Изучение функциональной роли метилирования G966/C967 16S PPHK Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имепи М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

005012660

ПРОХОРОВА Ирина Валерьевна

ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ МЕТИЛИРОВАНИЯ G966/C967 16S РРНК Escherichia coli

02.00.10 - биоорганическая химия

1 2 млр ¿012

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2012

005012660

Работа выполнена на кафедре Химии Природных Соединений химического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, доцент Сергиев Петр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Кубарева Елена Александровна

кандидат химических наук, Бони Ирина Венедиктовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии

наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится 13 марта 2012 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 10 февраля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибосома осуществляет синтез белков во всех клетках, считывая информацию о последовательности аминокислот с матричной РНК. Этот процесс называется трансляцией. Уровень базовой трансляции в клетке может меняться в зависимости от условий окружающей среды, при этом рибосома участвует в регуляции экспрессии генов с помощью множества специфических механизмов. Регуляция трансляции вносит свой вклад в адаптацию клетки к внешним условиям. Для регуляции экспрессии генов, рибосомы бактерий взаимодействуют с РНК-полимеразой, с различными белковыми факторами, низкомолекулярными веществами.

Функциональные центры рибосомы состоят преимущественно из остатков РНК. Во всех организмах рибосомные РНК содержат модифицированные нуклеотиды: псевдоуридин и нуклеотиды, метилированные по различным положениям гетероциклического основания или по 2' положению рибозы. Модификацию рРНК бактерий производят специализированные ферменты - рРНК-метилтрансферазы и псевдоуридинсинтазы, каждая из которых специфична для одного или нескольких модифицированных нуклеотидов. Функция некоторых модифицированных нуклеотидов заключается в обеспечении устойчивости бактерий к антибиотикам за счет изменения участка связывания антибиотика в рибосоме. Функция модифицированных нуклеотидов в рРНК Escherichia coli, не придающих клетке устойчивость к антибиотикам, изучена слабо. При делециях генов модифицирующих ферментов в той или иной степени наблюдается снижение скорости роста клеток по сравнению с клетками дикого типа. Ни одна из модификаций рРНК не обеспечивает работу базовых стадий трансляции. На данный момент модифицированным нуклеотидам рРНК приписывают роль в инициации трансляции, созреванию и сборке рРНК, поддержанию структуры рибосомы, регуляции трансляции при определенных условиях.

Таким образом, изучение функциональной роли посттранскрипционных модификаций рРНК важно как для разработки подходов для создания новых антибиотиков, так и для понимания фундаментальных аспектов работы рибосомы. В данной работе мы использовали штамм с двойной делецией генов rsmD, rsmB, для которого характерно отсутствие метилирования G966/C967 в 16S рРНК. Это позволило описать влияние метилирования G966/C967 на жизнедеятельность бактерии Escherichia coli, а также изучить функционирование рибосом, лишенных этих модификаций, на различных этапах трансляции.

Цель работы.

1. Исследовать влияние модифицированных нуклеотидов m2G966/m5C967 I6S рРНК на жизнеспособность бактерии Escherichia coli в различных условиях.

2. Изучить роль модифицированных нуклеотидов m2G966/m5C967 16S рРНК в регуляции экспрессии генов бактерии Escherichia coli.

3. Выявить стадии трансляции, для которых важно наличие модифицированных нуклеотидов m2G966/m5C967 16S рРНК.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе данной работы был создан штамм, несущий двойную делецию генов RsmD и RsmB метилтрансфераз. Было подтверждено отсутствие модификаций G966/C967 16S рРНК в полученном ArsmB/ArsmD штамме. Рибосомы мутантного типа были охарактеризованы с помощью различных тестов in vivo и in vitro. Была исследована выживаемость клеток ArsmB/ArsmD штамма по сравнению с клетками дикого типа при различных условиях. Холодочувствительный фенотип ArsmB/ArsmD штамма свидетельствует о необходимости модификаций рРНК для адаптации клетки к пониженной температуре. Это подтверждалось существенным

замедлением перехода к логарифмической фазе роста клеток в отсутствие модификации G966/C967 при дополнительной нагрузке на аппарат трансляции.

Уровень синтеза белка во многом определяется эффективностью инициации трансляции его мРНК. Эффективность инициации во многом определяется стабильностью 70S инициаторного комплекса. Известно, что ряд метилированных нуклеотидов 16S рРНК участвуют в отборе инициаторной fMet-TPHKfMe' и AUG кодона мРНК. Однако в литературе отсутствуют данные о молекулярных механизмах, посредством которых модифицированные нуклеотиды 16S рРНК влияют на инициацию трансляции. В данной работе было показано, что отсутствие m2G966/m5C967 модификаций в 16S рРНК приводит к пониженной эффективности инициации с неканонических инициаторных кодонов in vivo.

Кроме того, было обнаружено, что метилирование G966/C967 увеличивает эффективность связывания инициаторной тРНК в Р-участок 30S субчастицы при образовании 30S и 70S инициаторных комплексов in vitro. Более явно эффект проявлялся при наличии неканонического AUU инициаторного кодона в мРНК. Полученные результаты позволяют детально описать механизм влияния метилирования G966/C967 на инициацию трансляции.

На примере метилирования G966/C967 впервые было показано участие метилирования рРНК в регуляции экспрессии генов. В данной работе были созданы репортерные конструкции на основе генов люцифераз Jluc и Иис. С помощью данных конструкций, а также сравнительного протеомного анализа штаммов дикого и мутантного типов было показано, что в ArsmB/ArsmD штамме происходит индукция триптофанового оперона из-за нарушений в механизме аттенюации транскрипции. Это существенно расширяет представления о роли метилирования рРНК в регуляции экспрессии генов.

Апробация работы. Материалы диссертации многократно обсуждали на семинарах лаборатории химии рибонуклеопротеидов кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ имени М.В, Ломоносова; докладывали на конференциях: XIV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» МГУ имени Ломоносова. Москва, Россия. Апрель 11-14, 2007; XV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» МГУ имени Ломоносова. Москва, Россия. Апрель 8 - 12, 2008; международная конференция «Рибосомы» 2010. Орвието, Италия. Май 3-7, 2010; международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Москва, Россия. Ноябрь 17-19, 2010; 16-ая ежегодная конференция «РНК». Киото, Япония. Июнь 14-18, 2011; международный 36 конгресс ФЕБС «Биохимия для будущей медицины». Турин, Италия. Июнь 25-30,2011; международная конференция ЭМБО «Синтез белка и контроль трансляции». Хайдельберг, Германия. Сентябрь 7-11, 2011.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 68 рисунками. Библиографический указатель включает 157 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Модифицированные нуклеотиды m2G966/m5C967 16S рРНК Escherichia coli расположены в Р-участке 30S субчастицы и формируют «карман», связывающий антикодон тРНК. Модификацию G966 и С967 осуществляют RsmD и RsmB метилтрансферазы, соответственно. Рассмотрение структуры комплекса рибосомы Escherichia coli с инициаторной тРНК показало, что наименьшее расстояние от G966 до антикодона тРНК составляет 3,6 А (Рис. 1, А). Гетероциклическое основание G966 может вступать в стэкинг-взаимодействия с рибозой нуклеотида С34 тРНК или образовывать

дополнительные контакты в случае элонгаторных тРНК, часто модифицированных по 34 нуклеотиду. Расположение модифицированных остатков G966 и С967 16S рРНК позволяет предположить их участие в стабилизации пары кодон-антикодонового дуплекса в третьем положении кодона, что может быть важно для инициации трансляции.

На стадии инициации происходит узнавание инициаторного AUG кодона мРНК и образование 70S инициаторного комплекса (70S 1С) рибосомы с мРНК и инициаторной fMet-TPHKfMM, связанной в Р-участке рибосомы. На первом этапе инициации образуется 30S инициаторный комплекс (30S 1С), содержащий 30S субчастицы, факторы инициации IF1, IF2, IF3, мРНК и íMet-TPHKfMct. На втором этапе происходит присоединение 50S субчастицы, диссоциация комплекса рибосомы и факторов инициации. В отборе инициаторной тРНК и инициаторного AUG кодона ключевую роль играет фактор инициации IF3. Результаты Varshney и соавторов (2008) свидетельствуют о том, что метилирование 16S рибосомной РНК важно для селекции инициаторной тРНК.

В научной литературе имеются противоречивые данные об уровне трансляции, обеспечиваемого рибосомами с мутациями нуклеотидов G966 и С967. В частности, замены G966 на три остальных рибонуклеотида по данным Adbi и соавторов (2005) приводили к понижению уровня трансляции. Согласно результатам Saraiya и соавторов (2008) замены G966U и C967U приводили к гиперактивности рибосом. Причем гиперактивность, наблюдаемая для мутантных рибосом, подавлялась при повышенной экспрессии IF3, но не IF1 или IF2. При заменах G966, С967 метилтрансферазы RsmD и RsmB не могут осуществлять свою функцию, однако при использовании мутантов нуклеотидов G966 и С967 нельзя разделить эффект, вызванный отсутствием метальных групп и эффект, вызванный изменением нуклеотида. Исследование функциональной роли метилирования G966/C967 стало возможным благодаря идентификации генов метилтрансфераз rsmB и rsmD, ответственных за их модификацию.

Характеристика фенотипа ArsmB/ArsmD штамма была проведена для выяснения роли метилирования G966/C967 в жизнедеятельности клетки. Наиболее сложной и интересной задачей представлялось объяснить феиотип ArsmB/ArsmD штамма изменениями в работе рибосом мутантиого типа in vitro.

1. Фенотип ArsmB/ArsmD штамма.

Штамм ArsmB/ArsmD был получен путем инактивации гена rsmB в штамме JW3430, несущего замену гена rsmD метилтрансферазы на ген устойчивости к канамицину. Штамм JW3250 был любезно предоставлен проф. Н.Мори, Япония. Делению гена rsmB подтверждали ПЦР анализом геномной ДНК.

