Разработка и применение метода САЙТ-направленной фотохимической модификации для изучения пространственной структуры протяженных р-РНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

' \ О

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 576.85.48

БАРАНОВ Павел Викторович

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА САЙТ-НАПРАВЛЕННОЙ ФОТОХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ПРОТЯЖЕННЫХ рРНК.

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных веществ.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1998

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факуль Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и а Институте молекуля[ генетики им. М. Планка, Берлин, Германия.

Научные руководители: академик РАН, д.х.н., профессор A.A. Богданов, д.х.н., профессор O.A. Донцова

Научный консультант: профессор

Р. Бримакомб

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, Готтих Б.П.

доктор биологических наук Аграновский A.A.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии СО РАН.

Защита состоится 6 октября 1998 года в 17 часов на заседании Диссертационного сс Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. i Ломоносова по адресу: . 19899, Москва, Воробьевы горы. Институт физико-химической биол им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ Автореферат разослан 30 августа 1998.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Рибосома представляет собой сложный макромолекулярный комплекс РНК и белков, осуществляющий биосинтез белка во всех живых организмах. Таким образом, исследование структуры рибосомы представляет собой огромный научный интерес. В связи с крупными размерами рибосомы определение ее структуры является крайне сложной задачей. Несмотря на значительные успехи в развитии структурных физико-химических методов, к настоящему времени удхтось определить структуру рибосомы лишь с относительно низким разрешением (9А). Такое разрешение дает представление о форме рибосомы и даже позволяет выявить определенные спиральные районы РНК в рибосоме, однако, не позволяет соотнести эти районы с известными элементами первичной и вторичной структуры. Единственный способ представить себе реальное расположение РНК в рибосоме -компьютерное моделирование, основанное на комбинации данных о структуре рибосомы полученных с низким разрешением с помощью РСА или криоэлектронной микроскопии, вместе с данными, полученными с помощью различных биохимических методов. Однако, следует заметить, что количество биохимических данных для разных районов РНК значительно зарьнруется и, как следствие, различные области моделей рибосомы построены с разной степенью достоверности. В связи с этим совершенно необходимой является разработка методов, позволяющих избирательно изучить структуру отдельных районов рибосомы.

Цель работы. Разработка и применение метода направленной фотохимической модификации рнбосомных РНК.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе был разработан универсальный метод для внесения фотохимической пробы в выбранные районы высокомолекулярных РНК, в частности, рибосомной РНК. Метод основан на гидролизе РНК с помощью РНКазы Н в присутствии модифицированных олигорибонуклеотидов. Фотоактивируемый нуклеотид, например 5'-3'-дифосфат тиоуридина, вводится в место разрыва в РНК с помощью РНК лигазы. Фрагментированная РНК, несущая фотоактивируемый нуклеотид, впоследствии ассоциирует с рибосомными белками с образованием активных рибосомных субчастиц. Далее такие рибосомные субчастицы облучаются мягким УФ-светом и полученные пришивки анализируются с помощью стандартных методов: гидролиза Р!-ГКазой Н и обратной транскрипцией.

^гот метод был успешно применен для 16S рРНК. Дифосфат тиоуридина был присоединен к нуклеотиду 1041 39 спирали 16S рРНК и пришит к двум нуклеотидам спирали 41. Полученные данные, с одной стороны, согласуются с ранее описанными сшивками между этими спиралями, которые получали облучением рибосом жестким УФ-светом. и. с другой стороны, позволяют судить о взаимной ориентации спиралей 39 и 41 в 30S субчастице.

Использование данного метода для 23S рРНК позволило получить и идентифицировать ряд внутренних РНК-сшивок. Несколько сшивок были получены внутри одних и тех же элементов вторичной структуры. Такие пришивки могут служить, с одной стороны, независимым подтверждением предложенной вторичной структуры рРНК и, с другой стороны, проясняют особенности структуры спиралей, в которых они были получены. Также было получено несколько пришивок между различными элементами вторичной структуры 23S рРНК. На основании этих данных можно утверждать, что спирали 21 и 22 домена 1 23 S рРНК сближены в пространстве, и скорее всего расположены антипараллельно по отношению друг к другу. Также было показано, что спирали 41 и 42, находящиеся в непосредственной близости к району связывания элонгационных факторов, формируют "U-образный" поворот.

