, мы оценили эффективность взаимодействия РНК-полимеразы с двумя различными фрагментами ДНК, каждый из которых содержал соответственно только промотор гена МТазы (V) или только промотор гена ЭР (IV). Степень связывания РНК-полимеразы с дуплексом IV в 4 раза меньше, чем с дуплексом V (рис. 5). Таким образом, в отсутствие МТазы транскрипция идет в первую очередь с промотора гена ssoIlM, который является более сильным в данной системе.
12 3 4
РНКП — + + —
Igjr рнкт i> :i
Днк(У) | ав
Выход комплекса L_..............................—.....................................................................
ДНК+РНКП, % -39 11 -
Рис. 5. Анализ комплексообразования ДНК-фрагментов V и IV (концентрация 30 нМ) с РНК-полимеразой Е. coli (концентрация 190 нМ) методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле (дорожки 2 а 3 соответственно). Дорожки 1 и 4 - исходные фрагменты ДНК. Реакционные смеси содержали гепарин (300 нМ). Выходы ДНК-белковых комплексов приведены под дорожками геля.
ДНК (IV) ' 110 н.и.
м......
Res
-10 гет
,. Mi Met
R
1'нс. 6. Механизм регуляции в системе Р-М 11-го типа SsoII. А. Стадия проникновения в клетку: активный синтез МТазы для защиты хозяйской ДНК. Б. Состояние системы, обеспечивающее эффективную защиту клетки от инфекции бактериофагом: МТаза блокирует собственный синтез и активирует синтез ЭР. Белыми овалами обозначены молекулы РНК-полимеразы, темно-серым овалом - сигма субъединица РНК-полимеразы, белым и серым прямоугольниками - промоторы генов ЭР и МТазы соответственно, тонкими стрелками - стартовые точки
транскрипции генов ЭР и МТазы соответственно, черным прямоугольником .....регуляторный
участок, волнистыми линиями - РНК-транскрипты.
Исходя из полученных результатов, регуляцию в системе Р-М SsoII можно представить в виде следующей схемы: на стадии проникновения системы в клетку сильный промотор гена МТазы снижает активность слабого промотора гена ЭР, то есть наблюдается транскрипционная интерференция (при этом идет активный синтез МТазы для защиты хозяйской ДНК). Со временем нарабатывается определенное количество МТазы, обеспечивающее эффективную защиту клетки от инфекции бактериофагом. При этом осуществляется негативная авторегуляция: МТаза подавляет транскрипцию своего собственного гена. Как классический репрессор, связываясь с регуляторным участком, МТаза блокирует доступ РНК-полимеразы к промотору собственного гена (стерическое препятствие). Таким образом, МТаза косвенно стимулирует транскрипцию гена ЭР. освобождая его от транскрипционной интерференции (рис. 6).
Вероятно, при активации транскрипции с промотора гена ЭР происходит «сталкивание» комплекса МТазы с ДНК. Это может быть связано с понижением сродства МТазы к ДНК. «расплетенной» в процессе элонгации. Эта гипотеза подтверждается результатами ряда экспериментов. Так, М^оН не взаимодействует с одноцепочечной ДНК, содержащей регуляторный участок. Кроме того, нами были сконструированы модифицированные дуплексы, являющиеся структурными аналогами ДНК-дуплекса, содержащего регуляторный участок и содержащие один или два остатка тимидингликоля (Т") (табл. 1).
Таблица 1. Некоторые физико-химические характеристики тнмидингликольсодержашнх ДНК-дуплексов и их немоднфицированного аналога.
N ДНК-дуплекс *(5'-373'-5') tn.„"c (±1) К ,i комплекса дуплекса с M.Ecimi. нМ
1 atcaaaacaggacaaattgtcctaaaaccaa tagttttgtcctgtttaäcaggattttggtt 72 224+24
VI atcaaaacagga-caaattgtcctaaaaccaa tagttttgtcct3lgtttaacaggattttggtt 60 374±32
VII atcaaaacaggacaaattgt3lcctaaääccaa tagttttgtcctgtttaaca-ggattttgc-tt 62 363+25
VIII atcaaaacagga-caaattgt^cctaaaaccaa tag?tttgtcct91gtttaaca-ggattttggtt 49 >4000
—-----
•Жирным шрифтом выделен регуляторный участок. т - остаток 5,6-дишдро-5,6-дигпдрокситимидина. концентрация ДНК-дуплексов при определении Т„л составляла 2,05-2.55 мкМ.
Введение одной модификации в дуплекс (VI и VII) приводит к его дестабилизации на 8-12°С по сравнению с [«модифицированным дуплексом (I) и понижает сродство M.Ecl 18kl к ДНК-лиганду примерно в 1,5 раза. Для ДНК-дуплекса VIII. содержащего два остатка "Г (по одному в каждой цепи) и имеющего Тп, на 23°С ниже чем ^модифицированный дуплекс 1, при 50-240-кратных избытках M.EcllSkI относительно ДНК комплекс не был зафиксирован. Таким образом, можно заключить, что дестабилизация двойной спирали в регуляторном участке препятствует связыванию Ssoll-подобных метилтрансфераз с ДНК.
2. Свойства делециониых производных M.SsolI и \l.EcI18kI
Как уже упоминалось, M.Ecl 18kl и M.SsolI представляют собой уникальные
бифункциональные белки: с одной стороны, каждый из них это фактор транскрипции в
своей системе Р-М, а с другой - фермент, катализирующий реакцию метилирования.
Известно, что регуляция осуществляется благодаря специфическому взаимодействию N-
концевой области M.SsolI (аминокислотные остатки 1-71) с промоторной областью генов
системы Р-М Ssoll (Karyagina el ai, 1997). Области M.SsoIl и M.EcllSkl с 72 по 379 a.o. обеспечивают другую функцию этих белков - метилирование ДНК.
Взаимосвязаны ли две ДНК-связываюише активности этих МТаз, или области, ответственные за регуляцию п метилирование, могут функционировать независимо',' Для ответа на этот вопрос требовалось сконструировать два делеционных мутанта M.SsoIl (или M.EcllSkl), один из которых представлял собой N-концевую область МТазы, а другой являлся областью белка, ответственной за метилирование, и изучить их свойства.
Нами были изучены свойства делеционного производного Ssoll-подобной метилтрансферазы EcllSkl - Д(72-379)Ес1181<1. в котором удалена область белка, ответственная за метилирование ДНК. На основе размера, строения и функции N-концевой области M.SsoIl или M.EcllSkl, можно сделать предположение, что она аналогична С-белкам, регулирующим экспрессию в других системах рестрикции-модификации. Эти белки обладают высоким сродством к операторной последовательности ДНК (Streeter el al.. 2004: Swaya el al.. 2005). Однако наши результаты свидетельствуют об отсутствии связывания белка A(72-379)Ecll8kI с 31-звенным ДНК-дуплексом 1. содержащим регуляторный участок (рис. 7).
