Поиск РНК-модифицирующих ферментов Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

00461455Э

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ГОЛОВИНА Анна Янковна

ПОИСК РНК-МОДИФИЦИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ Escherichia coli

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

- 2 ДЕК 2010

Москва-2010

004614559

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, доцент Сергиев Петр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Демидкина Татьяна Викторовна

кандидат биологических наук Дмитриев Сергей Евгеньевич

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Защита состоится 30 ноября 2010 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 29 октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Во всех живых организмах молекулы РНК различных типов подвергаются постгранскрипционным модификациям с помощью огромного количества различных ферментов. Только к концу прошлого века количество известных природных модификаций четырех основных рибонуклеотидов превысило сотню.

Среди всех классов РНК транспортные РНК наиболее подвержены различным модификациям. Около 11%, 14% и 17% всех нуклеотидов тРНК являются модифицированными в Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae и в клетке животных, соответственно. Эти модификации обеспечивают химическое и функциональное разнообразие тРНК, а также улучшают их структурную стабильность. Жизненную необходимость данных модификаций доказывает очень большое количество генов в геноме, кодирующих ферменты, которые ответственны за них: в некоторых бактериальных геномах представленность таких генов достигает 1%. Метилирование, одна из самых распространенных модификаций, способствует правильному сворачиванию тРНК, улучшая не только процесс аминоацилирования определенными аминоацил-тРНК синтетазами, но и специфичность декодирования в процессе трансляции.

Рибосомная РНК также содержит множество модификаций, сосредоточенных преимущественно в функционально значимых регионах. 16S рРНК E.coli насчитывает 11, a23S рРНК E.coli - 25 различных посттранскрипционно модифицированных нуклеотидов. Подавляющее большинство модификаций этих нуклеотидов составляют псевдоуридинилирование и метилирование. Известно, что некоторые модификации в рибосомной РНК могут участвовать в механизмах устойчивости клетки к антибиотикам и в процессах взаимодействия рибосомы с растущей пептидной цепью, повышать эффективность связывания рибосомы с аминоацилированной тРНК, способствовать ассоциации субчастиц, а также принимать участие во многих других жизненно важных для клетки процессах.

Функции многих модифицированных нуклеотидов бактериальных РНК до сих пор остаются неясными, и зачастую это связано с отсутствием каких-либо данных о ферментах, осуществляющих их. Знание о генах, кодирующих тот или иной фермент, дает возможность «включать» и «выключать» в клетке соответствующую модификацию, и такие манипуляции позволяют собрать исчерпывающую информацию о ее функции.

Альтернативный способ изучения влияния модифицированных нуклеотидов на функционирование рибосомы заключается в мутагенезе модифицируемых остатков.

Мутации нуклеотида-мишени, как правило, приводят к отсутствию модификации. Такие мутации часто детальны для клетки. Гены мутантных рРНК можно экспрессировать только одновременно с генами рРНК дикого типа. В связи с этим, для дальнейшего изучения свойств рибосом, несущих летальные мутации в рРНК, возникает необходимость создать способ выделения рибосом, несущих в себе соответствующую летальную мутацию из смеси с рибосомами дикого типа.

В данной работе было проведено исследование функций трех гипотетических метилтрансфераз Е, coli: YibK, YafE и YfiC, а также разработан метод аффинного выделения 30S субчастиц рибосомы К coli.

Цель работы.

1. Проверить, являются ли белки YibK, YafE и YfiC Е. coli метилтрансферазами и если являются, то установить субстраты для них;

2. Определить функциональную роль найденных модифицированных нуклеотидов

РНК;

3. Разработать способ выделения 30S субчастиц рибосом Е. coli методом аффинной хроматографии;

4. Проверить, в какой степени введение аффинного довеска в 16S рРНК влияет на функциональную активность 30S субчастиц in vivo и in vitro.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы было показано, что белки YibK и YafE являются SAM-зависимыми метилтрансферазами и метилируют рРНК Е. coli в составе собранных субчастиц, выделенных как из нокаутных штаммов, так и из штамма дикого типа. Это может означать, что и YibK, и YafE активны в особых для клетки условиях, а при культивировании клеток в богатой среде при 37°С модификации рРНК, за которые отвечают эти ферменты, отсутствуют. Установлено, что и YibK, и YafE катализируют перенос метальной группы на 16S рРНК в составе 30S субчастицы рибосомы. Предположение о вероятной метилирующей активности хотя бы одной из исследуемых метилтрансфераз в отношении нуклеотида m2G1516 16S рРНК было опровергнуто.

Установлено, что метилтрансфераза YfiC модифицирует только малые РНК, выделенные из экстракта клеток штамма AyfiC. В Е. coli осталось только несколько модифицированных нуклеотидов тРНК, для которых соответствующие ферменты до сих пор не идентифицированы. Подтверждено, что среди малых РНК только TPHKiVal подвергается метилированию белком YfiC in vitro. Было известно, что тРНК]Уа| содержит

модифицированный нуклеотид m6A37, для которого не было описано модифицирующего фермента. На полученных путем транскрипции in vitro тРНК было показано, что тРНКз11", содержащая аналогичную ш6А37 модификацию наряду с другим объемным заместителем на N6 атоме азота, не является субстратом для YfiC. Таким образом, мы показали, что YfiC не может участвовать в формировании посттранскрипционной модификации m6t6A37 в тРНКзТЬг, а исследуемая метилтрансфераза метилирует только один субстрат в Е. coli: TPHKiVal. Кроме того, методом MALDI MS было окончательно установлено и подтверждено, что модификация TPHKiVal, осуществляемая метилтрансферазой YfiC, представляет собой метилирование экзоциклического атома азота нуклеотида А37.

Было установлено, что для образования модификации ш6А37 в TPHKiVal в клетке достаточно только гена yfiC, а его расположение в геномном контексте не играет принципиальной роли. Путем MALDI MS анализа тРНК,Уа| из штамма AyfiC, метилированной in vitro, показали, что наличие только белка YfiC необходимо и достаточно для осуществления модификации.

Показано, что в богатых и бедных средах, в диапазоне от 30 до 42°С скорость роста штаммов дикого типа и штамма AyfiC практически не различаются, и это означает, что модификация ш6А37 не дает конкурентных преимуществ в стандартных для клетки условиях.

Исследование способности клеток к выживанию в стрессовых условиях показало, что наличие метилирования шбА37 в TPHKiVal повышает жизнеспособность клеток при осмотическом и окислительном стрессах. Первое, по всей видимости, связано со способностью тРНК, обладающей дополнительной гидрофобной группой, более эффективно связываться с рибосомой в условиях повышения ионной силы внутри бактериальной клетки при осмотическом стрессе. Окислительный стресс, по всей видимости, приводит к ужесточению требований к эффективности взаимодействий в процессе трансляции, в связи с чем отсутствие метилирования нуклеотида А37 в TPHKiVal понижает жизнеспособность клетки в данных условиях. Вероятно, одной из функций модификации т6А37 в TPHKiVal является устойчивость бактериальной клетки к осмотическому и окислительному стрессам.

Кроме установления субстратов для трех перечисленных метилтрансфераз Е. coli, также был разработан метод аффинного выделения 30S субчастиц рибосом, содержащих аптамер к сгрептавидину в спирали 33а 16S рРНК. Это позволяет исследовать влияние различных мутаций на функцию и структуру рибосомы, в том числе и содержащих

мутации модифицируемых нуклеотидов. Различными методами было показано, что 30S субчастицы, несущие аптамер, не нарушают функциональную активность рибосомы in vitro и in vivo. Метод аффинного выделения 30S субчастиц рибосомы с помощью стрептавидин-сефарозы является наиболее быстрым и эффективным среди всех известных на сегодняшний день методов выделения мутантных рибосомных субчастиц, а активность полученных рибосом сравнима с активностью рибосом дикого типа.

Известно, что большинство антибиотиков воздействует на рибосому, и механизм устойчивости к ним зачастую связан со способностью бактериальных ферментов метилировать некоторые нуклеотиды рРНК. Создание методологии поиска ферментов, отвечающих за данные модификации, может иметь важное практическое значение для разработки новых антибиотиков. Также важным будет создание простого и эффективного метода аффинного выделения рибосомных субчастиц. Он облегчит исследование свойств рибосом, несущих любую летальную мутацию.

Апробация работы. Материалы диссертации многократно обсуждали на семинарах лаборатории химии рибонуклеопротеидов кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им. Ломоносова; докладывали на конференциях: XIV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» МГУ имени Ломоносова. Москва, Россия. Апрель 11-14, 2007; XV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» МГУ имени Ломоносова. Москва, Россия. Апрель 8- 12, 2008; ЕМВО Conference Series on Protein Synthesis and Translational Control. Хайдельберг, Германия. Сентябрь 9-13,2009; Ribosomes 2010. Орвието, Италия. Май 3-7,2010

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 46 рисунками. Библиографический указатель включает 160 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В подавляющем большинстве случаев в качестве кофактора - донора метальной группы - метилтрансферазы используют S-аденозилметионин (SAM). SAM-зависимые метилтрансферазы делят, согласно способу укладки активного центра, на 5 структурных

классов: I-V. Каждый из этих классов имеет определенную a/ß топологию, которая формирует SAM-связывающий карман. Большинство SAM-зависнмых метилтрансфераз принадлежат к классу I (семейство RFM), для которого характерна укладка Россмана, представляющая собой большое количество параллельных ß-листов, соединенных а-спиралями. Последний ß-тяж ориентирован антипараллельно по отношению к остальным. Подавляющее большинство метилтрансфераз, модифицирующих азотистые основания РНК, принадлежат к классу I. Остальные РНК-метилтрансферазы относят к классу IV, который также называют SPOUT-семейством РНК-метилтрансфераз. Представителям этого семейства свойственна укладка из шести параллельных ß-тяжей, три из которых образуют уникальную и редко встречающуюся структуру - прочный трилистный узел. Другая особенность метилтрансфераз класса IV заключается в расположении активного сайта: он находится на поверхности соприкосновения двух мономеров димерного белка, причем каждый из мономеров вносит вклад в связывание с кофактором. На сегодняшний день известны кристаллические структуры некоторых SAM-зависимых РНК-метилтрансфераз из обоих семейств: как класса I, так и IV. Показано, что представители одного класса при связывании кофактора принимают схожую информацию.

