Ферментативные свойства pPHK метилтрансферазы RSMD Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

IIa правах рукописи

СЕРГЕЕВА Ольга Владимировна

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА рРНК МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ RSMD

Escherichia coli

02.00.10 - биоорганическая химия

1 2 мдр ZG12

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва -2012

005015545

005015545

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, доцент Сергиев Петр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Демидкина Татьяна Викторовна

доктор биологических наук, профессор Колб Вячеслав Адамович

Ведущая организация:

Институт белка РАИ

Защита состоится 20 марта 2012 г. в 17:00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу. 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ Лабораторный корпус "А", аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 17 февраля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

501.

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибосома представляет собой нуклеопротеид, основной функцией которого является перевод информации, закодированной в мРНК, в белок при помощи тРНК. В состав бактериальной рибосомы входят две субчастицы, которые состоят из рибосомной РНК и рибосомных белков. Рибосомная РНК содержит множество модифицированных нуклеотидов, которые располагаются преимущественно в функционально-важных частях рибосомы. Наиболее часто встречающимися модифицированными нуклеотидами рРНК является псевдоуридин и нуклеотиды, метилированные по различным положениям гетероциклического основания или по 2' положению рибозы. Функция некоторых модифицированных нуклеотидов заключается в обеспечении устойчивости бактерий к антибиотикам за счет изменения участка связывания антибиотика в рибосоме. Функция модифицированных нуклеотидов в рРНК Escherichia coli, не придающих клетке устойчивость к антибиотикам, изучена слабо. Модификацию рРНК бактерий производят специализированные ферменты - рРНК-метилтрансферазы и псевдоуридинсинтазы, каждая из которых специфична для одного или нескольких модифицированных нуклеотидов. Модификация рРНК происходит на разных стадиях сборки субчастиц рибосомы. Существуют ферменты, специфичные к рРНК, к промежуточным интермедиатам сборки и к уже собранным субчастицам. На сегодняшний день модифицирующие рРНК ферменты слабо изучены, хотя они могут играть важную роль в процессе сборки рибосомы. Исследование субстратной специфичности и кинетических характеристик ферментов, модифицирующих рРНК, необходимо для понимания процесса сборки и функционирования рибосомы.

В данной работе мы использовали штамм с делецией гена rsmD, в котором отсутствует метилирование G966 в 16S рРНК. Это позволило охарактеризовать субстратную специфичность, кинетические свойства и область связывания рРНК метилтрансферазы RsmD с 30S субчастицами рибосомы Escherichia coli, а также изучить фенотип клеток, лишённых этой модификации.

Цель работы.

1. Исследовать комплексообразование рРНК метилтрансферазы RsmD с различными субстратами.

2. Определить кинетические характеристики рРНК метилтрансферазы RsmD.

3. Изучить активный центр связывания SAM рРНК метилтрансферазы RsmD.

4. Исследовать область связывания рРНК метилтрансферазы RsmD с 30S субчастицами рибосомы.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе данной работы была охарактеризована рРНК метилтрансфераза RsmD. Оказалось, что фермент специфично модифицирует 30S субчастицы рибосомы, не взаимодействуя с 16S

рРНК и 70S субчастицами рибосомы. Модификация происходит на последнем этапе сборки субчастиц, до включения в инициацию трансляции. Целевой для RsmD нуклеотид G966 располагается в Р-участке рибосомы, однако его роль в процессе трансляции ещё не ясна. Модификация данного положения для рибосомы происходит более эффективно, чем взаимодействие с тРНК и мРНК. Только наличие инициаторных факторов позволяет мРНК и тРНК вытеснить метилтраисферазу RsmD из комплекса с 30S субчастицей.

Метилтрансфераза RsmD образует устойчивый комплекс с 30S субчастицами, константа диссоциации данного комплекса на два порядка ниже, чем для других рРНК метилтрансфераз. Оказалось, что и каталитические свойства метилтрансферазы RsmD отличают её от остальных рРНК метилтрансфераз. RsmD на три порядка быстрее других рРНК метилтрансфераз модифицирует 30S субчастицы рибосомы. Возможно, это связано с необходимость модифицировать данный нуклеотид в Р-участке рибосомы в ограниченный промежуток времени между окончанием сборки 30S субчастиц и инициацией трансляции. Взаимодействие метилтрансферазы с субчастицами не влияет на процесс инициации, так как после модификации метилтрансфераза теряет способность взаимодействия с субчастицами.

Метилтрансфераза RsmD относится к группе ферментов, в основе строения которых укладка Россмана. Домен связывания SAM имеет стандартные для данной группы мотивы - 58DxFxGxG и 127DPPF. Метилтрансфераза RsmD образует прочный комплекс с SAM. Активный центр RsmD необычно устойчив к мутациям консервативных аминокислот. Для инактивации оказалось необходимым заменить 3 аминокислоты активного центра, тогда как для других подобных ферментов одиночные мутации соответствующих аминокислот приводят к инактивации метилтрансфераз. Методом химического пробинга была определена область 16S рРНК, участвующая в связывании RsmD, что позволило построить модель взаимодействия RsmD с 16S рРНК.

Изучение рРНК метилтрансфераз важно для понимания механизмов появления антибиотикорезистентности. Во многих случаях появление устойчивых к антибиотикам штаммов обусловлено появлением специфических метилтрансфераз, модифицирующих рибосомную РНК. Также возможно, что некоторые рРНК метилтрансферазы, не несущие функцию защиты от антибиотиков, служат природным резервуаром для эволюции генов устойчивости к антибиотикам.

В рамках данной диссертационной работы охарактеризована метилтрансфераза RsmD, модифицирующая гуанозин, расположенный в Р-участке рибосомы.

Апробация работы. Материалы диссертации многократно обсуждали на семинарах лаборатории химии рибонуклеопротеидов кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им. Ломоносова; докладывали на конференциях: XV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» МГУ имени Ломоносова.

Москва, Россия. Апрель 8 - 12, 2008; Международная конференция «Рибосомы» 2010. Орвието, Италия. Май 3-7, 2010; Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Москва, Россия. Ноябрь 17-19, 2010.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 67 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 121 цитированную работу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Метилтрансфераза Г^тО модифицирует гуанозин 966, расположенный в Р-участке рибосомы по соседству с другим модифицированным нуклеотидом, т5С967. Нуклеотид т20966 напрямую взаимодействует с 34 нуклеотидом антикодоновой петли тРНК (рис. 1А). ЯйтБ может специфично взаимодействовать с 168 рРНК только после связывания рибосомных белков 87 и 819, и модифицировать более поздние промежуточные состояния сборки вплоть до полностью собранной 308 субчастицы рибосомы. По своей структуре И^тО отличается от других метилтрансфераз, содержащих, как правило, субстрат-узнающий и каталитический домены. ЯвшБ состоит из 198 аминокислот, в основе структуры находится укладка Россмана. У К^тО практически отсутствует домен, отвечающий за узнавание субстрата (рис. 1Б).

1«ррнк ». 6 -АХ.

31 спираль

юС96'»

i-у часто* y<fj4 тШК

Рис. 1. А. Расположение G966 в структуре рибосомы; Б. Структура метилтрансферазы RsmD.

1. Образование стабильного комплекса между метилтрансферазой RsmD и 30S субчастицами рибосомы

Для изучения комплексообразования RsmD и ее субстрата были использованы

30S субчастицы рибосомы, выделенные из штамма, лишённого гена

метилтрансферазы RsmD. Штамм ArsmD был любезно предоставлен проф.

Н.Мори, Япония. Метилтрансфераза RsmD была выделена в виде рекомбинантного белка, содержащего His6 таг на N-конце. Образование комплекса происходило в

присутствии нереакционноспособных аналогов S-аденозилметионина (SAM) (рис. 2А), а именно синефунгина (рис. 2Б) и S-аденозилгомоцистеина (SAH) (рис. 2В). Связываясь на месте кофактора SAM, но не обладая метальной группой, данные вещества фиксируют комплекс метилтрансферазы с 30S сучбастицами.