Отсутствие метилирования G966 в ArsmB/ArsmD штамме было подтверждено с помощью обратной транскрипции. Для этого выделяли суммарную РНК из штаммов WT, ArsmB/ArsmD, ArsmB, ArsmD и анализировали наличие модификации m3G966 по реакции обратной транскрипции. Сигнал, соответствующий m2G966 модификации, присутствовал а штамме дикого типа и ArsmB штамме и отсутствовал в ArsmD штамме (Рис. 1, Б).

Рис. I. А. Расположение модифицированных нуклеотидов ш2С966/т5С967 в структуре комплекса рибосомы с мРНК и тРНКгМм. Б. Детекция отсутствия метилирования 0966/С967 в штамме ДгашЗ/ДгатО.

/

ArsmB ArsmD

ArsmB/ArsmD WT Na2SjO,, ddGTP ArsmB/ArsmD Na^O,, ddGTP

WT

Стрелками отмечены остановки обратной транскриптазы, соответствующие пгС966 (вверху) и ш5С967 (при добавлении в реакцию ЦсЮТР, снизу). Справа изображена вторичная структура спирали 31 163 рРНК.

Метилирование С967 по С5 положению не останавливает реакцию обратной транскрипции. Поэтому для анализа модификации ш5С967 мы предварительно производили дезаминирование РНК с помощью бисульфита натрия. При этом неметилированные остатки цитидина дезаминируются с образованием уридина, а метилированные т5С не дезаминируются. Наличие последних можно детектировать с помощью обратной транскрипции в присутствии дидезокси ОТР (ёсЮТР) вместо сЮТР. Соответственно, мы не наблюдали сигнала остановки обратной транскриптазы для РНК из Ап-тВ/АптО штамма, в отличие от РНК из штамма дикого типа (Рис. 1, Б).

Чтобы изучить фенотип мутантного Дл?тй/Дг.?т/) штамма была определена скорость роста по сравнению с изогенным штаммом дикого типа (\¥Т) в различных условиях. Из литературных данных известно, что штаммы с делецией гена той или иной метилтрансферазы обнаруживают замедление скорости роста от 0 до 50%. Для штамма и штаммов с одиночными делециями Дг$тВ и \rsmD мы наблюдали замедление скорости роста на - 15% по сравнению со штаммом \УТ.

Чтобы оценить среднюю жизнеспособность клеток и в логарифмической, и в стационарной фазе роста при нехватке питательных веществ мы применили метод соревнования культур клеток. Для этого культуры мутантных штаммов смешивали в равных количествах с культурой дикого типа и инкубировали в течение суток. Затем определяли титр клеток обоих типов посредством параллельного высевания культур на чашку со средой без добавления и с добавлением антибиотика. Аликвоту смешанных культур разводили свежей средой и повторяли цикл экспериментов. Данный опыт провели при температурах 30°С, 37°С, 42°С, а также в минимальной среде М9 при 37°С. Для всех условий было обнаружено последовательное вытеснение клеток мутантного типа клетками дикого типа в общей смеси. Наиболее явно эффект проявлялся для штамма с двойной делецией Дг™В/ДгетЛ (Рис. 2).

« а

38-0

* 37 С

НС

1 т

*

и..... ♦ ®С » 1?С

-* « С ♦ ш

ЦИКЛ роста

« ?

• дас

• з? с

В--.

^^ * №

•Т»».

*

...... .,............¿.,.................„+.....

цикп роста

1 i цикл[к

Рис. 2. Вытеснение клеток мутантного \rsmD, АптВ/АптО) типа клетками дикого типа (Н'Т)

при различных условиях: 30°С, 37°С, 42°С в среде ЬВ и при 37°С в среде М9. Графики изображают зависимость соотношения титра клеток мутантного и дикого типов в логарифмической шкале от цикла роста, соответствующего 24 часам.

Возможно, в условиях роста культуры в лаборатории эффективность синтеза белка не является основным ограничивающим фактором. Для того, чтобы проверить, как клетки мутантного штамма выдерживают повышенную нагрузку на трансляционный аппарат, мы трансформировали штамм Дгатб/ДгхтО плазмидой, кодирующей чужеродный для Е.соИ белок, азурин, под контролем тетрациклинового промотора. При индукции промотора ангидротетрациклином (АНТ) клетка вынуждена тратить значительную часть ресурсов аппарата трансляции на синтез этого белка. Это приводит к увеличению лаг-фазы до перехода клеток к логарифмической фазе роста. Оказалось, что для клеток мутантного типа лаг-фаза примерно в два раза длиннее, чем для клеток дикого типа (Рис. 3). Мутантный Дгатй/ДгатО штамм оказывается намного менее приспособленным к условиям, требующим повышенного уровня синтеза белка.

0.3

1000

ОТ. 0 мкг/мл АНТ ОТ. 2 мкг/мл АНГ ОТ, 20 мкг/мл АНТ ОТ, 200 МК1/МЛ АНТ ДгзтВ/ДгзтО, 0 мкг'мл АНТ ДгатВ/ДгвтО, 2 мкг'мл АНТ ДгзтВ/ДгзтО. 20 мкг/мл АНТ ДгэтВ/ДгзтО, 200 мкг/мл АНТ

500 время, мин

Рис. 3. Зависимость оптической плотности клеток дикого типа (сплошные символы) и ДгетД/Дгот!/) типа (открытые символы) от времени. Клетки экспрессируют ген азурина в соответствии с концентрацией индуктора ангидротетрациклина, указанной справа.

Была исследована также чувствительность мутантных штаммов к пониженной температуре. Мы обнаружили, что Дгатй/ДгяпО штамм растет значительно медленнее по сравнению со штаммом дикого типа на твердой среде ЬВ при 18°С (Рис. 4, А). Скорость роста в жидкой среде \rsmBIArsmD штамма была в 3,6 раза медленнее по сравнению со штаммом дикого типа (Рис. 4, Б).

1500-

□ \ДГТ

■I лгвтВ/АгэглО

1000-

500-

1 - ш

2 - ДгетО

3 - Дг5т8/Дг5т 1 - йгзтВ

1РТй.

№1 11=3 1Р1 1РЗ

Рис. 4. Рост штаммов дикого и мутантного типов при 18°С. А. Изображены клетки, рассеянные на ЬВ, инкубированные при 18°С в течение трех суток. Б. Период удвоения клеток (т) в жидкой среде ЬВ при 18°С. Жирными Горизонтальными треугольниками показано увеличение концентрации индуктора: 0; 0,1; 0,5; 1; 10 мМ 1РТв для экспрессии №1 или №3. Первый слева белый столбик соответствует периоду удвоения \¥Т без плазмиды, первый слева черный столбик - периоду удвоения ДгатД/ДгатД без плазмиды с фактором.

Известно, что отсутствие некоторых модификаций рРНК приводит к дефектам биогенеза рибосомных субчастиц, что проявляется при пониженных температурах, как например для т62А1518/т62А1519. Однако оказалось, что сборка малой субчастицы в отсутствие т 0966/т5С967 модификаций не нарушена. При анализе профилей распределения рибосомных субчастиц, выделенных из культур обоих типов, выращенных при 18°С, в градиенте концентрации сахарозы мы не обнаружили ни изменений в отношении количеств субчастиц, ни промежуточных интермедиатов сборки или продуктов деградации субчастиц (Рис. 5, А). Анализ профилей в ассоциирующих условиях показал, что и при 18°С, и при 37°С Д^тВ/А^т/) штамм содержит в 1,5 раза меньше полисом, что свидетельствует о снижении количества рибосом, вступающих в трансляцию (Рис. 5, Б).

ДгетВ/ДгегтЮ 37°С бОв

№Т 37"С

'ТОЭ

ДгетВ/ДгетР 37°С

А гаэ

полисомы )

_ полисомы

! 503 303

ДгзтВ/ДгетО 18"С 508

ДгетВ/Д^тО 18°С

»

полисомы '

I 50в

ЗОБ

Г

Рис. 5. Анализ рибосомных профилей в градиенте концентрации сахарозы, полученных из клеток \УТ и ДгатД/ДгатД выращенных при 18°С и при 37°С. Отмечены субчастицы рибосом, полисомы. А. Анализ в диссоциирующих условиях в буфере НЕРЕЗ-КОН рН 7,5 (20 мМ), М§(ОАс)2 (1 мМ), Ыа,ОАс (200 мМ), р-меркаптоэтанол (4 мМ). Б. То же в ассоциирующих условиях в буфере НЕРЕЭ-КОН рН 7,5 (20 мМ), Ма(ОАс)2 (20 мМ), ЫН4ОАс (200 мМ), р-меркаптоэтанол (4 мМ).

Известно, что адаптация бактериальной клетки к пониженной температуре происходит в том числе на стадии трансляции и наибольшее значение для этого имеют факторы инициации №1 и ИЗ. В связи с этим мы проверили, связана ли холодочувствительность ДгапгВ/ДгаиО штамма с дефектами в работе №1 или ИЗ. Для этого штаммы дикого и мутантного типов трансформировали высококопийной плазмидой рС^ЕЗО, кодирующей Ш1 или №3. В клетках мутантного типа только наибольший уровень экспрессии факторов (1-10 мМ 1РТй) приводил к незначительному уменьшению периода удвоения (Рис. 4, Б). Таким образом, холодочувствительный фенотип ДглтВ/ЛгапО штамма не супрессируется факторами 1Р1, №3.

По всей видимости, холодочувствительный фенотип АгятВ/Аг.чтО штамма обусловлен функциональным дефектом мутантных рибосом, возможно проявляющимся на стадии инициации трансляции. Или же он может быть вызван изменением уровня экспрессии какого-то гена, участвующего в адаптации клетки к пониженной температуре, например, гена одного из белков сэр семейства.

2. Влияние модифицированных нуклеотидов ш2С966/ш5С967 на белковый состав

клетки.