На основании знаний о характерных мотивах метилтрансфераз I и IV классов было выявлено большое количество гипотетических метилтрансфераз Е. coli, информация о которых содержится в базе данных Pfam. Из этого списка мы выбрали 3 гипотетические метилтрансферазы: YibK, YafE и YfiC.

Гипотетический белок YibK Я coli состоит из 157 аминокислот и предположительно обладает РНК-связывающей и РНК-метилирующей активностью. Согласно базе данных Pfam, YibK Е. coli принадлежит семейству SpoU рРНК-метилтрансфераз, которое, наряду с родственным ему семейством SPOUT, входит в клан "a/ß-узел". Как правило, метилтрансферазы из этого клана катализируют перенос метильной группы на 2'-гидроксигруппу рибозы, однако известны ферменты Е. coli из данного клана, способные метилировать азотистые основания. Например, метилтрансфераза YggJ ответственна за модификацию нуклеотида m3U1498 в 16S рРНК, а YbeA - за т3¥1915 в 23S рРНК. Учитывая вышеперечисленные данные, мы ожидали найти субстрат гипотетической метилтрансферазы YibK Е. coli в рибосомной РНК. Известно, что в рибосоме осталось только 3 метилированных нуклеотида, для которых до сих пор не идентифицированы соответствующие метилтрансферазы: m2G1516 в 16S рРНК и m6A2030, m7G2069 в 23S рРНК. Кроме того, нет однозначных данных о модификации нуклеотида 2501 в 23 S рРНК.

Существует также вероятность того, что некоторые метилтрансферазы активны только в особых для клетки условиях (например, при стрессе), поэтому соответствующие им модификации могут быть до сих пор неизвестны вовсе.

Белок YafE Е. coli имеет длину 207 аминокислот, и остатки 2-96 формируют домен, характерный семейству "метилтрансфераза_11". Белки данного семейства являются SAM-зависимыми метилтрансферазами и имеют укладку Россмана.

YfiC - белок, состоящий из 245 аминокислот, - принадлежит к семейству MTS (малодоменные метилтрансферазы), которое входит в клан белков с укладкой Россмана. Согласно базе данных Pfam, белок YfiC должен обладать метилтрансферазной активностью, предположительно тбА метилтрансферазной активностью. В Е. coli осталось только две модификации т6А в РНК (т6А2030 23S рРНК и т6А37 TPHKiVal), за которые были ответственны неизвестные ферменты. Метилтрансферазную активность белка YfiC по отношению именно к этим двум нуклеотидам мы стали в первую очередь проверять.

Для того, чтобы установить субстраты белков YibK, YafE и YfiC, мы использовали штаммы, в которых соответствующие гены были инактивированы, и тестировали метилирующую активность рекомбинантных гипотетических метилтрансфераз по отношению к разным компонентам клеток этих штаммов.

1. Поиск субстратов метилтрансфераз YibK, YafE и YfiC

Нокаутные штаммы AyibK, Ayqß и AyfiC, были выращены в среде LB при 37°С, причем заметной разницы в скорости роста штаммов по сравнению с диким типом не наблюдалось. Для осуществления функциональных тестов были выделены белки YibK, YafE и YfiC, содержащие Кэб-довески на С-концах. Скорость роста штамма pYibK, несущего плазмиду с геном белка YibK, была заметно ниже скорости роста остальных штаммов-продуцентов и клеток дикого типа.

Лизаты клеток AyibK, AyafE и AyfiC разделяли на рибосомные (осадок) и S100 (супернатант) фракции методом ультрацентрифугирования, а затем половину каждой фракции депротеинизировали фенолом. В результате фракционирования лизата получали рибосомы, рибосомные РНК, малые РНК и РНК-белковые фракции, лишенные рибосом. Полученные фракции обрабатывали соответствующими рекомбинантными белками

(У1ЬК, УаЯВ или УйС) в присутствии радиоактивно-меченного 8-аденозил-Ь-[метил-3Н]метионина ([3Н]-8АМ). Радиоактивность очищенных от избытка метки образцов детектировали с помощью сцинтилляционного счетчика.

1.1. Исследование метилирующей активности YibK и YafE

В результате реакции с соответствующими метилтрансферазами in vitro мы обнаружили, что метилированию подвергаются только рРНК в составе собранных субчастиц, выделенных как из нокаутных штаммов, так и из штамма дикого типа (рисунок 1). Можно сделать вывод, что и YibK, и YafE являются SAM-зависимыми метилтрансферазами, а также оба белка ответственны за метилирование рибосомных субчастиц Е. coli в нестандартных для клетки условиях.

Чтобы убедиться в том, что субстратами этих метилтрансфераз действительно являются рРНК, мы провели аналогичное ш vitro метилирование рибосом из штамма-нокаута и из дикого типа, и выделенные из них рРНК, меченные тритием, нанесли на 6% ПААГ. Гель обработали реагентом Amplify, а сигнал детектировали с помощью рентгеновской пленки. На рисунке 2 представлены результаты такого метилирования рибосом дикого типа и из штамма, нокаутного по гену vibK. Очевидно, что субчастицы обоих штаммов подвергаются метилированию

метилтрансферазой YibK.

cpnt 30000

■ белки

25000 ■ ■ тРНК рРНК

20000 ■ рибосомы

15000 i 1

10000

5000

0 1 ¿WhK-YlbK 1 \\1*YlbK _ 1____к AvafE+Yoft MTnafL

Рисунок 1. Распределение радиоактивной метки во фракциях штаммов \yibK. Дуп/Е и WT, обработанных белками УШК (столбцы «ЛуШК+Уй)К». «\¥Т+У1ЬК») и Уа® (столбцы «Ауа/Е+Уат», «\¥Т+Уаге»)

[»РПКДп'ЬА -V4hK

Рисунок 2. Радиоавтограф электрофореза рРНК. выделенных из рибосом штаммов АуШК и метилированных белком У'.ЬК в присутствии [ЛН]-8АМ.

Для того, чтобы определить, какая именно рРНК является мишенью для метилтрансфераз YibK и YafE, рибосомы фракционировали на субчастицы в сахарозном градиенте методом ультрацентрифугирования, а затем провели in vitro метилирование 30S и 50S субчастиц по отдельности. В качестве положительного контроля были выбраны 30S субчастицы рибосом из штамма, нокаутного по гену уже известной рРНК-метилтрансферазы yhhF, обработанные метилтрансферазой YhhF в присутствии радиоактивного SAM. Контрольные 16S рРНК (Юмкг) были взяты в 10-кратном недостатке по отношению к исследуемым 16S рРНК (0,1мг). Эксперимент показал, что и YibK, и YafE катализируют перенос метильной группы на 16S рРНК в составе 30S субчастицы рибосомы (рисунок 3). Небольшую интенсивность сигнала можно объяснить тем, что рекомбинантные белки YibK и YafE не подвергали диализу (в связи с их склонностью к агрегации), и поэтому возможно присутствие значительного количества эндогенного SAM, снижающее эффективность реакции метилирования in vitro. На радиоавтографе также видно, что метилирование рРНК дикого типа не прошло в обоих случаях. Это может означать, что в данном случае для протекания реакции необходимо присутствие обеих субчастиц рибосомы.

Как уже говорилось выше, на сегодняшний день известна только одна модификация 16S рРНК Е. coli, для которой до сих пор не идентифицирован соответствующий фермент, - m2G1516. Чтобы проверить причастность хотя бы одной из исследуемых метилтрансфераз к метилированию этого нуклеотида, мы провели изучение модификации нуклеотида G1516 16S рРНК методом обратной транскрипции. Как оказалось, YibK и YafE не участвуют в модификации нуклеотида nrG1516. Вероятно, и YibK, и YafE не

Рисунок 3. Радиоавтограф полиакриламидного геля, содержащего продукты электрофоретического разделения рРНК, выделенной из 30S и 50S субчастиц штаммов AyibK, AyafE и штамма дикого типа (WT), метилированных белками YibK. и YafE в присутствии [5H]-SAM. «Yhhf+30S AyhhF» -контрольные, меченные тритием 16S рРНК. Стрелками обозначены дорожки, в которых детектировалась радиоактивность.

катализируют перенос метальной группы на 16S рРНК в тех стандартных условиях выращивания клеток, который был применен в данной работе. Скорее всего, модификации подвергаются нукпеотиды 16S рРНК, для которых пока не описано модифицированное состояние.