ч- --К

V

"1

Б.

X"

/

А.

Рис. 2. А. S-аденозилметилнин аденозилгомоцистеин (SAH).

В.

(SAM); Б.

Синефунгин; В. S-

Все компоненты комплекса, а именно метилтрансфераза, 30S субчастицы и синефенгин, смешали и инкубировали при 37°С, после чего комплекс выделяли методом ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 10-30% в буфере Tris CI (50 мМ), NH4C1 (70 мМ), К.С1 (30 мМ), Mg(OAc)2 (1 мМ). Собранные фракции анализировали с помощью спектрофотометрии при 260 нм, определяя рРНК, и методом иммуноблотинга с помощью анти-His,; (рис. ЗА) антител и антител к рибосомному белку S4 (рис. ЗБ). Образование комплекса также подтверждали методом гель-фильтрации на колонках с сефадексом (рис. ЗВ).

30%4 1 5 1 ' 2 і 2 3 3 4 4 S 5 6 7 10% 6 7 К

> 1 ! 2 3 4 5 6 ; 7 ■ К

Рис. 3. Выделение комплекса RsmD и 30S субчастиц. Оптическая плотность фракций сахарозного градиента представлена на верхней панели рисунка. Фракции, соответствующие 30S субъединицам и их комплексу с RsmD отмечены. Иммуноблотинг фракций комплекса после ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (А) с помощью анти-HiSs антител, К-контроль рекомбинантный RsmD в том же количестве, что и 30S субчастицы в соответствующей фракции; (Б) с помощью антител к рибосомному белку S4, К-контроль суммарный белок 30S субчастиц, в том числе S4 в том же количестве, что и 30S субчастицы в соотвествующей фракции; В. Иммуноблотинг помощью aHTH-His6 антител фракций после гель-фильтрации. 1- фракция с максимальной оптической плотностью, 1К-4К-контроль без 30S субчастиц.

Таким образом, метилтрансфераза присутствует во фракциях рибосом, то есть происходит образование комплекса. Исходя из рис. ЗА и Б можно заключить, что соотношение 30S субчастиц и фермента близко к стехиометрическому.

Способность комплексообразования между 30S субчастицами и RsmD зависит от лиганда RsmD и от того, метилирована ли 30S субчастица. Комплексы 30S метилированных и неметилированных 30S субчастиц с RsmD в присутствии различных лигандов выделяли методом ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 10-30% в буфере Tris СІ (50 мМ), NH4CI (70 мМ), КС1 (30 мМ), Mg(OAc)2 (10 мМ), после чего анализировали методом иммуноблотинга с

помощью анти-Hisr, антител. Метилтрансфераза RsmD может образовывать комплекс є метилированными 30S субчастицами дикого типа (wt), когда в качестве кофактора синефунгин и SAH. Комплексообразование в присутствии SAM не происходит (рис. 4). Скорее всего, невозможность образования комплекса между метилированными 30S субчастицами и RsmD-SAM обусловлена стерическим затруднением, вызванным сближенностью метальных групп рРНК и SAM.

1 I г I 2 2 I 3 3' I к

Щ т. тиш». « Штт

4 I 4' I 5 I 5' I 6 I 6' I

Рис. 4. Иммуноблотинг комплексов с метилтрансферазой RsmD: 1 - 30S wt, синефунгин; 2 - 30S wt; 3 - 30S ARsmD, синефунгин; 4 - 30S ARsmD; 5 - 30S wt, SAM; 6 - 30S wt, SAH. Г,2',3',4',5',6' — фракции верха градиента, содержащие не связанную в комплекс метилтрансферазу. К- RsmD контроль.

Возможность образования комплекса 70S рибосом с RsmD также проверили методом ультрацентрифугирования с последующим анализом фракции рибосом с помощью иммуноблотинга. Оказалось, что после взаимодействия с 50S субчастицами, то есть после образования 70S рибосом, 30S субчастица теряет способность связаться с RsmD (рис. 5).

70S 30S К

Рис. 5. Проверка возможности образования комплекса RsmD с 70S рибосомами. К- RsmD контроль.

2. Комплексообразование в присутствии мРНК, тРНК и факторов иннциации

Известно, что инициация трансляции начинается с малой субчастицы рибосом. Взаимодействие 30S субчастиц с инициаторной тРНК даже в присутствии мРНК очень слабое в отсутствие факторов инициации, максимальное связывание достигает 30% (рис. 6). Равновесные константы диссоциации комплекса с fMet-тРНКг 30S субчастиц с делецией гена метилтрансферазы RsmD не отличаются от комплекса с 30S субчастицами дикого типа и составляют 1,4±0,3 и 1,3±0,3 рМ соответственно. Kj и Bmax рассчитывали из зависимости концентрации комплекса 30S*f[3H]Met-TPHKfMet*MPHK от концентрации ffH]Met-TPHKrMd Концентрацию комплекса определяли с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры, задерживающие комплекс 30S*ff H]Met-TPHKfMe'*MPHK, но не

свободную f[3H]Met-TPHKfMet. Мы использовали 022AUG мРНК, которая имела последовательность: 5'...UUA АСА GGU AUA CAU ACU AUG UUU ACG AUU...3'. Константы диссоциации бимолекулярного комплекса вычисляли, аппроксимируя кинетические кривые экспоненциальной зависимостью с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Таким образом, в отсутствие факторов инициации метилирование G966 не влияет на эффективность связывания fMet-TPHKfMet с 30S субчастицами.

IRMA. mkM

Рис. б. Зависимость концентраций комплексов 30S*tPHK*mPHK, образованных в буфере Tris С1 (50 мМ), NH4C1 (70 мМ), КС1 (30 мМ), Mg(OAc)2 (20 мМ), от концентрации fI3H]Met-TPHKfMet.

Группой Франка в сотрудничестве с группой Эренберга была определена структура комплекса 70S рибосомы с мРНК, инициаторной тРНК и тремя инициаторными факторами IF1, IF2 и IF3 методом криоЭМ (рис. 7).

Рис. 7. Структура комплекса 70S рибосомы с мРНК, fMet-TPHKfMet и инициаторными факторами IF1, IF2 и IF3, определенная с помощью криоЭМ. А. Синим цветом обозначена электронная плотность 50S субчастицы, жёлтым - 30S субчастицы, красным - добавочная электронная плотность, наблюдаемая в инициаторном комплексе и не наблюдаемая для свободных 70S рибосом. Б. Модель расположения лигандов рибосомы дополнительной электронной плотности. Показано предполагаемое расположение IF1, IF2, IF3 и, fMet-'rPHKfMet.

Из литературных данных известно, что фактор инициации IF3 осуществляет отбор тРНК и препятствует ассоциации субчастиц: N-домен IF3 взаимодействует с платформой 30S субчастицы в районе белка Sil, а С-домен закрывает участок платформы, необходимый для ассоциации с 50S субчастицей. Фактор IF2 ускоряет связывание fMet-TPHKfMet с 30S субчастицей, а также катализирует присоединение 50S субчастиц. Фактор инициации IF1 связывается с А участком малой субчастицы, IF1 способствует повышению точности инициации, стимулируя

активность №2 и ШЗ. Соответственно факторы инициации, тРНК, мРНК связываются в области взаимодействия метилтрансферазы ЯвтБ и должны разрушать комплекс с метилтрансферазой. Стабильность комплексов изучали методом иммуноблоттинга с использованием анти-Шве антител после фракционирования методом ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (10-30%). В качестве тРНК использовали инициаторную Ме1-тРНКгМй, в роли мРНК - 022АШ мРНК.

