Рентгеноструктурное исследование комплекса рибосомного белка TL5 с фрагментом рибосомной 5S РНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ
|
Федоров, Роман Витальевич
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2000
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.04
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ • ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА _ л „
РГь ОД
ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ 2 ^ (т
На правах рукописи УДК 539.576.8
ФЕДОРОВ Роман Витальевич
РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСА
/
РИБОСОМНОГО БЕЛКА ТЬ5 С ФРАГМЕНТОМ РИБОСОМНОЙ 5Б РНК
Специальность 02.00.04 - "физическая химия"
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2000
Работа выполнена в Институте белка РАН
Научный руководитель: кандидат физико-математических наук
Никонов Станислав Владимирович
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Зоркий Петр Маркович
доктор физико-математических наук, профессор Андреева Наталья Сергеевна
Ведущая организация:
Институт биофизики клетки РАН
Защита состоится 10 ноября 2000 года в 16 часов 15 минут на заседании Диссертационного совета Д 053.05.44 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ им. М. В. Ломоносова, Химический факультет, аудитория 337.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.
Автореферат разослан « 5 »октября 2000 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д 053.05.44 -ут
кандидат химических наук М. С. Бобылева
Etft.M-A't-fyO-
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Во всех живых организмах биосинтез белка осуществляется на рибосомах. В основе структурной организации и функционирования рибосом бактерий лежит взаимодействие трех рибосомных РНК и нескольких десятков белков. Сложный состав рибосомы существенно затрудняет построение моделей высокого разрешения, поэтому весьма актуальными являются структурные исследования ее отдельных компонентов. Кроме того, определение структур компонентов рибосомы как в свободном так и в связанном состоянии необходимо для последующего конформационного анализа и построения динамической модели рибосомы, с тем или иным приближением воспроизводящей процесс биосинтеза белков. Несмотря на интенсивные исследования структур рибосомы и ее компонентов, взаимодействия между рибосомными белками и рРНК изучены достаточно слабо. Структуры рРНК-белковых комплексов создают основу для изучения таких взаимодействий и могут быть использованы при построении детальной модели рибосомы.
Цель работы
Цель настоящей работы - определение пространственной структуры и структурный анализ комплекса рибосомного белка TL5 из экстремально-термофильной бактерии Thermits themophilus с фрагментом рибосомной 5S РНК из Escherichia coli.
Научная новизна
Впервые определена структура комплекса рибосомного белка TL5 с фрагментом рибосомной 5S РНК с атомным разрешением. Проведенный анализ взаимодействий между компонентами комплекса и сравнение структуры TL5-рРНК с гомологичной структурой комплекса L25-pPHK из Escherichia coli позволили выявить важный структурный элемент, который может отвечать за образование комплекса. Показано, что гомологичный белкам СТС С-концевой домен TL5 имеет уникальную укладку и особую форму поверхности с характерным распределением отрицательно заряженных остатков. Структура С-концевого домена белка TL5 является первой определенной структурой С-концевого домена белков семейства СТС и может быть использована для дальнейших структурных исследований белков этого семейства.
Публикации и апробация работы
По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы. Результаты работы докладывались на 5 конференциях. Координаты атомов окончательной модели комплекса TL5-pPHK занесены в RCSB Protein Data Bank (код 1FEU).
Объём н структура работы
Диссертационная работа изложена на 155 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 31 рисунок, 9 таблиц. Список литературы включает 166 источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объект исследования
TL5 является одним из рибосомных белков, которые специфически связываются с 5S рРНК в Thermus thermophilus. N-концевая часть аминокислотной последовательности TL5 гомологична 5S рРНК связывающему белку L25 из Escherichia coli, в то время как С-концевая часть обладает высокой степенью гомологии с аминокислотными последовательностями шоковых белков семейства СТС. Ранее было показано, что TL5 является функциональным аналогом L25, а N-концевой фрагмент TL5, включающий 91 аминокислотный остаток, связывается с тем же самым участком 5S рРНК, что и L25. Кроме того, TL5 может вытеснять белок L25 из его комплекса с 5S рРНК. Фрагмент 5S рРНК из Escherichia coli, использованный для получения РНК-белкового комплекса, включает спираль IV, петлю Е, спираль V и часть петли А.
Определение пространственной структуры комплекса TL5-pPHK
Кристаллизация комплекса белка TL5 с фрагментом 5S рРНК.
Кристаллизацию комплекса рибосомного белка TL5 из Thermus thermophilus и фрагмента рибосомной 5S РНК из Escherichia coli (40 нуклеотидов) проводили методом диффузии паров в висячей капле. Перед кристаллизацией РНК и белок раздельно переводили диализом в буфер: ЮмМ какодилат-Ыа, рН-7.0; 4мМ MgCl2; ЮОмМ КС1. После этого смешивали РНК и белок в молярном соотношении 1:1 и инкубировали при 40°С в течении 20-30 минут. Концентрация комплекса в растворе была 2-4 мг/мл. Каплю раствора комплекса помещали в центр силиконированного покровного стекла размером 25 х 25 х 1.5 мм и прибавляли к ней равный объем раствора осадителя, который включал в себя 10 мМ какодилат-Ыа (рН=7.0), 100 мМ MgCl2, 4 мМ CdCl2 и 7% 2-метил-2,4-пентандиол (МПД). Соль CdCl2 была добавлена в кристаллизационный раствор с целью улучшения качества кристаллов комплекса TL5-pPHK. Стекло с каплей объемом 10-20 микролитров смеси для кристаллизации помещали над стаканчиком с 0.5 мл противораствора. Противораствор содержал 200 мМ КС1 и 12% МПД. Полученные кристаллы
представляли собой гексагональные линзы и достигали в длину до 0.7 мм с диаметром 0.2 мм.
Нахождение условий замораживания кристаллов.
Тестирование кристаллов комплекса проводили при комнатной температуре, однако, время жизни кристаллов в пучке оказалось недостаточным для получения полного набора данных с одного кристалла. Для увеличения времени жизни кристаллы замораживали и съёмку проводили при 11 ОК. Поскольку кристаллизацию комплекса проводили при высокой концентрации хлорида калия в капле, нахождение условий замораживания кристаллов оказалось затруднительным. Использование стандартных криопротектантов, таких как глицерин, МПД, этиленгликоль и полиэтиленгликоль (ПЭГ) различных молекулярных весов в необходимой концентрации, вызывало выпадение соли. Понижение концентрации соли приводило, в свою очередь, к растворению кристаллов комплекса. Единственным подходящим криопротектантом оказался следующий раствор: 10 мМ какодилат-Na (рН=7.0), 100 мМ MgCI2, 100 мМ КС1, 4 мМ CdCl2, 15% МПД, 10% ПЭГ - молекулярный вес 400. Кристаллы вымачивались в этом растворе в течении одного часа и быстро замораживались в жидком азоте. В замороженном состоянии под жидким азотом кристаллы могли храниться в течение двух недель. Время жизни кристаллов в пучке было достаточным для получения наборов данных с одного кристалла с 3-10 кратной избыточностью.
Получение тяжелоатомных производных кристаллов.
Тяжелоатомные производные кристаллов комплексов получали методом диффузии тяжелоатомных соединений в кристалл. Для вымачивания кристаллов использовали 0.5-10 мМ растворы тяжелоатомных соединений в 2.4 М сульфате аммония, 100 мМ Na-какодилата, рН=6.2, или раствор криопротектанта. Время вымачивания определялось экспериментально. Были опробованы более 25 различных соединений. Из всех опробованных тяжелоатомных соединений только соль K2PtCU дала кристаллы с существенной величиной замещения. С этих кристаллов были сняты наборы данных при длинах волн близких к оптимальным для получения аномального сигнала. Однако, отсутствие изоморфизма и низкое отношение аномального сигнала к шуму не позволило использовать эти производные для расчета фаз. Параллельно был выделен и закристаллизован в составе комплекса белок с заменой метионннов на селенометионины с целью использования атомов селена в составе селенометионинов в качестве аномальных рассеивателей для метода аномальной дисперсии на нескольких длинах волн (MAD).
Сбор дифракционных данных.
Сбор дифракционных данных при комнатной температуре проводился с использованием генератора рентгеновского излучения с вращающимся анодом Rigaku RU200. При этом использовался детектор Mar Research 300 mm Image Plate. Для сбора данных при температуре 11 OK использовался синхротрон MAX-II, beamline BL711 (Лунд, Швеция) с детектором Mar Research 345 mm Image Plate. На этом синхротроне был получен лучший нативный набор с разрешением до 2.3 А, который использовался на последних стадиях уточнения структуры комплекса TL5-pPHK, а также наборы данных с кристаллов, содержащих TL5 с заменой метионинов на селенометионины. Нативиые кристаллы комплекса TL5-pPHK принадлежал» к группе симметрии Pi,12 с параметрами ячейки a=b=109.90 Ä, с=137.51 Ä, a=ß=90°, у=120° и отражали до разрешения 2.3Ä. Установлено, что в независимой части элементарной ячейки находятся две молекулы комплекса.
Поскольку синхротрон МАХ-II не был оборудован для оптимизации длины волны, получить селенометиониновый набор с максимальным аномальным сигналом (вблизи максимума /") не удалось. Тем не менее, несмотря на низкое отношение аномального сигнала к шуму, лучший из вышеупомянутых селенометиониновых наборов (SeMet (1)) был использован впоследствии для определения положений атомов селена в кристалле п расчета фаз методом изоморфного замещения с одной производной и учетом аномальной дисперсии на одной длине волны (SIRAS). Позднее был проведен эксперимент по сбору данных с селенометиониновых кристаллов TL5-pPHK на нескольких длинах волн, что позволило использовать метод MAD для решения фазовой проблемы. Такой набор данных (SeMet (2)) был снят на синхротроне DESY, beamline BW7A с детектором MAR CCD в Гамбурге (Германия). Для съемки были использованы три длины волны: - вблизи максимума/", Х2 -вблизи минимума/' и - удаленная точка. Основные характеристики наборов дифракционных данных представлены в табл. 1.