1.2. Исследование метилирующей активности YfiC

Открытая рамка считывания Е. coli yfíC кодирует белок, имеющий сходство с известными ш6А метилтрансферазами. Среди остатков шбА, описанных в научной литературе для Е. coli, оставалось два нуклеотида, для которых были неизвестны соответствующие метилирующие ферменты: m6A2030 23S рРНК и mr'A37 тРНК|Уа1 Предварительный поиск субстрата для метилтрансферазы YfiC начинали также с реакции in vitro метилирования различных фракций штамма AyfiC в присутствии рекомбинантного белка YfiC и [3H]-SAM. Оказалось, что добавление YfiC действительно приводит к появлению радиоактивно меченных продуктов, которые обнаружили в S100 фракции (белки и малые РНК) и во фракции, содержащей только малые РНК. Исходя из данных результатов, мы сделали вывод о том, что метилированию подвергается одна или несколько малых РНК, которые входят в состав обеих фракций. Общеизвестно, что все тРНК подвергаются метилированию различных типов, а среди других малых РНК Е. coli не выявлено метилированных нуклеотидов, для которых соответствующий фермент был бы неизвестен. Поэтому мы решили в первую очередь проверить, не служат ли тРНК субстратом для белка YfiC. Для того, чтобы выяснить, какие именно тРНК метилирует белок YfiC, соответствующую фракцию штамма AyfiC инкубировали с белком YfiC и [3H]-SAM. После избавления от избытка [3H]-SAM мы использовали сконструированные нами

биотинилированные олигонуклеотиды,

срт

............................................................................................................................................

160 00 140 00 12000

»00 «Ы. iX . :L¿. . AJ- . «Уа . Ü А

К АедЗ UliS ТпгЛ Olu1 Val2 Vati

I РНК

Рисунок 4. Включение радиоактивных метальных групп в тРНК, выделенные из штаммов АурС (черные столбики) и дикого типа (серые столбики), при обработке метилтрансферазой УйС и [3Н]-БАМ. В качестве контроля (К) использовали результат выделения тРНК без добавления биотинилированного олигонуклеотида.

комплементарные уникальным последовательностям на З'-концах трех типов тРНК Е. coli, несущих модификации: tPHK5Uu (Сш34), тРНКз1"1" (m6t6A37) и тРНК,™ (т6А37). Для перечисленных модифицированных нуклеотидов тРНК пока не было известно ферментов, ответственных за модификацию. Для выделения смесь малых РНК прогревали при 52°С с одним из биотинилированных олигонуклеотидов, а затем выделяли индивидуальные тРНК методом аффинной хроматографии на стрептавидин-сефарозе. В качестве контроля аналогичным способом были выделены тРНК3А'8, тРНК|01и и tphk2val. Проводили элюцию и анализировали наличие включенных в индивидуальные тРНК метальных групп с помощью сцинтилляционного счетчика. На рисунке 4 представлены результаты метилирования шести тРНК из штамма AyfiC. Мы обнаружили, что в данных условиях только tPHK|V°' подвергалась метилированию белком YfiC.

Исходя из того, что в тРНК|Уа| имелась только одна модификация ш6А37, для которой не был найден ответственный за нее фермент, мы сосредоточили особое внимание на этом нуклеотиде. Следовало учесть и тот факт, что тРНКз111' содержит аналогичную модификацию, наряду с более объемным заместителем на том же атоме азота - Ы6-треонилкарбамоил-группой (m6t6A37). Такой заместитель может препятствовать дальнейшему in vitro метилированию аденозина, а значит, предыдущий эксперимент не позволяет дать однозначного ответа о способности YfiC метилировать А37 в тРНК3Т1,г. Чтобы прояснить этот вопрос, мы получили tPHKi а и тРНКз ' путем амплификации их генов и последующей транскрипции in vitro, исключив таким образом формирование любых

постгранскрипционных модификаций тРНК до реакции с YfiC. В качестве контролей выступали выделенные тем же путем tPHK5uu и тРНК2Уа1. После обработки немодифицированных транскриптов тРНК

метилтрансферазой YfiC в присутствии [3H]-SAM

очищенные транскрипты тРНК анализировали на включение трития. Результаты эксперимента

cpm «со

.......... Ш

Ш

.........................I.....................

_....................■........................................

^н____

I — . ■........

LttiS Thrl VA!1 Vftl2

•IPHK

Рисунок 5. Включение радиоактивных метильных групп в тРНК, полученные с помощью in vitro транскрипции, при обработке метилтрансферазой YfiC и [3H]-SAM.

показывают, что только тРНК1Уа1 подвергается метилированию (рис. 5).

Как уже говорилось ранее, ш6А37 - это единственный модифицированный нуклеотид в тРНКЛа|, соответствующий фермент для образования которого не был идентифицирован до настоящей работы. Для того, чтобы подтвердить, что именно нуклеотид А37 служит мишенью УЙС при метилировании тРНК/'1, мы использовали метод МАЬЭ1 масс-спектрометрии. Для анализа использовали тРНКЛ"1, выделенные из клеток дикого типа и клеток штамма АуАС. Образцы тРНК обработали РНКазой Т1, и полученные фрагменты анализировали методом МА1Л)1 МБ. Результаты анализа представлены на рисунке 6а,б.

CACCUCCCt'tmo'UACAAG

н

а) тРНК ! AyfiC

4825 г- Kr-rvcfcw

CACCUCCCtcmo?UACin6AAG

б) тРНК / (AyfiC + pYfiC)

CACCUC CCl'cmo-UACmfAAG

в) тРНК / AyfiC + YRC + SAM

CACCUCCCUcmo'UACm^AAG

Г) ТРНК / VVT

Рисунок 6. MALDI MS-анализ фрагментов tPHKiVbI из (а) штамма AyjiC, (б) штамма дикого типа, (в) штамма AyfiC, несущего плазмиду pCA24YfiC, и (г) штамма AyfiC с последующей обработкой метилтрансферазой YfiC и SAM in vitro.

На рисунке представлена область тяжелых ионов. Фрагменты тРНК получены путем расщепления РНКазой Т1. Соответствующие пику олигонуклеотидные последовательности и их массы отмечены на спектре.

Как мы и ожидали, фрагменты TPHKiVal, содержащие нуклеотид А37, выделенные из штамма дикого типа, оказались на 14 Да тяжелее аналогичных фрагментов из AyfiC штамма. Кроме того, теоретически рассчитанные массы данных олигонуклеотидов в точности совпали с экспериментально полученными. Можно сделать вывод о том, что, в

отличие от tPHKiVí1 из клеток дикого типа, TPHKiVal из штамма AyfiC лишена метильной группы. Известно, что фрагмент tPHKiv"' с последовательностью CACCUCCCUcmo5UACm6AAG содержит единственный метилированный нуклеотид А37. В связи с этим результаты эксперимента однозначно указывают на то, что метилтрансфераза YfiC ответственна за формирование именно модификации ш6А37 в TPHK,v".

Удаление гена yfiC может оказывать влияние на функционирование других опосредованно связанных с ним генов. Поэтому нам необходимо было исключить вероятность того, что ген yfiC является только лишь посредником в процессе метилирования, удаление которого блокирует действие другой метилтрансферазы. Для этой цели мы провели in vivo комплементацию штамма AyfiC плазмидой pCA24YfiC, несущей ген YfiC. Из данного штамма-продуцента выделили TPHKiVal методом аффинной хроматографии, подвергли расщеплению РНКазой Т1, и полученные олигонуклеотиды анализировали методом MALDI MS (рис. 6в). Результаты анализа показали, что метилирование tPHKiv°' из штамма с экзогенной экспрессией yfiC происходит точно так же, как и в случае tPHKiV°' из дикого типа. Если собрать полученные данные воедино, можно сделать вывод о том, что только ген yfiC необходим для формирования метилирования нуклеотида А37 tPHKiv"' в клетке, и его положение в геноме не играет существенной роли.

Требовалось удостовериться в том, что для осуществления реакции метилирования не только необходим, но и достаточен белок YfiC. Для этого из штамма AyfiC выделили tPHKi™ и обработали ее рекомбинантным белком YfiC в присутствии SAM. После расщепления РНКазой Т1 полученные фрагменты тРНК анализировали методом MALDI MS (рис. бг). Как и ожидалось, исследуемый фрагмент тРНК/"1 содержал дополнительную метильную группу, по сравнению с аналогичным фрагментом тРНК из AyfiC штамма. Можно с уверенностью утверждать, что для формирования модификации ш6А37 в TPHKiVal необходимо участие только белка YfiC.

Влияние модификации ш6А37 tPHKj™ на способность клеток Е. coli к

выживанию в благоприятных условиях

Для изучения влияния метилирования ш6А37 тРНК/"1 на жизнеспособность клетки мы провели оценку скорости роста клеток дикого типа и штамма ÁyfiC в богатой среде LB и минимальной среде М9 при 30°С, 37°С и 42°С. Сравнение времен удвоения (рис. 7) не

выявило существенных

различий в скорости роста штаммов даже в минимальной среде М9.

Для более точного выявления различий в способности клеток к выживанию мы провели конкуренцию штаммов \\Т и Ау/гС в том же наборе условий. Равное количество клеток двух штаммов выращивали

совместно, ежедневно разбавляя клетки в 10ОО раз. Даже после 80 удвоений соотношение клеток не превышало десятка, что указывает на отсутствие влияния

метилирования т6А37 в тРНК1¥а' на жизнеспособность клетки в стандартных для нее условиях.

