Структурно-функциональные свойства малых субчастиц рибосом с фрагментированной 16S РНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЩИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени Ы.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 576.85.48

АФОНИНА Елена Ивановна

СТРЛГГ7И10-5ЛП01ИСНАЛЬНЫЗ СВОЙСТВА ШШХ СУБЧАСТИЦ РИБОСОМ С «РАПШТИРОВШГОП I6S РНК

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Работа выполнена в Ыегфакультетской Проблемной Научно-исследовательской Лаборатории ш.:. А.Н. Белозерского Московский Государственный Университет на. Ц.В. Ломоносова

Научный руководитель - чл.-корр. АН СССР, профессор

А.А.Богданов

.Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор С.В.Кириллов

- кандидат химических наук, старший научный сотрудник В.Д.Смирнов

Ведущая организация - Институт озоорганичэской хелш АН СССР

вы.Ы.Ы.Шаыяюша

Защита состоится 1991 г. в /5~* часов на заседании

специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском Государственном Университете км.Ы.В.Лоыоносова по адресу: ГСП 119899, Москва, В-234, Ленинские гори, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета ЫГУ.

Автореферат разослан

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

/

И.Г.Сшрнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биосинтез полипетидной цепи в клетке осуществляется на рибосомах, первостепенную роль в функционировании которых играет рибосомная РНК (рРНК). В настоящее время установлено, что в процессе биосинтеза белка рРНК взаимодействует с тРНК, мРНК и факторами трансляции. Исследование структурных и функциональных свойств 16S рРНК, входящей в состав малой субчастицы рибосом, имеот 'важное значение для выяснения молекулярного механизма трансляции. Разработка методов, позволяющих направленно изучать структуру внутренних районов РНК в субчастице, является актуальной проблемой рибосомологии.

Цель работы - детальное исследование структурно- функциональных свойств 16S рРНК в составе малой субчастицы рибосом методом направленной фрагментации РНК с помощью РНКазы Н и синтетических олигодезоксирибонуклеотидов.

Научная новизна и практическая значимость. Разработан новый подход к изучению структурной и функциональной роли рРНК в рибосоме. В его основу положена направляемая синтетическими олигоде-зоксирибонуклеотидамя фрагментация рРНК с помощью РНКазы Н.

Специфически фрагментированная рРНК вводится в процесс реконструкции рибосом, в результате чего образуются субчастицы, РНК которых имеет разрыв в исследуемом участке. Всестороннее изучение свойств этих частиц позволяет сделать выводы о функциональной значимости данного участка.

Показано, что белок-синтезирующая активность 30S субчаствд, содержащих фрагментированную 16S рРНК, значительно варьирует в зависимости от района, в котором происходит расщепление.

Полная потеря способности 30S субчастиц транслировать как природные, так и синтетические мРНК происходит лишь при расщепли кш 16S рРНК в районах 790 и 1400 нуклеотидных остатков (и.о.). Ассоциация изолированных фрагментов 16S pFHK возможна только в иргсутствии некоторых рибосомных белков. Связывание последних изменяет конформацию 16S рРНК, обеспечивая возможность образования

комплекса, содержащего все фрагменты РНК. В присутствии всех рибо-сомных белков возможна "сборка" активной малой суОчастицц. Данная работа представляет совой продолжение проводимого в отделе хшвш и биохимии нуклвопротеидов Меифакультетской ШИЛ им. А.Н. Белозерского комплексного исследования структуры рРНК, а также функционирования рибосомы. Полученные результаты позволяют сделать заключение о третичных взаимодействиях в молекуле 16S рРНК, РНК-белковых взаимодействиях в малой субчастице рибосом, оценить функщюнальную значимость исследованных районов рРНК.

0знакомле1ше с развитыми в работе методами и полученными с их помощью результатами окажется полезши для исследователей, интересующихся структурно-функциональными свойствами РЖ в рибонуклео-протеидных комплексах (вирусы, информосомы, рибосомы)

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Конференции молодых учених Мон$акультетской ШШ т. А.Н.Белозерского МГУ, Москва, 1990; Конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической хлыии, Пукино, 1988; Мевдународном симпозиуме "Регуляция трансляции", Рига, 1989; X Советско-французском симпозиуме "Регуляция экспрессии гоиома аукэрио? и прокариот", Киев, 1990.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на /iû страшщах машинописного текста и содержит следуказго разделы: введение, обзор литературы (свойства РНКазн H и область применения фермента в молекулярной биологии), обсуждение результатов, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 5" таблицами и JL9 рисунками. Библиографический указатель включает -Zof-цитировашшх работ.

