Структурный анализ комплексов вирусных РНК с компонентами трансляционного аппарата клетки тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский орденов Ленина, Октябрьской революции и Трудового красного знамени Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

О Д ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

., На правах рукописи

УДК.576.858:577.217

КОЛУПАЕВА Виктория Германовна

СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ КОМПЛЕКСОВ ВИРУСНЫХ РНК С КОМПОНЕНТАМИ ТРАНСЛЯЦИОННОГО АППАРАТА КЛЕТКИ.

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидита химических наук

Москва - 1998

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

Защита состоится 9 июня 1998 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.47. по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан апреля 1998 г.

Ученый секретарь

доктор химических наук Шатский И.Н.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Готтих Б.П.

доктор биологических наук Аграновский A.A.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Современная модель механизма инициации трансляции эукариотических мРНК предполагает, что 40S рибосомная субчастица, образовав предварительно комплекс с рядом факторов инициации и инициаторной тРНК, связывается исключительно на 5'-конце мРНК вблизи кэпа (кэп-структура - это 7-метилгуанозин, соединенный с З'-концевым нуклеозидом 5'-5' трифосфатной связью). При этом считают, что вторичная структура 5'-нетранслируемой области РНК расплетается эукариотическими инициаторными факторами eIF4A, eIF4B и eIF4F. Последний состоит из трех субъединиц - eIF4G, eIF4A, eIF4E и ассоциирован с 40S рибосомной субчастицей через фактор инициации eIF3. Первичное узнавание мРНК происходит за счет взаимодействия eIF4E (кэп-связывающей субъединицы фактора eIF4F) с кэп-структурой мРНК. Считается, что далее мРНК "сканируется" 40S рибосомной субчастицей до первого, находящегося в подходящем нуклеотидном контексте, AUG кодона. После этого к ней присоединяется 60S рибосомная субчастица, и образовавшийся 80S комплекс начинает синтез белка.

Эта "сканирующая" модель предъявляет определенные требования к структуре мРНК. Так, подавляющее число эукариотических мРНК моноцистронны, содержат относительно короткие (50-150 нуклеотидов) 5'-нетранслируемые области (НТО) и - единственная объединяющая особенность их 5'-НТО -кэпированы. Инициация трансляции происходит обычно на первом (то есть ближайшем к 5'-концу мРНК) AUG инициаторном кодоне. Такой механизм инициации трансляции называется кэп-зависимым.

Для ряда мРНК, наиболее характерными представителями которых являются две группы вирусных мРНК (пикорнавирусные и пестивирусные), предложен другой - внутренний (кэп-независимый) способ инициации трансляции. 5'-нетранслируемые области мРНК пикорнавирусов не кэпированы, имеют длину от 600 до 1200 нуклеотидов и содержат до 11 AUG триплетов, предшествующих истинному инициаторному AUG кодону. Инициация трансляции таких мРНК происходит в результате кэп-независимого связывания 40S рибосомной субчастицы с IRES (internal ribosome entry зке)-элементом - внутренним участком

5'-НТ0. IRES-элементы разных групп пикорнавирусов имеют длину от 400-450 нуклеотидов, обладают очень развитой вторичной структурой высококонсервативной для различных серотипов вирусов. В настоящее время выделяют три типа вторичных структур для пикорновирусных 5'-нетранслируемых областей: 1) кардио- и афтовирусы, 2) энтеро- и риновирусы, 3) вирус гепатита А. IRES-элементы пестивирусных мРНК также не кэпированы, сильноструктурированы и, в отличии от пикорнавирусов, включают еще 30 нуклеотидов кодирующей последовательности вирусного полипротеина и функционально важный структурный элемент - псевдоузел. Схематически IRES-элементы EMCV (Encephalomyocarditis virus) и CSFV (Classical swine fever virus) изображены на рис.la и 16.

В связи с такой необычной организацией 5'-НТО этих мРНК большой интерес представляет изучение механизма их инициации трансляции. Вторичная и/или третичная структура IRES-элементов абсолютно важна для трансляции пикорнавирусных и пестивирусных мРНК. Белковый синтез этих мРНК обеспечивается трансляционным аппаратом инфицированной клетки млекопитающих, при этом используются канонические факторы инициации (Pestova et а/., 1996, Pestova et at., 1998). Внутренняя инициация трансляции используется и рядом клеточных мРНК, такими как мРНК транскрипционного фактора TFIID, мРНК некоторых факторов роста и шаперонов. Регуляция трансляции этих матриц особенно важна для нормального функционирования клетки. Исследование специфического взаимодействия между структурными элементами 5'-НТО мРНК пикорнавирусов, пестивирусов и трансляционным аппаратом клетки могло бы пролить свет на детали механизма инициации белкового синтеза у кэп-независимых мРНК, которые неизвестны в настоящее время.

Эти исследования несомненно важны для понимания регуляторных процессов на стадии инициации трансляции, нарушение которых тем или иным образом губительно для клетки.

Цель работы.