11 ■

. . I ,___

I

Рисунок 7. Времена удвоения клеток дикого типа (серые столбики) и штамма АурС (черные столбики) в средах ЬВ и М9 при 30°С. 37°С и 42°С.

Влияние ш6А37 в тРНК)Уа1 на способность клеток Е. coli к выживанию в стрессовых условиях

Чтобы понять, какие преимущества может давать бактерии модификация ш6А37 в тРНК]Уа1, клетки штаммов дикого типа и ЛуАС в течение 2 часов подвергали различным стрессовым условиям: нагреванию до 50°С, осмотическому стрессу в 50% растворе сахарозы; кислотному стрессу, вызванному уксусной (50 мМ, рН 4.5) и фосфорной (100 мМ, рН 1.5) кислотами и окислительному стрессу, индуцированному 5 мМ раствором пероксида водорода. Для

Рисунок 8. Падение титра клеток в логарифмической шкале для штаммов дикого типа (серые столбики) и Ау^С (черные столбики) в различных стрессовых условиях.

оценки чувствительности к перечисленным условиям вычисляли падение титра клеток, произошедшее во время пребывания в стрессовых условиях (рис. 8).

Результаты эксперимента показали, что модификация т6А37 в тРНК/2' не оказывает влияния на способность клеток к выживанию при повышенной температуре и в сильнокислой среде, содержащей фосфорную кислоту.

В тоже время штамм, лишенный гена yflC, оказался более чувствителен к осмотическому обезвоживанию, которое обеспечивает раствор 50% сахарозы, , по сравнению со штаммом дикого типа. Из литературы известно, что при осмотическом стрессе бактерия накапливает значительное количество ионов калия в цитоплазме, таким образом повышая ионную силу раствора внутри клетки. Это может увеличить эффективность связывания макромолекул, содержащих в области контакта гидрофобные группировки. По всей видимости, метилирование нуклеотида А37 способствует наиболее прочному взаимодействию ангикодона TPHKiVal с соответствующим кодоном мРНК и, как следствие, повышению эффективности белкового синтеза в клетке при осмотическом стрессе.

Способность к выживанию при окислительном стрессе (в среде 5 мМ Н2О2) также снижается у бактерий штамма AyfiC, хоть и не так значительно. В этих условиях клетке необходимо оперативно синтезировать новые белки взамен поврежденных окислением и, по всей видимости, бактерии дикого типа способны к более эффективному белковому синтезу.

Наиболее затруднительно объяснить результаты, полученные при исследовании чувствительности клеток к повышенному содержанию уксусной кислоты в среде. Известно, что данный вид стресса приводит к понижению внутриклеточного pH, что, вероятно, препятствует нормальному прохождению каких-либо процессов в клетке, в которых задействована метилированная тРНК/*'.

Антикодон TPHKiVal представляет собой последовательность cmo5UAC, и ему наиболее соответствуют два из четырех известных валиновых кодона: GUA и GUG. Мы рассчитывали обнаружить некую закономерность, с которой данные кодоны распределены в бактериальных белках. Однако биоинформатический анализ встречаемости кодонов среди всех генов Е. coli показал, что кодон GUA распространен как в малоэкспрессируемых генах, так и в генах сильно экспрессируемых. Не удалось выявить корреляции частоты использования кодона GUA с функцией продуктов

экспрессии генов в клетке. Кодон GUG, который менее специфично связывается с антикодоном cmo5UAC, немного чаще встречается в генах, экспрессируемых больше среднего, однако закономерности в его распределении в белках различных функций также не было выявлено.

Результаты проведенного протеомного анализа с помощью двумерного электрофореза показали, что белковые профили штаммов дикого типа и AyfiC совпадают. Следовательно, синтез большинства белков в клетках, лишенных гена yfiC, не нарушен в стандартных условиях.

Таким образом, мы предполагаем, что основными функциями модификации тбА37 в тРНКЛ21 могут являться снижение чувствительности бактерии к осмотическому и окислительному стрессам и, возможно, регуляция синтеза некоторых белков в нестандартных условиях.

2. Разработка методики аффинного выделения 30S субчастиц

рибосомы

Рибосомная РНК является одной из важнейших мишеней для РНК-метилтрансфераз, и, как известно, основные модификации рРНК находятся в ключевых областях рибосомы. Для изучения функциональной роли модифицированных нуклеотидов рРНК необходимо бывает произвести замену или удаление одного или нескольких исследуемых нуклеотидов, или произвести иные манипуляции с рРНК. Такие мутации рРНК зачастую оказываются летальными для клетки. Существует ряд методов, которые позволяют получать рибосомы, несущие летальные мутации. К примеру, возможно синтезировать мутантную рРНК транскрипцией in vitro, а затем реконструировать рибосому, используя набор рибосомных белков. Полученные в результате такой процедуры рибосомы имеют невысокую активность и по своей структуре не соответствуют рибосомам, собранным в клетке. Получение мугантных рибосом в чистом виде возможно только при регулируемой экспрессии генов мутантных рРНК, в то время как жизнь клетки поддерживается генами рРНК дикого типа. В дальнейшем, необходимо разделять рибосомы, содержащие мутации, и рибосомы дикого типа. Известен метод аффинного выделения рибосом с помощью белка оболочки фага MS2. Применение этого метода приводит к получению рибосом с высокой активностью, однако необходимость предварительного аффинного выделения белка MS2 делает метод трудоемким. Ранее в нашей лаборатории был

ACCGACC GGGCCGG

gugaa

G С

G С

С G U U

предложен и налажен метод аффинного выделения 50S субчастиц рибосом Е. coli с помощью стрептавидин-сефарозы, который позволил вводить различные мутации в 23 S рРНК, и выделять мутантные 50S субчастицы, не имеющие структурных и функциональных отличий от 50S субчастиц дикого типа, кроме введенных мутаций.

В настоящей работе был разработан метод аффинного выделения 30S субчастиц

бактериальной рибосомы, несущей аптамер к стрептавидину в спирали 33а в 16S рРНК Е. coli (рис. 9а). Из литературы известно, что спираль 33а 16S рРНК является вариабельной в 16S рРНК бактерий, и даже ее удаление не приводит к потере функциональной активности рибосомы. Кроме того, она находится на поверхности рибосомы, не участвует во взаимодействиях с рибосомными белками и с большой субчастицей (рис. 96). Эти особенности спирали 33а делают ее идеальным объектом для встраивания в нее стрептавидин-связывающего аптамера.

Аптамер к стрептавидину был встроен между нуклеотидами 1031 и 1032 16S рРНК. Была создана плазмида pStr33, несущая ген тагированной 16S рРНК, под контролем лямбда Pl промотора. После трансформации этой плазмидой штамма РОР2136, имеющего термочувствительный белок-репрессор фага X, индукцию

Рисунок 9. Аптамер к стрептавидину, и а) его вторичная структура, б) его расположение в сконструированных в нашей лаборатории рибосомах. Светло-зеленым цветом обозначена 16S рРНК, темно-зеленым - рибосомные белки малой субчастицы. Синим цветом обозначена 50S субчастица рибосомы, красным - спираль 33а 16S рРНК, в которую был введен аптамер.

Удлинение нраймера

гермнннруюшем смесью: ^ «. «л.

ddCTP, (JATP. dCTP, dTTP

stop WT-I6S (+6 и.о.) 4 M4*H**i

AUGUGCCUUC £ £ s-^-' ^ *

stop a i" <o' ирпчывки Ы> ~ ~ f i / /,• j

CG<- fj z $ *

CCGGOCUAGC > } С t s

Str-l6S (+2 и.о.)

Рисунок 10. (Слева) схема удлинения олигонуклеотида, комплементарного области 1032-1048 168 рРНК дикого типа и 16Б рРНК со стрептавидин-связывающим аптамером. (Справа) радиоавтораф электрофореза

экспрессии гена мутантной 16Б продуктов удлинения олигонуклеотида в процессе

выделения 305 субчастиц рибосомы со стрептавидин-

рРНК производили среды до 42°С.

нагреванием связывающим аптамером.

Из штамма-продуцента рибосом, несущих стрептавидин-связывающий аптамер, с помощью ультрацентрифугирования выделяли смесь рибосом, а затем проводили связывание рибосомных субчастиц со стрептавидин-сефарозой в буфере для диссоциации рибосом и многократно промывали сорбент буфером. Элюцию проводили в буфере, содержащем 25 шМ биотина Специфичность выделения контролировали путем удлинения олигонуклеотида, комплементарного нуклеотидам 1032-1048 16S рРНК, с добавлением терминирующей смеси (рис. 10). Из результатов эксперимента видно, что выделенные субчастицы рибосом, несущих аптамер, полностью отделены от субчастиц дикого типа. Выход полученных тагированных 30S субчастиц рибосом составлял около 10% от общего количества рибосом в клетке, что составляет примерно 30% от всего количества субчастиц с аптамером, присутствующих в бактерии.

Необходимо было убедиться, что вставка аптамера в 30S субчастицу не вызывала никаких дефектов по сравнению с 30S субчастицами дикого типа. Для контроля за функциональной активностью

полученные 30S субчастицы, несущие аптамер к стрептавидину (30S str), реассоциировали с избытком 50S субчастиц дикого типа, и при фракционировании в градиенте сахарозы наблюдали пики, характерные для рибосом дикого типа. Это означает, что выделенные методом аффинной хроматографии 30S субчастицы рибосомы обладают способностью ассоциировать с 50S субчастицами.