Таблица 1. Основные характеристики наборов дифракционных данных комплекса ТЬ5-рРНК
Кристалл Нативный БеМе! (1) БеМе! (2) (на трех длинах волн)
Максимум Г Минимум /' Удаленная точка
ЦА) 1.108 0.968 0.9794 0.9797 0.9184
Разрешение (А) 20.0-2.3 25-2.9 25.0-3.0 25.0-3.0 25.0-3.0
Общее число рефлексов 188440 111437 137093 150010 149411
Число уникальных рефлексов 41886 20768 36713 36749 36747
Полнота набора (%)' 98.8 (97.8) 98.3 (99.2) 99.9 (99.8) 100.0(100.0) 100.0 (100.0)
17.0(4.5) 9.3 (3.7) 7.5(3.1) 11.0(4.2) 17.3 (4.6)
ЯитО) (%)' 5.2 (36.5) 8.7 (37.6) 12.6(39.9) 8.0(25.8) 7.6(24.1)
1В скобках приведены значения в слое высокого разрешения
Ш I I Ш |
Решение проблемы фаз.
Первоначальный набор фаз был получен с помощью метода молекулярного замещения. Основой для модели послужила небольшая часть структуры Ь25-рРНК в области контакта РНК/белок, которая включала часть фрагмента рРНК, спираль а! и тяжи р2, р6 Ь25. Для решения задачи молекулярного замещения использовался широкий диапазон методов в прямом и обратном пространствах. В конечном итоге, после оптимизации условий поиска, положение двух молекул в независимой части элементарной ячейки удалось определить независимо как паттерсоновским поиском (программа АМиНе), так и 6-мерным поиском (программа ЕРМЯ). Для получения правильного решения задачи молекулярного замещения наиболее важными факторами оказались выбор модели и диапазона разрешения, а в случае 6-мерного поиска таким фактором было также и количество элементов набора случайных решений, генерируемого на первой стадии поиска. При выборе диапазона разрешения решающим для получения контрастных пиков функций вращения и трансляции, а также для воспроизводимости решений в серии независимых запусков процедуры 6-мерного поиска было ограничение области низкого разрешения значениями около 8.0 А. При этом количество элементов набора случайных решений, генерируемого на первой стадии 6-мерного поиска, должно было быть не менее 17500.
Несмотря на успешное решение задачи молекулярного замещения, полученная модель представляла лишь малую часть структуры комплекса и не позволяла получить интерпретируемую карту электронной плотности для недостающей части структуры. Параллельно с решением задачи молекулярного замещения были предприняты попытки определить положения
атомов селена в кристаллах, содержащих ТЬ5 с заменой метионинов на селенометионины. Проведенный нами масс-спектрометрический анализ показал наличие трех селенометиониновых остатков на одну молекулу ТЬ5. Для поиска положений атомов селена использовался селенометиониновый набор БеМеЦО (см. табл. 1), который оказался изоморфным нативному набору, снятому при температуре 110К. Все шесть положений селена для двух молекул комплекса в независимой части элементарной ячейки были найдены с помощью разностных карт Фурье, рассчитанных с использованием фаз, полученных методом молекулярного замещения. После этого фазы, рассчитанные методом БЖАБ с учетом шести положений атомов селена, были скомбинированы с фазами, полученными методом молекулярного замещения, и уточнены с помощью процедуры модификации электронной плотности. Несмотря на то, что карты электронной плотности, рассчитанные с использованием этих фаз, были зашумлены, они позволяли распознать части структур фрагмента 5Б рРНК и Ы-концевого домена ТЬ5. С помощью этих карт удалось уточнить и дополнить полиаланиновую модель М-копцевого домена ТЬ5, добавив туда 36 остатков (остатки 5-10 и 42-71), входящих в тяжи Р1, (34 и р5 и спираль а1. Модель части фрагмента рРНК была также уточнена. Полученные позднее дифракционные данные БеМе1(2) (см. табл. 1) позволили рассчитать дополнительный набор фаз методом МАО. Положения атомов селена, определенные с учетом аномальной дисперсии на трех длинах волн, оказались теми же, что были найдены комбинацией методов молекулярного замещения и БШАБ. Карты электронной плотности, рассчитанные с использованием фаз полученных методом МАО, позволяли различить не наблюдаемые ранее части структуры С-концевого домена ТЬ5 и фрагмента 5 Б рРНК. Тем не менее, эти карты были в значительной степени зашумлены, поэтому набор фаз, полученный методом МАО, был скомбинирован с набором, полученным ранее методами молекулярного замещения и БШАБ. В табл. 2 приведены некоторые характеристики полученных наборов фаз. Последующее применение процедуры модификации электронной плотности и экстраполяции фаз до более высокого разрешения (2.3 А) позволило получить хорошо интерпретируемую карту электронной плотности высокого качества для большей части полипептидных цепей и нуклеотидов. Электронная плотность не наблюдалась для С-концов обоих молекул ТЬ5 (остатки 186-206) в независимой части элементарной ячейки. Эти остатки были исключены из окончательной модели.
Набор SeMet(l) SeMet(2)
Максимум /" Удаленная точка
Число положений атомов 6 6 6
Фазовая сила (Р) (центросимметричные рефлексы). ' 0.62 0.61 1.02
Фазовая сила (Р) (нецентроеимметричные рефлексы)1 0.81 0.91 1.51
Исип!! (центросимметричные рефлексы)2 0.82 0.82 0.66
КсиШ! (нецентроеимметричные рефлексы)1 0.90 0.86 0.73
Коим« (с учетом аномальных разностей)2 0.97 0.81 0.80
Общее значение показателя достоверности (figure of merit) при разрешении 4А - 0.5080
V Ml / hkl
Ш / «'
Построение и уточнение пространственной модели комплекса.
Полученные в результате вышеописанной процедуры карты электронной плотности были хорошего качества и позволяли построить полную модель как фрагмента рРНК, так и белка, за исключением 30 С-концевых остатков (177206). Первоначальная модель была построена с помощью программы О. Затем были проведены несколько циклов автоматического (программами X-PLOR и CNS) и ручного (программой О) кристаллографического уточнения. Автоматическое уточнение включало в себя молекулярно-динамическую процедуру моделированного отжига, которая проводилась как в декартовых, так и во внутренних координатах. В последнем случае уточняемыми параметрами были торсионные углы. На начальных стадиях уточнения использовались ограничения (типа "restraints") в соответствии с операцией некристаллографической симметрии. На поздних стадиях две молекулы комплекса в независимой части элементарной ячейки уточнялись независимо. Экспериментальная карта электронной плотности использовалась в качестве основного критерия достоверности при построении модели. Для построения С-концевых остатков 177-185 в обоих молекулах в независимой части
элементарной ячейки применялись карты F0. Критерием качества уточнения было значение фактора R{m, рассчитанное по 10% рефлексов.
Окончательная модель, уточненная до значений R-фактора 20.8% и Rfrec 24.5% при разрешении до 2.3 Â, включает 185 аминокислотных остатков и 40 нуклеотидов. Кроме того были локализованы 298 молекул воды, 13 ионов Cd+2 и 14 ионов Mgf2 в независимой части элементарной ячейки кристалла. Общее число атомов модели в независимой части элементарной ячейки составило 5025. Модель обладает хорошими стехиомегрическими параметрами, которые оценивались с помощью программы PROCHECK, и не содержит остатков, расположенных в запрещенных областях карты Рамачандрана. Статистика окончательной модели приведена в табл. 3. Часть окончательной 2F0-FC карты электронной плотности на уровне 1.5 с показана на рис. 1. Структура комплекса TL5-pPHK схематически показана на рис. 2.
Таблица 3. Показатели уточнения модели TL5-pPHK.
Диапазон разрешения (А) 8.0-2.3
Количество рефлексов 40543
Д-факгор (%) 20.8
Дг,сс (%) ' 24.5
Среднеквадратичное отклонение от стандартных значений Валентные связи (А) 0.006
Углы О 1.2
Средний температурный фактор атомов модели (А2) 5 S pPIIK 30 13
TL5 32.28
Растворитель 32.81
' Для расчета /?г«с использовалось 10% рефлексов
1-еи70 Ьеи70
Рисунок 1. Стереоизображение части окончательной 2Р0-РС карты электронной плотности при разрешении 2.3 А вокруг остатков Ьеи70, Уа171, А^72,01п73, \'а174 и А$п75 на уровне 1.5 о. Буквами \У обозначены атомы кислорода молекул воды.
Рисунок 2. Схематическое стереоизображение общего вида комплекса ТЬ5-рРНК.
Анализ структуры комплекса TL5-pPHK.
Структура белка TL5 в связанном состоянии.
Молекула рибосомного белка TL5 из Thermus thermophilus состоит из двух доменов, расположенных под углом 90° относительно друг друга, создавая таким образом L-образную структуру с размерами около 25x40x65Á (рис. 3). Структура в целом хорошо упорядочена за исключением С-концевых остатков 177-185, для которых электронная плотность плохо определена, что может объясняться конформационной подвижностью этой части молекулы белка в кристалле. N-концевой домен, включающий остатки 1-91, имеет несколько уплощенную форму с размерами 25x35x35Ä. Этот домен компактен и содержит ß-бочонок, сформированный двумя почти перпендикулярными друг другу ß-листами. Один ß-лист состоит из двух параллельных (ßb ß4) и одного антипараллельного (ß5) тяжей. Тяж ß5 изогнут и входит также во второй ß-лист. В результате второй ß-лист содержит четыре ß-тяжа (ß2) ß3, ß5, ß6). Тяжи ß2, ß3 и ßs, Рб образуют антипараллельные ß-шпильки, при этом внутренние ф2,рб) и внешние (ß3, ß5) тяжи четырехтяжевого ß-листа параллельны. N-концевой домен имеет топологию ßiaiß2ß3a2ß4ß5ß6. ß-бочонок содержит обширное ядро, состоящее из остатков: Leu5, А1а7, Leu 18, Leu24, Pro25, Gly26, Met28, Val37, Val39, Phe44, Val56, Ile57, Leu70, Val71, Val86 и Phe88. Большинство из этих остатков полностью недоступны для растворителя и являются гидрофобными во всех известных аминокислотных последовательностях гомологов белка TL5 (белки L25, СТС), что позволяет сделать предположение о структурной консервативности N-концевого домена TL5 в различных организмах. N-концевой домен TL5 содержит 11 отрицательно и 18 положительно заряженных остатков, образующих сеть водородных связей и солевых мостиков, стабилизирующих структуру. Многие из этих остатков образуют водородные связи с атомами главной цепи. Вовлеченные в водородные связи полярные остатки также вносят вклад в стабилизацию структуры. В целом структура N-концевого домена характеризуется большим числом водородных связей между атомами главной и боковых цепей.
