Дизайн и синтез двойного обращенного рибозима для сайт-направленного изменения последовательности РНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи ИВАНОВ Сергей Александрович

ДИЗАЙН И СИНТЕЗ ДВОЙНОГО ОБРАЩЕННОГО РИБОЗИМА ДЛЯ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО ИЗМЕНЕНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ РНК

02.00.10 - биоорганическая химия

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, химическом факультете Рурского университета, Бохум и в Институте химии при факультете математики и естественных наук I университета им. братьев Гумбольдт, Берлин,Германия.

Научныйруководитель: доктор химических наук, вед.научн.сотр.

Готтих Марина Борисовна

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Сабина Мюллер (Германия)

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

Михайлов Сергей Николаевич

кандидат физико-математических наук, Бибилашвили Роберт Шалвович

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН

Защита состоится 24 мая 2005 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского М ГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 22 апреля 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в молекулярной биологии и смежных областях науки много внимания уделяется изучению клеточных процессов с участием рибонуклеиновых кислот - трансляции и функционированию рибосомы, регуляции экспрессии генов, процессингу РНК, - а также каталитически активным РНК. При установлении роли рибонуклеиновых кислот в этих процессах часто стоит задача сайт-направленного изменения их нуклеотидной последовательности или введения модификаций. Модификация может вводиться как на 5'- или З'-конец РНК, так и в ее центральную часть и представлять собой измененный по углеводному остатку, фосфатной группе или гетероциклическому основанию нуклеотид, флуоресцентный краситель, остаток какой-либо реакционно-способной или репортерной молекулы и т. п. Проблема направленного изменения центральной части протяженной РНК наиболее трудна и на настоящий момент полностью не решена. В связи с этим разработка действенного метода, позволяющего направленно вводить во внутренний участок цепи РНК модифицированный фрагмент с требуемым функциональным свойством, является актуальной и важной задачей. Решение ее приблизит нас не только к пониманию механизмов протекания клеточных процессов с участием РНК, но и позволит получать рибонуклеиновые кислоты с заданными биологическими и физико-химическими свойствами.

Цель настоящей работы заключается в создании инструмента молекулярного воздействия, с помощью которого возможно сайт-направленное изменение первичной структуры РНК, т.е. замещение внутреннего участка цепи РНК на олигорибонуклеотид, содержащий в требуемой позиции природный или модифицированный фрагмент. Такой инструмент был создан на основе шпилечных рибозимов.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые на основе обращенного и вилочного шпилечных рибозимов создан двойной обращенный рибозим - инструмент молекулярного воздействия, с помощью которого возможно сайт-направленное изменение нуклеотидной последовательности внутренней части молекулы РНК. Изменение первичной структуры РНК достигается путем замещения участка ее цепи на олигорибонуклеотид, содержащий в требуемой позиции природный или модифицированный фрагмент. Процесс состоит из двойного

расщепления изменяемой РНК, замещении вырезанного участка цепи на новый, содержащий требуемую модификацию, и соединения модифицированного олигорибонуклеотида с полученными при расщеплении

фрагментами. С целью повысить эффективность протекания последней стадии -лигирования - была оптимизирована структура обращенного рибозима, входящего в состав двойного рибозима. Показано, что выход продукта лигирования зависит как от природы нуклеотида в месте соединения субстрат-связывающего и каталитического доменов обращенного рибозима, так и длины полинуклеотидного линкера, соединяющего их. Повышению каталитической активности рибозима способствует замещение нуклеотида гС на гА, а длина линкера должна составлять семь остатков аденозина (без учета З'-концевого нуклеотида гА субстрат-связывающего домена). Найдены оптимальные условия проведения процесса изменения последовательности РНК: продолжительность расщепления и лигирования РНК, а также концентрация кофакторов и полиамина

спермина) и модифицированного олигорибонуклеотида. Даны рекомендации по выбору температуры проведения реакции. С помощью созданного нами двойного рибозима можно будет направленно изменять последовательность рибонуклеиновых кислот с целью определения их функций в клеточных процессах, а также решать такую прикладную задачу, как получение молекул РНК с заданными биологическими и физико-химическими свойствами.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Результаты настоящего исследования были представлены на международных конференциях «The 5th Cambridge Symposium on Nucleic Acids Chemistry and Biology» (Кембридж, Великобритания, 2003 г.) и «The 6th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids (NACON VI)» (Шеффилд, Великобритания, 2004 г.), а также на «22nd Meeting on Molecular Biology» (Рабенштайнерский Колледж, Поттенштайн, Германия, 2004 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, экспериментальная часть, выводы и список литературы (132 ссылки). Материал иллюстрирован 38 рисунками, 11 схемами и 10 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Дизайн двойного рибозима как инструмента молекулярного