Как показано в нашей лаборатории Т.В.Пестовой, главную роль в первичном узнавании 5'-НТО РНК EMCV играет инициаторный фактор eIF4G, а в узнавании 5'-НТО РНК HCV и CSFV - сама 40S рибосомная субчастица. В структурном

Рис.1 Схематическое изображение вторичной структуры IRES-элементов РНК а) пикорнавирусов (на примере представителя кардиовирусов - EMCV ) и б) пестивирусов (на примере CSFV). Домены обозначены латинскими буквами в случае EMCV и римскими цифрами в случае CSFV, согласно принятой на сегодняшний день номенклатуре.

отношении, однако, эти взаимодействия не были охарактеризованы. Целью настоящей работы являлось изучение специфических взаимодействий между IRES-элементами EMCV (Encephalomyocarditis virus), FMDV (Foot-and-mouth disease virus), HCV (Hepatitis С virus) и CSFV (Classical swine fever virus) и компонентами трансляционного аппарата клетки.

Научная новизна и практическая ценность.

В результате настоящей работы впервые выявлены участки специфических взаимодействий между инициаторным фактором elF4G и IRES-элементом мРНК EMCV. Исследовано влияние на это взаимодействие факторов инициации eIF3, eIF4A и eIF4B. Впервые

локализованы сайты связывания вспомогательного фактора РТВ (pyrimidine tract-binding protein) на IRES-элементах EMCV и FMDV. Впервые охарактеризованы специфические взаимодействия эукариотической 40S рибосомной субчастицы и фактора инициации eIF3 с IRES-элементами HCV и CSFV . Полученные результаты представляют несомненную значимость, так как проливают свет на механизм инициации трансляции на молекулярном уровне, описывая первичные контакты в бинарных комплексах между компонентами трансляционного аппарата и мРНК, что абсолютно необходимо для дальнейшего изучения регуляции трансляции мРНК в целом.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и одна находится в печати. Результаты работы докладывались на Международных конференциях "Translational control", Годд Слрилг Харбор, США 1996 г., "The first Annual Meeting of the RNA Society" , Мэдисон, США 1996 г., "Howard Hughes Medical Institute Meeting" , Прага, Чехия, 1996 г. и Варшава, Польша, 1997 г.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на _ страницах машинописного

текста и состоит из введения , обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка

литературы. Содержит _ рисунков и _ таблицы. Список

литературы включает_источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Специфические вза&модействия компонентов трансляционного аппарата с IRES-элементами EMCVu FMDV.

1. Локализация участков связывания инициаторного фактора elF4G на IRES-элементе EMCV .

Инициация трансляции пикорнавирусных мРНК происходит путем связывания нагруженной рядом инициаторных факторов и Met-tRNAf 40S рибосомной субчастицы с IRES-элементами этих мРНК. При изучении реконструкции 48S предынициаторного комплекса на мРНК EMCV из индивидуальных компонентов было показано, что для образования комплекса абсолютно необходимы

факторы инициации eIF2, eIF3 и eIF4F (Pestova et at., 1996). Инициаторный фактор eIF4B стимулирует образование 48S комплекса. Полный eIF4F может быть заменен при реконструкции 48S комплекса на комплекс фактора eIF4A с С-концевыми 2/3 eIF4G (субъединицы фактора eIF4F). Как было показано в этом же исследовании, инициаторный фактор eIF4G (сам или как субъединица фактора eIF4F) специфически связывается с IRES-элементом EMCV, останавливая реакцию удлинения праймера в положении С786. Структура IRES-элемента EMCV схематически изображена на рис. 1а. Хотя мы не могли исключить, что eIF4G связывается с комплексом структур, образованным более чем одним доменом IRES-элемента, наиболее простым и вероятным было предположение, что он связывается где-то в районе J-K домена. Результаты эксперимента полностью подтвердили наше предположение. Для решения поставленной задачи мы использовали химическое и ферментативное зондирование. Суть эксперимента заключалась в следующем: комплекс рекомбинантного 2/3 eIF4G (457-1404 аминокислоты) (далее просто eIF4G) с РНК IRES-элемента EMCV (нуклеотиды 378-1155) образовывали в трансляционных условиях (ЮОтМ КАс, 20 шМ TrisHCl рН 7.5, 2тМ DTT, 2тМ MgAc2, ImM АТР) . После этого комплекс обрабатывали либо РНКазой VI, либо химическими реагентами СМСТ и DMS. РНКаза VI - неспецифическая эндонуклеаза, которая расщепляет фосфодиэфирные связи между нуклеотидами в высокоупорядоченных структурах РНК (двутяжевые участки РНК и нуклеотиды, находящиеся в стэкинге). СМСТ ( l-cyclohexyl-3-(2-morpholino-ethy!)-carbodiimide metho-p-toiuenesulfonate) модифицирует N3-U и в меньшей степени N1-G в неспаренных остатках РНК . DMS (dimethylsulfate) метилирует N1-А и N3-C, которые находятся в однотяжевых участках РНК. В качестве контроля использовали обработанную вышеуказанными реагентами свободную РНК IRES-элемента EMCV. Далее РНК анализировали методом реакции удлинения затравки. В качестве затравки использовали меченый у-[32Р]-АТР по 5'-концу ДНК-праймер. При этом обратная транскриптаза останавливается перед нуклеотидом, модифицированным СМСТ или DMS, или на нуклеотиде, фосфодиэфирная связь которого с последующим расщеплена РНКазой VI. Полученные фрагменты кДНК разделялись в 7% полиакриламидном геле с 7М мочевиной, для идентификации полос использовали сиквенс ДНК с

соответствующих праймеров. Для детекции зон применяли радиоавтографию.