Задача рибосомы и всего аппарата трансляции состоит не только в синтезе белков, но и в том, чтобы белки были синтезированы в пропорциях, необходимых для клетки в данный

момент. Для сравнения количеств белков, мы провели двумерный электрофорез белковых фракций, полученных из клеток \¥Т и Дгатй/ДгатД меченых флуоресцентными красителями СуЗ и Су5, соответственно. На изображении геля белки, содержащиеся в равных количествах, видны в виде желтых точек, белки, преобладающие в диком типе - в виде зеленых точек, преобладающие в мутантном типе - в виде красных точек (Рис. 6). Идентификацию белков, чей уровень экспрессии отличался больше, чем в 2 раза, проводили методом МАЛДИ-масс спектрометрии. Результаты для штаммов, выращенных в среде Е,В при 37°С, показаны на рисунке 6, А и в таблице 1.

Рис. 6. Сравнительный лротеомный анализ белковых фракций клеток дикого типа и мутантного Дгаий/ДгетВ типа. Белки, выделенные из клеток \¥Т метили по остаткам лизинов красителем СуЗ, дающим зеленое свечение флуоресценции, а белки, выделенные из клеток АгзтВ/Дгзтй, метили флуоресцентным красителем Су5, дающим красное окрашивание при сканировании флуоресценции. Белки, идентифицированные с помощью МАЛДИ-масс спектрометрии, отмечены на двумерном геле. А. Анализ проведен для клеток, выращенных в среде ЬВ. Б. То же для клеток, выращенных в среде М9. содержащей 100 мкг/мл триптофана.

Ген Белок Соотношение АптВ/АптОтТ Функция

арА Главный белок холодового шока 2,6 Адаптация к холодовому шоку

гроI РНК-полимераза, со субъединица 2,3 Поддержание структуры комплекса РНК-полимеразы

изрА Белок, регулирующий ответ клетки на различные шоки 2,0 Адаптация к различным шокам

тоаВ Субъединица белка, участвующего в биосинтезе молибдена 0,5 Синтез молибдоптерин-гуанин-динуклеотида

ксІяА З-дезокси-й-манно-октулосонат- 8-фосфат синтаза 0,5 синтез липополисахаридов

агоС Хоризмат синтаза 0,5 Синтез хоризмата

ШсВ Треонин дегидратаза 0,5 Деградация 1_-серина, Ь-треонина

рке8 Фенилаланин-тРНК-синтетаза, а субъединица 0,5 Аминоацилирование тРНК№с

ИетЬ Глутамат-1 -семиальдегид 2,1-аминомутаза 2,9 Синтез тетрапиррола

уеіТ КАБН-зависимая дигидроуридин дегидрогеназа, субъединица 0,4 Превращения пиримидинов

асеА Изоцитрат лиаза 2,6 Глиоксилатный цикл

іїрВ Триптофан синтаза, р субъединица 2,6 Синтез Ь-триптофана

ШаА Триптофаназа 0,4 Деградация Ъ-

триптофапа

katG Каталаза/гидропероксидаза НР1(1) 0,4 Деградация оксид-радикалов

Табл. 1. Белки, идентифицированные с помощью МАЛДИ-масс спектрометрии, количества которых изменяются в штамме Дгс/яЛ/Дгст-О по сравнению со штаммом дикого типа.

При анализе данных сравнительного протеомного анализа необходимо помнить, что изменения в уровне экспрессии того или иного белка могут быть вызваны прямым или опосредованным влиянием метилирования G966/C967. Во втором случае ген, экспрессия которого зависит от метилирования, может регулировать экспрессию других генов. Так, в мутантном штамме мы обнаружили повышенный уровень белка UspA, появляющегося при неблагоприятных условиях и замедляющего переход к логарифмической фазе роста. Аналогично, посредством сравнительного протеомного анализа, было обнаружено, что уровень экспрессии ОшрА возрастает при повышенной экспрессии UspA. OmpA является одним из наиболее распространенных мембранных белков E.coli. Таким образом, повышенное количество OmpA в ArsmB/ArsmD штамме может быть обусловлено повышенным уровнем UspA. Однако мы не обнаружили увеличения количеств других белков, количество которых регулируется UspA. Кроме того, в мутантном штамме понижен уровень kdsA, фермента участвующего в синтезе липополисахаридов, составляющих клеточную стенку бактерий. Так что, скорее всего мы наблюдаем стресс клеточной мембраны, вызванный отсутствием метилирования G966/C967.

Несмотря на незначительное снижение скорости роста мутантного штамма при нормальных условиях, данные показывают, что в отсутствие метилирования G966/C967 активированы сигнальные пути, реагирующие на стрессовые условия, так как повышена экспрессия cspA и uspA. CspA является РНК-шапероном, и его появление в клетке приводит к дестабилизации некоторых мРНК из-за разворачивания их вторичных структур, что делает их доступнее для действия РНКаз. Увеличение уровня экспрессии cspA в мутантном штамме может приводить к изменению уровня экспрессии других белков. Повышенный уровень cspA в ЛrsmB/ArsmD штамме скорее всего является следствием нарушения регуляции его экспрессии, либо на стадии транскрипции, либо на стадии трансляции. Во время адаптации клетки к пониженной температуре количество CspA сначала повышается, а затем должно снизиться для возобновления экспрессии других генов. Нарушения в регуляции экспрессии cspA в мутантном штамме могут быть причиной плохой адаптации ArsmB/ArsmD штамма к пониженной температуре.

Мы обнаружили также, что в А rsmB/ArsmD штамме меняются количества белков участников ряда биосинтетических путей. Данные обо всех белках, отмеченных в ходе анализа, довольно сложно интерпретировать без каких-либо дополнительных экспериментов. Мы обратили внимание на изменения уровня экспрессии белков, участвующих в биосинтезе аминокислот триптофана и фенилаланина. Среди них белок агоС участвует в биосинтезе хоризмата - предшественника ароматических соединений, pheS - фенилаланин-тРНК-синтстаза, trpB - ß-субъединица триптофан синтазы и tnaA -триптофаназа. Мы наблюдали увеличение уровня trpB и снижение уровня агоС, pheS, tnaA. Интересно, что все эти белки, кроме агоС, закодированы в оперонах, содержащих лидерные пептиды и регулируемых посредством аттенюации транскрипции. Поскольку эти опероны кодируют полицистронную мРНК, белки этих оперонов транслируются за счет сопряженной трансляции и регулируются единым образом. Изменения количеств других белков оперонов не детектированы в ходе протеомного анализа в силу ограничения этого метода. Каким же образом метилирование G966/C967 может влиять на экспрессию этих оперонов и какие последствия это имеет для клетки? Можно предположить, что метилирование G966/C967 важно для трансляции лидерных пептидов trpL (триптофановый оперон), pheM (фенилаланиновый оперон), tnaC (триптофаназный оперон). Чтобы детально изучить влияние метилирования G966/C967 на экспрессию этих оперонов мы использовали систему репортерных белков.

на уровень

3. Влияние модифицированных нуклеотидов экспрессии триптофанового оперона E.coli.

Влияние метилирования G966/C967 на экспрессию триптофанового оперона исследовали с помощью системы двух белков-репортеров. Мы сконструировали плазмиду ага2, несущую гены люцифераз светлячка Flue и коралла Rluc под самостоятельными арабинозными промоторами рт. Уровень экспрессии Rluc служил внутренним стандартом системы. Уровень экспрессии Flue зависел от изменений, вносимых в его ген на плазмиде.

На первом этапе мы оценили уровень экспрессии обоих репортерных белков в штаммах дикого и мутантного типов, несущих плазмиду ага2 с генами Flue и Rluc с одинаковыми промоторами транскрипции и участками инициации трансляции. Хотя уровень экспрессии обоих генов одинаковый, активность Rluc в условиях эксперимента была значительно выше, чем активность Flue (Рис. 7). Метилирование G966/C967 не влияет на активность Flue и Rluc, а значит, не влияет и на уровень экспрессии их генов.

Рис. 7. Активности Rluc, Flue в штаммах I—| wf дикого типа WT и мутантного brsmB/ArsmD,

■ irsmB/ArsmD несУЩих плазмиду ага2 с генами Flue и Rluc с одинаковыми промоторами транскрипции и участками инициации трансляции. Активности выражены в относительных единицах люминесценции (RLU).

Flue

Известно, что регуляция экспрессии триптофанового оперона осуществляется во время трансляции лидерного пептида trpL, ген которого расположен в начале оперона перед геном trpE. Скорость движения рибосомы влияет на образование альтернативных вторичных структур в межцистронной области trpL-trpE мРНК. Эти вторичные структуры соответствуют терминатору или антитерминатору транскрипции, их образование определяет, продолжит ли РНК-полимераза транскрибировать гены оперона.

Для изучения экспрессии триптофанового оперона с помощью репортерных плазмид мы встроили перед геном Flue область, кодирующую trpL лидерный пептид, слитую с геном Flue (конструкция trpL, рис. 8, слева). Мы так же сконструировали плазмиду, содержащую за геном лидерного пептида всю регуляторную область и последовательность, кодирующую первые 10 аминокислот trpE гена триптофанового оперона (конструкция tipL-trpE, рис. 8, справа). В обоих случаях встраиваемые кодирующие области образовывали единую рамку считывания с началом кодирующей области Flue.

рА,я Rfuc р*"* trpL Flue р4'* Rluc p»s-trpL fj trpE Rue

ир1 г Г" " "~)r 1 Г ) trpL-trpe J^C ~~)r C~1 ¥(

)

Рис. 8. Строение кодирующих областей Rluc и Flue в составе конструкций trpL, trpL-trpE. Отмечены арабинозный промотор рАЕА, гены Rluc, Flue, trpL, trpE и шпилька, соответствующая терминатору транскрипции в случае trpL-trpE.