воздействия

Предложенная нами стратегия сайт-направленного изменения нуклеотидной последовательности внутренней части молекулы РНК заключается в замещении при помощи инструмента молекулярного воздействия участка цепи исследуемой РНК на олигорибонуклеотид, содержащий в требуемой позиции нужную модификацию (схема I). Для осуществления процесса необходимо сначала провести двойное расщепление изменяемой РНК, заместить вырезанный участок цепи на новый, содержащий требуемую модификацию, а потом соединить модифицированный олигорибонуклеотид с полученными при расщеплении РНК 5'- и З'-концевым фрагментами.

Схема I. Сайт-направленное замещение участка цепи РНК на олигорибонуклеотид, содержащий необходимую модификацию, при помощи двойного рибозима (стрелками указаны места расщепления и лигирования РНК).

Расщепление Лигировакие

изменяемая РНК

В связи с тем, что процесс замещения состоит из поэтапного сайт-направленного расщепления и лигирования РНК, инструмент молекулярного воздействия было решено создавать на основе каталитически активных рибонуклеиновых кислот - шпилечных рибозимов {hairpin ribozymes). В целях осуществления двойного расщепления и лигирования РНК было предложено ковалентно соединить в единую молекулу два рибозима, создав тем самым новый искусственный вид рибозимов - двойной рибозим {twin ribozyme, схема I). В

5

настоящей работе в качестве исходных одиночных рибозимов использовали обычный {conventional) и обращенный (reverse-joined) шпилечные рибозимы (рис. 1). Обращенный рибозим является производным обычного рибозима и формально получается из него путем разрезания цепи рибозима между участками Н2 и НЗ, удаления петли участка Н4 и последующего соединения посредством линкера из 6 нуклеотидов участков Н1 и Н4. Для придания стабильности структуре обращенного рибозима концы участка НЗ соединены петлей из 4 нуклеотидов.

Рис. 1. Вторичная структура комплексов РНК-субстрата с обычным и обращенным шпилечными рибозимами. Стрелками указаны места расщепления/лигирования РНК. Приведена схема образования обращенного рибозима из обычного, места формального разрезания цепи которого указаны пунктиром.

После расщепления исходной РНК двойным рибозимом образуются 5'- и 3'-концевой РНК-фрагменты, образующие с ним дуплексы длиной 4 и 6 н.п., соответственно (схема I). Такие дуплексы в условиях проведения реакции нестабильны, и поэтому фрагменты легко диссоциируют из комплекса с рибозимом, что делает процесс их лигирования с модифицированным олигонуклеотидом невозможным [S. Muller et al. in Highlights in Bioorganic Chemistry, Wiley-'VCH, 2004, p. 404]. С целью стабилизировать комплекс рибозима с 5'-концевым РНК-фрагментом было предложено удлинить З'-концевую часть цепи двойного рибозима (схема II). Обычный рибозим, содержащий удлиненный называется вилочным

рибозимом (three-wayjunction ribozyme, схема II, Б). Активность такого рибозима была изучена и структура оптимизирована ранее [S Muller et al in Highlights in Bioorganic Chemistry, Wiley-VCH, 2004, p 404]. Применение аналогичного подхода для стабилизации лигируемого З'-концевого РНК-фрагмента не увенчалось успехом -обращенный рибозим с удлиненным 5'-концом был неактивен [S. Muller, неопубликованные данные]. В качестве альтернативного подхода было предложено ввести в состав обращенного рибозима модифицированный нуклеотид и ковалентно присоединить к нему дополнительный (второй) 5'-концевой участок, образующий длинный дуплекс с З'-концевым фрагментом (схема II, А). Обращенный рибозим, образованный из трех ковалентно соединенных в точке ветвления олигонуклеотидных цепей, называется разветвленным рибозимом (branched ribozyme). Он был предложен нами впервые. Предполагалось, что двойной рибозим R-DRBV, построенный из вилочного и разветвленного рибозимов (схема II, В) и способный образовывать стабильные дуплексы с РНК-

фрагментами, сможет осуществлять процесс замещения участка цепи РНК на модифицированный олигорибонуклеотид более эффективно, чем рибозим, представленный на схеме I.

А

Б

Схема II. Образование двойного ри-

з

бозима R-DRBV из разветвленного (А) и вилочного (Б) шпилечных рибозимов. Модифицированный нуклеотид в составе разветвленного рибозима условно обозначен кружком с волнистой линией Показана структура комплекса двойного рибози-ма с изменяемой РНК, места ее расщепления указаны стрелками (В).