г

СОДЕРЙАНИЕ РАБОТЫ

Метод направленной фрагментации РНК с помощью РНКазы Н и синтетических олигодезоксирибонуклеотидов был предложен в 1978 г. в Меифакультетской ШИЛ им. А.Н. Белозерского МГУ. Он основан на способности коротких олигонуклеотидов образовывать комплементарные комплексы с открытыми однотякевыми участками РНК. Обработка таких комплексов РНКазой Н, специфически гидролизупцей РНК в составе ге-тэродуплекса РНК-ДНК, приводит к образованию разрывов в цепи РНК, причем направление гидролиза определяется специфичностью связанного олигонуклеотида. Сегментированная рРНК вводится в процесс реконструкции, в результате чего образуются субчастицы, РНК которых имеет разрыв в исследуемом месте. Изучение способности этих частиц выполнять присущие им функции позволяет сделать определенные выводы о функциональной значимости данного участка. Выбор мест гидролиза определяется га способностью образовывать комплементарный комплекс и стерической доступностью. Этим требованиям отвечают однотякевые участки, не вовлеченные в сильные внутримолекулярные взаимодействия. По-еидимому, именно от таких участков можно ожидать и активного функционирования. Существенным условием при постановке такого рода экспериментов является достижение количественной степени гидролиза по одному выбранному месту. Только в этом случае можно однозначно трактовать данные функционального анализа.

В настоящей работе описанный подход использован для . исследования девяти различных участков 165 рРНК.' 3' концевой и центральный район 16Б рРНК можно, с большой долей уверенности, считать непосредственно принимающими участие в работе рибосомы. Остальные участки выбирались, в основном исходя из структурных, а не функциональных соображений (Рис.1).

Полученные фрагментированные в различных районах 165 РНК исследовали по следующей схеме: 1). Идентификация мест разрывов в первичной структуре. Соответствие мест разрывов положению предполагаемых комплементарных комплексов может быть легко проверено'по величине образующихся фрагментов (Рис.2). В некоторых слу ¡аях идентификация фрагментов может быть облегчена предварительным введением в РНК концевой метки.

-!

£ «и »•» и м• СЮ

Ж

® 11«111М1 п • • и 11 и I »• I и • Ъ «су«

г.уч:

х <гг40с-

« ¡-«эо

V'

щ

,л {Ги-.м .10

Iti.it I и I • I

.«О» «

£ I I И • II*

Ь1С.1. Модель вторичной структуры 16Б рРНК. Полокышн олигода-зэксир^Лшуклеовдов, кошигементаршх исследуемым районам 16в рРНК обозначены лшшями и римскими цифрами. В дальнейшем . рРШ, Фрагмвнтировалная о'помощью РНКазы.Н ь присутствии определенных олш -о дэг»оксирибонуы1«огидов, обозначена 1бв РЮШ. где И-СОЭ-ГЫТПЬуЫайй римской цифре олигсиуклбогид.

Рас. 2. Э.:;ектрофо[ютнчвскиЯ анализ 165 рРНК, фряплеятир'-1 ванной в присутствии синто тических олигодезокскрибо яуклеотидов: 1 - 16s РНК т т г; 2,3 - 163 FHK, выделенная из 30S субчастиц, инкубирован ных с РНКазоЙ Н в присутпт вии олигонуклеотидэ II;

4 - маркерная дорожка;

5 - 16S FHK II; 6 - 165 РНК 1: 7-165 РНК у; 8 - интактнял 16S РНК. .

2). Исследование стабильности изолированной Фрагментированной FHK. Если концу разрыва удерживаются системой внутримолекулярных взаимодействий, то он остается скрытым и никак не проявляется без дополнительной денатурирующей обработки. Диализ фрагментированной FHK в неленатуриругаем ПЛАТ, а также в градиенте плотности ■ сахарозы в солевых условиях, используемых при реконструкции 30s субчастиц, может показать является ли данный разрыв скрытым (Рис.3).

3). Исследование способности расщепленной FHK к реконструкции в ЗОВ субчастииы. Реконструкцию 30S субчэстии с использование* интоктной и фрагментированной 165 РНК проводили по методу Нсмурн v Трауба. Реконструированные частицы рыле.Ил.,;: улырацрнтрифугированием в градиенте плотности сахарозы в ryi»ipe с выег-ким содержанием ионов мапшя ( буфер ТМ: ?о чМ Трис-Н'Л, го мм KgCl,, б мМ р-меркаптозтэнола). Малые суччэствич рт«чт< w, полученные как из интэктной, так и из сэдррипюЧ! "¿win"*:* р:>ркьн

t S3

м

25Щ Ш gg г*

ста»

t—•• I

• ! . -

—

I

—389

РНК, седиментируют в градиенте плотности сахарозы неотличимо от контрольных 30S субчастиц (рис. 4).