С-концевой домен включает остатки 92-176. Он сильно удлинен и имеет сигарообразную форму с размерами 22 х 22 х 50 Ä. Уникальная структура этого домена никогда не наблюдалась ранее в других белках. Этот домен имеет топологию ßvCXaßgßößioßiißi2ßi3- Семь ß-тяжей С-концевого домена образуют два антипараллельных ß-листа (ß7ß9ß12) и (ßaßnßu) и один двухтяжевой параллельный ß-лист (ß7ß|0). Тяж ß9 является продолжением тяжа ß8 через выступ, образованный остатками His 121 и Argl22. Тяж ßi3 является продолжением тяжа ßi2 через петлю, образованную остатками от А1а164 до Glul69. Эти петля и выступ образуют обширное плато в центральной части домена, которое стабилизируется взаимодействиями между Hisl21 и Glu 169 через два иона Cd2+. Обширное и плотное гидрофобное ядро
проходит через весь домен и включает остатки VallOO, Leul02, Phel04, Prol08, Leu 117, lie 124, Vall26, Vall28, Prol34, Ilel37, Vall39, ValJ41, Leul44, Leul50, Alal52, Leul55, Leul57, Vall61, Leul63, Vall65, IIel71, Alal72, Vall74 и Val 175. Это гидрофобное ядро наряду с широкой сетью водородных связей, в образовании которых участвуют атомы главной цепи, стабилизирует структуру домена. Как и в случае N-концевого домена, аминокислотные остатки образующие гидрофобное ядро С-концевого домена гидрофобны во всех известных аминокислотных последовательностях семейства L25-TL5-СТС, что также позволяет предполагать структурную консервативность С-концевого домена TL5 в семействе белков L25-TL5-CTC.
Не*
Рисунок 3. Схематическое стереоизображение общего вида ТЬ5 в связанном состоянии.
Большинство петель, соединяющих р-тяжи С-концевого домена, достаточно длинные. Одна из таких петель (р7, р8) включает спираль а3 и вместе с петлей (Рю, Рн) формирует один из полюсов домена. Каждая из петель (р9, Рю) и (Рп, Р12) содержит три остатка в конформации спирали 310-Основная (глобулярная) часть С-концевого домена содержит 14 кислотных и 6 основных остатков. В дополнение к этому С-конец, включающий остатки 177206, содержит 13 кислотных остатков (из них 12 остатков глутаминовой кислоты) и только 4 основных остатка. Таким образом, количество кислотных остатков в С-концевом домене значительно превышает количество основных остатков, что и определяет общие кислотные свойства домена в целом. С-конец отходит в сторону от основной части домена и, по всей видимости, обладает значительной конформационной подвижностью. Распределение зарядов на поверхности этого домена является очень характерным: отрицательно заряженные остатки образуют на поверхности три полосы, содержащие по четыре остатка каждая, направленные от одного полюса домена к другому (рис. 4).
Несколько водородных связей и солевой мостик между 01и94 и А^З 1 соединяют и С- концевые домены. Кроме того, взаимное расположение доменов стабилизировано гидрофобным ядром, которое проходит через всю молекулу и включает остатки междоменной области (РЬе48, Уа170, Ьеи91, Уа196, Ме198, 11е133), и взаимодействиями остатков глутаминовой кислоты с гистидинами через ионы Сс12+. Как показывает анализ структуры, ионы Сс12+ связываются только с белковой частью комплекса (атомами азота в гистидинах и атомами кислорода, принадлежащими боковым цепям кислотных остатков) и молекулами воды. В большинстве случаев удалось определить положения 6 лигандов в координационной сфере ионов Сс!2+ (рис. 5). Было найдено, что на поверхности С-концевого домена ТЬ5, в обеих молекулах независимой части элементарной ячейки кристалла, 2 иона Сс12+, взаимодействующие друг с другом через молекулу воды, образуют кластер, в который входят атомы кислорода и азота боковых групп остатков С1и169 и Н1б121 и атом кислорода главной цепи АБр123. Таким образом, данный кластер связывает между собой петли (р8, р9) и (Р|2, Рп), дополнительно стабилизируя их взаимное расположение. Ионы кадмия могут стабилизировать как конформацию С-концевого домена и междоменной области, так и взаимодействия между молекулами в кристалле, что объясняет значительное улучшение качества кристаллов комплекса ТЬ5-рРНК при добавлении соли кадмия в кристаллизационный раствор.
Лгу! 12
Л5р93
Рисунок 4. Поверхностный электростатический потенциал С-концевого домена ТЬ5. Боковые цепи отрицательно заряженных остатков укладываются в полосы на поверхности вдоль длинной оси домена.
Рисунок 5. Стерео-изображение первой координационной сферы иона Сс12*, куда входят атомы боковых цепей остатков №554 и А5р123. Электронная плотность 2Р0-РС при разрешении 2.3 А изображена на уровне 11 а. Буквами XV обозначены атомы кислорода молекул воды.
Структура 5S рРНК в связанном состоянии.
Фрагмент 5S рРНК из Е. coli (нуклеотиды 69-87/90-110), использованный для получения РНК-белкового комплекса, включает спираль IV, петлю Е, спираль V и часть петли А (рис. 6). За исключением неспаренных U87 и G107, А108, А109, С110 в З'-концах и G69 в 5'-концах обоих цепей РНК, все нуклеотиды вовлечены в парные взаимодействия и, в целом, связанная молекула 5S рРНК имеет структуру двойной спирали. Структура фрагмента рРНК очень близка к структуре рРНК в комплексе L25-pPHK. Наиболее интересной особенностью структуры, которая наблюдалась ранее для РНК в свободном состоянии, являются спаривание и стэкинг-взаимодействия оснований петли Е, которые образуют выпячивание ("bulge") на двойной спирали. Расстояния между С1 '-атомами пар оснований в центральной части этой петли и на ее концах изменяются от 14.7 до 9.4 А. В результате малый желобок петли Е оказывается расширен, а большой желобок сужен в области трех центральных пар оснований петли.
Взаимодействия РНК-белок в составе комплекса.
Структура комплекса TL5-pPHK показывает, что с фрагментом рРНК взаимодействует только N-концевой домен белка. Этот домен взаимодействует с 10 из 17 пар оснований. При образовании комплекса 1681 А2 поверхности, доступной для растворителя, оказываются закрыты. Примыкающая поверхность, образованная боковыми цепями девяти остатков, принадлежащих к четырехтяжевому р-листу и четырех остатков, принадлежащих области спирали cti N-концевого домена, взаимодействует напрямую или через молекулы воды с малым желобком петли Е 5S рРНК. Схема взаимодействий фрагмента рРНК с боковыми цепями TL5 представлена на рис. 6. Большая часть взаимодействий осуществляется с сахарофосфатным остовом рРНК. Пять наиболее консервативных во всех известных аминокислотных последовательностях семейства белков L25-TL5-CTC остатков (ArglO, Argl9, Tyr29, His85 и Asp 87), взаимодействуют с сахарофосфатным остовом рРНК и/или с ее основаниями напрямую, либо через молекулы растворителя. Три из этих пяти остатков (Туг29, His85, Asp87) идентичны во всех известных аминокислотных последовательностях белков L25 и СТС и расположены приблизительно вдоль прямой линии. Конформации боковых цепей этих остатков стабилизированы взаимодействиями внутри самого белка. Основной особенностью взаимодействий пяти наиболее консервативных остатков с рРНК является то, что все атомы белка и рРНК, вовлеченные в эти взаимодействия, образуют две плоскости, приблизительно параллельные плоскости четырехтяжевого р-листа (рис. 7).
Рисунок б. Схема вторичной структуры фрагмента (40 нуклеотадов) 5S рРНК и его контактов с белком TL5. Контакты осуществляются только с боковыми цепями аминокислотных остатков белка. Буквами W обозначены атомы кислорода молекул воды.
Площадь плоской поверхности образованной атомами боковых групп остатков ArglO, Argl9, Tyr29, His85 и Asp87 приблизительно составляет 60 Á2. Взаимодействующие с нуклеотидами U103, А104, G105 и G106 остатки Arg31 и Arg72 дополшггельно увеличивают общую площадь плоской контактной поверхности. Помимо прямых контактов с основанием G75, атомы боковой цепи остатка Asp87 участвуют во взаимодействиях с нуклеотидами U74, G102 и U103, через молекулу воды. Значительная доля плоской контактной поверхности белка является гидрофобной. В свою очередь, на поверхности малого желобка рРНК атомы участвующих во взаимодействии с белком Сахаров G75, G76, U77 и U103, А104, G105 образуют два гидрофобных пятна. Близость пространственных структур фрагментов рРНК в составе комплексов
ТЬ5-рРНК, Ь25-рРНК и в свободном состоянии указывает на то, что контактная область является стабильной частью структуры рРНК. Поскольку для ТЬ5 не существует прямых подтверждений того, что контактная плоскость является устойчивым элементом структуры, который может существовать в растворе свободного белка, для выяснения этого вопроса были проведены дополнительные исследования методами молекулярной динамики.
Изучение устойчивости контактной плоскости 1Ч-концевого домена
ТЪ5.