Полученные данные открывают новые возможности изучения структуры рРНК; они несут новую важную информацию о конформаши ряда элементов рРНК и .могут значительно помочь моделированию пространственной структуры рибосомы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международной конференции "Взаимодействие лигандов с рибосомой", Москва-Гурзуф, 1994, на международной конференции "Контроль трансляции", Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк (США), 1994, на 3-м международном симпозиуме "Биоорганическая химия", Дагомыс, 1995, на международной конференции "Frontiers in translation", Виктория (Канада), 1995, на 1-й ежегодной конференции международного РНК общества, Мэдисон (США), 1996, на всероссийской конференции студентов и аспирантов, Москва, 1997, на 2-й ежегодной конференции международного РНК общества, Альберта (Канада), 1997. на третьей международной конференции посвященной памяти Энгельгардта, Волга, 1997, на 3-й ежегодной конференции международного РНК общества, Мэдисон (США), 1998, на международной Гордон конференции "Исследования нуклеиновых кислот" Нью-Порт, Род Айлэнд (США), 1998, на международной конференции "Структурные исследования рибосомы и ее функциональных комплексов", Ганновер (Германия), 1998.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на _ страницах

машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен структуре 235 рРНК), результаты, обсуждение результатов, материалы и методы,

выводы. Материал иллюстрирован_рисунками. Библиографический указатель включает

_цитированных работ.

Содержание работы.

1.Разработка метода сайт-направленной фотохимической модификации рнбосомных

РНК.

Большой успех в изучении структуры мРНК-связывающего центра рибосомы был достигнут благодаря методу сайт-направленной фотоаффинной модификации мРНК. Этот метод был основан на включении фотоактивируемых нуклеотидов в природные аналога мРНК путем Т7 транскрипции. Использование мРНК, содержащих статистэтески встроенные фотоактивируемые нуклеотиды, с одной стороны, позволяет генерировать строго специфические пришивки между мРНК и рибосомными компонентами, и, с другой стороны, позволяет сравнительно легко проанализировать положение этих пришивок как в составе мРНК, так и в составе рРНК.

К сожалению, такой метод применим только для коротких РНК, например для 55 рРНК. В случае протяженных рРНК, таких как 16Б рРНК и 235 рРНК его применение невозможно, в первую очередь, ввиду их большого размера. Ранее в нашей лаборатории было показано, что ЗОБ субчастицы рибосомы могут быть реконструированы из 16Б рРНК, содержащей разрывы в определенных положениях, причем реконструированные субчастииы, в отдельных случаях сохраняют до 80% своей активности. Эти данные привели к мысли о создании метода сайт-направленного введения фотоактивируемых нуклеотидов в рРНК. Метод основан на гидролизе рРНК по единичной фосфодиэфирной связи, введении фотоактивируемого нуклеотида в рРНК и последующей реконструкции субчаспщ рибосомы из такой модифицированной рРНК и рибосомных белков.

Основной проблемой, которую было необходимо разрешить, оказался выбор универсального метода, позволяющего вносить специфические единичные разрывы в цепи

рРНК. Одним из способов, с помощью которого возможно осуществление данной задачи, было применение синтетических рнбозимов. Однако, выяснилось, что гидролиз рибосомной РНК под действием рибозимов проходит с очень низкой эффективностью. К тому же, использование рибозимов накладывает определенные ограничения на выбор нуклеотидной последовательности в рРНК для внесения разрыва. По этим двум причинам использование рибозимов для решения данной задачи оказалось неприемлемым. С другой стороны, известно, что РНКаза Н гидролизует РНК в РНК/ДНК-дуплексах по всей их длине. В то же время из литературных данных было известно, что использование олигодезоксирибонуклеотидов содержащих различные модифицированные нуклеотиды, может резко повысить специфичность гидролиза РНК РНКазой Н. Основываясь на этих данных было решено синтезировать химерные олигонуклеотиды, содержащие четыре дезоксирибонуклеотидных остатка на 5'-конце и около 10 2'-0-метил-рибо либо незамещенных рибонуклеотидных остатков в основной части молекулы, комплементарные определенным районам РНК. Дезоксирибонуклеотидная часть таких олигонуклеотидов необходима для узнавания субстрата РНКазой Н, а модифицированная часть олигонуклеотида необходима для того, чтобы гибридизация такого олигонуклеотида происходила в строго определенном выбранном месте рРНК. Положение разрывов, вносимых РНКазой Н, определяли с помощью метода обратной транскрипции (Рис 1). Оказалось, что РНКаза Н в присутствии таких химерных олигонуклеотидов гидролизует РНК только по одной фосфодиэфирной связи, причем, в подавляющем большинстве случаев гидролиз происходит строго на границе между однотяжевой РНК и РНК находящейся в дуплексе со стороны 3'-конца. Таким образом, проблема внесения направленных единичных разрывов в рРНК была успешно решена. Позднее было сделано наблюдение, что гидролиз РНК в присутствии химерных метилированных олигонуклеотидов происходит с большей эффективностью, чем в случае ДНК-РНК-олигонуклеотидов. К тому же ДНК-РНК-олигонуклеотиды менее устойчивы при длительном хранении. Поэтому впоследствии в работе использовались только метилированные олигонуклеотиды.