3 4

Б 7

m

, i

fíteflW

ISS

-763

--36Î

Рис. 3. Анализ фрагментиро-ванной 163 рРНК в неденату-рирущем ПААГ: 1-нативная 16Б РНК; 2-163 РНК I; 3-163 РНК I, инкубированная 3 мин при 60°С; 4-1 бе РНК I, инкубированная 3 кош при 60°С, затем - 90 мин при 37°С в ТМ буфере; 5-16Б РНК II; 6-163 РНК II, инкубированная з мин при бо°с,- 7-163 гак и, инкубированная 3 мин при 60°С, затем - 90 мин при 37°С в ТЫ буфере.

4). Определение биологической активности 30S субчастиц, реконструированных из фрагшнтировашшх 16s РНК. Способность 30S субчастиц, реконструированных из несущих разрывы 16S РНК, функционировать в полипептидном синтезе исследовали в бесклеточной системе трансляции в присутствии поли(и), а такие в системе с US2 РНК. Анализируемые 30S субчастицы выделяли из соответствующих фракций сахарозного градиента спиртовым осаждением и определяли их транслирующую • активность параллельно с контрольными 3ÛS. суочастицами, реконструированными из интактной 16S РНК. За 100% принималась активность 30s субчастиц, реконструированных из интактной 16S РНК, за вычетом фона, даваемого системой в отсутвие мРНК.

ноиерв фракций

Рис 4. Анализ 30S субчастиц, реконструированных из фрагментированной IGS РНК в градиенте плотности сахарозы: а) нативние 30S субчастмы; 3QS субчастшн, содержащие: ь) tes ПК г: о) 1 es РНК II; d> 16S РНК V.

1. 30S субчастицы, содержащие 16Б РНК, фрагментов энную в в районе 1530-1539 и.о.

Для исследования этого функционально важного района, содержащего последовательность, комплементарную участку Дальгарно (внта-SD). был использован олигонуклео^ -чомплруентарный 1530-1539 и.о. (Табл. 1). Степень гидролиза 1-, ГШ Шазой Н в присутствии олигонуклеотила IX удобно оценивать в чксп^^-ймвитах с меченой по 3'-концевому нуклеотиду 1GS РНК. При О—лллш 3' концевых нуююотидов происходит исчезновение Гмиот<тивной зоны tas FUK- При реконструкции с г, jt-v- <'"xnWTO олрлэоввмю субчастии, идентичных по срлижмгоимоигам

характеристикам натиышм 30S субчастицам, однако отщепляющийся малый фрагмент не ассоциировал с остальной частью молекулы 16S РНК.

ТЛКЛЩА 1

Условия гидролиза 16S РНК РНКазоЯ Н в присутствии синтетических олигодезоксирибонуклеотидов. (Гидролиз проьодался 2,6 ч при 4°С в буфере: ю Ш Трис-HCl, рн 7,3, ю кМ Mgci?, гоо нЫ KCl, о,1 мЫ дитиотреитола)

Номер и последовательность Место сьязы- Полярное рнкячи к

сишгодезоксирнбонуклеотида ваыия слиго- соотношений

нуклеотида олиго/РНК ,л-3

на 16S РНК ид

i catcctctca 296-304 iii 1,3

ii tttgctccc 773-782 1:2 2,6

ii- ccagjtatctaatcctgtg 781 -800 1:5 1.3

iii cgt caatt с attt 913-925 1,6:1 1.0

i? catgtcaag 990-9э8 0,6:1 1.2

v cctgtct 1043-1049 1.5:1 3,25

vi cgtaagggc 1207-1215 2:1 4,0

vii gatgtgtg6cag 1392-1406 1:1 2.6

tili ассггстт 1499-1506 1;1 1.3

IX gaggtgatc 1530-1539 1:1 2,0

Была ассльдоьааа способность 306 субчаслсц, содержащих J6S РЩ IX ассоциировать с 50S субчастицами. Способность к образованию 70s -рибосом оказалась сниженной на 30S по сравнению с ЗСВ субчасмцами, содержащими наганную 16S РНК (см. таблицу 2). 3üs субчастицы инкубировали с 506 субчастицами в буфере с то2 т

ионной силой я составом, который используется при анализе биологической активности рибосом. Хотя этот анализ проводился в неравновесных условиях, полученные данные свидетельствуют о гетерогенности популяции 30S субчастиц с 16S РНК IX. Очевидно, что ассоциация субчастиц нарушается при удалении 3'- концевых нуклеотидов.