С целью изучения устойчивости контактной плоскости Ы-концевого домена ТЬ5 было проведено молекулярно-динамическое моделирование поведения свободного И-концевого домена ТЬ5 в водной среде при различных температурах. Анализ динамической траектории (10 пс при постоянных температуре ЗООК и давлении 101325 Па, с шагом 0.0005 пс) показал, что наиболее консервативной частью структуры домена является область четырехтяжевого р-листа (р2, Рз, Р5> Рб)- Несколько большую гибкость проявляет Р-лист (рь р4, Р5), а наиболее подвижными частями И-концевого домена являются петли (а2, р4), ф4, р5), (р5, р6), и область перехода тяжа р3 в спираль а2. Несмотря на заметную подвижность р-листа (рь р4, р5) и спирали аь взаимное расположение начала петли (Рь а,) и конца спирали 01 (областей содержащих Ат^Ю и А^19) друг относительно друга и относительно р-листа (р2, Рз, Рг, Рб) остается достаточно консервативным. После минимизации энергии системы в конце динамической траектории, структура контактной плоскости осталась неизменной. Более того, несмотря на некоторые изменения относительной ориентации контактной плоскости вдоль динамической траектории, ее структура при этом не нарушалась.
Процедура моделированного отжига И-концевого домена ТЬ5 в водной среде, которая давала возможность наблюдать последовательность разрушения элементов структуры М-концевого домена при постепенном увеличении энергии системы, показала, что контактная плоскость является одним из наиболее стабильных элементов структуры.
Таким образом, методами молекулярной динамики было получено подтверждение того, что контактная плоскость является устойчивым элементом структуры И-концевого домена ТЬ5 и может существовать в растворе свободного белка.
Рисунок 7. Подробное изображение РНК-белковых взаимодействий, включающих наиболее консервативные аминокислотные остатки. Атомы боковых иепей TL5, участвующие во взаимодействиях с рРНК, лежат в плоскости, которая параллельна плоской поверхности образованной участвующими во взаимодействиях атомами рРНК.
Взаимодействие рРНК-рРНК в кристалле.
Две молекулы РНК в независимой части элементарной ячейки располагаются приблизительно перпендикулярно друг другу. Взаимодействие между ними осуществляется главным образом поверхностями малых желобков, образованных петлями Е и спиралями IV. Нуклеотиды А78, G79, U80 и G96, А99, G100 участвуют во взаимодействиях РНК-РНК. Каждая молекула рРНК связанна с другой 17 водородными связями, в 7 из которых участвуют атомы оснований. Эти нуклеотиды не вовлечены в РНК-белковые взаимодействия и расположены на стороне РНК, противоположной положению белка в комплексе.
Сравнение структур комплексов TL5-pPHK и L25-pPHK.
Фрагменты рРНК в комплексах TL5-pPHK и L25-pPHK близки как по нуклеотидному составу, так и по пространственной структуре. Нуклеотидные последовательности этих фрагментов отличаются в основном только заменами на 5'- и З'-концах обоих цепей. Наложения фрагментов рРНК из TL5-pPHK и L25-pPHK дает среднеквадратичные отклонения координат всех атомов
фосфора двойной спирали 1.03 А, что сопоставимо с соответствующим значением для двух молекул в независимой части элементарной ячейки кристалла TL5-pPHK.
Несмотря на низкую гомологию аминокислотных последовательностей структура N-концевого домена TL5 оказывается очень близкой к L25. Можно предположить, что причиной такого сходства является консервативность гидрофобных ядер обоих белков. Однако, элементы вторичной структуры и петли в этих белках отличаются по размерам: спираль cti в TL5 содержит только 6 остатков вместо 9 в L25, в то же время, спираль а2 в TL5 значительно длиннее и заменяет спирали а2 и а3 в L25. Структуры р-бочонков в обоих белках очень близки. Их Са атомы могут быть наложены со среднеквадратичным отклонением 0.71 А. Число положительно и отрицательно заряженных боковых цепей приблизительно одинаково в обоих структурах, однако в TL5 имеется 12 аргининов и 6 лизинов вместо 6 аргининов и 11 лизинов в L25. Несмотря на то, что число РНК-белковых взаимодействий в обоих комплексах приблизительно одинаково, в L25 большая часть взаимодействующих атомов расположена в области спирали аь которая входит в большой желобок РНК. В TL5 эта спираль короче и расположена за пределами большого желобка РНК. Большая часть взаимодействий в этом случае осуществляется остатками четырехтяжевого Р-листа и таким образом, что все р-тяжи оказываются вовлеченными в РНК-белковые взаимодействия.
Также как и в случае TL5, взаимодействующие с 5S рРНК атомы пяти наиболее консервативных остатков L25 лежат в одной плоскости. Эта плоскость приблизительно параллельна плоской поверхности, образованной участвующими в контакте атомами 5S рРНК. Она совпадает с подобной плоскостью в TL5 при наложении N-концевого домена TL5 на L25, хотя площадь плоской поверхности в этом случае составляет приблизительно половину от площади плоской поверхности в TL5. Для того, чтобы оценить устойчивость контактной плоскости белка L25 было проведено молекулярно-динамическое моделирование по схеме, аналогичной использованной в случае N-концевого домена TL5. Моделирование показало, что и в L25 контактная плоскость является одним из наиболее стабильных элементов структуры. Сравнительный анализ динамического поведения N-концевого домена TL5 и L25 при постепенном повышении температуры указывает на большую устойчивость контактной плоскости в N-концевом домене TL5.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1. Получены наборы дифракционных данных кристаллов комплекса рибосомного белка TL5 из Thermus thermophilus с фрагментом 5S рРНК из Escherichia coli с разрешением 2.3 А.
2. Проблема фаз рентгеноструктурного анализа для кристаллов комплекса TL5-pPHK решена совокупностью методов молекулярного замещения, изоморфного замещения и аномальной дисперсии на трех длинах волн.
3. Пространственная структура комплекса TL5-pPHK определена и уточнена до R-фактора 20.8% и Rfree 24.5%, при разрешении 2.3 А.
4. Проведен подробный структурный анализ комплекса и взаимодействий между его компонентами.
5. Проведено сравнение пространственных структур комплексов TL5-pPHK и L25-pPHK. Показано, что в обоих случаях молекулы белка взаимодействуют с 5S рРНК главным образом через гидрофобные плоские контактные поверхности со специфически расположенными атомами боковых цепей пяти консервативных взаимодействующих остатков.
6. Получено подтверждение того, что контактные плоскости в белках TL5, L25 и взаимодействующих с ними фрагментах рРНК являются устойчивыми элементами, которые могут существовать в структурах отдельных компонентов комплекса в растворе. При этом, сравнительный анализ динамического поведения L25 и N-концевого домена TL5 указывает на большую устойчивость контактной плоскости в N-концевом домене TL5. Наличие таких плоских гидрофобных поверхностей может играть важную роль на первом этапе образования комплекса, тогда как распределение на этих поверхностях атомов, участвующих в межмолекулярных взаимодействиях с образованием водородных связей или солевых мостиков, может быть важным для специфического узнавания рРНК белком.
7. Увеличение плоской контактной поверхности в TL5-pPHK по сравнению с L25-pPHK за счет взаимодействующих с рРНК атомов неконсервативных остатков может объяснять более высокое сродство TL5 к 5S рРНК из Escherichia coli.
8. Показано, что гомологичный белкам СТС С-концевой домен TL5 имеет уникальную укладку и особую форму поверхности с характерным распределением отрицательно заряженных остатков. Структура С-концевого домена белка TL5 является первой определенной структурой С-концевого домена белков семейства СТС и может быть использована для дальнейших структурных исследований белков этого семейства.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. С.В. Никонов, Н.А. Невская, Н.П. Фоменкова, А.Д. Никулин, Р.В. Фёдоров. И.А. Елисейкина, С.В. Тищенко, М.Б. Гарбер. Структурные исследования бактериальных рибосомных белков., Поверхность: рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования (1999) 2, 5-9.
2. S.V.Nikonov, N.A.Nevskaya, R.V.Fedorov. A.R.Khairullina, S.V.Tishchenko,
A.D.Nikulin and M. B. Garber. Structural Studies of Ribosomal Proteins. Biol. Chem. (1998) 379, 795-805.
3. S.V.Nikonov, N.P.Fomenkova, A.D.Nikulin, R.V.Fedorov. N.A.Nevskaya. The ribosome structure: RNA-protein and protein-protein interactions. Molecular Biology Moscow (1998) 32 (5), 773-781.
4. Crystallization and Structural Studies of Bacterial and Archaeal Ribosomal Proteins and their Complexes with RNA. M.Garber, N.Budanova, N.Davydova, M.Dontsova, R.Fedorov. Fomenkova, G.Gongadze, A.Kalinin, V.Meshcheryakov, S.Moskalenklo, E.Mudrik, N.Nevskaya, O.Nikonov, S.Nikonov, A.Nikulin, A.Peredelina, M.Paveliev, A.Rak, A.Serganov, D.Shcherbakov, S.Tishchenko, J.Vassilieva, A.Kraft, W.Piendl, C.Ehresmann,
B.Ehresmann, Salam Al-Karadaghi, Anders Liljas, P.Allard, M.Helgstrand, T.Hard. The Ribosome. Structure, Function, Antibiotics and Cellular Interactions. Helsingoer Conference, Denmark. June 13-17, 1999.
5. Crystallization and Structural Studies of Ribosomal Protein TL5 from Thermus thermophilus in Complex with 5S rRNA fragments. V.Meshcheryakov, R.Fedorov. G.Gongadze, N.Fomenkova, E.Mudrik, A.Serganov, M.Selmer, S.Al-Karadaghi, B.-H. Jonsson, A.Liljas, S.Nikonov, M.Garber. The Ribosome. Structure, Function, Antibiotics and Cellular Interactions. Helsingoer Conference, Denmark. June 13-17, 1999.
