Пространственная структура комплекса рибосомного белка S15 с фрагментом 16S рибосомной РНК из Thermus thermophilus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский орденов Ленина, Октябрьской революции и Трудового красного знамени Государственный Университет им. М. В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.217

s 5 О Л

НИКУЛИН Алексей Донатович, j ;

Пространственная структура комплекса рнбосомного белка S15 с фрагментом 16S рибосомной РНК из Thermus thermophilus.

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2000

Работа выполнена в Группе структурных исследований Института белка РАН и Учебном центре молекулярной биологии Пущинского государственного университета

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук С. В. Никонов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук О. А. Донцова

доктор химических наук Л. В. Малинина

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится 10 октября 2000 г. в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьёвы горы, Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан ^ сентября 2000 г.

Ученый секретарь кандидат химическ

И. Г. Смирнова

О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Все живые клетки осуществляют биосинтез белка в рибосомах -чрезвычайно сложных молекулярных машинах. Для того, чтобы понять, почему этот процесс протекает так точно и эффективно, необходимо знать детальное устройство рибосомы. Структурные исследования рибосомы широко ведутся уже в течении 40 лет, но только в 1999 году был достигнут существенный прогресс в этом направлении (1).

Сложная организация рибосомы существенно затрудняет построение моделей высокого разрешения, поэтому чрезвычайно актуальны структурные исследования отдельных компонентов рибосом. В основе структурной организации и функционирования бактериальной рибосомы лежит взаимодействие трех рибосомных РНК и нескольких десятков белков. Несмотря на интенсивные исследования, взаимодействия между рибосомными белками и рРНК изучены достаточно слабо. В последний год сделан заметный шаг вперед -определены первые структуры рРНК-белковых комплексов с атомным разрешением, существенно расширившие наши знания в области РНК-белковых взаимодействий. Эти структуры можно использовать также при построении детальной модели рибосомы, поскольку отдельные элементы рибосом можно встраивать в модели рибосомных субчастиц, получая достаточно точные модели рибосомы на атомарном уровне.

Цель работы

Целью настоящей работы было определение пространственной структуры комплекса рибосомного белка S15 со специфически связывающимся фрагментом 16S рибосомной РНК из Thermus thermophilus и анализ их взаимодействия.

Научная новизна

Впервые определена структура комплекса рибосомного белка S15 с фрагментом рибосомной РНК, что позволило рассмотреть взаимодействия между рибосомным белком и 16S рРНК с атомарным разрешением и показать важную роль рибосомных белков при сворачивании рРНК. Знание деталей рРНК-белковых взаимодействий может активно использоваться для исследований механизма биосинтеза белков на рибосомах и влияния на этот процесс антибиотиков.

Методика получения фрагментов РНК высокой чистоты в препаративных количествах с использованием самоотщепляющихся рибозимов на концах транскрипта может быть полезна в биохимических и кристаллографических исследованиях РНК и комплексов РНК с белками. Методика получения и использования мутантных белков со вставками дополнительных селенометионинов может широко применяться для

реитгеноструктурных исследований макромолекул с помощью метода аномального рассеяния на нескольких длинах волн.

Результаты работы имеют также фундаментальное значение для физической химии белков и нуклеиновых кислот, поскольку позволяют выявить детали и принципы взаимодействия этих макромолекул.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы. Результаты работы докладывались на 3 конференциях. Координаты атомов полученной модели комплекса S15-pPHK занесены в RCSB Protein Data Bank (код 1DK1) и в NDB банк (код RR0005).

Объём и структура работы

Диссертационная работа изложена на (во страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит ЬО рисунков, ¡о таблиц. Список литературы включает 1% источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект исследования

Белок S15 - один из наиболее изученных рибосомных белков. Он входит в число белков малой рибосомной субчастицы, независимо связывающихся с 16S рибосомной РНК. Белок S15 связывается с центральным доменом 16S рРНК и входит в состав «платформы» малой субчастицы рибосомы (2). «Платформа» - функционально важная область рибосомы: она необходима для сборки целой рибосомы из отдельных субчастиц и служит местом связывания тРНК в Р-участке рибосомы (3,4). Как и некоторые другие рибосомные белки, белок S15 является репрессором трансляции своей собственной мРНК (5). Недавно было показано, что белок S15 может специфически взаимодействовать с петлей 23 S рРНК, выступающей из большой рибосомной субьединицы в сторону малой (6). Таким образом, белок S15 важен для функционирования и сборки рибосомы, и является чрезвычайно интересным объектом для исследования механизмов взаимодействия белков с РНК, поскольку взаимодействует с тремя различными РНК.

Минимальный специфически связывающийся с белком S15 фрагмент 16S рРНК из Т. thermophilic, длиной 56 нт, был выделен ранее А. Сергановым (7). Структура белка S15 Т. themophilus в растворе определена с помощью ЯМР (8). Кристаллическая структура известна для гомологичного белка S15 из Bacillus stearothermophilus (9). Материалы и методы

Получение рекомбинантных белков проводили путем экспрессии плазмидных ДНК, содержащих ген рибосомного белка TthS15 из Т. thermophilic или его различные мутанты, в клетках штаммов Е. coli

BL21(DE3) или B834(DE3) (10). Выделение и очистку белков осуществляли с помощью хроматографии на колонке с CM-Sepharose, как описано ранее (10). Чистота полученных белков была не менее 95%.

Получение фрагментов РНК проводили транскрипцией in vitro линеаризованной плазмидной ДНК с Т7 промотором. Конструкции для синтеза фрагментов РНК длиной 56 нт, 57 нт, 61 нт и 65 нт были предоставлены А. Сергановым. Очистку полученных фрагментов осуществляли гель-фильтрацией на колонке Prep BioSil SEC-250 или очисткой на геле в денатурирующих условиях. Для получения гомогенных концов использовали самоотщепляющиеся рибозимы на 3'-конце или на обоих концах транскрипта.

Получение и кристаллизация комплекса S15-PHK. Комплекс белка S15 с фрагментами РНК получали смешиванием их эквимолярных количеств в соответствующем буфере с последующей инкубацией при 4°С в течение не менее 1 часа. Для кристаллизации использовали метод висячей капли (11).

Сбор дифракционных данных проводили методом вращения-качания. В качестве источника рентгеновских лучей использовались генератор с вращающимся анодом (Nonius, детектор DIP2000a), синхротроны LURE. Париж (станции DW21 и W32, детекторы MAR Image Plate), DESY, Гамбург (станция BW7A, детектор MAR CCD) и ESRF, Гренобль (станция ID14, детектор MAR CCD). Для увеличения времени жизни в рентгеновском пучке кристаллы охлаждали до 11 OK, используя криостат на жидком азоте (Oxford Cryosystems). Полученные дифракционные картины обрабатывали программами DENZO и SCALEPACK (12).

Расчеты проводили на рабочих станциях Octane и Indigo2 (SGI) и персональном компьютере. Большинство использованных кристаллографических программ являются частью комплекса ССР4 (13). Уточнение рассчитанной структуры проводили с помощью комплекса CNS (14). Для построения модели комплекса использовалась программа молекулярной графики О (15).

Определение пространственной структуры комплекса S15-PHK.

Оптимизация условий кристаллизации. Первоначально условия кристаллизации комплекса белка S15 с фрагментом РНК были найдены С. Тищенко (неопубликованные данные), для чего использовался набор Natrix™ Crystal Screen (Hampton Research). Кристаллы комплекса размером 100-200 мкм выпадали при наличии в каплях сульфата аммония при 22°С и pH от 5.6 до 8.5. Оптимальными условиями для образования кристаллов оказались следующие: 3-5 мМ ионов магния, 2.ОМ сульфата аммония, pH 6.2±0.1, 22°С. Кристаллы давали дифракционную картину с разрешением около 3.2Â.

С целью улучшение качества и увеличение области разрешения кристаллов исследовали разные варианты фрагментов РНК в составе

комплекса (рис. 1.). Однако, как оказалось, кристаллизуется только комплекс с фрагментом РНК длиной 57 нт.

I Н22 г-"" ' пс

аол°0Л,ОС «V^Vo

1-171 ~ в>0 А гА

Н21 в«0* 0 „а V Ло

° Vс

e-ç mn

cGc

о

° С '

C-C A

C-G G-C I— G — С

О- С A

¡:? -

Рис. 1. Схематическое представление расчетной вторичной структуры фрагментов 16S рРНК. На схеме обозначена нумерация спиралей рРНК.

1. фрагмент длиной 57 нг,

2. фрагмент длиной 56 нт,

3. фрагмент длиной 61 нт,

4. фрагмыгт длиной 65 нг.

На качество кристаллов сильно влияет степень чистоты исходных компонентов. Белок S15 после хроматографии получали с высокой степенью чистоты (без примесей по электрофорезу). При проверке препарата РНК было замечено наличие примесей 57+1, 57+2 нт, которые невозможно отделить гель- фильтрацией. Для получения гомогенных концов использовали самоотщепляющиеся рибозимы на 3'-конце или на обоих концах транскрипта, (рис. 2).

Оптимальным вариантом получения РНК оказалось использование конструкции с 3'-концевым рибозимом с последующей очисткой фрагмента на геле при денатурирующих условиях. Следует отметить, что полученные из разных конструкций фрагменты РНК давали отличающиеся по качеству кристаллы и с разным выходом. Это можно объяснить влиянием на упаковку молекул комплекса в кристалле межмолекулярных контактов концов фрагментов РНК, которые отличаются в зависимости от способа получения фрагмента (рис. 2.).

Время инкубации раствора комплекса перед кристаллизацией также влияло на рост кристаллов. По истечении 15 минут после смешивания растворов белка и РНК, образовывалось более 95% молекул комплекса, состояние равновесия наступало после 30 минут инкубации при 4°С (7). Увеличение времени инкубации до 2-3 часов способствовало образованию более качественных кристаллов.

В результате проведенной работы была оптимизирована методика получения крупных кристаллов комплекса с низкой мозаичностью и хорошим выходом.

+

ÏWHNM — nnnnn— n- га, ic, i<4 га

^^ X-rA. rC, rU

H-un

Рис.2. Транскрипция in vitro.

а). Схема транскрипции. Показаны промотор Т7 РНК-полнмеразы и положение сайга рестрикции на 3' конце ДНК, используемый для ее линеаризации. Справа приведен транскрипт.

б). Транскрипт с хаммерхед рибозимом на 3' конце фрагмента. Стрелкой показано место вырезания рибозима после транскрипции. Справа приведен получающийся после опцепдения рибозима фрагмент РНК с циклофосфатом на 3'-конце.

в). Транскрипт с хаммерхед рибозимами на обоих концах фрагмента после транскрипции.

г). Структура минимального хаммерхед-рибозима (16). Выделены консервативные нуклеотиды.

Кристаллизация комплекса белка S15 с фрагментом 16S рРНК.