Отношение активности Flue к Rluc было одинаковым в штамме дикого типа и в ArsmB/ArsmD штамме, несущих trpL конструкцию (Рис. 9). Это означает, что лидерный пептид trpL синтезируется с равной эффективностью в обоих штаммах.

Рис. 9. Относительный уровень экспрессии белков-репортеров Fluc/Rluc в штаммах дикого типа WT и мутантного \rsmBlkrsmD типа, несущих конструкции ara2trpL, ara2trpL-trpE. Клетки растили в среде LB, которая содержит количества триптофана, соответствующие репрессии триптофанового оперона.

CD WT

■ ArsmB/ArsmD

IrpL

trpL-trpE

Когда клетки несли trpL-trpE репортерную плазмиду, значение Fluc/Rluc было больше в ArsmBI&rsmD штамме по сравнению со штаммом дикого типа (Рис. 9). Полученный результат соответствовал данным протеомного анализа (Табл. 1). Поскольку природный промотор триптофанового оперона был заменен на арабинозный промотор, только механизм агтенюации транскрипции мог влиять на экспрессию репортера Flue.

Мы также измерили активности репортерных белков в обоих штаммах, несущих trpL-trpE конструкции, в минимальной среде М9 с добавлением и без добавления триптофана. В присутствии триптофана в среде мы наблюдали повышенное значение Fluc/Rluc в мутантном штамме по сравнению со штаммом дикого типа (Рис. 10). Это соответствовало данным сравнительного протеомного анализа клеток, выращенных в М9 при наличие триптофана (Рис.6, Б). Результаты показывают, что отсутствие модификаций G966/C967 приводит к такому же уровню дерепрессии оперона, как и голодание по триптофану (Рис. 10).

Рис. 10. Относительный уровень экспрессии белков-репортеров Fluc/Rluc в штаммах дикого и мутантного типов, несущих конструкцию trpL-trpE, в минимальной среде М9 ± триптофан.

Можно было предположить, что метилирование G966/C967 оказывает влияние на эффективность трансляции trpE цистрона, а не на аттенюацию транскрипции. В таком случае количество мРНК репортерного белка Flue было бы одинаковым в обоих штаммах, а изменялось бы только количество самого белка. Мы определили количества мРНК репортерных белков с помощью количественного ОТ-ПЦР в штаммах обоих типов, несущих trpL-trpE конструкцию. Мы обнаружили, что относительное количество Flue транскрипта больше для мутантного штамма по сравнению со штаммом дикого типа (Рис. 11). Это означает, что в ArsmB/ArsmD штамме изменяется эффективность аттенюации транскрипции триптофанового оперона.

Рис. П. Отношение количеств мРНК Flue и Rluc, определенное с помощью ОТ-ПЦР анализа. Значения Fluc/Rluc для trpL-trpE конструкции нормировали на значения Fluc/Rluc для trpL конструкции, поскольку уровень экспрессии Flue и Rluc репортеров одинаков в обоих штаммах, несущих tipL конструкцию.

4rsmB/ArsmD

Известно, что остановка рибосомы при встраивании двух остатков триптофана в лидерном пептиде приводит к дерепрессии оперона. Мы заменили два триптофановых кодона лидерного пептида в конструкции ґгрИгрЕ на два аланиновых (2А1а) и ввели дополнительные мутации, сохраняющие вторичную структуру мРНК. Уровень экспрессии репортерных белков был одинаковым в штамме дикого типа и Дгдаг5/Дгст£> штамме, несущих плазмиду 2А1а (Рис. 12). Это означает, что в мутантном штамме даже при достаточном количестве триптофана в среде рибосома задерживается при встраивании остатков триптофана в лидерном пептиде. Это способствует образованию антитерминатора транскрипции и дерепрессии всего оперона.

В качестве контроля мы использовали конструкцию йрЕ-йрЕ(2А^) с заменами двух триптофановых кодонов лидерного пептида на два аргининовых кодона. Исходя из

частоты встречаемости кодонов в последовательностях белков, можно предполагать значительную задержку рибосомы при встраивании аргинина. В соответствие с этим мы наблюдали повышенные значения Р1ис/Иис, одинаковые в обоих штаммах (Рис. 12).

Известно, что эффективность аттенюации транскрипции триптофанового оперона зависит, по крайней мере, от четырех факторов: от эффективности инициации и терминации трансляции лидерного пептида, скорости встраивания рибосомой двух остатков триптофана в лидерном пептиде и от продолжительности паузы РНК-полимеразы при транскрипции мРНК. Полученные результаты свидетельствуют о том, что метилирование G966/C967 оказывает влияние на скорости встраивания остатков триптофана в trpL лидерный пептид, однако нельзя исключать влияния метилирования G966/C967 и на другие этапы трансляции trpL лидерного пептида.

Интересно, что дерепрессия триптофанового оперона была обнаружена также в отсутствие модификации нуклеотида 37 тРНК, вносимой ферментами miaA, miaB. Исходя из дефектов связывания тРНК в отсутствие модификации нуклеотида А37 было предположено, что индукция триптофанового оперона вызвана замедленным встраиванием рибосомой двух остатков триптофана в лидерный пептид. При замене триптофановых кодонов Yanofsky и соавторы (1990) также наблюдали одинаковый уровень экспрессии оперона в присутствие и в отсутствие модификации тРНК.

Чтобы более полно охарактеризовать свойства рибосом, лишенных m2G966/msC967 модификаций, мы решили провести ряд опытов in vitro.

4. Определение аффинности fMet-rPHKfMet к Р-участку 30S субчастиц дикого и мутантного типов.

Мы исследовали эффективность протекания стадий инициации трансляции с рибосомами дикого и мутантного типов, выделенных из штаммов WT и ArsmB/ArsmD. Связывание инициаторной fMet-tphkfmet на стадии инициации происходит в Р-участок 30S субчастицы. Мы определили максимальный уровень мРНК-зависимого связывания инициаторнои fMet-TPHKfMe' в Р-участок 30S субчастицы (Втах) и константу диссоциации (Kd) комплекса 30S*tPHK*mPHK. Эти параметры показывают сродство fMet-TPHKfMet к 30S субчастицам в равновесных условиях (Kd) и в условиях большого избытка fMet-tphkfmc' (Вшах). Мы использовали 022AUG мРНК, которая имела последовательность: 5'...UUA АСА GGU AUA CAU ACU AUG UUU А CG AUU...3'. Kd и Bmax рассчитывали из зависимости концентрации комплекса 30S*f[3H]Met-тРНКгМй*мРНК от концентрации f[3h]Met-tphkfmet. Концентрацию комплекса определяли с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры, задерживающие комплекс 30S*f[3h]Met-tphkfmet*mphk, но не свободную f[ h]Met-tphkfmet (Рис. 13). Стоит отметить, что связывание тРНК происходит очень слабо в отсутствие факторов инициации и составляет не больше 25%. Полученные значения были практически одинаковы для 30S субчастиц дикого типа (Bmax=33%, Kd=0,91±0,08 мкМ) и мутантного типа (Bmax=30%, Kd=l,00±0,06 мкМ).

Таким образом, в отсутствие факторов инициации метилирование G966/C967 не влияет на эффективность связывания fMet-tphkfmsl с 30S субчастицами.

□ WT

■ ArsmBMrsmD Рис' 11 Влияние мутаций в trpL

лидерном пептиде в конструкции trpL-trpE на экспрессию Flue, Rluc в штаммах дикого и мутантного ArsmBIkrsmD типов.

2А1а

2Arg

WT

ürsmB/ArsmD

fí'HJMet-TPHK,"«, мкМ f['H]Met-TPHK,'"', мкМ

Рис. 13. Зависимость концентраций комплексов 30S*tPHK*mPHK, образованных в буфере Tris с1 (50 мМ), nh4ci (70 мМ), кс1 (30 мМ), Mg(OAc)2 (20 мМ), от концентрации ffHJMet-TPHK,"1'".

5. Влияние модифицированных нуклеотидов m2G966/m5C967 на эффективность образования 30S инициагориых комплексов.

Мы исследовали влияние модифицированных нуклеотидов m2G966/m5C967 на связывание fMet-TPHKfMet в присутствии факторов инициации. Для определения эффективности образования 30S 1С мы использовали два подхода: связывание комплексов на нитроцеллюлозных фильтрах и RelE-принтинг. В первом случае образовывали комплексы 30S*f[3H]Met-TPHKfMa*MPHK*IFl*IF2*IF3 с двукратным избытком тРНК. мРНК имела последовательность: 5'... CAA UUA AGG AGG UAU ACU AUG UUU ACG AUU ...3'. Эффективность образования 30S 1С рассчитывали как отношение количеств комплексов, связанных на фильтрах, к исходному количеству 30S субчастиц (Рис. 14). Наиболее важным для эффективного образования 30S 1С является наличие фактора IF2, который способствует связыванию fMet-TPHKfMet.

100 80 60 40 20 О

till Пі п.

IF1,2,3 IF1,2 IF2,3 IF1.3

O WT

■ ArsmB/¿\rsmD

Рис. 14. Эффективность образования З 0S 1С в зависимости от наличия инициаторных факторов для 30S субчастиц дикого и мутантного типов. Образование 30S 1С проводили в буфере Tris С1 (50 мМ), nh4ci (70 мМ), KCI (30 мМ), Mg(OAc)2 (20 мМ) в присутствии GTP (1 мМ).

Отсутствие модификации G966/C967 приводило к уменьшению эффективности образования 30S 1С на величину порядка 20% для всех комбинаций факторов инициации.