Для проверки функциональной активности исследуемых 30S субчастиц in vivo плазмидой, кодирующей все рибосомные гены, включая ген 16S рРНК

а)

■я S.

к 1 2 1 2

Но.шоразмерная мРНК *"**

Инн una горний комплекс _» 4

Комплекс с тРНК в а- н Р- сайтах

Рисунок 11. Свойства 305 ей- субчастиц, а) радиоавтограф электрофореза продуктов тоулринта. В дорожке «К» находится продукт обратной транскрипции мРНК в отсутствие рибосом. Дорожки «1» демонстрируют инициаторные комплексы, образованные субчастицами 305 бН и 305 дикого типа, дорожки «2» - последующее связывание Ьуз-тРРПОЕР-ТиЮТР. б) Кривые титрования 305 5Сг и 305 дикого типа (305\УТ) инициаторной £Ме1-тРНК1Ш1

(со встроенным в ее последовательность стрептавидин-связывающим аптамером)

трансформировали штамм AVS69009, в котором все хромосомные рДНК гены были инактивированы. Полученный штамм был жизнеспособен. Его время удвоения в среде LB при 37°С составило 74±9 минут. Это сопоставимо с временем удвоения такого же штамма, несущего на плазмиде гены рРНК дикого типа (время удвоения 66±7 мин). Возможность клеток, располагающих только 16S рРНК со встроенным в нее аптамером, к размножению означает то, что выделяемые нами 30S субчастицы безусловно активны in vivo.

Для сравнения функциональной активности полученных 30Sstr субчастиц, с 30S субчастицами дикого типа, было проведено их связывание в инициаторный комплекс с мРНК и fMet-TPHK™* (рис 11а). Добавление к инициаторному комплексу 50S, второй тРНК и элонгационных факторов приводило к характерному сдвигу сигнала на 1 нуклеотид, как в случае рибосом дикого типа, так и в случае рибосом, содержащих аптамер. Формирование комплексов определяли путем удлинения радиоактивно меченного олигонуклеотида, комплементарного З'-концу мРНК. При этом обратная транскриптаза останавливает удлинение праймера, достигая связанной с мРНК рибосомы. Титрование инициаторной fMet-TPHK"4'01, меченной тритием, комплексов полученных 30Sstr субчастиц с мРНК также показало лишь незначительные различия в активности полученных 30S субчастиц.

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что активность выделенных методом аффинной хроматографии 30Sstr субчастиц высока и сравнима с активностью 30S субчастиц рибосомы дикого типа.

ВЫВОДЫ

1. Метилтрансферазы YafE и YibK Е. coli способны метилировать 30S субчастицы рибосомы in vitro, но модификация нуклеотида m2G1516 16S РНК не осуществляется белками YafE и YibK

2. Белок YfiC осуществляет SAM-зависимое метилирование нуклеотида А37 tPHKiV"' Е. coli с образованием остатка т6А.

3. Метилирование тРНК|Уа| с образованием ш6А37 способствует выживанию клеток при осмотическом и окислительном стрессе.

4. Вставка стрептавидин-связывающего аптамера в спираль 33а 16S рРНК позволяет выделять функционально-активные 30S субчастицы в чистом виде с помощью аффинной хроматографии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Anna Y. Golovina, Petr V. Sergiev, Andrey V. Golovin, Marina V. Serebryakova, Irina Demina, Vadim M. Govorun & Olga A. Dontsova. The yfiC gene of E. coli encodes an adenine-N6 methyltransferase that specifically modifies A37 of tRNAiVal (cmo5UAC). RNA. 2009. 15(6): 1134-41.

2. Golovina AY, Bogdanov AA, Dontsova OA, Sergiev PV. Purification of 30S ribosomal subunit by streptavidin affinity chromatography. Biochimie. 2010. 92(7):914-7.

3. Малашко А. Я., Сурдина А. В. Структура и свойства рибосомного белка S7 из стрептомицетов XIV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» Московский Государственный Университет имени Ломоносова. Москва, Россия. Апрель 11-14,2007

4. Головина А.Я., Сергиев П.В. Изучение механизма транслокации на бактериальной рибосоме. XV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» Московский Государственный Университет имени Ломоносова. Москва, Россия, Апрель 8 - 12,2008.

5. Anna Golovina, Andrey Golovin, Alexey Bogdanov, Olga Dontsova, Petr Sergiev, Marina Serebryakova, Irina Demina, Vadim Govorun. The yfiC gene of E. coli encodes an adenine-N6 methyltransferase that specifically modifies A37 of tRNAiVal (cmo5UAC). EMBO Conference Series on Protein Synthesis and Translational Control. Heidelberg, Germany, September 9-13, 2009. Poster Abstracts, p. 132.

6. Petr V. Sergiev, Irina V. Prohorova, llya A. Osterman, Olga V. Sergeeva, Anna Y. Golovina, Mikhail V. Nesterchuk, Dmitry E. Burakovsky, Pohl Mil on, Irina V. Demina, Marina V. Serebryakova, Vadim M. Govorun, Alexey A. Bogdanov, Olga A. Dontsova. Ribosome modification in regulatory networks of bacteria. Ribosomes 2010. Orvieto, Italy, May 3-7, 2010. Poster Abstracts, p. 138.

Подписано в печать:

26.10.2010

Заказ № 4378 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы.

1.1. Разнообразие модификаций РНК в клетке

1.2. РНК-метилтрансферазы бактерий: их структура и функции.

1.2.1. т5С и m5U метилтрансферазы

1.2.2. N-метилтрансферазы т6А метилтрансферазы m2G метилтрансферазы т'G метилтрансферазы

1.2.3. SPOUT-суперсемейство метилтрансфераз

1.2.4. SAM-радикальное суперсемейство метилтрансфераз

Нуклеиновые кислоты были открыты еще в конце 19 века, и сейчас ни один исследователь не может представить себе существование живой клетки без РНК. В 50-х годах 20 века группа русских учёных под предводительством Белозерского и Спирина показала, что большую часть РНК клетки составляет рибосомная РНК, обеспечивающая синтез всех белков. Не менее важное место в жизнедеятельности живых организмов занимают транспортная, матричная и другие малые'РНК. Для осуществления нормального функционирования, поддержания необходимой структуры, эффективности и специфичности взаимодействия со своими мишенями многие РНК (в особенности рРНК и тРНК) претерпевают множественные химические превращения, затрагивающие, как правило, азотистые основания и рибозу в нуклеотидах. За данные превращения ответственно огомное количество разнообразных специфических ферментов, причем в некоторых бактериальных геномах представленность их генов достигает 1% [1]. Жизненную необходимость модификаций РНК доказывает также существование различных механизмов контроля качества в клетке, которые приводят к быстрой деградации тРНК при её неполной модификации [2,3].

Функции многих модифицированных нуклеотидов бактериальных РНК до сих пор остаются неясными, и зачастую это связано с отсутствием каких-либо данных о ферментах, осуществляющих их. Знание о генах, кодирующих тот или иной фермент, дает возможность «включать» и «выключать» в клетке соответствующую модификацию, и такие манипуляции позволяют собрать исчерпывающую информацию о ее функции.

Альтернативный способ изучения влияния модифицированных нуклеотидов на функционирование рибосомы заключается в мутагенезе модифицируемых остатков. Мутации нуклеотида-мишени, как правило, приводят к отсутствию модификации. Такие мутации часто детальны для клетки. Гены мутантных рРНК можно экспрессировать только одновременно с генами рРНК дикого типа. В связи с этим, для дальнейшего изучения свойств рибосом, несущих летальные мутации в рРНК, возникает необходимость создать способ выделения рибосом, несущих в себе соответствующую летальную мутацию из смеси с рибосомами дикого типа.

Данная работа посвящена исследованию функций трех гипотетических метилтрансфераз Е. coli: YibK, YafE и YfiC, а также разработке удобного инструментария для выделения 30S субчастиц, которые могут содержать любые мутации, необходимые для изучения нуклеотидов, особо важных для функционирования рибосомы Е. coli.

1. Обзор литературы

4. Выводы

1. Метилтрансферазы YafE и YibK Е. coli способны метилировать 30S субчастицы рибосомы in vitro, но модификация нуклеотида m2G1516 16S РНК не осуществляется белками YafE и YibK

2. Белок YfiC осуществляет SAM-зависимое метилирование нуклеотида A3 7 тРНК(Уа' Е. coli с образованием остатка т6А.

3. Метилирование TPHKiVal с образованием ш6А37 способствует выживанию клеток при осмотическом и окислительном стрессе.

4. Вставка стрептавидин-связывающего аптамера в спираль 33а 16S рРНК позволяет выделять функционально-активные 30S субчастицы в чистом виде с помощью аффинной хроматографии.

1. Bjôrk G.R., Ericson J.U., Gustafsson C.E., Hagervall T.G., Jônsson Y .H., Wikstrôm P.M. Transfer RNA modification. Annu. Rev. Biochem. (1987). 56: cc. 263-287.

2. Kadaba S., Krueger A., Trice T., Krecic A.M., Hinnebusch A.G., Anderson J. Nuclear surveillance and degradation of hypomodified initiator tRNAMet in S. cerevisiae. Genes Dev. (2004). 18: cc. 1227-1240.

3. Alexandrov A., Chernyakov I., Gu W., Hiley S.L., Hughes T.R., Grayhack E.J., Phizicky E.M. Rapid tRNA decay can result from lack of nonessential modifications. Mol. Cell. (2006). 21: cc. 87-96.