Кристаллизационные капли получали смешиванием 3 мкл раствора комплекса (6 мг/мл фрагмента РНК, 3 мг/мл белка S15, 2.6 мМ хлорида магния, 50 мМ хлорида калия, 10 мМ Na какодилата, рН 6.2) и 2 мкл раствора осадителя (2.4 M сульфата аммония, 100 мМ Na какодилата, рН 6.2). Стекло с каплей помещалось над 500 мкл раствора осадителя. Кристаллизация проводилась при 22°С. Кристаллы достигали размера 300x300x500 мкм через 3-5 дней и имели гексагональную форму (рис. Г). Предел разрешения дифракционной картины достигал 2.8Â.

Сбор дифракционных данных. Тестирование кристаллов комплекса проводили при комнатной температуре, однако время жизни

' Рисунки, обозначенные римскими цифрами, расположены на цветной вкладке между стр. 8 и 9.

г

кристаллов в пучке оказалось недостаточным для получения полного набора данных. Для увеличения времени жизни кристаллы замораживали и съёмку проводили при 11 ОК. Нахождение условий замораживания оказалось затруднительным, так как использование глицерина, МПД, этиленгликоля, полиэтиленгликолей для предотвращения образования льда при замораживании кристаллов, вызывало осаждение сульфата аммония из растворов. Понижение концентрации соли приводило, в свою очередь, к растворению кристаллов комплекса. Единственным подходящим раствором оказался следующий раствор: 25% глюкозы, 2.0М сульфат аммония, 100 мМ № какодилат, рН 6.2. Кристаллы переносили в данный раствор на 3 часа, затем помещали в петлю из нейлонового волокна и замораживали в жидком этане. В замороженном состоянии под жидким азотом кристаллы могли храниться в течении 2 недель без изменения качества дифракционной картины. Время жизни кристаллов в пучке было достаточным для получения наборов данных с не менее чем 10-кратной избыточностью. Характеристики наборов данных, собранных с кристаллов комплекса, приведены в таблице 1.

Определение стартового набора фаз. Были оттестированы 17 различных соединений, из них только две соли (К2Р1С14 и ТЬС13) дали изоморфные кристаллы с хорошей величиной замещения. С кристаллов были сняты наборы данных при длинах волн оптимальных для получения аномального сигнала и использованы для определения стартового набора фаз (табл. 1). Однако рассчитанные фазы оказались недостаточными, и полученная карта электронной плотности была неинтерпретируемой.

Таблица 1. Стагнстпческпе характеристики экспериментальных данных, полученных от криааллоп комплекса 815-рРНК и 815(25еМеО-рРНК.

Kpucma.it Чативный тьа, 2 БеШ

Длина волны,А 0.9630 0.9537 1.042 1.54 0.9794 0.9800

11 редел разрешения, А 30-3.0 20-3.1 30-3.5 20-3.1 15-3.0 15-3.0

Всс1 и рефлексов 89459 100936 58303 106291 196631 224864

Из них уникальных 6804 6125 4349 6151 6694 6707

11олн(ма набора, % 99.9 99.1 99.9 99.9 99.8 94.3

(99.8) (99.8) (99.9) (99.9) (99.2) (78.2)

Величина [1/а1] 10(5) 15(10) 15(10) 12(10) 10(10) 5(4)

6.7 9.1 6.7 8.5 7.2 7.1

(27.9) (25.0) (21.6) (37.5) (23.1) (23.7)

В скобках приводится значение величины в слое высокого разрешения

Параллельно был выделен и закристаллизован в составе комплекса белок с заменой метионинов на селенометионины с целью использования аномального рассеивания на многих длинах волн (МАО) для определения фаз (табл. 1). К сожалению, внедрение двух селенометионинов в комплекс такого размера (27.3 кДа) оказалось недостаточным для

применения выбранного метода, поскольку отношение AFani/aà.Fano оказалось значительным только до разрешения 4.5Â.

Для преодоления трудностей получения фаз был выделен ряд мутантных белков: два белка с заменой одной из аминокислот на цистеин (ТЗС и К4С), и четыре белка с заменой двух аминокислот на метионин (I2M+K4M, Q8M+A79M, V10M+A79M, I11M+A79M). Внедрение цистеинов проводилось с целью последующего специфического связывания соединений ртути, а двух дополнительных метионинов - для увеличения аномального сигнала от селенометиониновых белков при определении фаз методом MAD. Изменения последовательности гена белка S15 были проведены с помощью ПЦР, используя олигонуклеотиды для получения соответствующих замен в аминокислотной последовательности.

Вставка цистеинов не дала желаемого результата по причине низкой величины замещения атомов ртути в тяжелоатомных производных белков S15T3C и S15K4C. Использование белка S15(111М+А79М) позволило получить кристаллы комплекса с пределом разрешения дифракционной картины 2.8Â и значительным аномальным сигналом. С этих кристаллов собраны данные на трех длинах волн (табл. 2) и использованы для расчета фаз методом MAD.

Таблица 2. Статистические характеристики экспериммггальных данных, полученных от кристаллов комплекса S 15(111М+А79М) - рРНК.

Кристалл 4 5еМе1 Максимум f Минимум/' Удаленная точка

Длина волны, А 0.97926 0.97961 0.94654

Предел разрешения, А 20-2.9 20-2.9 20-2.8

Всего рефлексов 401102 233481 373691

Из них уникальных 7358 7379 8260

Полнота набора, % 99.9(99.8) 98.0 (98.0) 99.9 (99.5)

Величина [1/ст1] 20(15) 20(15) 19(12)

К(1)„.с,бе==1|И1>/£1, % 3.6(11.5) 3.1 (11.5) 3.8 (20.9)

В скобках приводится значение величины в слое высокого разрешения

Расчет фаз полученных методами изоморфного замещения и методом аномального рассеивания на многих длинах воли.

Дифракционные данные от двух производных кристаллов и данные от кристаллов комплекса, содержащего белок с двумя селенометионинами, были нормированы к нативному набору с помощью программы СТАВ (17) и использованы для вычисления карт функции Паттерсона с коэффициентами Ррн-Рр (изоморфный синтез) и />//-/>// (аномальный синтез). Нахождение координат тяжелых атомов проводилось программой ЯБРБ из комплекса ССР4 (13).

Нормирование данных при использовании метода МАО, проводили программой 8САЬА из комплекса ССР4 (13). На разностной аномальной

карте Паттерсона наблюдались четкие пики соответствующие четырем атомом селена.

В случае метода изоморфного замещения уточнение координат тяжелых атомов и величины замещения с последующим расчетом фаз проводили программой MLPHARE из комплекса ССР4, причем учитывалась как изоморфная информация, так и эффект аномального рассеивания тяжелыми атомами. Дня метода аномального рассеивания на многих длинах волн в тех же целях использовали программу SHARP (18).

В результате, интерпретируемые карты электронной плотности были получены двумя независимыми путями: методом изоморфного замещения с учетом аномального рассеивания тяжелыми атомами и методом аномального рассеивания на многих длинах волн. Статистика по расчетам приведена в табл. 3 и 4.

Таблица 3. Статистические характеристики определения фаз методом изоморфного замещения (программа MLPHARE).

Кристалл К;Р1С14 TbCl, 2 SeKiet

(max/") (minf)

Rc.ii,.*, центр 0.49(0.36) 0.45(0.58) 0.65(0.46) 0.67(0.84) 0.66(0.88)

Ясн,!* ацентр 0.65(0.46) 0.68(0.77) 0.97(0.71) 0.64(0.79) 0.66(0.82)

КсиП!» аномальный** 0.83 0.76 0.88 0.76 0.59

Фазовая сила, центр *** 0.89(0.96) 0.93(0.90) 0.86(0.95) 1.11(0.91) 1.13(0.88)

Фазовая сила, ацентр *** 0.92(0.96) 0.91(0.91) 0.84(0.96) 1.84(1.45) 1.81(1.41)

Таблица 4 Статистические характеристики определения фаз методом аномального рассеивания на многих длинах волн (программа SHARP).

Кристалл 4 БеМе! Максимум/' Минимум /' Удаленная точка

Rc.ii» Центр * 0.60 (0.54) 0.46 (0.59) нет

RcuШl ацентр * 0.61 (0.55) 0.46 (0.57) нет

Исии,, аномальный** 0.44 (0.93) 0.60 (0.98) 0.50 (0.98)

Фазовая сила, центр*** 1.51 (0.63) 1.65 (0.62) нет

Фазовая сила, ацентр*** 4.47 (1.11) 3.13 (1.04) 3.96 (0.92)

Центр. - центросимметричные рефлексы, ацентр. - нецентросимметричные рефлексы В скобках приводится значение величины в слое высокого разрешения

"Фазовая сила

IN'

где 114' = K|f„|(0ü.t)-|/-;„|(ca'c-)i;

Построение и уточнение пространственной модели комплекса.

После расчета первоначальных фаз электронная плотность была модифицирована программой SOLOMON из комплекса ССР4(13). Карты электронной плотности, полученные обоими методами, были высокого

Рис. I. Фотография кристаллов комплекса белка S15 из T.thermophilus с 16S рРНК. Рис. II. Фрагмент карты электронной плотности полученной методом MAD. Рис. III. Стереоизображение структуры комплекса Обозначены спирали фрагмента РНК (Н20, Н21, Н22) и две спирали белка (а 1 и аЗ). Разные тяжи РНК выделены желтым, оранжевым и красным цветами. Голубыми сферами обозначены ионы магния.

Рис. IV. Расположение взаимодействующих с белком S15 нукпеотидов на I6S рРНК. Красным цветом выделены консервативные нуклеотиды, серым цветом - неконсервативные. Сферами показаны контактирующие с белком фосфаты нуклеотидов; в случае взаимодействия с белком непосредственно оснований последние также выделены соответствующим цветом. Голубые сферы - ионы магния.

Рис. V. Расположение взаимодействующих с РНК аминокислотных остатков в белке S15. Красным цветом показаны аминокислоты, консервативные среди известных последовательностей белка; зеленым - консервативные среди бактерий; серым - неконсервативные.

Рис. VI. Структура участка соединения трех спиралей РНК. Показано взаимодействие основания G587 с 3' фосфатом А753 и участие иона магния. Красным цветом выделен поворот цепи РНК на 90° между нуклеотидами А753 и С754.

Рис. VII. Основания G752, G654, С754 (красные) образуют тройное взаимодействие в районе соединения спиралей РНК. Ниже располагается обратная Хугстеновская пара A-U (оранжевая). Нукпеотид А653 (серый) является уменьшающей напряжение вставкой. Голубым показан фрагмент электронной плотности вокруг трех нуклеотидов (1,2а). Зеленые пунктирные линии - водородные связи.