1- 30Э + КэтО => ЗИКялО => #1 +мРНК+тРНК

2-305+ ВяпО^ 305*Я5т0 => Ш +ЫРНК+ТРНК

3 ■ 305+ Й!Ш0 => 305«й5т1)=> +1РЗ +МРНК+ТРНК

4 - 305 + К5П1[)=> 30Б*Рзт0

5-305+ (¡$тВ=> ЗЮТяпВо + Н+И+В+мРНК+тРНК 6 - зог +мРНН+тРНК=> 305*мРНК*тРНК=> + Й5т0

Рис. 8. Образование комплекса ЗОЭ субчастиц и метилтрансферазы НэпШ в присутствии факторов инициации, мРНК, тРНК при 10 мМ М§2+. К -контроль Язга!). Справа показан порядок добавления компонентов.

1БЗ связывается в непосредственной близости от Р-участка и его афинность к субчастицам, по-видимому, больше, так как №3 вытесняет ЯвтБ из комплекса с 308 субчастицами (рис. 8, дорожка 3). Ш2 также вытесняет метилтрансферазу из комплекса с 30в субчастицами (рис. 8, дорожка 2). Присутствие фактора инициации №1 не влияет на стабильность комплекса, возможно из-за того, что области связывания ПЧ и ЯвтО на поверхности ЗОЭ субчастицы рибосомы не перекрываются. В присутствии всех факторов инициации, мРНК и тРНК комплекс 30Э субчастицы с метилтрансферазой диссоциирует. В отсутствие факторов инициации комплексообразование 308 субчастиц с ЯвтО предпочтительнее, чем взаимодействие с мРНК и тРНК, то есть фермент вытесняет мРНК и тРНК из комплекса.

3. Применение КвшЭ для сайт-специфического введения флуоресцентной метки

Метилтрансфераза НэтО модифицирует один нуклеотид из 4,5 тысяч нуклеотидов рибосомной РНК. Было интересно использовать её уникальную специфичность для направленного введения флюоресцентной метки в рибосому. Мы проверили способность метилтрансферазы ЯвшЭ использовать алкинильное производное вАМ - пент-2-ен-4-инил-8-аденозилгомоцистеина (Ас1оЕпУп) (рис. 9А) в качестве донора алкинильного радикала и переносить его на экзоциклическую аминогруппу нуклеотида 0966 16Э рРНК в составе ЗОЭ субчастицы, неметилированной по этому остатку. Включение алкинильных радикалов в ЗОБ субчастицы составляет 88% (рис. 9Б). Зависимость выхода алкинильного производного ЗОЭ субчастицы от времени реакции измеряли с помощью радиоактивного [14С]8АМ. После инкубации с алкинильным производным вАМ в реакционную смесь через определенные промежутки времени добавляли радиоактивный [14С]8АМ. Фермент ЯвтВ проводил включение

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

радиоактивных метальных групп в те 308 субчастицы, которые остались ^модифицированными, т.е. не содержали алкинильных групп.

100г

Рис. 9. А. Пент-2-ен-4-инил-8-аденозингомоцистеин (AdoEnYn). Б. Кинетика включения алкинильных групп в 30S субчастицы, выделенные из штамма ARsmD и не содержащие метальной группы, присоединенных к нуклеотиду G966.

Включение алкинильного радикала в 30S субчастицу рибосомы позволяет использовать субчастицы в реакции 1,3-циклоприсоединения азида флуоресцентной метки (реакция Хыосгена) и получения флуоресцентно-меченых 30S субчастиц рибосомы. Основным катализатором реакции Хыосгена является Cu(I), которая легко окисляется до Cu(II), образуя при этом опасные для рибосомы радикал-ионы. Для защиты рибосомы были подобраны лиганды для ионов меди, которые уже использовались с клеточными системами, а именно ТВТА и ТНРТА -трис-(3-гидроксипропилтриазолилметил)амин. ТНРТА обладает большей растворимостью в воде и лучше подходит для работы с 30S субчастицами. Таким образом, реакцию циклоприсоединения алкинильных 30S субчастиц к азиду флуоресцентной метки Alexa 555 проводили в присутствии CuS04, ТНРТА, аминогуанидина (дополнительная ловущка для радикал-ионов), аскорбата натрия в буфере Tris С1 (50 мМ), Ш4С1 (70 мМ), KCl (30 мМ), Mg(OAc)2 (7 мМ). Выход флуоресцентного производного 16S рРНК составил 77% от общего количества 16S рРНК и был рассчитан по калибровочной кривой стандартных концентраций Alexa 555.

При проверке функциональной активности на нитроцеллюлозных фильтрах оказалось, что флуоресцентно-меченые Alexa555-30S субчастицы не способны связывать инициаторную fMet-TPHKrMel в 70S инициаторном комплексе по сравнению с 30S wt (рис. 10А). Это может происходить по нескольким причинам. Во-первых, поскольку нуклеотид G966 16S рРНК находится в непосредственной близости к Р-участку рибосомы, то добавление объемной флуоресцентной метки может мешать связыванию тРНК. Во-вторых, компоненты реакции циклоприсоединения могут повреждать рибосомную РНК или рибосомные белки. Для решения этого вопроса был проведен тест функциональной активности рибосом на каждой стадии (рис. 1 ОБ).

ЮОг

ЮОг

Рис. 10. А. Тест функциональной активности флуоресцентно-меченых рибосом. Б. Проверка функциональной активности 30S субчастиц по выходу 70S инициаторного комплекса. Использовали следующие варианты обработки 30S субчастиц, лишенных модификации G966: 1 - алкинил-ЗОЭ (30SAdoEnYn); 2 -Alexa555-30S; 3 - 30S, инкубированные со всеми компонентами смеси для реакции циклоприсоединения, кроме А1еха555; 4 - 30S, инкубированная с RsmD; К - 30S без обработок.

Алкинилирование рРНК не влияет на функциональную активность 70S инициаторного комплекса. Причиной инактивации Alexa555-30S служит не само введение флуорофора, а повреждение рибосомных субчастиц при инкубации в условиях реакции циклоприсоединения (рис. 10Б, 2 и 3). Варьирование концентраций катализатора реакции и других участников реакции не дало положительного результата. Таким образом, оптимизация условий встраивания флуоресцентной метки в рРНК не увенчалась успехом. Условия, в которых встраивание метки было эффективным, способствовали инактивации рибосом. По-видимому, для создания эффективного неповреждающего метода встраивания флуорофора в 30S субчастицы рибосомы необходимо отказаться от использования солей меди.

4. Определение константы диссоциации комплекса 30S субчастиц с метилтрансферазой RsmD

Для определения константы диссоциации комплекса 30S субчастиц с метилтрансферазой RsmD использовали метод титрования фиксированной концентрации 30S субчастиц возрастающими концентрациями метилтрансферазы в присутствии синефунгина и S-аденозилгомоцистеина в буфере с Tris С1 (50 мМ), NH4C1 (70 мМ), KCl (30 мМ), Mg(OAc)a (7 мМ). Комплексы анализировали методом иммуноблотинга с помощью aHTH-Hisö антител. В качестве контроля использовали 30S субчастицы дикого типа. Полученные значения аппроксимировались в программе GraphPad Prism, используя модель с одним сайтом связывания.

30S + RsmD => 30S*RsmD : [30S*RsmD]=Bmax*[RsmD]/(Kd+[RsmD])

tRsiriDJI, mkM

Рис. 11. Кривая титрования 30S субчастиц возрастающими концентрациями RsmD в буфере Tris С1 (50 мМ), NH4C1 (70 мМ), KCl (30 мМ), Mg(OAc): (7 мМ) в присутствии: синефунгина (А ), SAH (■ ). С 30S wt в присутствии синефунгина (♦ ) в качестве контроля.

Оказалось, что 30S субчастицы дикого типа практически не связываются с метилтрансферазой в присутствии синефунгина, для них Втах составляет порядка 20% (рис. 11). Соответственно, не имеет смысла рассчитывать константу диссоциации таких комплексов. В случае 30S субчастиц с отсутствием метилирования Втах составляет 100% как в случае синефунгина, так и в случае SAH с учетом погрешности. Константа диссоциации комплекса 30S субчастиц с RsmD в присутствии синефунгина 29±5 нМ, в присутствии SAH - 41±15 нМ. Полученные значения константы диссоциации комплекса свидетельствуют о прочном взаимодействии, связывание на 2-3 порядка лучше, чем в случае других рРНК метилтрансфераз. Например, метилтрансфераза RsmC метилирует 30S субчастицы рибосомы по 1207 положению, константа диссоциации данного комплекса 20 мкМ. Метилтрансфераза Riml модифицирует 1962 цитозин 23S рРНК, константа диссоциации составляет 34 мкМ.