Отсутствие ДНК-белкового комплекса в наших экспериментах может быть связано с недостаточной длиной ДНК-дуплекса I и. как следствие, низким сродством к нему Д(72-379)Ec!l8kI. Возможно, делеционный мутант связывается с более протяженной ДНК. содержащей промоторную область генов системы Р-М Ssoll. Логично предположить, что в этом случае он должен регулировать экспрессию генов этой системы.
Чтобы выяснить, может ли изолированный N-концевой фрагмент M.EcllSkl выступать в роли регуляторного белка, мы изучили транскрипцию ichob .v.vulIR и ssoilM ш vitro в присутствии A(72-379)Ecll8kl. В контрольном эксперименте использовали полноразмерную M.EcllSkl. Как видно из рис. 8. в присутствии M.EcllSkl наблюдается увеличение количества РНК-транскрипта, синтезирующегося с промотора гена ЭР, и уменьшение количества РНК-транскрипта, синтезирующегося с промотора гена МТазы. в зависимости от концентрации МТазы в смеси. При добавлении в реакционную смесь полипептида A(72-379)Ecll8kI наблюдается тот же результат, что и при полном отсутствии белка: большее количество РНК-транскрипта с промотора гена МТазы по сравнению с количеством РНК-транскрипта с промотора гена ЭР. Очевидно, что
1 2
ДНК-белковый комплекс
Рис. 7. Анализ равновесного связывания 5'- 2Р-меченного ДНК-дуплекса I (концентрация 20 нМ) с Д(72-379)Ес11Ш (2000 нМ, дорожка I) и M.Ecll 8kl (150 нМ, дорожка 2) методом «торможения» в геле.
дедеционная форма метилтрансферазы Л(72-379)Ес118к1 не способна быть транскрипционным фактором. Вероятно, это связано с очень низким сродством А(72-379)Кс118к1 к промоторной области системы Р-М ЗбоП. Таким образом, наличие области, ответственной за метилирование, необходимо для эффективного связывания М-концевого фрагмента МТазы с регуляторным участком и поддержания регуляторной функции белка.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Аналш РНК-транскринтов с
ДНК-фрагмента II методом
— ~~ ,/////У/У/ электрофореза в 5%-ном Г1ААГ,
' ЦТ' * содержащем 7 М мочевину. I. 8
1'|! !; Т | ' : {) Продукты транскрипции в отсутствие П ! * • |'|И| Г || М.Ес118к1. 7, 14 - продукты
ЙМЦН—I«Ы( 11 транскрипции в присутствии
К
м-
М.Ее118к1 (4,5 мкМ). 2 - 6 - Продукты транскрипции в присутствии возрастающего количества ¿\( 72-379)Ес118к1 (0.15: 0,45; 1,3; 2,5 и 3
мкМ), 9-13.....продукты транскрипции
в присутствии возрастающего количества М.ЕсПШ (0,4; 0,7; 1: 2 и 3 мкМ). К - РНК-транскрнпт с промотора гена ЭР. М......РНК-транскрипт с промотора гена МТазы соответственно.
В этом и предшествующих исследованиях выделить гомогенный препарат А( 1-7ПЕс118к1 в количествах, необходимых для молекулярно-биологичееких исследований, не удалось. Поэтому для детального исследования влияния М-концевой области на взаимодействие М.ЗэоП с участком метилирования мы предложили изучить свойства метилтрансферазы М1аХ (ММаХ). которая по существу является природным делециониым производным М.БбоН (КиЬагега е( о/. 2002). Единственным существенным отличием двух ферментов является отсутствие в структуре МЛчЧаХ М-концевой части длиной в 70 а.о.
Установлено, что Ка комплекса М.М1аХ с 30-звенным ДНК-лигандом IX, содержащим участок метилирования, (162 ± 18 нМ) совпадает в пределах ошибки со шачснисм комплекса М.ЯноИ с этим субстратом (144 х 14 нМ). Вместе с тем, М.ЯхоП примерно в 3 раза эффективнее метилирует дуплекс II по сравнению с М.М1аХ.
5'-САТССТСССАДССТОССТСТАССТТСАТАС-З1 3'~СТАССАС6СТТСвАСС6А6АТС5ААСТАТС-5' (дуплекс IX)
Таким образом, продемонстрирована взаимосвязь между двумя ДНК-связывающими центрами М&оП-подобных белков. Так, отсутствие первых 70 а.о., предшествующих первому консервативному мотиву С5-цитозиновых метилтрансфераз М.&оП и М.Ес118к1, приводит к снижению эффективности катализа переноса метальной группы с кофактора на ДНК. Наличие области ЗзоП-подобной МТазы, ответственной за метилирование, существенно для связывания белка с регуляторным участком.
Структурное и функциональное сходство N-концсвых областей М'Газ и С-бслкон позволяет предположить, что Ssoll-подобные прокариотпческне метнлтрансферазы с Рукописной регулягорпоп областью могли образоваться при слиянии гомолога С-белка и метилтрансфсразы.
3. Свойства мутантных форм M.Ssoll и M.Ecll8kI, содержащих единичные аминокислотные замены
3.1. Мутантныс формы M.EclISkI, содержащие замены в N-копцепой области белка Основываясь на модели комплекса N-концевой области M.Ssoll с регуляторным участком (Kairagina et al., 2003), было высказано предположение о взаимодействии остатков Lys2l, Lys31, Arg35. Arg38. Arg39 и Arg42 с ДНК (Kan-agina et al.. 2003). Действительно ли эти аминокислотные остатки вовлечены в связывание с 15-звенным инвертированным повтором? Определяют ли они способность Ssoll-нодобных МТаз регулировать экспрессию генов в система Р-М? Мы изучили свойства мутантных форм M.Ecll8kI, в которых один из перечисленных остатков заменен на Ala. Мутантныс формы M.EclISkI с заменами R15A, К.46А и К.53А предполагалось использовать в качестве контролен.
Для оценки сродства мутантных форм M.EclISkI с единичными аминокислотными заменами к 31-звенпому дуплексу I, содержащему регуляторпый участок, определяли константы диссоциации белково-нуклеиновых комплексов методом Сютчарда. Значения констант диссоциации комплексов приведены в табл. 2.