Рис. VIII. Участок взаимодействия белка S15 с РНК в районе соединения трех спиралей. Голубыми сферами выделены ионы магния, окруженные фрагментами электронной плотности (1 8а). Водородные связи показаны зелеными пунктирными линиями. Боковые цепи остатков Туг68 и Arg71 контактируют непосредственно с сахарофосфатным остовом, a Glu72 - через ион Mg3. Расстояние между Mg2 и Mg3 составляет 4.7А.

Рис. IX. Структура второго участка взаимодействия белка SI5 с рРНК (нуклеотиды G666-U740/G667-C739 и район петли а2-аЗ). Остаток Ser51 образует водородные связи с основаниями с РНК посредством молекулы воды (W). Водородные связи показаны зелеными пунктирными линиями.

Рис. X. Предполагаемая модель взаимодействия белка S15 с мРНК (Э. Вестхов).

Рис. XI. Предполагаемая модель взаимодействия между 16S рРНК, белком SI5 и шпилькой

23S рРНК. В качестве модели шпильки взята структура U2A мяРНК.

качества и легко интерпретируемыми - можно было легко различить а-спирали белка и основания РНК. (рис. II). В электронную плотность была помещена определенная ранее методом ЯМР структура белка S15 и исправлена соответственно имеющейся плотности. Ход цепи РНК прослеживался четко, основания были соотнесены с плотностью вручную. В процессе интерпретации карты электронной плотности было обнаружено, что нуклеотид С664 имеет две альтернативные конформации.

Уточнение модели комплекса проводили программой CNS (14) с использованием рефлексов со срезкой по 2о(1). Для уточнения положений атомов использовали метод отжига (simulated annealing) и минимизацию энергетической функции Еша\ по градиентному методу. При уточнении

осуществлено моделирование объёмного неупорядоченного растворителя (bulk solvent correction) с помощью стандартной процедуры. По достижению R-фактором модели значения 0.3, для каждого атома провели уточнение изотропных температурных факторов. В процессе уточнения модели были добавлены 7 ионов магния и 24 молекулы воды. Молекулы помещались в положения, соответствующие пикам в 3Fo/)S-2Fca/c карт электронной плотности, расположенных вблизи потенциальных доноров и акцепторов водородных связей. На всех стадиях уточнения в качестве критерия улучшения модели руководствовались свободным R-фактором, вычисляемым по тестовому набору (5% от полного набора). Основные показатели построенной модели приведены в табл. 5.

Таблица 5. Параметры конечной модели комплекса

Разрешение (А) 8.0-2.8

Срезка 2а

Число используемых при уточнении 7679

отражений

Количество в независимой части ячейки атомов белка и РНК 2010

молекул воды 24

ионов магния 7

ионов калия и натрия 3

Я фактор рабочий 0.223

свободный (по 5% отражений) 0.288

Среднеквадратичные отклонения параметров длин связей (А) 0,005

от идеальных значений валентных углов (°) 1,262

Остатки белка на карте Рамачацдрана В разрешенных областях 77,9

В дополнительных областях 16,9

Анализ структуры комплекса S15-pPHK.

Пространственная структура комплекса S15-PHK представлена на рис. III. Сравнение полученной структуры и структуры низкого разрешения участка 30S субчастицы, содержащего белок S15, показало хорошее соответствие взаимного расположения элементов белка и рРНК, что говорит о минимальном влиянии кристаллической упаковки на структуру комплекса.

Белок S15 не меняет свою структуру при образовании комплекса с рРНК. Рассчитанное среднеквадратичное отклонение положения атомов главной цепи белка в комплексе с РНК и свободном состоянии (9) составляет всего 0.8Â, что не превышает экспериментальной ошибки определения координат атомов.

Структура РНК-фрагмента. Фрагмент 16S рРНК из T.thermophilus длиной 57 нт состоит из укороченных спиралей Н20, Н21 и Н22. Спирали Н21 и Н22 закрыты петлями из 4 нуклеотидов UUCG. Спираль Н22 стыкуется со спиралью Н21, образую вытянутую структуру, а спираль Н20 прилегает к ней под углом примерно в 60°. Полученная структура РНК в комплексе с белком хорошо согласуется с биохимическими

данными по подвижности фрагмента РНК в геле (19). Уникальная конформация соединения трех спиралей РНК обеспечивается целой сетью взаимодействий (рис. 3, VI-VII):

1. образованием триплета G654-C754-G752,

2. обратной Хугстеновской парой U652-A753,

3. водородной связью неспаренного основания G587 и фосфатной группой С754,

4. перекрестным стэкинг-взаимодействием между основаниями G588, А753 и G654 принадлежащих трем спиралям РНК,

5. наличием трех ионов магния компенсирующих отрицательные заряды и служащих мостиками при электростатических взаимодействиях,

6. снятием стерических напряжений за счет 2'-эндо конформации рибозы нуклеотидов А753 и А653 и выпетливанием нуклеотида А653 из спирали Н22.

Рис. 3. Схема вторичной структуры комплекса рибосомного белка S15 с фрагме!ггом рРНК. Нумерация нуклеотидов соответствует 16S рРНК Е. coli. Линиями показаны взаимодействия между аминокислотными остатками и нуклеотидами или сахарофос-фатным остовом (фосфатом или 2'-ОН группой сахара). Основания, выделенные жирным шрифтом, высоко консервативны (95%) среди -6000 последовательностей 16S рРНК. Рибозные кольца, имеющие С2'-эндо конформацию, зачернены. Стэкинг - взаимодействия оснований обозначены штриховой линией. Показаны две альтернативные конформации G664. Аминокислоты, имеющие степень консервативности более 80% среди бактериальных последовательностей белка S15 подчеркнуты. Жирным шрифтом выделены аминокислоты, консервативные среди 55 бактериальных, архейных и эукарнотических последовательностей.

В верхней части спирали Н22 РНК аденозин А665 выпетливается наружу из спирали (рис. 3.), как было предсказано ранее (7). G664 имеет две альтернативные конформации: он может быть направлен наружу из области спирали или внутрь спирали. В первом случае его положение стабилизировано взаимодействиями с G664 и А665 симметричной молекулы, а во втором случае G664 образует

HÎS41 Serîl

неканоническую пару с G741. G742 и А663, из этой области консервативных нуклеотидов, образуют G*A имино-пару. В результате эта область РНК сильно отклоняется от конформации обычной для спирали РНК A-формы и открыта для внешних взаимодействий.

Взаимодействие белка S15 с РНК. Белок S15 распознает на поверхности РНК два удаленных участка (рис. 3), что соответствует предшествующим данным по футпринтингу и мутагенезу комплекса S15-РНК из разных организмов.

Один участок связывания располагается в районе соединения трех спиралей РНК (рис. 3 и VIII). Описанная ранее сеть взаимодействий, образованная высоко консервативными нуклеотидами, создает уникальную геометрию соединения трех спиралей рРНК, которая распознается белком. Белок взаимодействует с сахарофосфатным остовом, стабилизируя геометрию третичной структуры РНК. С районом соединения трех спиралей РНК прямо или через ион магния (Mg3) взаимодействуют боковые остатки аминокислот спирали аЗ (Arg64, Arg71, Туг68 и Glu72). Пять нуклеотидов одного тяжа спирали Н22 с С656 по G660 и два с другой стороны, С749 и G750, взаимодействуют с аминокислотами спирали al, частью спирали a2 у петли, соединяющей эти спирали. Большинство аминокислотных остатков взаимодействуют с сахарофосфатным остовом малого желобка РНК. Имеются только два специфических контакта с основаниями - это G657-Thr21 и G750-Gly22.

Второй участок располагается в верхней части спирали Н22. Белок S15 специфически связывается с высоко консервативными нуклеотидами малого желобка G666-U740/G667-C739 (рис. 4 и IX), стабилизируя уши-рение большого желобка в этом районе. Консервативные аминокислотные остатки района петли a2-a3 (His41, Asp48 и Ser51), направленные в сторону РНК, образуют непосредственно или через воду водородные связи со всеми четырьмя нуклеотидами G-U/G-C пар. Специфическое узнавание малого желобка происходит благодаря наличию G-U пары.

Правильной ориентации двух участков РНК относительно друг друга способствует выпетливание нуклеотида С748, приводящее к изгибу спирали Н22 (рис. 3 и IV). Важность выпетливания для связывания белка было подтверждено биохимическими экспериментами (7).

Ранее выдвигалась гипотеза о местах связывания белка S15 с РНК на основе расположения консервативных положительно заряженных остатков (8). Структура комплекса не подтверждает эту гипотезу, поскольку из 17 аминокислот, взаимодействующих с 16S рРНК, только 4 положительно заряжены (рис. 3 и V) и они рассредоточены по всей молекуле белка. Остальные 15 положительно заряженных остатков белка во взаимодействиях с 16S рРНК не участвуют.

Предполагаемый механизм связывания белка S15 с 16S рРНК.

Комплекс S15-PHK является уникальным, поскольку впервые определена структура комплекса РНК с полностью а-спиральным белком.

Из литературы известно, что ионы магния и белок S15 в равной степени индуцируют конформационные изменения данного района рРНК (19). Такое конформационное изменение структуры может происходить при «переключении» спаривания нуклеотида С754 с G587 (без магния) на G654 (в присутствии магния). Белок стабилизирует аналогичное расположение спиралей РНК «запирая» их при связывании.

Представленная структура впервые на молекулярном уровне показывает механизм узнавания белком G*U wobble пары в малом желобке РНК (первый участок взаимодействия). Он отличается от узнавания белком L30 G4J пары в большом желобке мРНК (20). Кроме того, механизм узнавания белком малого желобка РНК в комплексе S15-РНК отличается от имеющего место в комплексе L11-рРНК (21,22), где в малый желобок РНК укладывается целая а-спираль белка. Белок S15 взаимодействует с рРНК боковыми цепями остатков петель между а-спиралями белка.

Второй участок взаимодействия занимает большую область на поверхности белка. Характерно, что консервативные нуклеотиды этого района не принимают непосредственное участие во взаимодействиях с белком, а образуют уникальную структуру РНК, сахарофосфатный остов которой узнаётся белком. Аналогично, на основе комплиментарносги поверхностей, происходит узнавание в комплексе L11-рРНК. Однако, если в комплексе L11-рРНК доминируют контакты с сахарофосфатш>1м остовом РНК, то в комплексе S15-PHK большое значение имеют взаимодействия боковых цепей белка с основаниями РНК.

Присоединение белка S15 стабилизирует уширение большого желобка рРНК во втором участке связывания и вызывает изгиб спирали Н22 за счет связывания двух пространственно удаленных участков 16S рРНК. Таким образом, важная роль белка S15 в сборке платформы малой субчастицы рибосомы, по-видимому, заключается в стабилизации правильной конформации данного района 16S рРНК, после чего с ним могут взаимодействовать другие участки рРНК и рибосомные белки. Большой желобок становится доступным для связывания белками S18 и S6.