/

.5

В

изменяемая РНК

1.1 Строение и синтез разветвленного рибозима R-RB

С целью установить возможность применения двойного рибозима R-DRBV в реакции изменения последовательности РНК важно было изучить каталитическую активность входящего в его состав разветвленного рибозима (схема II, А) и сравнить ее с активностью обычного обращенного рибозима. В связи с этим необходимо было синтезировать и исследовать свойства обоих рибозимов в реакциях расщепления и лигирования РНК. В качестве обычного рибозима использовали рибозим R-RC6 (рис. 2 Б), оба домена которого соединены посредством цитидина, формирующего уотсон-криковскую пару с З'-концевым нуклеотидом субстрата. Рибозим получали методом транскрипции при помощи РНК-полимеразы фага Т7. Поэтому на его 5'-конце содержится полипуриновая последовательность.

место расщеплении * ~ S36FS

о А С цИ < f?vC

У .

" » S24F5

- 1

/

S Gcgg : - ! Ч* ^ S14FS

l'\\\ ПН

6VAAGAG GUGAGCCAGAUUUCUGdT 3

^ ^ А а а сегмент А

s А

а С— 6 G— С

сегмент Cv 0 Ъ р-с о

сегмент В » 0

о-р-о ^

/

и

А

Г*

е»

I

С А

10 А /

ц .в С с —G

S с с — g сегмьнт А I U- А S G— с

§ S -а разветвленный обращенный рибозим

% cG R-RB

SG19

SG9 '

- с „ ¿с

меого лигирования ' ' v * S17F5cp j»

" vi" > Ä ~ •» *

! IM —A'illlll Hl'H.l

CAAGAG GUGAGCCAGAUUUCUGU 3

t H1 aoaa W2

5 — G

H4 SrS

обычный обращенный рибозим R-RC6

Рис. 2. Вторичная структура комплексов расщепляемых субстратов с разветвленным рибозимом R-RB (А) и лигируемых фрагментов с обычным обращенным рибозимом И-ИСб (Б). Сегменты А, В и С рибозима П-ЛВ соединены посредством модифицированного нуклеозида - Ы4-(6-ГИДрОКСИГвКСИЛ)-5-МеТИЛ-2'-ДвЗОКСИцитидина, условно обозначенного в структуре как группа. Звездочкой обозначена флуоресцентная метка.

В качестве разветвленного рибозима использовали рибозим R-RB, состоящий из сегментов А, В и С, соединенных при помощи М4-(6-гидроксигексил)-5-метил-2'-

8

дезоксицитидина (рис. 2 А). Сегменты А и В формируют субстрат-связывающий домен рибозима, а сегмент С - каталитический. 81-звенный рибозим R-RB получали на твердофазном носителе CPG (стекло с контролируемым размером пор, 1000 А) амидофосфитным фосфотриэфирным методом, используя в качестве стартового нуклеозида 2'-дезокситимидин (схема III). На начальной стадии синтеза получали сегмент А (этап I). Затем в олигонуклеотидную цепь встраивали амидофосфит N4-(6-гидроксигексил-О-левулинилЛб-метил-б'-О-(4,4'-диметокситрифенил метил )-1-|3-D-2'-дезоксицитидина (этап II), который был получен из 2'-дезокситимидина в семь стадий с выходом 55 %. После удаления б'-O-DMT защитной группы синтезировали сегмент В (этап III), свободную 5'-ОН группу которого блокировали остатком уксусной кислоты (этап IV). Ключевая стадия синтеза заключалась в удалении остатка левулиновой кислоты с гидроксильной группы остатка н-гексанола в составе модифицированного нуклеотида. Для этого олигонуклеотид обрабатывали раствором гидрата гидразина в смеси уксусной кислоты и пиридина (этап V). Синтез продолжали, присоединяя к свободной ОН-группе остатка н-гексанола первое звено (гА) сегмента С (этап VI). На конечной стадии синтеза удаляли 5'-0-DMT группу.

Схема III. Твердофазный синтез разветвленного обращенного рибозима Я-ЯВ.

Отдельно показана структура модифицированного амидофосфита.