3QS субчастшщ, реконструированные из 16S РНК IX, были полностью активны в полиÍU) - зависимой системе трансляции. Трансляционная активность в бесклеточной системе с US2 РНК снижалась до 45*. Однако полученные субчастицы могли правильно узнавать инишаторные кодоны fe природной матрице и потеря активности рибосом была связана, очевидно, с замедленным синтезом основного продукта.

2. 30S субчастиш, содержащие 16S РНК фрагментированную в районе 1400 я 1500 И.О.

В настоящее время установлено, что в образовании декодирующего центра рибосомы участвуют несколько консервативгах районов 16S рРНК. которые объединены в сложную высокоорганизованную структуру.

Для исследования данного района 16S РНК мы использовали два олигонуклеотида, комплементарных 1392-1408 н.о. и 1499-1506 н.о. В этих случаях степень гидролиза 16S РНК РНКазой H также было удобно оценивать в экспериментах с меченой по 3*-концевому нуклеотиду 16S РНК. При отщеплении фрагментов РНК с 3* конца происход!" иэчезновение радиоактивной зоны 16S РНК и возникновение ее i рчй :не фрагментов.

пгч типа Фрагментированной РНК образуют 3QS субчастицы при реконструкции .с белками, однако при этом происходит потеря 3' которых фрагментов. Была исследована способность {-•кг не груироведных 3GS еубчэсткп. содержащих оба типа фпг^нтированиой FHK, о'; *>?ем,пагь vos рибосомы при к .-.м.:¿•»Я-.'трии с tos сусччстипзми. '.казалось, ч*.способность к

ассоциации и иСразоь.аниш VOS рибосом понижалась до 65* и 'îb% у 80s еубчасгиц, содержащих itó РНК VI1 и 16S РНК VIII, соотьетстьенно (см. таблицу 2).

30 суочы'тшш, содоржащио 16S РНК vu были практически наактш,¡ü ь би(жлс1ТОЧ!ий систем« трансляции, как с ноли( U J, так и о «Sí l'HK. По-ьидимому, расщьглеиие ь районе 1400 и.о. и потеря 3' - концевого 140 н. фрагмента приводит к утрате ьсех рибосомных функций.

При рнсщеильнии ь районе 1500 и.о. и реконструкции ЗШ оуочасаиц происходит потири 40 н-. фрагмента. Однако, такие субчаотици сохраняют заметный уровень -.тиьности в бесклеточной CHi.-i'nMtí с природной матрицей (4Ъ%). Неожиданным оказался факт практически полного отсутствия активности у таких рибосом в Обсклвточной системе трансляции с пслй(и).

Полученные результаты подтверждает значимость З'-коицеього района Ш; РНК. При расдонл&иш в районе 1400 и.о., очевидно, разрушается одна из важных составляющих декодирующего центра рибоси-мы, что и приводит к инактивации 30S субчастиц, сохранение способности частично связываться с &0S субчастицей свидетельствует о су-щиствоьшши других вьмшх участков 1б£ РНК, которые участвует в ассоциации. Что Khccitíюя расщепления в районе 1500 н.о., то в этом случае неполная функциональная активность обусловлена, видимо, иамьншшам структуры а и.1ш р участков полученных рибосом.

3. 3tfc иубчастици, содержащий IBS IHK фрагмьнтироьанну^ в районах 990-998 и.о.; 1043-1049 и.о.; 1^07-1215 н.о.

Ь ПрИсу ТоТЬИИ ОЛМиНулЛиОТИЦа V происходит рЬСЩсШкШИО но ¡J-J7 и.о. (M&cfo разрыва установлено зд кюшфэвашюм, Гайда Г.З.). H случаи олигояуклеотидоь IV a vi точное место разрыва не определялось, однако район разрыва легко устанавливается по появлению фрагмкнюь соответствующей длины в денатурирующем ПААi1 (-990 и -ЬЬО; -1200 и -340 н.- соответственно). В полном соответствия с модйл^ю аторичной структуры Ítili PÍE E.culi разрывы во всех

фрагментированншс И1К оказались скрытыми и баз дополни и<-.-п и ф обработки не проявлялись.

ТАБЛИЦА 2

АССОЦИАЦИЯ РЕКОНСТРУИРОВАННЫХ ЗСК ОУЬ'ЧАО'ГИЦ С ЬОВ СМ'ШЧ'ИИАМИ И ИХ ТРАНСЛЯЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ

16Б РНК * 303 суОчастиц, ассоциированных с 503 субчастицами % Активности ряКОШ-тр. 303 оубчасгиц ь при! поли (и) ]