6. Structural Studies of Ribosomal Proteins. M. Garber, N.Davydova, G. Gongadze, R.Fedorov. A. Kalinin, V. Meshcheryakov, N.Nevskaya, S. Nikonov, A. Nikulin, A. Peredelina, A. Rak, U. Tin, S. Tishchenko, A. Liljas, T. Hard, B. Ehresmann, W. Piendl. Howard Hughes Medical Institute, Office of Grants and Special Programs, 1998 Meeting of International Research Scholars from Belarus, Czech Republic, Estonia, Hungary, Latvia, Lithuania, Poland, Russia, Slovak Republic, and Ukraine. Program and Abstracts, Budapest, Hungary, June 23-26, 1998.
7. Structural Studies of Ribosomal Proteins. Maria Garber, Natalia Davydova, Roman Fedorov. Natalia Fomenkova, George Gongadze, Vladimir Meshcheryakov, Alexander Kalinin, Alfia Khairullina, Natalia Navskaya, Stanislav Nikonov, Alexey Nikulin, Anna Peredelina, Elena Pilipenko, Alexey Rak, Svetlana Tishchenko, Ouliana Tin, Julia Vassilieva, Anders Liljas, Salam Al-Karadagi, Torleif Hard, Bernard Ehresmann, Wolfgang Piendl. GKSS Forschungszentrum, Second Circular of the workshop on Structure Research of the Ribosome and its Functional Complexes. 09.-11.09.1998, GKSS Research
Center Geesthacht.
8. Crystallization and Structural Studies of Ribosomal Proteins from Thermus thermophilus and Methanococcus jannaschii. M.Garber, N. Davydova, G. Gongadze, R. Fedorov. A. Khairullina, V. Meshcheryakov, N. Nevskaya, S. Tishchenko, B. Ehresmann, A. Liljas and W. Piendl. International Congress on Extremophiles 98, Yokohama, Japan, January 18-22, 1998.
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Молекулярное замещение
1.1.1. Функции вращения
1.1.2. Функции трансляции
1.1.3. Методы 6-мерного поиска
1.2. Изоморфное замещение и аномальное рассеяние
1.3. Уточнение структуры макромолекул
1.3.1 Метод наименьших квадратов (МНК) и его применение в кристаллографическом уточнении макромолекул
1.3.2. Проблема переопределенности задачи кристаллографического уточнения
1.3.3. Уточнение с ограничениями ("constraints" и "restraints")
1.3.4. Достоверность кристаллографического уточнения
1.3.5. Критерии оценки качества атомной модели
1.3.5.1. Стандартный кристаллографический R-фактор
1.3.5.2. Rfree как критерий оценки качества модели в процессе уточнения
1.3.6. Улучшение фаз методом модификации плотности с использованием "complete cross-validation"
1.3.7. Схемы и программы уточнения
1.3.7.1. ПрограммыX-PLOR и CNS
1.3.7.2. Программа SHELX
1.3.7.3. ARP/wARP - программа автоматического уточнения белковых структур
1.4. Исследования рибосом и их компонентов рентгенострукгурным методом
1.4.1. Рентгеноструктурный анализ рибосом и рибосомных субчастиц
1.4.1.1. Структура 30S рибосомной субчастицы Thermus thermophilics с разрешением 5.5Á
1.4.1.2.Структура 30S рибосомной субчастицы Thermus thermophilics с разрешением 4.5Á
1.4.1.3. Структура 50S рибосомной субчастицы Haloarcula marismortui с разрешением 5.0Á
1.4.1.4. Структура 70S рибосомы из Thermus thermophilus с разрешением 7.8Á
1.4.2. Структура отдельных компонентов рибосом
1.4.3. Структурные исследования рибосомных белков
1.4.4. Структурные исследования рибосомной РНК
1.4.5. Пространственные структуры РНК-белковых комплексов
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Получение и кристаллизация комплекса TL5-pPHK
2.2. Нахождение условий замораживания кристаллов
2.3. Получение тяжелоатомных производных кристаллов TL5-pPHK
2.4. Сбор дифракционных данных
2.5. Решение проблемы фаз
2.6. Определение и уточнение структуры
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Структура белка TL5 в связанном состоянии
3.2. Структура 5S рРНК в связанном состоянии
3.3. Взаимодействия РНК-белок в составе комплекса
3.4. Изучение устойчивости контактной плоскости
N-концевого домена TL
3.5. Взаимодействие рРНК-рРНК в кристалле
3.6. Сравнение структур комплексов TL5-pPHK и L25-pPHK
3.7. Сравнение структуры TL5 с другими известными структурами белков
Наиболее эффективным и универсальным методом определения трехмерной структуры макромолекул с атомным разрешением является рентгеноструктурный анализ. В последние годы этот метод в применении к кристаллам биологических макромолекул быстро развивается. Использование синхротронного излучения и новых типов детекторов (Image Plate, CCD), сбор данных при криогенных температурах и новые программы обработки данных позволяют значительно увеличить скорость и точность измерений. Разработка новых подходов и совершенствование существующих процедур в рамках методов изоморфного замещения, молекулярного замещения и аномальной дисперсии на нескольких длинах волн значительно облегчает получение стартового набора фаз. Этот стартовый набор может быть расширен до более высокого разрешения процедурами модификации электронной плотности или прямыми методами. Постоянно развивающиеся программы молекулярной графики упрощают и частично автоматизируют построение моделей макромолекул. Применение методов молекулярной динамики и стохастических процедур (моделированный отжиг) позволяет существенно сократить процесс уточнения структур макромолекул. Все это приводит к тому, что количество расшифрованных структур быстро растет. Тем не менее, вследствие чрезвычайно сложной организации рибосомы ее структурные исследования представляют собой крайне сложную задачу.
Данная работа посвящена определению пространственной структуры комплекса рибосомного белка TL5 из экстремально-термофильной бактерии Thermus thermophilics со специфическим фрагментом рибосомной 5S РНК из Escherichia coli. Бактериальная рибосома содержит три молекулы РНК (23 S, 5S и 16S) и около 50 рибосомных белков. TL5 является одним из рибосомных белков, которые специфически связываются с 5S рРНК в Т. thermophilics. Хотя структурные исследования рибосомы широко ведутся уже в течении 40 лет, только в 1999 году были получены карты электронной плотности 6 отдельных рибосомных субчастиц с разрешением близким к атомному. Сложный состав рибосомы существенно затрудняет построение моделей высокого разрешения, поэтому весьма актуальными являются структурные исследования отдельных компонентов рибосом. С другой стороны, определение структур компонентов рибосомы как в свободном так и в связанном состоянии необходимо для последующего конформационного анализа и построения динамической модели рибосомы.
В результате данной работы была определена структура комплекса белка ТЪ5 из Т. Жегторкйш со специфическим фрагментом рибосомной 58 РНК из Е. соН при разрешении 2.3 А. Детальный анализ структуры представлен в разделе "РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ".
Литературный обзор посвящен современным методам кристаллографии макромолекул, которые были использованы при определении структуры комплекса, и достижениям в рентгеноструктурном анализе компонентов рибосом.
137 ВЫВОДЫ
1. Получены наборы дифракционных данных кристаллов комплекса рибосомного белка TL5 из Thermits thermophilics с фрагментом 5S рРНК из Escherichia coli с разрешением 2.3 А.
2. Проблема фаз рентгеноструктурного анализа для кристаллов комплекса TL5-рРНК решена совокупностью методов молекулярного замещения, изоморфного замещения и аномальной дисперсии на трех длинах волн.
3. Пространственная структура комплекса TL5-pPHK определена и уточнена до R-фактора 20.8% и i?free 24.5%, при разрешении 2.3А.
4. Проведен подробный структурный анализ комплекса и взаимодействий между его компонентами.
5. Проведено сравнение пространственных структур комплексов TL5-pPHK и L25-рРНК. Показано, что в обоих случаях молекулы белка взаимодействуют с 5S рРНК главным образом через гидрофобные плоские контактные поверхности со специфически расположенными атомами боковых цепей пяти консервативных взаимодействующих остатков.
6. Получено подтверждение того, что контактные плоскости в белках TL5, L25 и взаимодействующих с ними фрагментах рРНК являются устойчивыми элементами, которые могут существовать в структурах отдельных компонентов комплекса в растворе. При этом, сравнительный анализ динамического поведения L25 и N-концевого домена TL5 указывает на большую устойчивость контактной плоскости в N-концевом домене TL5. Наличие таких плоских гидрофобных поверхностей может играть важную роль на первом этапе образования комплекса, тогда как распределение на этих поверхностях атомов, участвующих в межмолекулярных взаимодействиях с образованием водородных связей или солевых мостиков, может быть важным для специфического узнавания рРНК белком.
138
7. Увеличение плоской контактной поверхности в TL5-pPHK по сравнению с L25-рРНК за счет взаимодействующих с рРНК атомов неконсервативных остатков может объяснять более высокое сродство TL5 к 5S рРНК из Escherichia coli.
8. Показано, что гомологичный белкам СТС С-концевой домен TL5 имеет уникальную укладку и особую форму поверхности с характерным распределением отрицательно заряженных остатков. Структура С-концевого домена белка TL5 является первой определенной структурой С-концевого домена белков семейства СТС и может быть использована для дальнейших структурных исследований белков этого семейства.
139
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор приносит глубокую благодарность:
С. В. Никонову за руководство работой, бесценную помощь и поддержку;
Н. А. Невской, Н. П. Фоменковой и М. Б. Гарбер за помощь, поддержку и плодотворное обсуждение результатов;
Всему коллективу группы структурных исследований рибосомных белков и лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка (РАН) за прекрасную атмосферу, способствовавшую выполнению данной работы;
А. Лильясу и всему коллективу департамента молекулярной биофизики Лундского университета (Швеция) за плодотворное сотрудничество;
Л. В. Малининой за ценные консультации по методу молекулярного замещения;
О. С. Никонову за помощь при подготовке рисунков;
Российскому Фонду Фундаментальных Исследований, Фонду Дж. Сороса и Фонду Биомедицинских Исследований Ховарда Хьюза за финансовую поддержку данной работы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Содержащие петлю Е части 5S рРНК из рибосом Т. thermophilics и Е. coli находятся в близком соответствии [165] (рис.31). Нуклеотиды, которые различаются в соответствующих фрагментах 5S рРНК из этих двух организмов, не принимают участия в РНК-белковых взаимодействиях. Таким образом, кажется весьма вероятным, что TL5 будет одинаково взаимодействовать с 5S рРНК из Т. thermophilics и Е. coli.