5. Кинетические свойства метилтраисферазы RsmD

Для исследования кинетических параметров метилтрансферазу RsmD использовали в недостатке, а концентрацию 30S субчастиц варьировали вплоть до 200х по отношению к ферменту. Реакцию проводили при ЮООх кратном избытке [3H]SAM по отношению к RsmD в буфере Tris С1 (50 мМ), NH4C1 (70 мМ), KCl (30 мМ), Mg(OAc)2 (7 мМ). Реакцию останавливали буфером для выделения РНК, содержащим гуанидин хлорид, через 30 с; 1,5 мин.; 3 мин.; 6 мин.; 12 мин.; 24 мин., выделяли РНК, содержащую [3Н]СН3-группу, и определяли уровень метилирования по радиоактивности, используя сцинтилляционный счётчик. В качестве контроля использовали смесь метилтраисферазы с [3H]SAM без 30S субчастиц.

Полученные значения анализировали с помощью теории ферментативной кинетики, а именно уравнения Михаэлиса-Ментен:

30S + RsmD <-> 30S*RsmD «-> RsmD + 30S* u = Vmax*[30S]/(Km+[30S]) Преобразованием уравнения является линеаризация Лайнуивера-Бэрка:

1/и = Km/Vmax*[30S] + 1/Vmax

1/[30S]*10'3 , рм-'

Рис. 12. Линеаризация Лайнуивера-Бэрка для реакции модификации 30S субчастиц с метилтрансферазой RsmD.

Среднее уравнение прямой после линеаризации: у = 0.0146х + 4.37. Значение по оси абсцисс при у=0 соответствует (-1/Кш), значение по оси ординат при х=0 соответствует (1/Vmax) (рис. 12). В случае модификации 30S субчастиц с метилтрансферазой RsmD константа Михаэлиса составила 3,3 ±0,6 нМ, каталитическая константа 0,028±0,004 мин"1. По сравнению с другими рРНК метилтрансферазами RsmD характеризуется значительно более низкой константой Михаэлиса по отношению к 30S субчастицам. Оказывается, что RsmD значительно более эффективно связывает малую субчастицу рибосомы, при этом каталитическая константа оказывается сравнимой с другими ферментами подобного типа. Значение константы Михаэлиса для метилтрансферазы RrmJ, модифицирующей 2552 уридин 50S субчастицы рибосомы, составляет 0,7 цМ, а каталитическая константа равна 0,06 мин"1. Для метилтрансферазы RlmH, которая участвует в метилировании псевдоуридина 1915 в составе 70S субчастицы рибосомы, константа Михаэлиса составляет 1,6 цМ, а каталитическая константа -0,19 мин"1. Не так много рРНК метилтрансфераз кинетически охарактеризованы. В основном определены кинетические характеристики для ферментов, субстратами которых являются собранные субчастицы рибосомы. В этом случае ферменты, модифицирующие 30S субчастицу, проявляют большую каталитическую эффективность по сравнению с ферментами, модифицирующими 50S и 70S субчастицы. Это можно объяснить тем, что инициация трансляции начинается с 30S субчастиц, соответственно ферменты обладают меньшей возможностью для модификации и ограниченным временем образования комплекса до связывания инициаторных факторов, мРНК и тРНК.

6. Химический и ферментативный пробинг комплекса RsmD с 30S субчастицами

Для изучения нуклеотидов 16S рРНК, контактирующих с метилтрансферазой RsmD, был использован метод химического и ферментативного пробинга. В качестве специфических химических агентов использовали диметилсульфат, кетоксапь (3-этоксибутанон-2-аль-1) и водорастворимый карбодиимид (1-Циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид тие/ло-р-толуолсульфонат или

СМСТ). Для ферментативного пробинга были использованы РНКазы ТІ и Т2. При образовании комплекса некоторые нуклеотидные остатки должны менять свою реакционную способность по отношению к модифицирующим агентам. Это означает, что именно эта область вовлечена во взаимодействие с метилтрансферазой. В качестве контроля использовались ЗОЭ субчастицы, модифицированные в отсутствие Я^тО.

Четыре нуклеотида изменяют свою реакционную способность по отношению к модифицирующим агентам и РНКазам, а именно А968, А969, С970. А790 (рис. 13).

ІШ ОМБ КеШ Т1 Т2 и С С А ■ + ■ + - + .+ .+

А968 А969

ст

иы РМЭ Кеш СМСТ Я5тО - + - + ■ » • * АС ОН

А790

Рис. 13. Химический и ферментативный пробинг комплекса ЗОЭ субчастиц с метилтрансферазой КэтО. А, С, в, и - дорожки сиквенса, 1Ж - без модифицирующего агента. ЭМв - модификация диметилсульфатом, КеЙ1 -модификация кетоксалем. СМСТ - модификация водорастворимым карбодиимидом, Т1 - модификация РНКазой Т1, Т2 - модификация РНКазой Т2. + - обозначают образование комплекса с ЯэпШ до модификации, - - обозначают отсутствие белка.

Нуклеотидные остатки А968, А969, С970 расположены в непосредственной близости от нуклеотида-мишени 0966 метилтрасферазы 11зтО. Нуклеотид А790 удален во вторичной структуре 168 рРНК от нуклеотида 0966 (рис. 14А). Если рассмотреть пространственное расположение всех нуклеотидных остатков, защищенных метилтрансферазой от химической модификации, то они расположены по обеим сторонам полости в ЗОЭ субчастицы, в которой, скорее всего, происходит связывание метилтрансферазы (рис. 14Б).

Размер полости Р-участка, в котором располагаются нуклеотиды, меняющие свою реакционную способность, составляет около 30 А, а размер метилтрансферазы в зависимости от проекции 25-40 А. Вполне возможно, что метилтрансфераза защищает нуклеотидный остаток А790, заполняя все пространство между головой и платформой 308 субчастицы.

А.

Рис. 14. Моделирование пространственного расположения метилтрансферазы К^тБ и фрагмента 16Б рРНК, содержащего нуклеотид-мишень. А. Схематическое изображение участка 165 рРНК. В квадрате 0966 стрелками показаны нуклеотиды, изменяющие свою реакционную способность при образовании комплекса ЗОЭ субчастиц с ИвтБ. Б. Лентами обозначен ход полипептидной цепи ЯзпШ, 16Э рРНК представлена проволочной моделью, ван-дер-Ваальсовыми сферами показаны нуклеотиды, изменившие свою реакционную способность. В. Р^пШ представлен в виде модели поверхности, окрашенной в соответствии с электрическим потенциалом от -5 (красный цвет) до +5 (синий цвет). 16Э рРНК изображена проволочной моделью, ван-дер-Ваальсовыми сферами показаны нуклеотиды, изменившие свою реакционную способность.

Если рассмотреть распределение заряда на поверхности метилтрансферазы, то существует область поверхности, обогащенная положительно заряженными

остатками аминокислот. Скорее всего, эта часть белковой глобулы и попадает в полость между нуклеотидными остатками А790 и G966 (рис. 14В). В структуре метилтрансферазы можно выделить положительно заряженную область, которая немного выступает по сравнению с остальной частью белка. Размер данной области около 26 Á и, можно предположить, что белок связывается с полостью рРНК размером около 30 А именно этой частью.