При обработке бинарного комплекса е1Р4С и мРНК ЕМСУ ЭМБ практически полностью защищались А770-774 (рис.2 сравните линии 2 и 3), несколько слабее А 687-688 и А 724. Модификация СМСТ выявила защиту 11725. Ферментативный пробинг комплекса е1Р4в с ШЕЗ-элементом ЕМСУ показал, что остатки А765, 11768, С776-С779, а так же Ш85 и А691 не чувствительны к РНКазе VI в присутствии е1Р4С, тогда как авб, С784,С785 подвергаются гипермодификации в присутствии белка.

е!Р46 | — , 1

РМБ ; — ~р ! ~р

а770-774

1

в а т

Рис.2.Фрагмент радиоавтограммы полиакриламидного геля, демонстрирующий результаты химического пробинга комплекса РНК ЖЕБ-элемента ЕМСУ и еП^О.

Гипермодификация является, скорее всего, следствием конформационных изменений в 1-К домене ШЕБ-элемента ЕМСУ при его взаимодействии с еГР40. Результаты описанных выше экспериментов суммированы на рис.3.

Так как при использовании компактного реагента БМБ А770-774 практически не модифицировались в присутствии белка,

А А

ее

С С

с и

С й Сй в С

вс, ливиси1

5'

Рис.З Результаты химического и ферментативного зондирования комплексов РНК ШЕ5-пемента ЕМСУ н факторов инициации е!Р-ГС, е!Р4Р и РТВ. Нуклеотилы с 807 по ^ 15 составляют консервативный для всех пикорнавирусов полипиримидиновый тракт. • -положение, в котором останавливается реакция удлинения пранмера з бинарном комплексе РНК с е1Р-Ю.

<— РНК'аза VI РПКаза ОМЕ

омэ смет

РТВ

РНКазаУ1 .»• Гипсрчодифика-_ цин РНКазой VI

- омэ смет

е!Р4С

I

въ

С А

вс

Сй А11 Св СС

А и 807

Аи

ААв СССй 1Л)СС и и иСАААААСдс' сс^с™ Л С

со" 1-

.0" С |0йА1иААиАС

Л А

Ав и 334

2с

и НгаА-А

иА» А иССАССиб

и,

II 750

и А 11

исиС1МС у сйссисссиозсАсдисс у

СС Ф V

се 1

Аи ее

К

700 (А и'А

Чи5

С С

си

А

ссс-с с

СС Аи < ид

иси

мы предполагаем, что именно эти пурины вовлечены в прямой контакт с е1Р4С. При этом близлежащие спирали стабилизируют это взаимодействие. Подобная модель (непосредственный контакт белка с внутренней или концевой петлей шпильки и его стабилизация фосфатным остовом самой шпильки) описана в литературе для РНК-белковых контактов и в ряде случаев доказана рентгеноструктурным анализом. Важно подчеркнуть, что все указанные остатки А770-774, А724, А688, исключая А687, консервативны у всех кардио- и афтовирусов. А замена А772 на С или делеция нуклеотидов 727-730 в I спирали ведут, по данным Ра1тепЬег§ и соав., к практически полной потере трансляционной активности мРНК ЕМСУ. При изучении бинарного комплекса е1Р4С с Ш-ЕБ-элементом ЕМСУ были также использованы праймеры, позволяющие тестировать другие домены IR.ES-элемента. Однако никаких дополнительных контактов в Н, I, Ь и М доменах, а также в их спейсорных участках обнаружено не было.

Так как мы не могли исключить влияние возможных третичных РНК-РНК контактов на исследуемые взаимодействия, особенно с I доменом, чья функция до сих пор не ясна, то было исследовано взаимодействие е1Р4С с делеционным мутантом 485647 (Д485-647) ШЕБ-элемента ЕМСУ. Как было показано ранее ^^айеуа А.О. ef а/. 1990), вторичная структура 1-К домена такого мутанта аналогична соответствующей структуре в немутированной РНК. При анализе РНК Д485-647 в составе комплекса с е1Р40 было показано, что реакция удлинения праймера останавливается в том же положении С786, что и в случае РНК дикого типа. Дальнейшие эксперименты химического и ферментативного пробинга полностью воспроизвели описанную выше картину, то есть полученную для неделетированной по I домену РНК.