Рибосомные белки TL5 и L25 взаимодействуют с очень похожими фрагментами 5SpPHK из рибосом Т. thermophilics и Е. coli и являются функциональными аналогами в рибосомах. Эксперименты по реконструкции показывают, что 50S рибосомные субчастицы из Е. coli с заменой L25 на TL5 являются функционально активными [150]. Ранее было также показано, что TL5 может вытеснять белок L25 из его комплекса с 5S рРНК [151]. Причиной этого может быть увеличение плоской поверхности взаимодействия белок-РНК в комплексе TL5-pPHK по сравнению с L25-pPHK за счет атомов неконсервативных остатков. Большая стабильность комплекса в случае TL5-pPHK может быть характерной особенностью белка из экстремально термофильного организма Т. Thermophilics, функционирующего при повышенной температуре.
При образовании комплекса рРНК взаимодействует напрямую с 11 остатками TL5 и закрывает около 840 Á2 поверхности белка, доступной для растворителя. Значительная доля закрытой поверхности является плоской и гидрофобной. Аналогично, на поверхности малого желобка рРНК атомы Сахаров G75, G76, U77 and U103, А104, G105 образуют два гидрофобных пятна. Близость пространственных структур фрагментов рРНК в составе комплексов TL5-pPHK, L25-pPHK и в свободном состоянии указывает на то, что контактная область является стабильной частью структуры рРНК. Методами молекулярной динамики было показано, что контактная плоскость является устойчивым элементом структуры N-концевого домена TL5 и L25. При этом, сравнительный анализ динамического поведения N-концевого домена TL5 и L25 при постепенном повышении температуры указывает на большую устойчивость контактной плоскости в N-концевом домене TL5. Таким образом, контактные плоскости в белках TL5, L25 и взаимодействующих с ними фрагментах рРНК являются устойчивыми элементами, которые могут существовать в структурах отдельных компонентов комплекса в растворе. Наличие таких плоских гидрофобных поверхностей может играть важную роль на первом этапе образования комплекса, тогда как распределение на этих поверхностях атомов, участвующих в межмолекулярных взаимодействиях с образованием водородных связей или солевых мостиков, может быть важным для специфического узнавания рРНК белком.
Большинство белков семейства L25-CTC состоят из N- и С-концевых доменов (рис. 23). Только в Е. coli и Haemophilus influenzae найдены белки L25 с укороченными с С-конца последовательностями. Кроме того, белок СТС из Aquifex aeolicus имеет укороченную с N-конца последовательность (менее чем половина L25), соединенную с полным С-концевым доменом. Сравнение аминокислотных последовательностей (рис. 23) и анализ кристаллических структур показывают, что гидрофобные ядра, которые в основном стабилизируют структуры обоих доменов TL5, высоко консервативны во всем семействе белков СТС. Отсюда следует, что N-и С-концевые домены всех белков СТС могут иметь топологию близкую к белку TL5. Для N-концевого домена, это подтверждается сравнением структур TL5 и L25. По-видимому, два домена белков семейства СТС могут существовать и функционировать независимо в клетках разных организмов. Действительно, 91 N-концевой остаток рибосомного белка TL5 образует стабильный глобулярный белок, который специфически взаимодействует с 5S рРНК [159].
Поскольку 5 остатков, образующие плоскость взаимодействия с 5S рРНК в TL5 и L25, являются наиболее консервативными для N-концевых доменов во всех известных аминокислотных последовательностях белков семейства СТС, кажется вероятным, что эти белки могут связываться с рибосомами и взаимодействовать с 5S рРНК. Отсутствие гомологов L25 в геномах бактерий, содержащих последовательности СТС, может означать, что СТС играет роль L25 в этих организмах, связываясь с 5S рРНК посредством N-концевого домена. Что касается
136 функции С-концевого домена, то она до сих пор не исследована. Известно только то, что С-концевой домен ТЬ5 не связывается с рРНК [166]. Таким образом, два домена белков семейства СТС могут обладать совершенно разной функциональной активностью в клетке. В данный момент мы можем только предполагать, что С-концевые домены белков СТС обладают способностью взаимодействовать с некоторыми компонентами клетки в стрессовых условиях. При этом следует отметить, что кислотность С-концевого домена не является общим свойством белков СТС, некоторые из них имеют нейтральные и основные последовательности.
1. Brunger А.Т. (1997) Patterson Correlation Searches and Refinement. In Methods in Enzymology, 276, 558-580, Academic Press.
2. Rossmann M.G. & Blow D.M. (1962), Acta Cryst., 15, 24-31
3. Drenth J. (1994) Principles of Protein X-ray Crystallography. SpringerVerlag New-York, Inc.
4. Huber R. (1965), Acta Cryst, A19, 353-356.
5. Blundell T.L. & Johnson L.N. (1974) Protein Crystallography. Academic Press, New York.
6. Crowther R.A. (1972) in "The Molecular Replacement Method', Int. Sei. Rev. No. 13 (Rossmann M.G., ed.). Gordon & Breach, New York.
7. Navaza J. (1987), Acta Cryst., A43, 645.
8. Navaza J. (1993), Acta Cryst., D49, 588.
9. Navaza J. & Saludjian P. (1997) AMoRe: An Automated Molecular Replacement Program Package, in Methods in Enzymology, 276, 581-594, Academic Press.
10. Ю.Дубровин Б.А., Новиков С.П., Фоменко А.Т. (1994) Современная геометрия. Методы и приложения. Издание третье, Москва "УРСС".11.3ар Р. (1993) Теория углового момента. О пространственных эффектах в физике и химии. Москва, "Мир".
11. Matthews B.W. & Czerwinski E.W. (1975), Acta Cryst., A31,480-487.
12. HauptmanH. (1982), Acta Cryst., A38, 289-294.
13. Brunger A.T. (1992) X-PLOR, Version 3.1. A system for X-ray Crystallography and NMR. New Haven, CT: Yale University Press.
14. Collaboratiove Computational Project, Number 4. (1994), Acta Cryst., D50, 760-763.
15. Rossmann M.G., Blow D.M., Harding M.M., Coller E. (1964), Acta Cryst., 17, 338-342.
16. Argos P. & Rossmann M.G. (1980) in "Theory and Practice of Direct Methods in Crystallography" (Ladd and Palmer, eds.), pp.361-417. Plenum, New York.
17. Crowter, R.A. & Blow, D.M. (1967). A method of positioning a known molecule in an unknown crystal structure. Acta Cryst., 23, 544-548.
18. Harada Y., Lifchitz A., Berthou J., Jolies P. (1981), Acta Cryst., A37, 398406.
19. Fujinaga M. & Read R.J. (1987), J! Appl. Cryst., 20, 517-521.
20. Doesburg H.M. & Beirskens P.T. (1983), Acta Cryst., A39, 368-376.
21. Read R.J. & Schierbeek A.J. (1988), J. Appl. Cryst., 21, 490-495.
22. Cygler M. & Desrochers M. (1989), Acta Cryst., A45, 563-572.
23. Bentley G.A. & Houndusse A. (1992), Acta Cryst., A48, 312-322.
24. G.J. Kleywegt & T.A. Jones (1997) Template convolution to enhance or detect structural features in macromolecular electron-density maps, Acta Cryst, D53, 179-185.
25. Brunger A.T., Milburn M.V., Tong L., de Vos A.M., Jancarik J., Yamazumi Z., Nishimura S., Ohtsuka E., Kim S.-H. (1990), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 4849-4853.
26. Castellano E., Oliva G., Navaza J. (1992), J. Appl. Cryst., 25, 281.
27. Baikalov I. & Dickerson R.E. (1998) Molecular Replacement Using DNA Helical Symmetry. Acta Cryst., D54, 324-333.
28. Rabinovich D. & Shakked Z. (1984), Acta Cryst., A40, 195-200.
29. Kissinger C.R., Gehlhaar D.K., Fogel D.B. (1999) Rapid automated molecular replacement by evolutionary search. Acta Cryst., D55, 484-491.
30. Chang G. & Lewis M. (1997) Molecular Replacement Using Genetic Algorithms. Acta Cryst., D53,279-289.
31. Metropolis N., Rosenbluth A.W., Rosenbluth M.N., Teller A. & Teller E. (1953),J. Chem. Phys., 21, 1087-1092.
32. Kirkpatrick S., Gelatt C.D. Jr & Vecchi M.P. (1983), Science, 220, 671-680.
33. Chang G. & Lewis M. (1994), Acta Cryst., D50, 667-674.
34. Miller S.T., Hogle J.M. & Filman D.J. (1996), Acta Cryst., D52, 235-251.
35. Powell M.J.D. (1977), Math. Programming, 12, 241-254.
36. Read R.J. (1997) Model Phases: Probabilities and Bias. In Methods in Enzymology, 277, 110-128, Academic Press.
37. Green D., Ingram V. & Perutz M.F. (1954), Proc. R. Soc., A225, 287.
38. Hoffman D. W., Davies C., Gerchman S. E., Kycia J. H., Porter S. J., White S. W., Ramakrishnan V. (1994) Crystal structure of prokaryotic ribosomal protein L9: a bi-lobed RNA-binding protein. EMBO J., 13(1), 205-212.
39. Golden B. L., Ramakrishnan V., White S. W. (1993) Ribosomal protein L6: structural evidence of gene duplication from a primitive RNA binding protein. EMBO J., 12(13) 4901-4908.
40. Ke H. (1997) Overview of Isomorphous Replacement Phasing. In Methods in Enzymology, 276,448-461, Academic Press.
41. Blow D.M. and Crick F.H.C. (1959) Acta Cryst., 12, 794.
42. Wilson C. and Agard D.A. (1993) Acta Cryst., A49, 97.
43. Baker D., Bystroff C., Fletterick R.J. and Agard D.A. (1993) Acta Cryst., D49,429.
44. Zhang,K.Y.J. (1993) SQUASH combining constraints for macromolecular phase refinement and extension. Acta Cryst., D49,213-222.