Таблица 2. Характеристика ДНК-связывающей. регуляторнон и метилирующей активностей M.EclISkI и ее мутантных форм.__________
М Газы Kd комплекса .MTiHbi с дуплексом l с регуляторным участком, нМ Olli, выход трапскршпа па единицу акгшшон концентрации М'Гачы Kd комплекса МТачи с дуплексом 1.4 с метилируемым участком, иМ Отн. кама.'и.ияя СКОрОСТЬ метилирования
wt EcllSkl 224±24 1 87±12 I
EcI18kl(R15A) 56±13 0,4 103±24 0.4
Ecll8kI(K21A) 48±9 3,9 87±3 38
EcI18kI(K31A) 198±29 I 26 ±3 29
EclI8kI(R35A) >4000 нет 140±12 1,6
EcI18kI(R38A) >4000 нет %±13 11
Ecl18kI(R39A) 93±14 0,4 266±4 22
Ecll8kI(R42A) 32±2 2,5 256±4 0,3
Edl8kI(K46A) 250±32 13,5 >4000 пет
EclJ8kI(K53A) 206±7 1.8 >4000 пег
М.1-с118к1(Я35Л) и М.Ес118к1(ЮХЛ) практически не взаимодействуют с ДНК-лигаидом 1. то есть можно предположить, что остатки Агс35 и Агд38 играют ключевую роль в связывании регуляторпого участка, либо их замена существенным образом меняет структуру белка.
Отсутствие контактов остатков 1^21 и ЬуяЗ! М.Ес118к1 с углеводофосфатным остовом регуляторпого участка было показано методом аффинной модификации белка и его мутантных форм ДНК-дуплексами, содержащими 2'-0-(2-оксоэтил)уридиновые звенья. 2'-Альдегидная группировка таких ДНК способна селективно взаимодействовать с пространственно сближенными Е-аминогруннами остатков лизина в составе белково-пуклеинового комплекса (схема 1). Места введения остатков 2'-0-(2-оксоэтил)уридина в ДНК были выбраны исходя из схемы контактов димера М.8«>П или М.Ес118к1 с регуляторпым участком (табл. 3).
r'o-1 0 ■ me.
О
? à I
0=Р-0' v н or'
R , R"-фрагменты олигонуклеотидной цени.
Схема 1.
В результате были сконструированы модифицированные дуплексы X-XIII, являющиеся структурными аналогами ДНК-дуплекса I и содержащие одну альдегидную группу в 2'-положении углеводного фрагмента. Модифицированный дуплекс XÍV. без регуляторпого участка ДНК использовали в качестве контроля (табл. 3). Аффинной модификации 2'-альдегидсодержащими ДНК были подвергнуты мутаптные формы метилтрансферазы: M.Ecll8kI(K2IA), M.Ecll8kl(K3IA), M.EclI8kI(K46A) и M.Ecll8kI(K53A). Если бы какой-то из рассматриваемых остатков Lys контактировал с модифицированной группировкой, то при его замене на Ala белково-нуклеиновыи конъюгат бы не образовывался. Оказалось, что все мутаптные формы М.Ес118к1 эффективно взаимодействовали с дуплексами X-XIII, содержащими регуляторный участок (табл. 3). Однако для M.Ecll 8kI(K31A) обнаружено примерно 1.5-2-кратное падение эффективности образования комплекса, в котором белок ковалентно связан, с модифицированным дуплексом X. Аналогичный эффект наблюдался при взаимодействии М.Ес11Ш(К46А) с ДНК-дуплексом XI. Подобные результаты, однако, не являются доказательством участия каждого из этих остатков лизина в образовании
конъюгата с реакционноспособными олигонуклеотидами, входящим в состав указанных дуплексов. Возможно, с 2'-0-2-оксоэтильной группой в дуплексах Х-ХШ сближено несколько остатков лизина, в том числе и обсуждаемые выше. Не исключено также опосредованное влияние проведенных аминокислотных замен на сближенность с модифицированным звеном другого остатка лизина, образующего ковалентную связь с ДНК-лигандом.
Регуляторную активность всех мутантных форм M.Ecll8kI проверяли, проводя транскрипцию in vitro. Установлено, что M.Ecll8kI(R35A) и M.Ecll8kI(R38A) не способны регулировать транскрипцию генов в системе Р-М M.SsoII (табл. 2). Вероятно, это связано с их низким сродством к промоторной области системы рестрикции-модификации.
Таблица 3. Эффективность ковалентного связывания М.Ес118к1 и ее мутантных форм с ДНК-дуплексами, содержащими альдегидную группу в 2'-положении углеводного фрагмента._
№ ДНК-дуплекс* (5'-»3-) Выход ДНК-белкового конъюгата, %
M.Ecll8kI Мутантные формы M.Ecll8kI
К21А К31А К46А К53А
X АТС AAAACAGGACAAATXGTCCT ААААСС АА TAGTTTTGTCCTGTTJAACAGGATTTTGGTT 32±6 22±3 16±2 24±4 25±5
XI ATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAA TAGTTTTGTCCTGTTJAACAGGAXTTTGGTT 18±2 20±3 15±3 11±3 18±2
XII ATCAAAACAGGACAAATTGXCCTAAAACCAA TAGTITTGTCCTGTT TAACAGGATtttggtt 30±5 30±4 22±5 22±4 27±4
Х1П ATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAA TAGTTTTGXCCTGTT2AACAGGATTTTGGTT 40±6 37±7 38±6 41±7 51±6
XIV catacgaxgatccattcgct gtatgctactaggtaagcga 3±1 2±1 3±1 2±1 2±1
*Жирным шрифтом выделен регуляторный участок, X - остаток 2'-0-(2-оксоэтил)уридина.
В присутствии мутантных форм М.Ес118к1, способных связываться с регуляторным участком, наблюдается увеличение количества РНК-транскрипта, синтезирующегося с промотора гена эндонуклеазы рестрикции, и уменьшение количества РНК-транскрипта, синтезирующегося с промотора гена метилтрансферазы, что свидетельствует о способности данных белков регулировать транскрипцию (рис. 7). Для характеристики регуляторной активности МТаз определяли процент выхода РНК-транскриптов и строили кривые зависимости этой величины от концентрации МТаз в единицах активности. За единицу активности каждого белка принимали единицу его активной концентрации. Эффективность транскрипции с ДНК-фрагмента II оценивали по
увеличению относительного выхода транскрипта с промотора гена ЭР на единицу активной концентрации МТазы. Эти величины рассчитывали как отношение значения углового коэффициента (тангенса угла наклона) начального прямолинейного участка кривой для каждой из МТаз к значению углового коэффициента для М.Ес118к1 (рис. 7, А; табл. 2).
150 200 250 300
С, ед. акт.
150 200 250
С, ед. акт.
Рис. 7. Графики зависимости выхода РНК-транскрипта с гена (А) или с гена юо//М (Б) от концентрации М.Ес118к1 (♦) и ее мугантных форм М.Ес118к1(К15А) - М.Ес118к1(К21 А) М.Ес118к1(К31А) - * , М.Ес118кШША) М.Ес118к1(Я42А) М.Ес118к1(К46А) - в, М.Ес118к1(К53А) - т.