РНК-продукт удаляли с твердофазного носителя, защитные группы с экзоциклических аминогрупп гетероциклических оснований, р-цианоэтильную и 5'-О-ацетильную группы снимали при помощи насыщенного раствора аммиака в метаноле при 25 °С в течение 22 ч. Деблокирование 2'-ОН групп проводили, обрабатывая олигонуклеотид тригидрофторидом триэтиламина (ТЕД-ЗИР) при 55 °С в течение 1,5 ч. Очистку продукта осуществляли в 20 % полиакриламидном геле методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях (7 М мочевина и 60 °С). С целью определить нуклеотидный состав выделенного продукта проводили его полное ферментативное расщепление нуклеазой Р1 и щелочной фосфатазой. Продукты гидролиза анализировали методом обращенно-фазной ВЭЖХ (рис. 3). Анализ гидролизной смеси показал, что экспериментально найденный состав РНК-продукта хорошо согласуется с теоретическим составом целевого рибозима R-RB.

Рис. 3. Определение нуклео-тидного состава рибозима Я-ЯВ методом обращенно-фазной ВЭЖХ. Хроматограм-мы: 1 - реакционная смесь после ферментативного расщепления рибозима, обозначенный звездочкой пик обусловлен присутствием ферментов; 2 - ферментативная смесь без РНК; 3 -нуклеозид №-(6-гидрокси-гексил-5-метил-2'-дезоксици-тидин (обозначен как «У»). Приведен теоретический и экспериментально найденный (в скобках) состав рибозима.

1.2 Каталитические свойства разветвленного R-RB и обычного R-RC6 обращенных рибозимов

Нуклеазную активность разветвленного рибозима Я-ЯВ и обычного Я-ЯСб изучали, расщепляя различные РНК-субстраты: Б14Р5, Б24Р5 и Б36Р5 (рис. 2 А). Анализ реакционных смесей показал, что разветвленный рибозим расщепляет все

три субстрата с той же специфичностью, что и обычный. Для обоих рибозимов и всех субстратов были определены эффективность и кинетические параметры реакции расщепления. Оказалось, что искусственный рибозим R-RB лишь в пять раз менее активен, чем его немодифицированный аналог R-RC6.

С целью изучить лигазную активность обоих рибозимов использовали РНК-фрагменты 8019, 809 и 817Р5ср (рис. 2 Б). Последний из них содержал необходимую для лигирования 2',3'-циклическую фосфатную группу (ср). Результаты экспериментов, проведенных при различных условиях, показали, что разветвленный рибозим R-RB в отличие от обычного способностью лигировать РНК не обладал. Это означает, что применение его в составе двойного рибозима R-DRBV (схема II, В) в качестве одной из каталитических единиц невозможно. Двойной рибозим, построенный на основе такого разветвленного рибозима, не сможет в процессе изменения последовательности РНК лигировать встраиваемый олигорибонуклеотид с З'-концевым фрагментом исходной РНК. Обычный обращенный рибозим R-RC6 лигировал фрагменты 8019 и 809 с 817Р5ср с эффективностью 11 и 20 %, соответственно. В связи с этим для создания активного двойного рибозима было решено использовать обращенный рибозим R-RC6.

2. Оптимизация структуры обычного обращенного рибозима в реакциях лигирования РНК

В целях увеличения эффективности лигирования мы провели оптимизацию первичной структуры обращенного рибозима R-RC6. Для этого методом транскрипции было получено несколько рибозимов-производных, различающихся природой нуклеотида (М) в месте соединения субстрат-связывающего и каталитического доменов и длиной полинуклеотидного линкера (Дп), соединяющего их (рис. 4). Влияние природы нуклеотида М на активность рибозима изучали, сравнивая эффективность и скорость реакций лигирования, катализируемых рибозимами R-RC6 и R-RA6, содержащими на месте М нуклеотид гС или гА, соответственно. Результаты лигирования фрагментов 809 и 817Р5ср показали, что замена гС на гА положительно влияет на каталитическую активность обращенного рибозима (табл. 1).

место лигирования

SG9/SU9 y^^jf si7F5cp Jft

г киисис с*с.•/свои'-uaaa-íac i

i i i i i i«—* i m 1111111 м 111

МААСАО GUGA6CCAGAUUUCUGU- Э*

*.m*»cJ? т А°а* Н2

Н4 g:

А

U А U U.