Предполагаемый механизм может оказаться очень важным и распространенным при сворачивании рРНК в процессе сборки рибосомных субчастиц.

Взаимодействия белка S15 с мРНК и 23S рРНК. Белок S15 из E.coli ингибирует свой собственный синтез, захватывая псевдоузел сразу за местом посадки рибосомы на мРНК, и переводя транслирующий комплекс в неактивное состояние (5). Репрессия снимается 16S рРНК, которая обладает большей константой связывания с белком и вытесняет

мРНК из связанного состояния. По данным фугпринтинга и сайтспецифического мутагенеза, S15 узнает на мРНК два участка, так же как и на 16S рРНК: первый из них - G-U/G-C мотив, аналогичный описанному нами, второй представляет собой определенную конформацию сахарофосфатного остова коаксиально состыкованных двух спиралей РНК образующих псевдоузел (рис. 4.).

Доктором Э. Вестховым (неопубликованные данные, рис. X) был сделан трехмерный докинг белка S15 с предполагаемой структурой псевдоузла мРНК. Расстояние между предполагаемыми участками связывания и ориентация молекул белка и мРНК хорошо соответствует данным, полученным на основе анализа структуры комплекса S15-pPHK. Было предположено, что механизм контроля трансляции белка S15 основан на такой молекулярной мимикрии между двумя связывающимися молекулами РНК.

\ Рис. 4. Участок связывания

белка S15 на мРНК и две конформацни регуляторного участка гена rpsO из Е. coli. Слева - конформация шпилечных структур, справа - конформация псевдоузла, образующаяся при связывании белка. Зачернен инициирующий кодом, рамкой выделен рибосом-связывающий участок, жирной рамкой выделен гомологичный рРНК G-U/G-C мотив.

S15 взаимодействует с служит мостиком между

(К о

ÏTï

Л U-A C-ü U-A

С - G - -40

5ч,-

+SI5

с-с

G-C--ÎO

и°Л

C-G иА-и G -С

С,-С--У) и

G-U

ACU UCAUUC.UA L'A U А'-

А

С*- -10

АииС

Недавно было показано, что белок консервативной шпилькой 23 S рРНК которая двумя рибосомными субчастицами (6). Противоположная сторона белка S15, не вовлеченная в взаимодействия с 16S рРНК, и особенно спираль а4, является наиболее вероятным кандидатом для связывания такой шпильки (рис. XI).

Основные результаты н выводы

1. Разработаны новые условия получения и очистки фрагментов 16S рРНК с использованием самоотщепляющихся рибозимов, что позволило наработать в препаративных количествах фрагменты РНК высокой степени чистоты.

2. Получен и выделен ряд мутантных белков S15. Получены кристаллы комплексов мутантных белков с фрагментом РНК.

3. Определена пространственная структура комплекса белка S15 с фрагментом 16S рРНК из T.thermophilus с разрешением 2.8Â.

4. Показано, что структура белка S15 в комплексе с 16S рРНК не отличается от структуры белка в свободном состоянии.

5. Обнаружена новая уникальная структура соединения трех спиралей в молекуле 16S рРНК

6. Показано, что рибосомный белок S15 связывается с 16S рРНК в двух пространственно удаленных участках: в одном происходит специфическое узнавание аминокислотными остатками оснований рРНК, в другом - стабилизация уникальной укладки рРНК за счет взаимодействия аминокислотных остатков белка с сахарофосфатным остовом РНК.

7. Впервые на молекулярном уровне показан механизм узнавания аминокислотами белка G*U пары малого желобка РНК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. C.B. Никонов, Н.П. Фоменкова, А.Д. Никулин, Р.В. Фёдоров, H.A. Невская. (1998) Структура рибосомы: РНК-белковые и белок-белковые взаимодействия. Молекулярная биология, том. 32, №5, 773-781.

2. S.V. Nikonov, N.A. Nevskaya, R.V. Fedorov, A.R. Khairullina, S.V. Tishchenko, A.D. Nikulin and M.B. Garber. (1998) Structural Studies of Ribosomal Proteins. Biol. Chem., 379, 795-805.

3. A. Nikulin, A. Serganov, E. Ennifar, S. Tishchenko, N. Nevskaya, W. Shepard, C. Portier, M. Garber, В. Ehresmann, С. Ehresmann, S. Nikonov and P. Dumas. (2000) Crystal structure of the S15-rRNA complex. Nature Structural Biology, 7, 273-277.

4. Пространственная структура комплекса рибосомного белка S15 с фрагментом 16S рРНК из T.thermophilus. Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, Россия, 2000.

5. С. Ehresmann, A. Nikulin, A. Serganov, Е. Ennifar, S. Tishchenko, N. Nevskaya, W. Shepard, C. Portier, M. Garber, B. Ehresmann, S. Nikonov and P. Dumas. International conference "RNA structure", Santa Cruz, USA, 2000

6. A. Nikulin, A. Serganov, E. Ennifar, S. Tishchenko, N. Nevskaya, W. Shepard, C. Portier, M. Garber, B. Ehresmann, С. Ehresmann,

S. Nikonov and P. Dumas. Crystal structure of the S15-rRNA complex at 2.8 Â resolution. XIX European Crystallographic Meeting, Nancy, France, August 2000.

Список цитируемой литературы

1 Green R. and Puglisi J. D. (1999) The ribosome revealed. Nat.Struct.Biol. 6, 999-1003.

2 Held W.A., etal. (1974) Assembly mapping of 30S ribosomal proteins from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 249,3103-3111.

3 Lee K., et al. (1997) In vivo determination of RNA structure-function relationship: analysis of the 790 loop in ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 269, 732-743.

4 Moazed D. & Noller H.F. (1990) Binding of tRNA to the ribosomal A and P sites protects two distinct sets of nucleotides in 16S rRNA. J. Mol. Biol. 211, 135-145.

5 Philippe C., etal. (1993) Ribosomal protein S15 from Escherichia coli modulates its own translation by trapping the ribosome on the mRNA loading site. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 4396-4398.

6 Culver G.M., et al. (1999) Identification of an RNA-protein bridge spanning the ribosomal subunit interface. Science 285, 2133-2135.

7 Serganov A.S., et al. (1996) The 16S rRNA binding site of Thermus thermophilus ribosomal protein S15: comparison with Escherichia coli S15, minimum site and structure. RNA 2, 11241138.

8 Berglund H., etal. (1997) Solution Structure ofthe Ribosomal RNA Binding Protein S15 from Thermus Thermophilus. Nat.Struct.Biol. 4, 20-23.

9 Clemons Jr, et al.( 1998) Conformational variability of the N-terminal helix in the structure of ribosomal protein S15. Structure 6, 429-438.

10 Serganov A., etal. (1997) Ribosomal protein SI 5 from Thermus thermophilus: cloning, sequencing, overexpression of the gene and RNA-binding properties ofthe protein. Eur. J. Biochem, 246,291-300.

11 Ducruix A. & Giege R. (1997) Crystallization of nucleic acids and proteins. A practical approach. Oxford University Press.

12 Otwinowski Z. & Minor W. (1996) Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology 276A, 307-326.

13 COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT, NUMBER 4. (1994) The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst. D50, 760-763.

14 Brünger A.T. etal. (1998) Crystallography & NMR System: a new software suite for macromolecular structure determination. Acta Cryst. D54, 905-921.

15 Jones T.A, et al. (1991) Improved methods for the building of protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst. A47, 110-119.

16 Price S.R. etal. (1995) Crystallization of RNA-protein complexes. I. Methods for the large-scale preparation of RNA suitable for crystallographic studies. J. Mol. Biol, 249, 398-408.

17 С. В. Никонов, неопубликованные данные.

18 de la Fortelle E. and Bricogne G. (1997) Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods in Enzymology 276A, 472-494.

19 Orr J.W., etal. (1998) Protein and Mg2+-induced conformational changes in the SI5 binding site of 16S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 275, 453-464.

20 Mao H., et al. (1999) A novel loop-loop recognition motif in the yeast ribosomal protein L30 autoregulatory RNA complex. Nature Struct. Biol. 6, 1139-1147.

21 Conn G.L., et al. (1999) Crystal structure of a conserved ribosomal protein-RNA complex. Science 84, 1171-1174.

22 Wimberly B.T., etal. (1999) detailed view of a ribosomal active site: the structure of the LI 1-RNA complex. Cell 97,491-502.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Современные представления о структуре рибосом.

1. Введение.

2. Структура рибосом и отдельных субчастиц.

2.1. Электронно-микроскопические исследования рибосом.

2.2. Исследования рибосом рентгеноструктурным методом.

2.2.1. Структура 30S рибосомной субчастицы Т. thermophilics с разрешением 5.5Á.

2.2.2. Структура 30S рибосомной субчастицы Т. thermophilics с разрешением 4.5Á.

2.2.3. Структура 50S рибосомной субчастицы Haloarcula marismortui с разрешением 5.0Á.

2.2.4. Структура 70S рибосомы Т. thermophilics с разрешением 7.8Á.

3. Структуры отдельных компонентов рибосом.

3.1. Структурные исследования рибосомной РНК.

3.2. Структурные исследования рибосомных белков.

3.3. Взаимодействие рибосомных белков с рРНК.

3.4. Пространственные структуры РНК-белковых комплексов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Материалы и методы.

1. Материалы.

1.1. Химические реактивы и ферменты.

1.2. Буферы.

1.3. Среды.

2. Методы.

2.1. Методы генной инженерии.

2.1.1. Выделение плазмидной ДНК из небольших объёмов культуры.

2.1.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК из больших объёмов культуры.

2.1.3. Полимеразная цепная реакция.

2.1.4. Электрофорез в агарозном геле.

2.1.5. Очистка фрагментов ДНК.

2.1.6. Лигирование ДНК.

2.1.7. Получение компетентных клеток Е.coli.

2.1.8. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК.

2.1.9. Определение первичной структуры ДНК.

2.1.10. Обработка информации о последовательностях нуклеотидов и белков.

2.2. Препаративное выделение и очистка РНК.

2.2.1. Синтез РНК-фрагментов с помощью транскрипции in vitro.

2.2.2. Очистки. РНК-фрагментов с псмопткю гел«-фяпътр?щии.

2.2.3. Очистка РНК-фрагментов ионообменной хроматографией.

2.2.4. Электрофорез в ПААГ/8М мочевине при денатурирующих условиях.

2.2.5. Электрофорез в ПААГ в нативных условиях.

2.2.6. Очистка РНК-фрагментов электрофорезом на геле в денатурирующих условиях.

2.3. Экспериментальные процедуры при работе с белками.

2.3.1. Электрофорез в ПААГ/SDS.

2.3.2. Суперпродукция рибосомного белка S15 T. thermophilus в клетках

Е. coli.

2.3.3. Выделение рибосомного белка S15 T. thermophilus.