Нами впервые показано, что аминокислотные замены в регуляторной области М.Ес118к1 влияют на ее способность регулировать транскрипцию в системе Р-М. Различная динамика изменения выхода РНК-транскриптов в условиях одинаковой активной концентрации мутантных форм МТазы стала интересным и неожиданным результатом. Мы полагали, что мутантные формы, обладающие высоким сродством к регуляторному участку, должны эффективнее регулировать транскрипцию, а низким -соответственно меньше влиять на данный процесс. Отсутствие такой корреляции, возможно, связано с тем, что величина К^ отражает термодинамическую стабильность комплекса МТазы с ДНК, а относительный выход продукта транскрипции на единицу активной концентрации МТазы косвенным образом характеризует скорость образования комплекса МТазы с ДНК, то есть является кинетической характеристикой процесса.
С целью дальнейшего изучения взаимного влияния двух ДНК-связывающих центров БвоИ-подобных МТаз мы исследовали способность всех мутантных форм М.Ее118к1 взаимодействовать с участком метилирования. Значения К^ комплексов МТаз с 30-звенным дуплексом IX и относительные начальные скорости его метилирования ферментами приведены в табл. 2. Очевидно, что аминокислотные замены в области
M.EcllSkl, ответственной '!a регуляцию, шшяюг па способность белка евтываи. и мет нлировать субстрат.
3.2. Мутантнан форма M.SsolI, содержащая замену в области, ответственной за метилирование
Остаток Cysl42 является единственным остатком цисгеина в молекулах M.SsolI н M.licl 18kT. Он входит в состав консервативного для всех С5-ш1гознновых метилтрансфсраз дипеитнда ProCys, играющего ключевую роль в катализе переноса метальной группы с кофактора реакции AdoMet па ДНК-субстрат (Cheng et al., 1993). Ранее было показано, что замена Cysl42 на Ala в молекуле M.SsolI приводит к потере белком ферментативной активности, однако мутаптпый белок сохраняет способность связываться с участком метилирования, хотя и менее эффективно по сравнению с исходной M.SsolI (Воробьева, 2004). Эти данные коррелируют с результатами, полученными в нашей работе и представленными в табл. 4. Мы впервые показали, что «выключение» метилирующей функции повышает сродство M.Sso!I(C 142А) к регуляторной последовательности примерно в 7 раз по сравнению с wt M.SsolI и wi M.EcllSkl. При этом M.SsoII(C142A) сохраняет способность регулировать транскрипцию в системе I'-M Ssoll на том же уровне, чю и исходный белок (latvi. I).
Таблица 4. Характеристика свойств М.Sso! 1 (С142Л) в сравнении с M.SsolI и M.EcllSkl.
M.Sso»(C142A) wt M.SsolI >vt M.EcllSkl
Кл комплекса белка с дуплексом IX с участком метилирования, нМ 172 ± 10 144 ± 14 87 ± 12
Относительная начальная скорое н, метилирования дуплекса IX IICI 1 1
Кй комплекса белка с дуплексом I с регуляторным участком, нМ 35 ±3 248 ±33 224 ± 24
Относительный выход транскрипта па единицу акт ивной концентрации МТазы 1 1 1
Таким образом, очевидна взаимосвязь между функционированием двух ДНК-связывающнх центров Ssoll-подобпых белков. Аминокислотные замены в регуляторной области белка влияют на сю способность метилирован, субарат. Cyiueeiujei и обратная зависимость - отсутствие ферментативной активности в полноразмерном белке приводит к увеличению его сродства к регуляторному участку в ДИК (замена Cys 142 на Ala), хотя и не влияет на регуляторную функцию. Вместе с тем делеционный мутант Д(72-37У)Ес118к1, в котором отсутствует вся область белка, ответственная за метилирование, не связывается с регуляторным участком ДНК и теряет способность выступать в роли фактора транскрипции.
выводы
1. Установлено, что ферменты модификации - С5-цнтозиновая ДНК-метилтрансфераза SsoII и Ssoll-подобная метилтрансфераза Ecll8kl - оказывают влияние па транскрипцию генов системы рестрикции-модификации SsoII in vitro.
2. Показано, что ингибированне транскрипции собственного гена SsoII-подобными метилтрансферазами обусловлено конкуренцией РНК-полимеразы и фермента модификации за участок связывания вблизи промотора гена метилтрансферазы. Активация транскрипции гена эидопуклеазы рестрикции SsoII происходит за счет исчезновения транскрипционной интерференции в результате связывания фермента модификации с рогуля горным участком.
3. Впервые продемонстрировано, что наличие области белка, ответственной за метилирование, необходимо для эффективного связывания Ssoll-подобных метилтрапсфераз с регуляторным участком и выполнения этими ферментами функции факторов транскрипции.
4. Показано, что замена остатков Arg35 или Arg38 метилтрансферазы EcllSkl на алашш приводит к существенному ухудшению связывания белка с регуляторным участком.
5. Впервые обнаружена взаимосвязь между функционированием двух ДН!-С-узнающих центров SsolI-нодобиых метилтрансфераз. Аминокислотные замены в регуляторной области фермента модификации EcllSkl влияют на его способность метилировать субстрат. Существует и обратная зависимость: «выключение» каталитической функции метилтрансферазы SsoII приводит к увеличению сродства мутантной формы белка к регуляторной последовательности.
Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:
1. Федотова Е.А., Проценко A.C., Захарова М.В., Лаврова Н.В., Алексеевский A.B., Орецкая Т.С., Карягина A.C., Солонин A.C., Кубарева Е.А. Ssoll-подобиая ДНК-метилтрансфераза Ecll8kl: взаимосвязь между регуляторной и метилирующей функциями. И Биохимия (2009) 74, вып. 1, С. 109-116.
2. Yang F., Romanova Е., Kubareva Е., Dolinnaya N., Gajdos V., Burenina О., Fedotova E., Ellis J.S., Oretskaya Т., Hianik Т., Thompson M. Detection of DNA damage: effect of thymidine glycol residues on the thermodynamic, substrate and interfacial acoustic properties of oligonucleotide duplexes. II Analyst (2009) 134, N 1, C. 41-51.
3. Федотова E.A., Ян Ф., Кубарева Е.А., Романова Е.А., Проценко A.C., Вирясов М.Б., Гианик Т., Орецкая Т.С. Синтез и свойства модифицированных ДНК-фрагментов с включениями тимидингликоля. II Биоорганическая химия (2008) 34, N2, С. 215-222.
4. Федотова Е.А., Проценко A.C. Влияние аминокислотных замен на функционирование ДНК-метилтрансферазы Ssoll как регуляторного белка. // Материалы международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006». Химия. Т. 2. С. 56.