7. Изучение активного центра метилтрансферазы RsmD с помощью мутагенеза

В основе строения каталитического центра рРНК метилтрансфераз, модифицирующих гуанозин по 2 положению, лежит укладка Россмана, представляющая собой а/р сэндвич, в котором 7 р-листов уложены между двумя слоями а-спиралей. Домен связывания ко-фактора S-аденозилметионина также консервативен среди РНК метилтрансфераз. SAM располагается между мотивами 127DPPF130 и 58DxFxGxG64 метилтрансферазы. Карбоксильная и аминогруппа метионина в составе SAM образует водородные связи с аспартатом и глицином мотива DxFxGxG (рис. 15А).

TOSNArHM1" „ ♦

DPPF ¿JCS

KDCfjAGSGM /

А. Б.

Рис. 15. А. Схема сайта связывания S-аденозилметионина метилтрансферазы RsmD. Б. Мутации сайта связывания SAM.

Замены консервативных аминокислот 58D, |28Р, |2;Р, l3"F сайта связывания SAM метилтрансферазы RsmD были проведены путем мутагенеза in vitro и подтверждены секвенированием плазмидной ДНК. Таким образом, были получены как мутанты по одной аминокислоте, так и мутанты по двум и трем аминокислотам. Проверку активности мутантных форм RsmD выполняли in vivo, мутанты на плазмиде вносили в штамм с делецией гена метилтрансферазы. Методом обратной транскрипции анализировали наличие метальной группы в положении 966 16S рРНК, выделенной из клеток с различными мутантами метилтрансферазы (рис. 16).

N Мутации сайта связывания

SAM

1 PPF128-130AAS

2 F130S

3 РР128-129АА

4 D58A

5 D58A/PP128-129АА

Рис. 16. Метилирующая активность мутантов метилтрансферазы RsmD. Мутанты пронумерованы в соответствии с табл. Б (рис. 13), 6 - контроль RsmD.

Одиночные D58A и F130S и двойная РР128-129АА мутации не приводят к потере активности фермента (рис. 16, дорожки 2 и 4, 3), тройная D58A/PP128-129АА мутация аминокислот обоих мотивов связывания SAM также оставляет фермент активным. Только тройная мутация мотива 127DPPF130, а именно PPF128-130AAS (рис. 16, дорожка 1) приводит к инактивации фермента и потере способности метилирования I6S рРНК. Полученные данные также были подтверждены реакцией метилирования 30S субчастиц рибосомы in vitro.

Для исследования кинетических параметров активных мутантов метилтрансферазы RsmD, а именно D58A, РР128-129АА, D58A/PP128-129AA использовали такой же подход, что и для определения кинетических параметров метилтрансферазы RsmD. Белки использовали в недостатке, а концентрацию 30S субчастиц варьировали вплоть до 200х кратной по отношению к ферменту. Реакцию проводили в присутствии 1000 кратного избытка [3H]SAM по отношению к ферменту и останавливали буфером для выделения РНК, содержащим гуанидин хлорид, через 30 с; 1,5 мин.; 3 мин.; 6 мин.; 12 мин.; 24 мин., выделяли РНК, содержащую [3Н] С Н3-группу, и определяли уровень метилирования по радиоактивности, используя сцинтилляционный счётчик. В качестве контроля использовали смесь метилтрансферазы с [3H]SAM без 30S субчастиц.

Полученные значения анализировали с помощью теории ферментативной кинетики, а именно уравнения Михаэлиса-Ментен, используя линеаризацию Лайнуивера-Бэрка. К сожалению, мы не смогли исследовать кинетические характеристики белка с мутацией F130S, так как белок очень неустойчив и выпадает в осадок в процессе выделения.

150-,

40-i

l

30-

ъ

CL

Vi 20-

10

А.

0-i-1-1-1-1-1

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

1f[30S]"l0"3, pM'1

Б.

OH-,-1-1-1-1

ООО 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

1/[30S)*W3, pM1

60-,

B.

<M-1-1-I-1-1

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.2S

1/[30S]*10'J, pM''

Рис. 17. Линеаризация Лайнуивера-Бэрка для реакции модификации 30S субчастиц с активными мутантами метилтрансферазы RsmD: А. D58A, Б. РР128-129АА, В. D58A/PP128-129AA.

Рассчитанные значения константы Михаэлиса и каталитической константы для мутантов RsmD составили: D58A - 0,23±0,06 цМ и 0,055±0,007 мин'1; РР128-129АА - 5±1,1 нМ и 0,016±0,008 мин"1; D58A/PP128-129AA - 0,И±0,04 цМ и 0,038±0,01 мин"1, соответственно. По-видимому, двойная мутация РР128-129АА не влияет на активность метилтрансферазы, так как полученные кинетические характеристики фактически не отличаются от данных для дикого типа метилтрансферазы RsmD. При наличии одиночной мутации D58A и сочетания мутаций D58A/PP128-129AA константа Михаэлиса метилтрансферазы повышается на два порядка. Скорее всего, аспарагиновая кислота в 58 положении важна для взаимодействия метилтрансферазы RsmD с 30S субчастицей.

Для комплекса метилтрансферазы RsmD с S-аденозилметионином методом изотермического калориметрического титрования была определена константа диссоциации, равная 0,58 цМ (рис. 18). Также были определены константы диссоциации комплексов метилтрансферазы RsmD с нереакционными аналогами SAM - синефунгином и SAH, и мутированных форм RsmD с кофактором SAM (табл. I).

-12 J-г--■-1---т-■-1-■-

0 2 4 5 8

R мопярное отношение

Рис. 18. Изотермы адсорбции для связывания SAM с RsmD (в) и мутантами, полученные интегрированием пиков титрования: РР128-129АА (г), D58A (д), D58A/PPI28-I29AA (е), а также связывание RsmD с синефунгином (а), SAH (б) при 25°С в20 мМ Hepes К pH 7.5, 0.1% Triton Х100, 200 мМ NH4OAc, I мМ Mg(OAc)2, 5 мМ DTT, 10% глицерин.

Таблица 1.

Термодинамические параметры связывания метилтрансферазы RsmD и ее мутантов с S-аденозилметионином (SAM), S-аденозилгомоцистеином (SAH) и синефунгином (Sin).

Белок Лиганд N Кд, AH, AS,

pM ккал-М"' кал-М"'К"'

RsmD SAM 1,0 0,58 -3,2 17,8

RsmD SAH 0,9 2,50 -9,9 -7,4

RsmD Sin 1,0 5,00 -12,5 -17,6

РР128-129АА SAM 1,1 0,55 -1,6 23,3

D58A SAM 1,0 0,37 -0,7 27,2

D58A/PP128-129AA SAM нет сигнала

В составе синефунгина и SAH нет метальной группы, которую фермент переносит на рРНК. Соответственно теряется часть гидрофобных взаимодействий с метилтрансферазой по сравнению со связыванием SAM, энтропийная составляющая реакций становится отрицательной, как в случае синефунгина -17,6 кал М''-K"1, так и в случае SAH -7,4 кал-M''-K"1 то сравнению с положительным изменением энтропии, когда коферментом является SAM 17,8 кал-М" -К" .

Для белка с одиночной мутацией D58A и двойной мутацией РР128-129АА константы ассоциации и термодинамические характеристики близки по значениям к полученным для метилтрансферазы RsmD. Для белка с тройной мутацией D58A/PP128-129AA мы не смогли определить константу ассоциации в данных условиях (рис, 18). Возможно, это связано с низким значением энтальпийной составляющей реакции. Многие комплексы рРНК метилтрансфераз с SAM характеризуются константой диссоциации порядка десятков рМ, например, комплекс метилтрансферазы RlmH с SAM - 27 цМ, RlmD с SAM - 26 рМ.

Метилтрансфераза RsmD является эффективным ферментом, образующим прочные комплексы как с S-аденозилметионином, так и с 30S субчастицами рибосомы. По-видимому, кинетические характеристики RsmD связаны с ограниченным периодом времени доступности G966 для модификации: после сборки 30S субчастиц и до начала сборки инициаторного комплекса.

ВЫВОДЫ

1. Метилтрансфераза RsmD образует прочный комплекс с 30S субчастицами, выделенными из штамма E.coli, лишённого гена RsmD. Возникающий комплекс стабилен в условиях ультрацентрифугирования.