Далее 165 рРНК содержащие разрывы в различных положениях использовались для реконструкции в 305 субчастицы. Реконструкционную смесь центрифугировали в градиенте плотности сахарозы. Об образовании ЗОБ субчастиц судили по соответствии положения пика в сахарозном градиенте, соответствующему положению нативных ЗОБ субчастиц. Оказалось, что гидролиз 16Э рРНК по некоторым фосфодиэфирным связям не оказывает существенного

Э

влияния на ее способность реконструироваться а ЗОЭ субчастицы. В то же время, гидролиз некоторых определенных связей в 165 рРНК приводит к полной потере способности 16Б рРНК образовывать ЗОБ субчастицы. Видимо, это каким то образом связано с важностью этих районов в формировании третичной структуры рРНК. Однако, было обнаружено большое число положений в 16Б рРНК, гидролиз которых не влияет на последующую реконструкцию, и эти положения являются пригодными для применения описанного нами метода.

Рисунок 1. Анализ положений разрывов а 16Э рРНК с помощью обратной

транскрипции. А, С, б, и -дорожки сиквенса по Сэнгеру; К продукты обратной транскрипции исходной 16Э рРНК; X

- фрагментированной 163 рРНК. Стрелками указаны зоны соответствующие положениям разрывов з рРНК. Рисунок А-для 163 рРНК. фрагментированной по положению 565-566; В

- 712-713; С -11411142

РНКаза Н гилролизует РНК таким образом, что на З'-конце в месте разрыва образуется свободная гидроксильная группа. Следовательно, эта группа может служить субстратом для РНК-лигазы. Было решено лигировать радиоактивномеченный фотоактивируемый нуклеотид с З'-концом рРНК в месте разрыва с помощью РНК лигазы. Результаты лигироваяия представлены на рисунке 2. Оказалось, что З'-конец РНК в месте разрыва действительно является очень хорошим субстратом для РНК лигазы. И совершенно неожиданно было сделано наблюдение что З'-конец самой 16Б рРНК, который также содержит свободную 3'-

пшроксильную группу, является гораздо худшим субстратом. На рисунке 2 отчетливо видны радиоактивномеченные фрагменты соответствующие 5'-концевым фрагментам рРНК, и совершенно не заметны зоны, соответствующие З'-концевым фрагментам.

А.

1 2 3

Рисунок 2. Разделение фрагментов 16Э рРНК I 4% ГТААГ после лигирования » радиоактивномеченным 5 '-3 '-дифосфатол тнеуридина. Дорожка 1 соответствует 16Е рРНК, фрагментированной по связи 565-566; '. - по связи 712-713; 3 - по связи 1141-1142. И этом рисунке отчетливо видно, чт< лигирование проходит в основном только Л1 5'-концевым фрагментам 16Б рРНК.

Степень реконструкции субчастиц после лигирования и очистки оценивали как помощью измерения оптической плотности, так и путем измерения радиоактивности. Бьи показано, что дополнительный нуклеотид не влияет на реконструкцию ЗОБ субчастицы, РНК фрагмент, содержащий тиоуридин, включается в малую субъединицу рибосомы. Таки; образом, нам удалось ввести фотоактивируемый нуклеотид в конкретное выбранно положение рРНК в составе рибосомы. Окончательная схема метода сайт-направленно фотохимической модификации рРНК представлена на рисунке 3.

5'

рРНК

.ишеряый олигокуклсотнд

РНКаза Н

3"

5'

рРНК

3'

рРНК

2 РНК лиг аза

Гр]зир

5Б рРНК, белки

УФ облучение, фенольная депротеинизация

Анализ пришивок стандартными методами

Рисунок 3. Схема метода.

2. Применение метода направленной фотохимической модификации рРНК для изучения структуры 16Э рРНК.

К настоящему времени накопилось огромное количество данных по фотохимическим пришивкам между различными компонентами рибосомы, РНК, белками, факторами и другими рибосомными лигандами такими как тРНК и мРНК. Эти данные представляют большой интерес для исследователей пространственной структуры рибосомы. Однако, литературный поиск этих данных представляет собой крайне трудную задачу. В целях облегчения этого поиска нами была создана база данных рибосомных пришивок. Эта база данных свободно доступна в сети Интернет по следующим адресам: Ьйр:/Л*ул«г.трт^-ЬегНп-dahlem.mpg.de/~baranov/DRC/ и http://ribosome.genebee.msu.su/DRC/ . Данная база данных использовалась нами позднее для выбора наиболее интересных для исследования районов рРНК.