Делеционный мутант по 1-К домену Д701-763 ШЕБ-элемента РНК ЕМСУ в составе бинарного комплекса с еП-"4С не останавливал реакцию удлинения праймера в положении С786. Район 5А770-774 сохранен в этом варианте мутированной РНК и также находится в боковой петле, как и в РНК дикого типа. При обработке ЭМБ бинарного комплекса е№40 и этой РНК Д701-763 ни один из 5 адениновых остатков 770-774 не защищался в присутствии е1Р4С. Таким образом, для специфического связывания е1Р40 с ШЕБ-элементом ЕМСУ достаточно 1-К домена, но при этом несомненно важен структурный контекст, окружающий А770-774 нуклеотиды (остатки, вовлеченные, по

нашему мнению, в прямой контакт с е1Р4С). Важно заметить, что РНК ЕМСУ с мутацией Д701-763 нуклеотиды была совершенно трансляционно не активна, вероятно, в силу нарушения взаимодействия с фактором е1Р4С.

2.Влияние инициаторных факторов е1Р4А и е1Р4В на специфическое связывание е1Р4в с 1ЯЕЭ-элементом ЕМСУ.

Нативный инициаторный фактор еШ40 - субъединица фактора е1Р4Р. В состав последнего, помимо е1Р4С, входят факторы инициации е1Р4А и е1Р4Е. При реконструкции предынициаторного 48Б комплекса из индивидуальных компонентов е1Р4Р полностью (без изменения детектирумого по меченой МеЫ1ШАг количества конечного 48Б инициаторного комплекса) мог быть замещен на С-концевые 2/3 своей субъединицы е1Р4С (457-1404 аминокислоты) и е1Р4А. Тем не менее, мы проверили, как влияет замена е1Р4Р на еШ40 в экспериментах химического и ферментативного пробинга, чтобы изучить возможное влияние других субъединиц е№4Р на связывание е1Р40 с ШЕБ-элементом ЕМСУ. При обработке бинарного комплекса е1Р4Р с тЕБ-элементом ЕМСУ (образованного в тех же условиях, что и комплекс с е1Р40) РНКазой VI и БМБ наблюдались все обнаруженные ранее защиты (рис.3). Таким образом, специфические контакты между еПЧО и ШЕБ-элементом ЕМСУ полностью сохранены в нативной форме этого фактора инициации (как субъединицы еП^Р). Одновременно мы показали, что другие субъединицы фактора инициации е№4Р (е!Р4А и е1Р4Е) не влияют на это специфическое связывание.

Предполагается, что одна из субъединиц е1Р4Р -инициаторный фактор е1Р4А - работает, циркулируя через е1Р4Р. Принято считать, что е1Р4А - АТР-зависимая РНК-хеликаза. Кроме того, для эффективной РНК-хеликазной активности е!Р4А необходим фактор инициации е1Р4В. При УФ-сшивании 32Р-меченого 1КЕБ-элемента РНК ЕМСУ с е1Р4А не было обнаружено взаимодействия мРНК с этим фактором инициации. е1Р4В метится достаточно слабо в отсутствии других факторов инициации . Однако при добавлении е1Р4С значительно возрастает УФ-индуцированное сшивание этих двух белков. Эти исследования предполагают, что е!Р4В, е1Р4А и е!Р4С возможно собираются в

комплекс на IRES-элементе EMCV, поэтому мы тестировали в экспериментах пробинга все эти факторы вместе.

При обработке комплексов РНК и eIF4A, РНК и e!F4G+eIF4A, РНК и eIF4A+eIF4B+eIF4G (образованных в вышеописанных трансляционных условиях) РНКазой VI и DMS не было обнаружено ни дополнительных контактов, ни изменения структуры между J-K доменом и AUGs34 инициаторным кодоном. Этот результат повторял картину, полученную при сравнении взаимодействия инициаторных факторов eIF4G и eIF4F. Таким образом, ни eIF4A, ни eIF4B не влияли на специфическое взаимодействие eIF4G с IRES-элементом РНК EMCV. Замена eIF4A на его мутантную форму (R362Q), которая не способна диссоциировать от eIF4F и является транс-доминантным ингибитором функции eIF4F (Pause A. et al. 1994), также не повлияла на связывание eIF4G. Исходя из наших экспериментов и данных УФ-сшивания, мы предполагаем, что eIF4A не является классической хеликазой, а вероятно вовлечен в процесс реорганизации и "подгонки" IRES-элемента EMCV к РНК-связывающему каналу 40S рибосомной субчастицы. Видимо, для этого процесса недостаточно вспомогательной роли фактора eIF4B, а небходимы и другие компоненты предынициаторного комплекса (eIF2, 40S рибосомная субчастица, eIF3).

Полученные экспериментальные данные полностью согласуются с современным представлением об инициации трансляции EMCV, согласно которому, рибосомальный предыницнаторный комплекс связывается непосредственно с инициаторным AUGs34 кодоном без сканирования 5'-НТО.

3. Влияние шшциаторного фактора eIF3 на специфическое взаимодействие eCF4G с IRES-эле.ментом E.VICV.

По данным литературы известно, что помимо сайта связывания с eIF4A и eIF4E, eIF4G также обладает участком связывания с инициаторным фактором eIF3. Поскольку последний связан непосредственно с 40S субчастицей, то такая цепочка: кэп-eIF4E-eIF4G-eIF3-40S, как предполагают, и обеспечивает первичное узнавание эукариотических кэпированных матриц 40S рибосомной субчастицей. Помимо этого, eIF3 необходим для инициации трансляции мРНК EMCV, которая протекает по кэп-независимому механизму внутренней инициации (Pestova T.V. et al.