петли в А А

СС-и-

нз

и—А U G U С

М ■ A R-RAn, п = 6, 7,8,12

« ■ С R-RC6 (п = 6)

Г = и SU9 К » G SG9

Рис. 4. Вторичные структуры комплексов, образованных лигируемыми РНК-фрагментами Б09 или БШ и Б17Р5ср с обращенными рибозимами Р-РАп (п = 6, 7, 8 и 12) и Р-РС6. Звездочкой обозначена флуоресцентная метка, «ср» - 2',3'-цикличе-ская фосфатная группа

Для того чтобы выяснить влияние прочности (длины) дуплекса Н1 на скорость реакции, мы провели лигирование фрагментов SG9 и SU9 с S17F5cp при помощи рибозима R-RC6. Фрагменты SG9 и SU9 различаются лишь природой З'-концевого нуклеотида К и содержат rG или rU, соответственно (рис. 4). Фрагмент SU9 в отличие от SG9 образует с рибозимом дуплекс длиной 5 н.п., и поэтому он менее стабилен, чем дуплекс SG9/R-RC6 (6 н.п.). Оказалось, что константа скорости реакции лигирования для SU9 была в 4 раза выше, чем в случае SG9 (табл. 1). Следовательно, понижение прочности дуплекса Н1 в комплексе рибозима R-RC6 с РНК за счет уменьшения его длины с 6 до 5 н.п. благоприятствует лигированию. Такая же закономерность наблюдалась и в случае рибозимов R-RA7 - R-RA12 (табл. 1), для которых скорость и эффективность лигирования была выше при формировании 5-звенных дуплексов Н1. Однако при лигировании фрагментов SG9 и SU9 с S17F5cp этими рибозимами значения для разных фрагментов различались в меньшей степени. По-видимому, это связано с тем, что пара U/A, фланкирующая дуплексы, образуемые рибозимами R-RA7 - R-RA12 с SU9, менее стабильна, чем пара G/C в составе дуплекса SG9/R-RC6, поэтому при сворачивании рибозим-субстратного комплекса она может разрушаться, что приводит к формированию участка Н1 длиной 5 н.п. Обнаруженная нами закономерность нарушается только в случае рибозима R-RA6, который лигировал субстрат SU9 лучше, чем SG9 (табл. 1). Возможно, это обусловлено особенностями формирования третичной структуры комплекса рибозима R-RA6 с указанными субстратами.

Интересно отметить, что наличие пары G/C в точке соединения каталитического и субстрат-связывающего доменов отрицательно влияет не только на лигирование, но и на расщепление РНК. Так, результаты расщепления субстрата S14F5 (рис. 2 А) и его аналога S1, содержащего на З'-конце вместо гуанозина уридин, рибозимами R-RC6 и R-RA6 показали, что расщепление РНК в комплексах, содержащих пары U/A (R-RA6-S1), U/C (R-RC6-S1) и G/A (R-RA6-S14F5), протекает с примерно одинаковой скоростью. В случае же комплекса R-RC6S14F5, содержащего пару G/C, значение константы скорости реакции было в 4,5 раза ниже.

Таблица 1. Лигирование РНК-фрагментов SU9 и SG9 с S17F5cp обращенными рибозимами R-RC6 и R-RAn (п = 6, 7, 8 и 12).

рибозим R-RC6 R-RA6 R-RA7 R-RA8 R-RA12

короткий субстрат SU9 SG9 SU9 SG9 SU9 SG9 SU9 SG9 SU9 SG9

кцд, МИН"1 0,20ю 0,046 0,94 0,56 0,89 1,14 0,53 0,86 0,26 0,45

К, нМ 166,6 33,4 140,8 141,1 109,3 75,3 73,9 97,3 76,6 85,4

выход, % (эквимолярные условия) 22 24 35 43 35 44 31 43 22 33

выход. % (однооборотные условия) 27 43 56 61 63 70 54 58 35 43

Кинетические параметры получены в однооборотных условиях с относительной погрешностью измерения 5 и 16 % для значений кед и К, соответственно. Буфер: 15 мМ Трис-НС1,10 мМ МдС12, 2 мМ спермин, рН 7,5, 32 °С.

Затем мы исследовали влияние длины полинуклеотидного линкера, соединяющего каталитический и субстрат-связывающий домены рибозима, на лигазную активность рибозимов Р-РАп (рис. 4). Длину полинуклеотидного линкера варьировали от 6 до 12 звеньев. Экспериментальные данные показали, что длина полиаденилатного линкера, при которой активность рибозима наивысшая, должна составлять семь нуклеотидов (рис. 4, п = 7). Действительно, реакция лигирования фрагментов Б09 и Б17Р5ср рибозимом R-RA7 характеризовалась наибольшей эффективностью (70 %) и максимальным значением константы скорости (кцд = 1,14 ± 0,05 мин'1, табл. 1). Таким образом, оптимизировав структуру обращенного рибозима (природу нуклеотида в месте соединения двух доменов и длину полинуклеотидного линкера) и, следовательно, образуемого им с РНК комплекса, мы добились значительного увеличения его активности в реакциях лигирования. Была

13

определена структура наиболее активного обращенного рибозима - R-RA7. Следует отметить, что оптимизировав структуру обращенного рибозима, мы увеличили выход продукта лигирования в 70 раз по сравнению с изученным ранее в нашей лаборатории обращенным рибозимом [С. Schmidt et al., NucleicAcidsRes. 2000, 28, 886].