2.3.4. Суперпродукция и выделение рибосомного белка S15 Т. thermophilus с заменой метионинов на селенометионины.

2.3.5. Спектроскопический анализ белков.

2.4. Получение и кристаллизация комплекса Т. thermophilus S15/PHK.

2.4.1. Получение комплекса S15/PHK Т. thermophilus.

2.4.2. Кристаллизация комплекса S15/РНК T. thermophilus.

2.5. Методы рентгеновской кристаллографии.

2.5.1. Условия замораживание кристаллов.

2.5.2. Условия получения тяжелоатомных производных кристаллов.

2.5.3. Сбор и обработка рентгеновских дифракционных данных.

2.5.4. Определение структуры комплекса.

2.5.5. Уточнение структуры.

2.5.6. Анализ полученной структуры.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Получение и кристаллизация комплекса S15-рРНК.

1.1. Получение и очистка РНК-фрагментов.

1.2. Получение и выделение белка T. thermophilus SI5 дикого типа и мутантных.

1.3. Получение кристаллов комплексов S15 с фрапиентамк рРНК.

2. Определение пространственной структуры комплекса рибосомного белка

S15-рРНК из T. thermophilus.

2.1. Нахождение условий замораживания.

2.2. Определение стартового набора фаз.

2.3. Расчет фаз, полученных методами изоморфного замещения и методом аномального рассеивания на многих длинах волн.

2.4. Построение и уточнение пространственной модели комплекса.

3. Анализ пространственной структуры комплекса рибосомного белка S15 с фрагментом 16S рРНК из T. thermophilus.

3.1. Особенности структуры белка в комплексе.

3.2. Структура РНК-фрагмента.

3.3. Взаимодействие белка S15 с молекулами РНК.

3.3.1. Области связывания белка S15 с 16S рРНК.

3.3.2. Предполагаемая модель связывания белка S15 с 16S рРНК.

3.3.3. Предполагаемая модель взаимодействия белка S15 с мРНК.

3.3.4. Предполагаемая модель взаимодействия белка S15 с 23S рРНК.

ВЫВОДЫ.

Все живые клетки осуществляют биосинтез белка на рибосомах -чрезвычайно сложных молекулярных машинах. Для того, чтобы понять, почему этот процесс протекает точно и эффективно, необходимо знать детальное устройство рибосомы. Структурные исследования рибосомы широко ведутся уже в течении 40 лет, но только в последние два года благодаря достижениям в разработке методов криоэлектронной микроскопии и рентгеновской кристаллографии был достигнут существенный прогресс в этом направлении: получены структуры большой субчастицы из Haloarcula marismortui с разрешением 5Á (Clemons et al, 1999), малой субчастицы из Thermits thermophilus с разрешением 5.5Á (Ban et al, 1999), а также целой 70S рибосомы из Т. thermophilus с разрешением выше 8Á (Cate et al, 1999).

В основе структурной организации и функционирования рибосомы лежит взаимодействие трех рибосомных РНК и нескольких десятков белков. Несмотря на интенсивные исследования, взаимодействия между рибосомными белками и рРНК изучены достаточно слабо. В последний год сделан заметный шаг вперед -определены первые структуры рРНК-белковых комплексов с атомным разрешением, существенно расширившие наши знания в области РНК-белковых взаимодействий. Эти структуры можно использовать также при построении детальной модели рибосомы, поскольку отдельные элементы рибосом можно встраивать в модели рибосомных субчастиц, получая достаточно точные модели рибосомы на атомарном уровне.

В Институте бежа РАН в сотрудничестве с зарубежными лабораториями методами рентгеновской кристаллографии ведутся исследования структур рибосомных белков из экстремально-термофильного организма Т. thermophilus. Белки из Т. thermophilus имеют высокую гомологию с соответствующими белками из E.coli, что позволяет аппроксимировать многочисленные функциональные данные для белков из мезофильной Е. coli на структуры белков из термофила. За несколько лет были определены структуры 5 белков из Т. thermophilics: LI. J 22, L30, S6, S8, структуры белка LI из Methanococcus jannaschii и Methanococcus thermolitothrophicus. Данная работа является частью комплексных исследований структуры рибосомы Т. thermophilus и логичным продолжением работ по определению пространственных структур рибосомных белков с выходом на более сложные объекты - комплексы рибосомных белков с фрагментами рРНК.

Белок S15 - один из наиболее изученных рибосомных белков. Он входит в число белков малой рибосомной субчастицы, независимо связывающихся с 16S рибосомной РНК. Белок S15 связывается с центральным доменом 16S рРНК и входит в состав «платформы» малой субчастицы рибосомы (Held et al. 1974). «Платформа» - функционально важная структура рибосомы, поскольку необходима для сборки целой рибосомы из отдельных субчастиц и служит местом связывания тРНК в Р-участке рибосомы (Lee et al. 1997, Moazed & Noller 1990). Как и некоторые другие рибосомные белки, белок S15 является репрессором трансляции своей собственной мРНК (Philippe et al. 1993). Недавно было показано, что белок S15 может специфически взаимодействовать с петлей 23S рРНК, выступающей из большой рибосомной субъединицы в сторону малой (Culver et al. 1999). Таким образом, белок S15 важен для функционирования и сборки рибосомы и является чрезвычайно интересным объектом для исследования механизмов взаимодействия белков с РНК, поскольку взаимодействует с тпрмя различными РНК.

В результате данной работы были получены кристаллы комплекса белка S15 T. thermophilus со специфическим фрагментом 16S рибосомной РНК и определена структура комплекса с разрешением 2.8Â. Детальный анализ структуры комплекса представлен в разделе "Результаты и обсуждение".

Литературный обзор посвящен современному представлению о структуре рибосомы и её отдельных компонентов - рибосомных белков, рибосомной РНК, а также взаимодействиям между рибосомными белками и РНК.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Современные представления о структуре рибосом

1. Введение

История открытия рибосом начинается в 1940 годах, когда А. Клод (Claude 1940) выделил из животных клеток цито плазматические РНК-сод ержащие гранулы меньшие, чем митохондрии. Эти гранулы были размером 50-200 мкм в диаметре, и позднее Клод назвал из «микросомами». Химический анализ показал, что микросомы являются фосфолипид-рибонуклеопротеидными комплексами. В 1956 год}' Дж. Палад (Palade & Siekevitz 1956) описал маленькие гранулы, прикрепленные к мембранам эндоплазматического ретикулума или свободно перемещающиеся в цитоплазме. Микросомы Клода являлись фрагментами эндоплазматического ретикулума с прикрепленными частицами Палада. Последние оказались рибонуклеопротеидными частицами, содержащими большую часть РНК, участвующую в белковом синтезе.

В нескольких лабораториях в середине 50-х годов удалось выделить эти частицы в свободном состоянии из различных организмов: из дрожжей (Chao and Schachman 1956), из растений (Ts'о et al. 1956), из животных (Petermann and Hamilton 1957) были выделены 80S частицы, а из бактерий Е. coli (Tissieres and Watson 1958) - 70S частицы. В 1958 году состоялся первый симпозиум в Массачусетском технологическом институте, посвященным этим частицам и их участию в биосинтезе белков. Там они получили название «рибосомы», которое используется и сейчас. Так начиналась история исследования рибосом, которая длится уже более 40 лет.

выводы

Разработаны новые условия получения и очистки фрагментов 16S рРНК с использованием самоотщепляющихся рибозимов, что позволило наработать в препаративных количествах фрагменты РНК высокой степени чистоты. Получен и выделен ряд мутантных белков S15. Получены кристаллы комплексов мутантных белков с фрагментом РНК.

Определена пространственная структура комплекса белка S15 с фрагментом 16S рРНК из T. thermophilus с разрешением 2.8Â.

Показано, что структура белка S15 в комплексе с 16S рРНК не отличается от структуры белка в свободном состоянии.

Обнаружена новая уникальная структура соединения трех спиралей в молекуле 16S рРНК.

Показано, что рибосомный белок S15 связывается с 16S рРНК в двух пространственно удаленных участках: в одном происходит специфическое узнавание аминокислотными остатками оснований рРНК, в другом -стабилизация уникальной укладки рРНК за счет взаимодействия аминокислотных остатков белка с сахарофосфатным остовом РНК. Впервые на молекулярном уровне показан механизм узнавания аминокислотами белка G*U пары малого желобка РНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на успех в кристаллографии рибосомы и рибосомных субчастиц, исследования комплексов между рибосомными белками и фрагментов рибосомной РНК весьма актуальны и в настоящее время. Модели рибосомных субчастиц имеют недостаточно высокое разрешение для анализа взаимодействий между белками и РНК на атомарном уровне, в то время как структуры комплексов позволяют достичь такого разрешения,

В данной работе впервые определена структура комплекса рибосомного белка S15 с фрагментом рибосомной РНК, что позволило рассмотреть взаимодействия между рибосомным белком и 16S рРНК с высоким разрешением и показать важную роль рибосомных белков при сворачивании рРНК. Предполагаемый нами механизм стабилизации структуры рРНК может оказаться важным и распространенным при сворачивании рРНК в процессе сборки рибосомных субчастиц. Знание этих деталей может активно использоваться для исследований механизма биосинтеза белков на рибосомах и влияния на этот процесс антибиотиков.

На основе полученных данных по взаимодействию белка S15 нами были предложены две модели взаимодействия этого белка с другими РНК - с мРНК и с 23 S рРНК из другой субчастицы.

Методика получения фрагментов РНК высокой чистоты в препаративных количествах с использованием самоотщепляющихся рибозимов на концах транскрипта может быть весьма полезна в биохимических и кристаллографических исследованиях РНК и комплексов РНК с белками. Методика получения и использования мутантных белков со вставками дополнительных селенометионинов может широко применяться для рентгеноструктурных исследований макромолекул с помощью метода аномального рассеяния на нескольких длинах волн.

1. Abdel-Meguid S.S., Moore P.B., Steitz Т.А. (1983) Crystallization of a ribonuclease-resistant fragment of Escherichia coli 5 S ribosomal RNA and its complex with protein L25. J Mol Biol, 171, 207-215.

2. Abrahams J.P. & Leslie A.G.W. (1996) Methods used in the structure determination of bovine mitochondrial Fl ATPase. Acta Cryst. D42, 905-921.

3. Adamski F.M., Atkins J.F., Gesteland R.F. (1996) Ribosomal protein L9 interactions with 23S rRNA: the use of a translational bypass assay to study the effect of amino acid substitutions. J Mol Biol, 261, 357-371.

4. Agafonov D.E., Kolb V.A., Spirin A.S. (1997) Proteins on ribosome surface: measurements of protein exposure by hot tritium bombardment technique. Proc Natl Acad Sei USA, 94, 12892-12897.