1996). Для изучения возможного влияния инициаторного фактора eIF3 на специфическое взаимодействие eIF4G с IRES-элементом EMCV мы изучали тронной комплекс eIF4G+eIF3 и РНК IRES-элемента EMCV методом ферментативного и химического пробинга.

Fie было обнаружено дополнительных защит от DMS или РНКазы VI ни в исследуемом тройном комплексе eIF3+erF4G с IRES-элементом EMCV, ни в бинарном комплексе eIF3 с этой же РНК. Все описанные ранее защиты самого eIF4G были сохранены в тройном комплексе. Исходя из полученных данных, мы предполагаем, что связывание eIF4G с IRES-элементом EMCV автономно и сохранено на всех этапах образования предынициаторного комплекса.

4.Структурный анализ взаимодействии РТВ (pyrimidine tract-binding protein) с IRES-элементами EMCV и FMDV.

Ранее в нашей лаборатории при реконструкции предынициаторного 48S комплекса на мРНК IRES-элемента EMCV из индивидуальных компонентов было показано, что необходимыми и достаточными являются факторы инициации eIF2, eIF3, eIF4A, eIF4G. Однако добавление РТВ (pyrimidine tract-binding protein^ который специфически взаимодействует с IRES-олементом EMCV (Borovjagin A.V. et а!. 1990) стимулировало этот процесс. Также, как было показано Kamiski и соав. (Kaminski A. et al. 1995), РТВ существенен для трансляции РНК EMCV in vitro. Поэтому было важно выяснить, каким образом РТВ взаимодействует с IRES-элементом EMCV, чтобы иметь представление о возможных функциях этого белка на стадии инициации трансляции.

Как было показано ранее. РТВ связывается в районе Н доменов IRES-элемента EMCV (рис.la и 3) и IRES-элемента FMDV (l'oot-and-mouth disease virus ), вируса, вторичная структура 1RES-элемента которого практически полностью идентична таковой для EMCV. Также был обнаружен второй сайт связывания РТВ для IRES-элемента FMDV - в районе инициаторного ALrGs06 кодона. Для IRES-элемента EMCV наличие второго участка связывания РТВ ранее продемонстрировано не было. Для картирования точного участка связывания РТВ мы использовали метод химического и ферментативного зондирования, описанный выше.

Бинарный комплекс образовывали в трансляционных условиях (ЮОшМ КАс, 20 шМ TrisHCl рН 7.5, 2mM DTT, 2mM MgAc2). Кроме РНКазы VI также использовали РНКазу ONE. Она специфически расщепляет фосфодиэфирные связи между нуклеотидами в одноцепочечных участках РНК. Наиболее интересным казалось использование СМСТ, поскольку РТВ обладает повышенным сродством к пиримидинам. При модификации комплекса РТВ и РНК IRES-элемента EMCV СМСТ защищаются нуклеотиды U421-423, U430 в районе Н домена, U747, U749, U758-759 в районе К домена и U813-815 , находящиеся в полипиримидиновом тракте (нуклеотиды с 807 по 815) (рис.3). При использовании РНКаз нуклеотиды А446, G443-A441 и A408-U410, С391 в районе Н домена, С742 в К домене IRES EMCV, С812 и U813, находящиеся в полипиримидиновом тракте защищаются в присутствии РТВ.от расщепления РНКазой VI. Анализ комплекса РТВ и IRES EMCV с помощью РНКазы ONE показал, что нуклеотиды C420-U421, C398-U400, и С403 в Н домене, а также U749 в К домене IRES EMCV не доступны для РНКазы ONE в присутствии РТВ. При модификации DMS защищалось С746 в граничной петле К домена. Результаты вышеописанных экспериментов суммированы на рис. 3. Впервые для IRES-элемента EMCV был выявлен второй участок связывания РТВ в районе 3' границы IRES-элемента.

Вторичная структура IRES-элемента EMCV высоко гомологична структуре IRES-элемента FMDV. Ранее было показано, что РТВ взаимодействует с IRES-элементом FMDV в районе Н домена и в области, прилежащей к инициаторному кодону. Мы изучили взаимодействие РТВ с этим объектом. Было обнаружено, что U396-398 в петле Н домена, U722, U724 (граничная петля К спирали) и U781-783, U786-788 (полипиримидиновый тракт) не модифицируются в присутствии РТВ СМСТ. Результаты эксперимента суммированы на рис.4.

Таким образом, в результате исследований были выявлены 6 участков специфического связывания РТВ с IRES-элементом РНК EMCV: 1-UCUU401 - непосредственно около основания домена Н, 2-основание спирали Н (нуклеотиды 407-410 и 440-443), 3-UCUUU423 в петле домена Н, 4-внутренняя петля домена К и прилегающая к ней спираль, 5-внешняя петля домена К CUUU749 и 6-CCUUU815 - часть полипиримидинового тракта. С IRES-

>смст

5'

САСАААСС О С И

Рис.4 Результат химического зондирования комплекса РНК IR.ES-•шемента РМБУ и РТВ. Нуклеотиды с 779 но 790 составляют консервативный для всех пикорнавирусов полипиримидиновый тракт.