3. Двойной обращенный рибозим R-DRV в реакции сайт-направленного изменения последовательности РНК

На основании результатов поэтапной оптимизации структуры обращенного рибозима нами был выполнен дизайн двойного обращенного рибозима R-DRV (рис. 5 А). Его левая 5'-концевая часть образована оптимизированным обращенным рибозимом R-RA7, а правая З'-концевая представляет собой вилочный шпилечный рибозим, структура которого была оптимизирована ранее [S. Muller et al. in Highlights in Bioorganic Chemistry, Wiley-VCH, 2004, p. 404].

Двойной рибозим R-DRV был исследован в модельной реакции сайт-направленного изменения последовательности РНК: с его помощью во внутреннюю часть 40-звенного РНК-субстрата S40F3F5 был введен тетрануклеотид 3'-CUAA-5', в результате чего был получен 44-звенный продукт P44F3F5 (рис. 5). В целях визуализации субстрата, а также анализа промежуточных и конечных продуктов реакции субстрат S40F3F5 содержал флуоресцентные метки на 5'- и З'-конце (Хвт 514 нм). Для того чтобы исключить возможное влияние одной каталитической единицы рибозима на активность другой, длина заменяемого участка исходной РНК составляла 16 нуклеотидов. Участок рибозим-субстратного комплекса между петлями содержал термодинамическую петлю (рис. 5 А),

основания нуклеотидов которой были комплементарны основаниям тетрануклеотида, вставляемого в последовательность РНК в составе олигорибонуклеотида S20cp (рис. 5). Петлю ввели, обеспечив тем самым разницу термодинамической стабильности дуплексов, образуемых рибозимом с субстратом и продуктом. В контрольных экспериментах по УФ-плавлению коротких РНК-дуплексов длиной 8 и 12 н.п., формирующихся в области термодинамической петли до и после процесса замещения участка РНК, мы показали, что термическая стабильность совершенного дуплекса почти на 35° выше, чем дуплекса, содержащего

выпетленный участок. Более того, процесс его образования характеризовался намного меньшим значением изменения свободной энергии Гиббса (ДДО° = -17,4 ккал/моль). Эти данные свидетельствуют о том, что процесс замещения вырезанного участка РНК на вставляемый олигорибонуклеотид энергетически выгоден, т. е он протекает самопроизвольно

Рис. 5. Строение двойного рибозима Я-йЯМ и схема сайт-направленного изменения последовательности субстрата Показана структура комплексов двойного рибозима R-DRV с субстратом S40F3F5 (А) и продуктом P44F3F5 (Б) Вставляемый олигорибонуклеотид Б20ср длиннее замещаемого внутреннего участка 16ср на четыре нуклеотида, которые комплементарны нуклеоти-дам термодинамической петли Звездочкой обозначена флуоресцентная метка «ср» -2',3'-циклическая фосфатная группа Структура олигонук-леотида в6-ап1/, блокирующего 5'-концевой участок рибозима (В)

Процесс замещения проводили в два этапа. На первом этапе субстрат S40F3F5 расщепляли в двух местах, что сопровождалось образованием меченых 5'-

и З'-концевых РНК-фрагментов - 15- и 9-мера, соответственно, - и внутреннего немеченого 16-звенного фрагмента (рис. 5). На втором этапе в реакционную смесь добавляли олигонуклеотид S20cp и лигировали его с обоими концевыми фрагментами. После двойного лигирования получали продукт реакции - 44-звенный олигорибонуклеотид P44F3F5. Он на четыре нуклеотида длиннее, чем субстрат. С целью осуществить этап лигирования на З'-конце S20cp находилась 2',3'-циклическая фосфатная группа, которая была необходима для лигирования обращенной частью двойного рибозима. Реакция лигирования вилочной частью была возможна благодаря наличию на З'-конце 15-звенного фрагмента циклической фосфатной группы, образующейся на стадии расщепления субстрата. Анализ реакционной смеси через 30 минут после начала расщепления показал, что в ней содержатся все меченные флуоресцеином продукты реакции: 3'- и 5'-концевой фрагменты (9- и 15-мер, соответственно), а также промежуточные 25- и 31-звенный олигонуклеотиды, получающиеся при однократном разрезании субстрата (рис. 6 А, дорожка 2). При добавлении в реакционную смесь S20cp наблюдалось возникновение трех пиков. Они соответствовали 29- и 35-меру, получающимся в результате лигирования 20-мера с 9- или 15-звенным фрагментом, соответственно, и 44-меру - продукту реакции двойного лигирования (рис. 6 А, дорожки 3 и 4). В результате инкубации реакционной смеси в течение 120 минут образовалось 9 % целевого 44-звенного продукта P44F3F5, в то время как количество исходного субстрата S40F3F5 было 5 % (рис. 6 А, дорожка 4; рис. 6 Б).