Иативная 100 100 100

I - 45

II 0 35 -

II' 0 5 го

III 60 50 45

IV - 90

V - 30 -

IV, V - 30 60

VII 65 3 10

VIII 75 5 45

IX 70 95 45

Гидролиз РННазой Н в присутствии сразу двух олигонуклоотидов IV и V приводит к образовании ~50 н. фрагмента (~у90-10-17 и.о.). Надо отметить, что в этом случав гидролиз по шз<лу свлмышил олигонуклеотида IV, по-видимому, облегчает гидролиз по меоту связывания олигонуклеотида V. Полный гидролиз 163 РНК дыл'тъ&тгщ легко и воспроизводимо при. совместном присутствии утих олигоиуклеотидов (рис.5, дорожка 2 ). Гидролиз проводили также в присутствии одновременно трех олигонуклеотидоь IV,V,VI (рис.5, дорожка 4). 150 н. фрагмент, представляющий слбсй имрхнш чьеть 3«концевого главного домена,-мотет бить Лагко оад^л«.! при снил-ший концентрации ионов Mg2+ (до 3 мМ)'. Фрагменты 1- и:/< и.о. и 200-1542 н.о-. не разделяются в ¿тих усмшя/,.

Рис. 5. Электрофоретическкй анализ фрагментировоннов 165 РНК: 1-фрагменты 16в РНК У,?1, выделенные из реконструированных ЗОБ суочастиц; 2-163 РНК 7,71; 3-фрагменты 165 РНК Т1,У,П, выделенные из реконструированных ЗОЭ субчастиц; 4-16Б РНК

1047-1200 н.о. представляет собой относительно автономную структуру в 165 FHK, не связанную с остальной частью молекулы сильными третичными взаимодействиями.

При реконструкции 16S РНК IV, v и 16S РНК IV, V, VI образуются РНП частицы с коэффициентом седиментации 305. При этом происходила полная потеря 50 н. фрагмента, все остальные фрагменты входили в состав образовавшихся частиц (рис.5, дорожки 1,3). Небольшой шпилечный участок, вырезаемый в 16S РНК IV, v, по-видимому, не участвует ни в каких дальних взаимодействиях. В противоположность ему 160 н. фрагмент, очевидно, вовлечен во внутримолекулярные взаимодействия, организующие структуру оубчпстшш. Эти взаимодействия должны в значительной степени индуцироваться белками. В процессе реконструкции при использовании РНК, Фрагментированной по 1047 н.о. и в районе 120G н.о., происходит образование нормальных 30S су?чэстиц.

При исследовании РНЛ-частиц, содержащих делегированную РНК, для реконструкции использовали материал, выделенный при центрифугировании из пика, соотретствуш^го дьум фрагментам '{ис.Г>а, зона I, рис.7). В случзе с-Срэзупци'-ся РНП-Ч'а 'тиаы

и*-ли значительно более низкий ss-нг '"Д-лм-'нтчйг.«.

н'»гигнн*? .?(.«• «-участии« - -/»X*- с.Ъ/. :"-'К, ч из

Т * 1 3 4

— —.110

—> —J0

Вероятно, район

этих частиц также состояла из двух фрагментов (рис.?, дорожка 4). Уменьшение коэффициента седиментации, по видимому, может происходить либо за счет уменьшения компактности частиц, содержащих по-прежнему все компоненты, либо за счет потери части белков, способность связываться которых снижается при потире 160 н. фрагмента.

При анализе' белковой части полученных частиц с помощью двумерного электрофореза было обнаружено, что происходит полная

Рис. 6. а) Разделение фрагментов 16S РНК Y,VI в градиенте плотности сахарозы. Зона I соответствует фрагментам 1-1047 н.о. и "12ГЮ 1542 н.о. Зона II - фрагменту 1047-~1200 н.о.

Ъ) Анализ РНП-комплексов, полу -чанных при реконструкции с рлбо • сонными белками фрагментов РНК, выделенных из зоны 1 (см. выше).

Что касается S10, то факт его отсутствия в таких суочастшшх на кажется столь удивительным, как отсутствие S5. Согласно карте самосборки белок S10 является "поздним" белком при реконструкции и его связывание в значительной степени зависит от S7, зэ, 319. Его локализация в районе 1120 н.о.160 н.о. 3' концевого домена основывается на данных по сшивкам, а такж« химического и энзиматического футпринтинга.

По данным нейтронного рассеяния белок ß5 располагав „м рялсм с белками S4 .и S12. С помощью УФ сшявик устанйЯ.-..-ю, чг.> взаимодействует с районом fcS9 560 н.о. и Ь' к..ч р -.л .' м tu;

потеря двух белков - Sb и sio.

вшшра фраков

ИКС. оч"1чшт, при потере "верхней** части 3' концевого района 163 ШК (ИМ-Ч- " 1,г;оо и.о., см. рис. 1) происходят конформапионные тройки во всех демонах (63 РНК, приводящие к изменению 01-и.ч*ш)т. мест связывания болка Б5.