АСС I

ее вс с в

АСС1 в С

ид

в С 779

6С 3'

I— иСС1КЗАС СААиА Ц>ф1}сс Ц^ййАиААСС,

... Аи 790 А

650 С с С

О С ____и

С й» Ю11А1САСААС

А А 750 806

А и в С

РоАДА

9 1ЛЮАСССС(31ЮАААЧ,1 £ сСАСиСССО_АСиис1^

Св Св и А

ид с с.

А А

си6

в С 700

£ А

св с с

ССА ОС

АА®

К

элементом РМЭУ РТВ взаимодействует соответственно сайтам 3. 5 и 6, определенным для ЕМСУ. То, что специфические места связывания РТВ с КЕБ-элементами ЕМСУ и РМБУ находятся на границах ЖЕБ-элементов, видимо, позволяет белку (в нагивном состоянии находящемуся в виде димера) эффективно адаптировать эти сложные структуры к взаимодействию с другими факторами инициации. Мы предполагаем, что одним из этих факторов является е1Р4С. В пользу нашего предположения говорит и тот факт, что трансляция вариантов вирусных РНК ЕМСУ, в ШЕБ-элементах которых изменено количество остатков аденина в петле А770-774 между .1-К. доменами (6 адениновых остатков, а не 5 как в случае нашего варианта вирусной РНК ЕМСУ), остатков, участвующих, по нашему мнению, в связывании е!Р40, критически зависит от наличия РТВ в ретикулоцитном лизате (Кагппкк1 а аI 1995).

II. Специфические взаимодействия между компонентами трансляционного аппарата и IRES-элементами CSFV и HCV.

Как было показано ранее, для образования инициаторного комплекса на IRES-элементах CSFV (рис.1б) и HCV (вируса, гомологичного по вторичной структуре 5'-НТО пестивирусных РНК)' достаточно eIF2, eIF3, Met-tRNAf, и 40S рибосомной субчастицы (Pestova T.V. et at. 1998). В присутствии этих компонентов реакция удлинения праймера останавливается в положении +15-17 относительно инициаторного AUG кодона. Более того, 40S рибосомная частица сама образует стабильный бинарный комплекс с этими IRES-элементами, останавливая в его составе реакцию обратной транскрипции в положениях, указанных на рис.5. Таким образом, впервые было продемонстрировано образование бинарного стабильного комплекса между эукариотической 40S рибосомной субчастицей и мРНК, в котором инициаторный кодон сразу попадает в район Р-сайта 40S рибосомной субчастицы. До этого существование таких комплексов предполагалось только в прокариотических организмах. Результаты этих исследований предполагают, что сама 40S рибосомная субчастица играет главную роль в узнавании этого типа IRES-элемента. Элементы структуры этих IRES, которые узнает 40S рибосомная субчастица, не были

идентифицированы в указанной выше работе. Для решения поставленной задачи мы использовали ферментативное и химическое зондирование.

1.Взаимодействие 40S рибосомной субчастицы с IRES-элементами CSFV и HCV.

Надо отметить, что эксперименты по зондированию комплексов IRES-элементов CSFV и HCV достаточно трудоемки. Во-первых, очень немногие остатки доступны химической модификации, так как IRES-элементы CSFV и HCV очень сильно структурированы. Во-вторых, по этой же причине затруднена работа обратной транскриптазы на этих матрицах: в контрольных экспериментах реакция удлинения праймера часто останавливается даже на немодифицированной свободной РНК. Комплекс 40S рибосомной субчастицы с IRES-элементами HCV (нуклеотиды с 1 по 372) и CSFV (нуклеотиды с 1 по 442) образовывали в трансляционных условиях (ЮОтМ КАс, 20 тМ TrisHCl рН 7.5, 2тМ DTT, 2тМ MgAc2, ImM АТР). При обработке бинарного комплекса 40S субчастицы и IRES-элементов CSFV и HCV DMS и СМСТ никаких контактов между нуклеотидами IRES-элемента HCV и CSFV, находящихся в одноцепочечных участках, и 40S субчастицей обнаружено не было. Информативные результаты были получены при обработке бинарного комплекса 40S рибосомной субчастицы и IRES-элементов HCV и CSFV РНКазой V]. В случае CSFV защищались положения U387-U389 (они модифицируются СМСТ, но не защищаются от него в присутствии 40S субчастицы), С342, U31I, А287-С286, G264, С249, А245. Нуклеотиды А204, С186 подвергались гипермодификации РНКазой VI в присутствии 40S рибосомной субчастицы (рис.5б). Для IRES-элемента HCV был исследован район до 270 нуклеотида. Было показано, что защищались нуклеотиды G249-U248, G241, U226-G224, U220, А179, G180 (рис.6 сравните линии 1 и 2). Описанные данные суммированы на рис.5. Как видно из этих рисунков, 40S рибосомная субчастица связывается в центральной части основной шпильки домена III этих IRES-элементов и (как было продемонстрировано для ERES-элемента CSFV) в районе псевдоузла и за инициаторным AUG373 кодоном. Интересно отметить, что именно на U387-A392 нуклеотидах останавливалась реакция обратной транскрипции при удлинении праймера в

403

е1РЗ

□

л

РНКаза VI, Гипермодификация РНКазой VI,

!