5. Бабаян Т.А., Федотова Е.А., Ершова A.C., Проценко A.C. Регуляция в системе рестрикции-модификации Ecll8kl // Материалы международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007». Биоиженерия и биоинформатика. С. 20-21.
6. Fedotova Е., Kubareva Е. Determination of dissociation constants using Scatchard method. // Offspring-Meeting of the International Research Training Group Gießen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded). 12th-15th of February 2008. Moscow. P. 14.
7. Fedotova E., Protsenko A., Zakharova M., Solonin A., Oretskaya Т., Kubareva E. (Cytosine-5)-DNA methyltransferase Ecll8kl: interrelation between methylation and regulatory functions. // Spring-Meeting and Workshop «Protein-protein interactions». 9"42th of March 2008. Schloß Rauischholzhausen, Germany. P. 9.
8. Орецкая T.C., Ле Тхи Хиен, Фань Ян, Федотова Е.А. Модифицированные олигонуклеотиды: химия и молекулярно-биологические исследования. // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11.05 - 15.05.2008, Новосибирск, Россия. С. 99.
9. Буренина О.Ю., Бабаян Т.А., Федотова Е.А. Особенности регуляции в системе рестрикции-модификации Ssoll. // Материалы международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2009». Секция «Химия». Подсекция «Науки о живом». С. 5.
" Н2-а/11/09 Подписано в печать 18.11.2009 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 1
ООО "Цпфровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-та'й:info@cfr.ru
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. Регуляция в системах рестрикции-модификации прокариот (Обзор литературы).
1.1. Явление рестрикции-модификации.
1.2. Распространение и роль систем рестрикции-модификации.
1.3. Молекулярная организация систем рестрикции-модификации П-го типа.
1.4. Регуляция активности генов метилтрансфераз и эндонуклеаз рестрикции в системах рестрикции-модификации Н-го типа.
1.4.1. Регуляция в системах рестрикции-модификации П-го типа, опосредованная Сб елками.
1.4.1.1. Пространственная структура С-белков.
1.4.2. Регуляция в системах рестрикции-модификации посредством метилирования ДНК.
1.4.3. Регуляция в системах рестрикции-модификации с участием С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз.
1.5. Общая характеристика структурных и функциональных свойств ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. coli.
I. 6. Механизмы транскрипционной интерференции.
ГЛАВА II. Изучение особенностей регуляции в системе рестрикции-модификации SsoII (Обсуждение результатов).
II.1. Характеристика SsoII-подобной метилтрансферазы EcllSkl.
11.2. Изучение влияния метилтрансфераз SsoII и EcllSkl на транскрипцию генов ферментов рестрикции-модификации в системе SsoII in vitro.
11.3. Изучение механизма регуляции транскрипции генов в системе рестрикции-модификации SsoII.
11.4. Исследование способности метилтрансферазы Ecll8kl к димеризации при взаимодействии с регуляторным участком с помощью бифункциональных сшивающих агентов.
И.5. Свойства делецнонных производных метилтрансфераз SsoILh EcI18kI
11.5.1. Делеционное производное Д(72-379)Ес118к1.
11.5.2. M.NlaX - природный аналог делеционного мутанта A(l-70)SsoII.
II.6. Свойства мутантных форм метилтрансфераз SsoII и EcllSkl, содержащих единичные аминокислотные замены.
11.6.1 Мутантные формы метилтрансферазы Ес118к1, содержащие замены в N-концевой области белка.
II.6.2. Мутаитная форма M.SsoII, содержащая замену в области, ответственной за метилирование.
ГЛАВА III. Экспериментальная часть.
III.1. Реактивы и материалы.
111.2. Приборы и методы.
111.3. Общие методики.
ВЫВОДЫ.
Системы рестрикции-модификации (Р-М) широко распространены в бактериальных клетках и содержат гены, кодирующие ферменты рестрикции (эндонуклеаза, ЭР) и модификации (метилтрансфераза, МТаза). Системы Р-М могут выступать в роли дискретных форм жизни аналогично вирусам и транспозонам [1]. Эндонуклеаза рестрикции гидрозшзует вторгающуюся ДНК, не модифицированную должным образом, то есть система Р-М выполняет функцию примитивной иммунной системы, защищающей бактерию-хозяина от проникновения чужеродной ДНК. Также в некоторых случаях было показано, что системы Р-М могут вести себя как эгоистичные мобильные элементы и вызывать перестройку генома. После закрепления системы Р-М в геномной ДНК она становится жизненно важной для бактерии. При потере клеткой системы Р-М долгоживущая (по сравнению с метилтрансферазой) эндонуклеаза рестрикции неминуемо приведет к гибели клетки [2].
Долгие годы основным аспектом исследования ферментов систем рестрикции-модификации (Р-М) 11-го типа являлось изучение белково-нуклеинового узнавания, связанного с выполнением их непосредственных функций - гидролиза ДНК или метилирования одного из оснований в цепи ДНК в строго определенном месте. Однако в последнее время системы Р-М все больше привлекают исследователей с точки зрения характеристики регуляции экспрессии генов, которая играет чрезвычайно важную роль при функционировании этих систем в клетках бактерий. Это связано с тем, что эндонуклеазы рестрикции представляют собой белки, потенциально опасные для экспрессирующей их клетки-хозяина. Нарушение функции специфического метилирования ДНК клетки-хозяина также может приводить к её гибели за счет расщепления собственной ДНК. В то же время, соотношение внутриклеточной активности МТазы и ЭР должно быть таким, чтобы ЭР могла гидролизовать чужеродную ДНК до того, как она будет специфически модифицирована МТазой. Поскольку многие системы Р-М определяются автономно реплицирующимися элементами — плазмидами и вирусами, можно предположить, что при их переносе из одного организма в другой регуляция экспрессии генов МТазы и ЭР должна осуществляться самой системой.
Однако, несмотря на очевидное существование регуляции экспрессии генов систем Р-М [1], на сегодняшний день крайне мало известно о возможных механизмах реализации этого процесса. Это обстоятельство определяет актуальность всестороннего изучения процесса регуляции экспрессии генов в системах рестрикции-модификации.
Исследования регуляции активности генов в системах Р-М, проведенные в последнее время, показали, что не существует универсального механизма этого процесса. Однако регуляция на уровне транскрипции, по-видимому, является определяющим механизмом координированной экспрессии генов систем Р-М. Выделяют 3 основных типа подобной регуляции систем Р-М: посредством С-белков (от английского слова «control»), посредством метилирования промоторной области системы Р-М МТазой, а также посредством взаимодействия МТаз с регуляторными последовательностями ДНК, отличными от участка метилирования. Последний тип регуляции характерен для С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз [3].