Нами была исследована способность комплекса, образованного двойным рибозимом R-DRV и субстратом S40F3F5, формировать правильную вторичную структуру. Для этого при помощи программы «RNA structure 4.0» было смоделировано строение наиболее стабильных комплексов. Оказалось, что вторичная структура самого стабильного комплекса

соответствовала предполагаемому характеру связывания субстрата и рибозима (рис. 5 А). Другой близлежащий по энергии комплекс имел

неправильную вторичную структуру. В ней 5'-концевоЙ участок рибозима GGGAGA формировал нежелательный дуплекс с цепью каталитического домена В' в составе обращенного рибозима. Естественно, расщепление и лигирование РНК в таком комплексе невозможно. Для того чтобы исключить формирование неправильной структуры комплекса рибозима с РНК, мы блокировали последовательность

GGGAGA при помощи комплементарного ей олигонуклеотида ЗЭ-апй (рис. 5 В). Расчет вторичной структуры комплекса R-DRV»S40F3F5«S6-anti показал, что он формирует одну стабильную, правильную структуру. Мы повторили реакцию изменения последовательности S40F3F5, изначально добавив в реакционную смесь блокирующий олигонуклеотид. Его положительное влияние на стадиях расщепления и лигирования оказалось бесспорным - выход целевого продукта P44F3F5 возрос почти в два раза, составив 17 % (рис. 6 Б).

Рис. 6. Изменение последовательности субстрата S40F3F5. Анализ реакционной смеси до (1) и после (2) расщепления субстрата в течение 30 мин и на стадии лигирования через 15 мин (3) и 120 мин (4) после добавления S20cp (А). Кривые накопления продукта реакции P44F3F5 и деградации субстрата S40F3F5 на стадии лигирования в отсутствии блокирующего олигонуклеотида 33-аМ1 (сплошные линии) и в его присутствии (пунктирные линии) (Б). Условия эксперимента: 200 нМ рибозим, субстрат и S20cp, 15 мМ Трис-HCI, 10 мМ MgCI2, 2 мМ спермин, рН 7,5, 37 °С.

В целях возможного увеличения выхода модифицированной РНК был осуществлен поиск оптимальных условий проведения этапов расщепления субстрата S40F3F5 и лигирования РНК-фрагментов с олигонуклеотидом S20cp. Расщепление изучали, варьируя концентрацию кофакторов, - полиамина спермина и ионов магния. Результаты экспериментов показали, что активность рибозима наиболее высока при концентрации спермина 2 мМ и ионов магния 1 и 10 мМ

соответственно; эффективность расщепления субстрата 89 %*). Условия проведения этапа лигирования

Значения констант получены при равной концентрации рибозима и субстрата в присутствии Трис-НС1 (15 мМ, рН 7,5) при 37 °С.

оптимизировали, варьируя солевой и олигонуклеотидный (S20cp) состав, а также температуру реакционной смеси. Мы установили, что на стадии лигирования следует использовать буферный раствор с выбранным ранее составом: 15 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 10 мМ МдС1г и 2 мМ спермин. Для повышения выхода целевой РНК модифицированный олигонуклеотид желательно брать в трехкратном избытке по отношению к рибозиму и исходной РНК и проводить реакцию при температуре 32 -37 °С. Однако необходимо отметить, что оптимальный температурный режим проведения реакции индивидуален для каждой рибонуклеиновой кислоты, последовательность которой требуется изменить. Мы полагаем, что он зависит как от степени сложности вторичной и третичной структуры исходной РНК, так и от стабильности дуплексов, образуемых заменяемым участком и встраиваемым олигорибонуклеотидом с субстрат-связывающим доменом рибозима. Для каждого процесса найти оптимальную температуру можно только экспериментально.