2. Константа диссоциации комплекса метилтрансферазы RsmD с 30S субчастицами - 20-30 нМ; константа Михаэлиса - 3 нМ, каталитическая константа -0,03 мин"1.

3. Константа диссоциации комплекса метилтрансферазы RsmD с кофакторами SAM - 0,58 цМ, SAH - 2,5 цМ; с ингибитором синефунгипом - 5,0 цМ.

4. Активный центр метилтрансферазы RsmD необычно устойчив к мутациям: мутации F130S, РР128-129АА, D58A, D58A/PP128-129AA не подавляют активность фермента, только тройная мутация PPF128-130AAS инактивирует фермент.

5. Константы диссоциации комплексов кофактора SAM с активными мутантами метилтрансферазы RsmD: РР128-129АА - 0,55 цМ, D58A - 0,37 цМ.

6. Константы Михаэлиса и каталитические константы комплексов 30S субчастиц с мутантами метилтрансферазы RsmD: D58A — 0,2 |iM и 0,05 мин'1; РР128-129АА - 5,0 нМ и 0,01 мин'1; D58A/PP128-129AA - 0,1 цМ и 0,038 мин'1 соответственно.

7. При связывании метилтрансферазы RsmD с 30S субчастицами нуклеотидные остатки А968, А969, С970 16S рРНК экранируются от действия модифицирующих реагентов и РНКаз.

8. Метилтрансфераза RsmD может использовать алкинильное производное SAM (пент-2-ен-4-инил8-аденозилгомоцистеин) в качестве донора алкинильного радикала и переносить его на экзоциклическую аминогруппу нуклеотида G966 16S рРНК в составе 30S субчастицы, не метилированной по этому остатку.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. П. В. Сергиев, И. А. Остерман, И. В. Прохорова, М. В. Нестерчук, О. В. Сергеева, А. Я. Головина, И. Я. Демина, М. А. Рогова, М. В. Серебрякова, В. М. Говорун, А. А. Богданов, О. А. Донцова. Опыт изучения методами системной биологии функциональной роли ферментативной модификации бактериальной рибосомы. (2011). Биоорганическая химия. Том 37, №1; стр. 81-90.

2. P. V. Sergiev, A. Y. Golovina, I. V. Prokhorova, О. V. Sergeeva, I. A. Osterman, M. V. Nesterchuk, D. E. Burakovsky, A. A. Bogdanov, 0. A. Dontsova. Modifications of ribosomal RNA: from enzymes to function. In Ribosomes structure, function, and dynamics. Eds. Rodnina, M.V., Wintermeyer, W., Green, R., 2011, Springer, Wien, NewYork. p. 97- И1.

3. О. В. Сергеева, Д. Е. Бураковский, П. В. Сергиев, Т. С. Зацепин, М. Томкувиене, С. Климасаускас, О. А. Донцова. Использование рРНК-метилтрансфераз для сайт-специфического введения флуоресцентной метки. (2012). Вести. Моск. Ун-та. Том 53, №2; стр. 126-132.

4. О. В. Сергеева, П. В. Сергиев, О. А. Донцова. Изучение влияния комплексов метилтрансфераз с рибосомной РНК на структуру рибосом. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "ЛОМОНОСОВ-2007". (2008). стр. 298. Москва, Россия.

5. О. V. Sergeeva. «Chemical probing - method of the complex structure analysis«. Offspring-Meeting of the International Research Training Group. (2008). p. 12. Москва, Россия.

6. О. V. Sergeeva, P. V. Sergiev, Y. A. Ordabayev, O. A. Dontsova. Complex of rRNA methyltransferase with its substrate. Ribosome-2010. (2010). p. 214. Оривиетто, Италия.

7. П. В. Сергиев, И. А. Остерман, И. В. Прохорова, М. В. Нестерчук, О. В. Сергеева, А. Я. Головина, И. Я. Демина, М. А. Галямина, М. В. Серебрякова, О. А. Донцова. РНК-метилтрансферазы Escherichia coli. От поиска генов к изучению регуляторных путей. Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». (2011). стр. 92. Новосибирск, Россия.

Подписано в печать:

16.02.2012

Заказ № 6658 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

61 12-2/278

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет Кафедра химии природных соединений

СЕРГЕЕВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА рРНК МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ RSMD Escherichia coli

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент Сергиев П.В.

Москва-2012

Содержание

Список сокращений 5

Введение 6

Литературный обзор 7

Морфологические элементы рибосомы 7

Нуклеолитический процессинг рРНК 10

Сборка 30S субчастицы рибосомы 11

Рибосомные белки 30S субчастицы 11

Интермедиаты сборки 30S субчастицы 14

Процесс сборки центрального домена 16S рРНК 16

Кинетика связывания рибосомных белков с 30S субчастицей 17

Сборка 50S субчастицы рибосомы 18

Рибосомные белки 50S субчастицы 18

Интермедиаты сборки 50S субчастицы 19

Белки, участвующие в сборке рибосомы 21

Хеликазы 22

Шапероны 24

GTPasbi 26

Модификация нуклеотидов рРНК 29

Модификация 16S рРНК 30S субчастицы 30

т62А1518иш62А1519 31

m2G966 и т5С967 33

Модификация 16SрРНК, происходящая после сборки 30S субчастицы 36

m7G527 36

m2G1207 37

m4Cml402 38

m3U1498 40

m5C1407 41

m2G1516 42

Модификация 23SрРНК 50S субчастицы 42 ¥516 в 30S субчастице; ¥746, ¥955, ¥1911, т3¥1915, ¥1917, ¥2457,

¥2504, ¥2580, 2604, ¥2605 в 50S субчастице 43

m'G745 47

m5U747 и m5U1939 48

m6A1618 49

m2G1835 51

m5C1962 52

m6A2030, m7G2069, C*2501, D2449 52

Gm2251, Cm2498, Um2552 53

m2G2445 55

m2A2503 56

Ферментативная модификация рибосомных белков 57

Результаты и обсуждение 60

Постановка задачи 60 Образование стабильного комплекса между метилтрансферазой RsmD

и 30S субчастицами рибосомы 61

Комплексообразование в присутствии мРНК, тРНКи факторов инициации 64

Применение RsmD для сайт-специфического введения флуоресцентной метки 61 Определение константы диссоциации комплекса 30S субчастиц

с метилтрансферазой RsmD 13

Ферментативные свойства метилтрансферазы RsmD 74

Химический и ферментативный пробинг комплекса RsmD с 30S субчастщами 16

Изучение активного центра метилтрансферазы RsmD с помощью мутагенеза 80

Заключение 88

Материалы и методы 90

Реактивы 90

Буферы и растворы 90

Биопрепараты 93

Выделение 30S, 70S субчастиц рибосом wt и ARsmD 93

Введение мутаций в метилтрансферазу RsmD 95

Трансформация клеток Е. coli 95 Выделение рекомбинантных белков RsmD и мутантов PPF128-130AAS, F130S,

РР128-129АА, D58A, D58A/PP128-129AA 96

Электрофоретическое разделение белков в SDS-ПААГ 91 Выделение комплекса метилтрансферазы RsmD с 30S ArsmD

методом гель-фильтрации 98 Выделение комплекса метилтрансферазы RsmD с 30S ArsmD

методом ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 99

Иммуноблотинг 100 Определение степени связывания тРНК с рибосомами

с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры 101

Комплексообразование в присутствии факторов инициации, тРНК, мРНК 101

In vitro алкинилирование 102

Реакция Хьюсгена 102

In vitro инициация трансляции 103

Определение константы диссоциации комплекса 30S субчастиц с RsmD 103 Определение кинетических свойств метилтрансферазы RsmD

и мутантов РР128-129АА, D58A, D58A/PP128-129AA 104 Математическая обработка данных,

полученных с помощью счетчика радиоактивности 104

Химический и ферментативный пробинг комплекса RsmD с 30S субчастицами 105 Измерение скорости роста штаммов wt и ArsmD в условиях повышенной экспрессии