4. Rozenski J., Crain P.P., McCloskey J.A. The RNA Modification Database: 1999 update. Nucleic Acids Res. (1999). 27: cc. 196-197.

5. Sprinzl M., Horn C., Brown M., Ioudovitch A., Steinberg S. Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes. Nucleic Acids Res. (1998). 26: cc. 148-153.

6. Dunin-Horkawicz S., Czerwoniec A., Gajda M.J., Feder M., Grosjean H., Bujnicki J.M. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. Nucleic Acids Res. (2006). 34: cc. D145-149.

7. Andersen N.M., Douthwaite S. YebU is a m5C Methyltransferase Specific for 16 S rRNA Nucleotide 1407. Journal of Molecular Biology. (2006). 359: cc. 777-786.

8. Tran E., Brown J., Maxwell E.S. Evolutionary origins of the RNA-guided nucleotide-modiflcation complexes: from the primitive translation apparatus? Trends Biochem. Sci. (2004). 29: cc. 343-350.

9. Lafontaine D.L., Tollervey D. Birth of the snoRNPs: the evolution of the modification-guide snoRNAs. Trends Biochem. Sci. (1998). 23: cc. 383-388.

10. Kiss T. Small nucleolar RNA-guided post-transcriptional modification of cellular RNAs. EMBO J. (2001). 20: cc. 3617-3622.

11. Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. Ribosomal RNA guanine-(N2)-methytransferases and their targets. Nucleic Acids Res. (2007). 35: cc. 2295-2301.

12. Cantoni G.L. Biological methylation: selected aspects. Annu. Rev. Biochem. (1975). 44: cc. 435-451.

13. Demirci H., Larsen L.H.G., Hansen T., Rasmussen A., Cadambi A., Gregory S.T., Kirpekar F., Jogl G. Multi-site-specific 16S rRNA methyltransferase RsmF from Thermus thermophilus. RNA. (2010). 16: cc. 1584-1596.

14. Anantharaman V., Koonin E.V., Aravind L. SPOUT: a class of methyltransferases that includes spoU and trmD RNA methylase superfamilies, and novel superfamilies of predicted prokaryotic RNA methylases. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2002). 4: cc. 71-75.

15. Michel G., Sauvé V., Larocque R., Li Y., Matte A., Cygler M. The structure of the RlmB 23S rRNA methyltransferase reveals a new methyltransferase fold with a unique knot. Structure. (2002). 10: cc. 1303-1315.

16. Ahn H.J., Kim H., Yoon H., Lee B.I., Suh S.W., Yang J.K. Crystal structure of tRNA(ml G37)methytransferase: insights into tRNA recognition. EMBO J. (2003). 22: cc. 2593-2603.

17. Urbonavicius J., Qian Q., Durand J.M., Hagervall T.G., Bjôrk G.R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO J. (2001). 20: cc. 4863-4873.

18. Christian T., Evilia C., Williams S., Hou Y. Distinct origins of tRNA(mlG37) methyltransferase. J. Mol. Biol. (2004). 339: cc. 707-719.

19. Purta E., van Vliet F., Tkaczuk K., Dunin-Horkawicz S., Mori H., Droogmans L., Bujnicki J. The yfhQ gene of Escherichia coli encodes a tRNA:Cm32/Um32 methyltransferase. BMC Molecular Biology. (2006). 7: cc. 23.

20. Goto-Ito S., Ito T., Ishii R., Muto Y., Bessho Y., Yokoyama S. Crystal structure of archaeal tRNA(m( 1 )G37)methyltransferase aTrm5. Proteins. (2008). 72: cc. 1274-1289.

21. Pôsfai J., Bhagwat A.S., Pôsfai G., Roberts R.J. Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res. (1989). 17: cc. 2421-2435.

22. Agarwalla S., Kealey J.T., Santi D.V., Stroud R.M. Characterization of the 23 S ribosomal RNA m5U1939 methyltransferase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. (2002). 277: cc. 8835-8840.

23. Madsen C.T., Mengel-Jorgensen J., Kirpekar F., Douthwaite S. Identifying the methyltransferases for m(5)U747 and m(5)U1939 in 23S rRNA using MALDI mass spectrometry. Nucleic Acids Res. (2003). 31: cc. 4738-4746.

24. Kealey J.T., Gu X., Santi D.V. Enzymatic mechanism of tRNA (m5U54)methyItransferase. Biochimie. (1994). 76: cc. 1133-1142.

25. Yusupov M.M., Yusupova G.Z., Baucom A., Lieberman K., Earnest T.N., Cate J.H.D., Noller II.F. Crystal Structure of the Ribosome at 5.5 A Resolution. Science. (2001). 292: cc. 883-896.

26. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.B., Steitz T.A. The Complete Atomic Structure of the Large Ribosomal Subunit at 2.4 A Resolution. Science. (2000). 289: cc. 905-920.

27. Liu M., Douthwaite S. Resistance to the macrolide antibiotic tylosin is conferred by single methylations at 23S rRNA nucleotides G748 and A2058 acting in synergy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2002). 99: cc. 14658-14663.

28. Hansen L.H., Mauvais P., Douthwaite S. The macrolide-ketolide antibiotic binding site is formed by structures in domains II and V of 23S ribosomal RNA. Mol. Microbiol. (1999). 31:cc. 623-631.

29. Xiong L., Shah S., Mauvais P., Mankin A.S. A ketolide resistance mutation in domain II of 23S rRNA reveals the proximity of hairpin 35 to the peptidyl transferase centre. Mol. Microbiol. (1999). 31: cc. 633-639.

30. Gu X., Ivanetich K.M., Santi D.V. Recognition of the T-arm of tRNA by tRNA (m5U54)-methyltransferase is not sequence specific. Biochemistry. (1996). 35: cc. 11652-11659.

31. Alian A., Lee T.T., Griner S.L., Stroud R.M., Finer-Moore J. Structure of a TrmA-RNA complex: A consensus RNA fold contributes to substrate selectivity and catalysis in m5U methyltransferases. Proc Natl Acad Sci USA. (2008). 105: cc. 6876-6881.

32. Kealey J.T., Lee S., Floss H.G., Santi D.V. Stereochemistry of methyl transfer catalyzed by tRNA (m5U54)-methyltransferase--evidence for a single displacement mechanism. Nucleic Acids Res. (1991). 19: cc. 6465-6468.

33. Ivanetich K.M., Santi D.V. 5,6-dihydropyrimidine adducts in the reactions and interactions of pyrimidines with proteins. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. (1992). 42: cc. 127-156.

34. Lee T.T., Agarwalla S., Stroud R.M. A unique RNA Fold in the RumA-RNA-cofactor ternary complex contributes to substrate selectivity and enzymatic function. Cell. (2005). 120: cc. 599-611.

35. Lee T.T., Agarwalla S., Stroud R.M. Crystal Structure of RumA, an Iron-Sulfur Cluster Containing E. coli Ribosomal RNA 5-Methyluridine Methyltransferase. Structure. (2004). 12: cc. 397-407.

36. Sticht H., Rosch P. The structure of iron-sulfur proteins. Progress in Biophysics and Molecular Biology. (1998). 70: cc. 95-136.

37. Reinisch K.M., Chen L., Verdine G.L., Lipscomb W.N. The crystal structure of Haelll methyltransferase convalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. Cell. (1995). 82: cc. 143-153.

38. Foster P.G., Nunes C.R., Greene P., Moustakas D., Stroud R.M. The first structure of an RNA m5C methyltransferase, Fmu, provides insight into catalytic mechanism and specific binding of RNA substrate. Structure. (2003). 11: cc. 1609-1620.

39. Tscherne J.S., Nurse K., Popienick P., Michel H., Sochacki M., Ofengand J. Purification, Cloning, and Characterization of the 16S RNA m5C967 Methyltransferase from Escherichia colij. Biochemistry. (1999). 38: cc. 1884-1892.

40. Gu X.R., Gustafsson C., Ku J., Yu M., Santi D.V. Identification of the 16S rRNA m5C967 Methyltransferase from Escherichia coli"j\ Biochemistry. (1999). 38: cc. 4053-4057.

41. Purta E., O'Connor M., Bujnicki J.M., Douthwaite S. YccW is the m5C methyltransferase specific for 23S rRNA nucleotide 1962. J. Mol. Biol. (2008). 383: cc. 641-651.

42. Reid R., Greene P. J., Santi D.V. Exposition of a family of RNA m(5)C methyltransferases from searching genomic and proteomic sequences. Nucleic Acids Res. (1999). 27: cc. 31383145.

43. Bujnicki J.M., Feder M., Ayres C.L., Redman K.L. Sequence-structure-function studies of tRNA:m5C methyltransferase Trm4p and its relationship to DNA:m5C and RNA:m5U methyltransferases. Nucleic Acids Res. (2004). 32: cc. 2453-2463.

44. Liu Y., Santi D.V. m5C RNA and m5C DNA methyl transferases use different cysteine residues as catalysts. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (2000). 97: cc. 8263-8265.

45. Goedecke K., Pignot M., Goody R.S., Scheidig A.J., Weinhold E. Structure of the N6-adenine DNA methyltransferase Mbull.TaqI in complex with DNA and a cofactor analog. Nat Struct Mol Biol. (2001). 8: cc. 121-125.