¡РНКаза VI, [РНКаза ОЫЕ,

СМСТ, РМв

а

На

а" с

А А

и и

"ь ££

ее св ей ли

А А

А и

3 А 70 А и 97 СО ал са

Аим Г Г

з С й ^

■»исии

и А

и=С А=и

ШЬ ОС ОС ОС

се с с ли вс

с аа

А Си б с

С 0222 йА__

ил^ АШа аи

и САССОО изоо'-о 5д0исссс ,-С ССги

аа ! 111с

ее ас™ с а^

ил се ил ОС си;

-<сиАе0Ао

и

5'

ид

са

28 Сй

САСАСиССАССАиСААиСАСиСС АСССССССиСССйОО

-и— е I 300

и йСиАСС С0А0иАаи0ии<3

О I-иССйСАААОСССио5

и А и 275

г ив

С ли

А ей

в Сй

А0иА

6С

131 ли

СССи А

328

"ССЗиССАСС[А^АА0САС0ААиСС*АААССиСАА 342

Рис. 5. Вторичная структура 5'-нетранслируемых областей РНК а) НСУ и б) СБРУ. Результаты пробинга комплексов РНК ЖЕЗ-элементов этих вирусов с 408 рибосомной субчастицей и фактором инициации еШЗ. • - положения, в которых останавливается реакция удлинения праймера в бинарном комплексе РНК с 405 рибосомной субчастицей.

А

la

U A U G Q C G U A ü A U CC A Ü

GC

6

lllb

Lf^a rA 22a

llb

G C G A

c c u

GC C ACCCC

GCC A A

G C GC G C U A A (JA A G A u G A CG C G GA GC

ACÜA

c u

A A yT'C G G C A C

__G C

—-U A

_*G C C C u u G C

LTÁ\(

G CIG^

A U,_V

U A

8CS' A U . C G G v

C G 180 U A 'CAGGACAG GUCCUGAA CCC

U A A

Illa

G G G

qU240

lile

G C

U A

G C «

G C 7 G n

aUUAACCCUGGCG ®.

' .GUGGGAUCGC,,G

U A \ i U"

A 'i :

lia

c

A

A 120 A

G

uc

GUCGUAUACGA G C A U

u u

A U U A U A G U GC

G G A U G U G U G

A U'C A C C G U A G U G C G 300 C G U G C G G U» A A G C C G

"U U U*

\

Ib

ACUAGCC G UAGUGG UGAUCGG AUCACC A ' ' *

u

A

311

AC C U t JJGGG Al

I

G C U

I

!

••••••

u ACAUGGCAC!AlJ<3 GAGUUGAAUCAUUUUGAAUUAUU "3f3 '№

40S РНКаза VI

U 220 FGAU 224-226

G241

Т

Рис.6 Фрагмент радиоавтограммы полиакриламидного геля, демонстрирующий результаты энзиматического зондирования комплекса РНК ШЕБ-элемента НСУ и 40Б рибосомной субчастицы.

бинарном комплексе IRES-элемента CSFV и 40S рибосомной субчастицы. Но основной вклад во взаимодействие между РНК CSFV и 40S субчастицей, видимо, вносит III домен, так как ранее было показано, что удаление первых 30 нуклеотидов кодирующей последовательности вирусного полипротеина и структуры псевдоузла не влияет на связывание оставшейся части IRES-элемента с 40S рибосомной субчастицей, хотя защиты в этом районе есть. О важности структуры именно III домена говорит и тот факт, что делеция 4 нуклеотидов (145-148) в его основании полностью элиминировала способность РНК CSFV образовывать стабильный комплекс с 40S рибосомной субчастицей. Наши

эксперименты согласуются с этими данными. Отсутствие защит при использовании химических реагентов говорит, скорее всего, о том, что нет прямых контактов между основаниями нуклеотидов IRES-элементов HCV и CSFV и белками 40S рибосомной субчастицы, тогда как вторичная и/или третичная структура IRES-элементов определяет их специфическое связывание с 40S рибосомной субчастицей. Хотя на основании полученных результатов мы не можем полностью исключить комплементарных взаимодействий между нуклеотидами IRES-элементов и 18S рибосомной РНК, подобно взаимодействию последовательности Шайн-Дальгарно прокариотических мРНК с 16S рРНК, по нашему мнению, наиболее вероятным представляется взаимодействие РНК-связывающего канала 40S рибосомной субчастицы с сахарофосфатным остовом IRES-элементов мРНК HCV и CSFV.

2.Специфнческое взаимодействие инициаторного фактора eIF3 с э'-нетранслируемой областью CSFV.