При исследовании биологической активности 305 субчастиц, с<ч|"рк.')пшх Фрагмрнтировинную гак - 16Э РНК iv, v, а также 16Б РНК 1V, V, VI би.чо покапано, что внесение разрывов в данный район '> бэ гик н« приводит к полной инактивации рибосом. Однако, фрагментация и пи долипия снижает активность ЗОБ субчастиц при трансляции ¡. 1ни<4) нл 70% и 31* соответственно. К тому же активность 303 ■ у^чпгтиц, в которых отсутствует БО н. фрагмент, в бесклеточной ¡и'-мчи трансляции в присутствии И32 РНК была'ниже, чем 303 < у'чпгтиц. содержащих 168 РНК IV. Возможно, этот факт объясняется •"•н. что долетировапний фрагмент находится в непосредственной |\ч!|.щпти пт мИИ связывающего центра 303 субчастицы.

Рис. 7. Электрофоретический анв-лиз (6б РНК: 1 - 16Э РНК У,У1; 2 - нативной 16Э РНК; 3 - фрагментов 165 РНК У,У1, выделенных из зоны I (см. рис. 6а); 4 - фрагментов 1бэ РНК. выделенных из реконструированных РНП-комплексов (см.заштрихованную зону на рис. 6,ь); 5 - ~160 н. фрагмент, выделенный из зоны II (см. ркс. 6,а).

4. SOS субчастицы, содержащие 16S РНК фрагментированную районе 770-800 н.о.

В центральном районе 16S РНК E.ooli - 770-800 н.о. было .найдено сразу несколько очень консервативных нуклеотидов, что указывает на его функциональную значимость. В настоящее время .появилось множество данных, свидетельствующих об участии этого района в ассоциации субчастиц, в связывании тРНК в Р участке рибосом.

В присутствии олигонуклеотидов II и II', комплементарных району 772-782 н.о. и 781-800 н.о. соответственно, были получены 16S РНК, несущие разрывы в центральном участке. Район разрыва легко устанавливается, так как образующиеся фрагменты практически одинаковы по длине и не разрешаются при электрофорезе в денатурирующем ПААГ (рис. 2, дорожка 5>. В случае использования олиго-нуклеотида II место разрыва определено секвенированием (Манькин А.С.)- после 776 н.о. Оба разрыва не являются скрытыми, т.е. частичная денатурация на фрагменты происходит в неденатурирущих условиях. Кратковременный прогрев при 60° С даже в буфере ТМ (с высокой концентрацией ионов Ug2+) приводит к их полному разделе-, ншо. Обратный процесс - ассоциация двух "половинок" свободной 16s РНК II - не происходит даже при длительном отжиге денатурированной 16S РНК И (рис.3, дорожки 5-7, рис.8). Таким образом, внесение разрыва в центральный район 16S РНК приводит к разрушению нескольких спиралей. Легкость диссоциации фрагментированной РНК объясняется, очевидно, тем, что разрывы находятся в участке вблизи границы домена и оба фрагмента. представляют собой самостоятельные структурные единицы.

Для того, чтобы определить минимальное число белков, участвующих в процессе объединения двух "половинок" 16S РНК, были исследованы комплексы фрагментированной в центральном районе 16S РНК с S4; S8; S4.S8.S16/S17; S4.S8.S16/S17. Получение соответствующих комплексов проводили в условиях реконструкции 203 субчастиц in uttro, т.е. при инкубации 16S РНК с белками в буфере ТМК (буфер ТЫ, содержащий 330 мЫ КС1) при 37°С.

Рис. 8. Анализ 185 РНК II в градиенте плотности сахарозы: а) нативная 163 РНК; Ь) 163 РНК II» о) 165 РНК II, инкубированная в буфере ТЫ 3 мин при 60°С.

ншаро фракций

Для получения изолированных "половинок" были использоваш вяледентае при центрифугировании в сахарозном градиенте tn пика, соответствующего изолированным фрагментам денатурированной 163 РЖ II (рис.8 о, заштрихованная зона). При г'юм обрпзоватше комплексов 16s РНК - белки, по седиментаниошшм характеристикам не отличающихся от комплексов, нативной 16S РНК, поблюдалось лишь в случае S4.S16/S17; и S4,S8,S16/S17 (рис.9).

В случав же S4 или S8 происходило связывание белков с Сегментами 16S РНК II, но образования единого комплекса, содержащего две "половинки" 16S РНК II и белки, не наблюдалось. Во псех случаях присутствие белков устанавливалось с помощью электрофореза по Лэммли. При этом исследовались фракции, поотвотствующие либо комплексу 16Б РНК - белок, либо "половинки" -билок.