5. Agalarov S.V., Prasad G.S., Funke P.V., Stout C.D., Williamson J.R. (2000) Structure of the S15, S6, S18-rRNA Complex: Assembly of the ?>0S Ribosome Central Domain. Science, 288, 107-112.

6. Agrawal R.K. and Frank J. (1999) Structural studies of the translational apparatuses. Curr. Opinion in Struct. Biol. 9, 215-221.

7. Agrawal R.K., Lata R.K., Frank J. (1999) Conformational variability in Escherichia coli 70S ribosome as revealed by 3D cryo-electron microscopy. Int J Biochem Cell Biol, 31, 243-254.

8. Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R.A., Frank J. (1998) Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation. Proc Natl Acad Sei USA, 95, 6134-6138.

9. Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R.A., Li Y., Leith A., Nierhaus K.H., Frank J. (1996) Direct visualization of A-, P-, and E-site transfer RNAs in the Escherichia coli ribosome. Science, 271, 1000-1002.

10. Allain F. H., Howe P. W., Neuhaus D., Varani G. (1997) Structural Basis of the RNA-Binding Specificity of Human U1A Protein. EMBOJ. 16, 5764

11. Antson A. A., Dodson E. J., Dodson G. G., Greaves R. В., Chen X.-P., Gollnick P. (1999) Structure of the trp RNA-binding Attenuation Protein, TRAP, Bound to RNA.821. Nature, 401,235

12. Ban N., Freeborn B., Nissen P., Penczek P., Grassucci R.A., Sweet R., Frank J., Moore P.B., Steitz T.A. (1998) A 9A resolution X-ray crystallographic map of the large ribosomal subunit. Cell, 93,1105-1115

13. Ban N., Nissen P., Hansen J., Capel M., Moore P.B., Steitz T.A. (1999) Placement of protein and RNA structures into a 5A-resolution map of the SOS ribosomal subunit. Nature, 400, 841-847.

14. Basavappa R. and Silger P.B. (1991) The 3A crystal structure of yeast initiator tRNA: functional implications in initiator/elongator discrimination. EMBOJ., 10, 3105-3 111.

15. Batey R.T. & Willamson J.R. (1996) Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16S rRNA: II. Specificity Determinants of RNA-protein recognition. J. Mol. Biol. 261, 550-567.

16. Batey R.T. & Willamson J.R. (1998) Effects of polyvalent cations on the folding of rRNA three-way junction and binding of ribosomal protein S15. RNA, 4, 984-997.

17. Beckmann R., Bubeck D., Grassucci R., Penczek P., Verschoor A., Blobel G., Frank J.1997) Alignment of conduits for the nascent polypeptide chain in the ribosome-Sec61 complex. Science, 278, 2123-2226.

18. Benard, L., Mathy N, Grunberg-Manago M, Ehresmann B, Ehresmann C, Portier C.1998) Identification in a pseudoknot of a U.G motif essential for the regulation of the expression of ribosomal protein S15. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2564-2567.

19. Berglund, H., Rak, A., Serganov, A., Garber, M., Hard, T. (1997) Solution Structure of the Ribosomal RNA Binding Protein SI5 from Thermus Thermophilus. Nat.Struct.Biol. 4, 20-23.

20. Betzel C, Lorenz S., Furste J. P., Bald R., Zhang M., Schneider T. R., Wilson K. S., Erdmann V. A. (1994) Crystal Structure of Domain A of Thermus flavus 5S rRNA and the Contribution of Water Molecules to Its Structure. FEBS Lett. 351, 159

21. Brimacombe R., Maly P., Zwieb C. (1983) The struciuie of ribosomal RNA and its organization relative to ribosomal protein. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 28, 1-48

22. Briinger A.T. Adams P.D., Clore G.M., Delano W.L., Gros P., Grosse-Kunstleve, R.W., Jiang J.-S., Kuszewski J., Nilges M., Pannu, N.S., Read, R.J., Rice, L.M., Simonson, T.,

23. Warren G.L. (1998) Crystallography & NMR System: a new software suite for macromolecular structure determination. Acta Cryst. D54, 905-921.

24. Bullock W.O. et al (1987) Bio Techniques, 5, 376-387.

25. Cate J.H., Gooding A.R., Podell E., Zhou K, Golden B.L., Kundrot C.E., Cech T.R., Doudna J.A. (1996) Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing. Science, 273, 1678-1685.

26. Cate J.H., Yusupov M.M., Yusupova G.Zh., Earnest T.N., Noller H.F. (1999) X-ray crystal structure of 70S ribosome functional complexes. Science, 285, 2095-2104.

27. Cazenave C., Uhlenbeck O.C. (1994) RNA template-directed RNA synthesis by T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91, 6972-6976.

28. Chao F.-C. & Schachman H.K. (1956) The isolation and characterization of a macromolecular ribonucleoprotein from yeast. Arch. Biochem. Biophys. 61,220-230.

29. Clemons, W. M., Davies, C., White, S. W., Ramakrishnan, V. (1998) Conformational Variability of the N-Terminal Helix in the Structure of Ribosomal Protein SI5. Structure, 6, 429-438.

30. COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT, NUMBER 4. (1994) The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst. D50, 760-763

31. Conn G. L., Draper D. E., Lattman E. E., Gittis A. G. (1999) Crystal structure of a conserved ribosomal protein-RNA complex. Science, 284, 1171

32. Correll C. C., Wool I. G., Munishkin A. (1999) The two faces of the Escherichia coli 23 S rRNA sarcin/ricin domain: the structure at 1.11 A resolution. J.Mol.Biol. 292, 275

33. Correll C.C., Munishkin A., Chan Y-L., Ren Z., Wool I. G., Steitz T. A. (1998) Crystal Structure of the Ribosomal RNA Domain Essential for Binding Elongation Factors. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 95,13436

34. Cox R.A. (1966) The secondary structure of ribosomal RNA in solution. Biochem. J. 98, 841-857.

35. Culver G.M., Cate J.H., Yusupova G.Zh., Yusupov M.M., Noller H.F. (1999) Identification of an RNA-protein bridge spanning the ribosomal subunit interface. Science, 285,2133-2135.

36. Dallas A., Moore P.B. (1997) The loop E-loop D region of Escherichia coli 5S rRNA: the solution structure reveals an unusual loop that may be important for binding ribosomal proteins. Structure, 5, 1639-1653.

37. Davies C., Ramakrishnan V., White S.W. (1996b) Structural evidence for specific S8-RNA and S8-protein interactions within the 30S ribosomal subunit: ribosomal protein S8 from Bacillus stearothermophilus at 1.9A resolution. Structure, 4, 1093-1104.

38. Davies, C., White, S. W., Ramakrishnan, V. (1996a) The Crystal Structure of Ribosomal Protein L14 Reveals an Important Organizational Component of the Translational Apparatus. Structure 4, 55

39. Deo R. C., Bonanno J. B., Sonenberg N., Burley S. K. (1999) Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell, 98, 835

40. Dijk J. and Littlechild J. (1979) Purification of ribosomal proteins from Escherichia coli under 1'iondenaturing conditions. Methods Enzymol. 59, 481-502.

41. Donly B.C. and Mackie G.A. (1988) Affinities of ribosomal protein S20 and C-terminal deletion mutants for 16S rRNA and S20 mRNA. Nucleic Acids Res, 16, 997-1010.

42. Draper D.E. (1996) Ribosomal protein-RNA interactions. In Ribosomal RNA:structure, evolution, processing and function in protein biosynthesis. Eds.

43. Zimmermann R.A., Dahlberg A.E. Boca Raton, Florida, CRC Press, 171-198.

44. Draper D.E. (1999) Themes in RNA-protein recognition. J. Mol. Biol., 293, 255-270.

45. Draper D.E. and Reynaldo L.P. (1999) RNA. binding strategies of ribosomal proteins. Nucleic Acid Res, 27, 381-388.

46. Dube P., Wieske M., Stark H., Schatz M., Stahl J., Zemlin F., Lutsch G., van Heel M. (1998a) The SOS rat liver ribosome at 25A resolution by electron cryomicroscopy and angular reconstruction. Structure, 6, 389-399.

47. Ducruix A. & Giege R. (1997) Crystallization of nucleic acids and proteins. A practical approach. Oxford University Press.

48. Ferre-D'Amare A. R., Zhou K., Doudna J. A. (1998) Crystal Structure of a Hepatitis Delta Vims Ribozyme. Nature, 395, 567

49. Fourmy D., Recht M. I., Blanchard S. C., Puglisi J, D. (1996) Structure of the a Site of Escherichia coli 16S Ribosomal RNA Complexed with an Aminoglycoside Antibiotic. Science, 274,1367

50. Fourmy D., Yoshizawa S., Puglisi J. D. (1998) Paromomycin Binding Induces a Local Conformational Change in the A-Site of 16 S rRNA. J.Mol.Biol. 277, 333-345.

51. Frank J., Radermacher M., Wagenknecht T., Verschoor A. (1988) Methods for studying ribosome stricture by electron microscopy and computer image processing. Methods Enzymol. 164, 3-35.

52. Frank J., Zhu J., Penczek P., Li Y., Srivastata S., Verschoor A., Radermacher M., Grassucci R., Lata R.K. & Agrawal R.K. (1995) A model of protein synthesis based oncryo-electron microscopy of the E.coli ribosome. Nature, 376, 441-444.

53. Fresco J.R., Alberts B.M., & Doty P. (1960) Some molecular details of secondary structure of ribonucleic acids. Nature 188, 98-104.

54. Gabashvili I.S., Agrawal R.K., Grassucci R.A., Frank J. (1999) Structure and structural variations of the E. coli SOS ribosomal subunit as revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J! Mol. Biol., 286, 1285-1291.

55. Golden B.L., Hoffman D.W., Ramakrishnan V., White S.W. (1997) Ribosomal protein SI7: characterization of the three-dimensional structure by 1H and 15N NMR. Biochemistry, 32,12812-12820.

56. Golden, B. L., Ramakrishnan, V., White, S. W. (1993) Ribosomal Protein L6: Structural Evidence of Gene Duplication from a Primitive RNA-Binding Protein. EMBG J. 12, 4901-4908.

57. Green R. and Noller H.F. (1997) Ribosomes and translation. Annu. Rev. Biochem, 66, 679-716.

58. Gutel R.R. (1996) Comparative sequence analysis and the structure of 16S and 23S rRNA in Ribosomal RNA: structure, evolution, processing and function in protein biosynthesis. Eds. Zimmermann R.A., Dahlberg A.E. Boca Raton, Florida, CRC Press, 111-128.

59. Handa N., Nureki O., Kurimoto K., Kim I., Sakamoto H., Shimura Y., Muto Y., Yokoyama S. (1999) Structural Basis for Tra mRNA Precursor Recognition by the Sex-Lethal Protein. Nature, 398, 579

60. Hansen H.A., Volkmann N., Piefke J., Glotz C., Weinstein S., Makowski I., Meyer S., Wittmann H.G., Yonath A. (1990) Crystals of complexes mimicking protein biosynthesis are suitable for crystallographic studies. Biochim Biophys Acta 1050, 1-7.