RelE-принтинг показывает накопление 30S 1С за время обработки комплексов белком RelE, разрезающим мРНК в А-участке 30S субчастицы. Использованная мРНК соответствовала началу кодирующей области Flue гена из конструкции Ara2: 5'...UCU AAGGAGGUU AUA АСС AUG CUC GAA GAC...3'.. Количества полноразмерной и расщепленной RelE мРНК мы оценивали с помощью обратной транскрипции. Результаты показали небольшое уменьшение эффективности образования 30S 1С для мутантных 30S субчастиц по сравнению с 30S субчастицами дикого типа для всех комбинаций факторов инициации (Рис. 14). Однако при использовании данного подхода наиболее важным для эффективного образования 30S 1С является IF3. Очевидно, связывание на нитроцеллюлозных фильтрах является более адекватным подходом, поскольку разрезание белком RelE мРНК в А-участке может влиять на структуру 30S 1С. Так или иначе, мы не обнаружили какого-либо фактор-специфического влияния модификаций m2G966/m5C967 на эффективность образования 30S 1С.

fMet-тРНК"*" IF1 IF2 IF3

полноразмерная мРНК

сигнал разрезания RelE

WT ArsmB/ArsmD

••••••• О•••••••

)fOitOO О • О • • о

•• о • • о > • • о • •

• • •• •

■А . штШЛ

щ щ m ** : ЯЩ,' '

Рис. 15.

Эффективность образования 30S 1С с 30S субчастицами дикого типа (WT) и мутантного типа (ArsmBÍ&rsmD) с различными комбинациями факторов инициации, определенная методом Reí Е-пршггинга.

Образование 30S 1С проводили в буфере HEPES-KOH рН 7,5 (20 мМ), MgfOAcb (20 мМ), NH4OAc (200 мМ), р-меркаптоэтанол (4 мМ) в присутствии GTP (1 мМ)

6. Изучение образования 30S инициаторных комплексов с 30S субчастицами дикого и мутантного типов с помощью методов быстрой кинетики.

Формирование 30S 1С начинается с ассоциации IF1, ÍF2, IF3 с 30S субчастицей. После этого связываются fMet-TPHK™" и мРНК и образуется 30S пре-инициаторный комплекс (pre-30S 1С). Самой долгой стадией является последняя, когда происходит конформационная перестройка pre-30S 1С и образуется дуплекс кодон-антикодон в Р-участке 30S субчастицы. При образовании 30S 1С происходит дискриминация инициаторных кодонов мРНК, отличных от AUG. Главную роль в этом играет фактор IF3.

С помощью метода остановленного потока мы исследовали влияние модифицированных нуклеотидов m2G966/m:'C967 на связывание fívíet-TPHKfMM с образованием 30S 1С. Этот подход, наряду со связыванием на нитроцеллюлозных фильтрах, был использован для определения скоростей и порядка элементарных стадий образования как 30S, так и 70S инициаторных комплексов. Метод позволяет за тысячные доли секунды смешать одинаковые объемы компонентов реакции, которые практически выстреливаются под действием центрального поршня в смеситель. Протекание реакции контролируется по изменению оптической плотности реакционной смеси или по изменению флуоресценции метки, введенной в компонент реакции.

Для определения скорости ассоциации fMet-tphkfmm с 30S субчастицами дикого и мутантного типов в установке остановленного потока смешивали 30S*IF1*IF2*IF3 (А1х488)*мРНК, содержащий донор флуоресценции, и меченую fMet-tphkrm" (QSY35), несущую тушитель флуоресценции (Рис. 16, А). Мы использовали несколько мРНК: trpL мРНК содержала кодирующую и 5'нетранслируемую области trpL. Чтобы исследовать влияние модификаций G966/C967 на отбор инициаторного кодона, мы использовали модельные мРНК 022 с разными инициаторными кодонами: AUG, AUU, UUG. мРНК 022AUG 5'... UUA АСА GGU AUA CAU ACU AUG UUU ACG AUU ...3' мРНК 022AUU 5'... UUA АСА GGU AUA CAU ACU AUU UUU ACG AUU ...3' мРНК 022AUU 5'... UUA АСА GGU AUA CAU ACU UUG UUU ACG AUU ...3' мРНК 12 trpL 5'... GUA AAA AGG GUA UCG АСА AUG AAA GCA AUU ...3' Кривая изменения сигнала флуоресценции отражает тушение флуоресценции при связывании тРНК с 30S 1С (Рис. 16, Б). Мы определили кинетические параметры ассоциации тРНК с 30S 1С, запрограммированного 022AUG и 022AUU мРНК. Мы не обнаружили существенных отличий в константах скорости ассоциации тРНК для разных типов 30S субчастиц. Однако, мы наблюдали заметное уменьшение амплитуд сигнала FRET для мутантных 30S субчастиц по сравнению с 30S субчастицами дикого типа (Рис. 16, В). Аналогичный результат был получен для всех использованных мРНК. Это может быть обусловлено ухудшением связывания тРНК и/или отличной конформацией 30S 1С, приводящей к изменению взаимного расположения донора и тушителя флуоресценции. Мы наблюдали снижение эффективности образования 30S 1С на 20% в отсутствие метилирования G966/C967 при связывании 30S 1С на нитроцеллюлозных фильтрах.

Поэтому более вероятной причиной уменьшения амплитуды флуоресценции является уменьшение степени связывания тРНК с ЗОЭ 1С в отсутствии модификации 0966/С967.

I

IF3 А1еха488 донор флуоресценции

OSY35 тушитель флуоресценции, fMet-тРНК '1'

1,00

1 ArsmBíArsmD 30S ■ 022AUG мРНК

2 • ДгетВ/Лге/nD 30S IrpL мРНК

WT 30S - tfpL мРНК WT 30S - 022AUG МРНК

0.2

□ WT

■ ArsmB/irsmD

0 60 100

022AUG 022AUU

Рис. 16. А. Схема образования 30S 1С. Б Изменение сигнала FRET при связывании IF3 (А1х488) и fMet-тРНКгМя (QSY35) в 30S 1С с 022AUG и trpL мРНК. Концентрация 1F3 (А1х488) составляла 0,06 мкМ, концентрация 30S субчастиц - 0,045 мкМ, концентрация тРНК 0,15 мкМ. В. Амплитуды реакций образования 30S 1С с 022AUG и 022AUU мРНК. Образование 30S 1С проводили в буфере HEPES-KOH рН 7,5 (20 мМ), Mg(OAc)3 (7 мМ), NH4OAc (200 мМ), р-меркаптоэтанол (4 мМ) в присутствии GTP (1 мМ).

Нельзя полностью исключить также изменение конформации 30S 1С в отсутствие метилирования G966/C967. Цистеин 166 IF3 и тиоуридин 8 fMct-tphkfmcl, несущие флуоресцентные метки, находятся достаточно далеко друг от друга в 3QS 1С (Рис, 17). Тогда предполагаемые конформационные изменения должны затрагивать не только Р-

тРНК,

Отмечены

флуоресцентно-меченые остатки №3 (А1еха488 в положении С166), ¡Ме^тРИК/"1 (тио-Ш С>5У35), и №1 (А1еха555 в положении С4) в структуре ЗОЭ 1С (ЗОв субчастииа не показана, вид с головы 308). Б. Модель взаимодействия №3, построенная на результатах криоэлектронной микроскопии ЗОБ 1С, Слева изображены желтым - 305 субчастица, зеленым - №2, оранжевым - ШЗ, С и N концевые домены, красным - тРНК, Справа 1РЗ изображен оранжевым, 308 субчастица - серым, синим отмечены участки 165 рРНК, взаимодействующие с №3 по данным гидроксил-радикального пробинга,

В соответствии с литературными данными мы не обнаружили различий в скорости ассоциации тРНК с 30Э 1С, запрограммированных 022АШ и 022А1Ш мРНК. Ассоциация тРНК происходит одинаково для 022Аий и 022Аии мРНК и даже в отсутствие мРНК из-за высокой аффинности 1Р2 к тРНК и 30Э субчастице. Известно, что существенно понижена стабильность тРНК в ЗОБ 1С, запрограммированного 022АШ мРНК.

Мы исследовали стабильность Ше1-тРНКгМа в Р-участке 30Э 1С, содержащего ЗОЭ субчастицы дикого или мутантного типов. Изучение диссоциации ЗОБ 1С показало значительную разницу в стабильности Ше1-тРНКгМи в зависимости от старт-кодона мРНК. Поэтому диссоциацию 308 1С, запрограммированного 022А11и мРНК, наблюдали

при разведении реакционных смесей в 2 раза (концентрации комплексов уменьшали от 0,2 до 0,1 мкМ). В то же время стабильность тРНК в 308 1С, запрограммированного 022АИО мРНК, оценивали при добавлении в реакционную смесь 10-кратного избытка немеченой ЙЛеС-тРНКсМ" Изменения количества 305 1С в зависимости от времени определяли при связывании на нитроцеллюлозных фильтрах (Рис. 18, А, Б). Скорость полураспада инициаторных комплексов гораздо выше для ЗОБ 1С, запрограммированного 022А1Ги мРНК, чем для ЗОЭ 1С, запрограммированного 022АШ мРНК. Метилирование 0966/С967 оказывало влияние на уровень связывания 1Ме1-тРНКгМе' с ЗОБ 1С. Для ЗОБ субчастиц мутантного типа эффективность начального образования инициаторных комплексов понижена с 70% до 58% для ЗОБ 1С, запрограммированных 022АиС мРНК и с 50% до 35% для ЗОЭ 1С, запрограммированных 022АОТ мРНК (Рис.18, А, Б).

Мы определили кинетические параметры диссоциации инициаторного комплекса, содержащего ЗОБ субчастицы дикого или мутантного типов. Известно, что в присутствии ШЗ ЗОБ 1С, запрограммированный 022А1Ю мРНК, диссоциирует гораздо быстрее, чем комплекс, запрограммированный 022АиС мРНК. Для анализа методом остановленного потока ЗОЭ 1С, содержащий донор флуоресценции №3 (А1х488) и тушитель флуоресценции МеЬтРНКг"" (05У35), смешивали с 20-кратным избытком немеченой fMet-тPHKfMel и детектировали разгорание флуоресценции №3 (А1х488) (Рис. 18, В, Г). Изменение сигнала флуоресценции очень мало в случае 022А1Ю мРНК, поскольку тРНК в этих условиях практически не покидает комплекс. В случае 022АЦи мРНК мы не наблюдали существенного влияния модификации 0966/С967 на скорость обмена 1Ме(> тРНК/4" (Рис. 18, Г). Амплитуда изменения сигнала флуоресценции была понижена для мутантных ЗОЭ субчастиц, как и при связывании МеЬтРНКГ6 1 в рге-ЗОЭ 1С.