45. Dodson E.J. (1975) In "Crystallographic Computing Techniques" (F.R. Ahmed, ed.), pp. 259-268, Munksgaard, Copenhagen.
46. Tickle I J. (1991) In "Isomorphous Replacement and Anomalous Scattering, Proceedings of the CCP4 Weekend', pp.87-95, Daresbury Laboratory, Warrington, U.K.
47. Terwilliger T.C. and Eisenberg D. (1983) Acta Cryst., A39, 813
48. Bricogne G. (1991) In "Isomorphous Replacement and Anomalous Scattering, Proceedings of the CCP4 Weekend", pp.60-68, Daresbuiy Laboratory, Werrington, U.K.
49. Otwinowski Z. (1991) In "Isomorphous Replacement and Anomalous Scattering, Proceedings of the CCP4 Weekendpp.80-85, Daresbury Laboratory, Werrington, U.K.
50. Read R.J. (1991) In "Isomorphous Replacement and Anomalous Scattering, Proceedings of the CCP4 Weekend', pp.69-79, Daresbury Laboratory, Werrington, U.K.
51. Hendrickson W.A. and C.M. Ogata. (1997) Phase Determination from Multiwavelength Anomalous Diffraction Measurements. In Methods in Enzymology, 276, 494-523, Academic Press.
52. Hendrickson W.A., Smith J.L., Phizackerley R.P. and Merritt E.A. (1988) Crystallographic structure analysis of lamprey hemoglobin from anomalous dispersion of synchrotron radiation. Proteins, 4(2), 77-88.
53. Ramakrishnan V. and Biou V. (1997) Treatment of Multiwavelength Anomalous Diffraction Data as a Special Case of Multiple Isomorphous Replacement. In Methods in Enzymology, 276, 538-557, Academic Press.
54. Hendrickson W.A. (1991) Determination of Macromolecular Structures from Anomalous Diffraction of Synchrotron Radiation. Science, 254, 51-58.
55. Konnert,J.H. (1976) A restrained-parameter structure-factor least-squares refinement procedure for large asymmetric units. Acta Cryst., A32, 614617.
56. Hendrickson,W.A., Konnert,J.H. (1980) Incorporation of stereochemical information into crystallographic refinement. Intern.Winter School on Cryst.Computing, Bangalore, India
57. Sussman,J.L., Holbrook.S.R., Church.G.M., Kim,S.-H. (1977) A structure-factor least-square refinement procedure for macromolecular structures using constrained and restrained parameters. Acta Cryst., A33, 800-804.
58. Sussman,J.L. (1985) Constrained-resntained least-squares (CORELS) refinement of proteins and nucleic acids. In Methods in Enzymology, 115, 271-303, Academic Press.
59. G.Jack,A., Levitt,M. (1978) Refinement of large structures by simultaneous minimization of energy and R factor. Acta Cryst., A34, 931-935.
60. Agarwal,R.C. (1978) A new least-square refinement technique based on the fast Fourier transforn algorithm. Acta Cryst., A34, 791-809.
61. Brunger,A.T., Kuriyn.J., Karplus,M. (1987) Crystallographic R factor refinement by molecular dynamics. Science, 235, 458-460.
62. Brunger,A.T., Karplus.M., Petsko,G.A. (1989) Crystallographic refinement' by simulated annealing: application to crambin. Acta Cryst., A45, 51-61.
63. Kuriyn,J., Brunger,A.T., Karplus.M., (1989) X-ray refinement of protein structures by simulated annealing: test of method on myohemerythrin. Acta Cryst., A45, 396-409.
64. Brunger,A.T., Krukovski,A., EricksonJ.W. (1990) Slow-cooling protocol for crystallographic refinement by simulated annealing. Acta Cryst., A46, 585-593.
65. Jones,T.A., Zou.J.Y., Cowan,S.W., Kjeldgaard,M. (1991) Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst., A47, 110-119.
66. Dodson,E. (1995) Report of workshop on validation of macromolecular structures solved by X-ray analysis. Joint CCP4 and ESF-EACBM newsletter on protein crystallography. 31, 51-57
67. Ramachandran,G.N., Ramakrishnan.C., Sasisekharan,V. (1963) J.Mol. Biol., 7, 95-99.
68. Briinden,C.I., Jones.T.A. (1990) Between objectivity and subjectivity. Nature, 343, 687-689.
69. Kleywegt,G.J., Jones,T.A. (1995) "Braille for pugilists", Proceedings of the CCP4 Study Weekend, 6-7 January, p. 11-23.
70. Laskowski,R.A., MacArthur,M.W., Moss,D.S., Thornton, J.M. (1993) PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J.Appl.Cryst., 26,283-291.
71. Watkin,D. (1994) The control of difficult refinements. Acta Cryst, D50, 411-437.
72. Brunger,A.T. (1992) Free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures. Nature, 355, 472-475.
73. Brunger,A.T. (1993) Assessment of phase accuracy by cross validation: the free R value. Methods and applications. Acta Cryst., D49, 24-36.
74. Rossmann,M.G., Blow,D.M. (1963) Determination of phases by the conditions of non-crystallographic symmetry. Acta Cryst., 16, 39-45.
75. Zhang,K.Y.J., Main,P. (1990) Histogram matching as a new density modification technique for phase refinement and extension of protein molecules. Acta Cryst., A46, 41-46.
76. Lunin,V.Yu., Urzhumtsev,A.G., Skovoroda,T.P. (1990) Direct low-resolution phasing from electron-density histograms in protein crystallography. Acta Cryst., A46, 540-544.
77. Lunin,V.Yu. (1993) Electron density histograms and the phase problem. Acta Cryst., D49, 90-99.
78. Lunin,V.Yu., Skovoroda,T.P. (1991) Frequencies-restrained structure factor refinement. I. Histogram simulation. Acta Cryst., A47, 45-52.
79. Lunin,V.Yu., Vernoslova,E.A. (1991) Frequencies-restrained structure factor refinement. II. Comparison of methods. Acta Cryst., A47, 238-243.
80. Cowtan,K.D., Main,P. (1993) Improvement of macromolecular electron-density maps by the simultaneous application of real and reciprocal space constraints. Acta Cryst., D49, 148-157.
81. Xiang,S., Carter, C.W.Jr, Bricogne.G., Gilmore,C.J. (1993) Entropy maximization constrained by solvent flatness: a new method for macromolecular phase extension and map improvement. Acta Cryst., D49, 193-212.
82. Schevitz,R.W., Podjarny,A.D., Zwick,M., Hugkes,JJ., Sigler,P.B. (1981) Improving and extending the phases of medium- and low- resolution macromolecular structure factors by density modification. Acta Cryst., A37, 669-677.
83. Jiang,J.-S., Brunger,A.T. (1994) Protein hydration observed by X-ray diffraction. J. Mol. Biol., 243, 100-115.
84. Roberts,A.L.U., Brunger,A.T. (1995) Phase improvement by cross-validation density modification. Acta Cryst., D51, 990-1002.
85. Brunger A.T. (1997) Free R Value: Cross-Validation in Crystallography. In Methods in Enzymology, 277, 366-396, Academic Press.
86. Cowtan,K.D. (1994) DM: An automated procedure for phase improvement by density modification. Joint CCP4 and ESF-EACBM newsletter on protein crystallography, 31, 34-38.
87. Lunin,V.Yu., Skovoroda,T.P. (1995) R-free likelihood-based estimates of errors for phases calculated from atomic models. Acta Cryst., A51, 880-887.
88. Lunin,V.Yu., Urzhumtsev.A.G. (1984) Improvement of protein phases by coarse model modification. Acta Cryst., A40,269-277.
89. Diamond,R. (1971) A real-space refinement procedure for proteins. Acta Cryst., All, 436-452.
90. Isaacs,N.W., Agarwal.R.C. (1978) Experience with fast Fourier least-squares in the refinement of the crystal structure of rhombohedral 2-zinc insulin at 1.5A resolution. Acta Cryst., A34, 782-791.
91. Sheldrick,G.M. (1976) SHELX86. Program for crystal structure determination. University of Gottingen, Federal Republic of Germany (Computer program).
92. Sheldrick,G.M. "SHELXS-86", Ciystallographic computing 3, edited by G.M.Sheldrick, C.Kruger, R.Goddard, Oxford: Clarendon Press, p.184-189.
93. Sheldrick,G.M. (1990) Phase annealing in SHELX-90: direct methods for larger structures. Acta Cryst., A46, 467-473.
94. Sheldrick,G.M, Schneider,T.R. (1997) SHELXL: high-resolution refinement. In Methods in Enzymology, 277, 319-343, Academic Press.
95. Lamzin.V.S., Wilson,K.S. (1993) Automated refinement of protein models. Acta Cryst., D49, 129-147.
96. Юсупов М.М., Траханов С.Д., Барынин В.В., Боровягин B.JL, Гарбер М.Б., Седельникова С.Э., Селиванова О.М., Тищенко С.В., Широков В.А., Единцов И.М. (1987) Кристаллизация 30S субчастиц рибосом Thermus thermophilus. Докл. АН СССР, 292, 1271-1274.
97. Trakhanov S.D., Yusupov М.М., Agalarov S.Ch., Garber M.B., Ryazantsev S.N., Tischenko S.V., Shirokov V.A. (1987) Crystallization of 70S ribosomes and 30S ribosomal subunits from Thermus thermophilus. FEBS Lett, 220, 319-322.
98. Yonath A., Glotz C., Gewitz H.S., Barteies K.S., Von Bohlen К., Makowski I., Wittmann H.G. (1988) Characterization of crystals of small ribosomal subunits. J. Mol. Biol., 203, 831-834.
99. Yonath A., Missing J., Teshe В., Lorenz S., Erdmann V. and Wittmann H.G. (1980) Crystallization of ribosomal subunit from B. stearothermophilus. Biochem. Int., 1, 428-435.