Полученные данные свидетельствуют о том, что отдельно взятых '¡илков S4 и 88 недостаточно для объединения двух "половинок" РНК. При исследовании комплексов фрвгмэнтироваиной 16S ГНК с суммой <1?ЛКОВ S4.!-" i 6/517 и S4,f-3,S16/S17 ûur-.o аггозанз, ЧТО S4.n<i/S17

стимулируют образовании комплексов, содержащих обо "пиноьинки" ЦЬ РНК и белки. В присутствии бежа Ей образующиеся комплексы Оолво стйбилыш и компактны (рис.9). Связывание бельов si, sió/tni вызывает кснформационные- перестройки в 6' концевом и центральном доменах, находяцихся в одной из "половинок", что, очевидно, обусловливает связывание 3' концевой "половины" 16й ГНК, Присутствие бежа S8 способствует образованию более прочного комплекса, так как S8 оказывает влияние на конформьцию всего центрального домена. Кроме того, ' связывание белка su (¿бант обеспечивать дополнительные моста контактов sití с ррнк.

В условиях реконструкции ЗОБ субчастиц с 16S Piüi п ■ образуются РНП комплексы, которые по своим седиминтациошшм характеристикам не отличимы, от нативных 30s субчастиц. При этом всегда наблюдалось легкое плечо, величина которого составляла 1520% пика 30S субчастиц (рис.4,с ). Очевидно, плечо представляет собой РНП частицы, состоящие из отдельных "половинок" РНК п некоторых белков. Субчастицы, содержащие фрагментированную в центральном районе 16S FIÍK, оказались неспособными образовывать 70s рибосомы даже при достаточно высоких концентрациях ионов м^' (см. таблицу г)

В то se время, 30S субчастицы, реконструированные из 16s РНК II сохраняли способность функционировать в бесклеточной системе с: поли(и), как в случае образования 30S субчастиц из неденатурированной фрагментированной РНК, так и при реконструкции из отдельных фрагментов (-35SS активности, табл. 2). При использовании же 16S РНК II' происходит практически полная потеря активности образовавшихся 30S субчастиц, как в случае поли(и)-зависимой 'трансляции, так и в случае использования в качестве матрицы MS2 РНК. Очовидно, в процессе трансляции наряду с конформацией РНК первостепенную роль играют определенные нуклеотидные остатки рРНК. В случае расщепления по 776 н.о. сохраняется целостность очень консервативной петли 790- 800 н.о. и', вероятно, вти нуклеотидц- в присутствии м1НК и тРНК могут находиться в нужной конформацни, что и позволяет полученным 30S субчастицам ассоциировать с 5(Е субчпсищчми и сохранять частичную способность функционировать.

5. 30s субчастицы, содержащие 16s РНК фрагментированную в районе 296-304 н.о.

В случав использования олигонуклеотида I расщепление РНКазой Н происходит после 301 н.о. (место разрыва установлено секвениро-ванием Гайда Г.З.). Разрыв является скрытым, так как фрагменты не удалось разделить без дополнительной денатурирующей обработки. Однако кратковременный прогрев при 60 С приводит к разделению фрагментов. Восстановить исходную структуру после отжига в условиях реконструкции не удается (рис. 3, дорожки 2-4 )•

РНП частицы, реконструирование из 16Б РНК I не отличались от нативных по седиментационным характеристикам и сохраняли достаточно высокий уровень активности в бесклеточной системе трансляции в присутствии М32 РНК - 85% и поли(и) - 45%.

*

Рис. 9. Анализ в градиенте плотности сахарозы РНП-комплек-сов, содержащих "половинки" 163 РНК II и рибосомные белки: а). Б4; Ъ). Б4. 316/517; 0). Б4, Б8, Б16/317.

с

• I

I

II

6.30S субчастацц, содержащие 16s' РНК сегментированную в районе 913-925 н.о.

При гидролизе РНКазой Н 16S. РНК в присутствии олмгонуклеотида III происходит образование двух фрагментов длиной -920 н.о. и ~620 н.о. (рис. 2, дорожка 1). Если обратиться ко вторичной структуре 16s РНК, то легко заметить, что для разделения фрагментов в данном случае не требуется разрушить ни одного спирального участка. Поэтому не удивительно, что 16S РНК III существует частично в виде отдельных фрагментов в буфере с понинйнной коцентрацией ионов Mg (1-3 мМ). Легкость диссоциации фрагментов в данном случав сравнима с диссоциацией 16S РНК II. Однако, 16s РНК II в данных условиях практически не содержит целой 16S РНК. Такое поведение трудао объяснить, анализируя лишь вторичную структуру. Очевидно, должны существовать третичные взаимодействия между 3' концевым доменом и остальной частью молекулы 16S РНК, которые чзстично поддерживают целостность РНК.