022AUG МРНК

G22AUU мРНК

WT

ArsmB/ûrsmD

20 40 60 80

время, мин

WT

ArsmS/ürsmD

022AUG мРНК

022AUU МРНК

WT

ArsmB/ürsmD

50 100 1S0 время, се к

Рис. 18. Стабильность fMet-TPHKfMa в 30S 1С с 022AUG (А, В) и 022AUU (Б, Г) мРНК. А, Б. Количества 30S 1С с 3ÛS субчастицами дикого типа (•) и 30S субчастицами мутантного типа (о) в зависимости от времени, определенные с помощью связывания на нитроцеллюлозных фильтрах. В, Г. Сигнал FRET при добавлении к 30S 1С, избытка немеченой fMe(-TPHKfMu. Эксперименты проводили в буфере HEPES-KOH рН 7,5 (20 мМ), Mg(OAc)2 (7 мМ), NH„OAc (200 мМ), (3-меркаптоэганол (4 мМ) в присутствии OTP (1 мМ)

Образование 70S 1С лимитирует уход фактора IF3 из 30S инициаторного комплекса. Известно, что скорость ухода IF3 из 30S 1С гораздо меньше в случае AUU старт-кодона по сравнению с AUG старт-кодоном. С помощью метода остановленного потока мы определили скорость обмена IF3 в 30S 1С для 30S субчастиц дикого и мутантного типов. 30S инициаторные комплексы, запрограммированные 022AUG или 022AUU мРНК,

30S WT 022AUG

30S ArsmBMrsrnD 022AUG

30S WT022AUU

30S ,jrsmBMrsmD 022АШ

содержали меченые факторы IF1 (Alx555), IF3 (Alx488), несущие донор и акцептор флуоресценции. Мы наблюдали уменьшение сигнала FRET при смешивании 3 OS 1С с 10-кратным избытком немеченого 1F3. Обмен IF3 в 30S 1С, запрограммированных 022AUU мРНК, происходит крайне медленно по сравнению с 30S [С, запрограммированных 022 AUG мРНК (Рис. 19).

Рис. 19. Диссоциация 1F3 из 30S 1С с 30S субчастицами дикого и мутантного типов и

3 j "V _ „ „, „ „ „ 022AUG или 022AW мРНК.

I 0.4 \Ч. Л ^^fIBi\rSmD022AUG Показано изменение сигнала

FRET между [Fl(Alx555) и [F3(Alx488) в зависимости от времени в логарифмической шкале. Эксперименты

проводили в буфере HEPES-КОН рН 7,5 (20 мМ), Mg(OAch (7 мМ), NH4OAC (200 мМ), Р-меркаптоэтанол (4мМ) в присутствии GTP (1 мМ)

Метилирование G966/C967 не влияло на скорости обмена IF3 в 30S 1С, запрограммированных 022AUG и 022 AUU мРНК. Общая амплитуда была одинакова для всех типов 30S 1С. Уменьшение амплитуды первой стадии реакции (до 10 секунд) в 1,7 раза для 30S субчастиц мутантного типа, возможно, является следствием ухудшения связывания тРНК с 30S 1С. Из представленных данных можно сделать вывод, что метилирование G966/C967 повышает эффективность связывания тРНК с 30S инициаторным комплексом, но не влияет на аффинность фактора IF3 к 30S 1С.

7. Влияние модифицированных нуклеотидов mzG966/msC967 на эффективность образования 70S 1С in vitro.

Формирование 70S 1С и образование первой пептидной связи существенно замедленны для мРНК с АШ старт-кодоном по сравнению с мРНК с AUG старт-кодоном. Мы исследовали образование 70S 1С для рибосом дикого и мутантного типов с помощью связывания на нитроцеллюлозных фильтрах. Для этого субчастицы рибосом предварительно инкубировали в буфере с высокой концентрацией Mg(OAc)2 (20 мМ) и затем добавляли остальные компоненты 70S 1С. В данных условиях лимитирующей стадией была диссоциация 70S субчастиц фактором IF3. Эффективность образования 70S 1С, содержащих H]Met-TPHKfMa, определяли, рассчитывая отношение количества 70S 1С, связанного на фильтрах, к количеству 70S рибосом, взятых в реакцию (Рис. 20). Мы не обнаружили разницы в скорости образования 70S 1С для рибосом дикого и мутантного типов. Это свидетельствует о том, что скорость диссоциации 70S рибосом фактором IF3 также не меняется в отсутствие метилирования G966/C967. Однако эффективность образования 70S 1С в отсутствие метилирования G966/C967 была на 15% ниже для 022AUG мРНК и на 20% ниже для 022AUU мРНК. Очевидно, уменьшение эффективности образования 30S 1С для мутантных 30S субчастиц приводит к заниженному уровню образования 70S 1С.

20 40 ВО время, мин

WT m022AUG +1F3 lirsmßMrsmD m022AUG +IF3 WT m022AUU + IF3 ârsmBMrsmD m022AUU +IF3 WT-mRNA +IF3 WT m022AUG -IF3 ¿srsmBürsmD m022AUG -IF3 ArsmBMrsmD -mRNA +IP3

Рис. 20. Образование 70S 1С для рибосом дикого и мутантного типов в зависимости от времени. 70S рибосомы предварительно проинкубировали в буфере Tris (50 мМ), NH,Cl (70 мМ), KCl (30 мМ), Mg(OAc)2 (20 мМ), после чего добавляли остальные компоненты 70S 1С. Образование 70S 1С детектировали при связывании на

нитроцеллюлозных фильтрах.

8 Эффективность инициации трансляции в штаммах дикого н мутантного типа in vivo.

Мы оценили эффективность инициации с различными инициаторными кодонами мРНК in vivo с помощью репортерных конструкций с генами flue, rluc. люцифераз. Мы заменили инициаторный AUG кодон тени flue в конструкции ага2 на GUG, UUG, CUG, AUU кодоны и измерили активность белков репортеров в штамме дикого типа и ArsmB/ArsmD штамме. Чтобы изучить влияние метилирования G966/C967 на эффективность инициации трансляции с безлидерной мРНК, мы также удалили 5'- нетранслируемую область гена Flue (Рис. 21, слева).

р"' Rluc p*"SUTR flue

xjgyal

p'-'butr Hue

p-" Rluc I 1 AUG

ÍÍ

p hi

г <Шв~

a-.

xJШZZD:

p-' riuc о

■uuo

иге !505~

игк

JSäT.

Г (AUG

) -¡AUG

в

Рис. 21. Эффективность инициации трансляции на различных инициаторных кодонах в штаммах дикого и мутантного типов in vivo. Слева изображено строение репортерных конструкций на основе ara2AUG (верхняя конструкция) с заменами инициаториого кодона на GUG, UUG, CUG, AUU и удалением лидерпой области Flue (безлидерная мРНК).

Результаты показали уменьшение относительной эффективности инициации трансляции in vivo для всех инициаторных кодонов относительно AUG старт-кодона в мутантном штамме (Рис. 21, справа). Наиболее заметный эффект наблюдали для UUG и AUU кодонов.

Таким образом, дестабилизация инициаторной тРНК в Р-участке 30S субчастиц мутантного типа в 30S 1С и 70S 1С приводит к уменьшению эффективности трансляции мРНК с неканоническими инициаторными кодонами in vivo. Модифицированные нуклеотиды ш' !G966/m5C967 повышают эффективность инициации трансляции, что особенно важно для мРНК с инициаторными кодонами отличными от AUG. Расположение модифицированных нуклеотидов mJG966 и ш5С967 в структуре комплекса 70S*mPHK*tPHK позволяет предположить их участие в стабилизации пары кодон-антикодонового дуплекса в третьем положении кодона. Это может быть особенно важно для AUU инициаториого кодона, поскольку он имеет неспаренное основание в третьем положении.

Несмотря на широкую известность и высокую консервативность многих модифицированных нуклеотидов рРНК точная функция определена пока только для нескольких из более тридцати модификаций в рРНК Escherichia coli. На сегодняшний день в литературе очень мало примеров изучения роли модифицированных нуклеотидов рРНК бактерий на молекулярном уровне. В данной работе было показано, что в отсутствие метилирования G966/C967 16S рРНК клетки Escherichia coli становятся чувствительными к пониженной температуре. Кроме того, в ArsmB/ArsmD штамме нарушена регуляция триптофанового оперона. Исходя из результатов, полученных in vitro, можно предположить, что метилирования G966/C967 стабилизирует инициаторную тРНК в Р-участке рибосомы.

Условия жизни Escherichia coli в окружающей среде существенно отличаются от лабораторных условий. При изменении температуры, недостатке питательных веществ, вынужденной экспрессии белков с мобильных элементов клетки, не содержащие метилтрансфераз rsmB, rsmD, не выдержат конкуренцию с клетками дикого типа.

ВЫВОДЫ

1. Метилирование нуклеотидов G966/C967 16S рРНК необходимо для адаптации клеток Escherichia coli к пониженной температуре.

2. Метилирование нуклеотидов G966/C967 16S рРНК повышает стабильность инициаторного комплекса.