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Номера фракций

Рисунок 4. Профили сахарозных градиентов. Жирная линия соответствует профилю натавной 30 субчастицы; обычная - 30S субчастицам реконструированным из нативной !6S рРНК. пунктирная - 30 субчастнцам реконструированным из 16S рРНК фрагментировалной по положению U41-U42. Черным квадратами обозначен уровень радиоактивности в фракциях градиента, содержащих 30S субчастиц реконструированную из 16S рРНК, фрагментированнуто по связи 1141-1142, с тиоуридинсм. присоединенны к нухлеотиду 114!.

Для апробации вышеописанного метода мы решили использовать положение 1141 в 16S рРНК Это место было выбрано по той причине, что для спирали 39, в которой находится нуклеотид 1141 известны пришивки со спиралью 41 и, таким образом данное положение может быть использовано для проверки достоверности данных получаемых при использовании предложенного нами метода.. Гидролиз рРНК осуществлялся с помощью РНКазы Н в присутствии олигонуклеотида deoxy(GGCC)-2'-OMe-(GGACCGCUGGC)-riboA. Как говорилось ранее РНКаза Н вносила разрыв строго по связи 1141-1142 (рис 1). Для того, чтобы оценить активность 30S субчаспш, содержащих такую рРНК, осуществляли ассоциацию таких субчастиц с 50S субчастицами с образованием 70S рибосом. Образование 70S рибосом анализировали путем измерения оптической плотности и измерения радиоактивности. Профили сахарозных градиентов для реконструированных 30S субчастиц представлены на рисунке 4. Как видно из этого рисунка фрагментация рРНК по связи 11411142 и введение дополнительного нуклеотида существенно не влияет на реконструкцию 30S субчастиц.

А. 2 3

В.

2 3

- I 5

#

1 '•

• V

•ig

* ZLs. s« А'-У-

.чй-^-Ув А' •,' "

в. :■

Рисунок 5. Анализ пришивок, полученных с помощью гиоуркдина, присоединенного к нуклеотиду 1141с помощью РНКазы Н. Каждой цифре соответствует

определенный набор нуклеотидов. Левые дорожки под каждой цифрой соответствуют необлученной РНК правые - облученной. Зоны соответствующие пришитой рРНК отмечены стрелками. Рисунки А и В соответствуют различным наборам олигодезокснрибонуклсотидов. На нижних схемах для каждой дорожки показаны фрагменты рРНК образуемые после гидролиза РНКазой Н в присутствии соответствующей комбинации

олигодезоксирибо нуклеотидов.

•

• 141

t i ч;

«j» i vj в i ш Л—<-

4 1Я1

Образование пришивок производили облучением УФ-светом с длиной волны около 350 нм. Полученные пришивки анализировал» с помощью РНКазы Н и метода обратной транскрипции. Метод РНКазы Н основан на использовании пар олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных рРНК. подобранных таким образом, что РНКаза Н вырезает в рРНК относительно короткий фрагмент ¿0-100 нукдеогидов, который легко отделить ог более тяжелых фрагментов в 4% ПАЛГ. В случае, если такой фрагмент образует пришивку с тиоуридином он будет радиоактивномеченным. Для того, чтобы пришивка существенно не влияла на подвижность фрагмента также использовался олигонуклеотид комплементарный району рРНК, в непосредственной близости от положения тиоуридина. Использование различных комбинаций олигонуклеотидов позволяет просканировать рРНК по всей ее длине. Анализ положения пришивки с помощью РНКазы Н представлен на рисунке 5. Было показано, что пришивка находится в районе 1270-1300 рРНК.

Рисунок 6. Анализ пришивок. пол>чей и их с участием тио^рилнна. присоединенного к нуклеотиду 1141. j помощью 'Обратной транскрипции. Дорожки А. С. Li. L' соотиегстпуют сякиепсу /НК н Сэнгеру; К - продукты транскрипции фрагмента !'iS рРНК*. не содержащего пришивки; X - продукты транскрипции фрагмента рРНК. содержащего пришивку. Стрелками обозначены юны соответствующие районам пришивки.