100. Wittmann H.G., Mussig J., Gewitz H.S., Piefke J., Rheinberger H-J. and Yonath A. (1982) Crystallization of E.coli ribosome. FEBS Lett., 146, 217220.
101. Карпова E.A., Сердюк И.Н., Тарховский Ю.В., Орлова Е.В., Боровягин B.JL (1986) Кристаллизация рибосом Thermus thermophilus. Докл. АН СССР, 289, 1263-1266.
102. Yusupov М.М., Tischenko S.V., Trakhanov S.D., Ryazantsev S.N., Garber M.B. (1988) A new crystalline form of 30S ribosomal subunits from Thermus thermophilus. FEBS lett., 238, 113-115.
103. Yusupov M.M., Garber M.B., Vasiliev V.D., Spirin A.S. (1991) Thermus thermophilus ribosomes for crystallographic studies. Biochimie, 73, 887897.
104. Yonath A. and Wittmann H.G. (1989) Challenging the three-dimensional structure of ribosome. Trends Biochem. Sei., 14, 329-335.
105. Trakhanov S., Yusupov M., Shirokov V., Garber M., Mitshler A., Ruff M., Thierry J.C., Moras D. (1989) Preliminary X-ray investigation of 70 S ribosome crystals from Thermus thermophilus. J. Mol. Biol., 209, 327-328.
106. Hansen H.A., Volkmann N., Piefke J., Glotz C., Weinstein S., Makowski I., Meyer S., Wittmann H.G., Yonath A. (1990) Crystals of complexes mimicking protein biosynthesis are suitable for crystallographic studies. Biochim Biophys Acta 1050, 1-7.
107. Ban N., Freeborn B., Nissen P., Penczek P., Grassucci R.A., Sweet R., Frank J., Moore P.B., Steitz T.A. (1998) A 9A resolution X-ray crystallographic map of the large ribosomal subunit. Cell, 93,1105-1115.
108. Clemons W.M.Jr, May J.L.C., Wimberly B.T., McCutcheon J.P., Capel M.S., Ramakrishnan V. (1999) Structure of a bacterial 30S ribosomal subunit at 5.5A resolution. Nature, 400, 833-840.
109. Ban N., Nissen P., Hansen J., Capel M., Moore P.B., Steitz T.A. (1999) Placement of protein and RNA structures into a 5A-resolution map of the 50S ribosomal subunit. Nature, 400, 841-847.
110. Cate J.H., Yusupov M.M., Yusupova G.Zh., Earnest T.N., Noller H.F. (1999) X-ray crystal structure of 70S ribosome functional complexes. Science, 285, 2095-2104.
111. Powers T. and Noller H.F. (1995) Hydroxyl radical footprinting of ribosomal proteins on 16S ribosomal RNA. RNA, 1, 194-209.
112. Mueller F. and Brimacombe R.A. (1997) A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. II. The RNA-protein interaction data. J. Mol Biol., 271, 545-565.
113. Lodmell J.S., Dahlberg A.E. (1997) A conformational switch in Escherichia coli 16S ribosomal RNA during decoding of messenger RNA. Science, 277, 1262-1267.
114. Agafonov D.E., Kolb V.A., Spirin A.S. (1997) Proteins on ribosome surface: measurements of protein exposure by hot tritium bombardment technique. Proc Natl Acad Sei USA, 94, 12892-12897.
115. Cate J.H., Gooding A.R., Podell E., Zhou K., Golden B.L., Kundrot C.E., Cech T.R., Doudna J.A. (1996) Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing. Science, 273, 1678-1685.
116. Szewczak A.A., Moore P.B. (1995) The sarcin/ricin loop, a modular RNA. J. Mol. Biol., 247, 81-98.
117. Correll C.C., Munishkin A., Chan Y-L., Ren Z., Wool I. G., Steitz T. A. (1998) Crystal Structure of the Ribosomal RNA Domain Essential for Binding Elongation Factors. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 95, 13436.
118. Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R.A., Li Y., Leith A., Nierhaus K.H., Frank J. (1996) Direct visualization of A-, P-, and E-site transfer RNAs in the Escherichia coli ribosome. Science, 271, 1000-1002.
119. Stark H, Orlova E.V, Rinke-Appel J, Junke N, Mueller F, Rodnina M, Wintermeyer W, Brimacombe R. and Marin van Heel (1997) Arrangement of tRNAs in Pre- and Posttranslocational Ribosomes Revealed by Electron Cryomicroscopy. Cell, 88, 19-28.
120. Wilson K.S. and Noller H.F. (1998) Mapping the position of translational elongation factor EF-G in the ribosome by directed hydroxyl radical probing. Cell, 92, 131-139.
121. Culver G.M., Cate J.H., Yusupova G.Zh., Yusupov M.M., Noller H.F. (1999) Identification of an RNA-protein bridge spanning the ribosomal subunit interface. Science, 285, 2133-2135.
122. Green R. and Noller H.F. (1997) Ribosomes and translation. Annu. Rev. Biochem, 66, 679-716.
123. Liljas A. (1991) Comparative biochemistry and biophysics of ribosomal proteins. Int. Rev. of Cytology., 124, 103-136.
124. Wittmann-Liebold B., Ashman K., Dzionara M. (1984) On the statistical significance of homologous structures among the Escherichia coli ribosomal proteins. Mol Gen Genet, 196,439-448.
125. Serdyuk I.N., Zaccai G., Spirin A.S. (1978) Globular conformation of some ribosomal proteins in solution. FEBSLett. 94, 349-352.
126. Moller W., Groene A., Terhorst C., Amons R. (1972) 50-S ribosomal proteins. Purification and partial characterization of two acidic proteins, A1 and A2, isolated from 50S ribosomes of Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 25,5-12.
127. Ramakrishnan V. and White S.W. (1998) Ribosomal protein structures: insights into the architecture, machinery and evolution of the ribosome. TIBS, 23, 208-212.
128. Orengo, C.A. and Thornton, J.M. (1993). Alpha plus beta folds revisited: some favored motifs. Structure, 1,105-120.
129. Fresco J.R., Alberts B.M., & Doty P. (1960) Some molecular details of secondary structure of ribonucleic acids. Nature, 188, 98-104.
130. Spirin A.S. (1960) On macromolecular structure of native high-polymer ribonucleic acid in solution. J. Mol. Biol., 2, 436-446.
131. Cox R.A. (1966) The secondary structure of ribosomal RNA in solution. Biochem. J., 98, 841-857.
132. Woodson S.A. and Leontis N.B. (1998) Structure and dynamics of ribosomal RNA. CurrOpin Struct Biol, 8, 294-300.
133. Abdel-Meguid S.S., Moore P.B., Steitz T.A. (1983) Crystallization of a ribonuclease-resistant fragment of Escherichia coli 5 S ribosomal RNA and its complex with protein L25. J. Mol. Biol. ,171,207-215.
134. Oubridge C., Ito N, Evans P.R., Teo C.H., Nagai K. (1994) Crystal structure at 1.92A resolution of the RNA-binding domain of the U1Aspliceosomal protein complexed with an RNA hairpin. Nature, 372, 432438.
135. Draper D.E. (1999) Themes in RNA-protein recognition. J. Mol. Biol, 293, 255-270.
136. Draper D.E. and Reynaldo L.P. (1999) RNA binding strategies of ribosomal proteins. Nucleic Acid Res., 27, 381-388.
137. Otwinowski, Z. and Minor, W. (1997) Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. In Methods in Enzymology, 276, 307-326, Academic Press.
138. Zvereva,M.I., Shpanchenko,O.V., Nierhaus,K.H. and Dontsova,O.A. (2000) Incorporation of ribosomal protein TL5 T.thermophilus into 50S ribosomal subunitis.co//. Dokl. Akad. Nauk, RAS, accepted.
139. Gongadze,G.M., Tishchenko.S.V., Sedelnikova,S.E. and Garber,M.B. (1993) Ribosomal proteins, TL4 and TL5, from Thermus thermophilus form hybrid complexes with 5S ribosomal RNA from different microorganisms. FEBS Lett., 330, 46-48.
140. Matthews B.W. (1968) Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol., 33,491-497.
141. Holm,L. and Sander,C. (1993) Protein structure comparison by alignment of distance matrices. J.Mol.Biol., 233, 123-138.
142. Lu,G. (2000) TOP: A new method for protein structure comparisons and similarity searches. J. Appl. Crystallogr., 33, 176-183.
143. Lu,M. and Steitz,T.A. (2000) Structure of Escherichia coli ribosomal protein L25 complexed with a 5S rRNA fragment at 1.8-A resolution. PNAS, 97, 2023-2028.
144. Stoldt,M. Wohnert,J., 0hlenschlager,0., Gorlach,M. and Brown,L.R. (1999) The NMR structure of the 5S rRNA E-domain-protein L25 complex shows preformed and induced recognition. EMBO J., 18, 6508-6521.
145. Correll,C.C., Freeborn,B, Moore,P.B. and Steitz,T.A. (1997) Metals, motifs and recognition in the crystal structure of a 5S rRNA domain. Cell, 91,705-712.
146. Jorgensen, W.L., Chandreskhar, J., Madura, J.D., Imprey, R.W. & Klein, M.L. (1983). Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. J. Chem. Phys., 79, 926-935.
147. Gryaznova,O.I., Davydova,N.L., Gongadze,G.M., Jonsson,B.H., Garber,M.B. and Liljas,A. (1996) A ribosomal protein from Thermus thermophilus is homologous to a general shock protein. Biochimie, 78, 915919.
148. Zhang,G. and Darst,S.A. (1998) Structure of the Escherichia coli RNA polymerase a subunit amino-terminal domain. Science, 281, 262-266.
149. Zhang,G., Campbell,E.A., Minakhin,L., Richter,C., Severinov,K. and Darst,S.A. (1999) Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell, 98, 811-824.
150. Niu,W., Kim,Y., Tau,G., Heyduk,T. and Ebright,R. H. (1996) Transcription activation at class II CAP-dependent promoters: Two interactions between CAP and RNA polymerase. Cell, 87, 1123-1134.