Объектом нашего исследования является система Р-М И-го типа SsoII, обнаруженная в штамме Shigella sonnei 47. Эта система является уникальной среди других систем Р-М, для которых описана регуляция экспрессии генов посредством С5-цитозиновых ДНК-МТаз (Mspl, EcoRII, ScrFI, LlaJI). Показано, что помимо авторегуляторной функции -ингибирования собственного синтеза — МТаза SsoII (M.SsoII) активирует транскрипцию гена ЭР SsoII. Регуляция в этой системе осуществляется благодаря специфическому взаимодействию N-концевой области M.SsoII (1-71 а.о.) с промоторной областью генов системы Р-М SsoII [4, 5]. Основное число контактов с M.SsoII обеспечивает локализованный внутри промоторной области 15-звенный инвертированный повтор (регуляторный участок) [6]. Несмотря на активное изучение взаимодействия M.SsoII с регуляторным участком собственно механизм регуляции экспрессии генов в системе Р-М M.SsoII оставался невыясненным. Вместе с тем, всестороннее исследование этого процесса, возможно, позволит выявить закономерности регуляции экспрессии генов в прокариотических клетках и глубже понять его основные аспекты.
Целью настоящей работы являлось установление особенностей механизма регуляции в системе рестрикции-модификации SsoII. В задачи работы входило изучение in vitro транскрипции генов системы Р-М SsoII в присутствии и в отсутствие метилтрансферазы SsoII и SsoII-подобной МТазы Ecll8kl, а также оценка эффективности комплексообразования МТазы и РНК-полимеразы Е. coli с фрагментами ДНК, содержащими регуляторные элементы генов системы Р-М SsoII.
Необходимо было выяснить способен ли полипептид, представляющий собой N-концевую область M.SsoII (1-71 а.о.), выступать в роли фактора транскрипции, то есть связываться с промоторной областью генов системы Р-М SsoII и регулировать их экспрессию. Особое внимание было уделено исследованию роли отдельных аминокислотных остатков N-концевой области МТазы во взаимодействии с регуляторным участком и их влиянию на транскрипционную активность фермента.
Отдельной задачей в рамках настоящего исследования стало выявление взаимосвязи между регуляторной и метилирующей функциями M.SsoII. Для этого были изучены свойства мутантных форм МТаз M.SsoII и SsoII-подобной M.Ecll8kI.
выводы
1. Установлено, что ферменты модификации - С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SsoII и SsoII-подобная метилтрансфераза Ecll8kl - оказывают влияние на транскрипцию генов системы рестрикции-модификации SsoII in vitro.
2. Показано, что ингибирование транскрипции собственного гена SsoII-подобными метилтрансферазами обусловлено конкуренцией РНК-полимеразы и фермента модификации за участок связывания вблизи промотора гена метилтрансферазы. Активация транскрипции гена эндонуклеазы рестрикции SsoII происходит за счет исчезновения транскрипционной интерференции в результате связывания фермента модификации с регуляторным участком.
3. Впервые продемонстрировано, что наличие области белка, ответственной за метилирование, необходимо для эффективного связывания SsoII-подобных метилтрансфераз с регуляторным участком и выполнения этими ферментами функции факторов транскрипции.
4. Показано, что замена остатков Arg35 или Arg38 метилтрансферазы Ecll8kl на аланин приводит к существенному ухудшению связывания белка с регуляторным участком.
5. Впервые обнаружена взаимосвязь между функционированием двух ДНК-узнающих центров SsoII-подобных метилтрансфераз. Аминокислотные замены в регуляторной области фермента модификации Ecll8kl влияют на его способность метилировать субстрат. Существует и обратная зависимость: «выключение» каталитической функции метилтрансферазы SsoII приводит к увеличению сродства мутантной формы белка к регуляторной последовательности.
1. Kobayashi I. Behaviour of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome evolution. //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 3742-3756.
2. Rocha E.P., Danchin A., Viari A. Evolutionary role of restriction/modification systems as revealed by comparative genome analysis. // Genome Res. 2001. V. 11 P. 946-958.
3. Нагорных M.O., Богданова E.C., Проценко A.C., Захарова М.В., Северинов К.В. Регуляция экирессии генов систем рестрикции-модификации второго типа. // Генетика. 2008. Т. 44. С. 1-10.
4. Shilov I., Tashlitsky V., Khodoun M., Vasil'ev S., Alekseev Y., Kuzubov A., Kubareva E., Karyagina A. DNA-methyltransferase SsoII interaction with own promoter region binding site. //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 2659-2664.
5. Воробьева О.В., Васильев С.А., Карягина А.С., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Анализ контактов между ДНК и белком в комплексе метилтрансфераза SsoII-промоторная область генов системы рестрикции-модификации SsoII. // Мол. биология. 2000. Т. 34. С. 1074-1080.
6. Bertani G., Weigle J.J. Host-controlled variation in bacterial viruses. // J. Bacteriol. 1953. V. 65. P. 113-121.
7. Luria S.E., Human M.L. A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses. // J. Bacteriol. 1952. V. 64. P. 557-569.
8. Arber W., Dussoix D. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. Host controlled modification of bacteriophage lambda. // J. Mol. Biol. 1952. V. 5. P. 18-36.
9. Lepikhov К., Tchernov A., Zheleznaja L., Matvienko N., Walter J., Trautner T.A. Characterization of the type IV restriction modification system BspLUllIII from Bacillus sp. LU11. //Nucleic Acids Res. 2001. V. 15. P. 4691-4698.
10. Roberts R.J., Cheng X. Base flipping. // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 181-198.
11. Pingoud A., Fuxrreiter M., Pingoud V., Wende W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. // Cell. Mol. Life Sci. 2005. V. 62. P. 6^5-101.
12. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliand G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The protein data bank. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 235-242.
13. Roberts R.J., Vincze Т., Posfai J., Macelis D. REBASE-enzymes and genes for DNA restriction and modification. // Nucleic Acids Res. 2007. Database issue. D269-D270.
14. Kobayashi I. Restriction-modification systems as minimal forms of life. / In: Restriction endonucleases. Ed. Pingoud A. // Berlin: Springer. 2004. P. 19-62.
15. Xia Y., Burbank D.E., Van Etten J.L. Restriction endonuclease activity induced by NC-1A virus infection of a Chlorella-\ike green alga. // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 6017-6030.
16. Янулайтис А. А., Стакенас П.С., Пятрушите М.П., Битинайте Ю.Б., Климашаускас С.Й., Буткус В.В. Изучение специфичности новых рестриктаз и метилаз. Необычная модификация цитозина по 4-ому положению. // Мол. биология. 1984. Т. 18. С. 115-129.
17. Ives C.L., Nathan P.D., Brooks J.E. Regulation of the BamHI restriction-modification system by a small intergenic open reading frame, bamHIC, in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. II J. Bacterid. 1992. V. 174. P. 7194-7201.