61. Harauz G., Beniac D.R., Wu J. and Zuzan H. (1994) Does the eucariotic large ribosomal subunit have a channel passing through it? Biochem. Biophys. Res. Commun. 205, 18691874.

62. Hard T., Rak A., Allard P., Kloo L., Garber M. (2000) The Solution Structure of Ribosomal Protein L36 from Thermus Thermophilus Reveals a Zinc-Ribbon-Like Fold. J.Mol.Biol. 296, 169.

63. Held W.A., et al. (1974) Assembly mapping of 30S ribosomal proteins from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 249, 3103-3111.

64. Helgstrand M., Rak A.V., Allard P., Davydova N., Garber M.B., Hard T. (1999) Solution structure of the ribosomal protein S19 from Thermus thermophilus. J Mol Biol, 292, 1071-1081.

65. Hendrickson W.A. and Ogata C.M. (1997) Phase determination from multiwavelength anomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology, 276, 494-522.

66. Higgins D.C., Bleasby A.J., Fuchs R. (1991) CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment. CABIOS, 8, 189-191.

67. Hoffman, D. W., Davies, C„ Gerchman, S. E., Kycia, J. H., Porter, S. J., White, S. W., Ramakrishnan, V. (1994) Crystal Structure of Prokaryotic Ribosomal Protein L9: A Bi-Lobed RNA-Binding Protein. EMBOJ. 13, 205-212.

68. Jones T.A., Zhou J.Y., Cowan S.W. & Kjeldgaard M. (1991) Improved methods for the building of protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst. Ml, 110-119.

69. Kalurachchi K., Nikonowicz E. P. (1998) NMR Structure Determination of the Binding Site for Ribosomal Protein S8 from Escherichia coli 16 S rRNA. J.Mol.Biol. 280, 639654.

70. Knight S. (1989) Ribulose 1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase A Structural Study, Thesis, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala.

71. M., Steitz T. A. (2000) Structure of E. coli Ribosomal Protein L25 Complexed with a5S rRNA Fragment at 1.8A resolution. Proc.Nat.Acad.Sci. USA in press

72. Mao H., White S. A., Willamson J. R. (1999) A Novel Loop-Loop Recognition Motif in the Yeast Ribosomal Protein L30 Autoregulatory RNA Complex. Nat.Struct.Biol. 6, 1139

73. Mao, H., Willamson, J. R. (1999) Local Folding Coupled to RNA Binding in the Yeast Ribosomal Protein L30. J.Mol.Biol. 292, 345-359.

74. Markus M.A., Gerstner R.B., Draper D.E., Torchia D.A. (1999) Refining the overall structure and subdomain orientation of ribosomal protein S4 delta41 with dipolar couplings measured by NMR in uniaxial liquid crystalline phases. J Mol Biol, 292, 375387.

75. Markus, M. A., Hinck, A. P., Huang, S., Draper, D. E., Torchia, D. A. (1997) High Resolution Solution Structure of Ribosomal Protein L11-C76, a Helical Protein with a Flexible Loop that Becomes Structured Upon Binding to RNA. Nat.Struct.Biol. 4,70-77.

76. McCutcheon J.P., Agrawal R.K., Philips S.M., Grassucci R.A., Gerchman S.E., Clemons W.M. Jr., Ramakrishnan V., Frank J. (1998) Location of translational initiation factor IF3 on the small ribosomal subunit. Proc Natl Acad Sci USA, 96,4301-4306.

77. Merritt, E.A. & Bacon, D.J. (1997) Raster3D Photorealistic Molecular Graphics. Methods in Enzymology 277, 505-524.

78. Moazed D. & Noller H.F. (1990) Binding of tRNA to the ribosomal A and P sites protects two distinct sets of nucleotides in 16S rRNA. J. Mol. Biol. 211, 135-145.

79. Moazed D., Noller H.F. (1986) Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNA from attack by chemical probes. Cell, 47, 985-994

80. Moazed D., Noller H.F. (1987) Interaction of antibiotics with functional sites in 16S ribosomal RNA. Nature, 327, 389-394

81. Moller W., Groene A., Terhorst C., Amons R. (1972) 50-S ribosomal proteins. Purification and partial characterization of two acidic proteins, A1 and A2, isolated from 50-S ribosomes of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 25, 5-12.

82. Mueller F. and Brimacombe R.A. (1997) A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. II. The RNA-protein interaction data. J. Mol. Biol, 271, 545-565.

83. Nakagawa, A., Nakashima, T., Taniguchi, M., Hosaka, H., Kimura, M., Tanaka, I. (1999) The Three-Dimensional Structure of the RNA-Binding Domain of Ribosomal Protein L2; a Protein at the Peptidyl Transferase Center of the Ribosome. EMBO J. 18, 1459-1467.

84. Nevskaya N., Tishchenko S., Fedorov R., Al-Karadaghi S., Liljas A., Kraft A., Piendl W., Garber M. and Nikonov S. (2000) Archaeal ribosomal protein LI: the structure provides new insights into RNA binding of the LI protein family. Structure, 8, 363-371.

85. Nicholas K.B. and Nicholas H.B.Jr. (1996) GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. Distributed by the authors.

86. Nikulin A, Serganov A, Ennifar E, Tishchenko S, Nevskaya N, Shepard W, Portier C, Garber M, Ehresmann B, Ehresmann C, Nikonov N and Dumas P. (2000) Crystal structure of S15-rRNA complex. Nature Structural Biology, 7, 273-277.

87. Nomura M., Held W.A. (1974) in Ribosomes. Eds. Nomura M., Tissieres A., Lengyel P. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 193-224.

88. Orengo, C.A. and Thornton, J.M. (1993). Alpha plus beta folds revisited: some favoredmotifs .Structure, 1, 105-120.

89. Orr J.W., Hagerman P.J. & Williamson J.R. (1998) Protein and Mg2+-induced conformational changes in the S15 binding site of 16S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 275, 453-464.

90. Otwinowski Z. & Minor W. (1996) Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology 276A, 307-326

91. Oubridge C., Ito N., Evans P. R., Teo C.-H., Nagai K. (1994) Crystal Structure at 1.92 Angstroms Resolution of the RNA-Binding Domain of the U1A Spliceosomal Protein Complexed with an RNA Hairpin. Nature, 372, 432

92. Oubridge C., Ito N., Evans P.R., Teo C.H., Nagai K. (1994) Crystal structure at 1.92A resolution of the RNA-binding domain of the U1A spliceosomal protein complexed with an RNA hairpin. Nature, 372, 432-438.

93. Palade G.E. & Siekevitz P. (1956) Pancreatic microsomes: An integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cyto1. 2, 671-691.

94. Petermann M.L. & Hamilton M.G. (1957) The purification and properties of cytoplasmic ribonucleoprotein from rat liver. J. Biol. Chem. 224, 725-736.

95. Philippe C., et al. (1993) Ribosomal protein S15 from Escherichia coli modulates its own translation by trapping the ribosome on the mRNA loading site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4396-4398.

96. Picking W.D., Odom O.W., Tsalkova T., Serdyuk I. and Hardesty B. (1991) The conformation of the nascent polylysine and polyphenylalanin peptides on ribosomes. J. Biol. Chem., 266, 1534-1542.

97. Pleiss J.A., Derrick M.L., Uhlenbeck O.C. (1998) T7 RNA polymerase produced 5' end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA, 4, 1313-1317.

98. Powers T. & Noller H. (1995) Hydroxyl radical footprinting of ribosomal proteins on 16S rRNA. RNA 1, 194-209

99. Powers T. and Noller H.F. (1995) Hydroxyl radical footprinting of ribosomal proteins on 16S ribosomal RNA. RNA, 1, 194-209.

100. Price S. R., Evans P. R., Nagai K. (1998) Crystal Structure of the Spliceosomal U2B"-U2A' Protein Complex Bound to a Fragment of U2 Small Nuclear RNA. Nature 394,645

101. Prince J.B., Taylor B.H., Thurlow D.L., Ofengand J., Zimmermann R.A. (1982) Covalent crosslinking of tRNAlVal to 16S RNA at the ribosomal P site: identification of crosslinked residues. Proc. Natl Acad Sci USA, 79, 5450-5454.

102. Puglisi E. v., Green R., Noller H. F., Puglisi J. D. (1997) Stracture of a Conserved RNA Component of the Peptidyl Transferase Centre. Nat.Struct.Biol. 4, 775

103. Radermacher M., Wagenknecht T., Verschoor A., Frank J. (1987) Three-dimensional reconstitution from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 5OS ribosomal subunit of E.coli. J. Microsc. 146, 113-136.

104. Ramakrishnan V. and White S.W. (1998) Ribosomal protein structures: insights into the architecture, machinery and evolution of the ribosome. TIBS, 23, 208-212.

105. Ramakrishnan V., Gerchman S.E. (1991) Cloning, sequencing, and overexpression of genes for ribosomal proteins from Bacillus stearothermophilus. J Biol Chem, 266, 880885.

106. Ramakrishnan, V., White, S. W. (1992) The Structure of Ribosomal Protein S5 Reveals Sites of Interaction with 16S rRNA. Nature, 358, 768-771.

107. Rife J. P., Moore P. B. (1998) The Structure of a Methylated Tetraloop in 16S Ribosomal RNA. Structure, 6, 747

108. Ryabova L.A., Selivanova O.M., Baranov V.I., Vasiliev V.D. and Spirin A.S. (1988) Does the channel for nascent peptide exist inside the ribosome? Immune electron microscopy study. FEBS Lett. 226, 255-260.

109. Ryan P.C., Lu M., Draper D.E. (1991) Recognition of the highly conserved GTPase center of 23 S ribosomal RNA by ribosomal protein LI 1 and the antibiotic thiostrepton. JMolBiol, 221,1257-1268.

110. Ryter J. M., Schultz S. C. (1998) Molecular basis of double-stranded RNA-protein interactions: structure of a dsRNA-binding domain complexed with dsRNA. EMBO J. 17, 7505

111. Samaha R.R., Green R., Noller H.F. (1995) A base pair between tRNA and 23S rRNA in the peptidyl transferase centre of the ribosome. Nature, 377, 309-314. (Erratum, Nature, 378,419)

112. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring harbor Laboratory Press.

113. Serdyuk I.N., Zaccai G., Spirin A.S. (1978) Globular conformation of some ribosomal proteins in solution. FEBS Lett. 94, 349-352.

114. Spirin A.S. (1960) On macromolecular structure of native high-polymer ribonucleic acid in solution. J. Mol. Biol. 2, 436-446.

115. Stade K., Junke N. and Brimacom'be R. (1995) Mapping the path of the nascent peptide chain through the 23S RNA in the 50S ribosomal subunit. Nucleic Acids Res., 23, 23712380.