Как было ранее показано, фактор инициации eIF3 специфически связывается с IRES-элементами CSFV и HCV и необходим для образования 80S инициаторного комплекса (образующегося при присоединении 60S рибосомной субчастицы к предынициаторному комплексу с 40S рибосомной субчастицей) (Pestova T.V. et al. 1998). Было интересно исследовать сайт связывания eIF3 с IRES-элементом пестивирусной РНК и его положение относительно выявленного места связывания с РНК 40S рибосомной субчастицы. При обработке бинарного комплекса eíF3 и IRES-элемента CSFV РНКазой VI защищались остатки GUG198-200, GAG217-219, А225, С232, АСА248-250. При использовании РНКазы ONE были идентифицированы нуклеотиды UG228-229, AUG 220-222. Нуклеотиды А218 и А220 практически не подвергались модификации DMS, a U221 - СМСТ в присутствии инициаторного фактора eIF3. Полученные результаты суммированы на рис.5. Таким образом, eIF3 связывается в районе внутренней петли домена ШЬ и прилегающих к ней спиралей непосредственно над сайтом связывания 40S рибосомной субчастицы. Ранее сообщалось о РНК-связывающих свойствах фактора инициации eIF3, но специфическое связывание с РНК охарактеризовано для этого бежа впервые. Сайты

связывания еШЗ и 40Б субчастицы частично перекрываются в районе 247-249 нуклеотидов ШЕБ-элемента СБРУ. Это, вероятно, связано с тем, что вышеуказанные нуклеотиды находятся на границе контактов этих достаточно крупных компонентов трансляционного аппарата. По крайней мере, добавление 40Б рибосомной субчастицы к бинарному комплексу еШЗ и IR.ES-элемента СББУ не изменяло специфическое взаимодействие инициаторного фактора и РНК. При этом контакты 40Б рибосомной субчастицы и РНК ЖЕ8-элемента оставались точно такими же, какие были обнаружены ранее в их бинарном комплексе. Эти данные предполагают, что инициаторный фактор еШЗ и 40Б рибосомная субчастица могут связываться одновременно и с достаточно высоким сродством с ЖЕ5-элементом СБРУ, что может быть важно при конкуренции вирусной РНК с клеточными мРНК за компоненты трансляционного аппарата клетки.

ВЫВОДЫ.

1. При помощи химического и ферментативного пробинга определен участок связывания на IRES-элементе мРНК EMCV инициаторного фактора eIF4G (eIF4F). Локализация этого сайта в районе J-K домена IRES-элемента EMCV определила функциональную (возможно не единственную) роль этой части структуры IRES-элемента.

2. Показано, что добавление инициаторных факторов eIF4A и eIF4B не изменяет специфического взаимодействия eIF4G с IRES-элементом EMCV.

3. При помощи химического и ферментативного зондирования локализованы сайты связывания РТВ (pyrimidine tract-binding protein) на IRES-элементах EMCV и FMDV. Показано, что участки взаимодействия РТВ с этими IRES-элементами находятся на границах IRES-элементов EMCV и FMDV.

4. Определены специфические контакты в бинарном комплексе 40S рибосомной субчастицы с ERES-элементами мРНК CSFV и HCV. Полученные данные указывают на отсутствие прямых контактов между нуклеотидными основаниями IRES-элементов и интегральными компонентами 40S рибосомной субчастицы.

5. При помощи ферментативного и химического зондирования установлена структура участка IRES-элемента CSFV, который специфически взаимодействует с инициаторным фактором eIF3.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. V.G. Kolupaeva, C.U.T. Hellen, I.N. Shatsky. 1996. Structural analysis of the interaction of the pyrimidine tract-binding protein with the internal ribosomal entry site of the encephalomyocarditis virus and foot-and-mouth disease virus RNAs. RNA . V.2, p.l 199-1212.

2. V.G. Kolupaeva, C.U.T. Hellen, I.N. Shatsky. 1996. Topography of the contacts of the pyrimidine tract-binding protein with the IRES elements of foot-and-mouth and encephalomyocarditis virus RNAs. The First Annual Meeting of The RNA Society, Madison. Abstract book, p.365.

3. V.G. Kolupaeva, T.V. Pestova, C.U.T. Hellen, I.N. Shatsky. 1996. Structural elements of picornaviral IRESs that interact with the pyrimidine tract-binding protein and initiation factor eIF4G. Translation control. Cold Spring Harbor, New York. Abstract book, p. 162.

4. D.V. Sizova, V.G. Kolupaeva, T.V. Pestova, I.N. Shatsky and C.U.T. Hellen. 1998. Specific interaction of eukaryotic translation initiation factor (elF) 3 with the S'-nontranslated regions of hepatitis С virus and classical swine fever virus RNAs. J. Virology, in press.

5. V.G. Kolupaeva, T.V. Pestova, C.U.T. Hellen and I.N. Shatsky. 1998. Translation initiation factor eIF4G recognizes a specific structural element within the internal ribosome entry site of the encephalomyocarditis virus RNA. J.Biol.Chem. in press.