18. Barcus V.A., Murray N.E. Barriers to recombination: restriction. // Cambridge: Univ. Press. 1995. P. 31-58.
19. Knowle D., Lintner R., Touma Y.M., Blumenthal R.M. Nature of promoter activated by C.PvuII, an unusual regulatory protein conserved among restriction-modification systems // J. Bacterid. 2005. V. 187. P. 488-497.
20. Tao Т., Bourne J.C., Blumenthal R.M. A family of regulatory genes associated with type II restriction-modification systems. // J. Bacterid. 1991. V. 173. P. 1367-1375.
21. Ives C.L., Sohail A., Brooks J.E. The regulatory С proteins from different restriction-modification systems can cross-complement. // J. Bacterid. 1995. V. 177. P. 6313-6315.
22. McGeehan J.E., Streeter S.D., Papapanagiotou I., Fox G.C., Kneale G.G. High-resolution crystal structure of the restriction-modification controller protein C.Ahdl from Aeromonas hydrophila. II J. Mol. Biol. 2005. V. 346. P. 689-701.
23. Savvaya M.R., Zhu Z., Mersha F., Chan S.H., Dabur R., Xu S.Y., Balendiran G.K. Crystal structure of the restriction modification system control element C.BclI and mapping of its binding site. // Structure. 2005. V. 13. P. 1837-1847.
24. McGeehan J.E., Streeter S.D., Thresh S.J., Ball N., Ravelli R.B., Kneale G.G. Structural analysis of the genetic switch that regulates the expression of restriction-modification genes. // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. 4778-4787.
25. Bart A., Dankert J., van der Ende A. Operator sequences for the regulatory proteins of restriction-modification systems. // Mol. Microbiol. 1999. V. 31. P. 1277-1278.
26. Semenova E., Minakhin L., Bogdanova E., Nagornykh M., Vasilov A., Heyduk Т., SoloninA., Zakharova M., Severinov K. Transcription regulation of the EcoRV restriction modification system. //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 6942-6951.
27. Cesnaviciene E., Mitkaite G, Stankevicius K., Janulaitis A., Lubys A. Espl396I restriction-modification system: structural organization and mode of regulation. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 743-749.
28. Пташне M. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг X. II М.: Мир. 1988. 158 С.
29. Streeter S.D., Papapanagiotou I., McGeehan J.E., Kneale G.G. DNA footprinting and biophysical characterization of the controller protein C.Ahdl suggests the basis of a genetic switch. //Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 6445-6453.
30. Moll I., Grill S., Gualerzi C.O., Blasi U. Leaderless mRNAs in bacteria: surprises in ribosomal recruitment and translational control. // Mol. Microbiol. 2002. V. 43. P. 239-246.
31. Mruk I., Blumenthal R.M. Tuning the relative affinities for activating and repressing operators of a temporally regulated restriction-modification system. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 3983-3998.
32. Mruk I., Rajesh P., Blumenthal R.M. Regulatory circuit based on autogenous activation-repression: roles of C-boxes and spacer sequences in control of the PvuII restriction-modification system. //Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P. 6935-6952.
33. Wilson G.A., Young F.E. Isolation of a sequence specific endonuclease (BamI) from Bacillus amyloliquefaciens H. И Mol. Biol. 1975. V. 97. P. 123-125.
34. Железная JI.A., Кайнов Д.Е., Юнусова A.K., Матвиенко Н.И. Регуляторный С-белок системы модификации-рестрикции EcoRV. // Биохимия. 2003. Т. 68. С. 105-110:
35. Bogdanova Е., Zakharova М., Streeter S., Taylor J., Heyduk Т., Kneale G., Severinov K. Transcription regulation of restriction-modification system Esp 13961. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 1-13.
36. Bogdanova E., Djordjevic M., Papapanagiotou I., Heyduk Т., Kneale G., Severinov K. Transcription regulation of the type II restriction-modification system AhdI. // Nuclcic Acids Res. 2008. V. 36. P. 1429-1442.
37. Murray N. Type I restriction systems: sophisticated molecular machines (a legacy of Bertram and Weigle). // Microbiol. Mol. Rew. 2000. V. 64. P. 412^134.
38. McGeehan J.E., Papapanagiotou I., Streeter S.D., Kneale G.G. Cooperative binding of the C.Ahdl controller protein to the C/R promoter and its role in endonuclease gene expression. //J. Mol.Biol. 2006. V. 358. P. 523-531.
39. Lubys A., Jurenaite S., Janulaitis A. Structural organization and regulation of the plasmid-bome type II restriction-modification system Kpn2I from Klebsiella pneumoniae RFL2. //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 4228^1234.
40. Mondragon A., Harrison S.C. The phage 434 Cro/ORl complex at 2.5 A resolution. // J. Mol. Biol. 1991. V. 219. P. 321-334.
41. Aggarwal A.K., Rodgers D.W., Drottar M„ Ptashne M., Harrison S.C. Recognition of a DNA operator by the repressor of phage 434: a view at high resolution. // Science. 1988. V. 242. P. 899-907.
42. Donner A.L., Paa K., Koudelka G.B. Carboxyl-terminal domain dimer interface mutant 434 repressors have altered dimerization and DNA binding specificities. // J. Mol. Biol. 1998. V. 283. P. 931-946.
43. Rumpel S., Razeto A., Pillar C.M., Vijayan V., Taylor A., Giller K., Gilmore M.S., Becker S., Zweckstetter M. Structure and DNA-binding properties of the cytolysin regulator CylR2 from Enterococcusfaecalis. IIEMBO J. 2004. V. 23. P. 3632-42.
44. Beletskaya I.V., Zakharova M.V., Shlyapnikov M.G., Semenova L.M., Solonin A.S. DNA methylation at the CfrBI site is involved in expression control in the CfrBI restriction-modification system. //Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 3817-3822.
45. Zakharova M., Minakhin L., Solonin A., Severinov K. Regulation of RNA polymerase promoter selectivity by covalent modification of DNA. // J. Mol. Biol. 2004. V. 335. P. 103-111.
46. Christensen L.L., Josephsen J. The methyltransferase from the LlaDII restriction-modification system influences the level of expression of its own gene. // J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 287-295.
47. Lubys A., Janulaitis A. Cloning and analysis of the plasmid-bome genes encoding the Bsp6I restriction and modification enzymes. // Gene. 1995. V. 157. P. 25-29.
48. Kita K., Kotani H., Sugisaki H., Takanami M. The Fokl restriction-modification system. I. Organization and nucleotide sequences of the restriction and modification genes. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 5751-5756.
49. Som S., Friedman S. Autogenous regulation of the EcoRlI methylase gene at the trancriptional level: effect of 5-azacytidine. // EMBO J. 1993. V. 12. P. 4297-4303.
50. Friedman S., Som S. Indaction of EcoRII methylase: evidence for autogenous control. // J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 6293-6298.