Для более точного анализа положения пришивки использовали метод обратной транскрипции. Для этого 150-200 нуклеотидный фрагмент эллюировали из теля и вводили и реакцию обратной транскрипции. Анализ положения пришивки с помощью обратной транскрипции представлен на рисунке 6. Было показано, что гиоуридин. присоединенный к нуклеотиду 1041. 16S рРНК образует сшивку с нуклеотидами 1272 и 1295. С одной стороны, эти данные демонстрируют правомерность описанною месь подхода, поскольку согласуются с другими данными по фотохимическому сшиванию рРНК в рибосоме. Ранее, независимо н двух лабораториях было показано, что спираль 39 (где расположен нуклеотид 1041) и спираль

К X А С G U

41 (где расположены нуклеотиды 1272 и 1295) сшиваются под действием жесткого УФ-света. С дри ой стороны, полученные данные проливают свет на взаимную ориентацию спиралей 39 и 41 в рибосоме. Возможный вариант взаимного расположения этих спиралей в пространстве представлен на рисунке 7.

Н41

Н39

Рисунок 7. Один из возможных вариантов взаимного расположения спиралей 39 и 41. Слирачь 39 обозначена черным цветом, спираль -М - серым. Атомы нуклеотида. к которому был присоединен гиоуридин. и атомы нуклеотидов участвующих а образовании пришивки показаны в аиде сфер. '

3.Применение метода направленной фотохимической модификации рРНК для изучения

структуры 23S рРНК.

Ввиду гого. что 23S рРНК почти в два раза длиннее 16S рРНК, анализ пришивок, полученных з нативных рибосомах с помошь/о жесткого УФ-света, представляет более трудную задачу в случае 23S рРНК, нежели а случае I6S рРНК. Вследствие этого, было получено большое количество данных о пришивках в 16S рРНК, в то время как в случае 23S рРНК их количество немногочисленно. Таким образом, изучение структуры 23S рРНК с помощью фотохимической модификации представляет собой больший интерес.

Ранее возможность реконструкции 50S субчастиц из фрагментированной 23S рРНК не изучалась. Поэтому, прежде чем использовать данный метод для изучения структуры 23S рРНК проводился поиск тех районов 23S рРНК. в которых гидролиз фосфодиэфирных связей не влияет существенно на способность 23S рРНК участвовать в реконструкции 50S субчастицы. Для этого разрывы в 23S рРНК вносились с помощью РНКазы Н в присутствии ряда оллгодезоксирибонуклеотидов, комплементарных различным районам 23S рРНК. Было проанализировано 8 районов 23S рРНК я обнаружено 4 района, разрывы в которых не препятствовали реконструкции 50S субчастиц. Эти районы и были выбраны лля

осуществления дальнейших исследований. Для внесения разрывов в 238 рРНК были синтезированы химерные олигонуклеотиды, представленные в таблице 1. Определение положений разрывов проводили методом обратной транскрипции (рис 8).

Таблица 1. Химерные олигонуклсотидь; использованные для внесения разрывов в 23Э рРНК. Последний олигонуклеотид в данной таблице частично комплементарен дополнительному району 23Э рРНК, этот район, а также положение дополнительного разрыва заключены в скобки.

GTCCCGCCCUAC-

^37248$^

b-ttZfjSZ

384-385^

* ^ -f.

GTG CUCUACCCC

856-867"

867-863

GGG CCUUCCCAC

1034-1045

1045-1046

GCC GACAUC GAG

24>9 2510 (1107-1117)

2499-2510 (1117-1118)

А С G U S К

к s а с а а

370- —

"" а.

380 - %

v —385

- Й * т» • . т

с

к s А С G U

т

& 1 Ш *-» 040

si

•V — —

- # Ä-1050

Рисунок 8. Анализ положений разрывов в 238 рРНК с помощью обратной транскрипции. А. С, С. Ьг -дорожки сиквенса по Сзнгеру; К - продукты обратной транскрипции исходной 23Б рРНК; 5 - фрагментированной 23Б рРНК. Стрелками указаны зоны соответствующие положениям разрывов в рРНК. Рисунок А для 235 рРНК. фрагментированной по положению 384-385; В - 867-868; С -1045-1046.

В

1 2 3 4 5

2510

1045 - _

Рисунок 9. Разделение фрагментов 23Б рРНК н 5Б рРНК после лнгироваяия с радиоактивномсяенным 5'-3'-дифосфатом тиоуриднна в 4% ГХААГ. Дорожка 1 соответствует 235 рРНК, не содержащей разрывов; дорожка 2 соответствует 233 рРНК, фрагменткрованной по связи 1045-1046; 2 - по связи 2510-2511; 3 - по связи 867-868. На зтом рисунке отчетливо видно, что ли гиро ванне проводит а основном только с ¿'-концевыми фрагментами 23Э рРНК и З'-концом 5Б рРНК..