46. Newby Z.E.R., Lau E.Y., Bruice T.C. A theoretical examination of the factors controlling the catalytic efficiency of the DNA-(adenine-N6)-methyltransferase from Thermus aquaticus. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (2002). 99: cc. 7922-7927.

47. Hou Y., Perona J.J. Stereochemical mechanisms of tRNA methyltransferases. FEBS Lett. (2010). 584: cc. 278-286.

48. Heiser T.L., Davies J.E., Dahlberg J.E. Change in methylation of 16S ribosomal RNA associated with mutation to kasugamycin resistance in Escherichia coli. Nature New Biol. (1971). 233: cc. 12-14.

49. Schuwirth B.S., Day J.M., Hau C.W., Janssen G.R., Dahlberg A.E., Cate J.H.D., Vila-Sanjurjo A. Structural analysis of kasugamycin inhibition of translation. Nat. Struct. Mol. Biol. (2006). 13: cc. 879-886.

50. O'Farrell H.C., Scarsdale J.N., Rife J.P. Crystal structure of KsgA, a universally conserved rRNA adenine dimethyltransferase in Escherichia coli. J. Mol. Biol. (2004). 339: cc. 337353.

51. Kimura S., Suzuki T. Fine-tuning of the ribosomal decoding center by conserved methyl-modifications in the Escherichia coli 16S rRNA. Nucleic Acids Res. (2010). 38: cc. 13411352.

52. Czerwoniec A., Dunin-Horkawicz S., Purta E., Kaminska K.H., Kasprzak J.M., Bujnicki J.M., Grosjean H., Rother K. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2008 update. Nucleic Acids Res. (2009). 37: cc. D118-121.

53. Ihsanawati, Nishimoto M., Higashijima K., Shirouzu M., Grosjean H., Bessho Y., Yokoyama S. Crystal Structure of tRNA N2,N2-Guanosine Dimethyltransferase Trml from Pyrococcus horikoshii. Journal of Molecular Biology. (2008). 383: cc. 871-884.

54. Purushothaman S.K., Bujnicki J.M., Grosjean H., Lapeyre B. Trmllp and Trmll2p Arc both Required for the Formation of 2-Methylguanosine at Position 10 in Yeast tRNA. Mol Cell Biol. (2005). 25: cc. 4359-4370.

55. Schubert H.L., Blumenthal R.M., Cheng X. Many paths to methyltransfer: a chronicle of convergence. Trends in Biochemical Sciences. (2003). 28: cc. 329-335.

56. Bujnicki J.M., Leach R.A., Debski J., Rychlewski L. Bioinformatic analyses of the tRNA: (guanine 26, N2,N2)-dimethyltransferase (Trml) family. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2002). 4: cc. 405-415.

57. Tscherne J.S., Nurse K., Popienick P., Ofengand J. Purification, cloning, and characterization of the 16 S RNA m2G1207 methyltransferase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. (1999). 274: cc. 924-929.

58. Sergiev P.V., Lesnyak D.V., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. Identification of Escherichia coli m2G methyltransferases: II. The ygjO gene encodes a methyltransferase specific for Gl 835 of the 23 S rRNA. J. Mol. Biol. (2006). 364: cc. 26-31.

59. Lesnyak D.V., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. Identification of Escherichia coli m2G methyltransferases: I. the ycbY gene encodes a methyltransferase specific for G2445 of the 23 S rRNA. J. Mol. Biol. (2006). 364: cc. 20-25.

60. Ogle J.M., Brodersen D.E., Clemons W.M., Tarry M.J., Carter A.P., Ramakrishnan V. Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science. (2001). 292: cc. 897-902.

61. Kubarenko A., Sergiev P., Wintermeyer W., Dontsova O., Rodnina M.V. Involvement of Helix 34 of 16 S rRNA in Decoding and Translocation on the Ribosome. Journal of Biological Chemistry. (2006). 281: cc. 35235 -35244.

62. Agafonov D.E., Kolb V.A., Spirin A.S. Ribosome-associated protein that inhibits translation at the aminoacyl-tRNA binding stage. EMBO Rep. (2001). 2: cc. 399-402.

63. Sunita S., Purta E., Durawa M., Tkaczuk K.L., Swaathi J., Bujnicki J.M., Sivaraman J. Functional specialization of domains tandemly duplicated within 16S rRNA methyltransferase RsmC. Nucleic Acids Res. (2007). 35: cc. 4264-4274.

64. Demirci H., Gregory S.T., Dahlberg A.E., Jogi G. Crystal Structure of the Thermus thermophilus 16 S rRNA Methyltransferase RsmC in Complex with Cofactor and Substrate Guanosine. J Biol Chem. (2008). 283: cc. 26548-26556.

65. Huang L., Hung L., Odell M., Yokota H., Kim R., Kim S. Structure-based experimental confirmation of biochemical function to a methyltransferase, MJ0882, from hyperthermophile Methanococcus jannaschii. J. Struct. Funct. Genomics. (2002). 2: cc. 121-127.

66. Gustafsson C., Persson B.C. Identification of the rrmA gene encoding the 23S rRNA mlG745 methyltransferase in Escherichia coli and characterization of an mlG745-deficient mutant. J. Bacteriol. (1998). 180: cc. 359-365.

67. Maidak B.L., Olsen G.J., Larsen N., Overbeek R., McCaughey M.J., Woese C.R. The Ribosomal Database Project (RDP). Nucleic Acids Res. (1996). 24: cc. 82-85.

68. Takeda H., Toyooka T., Ikeuchi Y., Yokobori S., Okadome K., Takano F., Oshima T., Suzuki T., Endo Y., Hori H. The substrate specificity of tRNA (mlG37) methyltransferase (TrmD) from Aquifex aeolicus. Genes Cells. (2006). 11: cc. 1353-1365.

69. Lee C., Kramer G., Graham D.E., Appling D.R. Yeast mitochondrial initiator tRNA is methylated at guanosine 37 by the Trm5-encoded tRNA (guanine-Nl-)-methyltransferase. J. Biol. Chem. (2007). 282: cc. 27744-27753.

70. Christian T., Hou Y. Distinct determinants of tRNA recognition by the TrmD and Trm5 methyltransferases. J. Mol. Biol. (2007). 373: cc. 623-632.

71. Goto-Ito S., Ito T., Kuratani M., Bessho Y., Yokoyama S. Tertiary structure checkpoint at anticodon loop modification in tRNA functional maturation. Nat. Struct. Mol. Biol. (2009). 16:cc. 1109-1115.

72. Tkaczuk K.L., Dunin-Horkawicz S., Purta E., Bujnicki J.M. Structural and evolutionary bio informatics of the SPOUT superfamily of methyltransferases. BMC Bio informatics. 8: cc. 73-73.

73. Lovgren J.M., Wikstrom P.M. The rlmB gene is essential for formation of Gm2251 in 23 S rRNA but not for ribosome maturation in Escherichia coli. J. Bacteriol. (2001). 183: cc. 6957-6960.

74. Purta E., Kaminska K.H., Kasprzak J.M., Bujnicki J.M., Douthwaite S. YbeA is the m3Psi methyltransferase RlmH that targets nucleotide 1915 in 23S rRNA. RNA. (2008). 14: cc. 2234-2244.

75. Basturea G.N., Rudd K.E., Deutscher M.P. Identification and characterization of RsmE, the founding member of a new RNA base methyltransferase family. RNA. (2006). 12: cc. 426434.

76. Watanabe K., Nureki O., Fukai S., Ishii R., Okamoto H., Yokoyama S., Endo Y., Hori H. Roles of Conserved Amino Acid Sequence Motifs in the SpoU (TrmH) RNA Methyltransferase Family. Journal ofBiological Chemistry. (2005). 280: cc. 10368 -10377.

77. Elkins P.A., Watts J.M., Zalacain M., van Thiel A., Yitazka P.R., Redlak M., Andraos-Selim C., Rastinejad F., Holmes W.M. Insights into catalysis by a knotted TrmD tRNA methyltransferase. J. Mol. Biol. (2003). 333: cc. 931-949.

78. Mallam A.L., Jackson S.E. A comparison of the folding of two knotted proteins: YbeA and YibK. J. Mol. Biol. (2007). 366: cc. 650-665.

79. Moss M., Frey P.A. The role of S-adenosylmethionine in the lysine 2,3-aminomutase reaction. J. Biol. Chem. (1987). 262: cc. 14859-14862.

80. Baraniak J., Moss M.L., Frey P.A. Lysine 2,3-aminomutase. Support for a mechanism of hydrogen transfer involving S-adenosylmethionine. J. Biol. Chem. (1989). 264: cc. 13571360.

81. Ballinger M.D., Frey P.A., Reed G.H. Structure of a substrate radical intermediate in the reaction of lysine 2,3-aminomutase. Biochemistry. (1992). 31: cc. 10782-10789.

82. Ballinger M.D., Reed G.H., Frey P.A. An organic radical in the lysine 2,3-aminomutase reaction. Biochemistry. (1992). 31: cc. 949-953.

83. Eliasson R., Fontecave M., Jörnvall H., Krook M., Pontis E., Reichard P. The anaerobic ribonucleoside triphosphate reductase from Escherichia coli requires S-adenosylmethionine as a cofactor. Proc. Natl. Acad. Sei. Ü.S.A. (1990). 87: cc. 3314-3318.

84. Eliasson R., Pontis E., Fontecave M., Gerez C., Harder J., Jornvall H., Krook M., Reichard P. Characterization of components of the anaerobic ribonucleotide reductase system from Escherichia coli. J. Biol. Chem. (1992). 267: cc. 25541-25547.