51. Som S., Freidman S. Regulation of EcoRII methyltransferase: effect of mutations on gene expression and in vitro binding to the promoter region. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 24. P. 5347-5353.
52. Som S., Friedman S. Characterization of the intergenic region which regulates the Mspl restriction-modification system. // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 964-967.
53. Butler D., Fitzgerald G.F. Transcriptional analysis and regulation of expression of the ScrFI restriction-modification system of Lactococcus lactis subsp. cremoris UC503 // J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 4668-4673.
54. O'Driscoll J., Glynn F., Cahalane O., O'Connell-Motherway M., Fitzgerald G.F., Van Sinderen D. Lactococcal plasmid pNP40 encodes a novel, temperature-sensitive restriction-modification system // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 5546-5556.
55. O'Driscoll J., Fitzgerald G.F., van Sinderen D. A dichotomous epigenetic mechanism governs expression of the LlaJI restriction/modification system // Mol. Microbiol. 2005. V. 57. P. 1532-1544.
56. Gross C.A., Chan C., Dombroski A., Gruber Т., Sharp M., Tupy J., Young B. The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. // Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 1998. V. 63. P. 141-155.
57. Maeda H., Fujita N., Ishihama A. Competition among seven Escherichia coli a subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 3497-3503.
58. Lewin B. Genes IX. Oxford University Press. NY. 2007. 912 P.
59. Shearwin K.E., Callen B.P., Egan J.B. Transcriptional interference a crash course. // Trends Genet. 2005. V. 21. P. 339-345.
60. Dodd I.B., Egan J.B. Action at a distance in CI repressor regulation of the bacteriophage 186 genetic switch. // Mol. Microbiol. 2002. V. 45. P. 697-710.
61. Callen B.P., Shearwin K.E., Egan J.B. Transcriptional interference between convergent promoters caused by elongation over the promoter. 11 Mol. Cell. 2004. V. 14. P. 647-656.
62. Martens J.A., Laprade L., Winston F. Intergenic transcription is required to repress the Saccharomyces cerevisiae SER3 gene. //Nature. 2004. V. 429. P. 571-574.
63. Sneppen K., Dodd I.B., Shearwin K.E., Palmer A.C., Schubert R.A., Callen B.P., Egan J.B. A mathematical model for transcriptional interference by RNA polymerase traffic in Escherichia coli. II J. Mol. Biol. 2005. V. 346. P. 399-409.
64. Карягина A.C. Структурно-функциональная характеристика систем рестрикции-модификации ДНК штамма Shigella sonnei 47. // Дисс. докт. биол. наук. ВНИИ РАСХН. Москва. 1997. 331 С.
65. Никольская И.И., Карташова И.М., Лопатина Н.Г. Ферменты новой системы хозяйской специфичности Sso47II. //Молекулярн. генетика. 1983. Т.12. С. 5-10.
66. Karyagina A.S., Lunin V.G., Degtyarenko K.N., Uvarov V.Yu., Nikolskaya I.I. Analysis of the nucleotide and derived amino acid sequences of the SsoII restriction endonuclease and methyltransferase. //Gene. 1993. V. 124. P. 13-19.
67. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Mi S., Posfai J.,Roberts R.J., Wilson G.G. The DNA (cytosine-5) methyltransferases. //Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 1-10.
68. Jeltsch A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. // Chembiochem. 2002. V. 3. P. 274-293.
69. Леднева P.K., Копылов A.M. Структурные аспекты ДНК-белкового узнаваиия. М.: МГУ. 1999. 119 С.
70. Karyagina A.S., Alexeevski А.У., Golovin A.V., Spirin S.A., Vorob'eva O.V., Kubareva E.A. Computer modelling of complex of (C5-cytosine)-DNA methyltransferase SsoII with target and regulatory DNAs. // Biophysics. 2003. V. 48. Supp. 1. P. 45-55.
71. Denjmukhametov M.M., Brevnov M.G., Zakharova M.V., Repyk A.V., Solonin A.S., Petrauskene O.V., Gromova E.S. The Ecll8kl restriction-modification system: cloning, expression, properties of the purified enzymes. // FEBS Lett. 1998. V. 433. P. 233-236.
72. Варфаломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. // М.: Фаир-пресс. 1998. 720 С.
73. Protsenko A., Zakharova M., Nagornykh M., Solonin A., Severinov K. Transcription regulation of restriction-modification system Ecll8kl. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 5322-5330.
74. Harley C.B., Reynolds R. Analysis of Escherichia coli promoter sequences. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 2343-2361.
75. Mitchell J.E., Zheng D., Busby S.J., Minchin S.D. Identification and analysis of 'extended-10' promoters m Escherichia coli. //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 4689-4695.
76. Manelyte L. Structural and functional analysis of MutS, a mismatch repair protein from Escherichia coli. II Dr. rer. nat. Institute of Biochemistry. Justus-Liebig University Giessen. Giessen. 2006. 124 P.
77. Karyagina A.S., Lunin V.G., Levtchenko I.Ya., Labbe D., Drousseau R., Lau P.C.K., Nikolskaya I.I. The SsoII and NlaX DNA methyltransferases: overproduction and functional analysis. // Gene. 1995. V. 157. P. 93-96.
78. Kubareva E.A., Walter J., Karyagina A.S., Vorob'eva O.V., Lau P.C.K., Trautner T. Determination of methylation site of DNA-methyltransferase NlaX by a hybrid method. // BioTechniques. 2002. V.33. P. 526-531.
79. Филькенштейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка. / М.: Книжный дом «Университет». 2002. 376 С.
80. Cheng X., Kumar S., Posfai J., Pflugrath J.W. Roberts R.J. Crystal structure of the Hhal DNA methyltransferase complexed with S-adenosyl-L-methionine. // Cell. 1993. V. 74. P. 299307.
81. Kirsch R.D., Joly E. An improved PCR-mutagenesis strategy for two-site mutagenesis or sequence swapping between related genes. //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1848-1850.
82. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.
83. Судьина A.E. Эндонуклеазы рестрикции SsoII, PspGI и Mbol: изучение свойств и определение ДНК-связывающих мотивов. // Дис. уч. ст. к. х. н. Москва. МГУ. 2004. 152 С.
84. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.
85. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. //Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
86. Perez A., Marchan I., Svozil D., Sponer J., Cheatham Т.Е., Laughton C.A. Orozco M. Refinement of the AMBER force field for nucleic acids: improving the description of alpha/gamma conformers. // Biophys. J. 2007. V. 92. P. 3817-3829.
87. Wang W. Biomolecular simulations: recent developments in force fields, simulations of enzyme catalysis, protein-ligand, protein-protein, and protein-nucleic acid noncovalent interactions. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2001. P. 30 P. 211-43.