метилтрансфреразы RsmD и ее неактивного мутанта PPF128-130AAS 107

Изотермическое калориметрическое титрование 108

Выводы 109

Список литературы 110

Список сокращений

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомная РНК

мРНК - матричная РНК

тРНК - транспортная РНК

IF1, IF2, IF3 - факторы инициации 1, 2, 3

SAM - S-аденозилметионин

SAH - S-аденозилгомоцистеин

Sin - синефунгин

н. - нуклеотиды

Ka - константа диссоциации

Кт - константа Михаэлиса

kcat - каталитическая константа

G - гуанин или остаток гуанидиловой кислоты

GTP - гуанозинтрифосфорная кислота

АТР - аденозинтрифосфорная кислота

IPTG - изопропилтиогалактопиранозид

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

1. Введение

Рибосома представляет собой нуклеопротеид, основной функцией которого является синтез белка, согласно информации, закодированной в мРНК. Рибосомная РНК содержит множество модифицированных нуклеотидов, которые располагаются преимущественно в функционально важных частях рибосомы. Наиболее часто встречающимися модифицированными нуклеотидами рРНК является псевдоуридин и нуклеотиды, метилированные по различным положениям гетероциклического основания или по 2' положению рибозы. Модификацию рРНК бактерий производят специализированные ферменты - рРНК-метилтрансферазы и псевдоуридинсинтазы, каждая из которых специфична для одного или нескольких модифицированных нуклеотидов. Модификация рРНК происходит на разных стадиях сборки субчастиц рибосомы, существуют ферменты, специфичные к рРНК, промежуточным интермедиатам сборки и уже собранным субчастицам. Функция некоторых модифицированных нуклеотидов заключается в обеспечении устойчивости бактерий к антибиотикам за счет изменения участка связывания антибиотика в рибосоме. Функция модифицированных нуклеотидов в рРНК Escherichia coli, не придающих клетке устойчивость к антибиотикам, изучена слабо. Отчасти это связано с недостатком данных о ферментах, осуществляющих модификацию рРНК. Знание о генах, кодирующих тот или иной фермент, дает возможность получать штаммы клеток, лишенных любой конкретной модификации, что может помочь в определении функции модифицированного нуклеотида, а также уточнить некоторые стадии сборки рибосомы. Изучение рРНК метилтрансфераз важно для понимания механизмов появления антибиотикорезистентности. Во многих случаях, появление устойчивых к антибиотикам штаммов обусловлено появлением специфических метилтрансфераз, модифицирующих рибосомную РНК. Также возможно, что некоторые рРНК метилтрансферазы, не несущие функцию защиты от антибиотиков, служат природным резервуаром для эволюции генов устойчивости к антибиотикам.

В рамках данной диссертационной работы охарактеризованы ферментативные свойства метилтрансферазы RsmD, модифицирующей гуанозин, расположенный в Р-участке рибосомы.

2. Литературный обзор

2.1 Морфологические элементы рибосомы

Рибосомы представляют собой самую распространенную молекулярную машину клетки, основной функцией которой является синтез белков. Поэтому основная масса клеточной РНК представляет собой именно рибОсомную PI 1К.

Рибосома состоит из двух неравных субъединиц, которые легко обратимо диссоциируют на малую (рис. 1 А) и большую (рис. 1 Б) субъедипины. У кишечной палочки (Escherichia coli) они называются 5GS и 30S в соответствии со своими коэффициентами седиментации [ 1 ]. Размер полной нрокарнотической рибосомы составляет 20 х 17 х 17 им. Малая рибоеомная субчастица имеет длину около 23 им, а ширину - 12 им.

А

Б

Центр альиый протуберанец

Рис. 1. Основные морофологические элементы малой 3QS [2] (А) и большой 50S (Ь) субчастиц рибосомы. Су б частицы представлены так. как если бы на малую субчастицу смотрели со стороны большой, а на большую со стороны малой. В. Кристаллическая структура 70S рибосомы Е. coli. Малая субчастица слева. 16S рРНК показана синим, S-белки показаны оранжевым. Большая субчастица справа. 23S рРНК доказана красным. 5S покачана розовым, L-белки - зеленым.

Основной компонент малой субчастицы рибосомы - 16S рибосомная PliK (рРНК) длиной 1542 нуклеотида (рис. 2 А). Помимо 16S рРНК в состав малой субчастицы входит 21 белок (от S1 до S21. в порядке увеличения своей электрофоретической Подвижности) [3]. В состав большой субчастицы входит две рРНК - 23S, состоящая ич 2904 нуклеотидов, и 5S - из 120 нуклеотидов (рис. 2Б). а также 33 белка (L1-L36).

А

cTteXJOO ЦЕНТРАЛЬНЫЙ М ДОМЕН Е? ?

Я-

Б

III ДОМЕН

IV ДОМЕН

5 -КОНЦЕВОЙ ь~ ДОМЕН

ГЛАВНЫЙ 3 -КОНЦЕ НОИ ДОМЕН

МАЛЫЙ 3 -КОНЦЕВОЙ ДОМЕН

5S рРНК

I ДОМЕН

Рис. 2. А. Схема вторичной структуры 16S рРНК [4]. Обозначены домены вторичной структуры, В. Схема вторичной структуры 23S рРНК и 5S рРНК [5].

Различные домены вторичной структуры 16S рРНК соответствуют крупным пространственным блокам 30S субчастицы. 5'-концевой домен 16S рРНК образует '"тело" и "плечо", центральный домен образует "платформу", содержащую последовательность анти Шайн-Дальгарно, главный 3'-концевой домен - "[олову", а матый З1-концевой домен 16S рРНК располагается на границе с 50S субчастицей и входит в состав "тела" 30S субчастицы. В составе 30S субчастицы также можно отметить ту ннель, в ходе трансляции содержащий 3'-концевую часть мРНК, "шпору", образованную спиралью 6 16S рРНК, и "шею", образованную спиралью 28 16S рРНК. Глобулярные домены рибосомных белков располагаются на периферии субчастицы с цитоплазмагической стороны, обращенной от 50S субчастицы. Белки, обращенные к 50S субчастицс. например, S12 и SI3, имеют важное функциональное значение. Основная функция 3QS субчастицы - считывание

15 пространственной структуре большой субчастицы можно выделить характерные выступы: L1 и L7/L12 "пальцы" и центральный протуберанец, образованный 5S рРНК и белками L5. L18 и L25. Кроме того, в структуре 50S субчастицы видна ложбина, в глубине которой располагается каталитический пептидилтранеферазный центр рибосомы (ПТЦ). От ПТЦ, к цитоплазматической стороне 50S субчастицы идет сквозной туннель, служащий для выхода синтезируемого пептида. Длина туннеля около 100 Á, диаметр около 25 Л и он может вмещать пептид длиной 40 аминокислот. Обе субчастицы образуют тРНК

мРНК.

связывающие участки А, Р и Е, через которые последовательно проходят тРНК при синтезе полипептида [6].

2.2 Нуклеолитический процессинг рРНК

Все три рРНК (168, 238, синтезируются в виде одного транскрипта (рис. 3) [7]. Созревание транскрипта, образование локальных элементов вторичной структуры и связывание первых рибосомных белков начинается до окончания процесса транскрипции рРНК. Одновременно с этим происходит ферментативная модификация определенных нуклеотидов.

Рис. 3. rrnB оперон. Отмечены промотеры рРНК и тРНК - PI и Р2, соответствующие терминаторы - Т1 и Т2, сайты процессинга РНКазы III (III), РНКазы G (G), РНКазы Е (Е), РНКазы Р (Р), РНКазы Т (Т), и некоторых неизвестных РНКаз.