Фрагментированная РНК сохраняет способность реконструироваться в 30S субчастицы, которые могут ассоциировать с 60S субчастицами. В этом случае образуется лишь "60$ 70s рибосом (см. табл. 2). Уровень активности рибосом, содержащих 165 РНК III, как в случае использования MS2 РНК, так и в присутствии поли(и) составлял ~50% активности рибосом, содержащих нативную 163 РНК.

В этом случае гидролиз РНКазой Н разрушает- район, объединяющий три главных домена вторичной структуры 16S РНК и участвующий' в образовании псевдоузла, которому приписывается важнейшая структурная роль. В лаборатории Ноллера найдено, что G926 является одним из нуклеотидов, участвующих в образовании декодирующего центра рибосомы и его доступность химической модификации изменяется при активации рибосом. Мутации, определяющие устойчивость к стрептомицину, вызывающему ложное кодирование, также располагаются в этом районе. Замена с на и в положении 912 н.о. позволяет _ приобрести устойчивость к стрептомицину.

Таким образом, учитывая вышеизложенные фякгы, мскнэ предположить, что структура этого района ьшп для прпьил!ного функционирования. Однако, достаточно высокий урсьень «ктйености

рибосом с 16S РНК III свидетельствует о наличии третичных взаимодействий между различными участкэми РНК, образующими декодирующий центр 30S субчастицы, которые обеспечивают структуру, необходимую для нормального функционирования рибосомы.

ВЫВОДЫ .

1. Методом направленной фрагментации РНК РНКазой Н в присутствии синтетических олигодезоксирибонуклеотидов могут быть получены 16S рРНК Е.coli с единичными разрывами в целом, ряде районов. Фрагментированная 16S рРНК с высокой эффективностью вступает в процесс реконструкции с рибосомными белками, образуя при этом 30S субчастицы.

2. Исследована стабильность изолированной 16S рРНК, фрагментированной в районе 770-790 н.о. Показано, что ассоциация фрагментов 16S рРНК может происходить лишь в присутствии рибосомных белков. Минимальный набор белков, приводящий к ассоциации фрагментов РНК, содержал белки S4, S16/S17.

3. Использованный подход позволяет получить рмбонуклеопротеидные частицы, содержащие делеции в 16S рРНК. Делеция 50 н. фрагмента ("990-1043 н.о.) не препятствует образованию 30S субчастиц, частично сохраняющих трансляционную активность. В рибонуклео-протеидных частицах, содержащих 16s РНК с делецией в районе 1047 н.о.-~1199 н.о. отсутствовали белки S5 .И 510.

4. Фрагментация 16S рРНК в составе 30S субчастиц всегда приводит к снижению способности транслировать как природные, так и синтетические матричные РНК. Трансляционная активность таких субчастиц зависит от положения разрыва. Полная инактивация 30s субчастиц происходила при расщеплении 165 рРНК в районах 790 н.о. и 1400 и.о., что указывает на прямое участие этих районов РНК в функционировании рибосом.

Основные результаты публикациях:

диссертации изложены

в следующих

1.Афонина 2.И.. Гайда Г.З., В.Я.Стельмащук, Н.В.Чичкова, ■А.А.Богданов Рибосомы с одиночными разрывами: получение и

биологическая активность. Молекулярная биология т.22, вып.2, с.446-453, 1988.

2. Afonina В., ChiohJcova N.. Bogdanova S., Bogdanov A. 30S . ribosomal subunite with fragmented 16S RNA: a new approach for Btruoture and funotion study of ribosomes. Bioohimie, v.72, n.5, 1991.

3. Afonina В., Chichlcova N.V., Bogdanov A.A. RNA-RNA and RNA-p rote in interactions in 30S ribosomal Bubunits: AsBooiation of 163 rRHA fragments in the presenoe of ribosomal proteins. PEBS Lett. 1991 (in press).

4. Афонина Е.И. 30S субчастицы рибосом E.ooli, содержащие Фраг-ментироваянув 16s РНК. Всесоюзная конф. молодых ученых-химиков 1986. Рига, с. 37.

5. Bogdanov A., Afonina Е., Chiohkova N.. Bogdanova S. A new approach to the investigation of structure and funotion of ribooome. "Regulation of translation" International Symposium Riga, USSB, 1989, p.43.

6. Афонина Е.И., Чачкова H.B. Получение 30S рибосом, содержащих делотированную 16S РНК. 5-я конф. молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии, Пущино, СССР, 1988, с.99-100.

Подписано в печать II.04.91г. Заказ 556 Форшт 60x90/16 Тирад 100_

Москва. ТшГОРрафая ВАСИШ