3. Метилирование нуклеотидов G966/C967 16S рРНК необходимо для функционирования механизма аттегаоации транскрипции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пуа А. Osterman, Irina V. Prokhorova, Vasily О. Sysoev, Yulia V. Boykova,01ga V. Eftemenkova, Maxim S. Svetlov, Vyacheslav A. Kolb, Alexey A. Bogdanov,Petr V. Sergiev, and Olga A. Dontsova. Attenuation based dual fluorescent protein reporter for screening translation inhibitors. (2012) Antimicrob. Agents Chemother, published ahead of print 17 January, doi:10.1128/AAC.05395-11

2. Сергиев П.В., Остерман И.А., Прохорова И.В., Нестерчук М.В., Сергеева О.В., Головина А.Я., Демина И.А., Рогова М.А., Серебрякова М.В., Говорун В.М., Богданов A.A., Донцова O.A. Опыт изучения методами системной биологии функциональной роли ферментативной модификации бактериальной рибосомы. (2011). Биоорганическая химия. Том 37, №1; стр. 81-90.

3. Sergiev, P.V., Golovina A.Y., Prokhorova I.V., Sergeeva O.V., Osterman I.A., Nesterchuk, M.V., Burakovsky D.E., Bogdanov, A.A., Dontsova, O.A. Modifications of ribosomal RNA: from enzymes to function. In Ribosomes structure, function, and dynamics. Eds. Rodnina, M.V., Wintermeyer, W., Green, R„ 2011, Springer, Wien, NewYork. p. 97-111.

4. Irina V. Prokhorova, Dmitry E. Burakovsky, Petr V. Sergiev, Alexey A. Bogdanov, Marina V. Rodnina, and Olga A. Dontsova. Influence of G966/C967 methylation in 16S rRNA Escherichia coli on translation. (2010). "Ribosomes 2010", Abstract book, p. 201

5. Petr V. Sergiev, Irina V. Prohorova, Ilya A. Osterman, Olga V. Sergeeva, Anna Y. Golovina, Mikhail V. Nesterchuk, Dmitry E. Burakovsky, Pohl Milon, Irina V. Demina, Marina V. Serebryakova, Vadim M. Govorun, Alexey A. Bogdanov & Olga A. Dontsova. Ribosome modification in regulatory networks of bacteria. "Ribosomes 2010", Abstract book, p. 215

6. Irina Prokhorova, Dr. Petr Sergiev, Prof. Olga Dontsova, Prof. Roland Hartmann. Influence of m2G966/m5C967 methylation on translation initiation. (2010) On-site evaluation of the IRTG 1384, p. 50

8. P. V. Sergiev, I. V. Prokhorova, D. E. Burakovsky, P. Milon, M. V. Serebryakova, I. A. Demina, M. A. Galyamova, V. M. Govorun, A. A. Bogdanov, M. V. Rodnina and O. A. Dontsova. Functional role of ribosomal RNA methylation. (2011). 36th FEBS CONGRESS Biochemistry for Tomorrow's Medicine", Abstract book, p. 10.

9. Petr V. Sergiev, Irina V. Prokhorova, Dmitry E. Burakovsky, Pohl Milon, Marina V. Serebryakova, Irina A. Demina, Maria A. Galyamova, Vadim M. Govorun, Alexey A. Bogdanov, Marina V. Rodnina and Olga A. Dontsova. Methylation of m2G966/m5C967 in the 16S rRNA is Needed for Translation Control of Gene Expression in Escherichia coli. (2011). The 16th Annual Meeting of the RNA Society, Abstract book, p. 279.

10. П.В. Сергиев, И.А.Остерман, И.В. Прохорова, M.B. Нестерчук, O.B. Сергеева, А.Я. Головина, И.А. Демина, М.А. Галямина, М.В. Серебрякова, O.A. Донцова. РНК-метилтрансферазы Escherichia coli. От поиска генов к изучению регуляторных путей. (2011). Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», сборник тезисов, стр. 92.

Подписано в печать 08.02.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1181 Отпечатано в ООО «Соцветие красою) 119991 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. А-102

61 12-2/285

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет Кафедра химии природных соединений

ПРОХОРОВА ИРИНА ВАЛЕРЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ МЕТИЛИРОВАНИЯ G966/C967 16S РРНК Escherichia coli

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент Сергиев П.В.

Москва - 2012

Содержание

Список сокращений....................................................................................................................3

Введение........................................................................................................................................4

Обзор литературы.......................................................................................................................6

Регуляция трансляции на стадии инициации.........................................................................7

Роль фактора IF3 в регуляции инициации трансляции......................................................8

Регуляция инициации: «арест» 30S пре-инициаторного комплекса:.............................10

Регуляция инициации: «сопряженная» трансляция.........................................................13

Регуляция инициации на стадии образования 30S пре-инициаторного комплекса:

«конкуренция» за мРНК.....................................................................................................14

Регуляция трансляции спектиномицинового оперона.....................................................17

Регуляция трансляции стрептомицинового оперона.......................................................19

Регуляция трансляции rplKAJL-rpoBC оперона...............................................................20

Регуляция трансляции белка S1.........................................................................................23

Регуляция трансляции белков бактериофагов..................................................................25

Адаптация бактерий к различным условиям посредством регуляции трансляции..........26

РНК-термосенсоры: адаптация к холодовому шоку на стадии инициации трансляции.

...............................................................................................................................................26

РНК-термосенсоры: адаптация к тепловому шоку на стадии инициации трансляции.

...............................................................................................................................................29

Регуляция трансляции малыми некодирующими РНК........................................................31

Регуляция системы токсин-антитоксин с помощью мнкРНК.........................................33

Роль мнкРНК в активации различных метаболических путей и адаптации бактерий к

стрессовым условиям..........................................................................................................35

Роль мнкРНК в регуляции экспрессии факторов вирулентности бактерий и передаче

межклеточных сигналов («quorum sensing»)....................................................................39

Взаимодействие рибосомы с РНК-полимеразой, аттенюация и анти терминация

транскрипции...........................................................................................................................42

Регуляция экспрессии S10 оперона, антитерминация транскрипции............................44

Регуляция экспрессии белков биосинтеза аминокислот: аттенюация транскрипции. .46 Механизмы регуляции, основанные на остановке трансляции при связывании с

рибосомой низкомолекулярных кофакторов........................................................................49

Регуляция трансляции РНК рибопереключателями........................................................55

Роль метилирования в регуляции трансляции......................................................................61

Роль метилирования 16S рРНК в регуляции трансляции на стадии инициации..........61

Диметилирование остатков А1518, А1519 16S рРНК......................................................64

Роль метилирования в поддержании структуры элементов рРНК: метилирование по

2'-ОН группе........................................................................................................................65

Роль метилирования тРНК в поддержании рамки считывания......................................67

Метилирование как вторичная функция рРНК метилтрансфераз..................................68

Роль метилирования G966/C967 в 16S рРНК...................................................................68

Обсуждение результатов..........................................................................................................71

Постановка задачи...................................................................................................................71

Характеристика фенотипа мутантного штамма ArsmB/A.rsmD...........................................71

Анализ холодочувствительного фенотипа штамма ArsmB/ArsmD.....................................74

Влияние метилирования G966/C967 на белковый состав клетки.......................................76

Влияние метилирования G966/C967 на регуляцию триптофанового оперона E.coli.......79

Определение аффинности fMet-TPHKfMet к Р-участку 30S субчастиц дикого и

мутантного типов.....................................................................................................................83

Влияние метилирования G966/C967 на образование 30S инициаторных комплексов. ...84 Изучение образования 30S инициаторных комплексов с 30S субчастицами дикого и мутантного типов с помощью методов быстрой кинетики.................................................85

Влияние метилирования G966/C967 на эффективность образования 70S 1С in vitro.......90

Эффективность инициации трансляции в штаммах дикого и мутантного типа in vivo. ..91

Материалы и методы................................................................................................................95

Реактивы...................................................................................................................................95

Буферы и растворы..................................................................................................................95

Конструирование штамма с двойной делецией генов rsmB/rsmD......................................96

Сравнение протеом штаммов дикого типа и мутантного ArsmBIArsmD............................98

Идентификация белковых зон при помощи МАЛДИ масс спектрометрическим анализа.

...................................................................................................................................................99

Измерение точности инициации трансляции с помощью репортерных конструкций in

vivo............................................................................................................................................99

Создание плазмид pAra2AUG, pAra2GUG, pAra2UUG, pAra2CUG, pAra2AUU, pAra2TrpL, pAra2TrpL-trpE, pAra2TrpLtrpE2A несущих гены репортеров Flue, Rluc. 99 Трансформация штаммов дикого типа и мутантного ArsmB/ArsmD репортерными

конструкциями и измерение активности белков репортеров Flue, Rluc......................101

Измерение количеств мРНК белков Flue, Rluc, экспрессированных в штаммах дикого типа и мутантного ArsmB/ArsmD, несущих плазмиды pAra2TrpL и pAra2TrpL-trpE,

методом RT-qPCR..................................................................................................................102

Выделение суммарной РНК и проведение обратной транскрипции............................102

Проведение количественного ПЦР анализа в реальном времени................................103

Исследование рибосомных профилей из клеток дикого типа и мутантного

ArsmB/ArsmD, выращенных при 37°С и 18°С.....................................................................103

Выделение рибосом из штаммов дикого типа и мутантного ArsmB/ArsmD...................104

Получение препаратов мРНК...............................................................................................104

Детекция образования 70SIC, 30SIC и комплексов f[3H]Met-TPHKfMet с 30S

субчастицами при связывании на нироцеллюлозных фильтрах.......................................106

Определение эффективности образования 30SIC методом RelE-принтинга..................106

Анализ модификации рРНК с помощью реакции обратной транскрипции....................108

Исследование этапов образования 30SIC методом «stopped flow»..................................109

Выводы......................................................................................................................................Ill

Список литературы.................................................................................................................112