5S

Как и в случае с 16S рРНК, З'-концевые гидроксильные группы в местах разрывов оказались хорошими субстратами для РНК-лигазы, в то время как лигирование тиоуридина с З'-концом самой 23S рРНК проходило с незначительным выходом (Рис 9). Однако 3'-концевая гидроксильная группа 5S рРНК оказалась хорошим субстратом для РНК лигазы. Поэтому все эксперименты по гидролизу 23S рРНК и ее лигированию с тиоуридином проводили с индивидуальной 23S рРНК в отсутствие 5S рРНК, а реконструкция проводилась ¡сак в присутствии белков, так и 5S рРНК. Профили градиентов, соответствующие реконструированным 50S субчастицам, представлены на рисунке 10.

В качестве функционального теста оценивали способность реконструированных субчастиц образовывать 70S рибосомы. Было показано, что все реконструированные субчастицы способны связывать 30S субчастицы, и как внесение разрыва, так и введение дополнительного нуклеотида оказывают незначительное влияние на эту способность.

0 2 4 6 8 101214161820

Номера фракций

Рисунок 10. Профили сахарозных градиентов. Жирная линия соответствует профилю нативной 50S субчастицы; обычная - 50S субчасгииам реконструированным из нативной 23S рРНК, пунктирная - 50S субчастицам реконструированным из 23S рРНК. фрагментированной по положению 1045-1046. Черными квадратами обозначен уровень радиоактивности в фракциях 1"радиента, содержащих 50S субчастицу, реконструированную из 23S рРНК. фрагментированной по связи 1045-1046 с тиоуридином. присоединенным к нуклеотиду 1045-1046.

Пришивки индуцировались облучением УФ-светом с длиной волны около 350 нм и анализировались с помощью РНКазы Н по той же схеме, что и для 16S рРНК (Рис 11). Анализ с помощью РНКазы Н показал, что тиоуридин, присоединенный к нуклеотиду 384 сшивается с районом 385-450 23S рРНК. Тиоуридин, присоединенный к нуклеотиду 867, образует пришивку с районом 880-910, тиоуридин присоединенный к нуклеотиду 1045, образует пришивку с районом 970-995, и тиоуридин, присоединенный к положению 1117 - с районом 1030-1045. Для тиоуридина, присоединенного к положению 2510, никаких пришивок обнаружить не удалось.

1 2 3 4 5

а:о эа?_8» 9Ю ж 9то юст^.

1 -35-,__Ш__

2____

3.

Л.' '

р« тою ,

1--га___

2__¡52__32__

3__по vi _

*-_

5----—_

1 2 3

Л.-»

940 юоо ибо гву

1 75 75 __

2. 3.

35 75 1575

Рисунок 11. Анализ внутримолекулярных сшивок в 235 рРНК с помощью РНКазы Н. Дорожки, обозначенные минусами соответствуют необлученной РНК, плюсами — облученной РНК. Зоны, соответствующие пришитой РНК обозначены стрелками. Рисунок А - для пришивок полученных из тиоуридина присоединенного к нуклеотиду 867, В - 1045, С -1117. На нижних схемах для каждой дорожки показаны фрагменты рРНК образуемые после гидролиза РНКазой Н в присутствии соответствующей комбинации

Дальнейшее, более точное определение положения сшивок проводили с помощью обратной транскрипции (Рис 12). Было показано, что тиоуридин присоединенный к нуклеотиду 384 сшивается с нуклеотидом 420, и в некоторых случаях, с нуклеотидами 415 и 424. Тиоуридин, присоединенный к нуклеотиду 867, образует серию сшивок в районе 905-920 с максимальной интенсивностью в районах нуклеотидов 909-910 и 917. Тиоуридин, присоединенный к нуклеотиду 1045, образует пришивку с нуклеотидом 993 и тиоуридин, присоединенный к нуклеотиду 1117, образует серию пришивок в районе нуклеотида 1037. Полученные пришивки суммированы на рисунке 13 на карте вторичной структуры 235 рРНК.

А В С

АСЭиХК1К2 К1 К2 X А С в и К1К2 X А С й и

Рисунок 12. Анализ пришивок с помощью обратной транскрипции. Дорожки А, С. О. Ь' соответствуют сиквенсу РНК по Сэнгеру; К - продукты транскрипции фрагмента 23Б рРНК, не содержащего пришивки; X -продукты транскрипции фрагмента рРНК, содержащего пришивку. Зоны, соответствующие положениям сшивок, обозначены стрелками. Рисунок А - для пришивок, полученных из тиоуридина, присоединенного к нуклеотиду 867, В - 1045, С -И 17.