116. Stark H, Orlova E.V, Rinke-Appel J, Junke N, Mueller F, Rodnina M, Wintermeyer W, Brimacombe R. and Marin van Heel (1997) Arrangemant of tRNAs in Pre- and Posttranslocational Ribosomes Revealed by Electron Cryomicroscopy. Cell, 88, 19-28.

117. Stark H., Mueller F., Orlova E.V., Schatz M., Dube P., Erdemir T., Zemlin F., Brimacombe R. and Marin van Heel. (1995) The 70S Escherichia coli ribosome at 23 A resolution: fitting the ribosomal RNA. Structure, 3, 815-821.

118. Stern S., Powers T., Changchien L.M., Noller H.F. (1989) RNA-protein interactions in 30S ribosomal subunits: folding and function of 16S rRNA. Science, 244, 783-790.

119. Stoldt M., Wohnert J., Gorlach M., Brown L.R. (1998) The NMR structure of

120. Escherichia coli ribosomal protein L25 shows homology to general stress proteins and glutaminyl-tRNA synthetases. EMBO J. 17, 6377-6384.

121. Stoldt M., Wohnert J., Ohlenschlager O, Gorlach M., Brown L. R. (1999) The NMR Structure of the 5S rRNA E-Domain-Protein L25 Complex Shows Preformed and Induced Recognition. EMBO J. 18, 6508

122. Studier F.W. and Moffat B.A. (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, 113-130.

123. Szewczak A.A., Moore P.B. (1995) The sarcin/ricin loop, a modular RNA. J. Mol. Biol, 247, 81-98.

124. Szewczak A.A., Moore P.B., Chang Y.L., Wool I.G. (1993) The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc Natl Acad Sei USA 90, 9581-9585.

125. Tissieres A. & Watson J.D. (1958) Ribonucleoprotein particles from E. coli. Nature 182, 778-780.

126. Trakhanov S., Yusupov M. Shirokov V., Garber M., Mitshler A., Ruff M., Thierry J.C., Moras D. (1989) Preliminary X-ray investigation of 70 S ribosome crystals from Thermus thermophilus. J. Mol. Biol., 209, 327-328.

127. Trakhanov S.D., Yusupov M.M., Agalarov S.Ch., Garber M.B., Ryazantsev S.N., Tischenko S.V., Shirokov V.A. (1987) Crystallization of 70S nbosomes and 30S ribosomal subunits from Thermus thermophilus. FEBS Lett, 220, 319-322.

128. Ts'o P.O.P., Bonner J. & Vinograd J. (1956) Microsomal nucleoprotein particles from pea seedlings. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 451-465.

129. Uma K, Nikonowicz EP, Kaluarachchi K, Wu H, Wower IK, Zimmermann RA (1995) Structural characterization of Escherichia coli ribosomal protein S8 and its binding site in 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Symp Ser, 33, 8-10.

130. Unge J., Aberg A., Al-Karadaghi S., Nikulin A., Nikonov S., Davydova N., Nevskaja N., Garber M. (1998) The Crystal Structure of Ribosomal Protein L22 from Thermus

131. Thermophilics: Insights Into the Mechanism of Erythromycin Resistance. Structure, 6, 1577-1586.

132. Unge J., Al-Karadaghi S., Liljas A., Jonsson B-H., Eliseikina I., OssinaN., NevskayaN., Fomenkova N., Garber M. and Nikonov S. (1997) A mutant form of the ribosomal protein LI reveals conformational flexibility. FEBS Lett, 411, 53-59.

133. Van Acken U. (1975) Protein chemical studies on ribosomal proteins S4 and S12 from ram (ribosomal ambiguity) mutants of Escherichia coli. Mol Gen Genet, 140, 61-68.

134. Van Den Worm S., Stonehouse N. J., Valegard K., Murray J. B., Walton C., Fridborg K., Stockley P. G., Liljas L. (1998) Crystal Structure of MS2 Mutants in Complex with Wild-Type RNA Operator Fragments. Nucleic Acids Res. 26, 1345

135. Vasiliev V.D. (1974) Morphology of the ribosomal 30S subparticle according to electron microscopic data. Acta. Biol. Med. Germ. 33, 779-793.

136. Vasiliev V.D., Selivanova O.M., Baranov V.I. and Spirin A.S. (1983b) Structural study of translating 70S ribosomes from E.coli. I. Electron microscopy. FEBS Lett. 155, 167172.

137. Vasiliev V.D., Selivanova O.M., Ryazantsev S.N. (1983a) Structure of the E.coli 50S ribosomal subunit. J. Mol. Biol, 171, 561-569.

138. Verschoor A., Srivastata S., Grassucci R. and Frank J. (1996) Native 3D structure of eucariotic 80S ribosome: morphological homology with the E.coli 70S ribosome. Journal of Cell Biology, 133, 495-505.

139. Verschoor A., Warner J.R., Srivastava S., Grassucci R.A., Frank J. (1998) Three-dimensional structure of the yeast ribosome. Nucleic Acids Res, 26, 655-661.

140. Wahl M.C., Bourenkov G.B., Bartunik H.D., Huber R. (1999) Flexibility, conformational diversity and two dimerization modes in complexes of ribosomal protein U2.EMBOJ, 19,174-186.

141. Westhof E., Romby P., Romaniuk P. J., Ebel J-P., Ehresmann C., Ehresmann B. (1989)

142. Computer Modeling from Solution Data of Spinach Chloroplast and of Xenopus Laevis Somatic and Oocyte 5S R/rRNA. J.Mol.Biol. 207, 417

143. White S. A., Nilges M., Huang A., Brunger A. T., Moore, P. B. (1992) NMR Analysis of Helix I from the 5S RNA of Escherichia coli. Biochemistry, 31,1610-1621.

144. Wilson K.S., Appelt K., Badger J., Tanaka I., White S.W. (1986) Crystal structure of a prokaryotic ribosomal protein. Proc Natl Acad Sci USA, 83, 7251-7255.

145. Wilson K.S., Noller H.F. (1998) Mapping the position of translational elongation factor EF-G in the ribosome by directed hydroxyl radical probing. Cell, 92, 131-139.

146. Wimberly, B. T., White, S. W., Ramakrishnan, V. (1997) The Structure of Ribosomal Protein S7 at 1.9A Resolution Reveals a Beta- Hairpin Motif that Binds Double-Stranded Nucleic Acids. Structure, 5, 1187-1198.

147. Wittmann H.G. (1982) Components of bacterial ribosomes. Annu Rev Biochem, 51, 155183.

148. Wittmann H.G., Mussig J., Gewitz H.S., Piefke J., Rheinberger PI-J. and Yonath A. (1982) Crystallization of E.coli ribosome. FEBSLett. 146, 217-220.

149. Wittmann-Liebold B., Ashman K., Dzionara M. (1984) On the statistical significance of homologous structures among the Escherichia coli ribosomal proteins. Mol Gen Genet, 196, 439-448.

150. Wittmann-Liebold B., Greuer B. (1978) The primary structure of protein S5 from the small subunit of the Escherichia coli ribosome. FEBS Lett, 95, 91-98.

151. Woodson S.A. and Leontis N.B. (1998) Structure and dynamics of ribosomal RNA. Curr Opin Struct Biol, 8, 294-300.

152. Worbs M., Huber R. and Wahl M. (2000) Crystal structure of ribosomal protein L4 shows RNA-binding sites for ribosome incorporation and feedback control of the S10 operon. EMBOJ., 19, 807-818.

153. Wower I., Kowaleski M.P., Sears L.E., Zimmermann R.A. (1992) Mutagenesis ofribosomal protein S8 from Escherichia coli: defects in regulation of the spc operon. J Bacteriol, 174, 1213-1221.

154. Xing Y., Draper D.E. (1995) Stabilization of a ribosomal RNA tertiary structure by ribosomal protein LI 1. JMol Biol, 249, 319-331.

155. Xing Y., Draper D.E. (1996) Cooperative interactions of RNA and thiostrepton antibiotic with two domains of ribosomal protein LI 1. Biochemistry, 35, 1581-1588.

156. Yonath A, Leonard K.R, Wittmann H.G. (1987) A tunnel in the large ribosomal subunit revealed by three-dimensional image reconstruction. Science, 236, 813-816.

157. Yonath A. and Wittmann H.G. (1989) Challenging the three-dimensional structure of ribosome. Trends Biochem. Sci., 14, 329-335.

158. Yonath A., Glotz C„ Gewitz H.S., Barteles K.S., Von Bohlen K., Makowski I., Wittmann H.G. (1988) Characterization of crystals of small ribosomal subunits. J. Mol. Biol., 203, 831-834.

159. Yonath A., Missing J., Teshe В., Lorenz S., Erdmann V. and Wittmann H.G. (1980) Crystallization of ribosomal subunit from B. stearothermophilus. Biochem. Int., 1, 428435.

160. Yusupov M.M., Garber M.B., Vasiliev V.D., Spirin A.S. (1991) Thermus thermophilus ribosomes for crystallographic studies. Biochimie, 73, 887-897.

161. Yusupov M.M., Tischenko S.V., Trakhanov S.D., Ryazantsev S.N., Garber M.B. (1988) A new crystalline form of 30S ribosomal subunits from Thermus thermophilus. FEBS lett. 238, 113-115.

162. Zimmermann R.A. (1974) in Ribosomes. Eds. Nomura M., Tissieres A., Lengyel P. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 225-269.

163. Бландел Т. и Джонсон Л. Кристаллография белка. М. Мир, 1979, 620 с.

164. Карпова Е.А., Сердюк И.Н., Тарховский Ю.В., Орлова Е.В., Боровягин В.Л. (1986) Кристаллизация рибосом Thermus thermophilus. Докл. АН СССР, 289, 1263-1266.

165. Колб В.А., Коммер A.A., Спирин A.C. (1987) Существует ли канал для синтезируемого на рибосоме пептида? Мечение транслирующих рибосом атомарным тритием. Доклады АН СССР, 296, 1497-1501.

166. Никонов C.B., Фоменкова Н.П., Никулин А.Д., Федоров Р.В., Невская H.A. (1998) Структура рибосомы: РНК-белковые и белок-белковые взаимодействия. Молекулярная биология (Molecular biology Moscow), 32, 1-9

167. Серганов A.A. (1997) Изучение РНК-связывающих свойств рибосомного белка S15 из Thermus thermophilic. Диссертация, МГУ.

168. Юсупов М.М., Траханов С.Д., Барынин В.В., Боровягин B.JL, Гарбер М.Б., Седельникова С.Э., Селиванова О.М., Тищенко C.B., Широков В.А., Единцов И.М. (1987) Кристаллизация 30S субчастиц рибосом Thermus thermophilus. Докл. АН СССР, 292, 1271-1274.