Первой эндорибонуклеазой, которая разрезает рРНК транскрипт, является РНКаза III [8]. Она отделяет предшественник рРНК от тРНК. В процессе транскрипции последовательности, фланкирующие 16S и 23 S рРНК, образуют структуру двойной спирали. Именно этот элемент узнается РНКазой III [9]. В итоге образуются предшественники 16S рРНК (17S рРНК), 23S рРНК, 5S рРНК (9S) и нескольких тРНК. Для образования 16S рРНК РНКазы Е, G и еще несколько неизвестных удаляют 115 нуклеотидов с 5'-конца и 33 нуклеотида с 3'-конца. Созревание 23S рРНК инициируется РНКазой III. После вырезания РНКазой III, 23S рРНК содержит 3 или 7 лишних нуклеотидов на 5'-конце и 7 или 9 - на 3' [10]. Конечный процессинг 5'-конца выполняется пока неизвестным ферментом, а за созревание 3'-конца отвечает

экзорибонуклеаза РНКаза Т. После разрезания РНКазой III, с 3'-стороны от предшественника 5S рРНК остаются одна или две последовательности тРНК. 5'—конец тРНК процессируется с помощью РНКазы Р, что приводит к образованию 9S рРНК, включающую 84 дополнительных нуклеотида на 5'-конце и 42 - на 3'-конце [11]. Финальный процессинг осуществляется экзорибонуклеазами РНКазой Т и пока неизвестной РНКазой (рис. 4) [12, 13, 14].

РНКаза G

РНКаза Е

РНКаза «I

16S

t 33». 4

? РНКаза III

■ 5' J' ■

■ 3' 5' -

f iff РНКаза Т РНКаза 111

?РНКазаЕ

РНКаза Ш

5S

/

РНКаза Т

4

РНКаза Е РНКаза 111

Рис. 4. Созревание рРНК. Изначально транскрибируемая в виде одного предшественника, рРНК разрезается несколькими РНКазами. Знак «?» обозначают сайт разрезания до сих пор не идентифицированного фермента, зеленые стрелки обозначают сайты разрезания, оранжевым цветом обозначены финальные продукты [14].

2.3 Сборка 305 субчастицы рибосомы

2.3.1 Рибосомные белки ЗОБ субчастицы

Сборка рибосомы представляет собой сложный и точно координированный процесс. Основные этапы включают: а) транскрипцию, процессинг и модификацию рРНК,

б) синтез и модификацию рибосомных белков, в) сворачивание (фолдинг) рРНК и рибосомных белков, г) связывание рибосомных белков с рРНК, д) связывание дополнительных белков, участвующих в сборке. Многие из этих этапов выполняются одновременно [15].

Белки, взаимодействующие с I6S рРНК классифицируют несколькими способами. Можно группировать белки но области рРНК, с которой они связываются: с 5'-концевым доменом рРНК, 3'-концевым доменом илицентральпым доменом рРНК. Второй тип классификации - по очередности связывания: белки, связывающиеся непосредственно с рРНК - первичные; связывающиеся после первичных - вторичные; третичные - белки, связывающиеся последними [16].

Для описания процесса формирования 30S субчастицы была предложена схема, основанная на экспериментах Иомуры по реконструкции 30S субчастицы в опытах in vitro (рис. 5). Эта схема не учитывает множества факторов, действующих в живой клетке.

А

/домен Центральный домен з' домен

$17 820

S7

Г

56:S18 S9 S13 S19 2"

/

Рис. 5. Карта Номуры [17]. 1° - первичпо связывающиеся белки, 2° - вторично связывающиеся белки, 3° -третично связывающиеся белки.

К белкам, связывающимся непосредственно с 168 рРНК, относятся 54, 87, 88. 815, 817 и 820. Комплекс белка 84 с 5"-концевой частью 168 рРНК может образоваться при пониженной температуре. Далее, как было показано с помощью опытов по химической

модификации рРНК (футиринтингу), при нагревании происходят конформационные изменения комплекса, которые укрепляют взаимодействие белка с РНК, а также способствуют связыванию вторичного белка 816 и третичного белка 812 (рис, 5). Вели на1реть 84 и 168 рРНК по-отдельности, а затем смешать, то коиформациошше изменения не произойдут и следующие белки не свяжутся (рис. 6).

!—i€

tf a "S

\ \

ч I W

ai*" ^O

Jf»'

53

t* '/

Г W

l

ss

Й

Л ÇÎÎ,»

T ' ^ :

_ tu

Ч Л .-Î

© *

m

/2 *

s

i

• и ° 1

. я s

¡¡['Л.щ

С

//штГ .1

Рис. 6. Взаимодействия рибосомных белков с рРНК. 2Е) представление 168 рРНК. цветом выделены белки и нуклеотиды, находящиеся с ними и контакте, серым цветом обозначены нуклеотиды, взаимодействующие с несколькими рнбосомными белками.

Исследование связывания остальных первичных белков оыявило подобную иерархию взаимодействия. Связывание S17 и S20 с 5'-доменом 16S рРНК не является температурЯО—зависимым, тогда как для взаимодействия S8 и S15 с центральным доменом методом химического пробинга были показаны некоторые отличия, проявляющиеся при нагревании образца [18]. Взаимодействие 87 с 3'-доменом происходит так же, как и для

S4 с 5*—Доменом. Можно сделать вывод, что одна из ролей первичных белков -обеспечение определенной koi[формации РНК. позволяющей связывать последующие белки. Сайт-направленный гидроксмл-радикальный пробинг окружения белка S15 показал, что хотя S8 не является посредником для его связывания, он все равно влияет на организацию РНК вокруг S15. Подобные исследования окружения S20 показали, что его контакты с 5'-доменом рРНК образуются в начале сборки, а взаимодействие с 3'-минорным доменом (спираль Н44-нуклеотид С1399) уже после этого, соответственно с направлением сборки от 5"-конца к 3'-концу [19J.

2.3.2 Промежуточные интермедиаты сборки 30S субчастицы

При реконструкции 30S субчастицы рибосомы in vitro было замечено образование двух промежуточных интермедиатов, образующихся при разной температуре. При низких температурах от 0°С до )5°С можно зафиксировать интермедиат (RI), состоящий из 16S рРНК и 15 рибосомпых белков, которые осаждаются в соответствии с коэффициентом седиментации 21S-22S, Реконструкция 30S субчастицы не может быть закончена, пока температура не повысится до 40°С. При 40°С дополнительные белки взаимодействуют с интермедиатом RI, происходят конформанионные изменения и образуется интермедиат RI* с коэффициентом седиментации 25S-26S. К интермедиату RI* присоединяются оставшиеся белки и образуется активная 30S субчастица (рис. 7) [20|.

21S-22S 2S5-26S

+ R'30 Rijo* -^->305

+6 белков

Рис. 7. Схема сборки 30S субчастицы in vitro.

Достаточно сложно изучать сборку 30S субчастицы те vivo, так как интермедиаты сложно зафиксировать при нормальных условиях роста клеток. Интермедиаты можно обнаружить с помощью сахарозного градиента цитоплазмы клеток штаммов, имеющих холод о- или термочувствительные мутации в компонентах рибосомы. В штаммах дикого типа интермедиаты можно зафиксировать методом импульсного мечения радиоактивными и стабильными изотопами. Таким образом, in vivo были обнаружены два интермедиата для 30S субчастиц (pl30S и p230S) (рис. 8) [21, 15].

pi 6S pPHK

+ 10 бел кое

21S 30S > p,30S -p230S

+ 1 1 белков

>30S

Рис. 8. Схема сборки 30S субчастицы in vivo.

Процесс сборки рибосомных субчастиц in vitro протекает медленнее, чем ш vivo. Сборку in vitro можно ускорить добавлением факторов, участвующих в сборке рибосом в клетке, таких, как Era, Rim M. RiniP. Era является СПРазой массой 34 кДа. на N-конце которой находится домен, отвечающий за связывание GTP, а на С-конце - за связывание РНК. Предполагается, что Era может выполнять функции шаперопа при биогенезе рРНК, RimM - белок, состоящий из р-доменов, связывается как с рРНК. так и с рибосомным белком S19. RimP. белок массой 35 кДа. взаимодействует с рибосомными белк