Список сокращений

мРНК - матричная РНК

тРНК - транспортная РНК

IF1, IF2, IF3 - факторы инициации 1, 2, 3

EF-Tu - фактор элогации Tu

EF-G - фактор элонгации G

RF1, RF2, RF3 - факторы терминации 1, 2, 3

RRF - фактор рециклирования

elFl - фактор инициации 1 эукариот

RNAP, a2ßß' - РНК-полимераза

РСА - рентгено-структурный анализ

н. - нуклеотиды

GTP - гуанозинтрифосфат

Pre-30S 1С - 3 OS пре-инициаторный комплекс

3OS 1С - 3OS инициаторный комплекс

70S 1С - 70S инициаторный комплекс

SAM - S-аденозилметионин

«stopped flow» - метод остановленного потока

RT-qPCR - обратная транскрипции с последующим количественным ПЦР анализом ИЭФ - изоэлектрофокусировка

МАЛДИ - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация 5'-UTR - 5'-нетранслируемая область мРНК З'-UTR - З'-нетранслируемая область мРНК Kd - константа диссоциации

FRET - резонансный перенос энергии флуоресценции

Введение

Функциональные центры рибосомы, осуществляющей биосинтез белка, состоят преимущественно из остатков РНК. Во всех организмах рибосомные РНК содержат модифицированные нуклеотидные остатки. Кроме того, широко распространены модификации тРНК. Модификацию рРНК бактерий производят специализированные ферменты - рРНК-метилтрансферазы, псевдоуридинсинтазы, специфические практически для каждого из положений модифицированного остатка. Гены, кодирующие ферменты посттранскрипционной модификации, действующие на компоненты аппарата трансляции, составляют третью часть от всех генов, ассоциированных с трансляцией. Количество модифицированных нуклеотидных остатков увеличивается для эукариот по сравнению с прокариотами. Для них внесение модификаций осуществляют унифицированные ферменты, специфичность которых определяют малые ядерные РНК.

Несмотря на широкую известность и высокую консервативность многих модификаций строго определенная функция пока приписана только нескольким из более тридцати модификаций в рРНК Escherichia coli. Замена гена фермента на хромосоме бактерии приводит к отсутствию соответствующей модификации. На данный момент идентифицированы все гены, отвечающие за модификацию рРНК Escherichia coli за исключением гена одной рРНК-метилтрансферазы. Наличие штаммов, в каждом из которых инактивирован один из генов, отвечающих за образование определенного модифицированного нуклеотида, позволяет изучать роль соответствующих модификаций in vitro и in vivo. Существует несколько гипотез о роли модифицированных нуклеотидов, основные из них - это поддержание структуры рибосомы и тРНК и так называемая «настройка» работы рибосомы. Эти гипотезы не исключают друг друга, и скорее всего, будут дополнены новыми. Ни одна из модификаций не является строго необходимой для работы базовых стадий трансляции. Было показано, что 30S субчастица рибосомы, лишенная всех модификаций, сохраняет часть функциональной активности, в то время как 5OS субчастица, лишенная модификаций, полностью неактивна [1]. Ни один из генов модифицирующих ферментов бактерии Escherichia coli не является жизненно необходимым для клетки. Однако условия жизни бактерий в окружающей среде существенно отличаются от лабораторных условий. Таким образом, существует предположение, что наличие той или иной модификации может играть существенную роль в адаптации клетки к изменяющимся условиям. При этом за счет регуляции транскрипции и трансляции происходят изменения в экспрессии генов, необходимые для адаптации. Модификации рРНК и тРНК могут влиять на трансляцию не всех, но некоторых мРНК, что оказывается критическим в определенных условиях. Не менее

важна регуляция трансляции для поддержания нужных количеств и соотношений компонентов аппарата трансляции в клетке.

Обзор литературы

Рибосома осуществляет синтез белков во всех клетках, считывая информацию о последовательности аминокислот с матричной РНК. Этот процесс называется трансляцией. Уровень базовой трансляции в клетке может меняться в зависимости от условий окружающей среды, при этом рибосома участвует в регуляции экспрессии генов с помощью множества специфических механизмов. Регуляция трансляции вносит свой вклад в адаптацию клетки к внешним условиям. Для регуляции экспрессии генов рибосомы бактерий взаимодействуют с РНК-полимеразой, с различными белковыми факторами, низкомолекулярными веществами.

В процессе трансляции прокариот задействованы молекулы мРНК, тРНК, несущей аминокислоту, факторы инициации IF1, IF2, IF3, факторы элонгации EF-G и EF-Tu, факторы терминации RF1, RF2, RF3 и фактор рециклирования REF. Делеции генов большинства из этих факторов детальны для бактериальной клетки. На данный момент базовые принципы работы рибосомы на стадии инициации, элонгации и терминации трансляции изучены достаточно хорошо, тем не менее, не до конца выяснены многие аспекты ее работы в клетке. В частности, мало изучено, какова организация рибосом в полисомы, как аппарат трансляции адаптируется к недостатку питательных веществ и другим стрессовым условиям. Исследуется стратегии, с помощью которых бактериофаги, внедряющиеся в бактериальную клетку, переключают трансляцию с клеточных на фаговые мРНК, а также механизмы, использующиеся для корегуляции экспрессии всех компонентов трансляционного аппарата.

Регуляция работы рибосомы чаще всего осуществляется на стадии инициации трансляции. Эффективность инициации трансляции в свою очередь зависит от строения участка связывания с рибосомой на мРНК и от доступности этого участка для связывания с рибосомой. Образование вторичной и, в некоторых случаях, третичной структуры в мРНК происходит ко-транскрипционно, причем в бактериальной клетке трансляция может начаться, когда РНК-полимераза еще не закончила синтез мРНК. Таким образом, и РНК-полимераза, и рибосома могут влиять на сворачивание мРНК. Кроме того, вторичную структуру мРНК может изменять связывание белков, низкомолекулярных соединений, например свободной аминокислоты или антибиотика.

Для эффективного образования комплекса рибосомы с мРНК и тРНК во время инициации трансляции важны правильное позиционирование и геометрия дуплекса кодона мРНК с антикодоном тРНК. Окружение этого дуплекса в малой субчастице рибосомы преимущественно составляют остатки рибосомной РНК. Известно, что некоторые нуклеотидные остатки рРНК подвергаются посттранскрипционной

модификации. Они сосредоточены в функциональных центрах рибосомы, в том числе в участках связывания тРНК, Их роль на данный момент изучена слабо, известно, что некоторые из них участвуют в механизмах устойчивости клеток к антибиотикам» в то время как про функцию других практически ничего не известно. Не исключено участие модифицированных нуклеотидов и в регуляции трансляции. В данном обзоре будут рассмотрены механизмы регуляции трансляции, известные примеры влияния модификаций на различные этапы синтеза белка и их участия в регуляции синтеза белка.

Регуляция трансляции на стадии инициации

Среди трех этапов синтеза белка на рибосоме инициация трансляции больше всего подвержена регуляции. На стадии инициации происходит узнавание инициаторного AUG кодопа мРНК и образование 70S инициаторного комплекса (70S 1С) рибосомы с мРНК и инициаторноЙ íMet-TPHKfMct, связанной в Р-участкс рибосомы. На первом этапе образуется 30S пре-нпициаторный комплекс (pre-30S 1С), состоящий из 30S субчастицы, трех факторов IF1, IF2, IF3, мРНК и инициаторноЙ тРПК (рис. 1). Дуплекс между ко дон ом мРНК и антикодоном тРНК образуется не сразу, а в результате конформационных перестроек и аккомодации мРНК, При этом образуется 30S инициаторный комплекс (30S 1С), тРНК занимает так называемый P/I-участок, характерный только для стадии инициации [2]. На второй стадии присоединяется 50S субчастица, диссоциируют факторы инициации и образуется 70S инициаторный комплекс. тРНК занимает положение в классическом Р-участке, изменяется конформация 30S субчастицы и ее положение относительно 50S субчастицы [3]. В частности, «голова» 30S субчастицы переходит в «закрытую» конформацию, наклоняясь ближе к «телу» [4], Для протекания второй стадии необходим гидролиз GTP фактором 1F2.

элонгзция ТА р МИ НАЦИ Я

р«и,И;К.п.нрооа-нио_

Рис. I. Схема инициации трансляция прокариот. 30S субчастица рибосомы изображена желтым, 50S -темно-зеленым, факторы инициации [FL. JK2, 11-3 - синим, зеленым и голубым, соответственно, fívlet-TPHKfMel красным, мРНК - черным. Отмечены элементы 30S субчастицы: голова, тело, платформа, участок, содержащий последовательность анти-Шайн-Дальгарно, участок, связывающий мРНК («канал мРНК»), а также последовательность Шайн-Дальгарно и нницнаторный AUG кодон в мРНК [5].

Для мРНК прокариот характерно наличие двух элементов, обеспечивающих ее связывание с 30S 1С: это последовательность Шайн-Дальгарно и ннициаторный кодон. Они расположены в 5"-концевой области мРНК па расстоянии 4-7 нуклеотидов друг от друга. Последовательность Шайн-Дальгарно - это 4-8 нуклеотидов, комплементарных последовательности 3'-концевого домена 16S рРНК. Таким образом, образование дуплекса LI (айн-Дальгарно на стадии инициации обеспечивает высокую аффинность мРНК к рибосоме. Хотя известно, что инициация может идти и в отсутствие последовательности Шайн-Дальгарно, например для безлидерных мРНК или мРНК, содержащих участки узнавания белка S1. В качестве инициаторного кодона для бактерии Escherichia coli кроме AUG могут выступать также канонические GUG (17,3% генов), UUG (3,7% генов) и редко встречающиеся неканонические AUA, AUC, GUC, UUC, ACG, GUA. CUG. AUU кодопы (1-3% генов).

Роль фактора IF3 в регуляции инициации трансляции

Проверку геометрии кодон-антикодонового дуплекса осуществляет фактор инициации IF3 [6J, Он вызывает диссоциацию fMet-TPHKt-Mci при образовании пары отличной от Уотсон-Криковской в любом положении кодон-антикодоиового дуплекса кроме первого положения, где допускается образование U-U или