Таким образом две из полученных пришивок образованы внутри одних и тех же элементов вторичной структуры, а именно пришивки из тиоуридинов присоединенных к нуклеотидам 867 и 1117. Эти сшивки образованы внутри одних и тех же спиральных участков между соседними цепями РНК. Они не представляют особого интереса с точки зрения организации пространственной макроструктуры рРНК в рибосоме. Т.е. они не несут информации, позволяющей ориентировать спирали, в которых они получены, относительно других компонентов рибосомы. Тем не менее, эти данные могут быть использованы при детальном моделировании самих спиралей. К тому же эти пришивки могут служить дополнительным подтверждением правомерности используемого нами метода. Другие две пришивки, а именно сшивки, образованные тиоуридинами, присоединенными к положениям 384 и 1045, образованы различными элементами вторичной структуры.

(г«г7-М10)-

■'а % и

а 'с * с ч

О.с А А О V А

I и 22 °

2407-2410

21

а

А

Рисунок 13. Суммарная схема пришивок полученных в 23Б рРНК.

Сшивки между спиралями 21 и 22 свидетельствует о сближенности этих спиралей в пространстве, что было предсказано с помощью сравнительного филогенетического анализа. Помимо этого на основании этих пришивок можно утверждать, что эти спирали расположены антипараллельно по отношению друг к другу. Один из возможных вариантов взаимного расположения спиралей 21 и 22 представлен на рисунке 14. Пожалуй, самой

«Vv,

. 420

415

H22

H21

Рисунок 14. Один из возможных вариантов взаимного

расположения спиралей 21 и 22. Спираль 21 обозначена черным цветом, спираль 22 - серым. Атомы нухлеотида к которое был присоединен тиоуридин и атомы нуклеотидов, участвующих в образовании пришивки, обозначены о виде сфер.

Н42

993 , tí i С

Н41

Рисунок 15. Один из возможных вариантов взаимного

расположения спиралей 41 и 42. Спираль 42 обозначена черным цветом, спираль 41 -серым. Атом а

нуклеотида, к котором) был присоединен

тиоуридин. и атомь нуклеотидов. участвующих I

образовании пришивки обозначены в виде сфер

интересной, с точки зрения топографии рРНК в рибосоме, является пришивка из нуклеотщ 1045 к спиралям 41 и 42. Район спиралей 41-42 находится в непосредственной близости с района связывания элонгационных факторов с 50S субчастицей. Данные о пришивке меж; этими спиралями являются основанием для утверждения, что эти спирали располагают!

антипараллельно по отношению друг к другу т.е. делают своего рода "'U-поворот". Вариант такого расположения представлен на рисунке 15. Такое расположение этих двух спиралей приводит к тому, что ГТФазный район 23S рРНК оказывается поблизости от района стыковки семи спиральных участков домена II 23S рРНК. Это согласуется с данными сравнительного филогенетического анализа, поскольку РНК больших рибосомных субчастиц из некоторых митохондрий вообще не содержат структуры, соответствующей спиралям 41 и 42 в £ coli.

Выводы

1. Разработан универсальный метод направленного гидролиза рРНК по единичной фосфодиэфирной связи с помощью РНКазы Н в присутствии химерных олигонуклеотидов

2. Показана возможность лигирования 3'-5'-дифосфата 4-тиоуридина с рРНК в местах гидролиза РНКазой Н.

3. Показана возможность реконструкции рибосомных субчастиц из рРНК, содержащих разрывы и дополнительные нуклеотиды в определенных положениях.

4. Разработан метод направленной фотохимической модификации протяженных РНК, с помощью которого получены сшивки в 16S рРНК между тиоуридином, присоединенным к нуклеотиду 1141 и нуклеотидами 1272 и 1295. Данные пришивки позволяют предложить способ взаимной ориентации спиралей 39 и 41 в 16S рРНК.

5. Получены сшивки в 23S рРНК между тиоуридином, присоединенным к нуклеотиду 384, и нуклеотидами 415, 420 и 424; получены сшивки в 23S рРНК между тиоуридином присоединенным к нуклеотиду 867 и нуклеотидами в районе 905-920; получена сшивка 23S рРНК между тиоуридином, присоединенным к нуклеотиду 1045 и нуклеотидом 993; получены сшивки в 23S рРНК между тиоуридином, присоединенным к нуклеотиду 1117 и нуклеотидами в районе нуклеотида 1037.

6. На основании полученных предложена модель взаимной ориентации спиралей 21 и 22, а также спиралей 41 и 42.