85. King D.S., Reichard P. Mass spectrometric determination of the radical scission site in the anaerobic ribonucleotide reductase of Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1995). 206: cc. 731-735.

86. Ugulava N.B., Gibney B.R., Jarrett J.T. Biotin synthase contains two distinct iron-sulfur cluster binding sites: chemical and spectroelectrochemical analysis of iron-sulfur cluster interconversions. Biochemistry. (2001). 40: cc. 8343-8351.

87. Ugulava N.B., Sacanell C.J., Jarrett J.T. Spectroscopic changes during a single turnover of biotin synthase: destruction of a 2Fe-2S. cluster accompanies sulfur insertion. Biochemistry. (2001). 40: cc. 8352-8358.

88. Tse Sum Bui B., Benda R., Schiinemann V., Florentin D., Trautwein A.X., Marquet A. Fate of the (2Fe-2S)(2+) cluster of Escherichia coli biotin synthase during reaction: a Mossbauer characterization. Biochemistry. (2003). 42: cc. 8791-8798.

89. Cicchillo R.M., Lee K., Baleanu-Gogonea C., Nesbitt N.M., Krebs C„ Booker S.J. Escherichia coli lipoyl synthase binds two distinct 4Fe-4S. clusters per polypeptide. Biochemistry. (2004). 43: cc. 11770-11781.

90. Tse Sum Bui B., Lotierzo M., Escalettes F., Florentin D., Marquet A. Further investigation on the turnover of Escherichia coli biotin synthase with dethiobiotin and 9-mercaptodethiobiotin as substrates. Biochemistry. (2004). 43: cc. 16432-16441.

91. Layer G., Moser J., Heinz D.W., Jahn D., Schubert W. Crystal structure of coproporphyrinogen III oxidase reveals cofactor geometry of Radical SAM enzymes. EMBO J. (2003). 22: cc. 6214-6224.

92. Layer G., Kervio E., Morlock G., Heinz D.W., Jahn D., Retey J., Schubert W. Structural and functional comparison of HemN to other radical SAM enzymes. Biol. Chem. (2005). 386: cc. 971-980.

93. Pierrel F., Douki T., Fontecave M., Atta M. MiaB protein is a bifunctional radical-S-adenosylmethionine enzyme involved in thiolation and methylation of tRNA. J. Biol. Chem. (2004). 279: cc. 47555-47563.

94. Chatterjee A., Li Y„ Zhang Y., Grove T.L., Lee M., Krebs C., Booker S.J., Begley T.P., Ealick S.E. Reconstitution of ThiC in thiamine pyrimidine biosynthesis expands the radical SAM superfamily. Nat. Chem. Biol. (2008). 4: cc. 758-765.

95. Frey P.A., Magnusson O.T. S-Adenosylmethionine: a wolf in sheep's clothing, or a rich man's adenosylcobalamin? Chem. Rev. (2003). 103: cc. 2129-2148.

96. Frey P.A., Hegeman A.D., Ruzicka F.J. The Radical SAM Superfamily. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. (2008). 43: cc. 63-88.

97. Booker S.J. Anaerobic functionalization of unactivated C-H bonds. Curr Opin Chem Biol. (2009). 13: cc. 58-73.

98. Toh S., Xiong L., Bae T., Mankin A.S. The methyltransferase YfgB/RlmN is responsible for modification of adenosine 2503 in 23S rRNA. RNA. (2008). 14: cc. 98-106.

99. Yan F., LaMarre J.M., Röhrich R., Wiesner J., Jomaa H., Mankin A.S., Fujimori D.G. RlmN and Cfr are radical SAM enzymes involved in methylation of ribosomal RNA. J. Am. Chem. Soc. (2010). 132: cc. 3953-3964.

100. Xiang Z. Advances in Homology Protein Structure Modeling. Curr Protein Pept Sei. (2006). 7: cc. 217-227.

101. Mallam A.L., Jackson S.E. Folding studies on a knotted protein. J. Mol. Biol. (2005). 346: cc. 1409-1421.

102. Mallam A.L., Jackson S.E. Probing nature's knots: the folding pathway of a knotted homodimeric protein. J. Mol. Biol. (2006). 359: cc. 1420-1436.

103. Gloss L.M. Tying the knot that binds. Structure. (2007). 15: cc. 2-4.

104. Mallam A.L., Jackson S.E. The dimerization of an alpha/beta-knotted protein is essential for structure and function. Structure. (2007). 15: cc. 111-122.

105. Wallin S., Zeldovich K.B., Shakhnovich E.I. The folding mechanics of a knotted protein. J. Mol. Biol. (2007). 368: cc. 884-893.

106. Mallam A.L., Morris E.R., Jackson S.E. Exploring knotting mechanisms in protein folding. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (2008). 105: cc. 18740-18745.

107. Sulkowska J.I., Sulkowski P., Onuchic J. Dodging the crisis of folding proteins with knots. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (2009). 106: cc. 3119-3124.

108. Tuszynska I., Bujnicki J.M. Predicting atomic details of the unfolding pathway for YibK, a knotted protein from the SPOUT superfamily. J. Biomol. Struct. Dyn. (2010). 27: cc. 511520.

109. Jeltsch A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. Chembiochem. (2002). 3: cc. 274-293.

110. Weber A., Kögl S.A., Jung K. Time-dependent proteome alterations under osmotic stress during aerobic and anaerobic growth in Escherichia coli. J. Bacteriol. (2006). 188: cc. 71657175.

111. Blankenborn D., Phillips J., Slonczewski J.L. Acid- and Base-Induced Proteins during Aerobic and Anaerobic Growth of Escherichia coli Revealed by Two-Dimensional Gel Electrophoresis. J Bacteriol. (1999). 181: cc. 2209-2216.

112. Kannan G., Wilks J.C., Fitzgerald D.M., Jones B.D., BonDurant S.S., Slonczewski J.L. Rapid acid treatment of Escherichia coli: transcriptomic response and recovery. BMC Microbiol. 8: cc. 37-37.

113. Almeida C.C., Romao C.V., Lindley P.F., Teixeira M., Saraiva L.M. The role of the hybrid cluster protein in oxidative stress defense. J. Biol. Chem. (2006). 281: cc. 32445-32450.

114. Samaha R.R., Green R., Noller H.F. A base pair between tRNA and 23S rRNA in the peptidyl transferase centre of the ribosome. Nature. (1995). 377: cc. 309-314.

115. Green R., Noller H.F. In vitro complementation analysis localizes 23S rRNA posttranscriptional modifications that are required for Escherichia coli 50S ribosomal subunit assembly and function. RNA. (1996). 2: cc. 1011 -1021.

116. Green R., Noller H.F. Reconstitution of functional 50S ribosomes from in vitro transcripts of Bacillus stearothermophilus 23S rRNA. Biochemistry. (1999). 38: cc. 1772-1779.

117. Khaitovich P., Tenson T., Kloss P., Mankin A.S. Reconstitution of functionally active Thermus aquaticus large ribosomal subunits with in vitro-transcribed rRNA. Biochemistry. (1999). 38: cc. 1780-1788.

118. Leonov A.A., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A. Affinity purification of ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23 S rRNA that affects the translocation. J. Biol. Chem. (2003). 278: cc. 25664-25670.

119. Youngman E.M., Green R. Affinity purification of in vivo-assembled ribosomes for in vitro biochemical analysis. Methods. (2005). 36: cc. 305-312.

120. Youngman E.M., Brunelle J.L., Kochaniak A.B., Green R. The active site of the ribosome is composed of two layers of conserved nucleotides with distinct roles in peptide bond formation and peptide release. Cell. (2004). 117: cc. 589-599.

121. Cochella L., Brunelle J.L., Green R. Mutational analysis reveals two independent molecular requirements during transfer RNA selection on the ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. (2007). 14: cc. 30-36.

122. Bachler M., Schroeder R., von Ahsen U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. (1999). 5: cc. 1509-1516.

123. Afonina E., Chichkova N., Bogdanova S., Bogdanov A. 30S ribosomal subunits with fragmented 16S RNA: a new approach for structure and function study of ribosomes. Biochimie. (1991). 73: cc. 777-787.

124. Miyauchi K., Ohara T., Suzuki T. Automated parallel isolation of multiple species of non-coding RNAs by the reciprocal circulating chromatography method. Nucleic Acids Res. (2007). 35: cc. e24.

125. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained Polyacrylamide gels. Anal. Chem. (1996). 68: cc. 850-858.

126. Kunkel T.A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1985). 82: cc. 488-492.

127. Douthwaite S., Powers T., Lee J.Y., Noller H.F. Defining the structural requirements for a helix in 23 S ribosomal RNA that confers erythromycin resistance. J. Mol. Biol. (1989). 209:cc. 655-665.

128. Ellwood M., Nomura M. Chromosomal locations of the genes for rRNA in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. (1982). 149: cc. 458-468.

129. Shimizu Y., Inoue A., Tomari Y., Suzuki T., Yokogawa T., Nishikawa K., Ueda T. Cellfree translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechno1. (2001). 19: cc. 751-755.

130. NIRENBERG M., LEDER P. RNA CODEWORDS AND PROTEIN SYNTHESIS. THE EFFECT OF TRINUCLEOTIDES UPON THE BINDING OF SRNA TO RIBOSOMES. Science. (1964). 145: cc. 1399-1407.