7. Создана "База Данных Рибосомных Пришивок" включающая в себя практически все описанные в литературе пришивки между рибосомными компонентами и лигандами, а также краткое описание реагентов используемых для генерации рибосомных пришивок.

Список работ опубликованных по теме диссертации Статьи в научных журналах:

1. Bogdanov A., Dontsova О., Rinke-Appel J., Dokudovskaya S., Lavrik I., Alekseeva К., Spanchenko О., Sergiev P., Baranov P., Shirokova E., Nierhaus К.. Brimacombe R. Thio-substituted derivatives of RNA: application in protein biosynthesis studies.(1995) Nucleic Acids Symp. Series. N31., pp.273-274.

2. Богданова С.Л., Дегтярев А.И., Баранов П.В., Докудовская С.С., Лаврик И.Н., Донцова

0.A., Орецкая Т.С., Крынецкая Т.С., Шабарова З.А., Богданов A.A. Направленное разрезание молекул 16S рРНК по единичной межнуклеотидной связи. 1995, Биохимия, т.60, вып.2, с.297-307

3. Baranov P.V., Dokudovskaya S.S., Oretskaya T.S., Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Brimacombe R. A new technique for the characterization of long-range tertiary contacts in large RNA molecules: insertion of a photolabel at a selected position in 16S rRNA within the Escherichia coli ribosome. (1997) Nucleic Acids Res., V.25, pp. 2266-2273.

4. Baranov P.V., Sergiev P.V., Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Brimacombe R. The Database of Ribosomal Cross-links (DRC). (1998) Nucleic Acids Res., V.26, ppl87-189.

5. Baranov P.V., Gurvich O.L., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A. New features of 23S ribosomal RNA folding: The long helix 41-42 makes «U-turn» inside the ribosome. (1998) RNA, V 4. pp. 658-668.

6. Baranov P.V., Kubarenko A.V., Gurvich O.L., Shamolina T.A., Brimacombe R. The Database of Ribosomal Cross-links: an update. (1999) Nucleic Acids Res., in press.

Тезнсы докладов:

1. Dontsova О., Dokudovskaya S., Bogdanova S., Baranov P., Lavrik 1., Brimacombe R., Bogdanov A. Intra-ribosomal RNA-RNA interactions; a photoaffinity crosslinling study. Translational Control. USA, New York, Cold Spring Harbor, August 24-28, 1994.

2. Dontsova O.A., Dokudovskaya S.S., Lavrik I.N., Baranov P.V., Sergiev P.V., Bogdanova S.L., Bogdanov A.A., Rinke-Appel J., Brimacombe R. RNA-RNA interactions in the prokaryotic ribosome: a cross-linking study. Frontiers in translation. Canada, Victoria B.C., May 20-25, 1995. VI-3.

3. Dontsova O., Dokudovskaya S., Lavrik I., Baranov P., Sergiev P., Bogdanova S., Bogdanov A., Rinke-Appe), J. And Brimacombe R. RNA-RNA interaction in the prokaryotic ribosome. Cross-linking study. Third International Symposium on Bioorganic Chemistry, Dagomys, Russia, September 17-23S, 1995.

4. Dontsova O., Dokudovskaya S., Baranov P., Sergiev P., Shpanchenko O., Brimacombe R., Bogdanov A. rRNA contacts inside the ribosome: cross-linking study. RNA'96: The first annual meeting of the RNA society. USA, Wisconsin-Madison, May 28-June 2, 1996. p. 175.

5. Baranov P.V., Gurvich O.L., Dokudovskaya S.S., Dontsova O.A., Brimacombe R. & Bogdanov A.A. The new approach for site-directed cross-linking study of large ribosomal RNAs. RNA'97. The second annual meeting of the RNA society. Canada, Alberta. May 27-June 1, 1997, p. 167.

6. Baranov P.V., Gurvich O.L., Dontsova O.A., Brimacombe R., Bogdanov A.A. Investigation of 23S ribosomal RNA structure within the E. Coli ribosome by new site-directed cross-linking approach. RNA'98. The third annual meeting of the RNA society. Wisconsin-Madison, May 26-30, ¡998, p. 138.

7. Dontsova O.A., Sergiev P.V., Baranov P.V., Dokudovskaya S.S., Lavrik I.N., Brimacombe R., Zvereva M.E., Shpanchenko O.V., Petrov A.V., Nierhaus K.H., Bogdanov A.A. New tertary rRNA contacts in E.coli ribosome. Structure Research of the Ribosome and its Functional Complexes. Gannover, Germany, September 9-11, 1998, p. 45.