Для того чтобы изучить активность двойного рибозима РО^, мы определили кинетические параметры и эффективность реакций расщепления и лигирования РНК, катализируемых каждым входящим в его состав шпилечным рибозимом (табл. 2). Свойства данной каталитической единицы изучали, блокируя активность другой путем замещения в расщепляемых субстратах и лигируемых фрагментах соседнего с местом протекания реакции нуклеотида гА на с1А (рис. 5).

Таблица 2. Кинетические параметры реакций расщепления и лигирования РНК двойным рибозимом R-DRV в однооборотных условиях.

субстрат(ы) кс/еаг (кед), мин" К, нМ кыек/! К (кид / К), мин" ВЫХОД, %

в40Р5с1А15 0,57 ± 0,01 16,1 ± 2,4 35,1 60

расщепление

840Р5с)А31 0,32 ± 0,02 12,0 ±4,6 27,0 25

лигирование ЭвЭ + Б35Р5йА15ср 829с1А35+Б15Р5ср 0,55 ± 0,03 1,38 ±0,09 22,9 ± 8,5 34,8 ±8,1 24,0 39,6 35 98

Буфер: 15 мМ Трис-НС1,10 мМ МдС12,2 мМ спермин, рН 7,5, 37 °С.

Оказалось, что значения параметров реакций для обеих каталитических единиц различаются незначительно (табл. 2). Из этого следует, что активности обращенного Р-РА7 и вилочного рибозимов в составе двойного рибозима Р-Э^ приблизительно одинаковы. Кроме того, активности обеих частей двойного рибозима

и одиночных шпилечных рибозимов в реакциях как расщепления, так и лигирования РНК оказались сравнимы. Следовательно, каталитическая активность обращенного и вилочного шпилечных рибозимов сохраняется при их ковалентном соединении. Предположительно, обе каталитические единицы в составе разработанного нами двойного рибозима R-DRV функционируют независимо друг от друга и процессы их сворачивания в правильную пространственную структуру протекают автономно.

Для доказательства того, что двойной рибозим R-DRV действительно способен замещать участок исходной РНК на олигорибонуклеотид, содержащий модифицированный фрагмент, мы провели внутреннее мечение субстрата Б40Р3Р5 остатком молекулы цианового красителя Су5. Краситель вводили в составе тетрануклеотида З'-СсГГ^АА-б', находящегося в олигорибонуклеотиде Б20ср-Су5. Реакционную смесь анализировали, регистрируя излучение только Было найдено, что на стадии лигирования образуются все ожидаемые продукты (29-, 35- и 44-мер). Выход целевого продукта Р44Р3Р5-Су5 составил 17 %.

Таким образом, разработанный нами двойной рибозим R-DRV благодаря присущей ему каталитической активности способен замещать внутренний участок цепи исследуемой РНК на олигорибонуклеотид, содержащий в требуемой позиции необходимую модификацию, т. е. сайт-направленно изменять первичную структуру РНК, выступая в роли инструмента молекулярного воздействия.

ВЫВОДЫ

1. Впервые на основе обращенного и вилочного шпилечных рибозимов разработан и получен двойной обращенный рибозим - инструмент молекулярного воздействия, с помощью которого осуществлено сайт-направленное введение во внутренний участок цепи РНК модифицированного фрагмента; изучена активность полученного рибозима; найдены оптимальные условия проведения процесса.

2. Впервые предложена и методом твердофазного олигонуклеотидного синтеза получена 81-звенная разветвленная молекула РНК, обладающая

каталитической активностью в реакциях расщепления различных РНК-субстратов, - разветвленный обращенный шпилечный рибозим.

3. Оптимизирована структура обращенного шпилечного рибозима и изучены его каталитические свойства в реакциях расщепления и лигирования РНК.

4. Показана возможность синтеза модифицированных по 5'-концу рибонуклеиновых кислот посредством удлинения РНК-праймера на одноцепочечной матричной ДНК при помощи РНК-полимеразы фага Т7.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. S. A. Ivanov, E. M. Volkov, Т. S. Oretskaya, S. Muller, Chemical synthesis of an artificially branched hairpin ribozyme variant with RNA cleavage activity, Tetrahedron 2004, 60,9273-9281.

2. С. А. Иванов, Р. Велц, М. Б. Готтих, С. Мюллер, Синтез РНК посредством удлинения праймера при помощи РНК-полимеразы фага 17, Молекулярная биология2004, 38, 798-803.

3. S. Muller, J. Wolf, S. A. Ivanov, Current strategies for the synthesis of RNA, Curr. Org. Synth. 2004, 1, 293-307.

4. S. Muller, R. Welz, S. A. Ivanov, K. Bossmann in Highlights in Bioorganic Chemistry: Methods and Applications (Ed.: С Schmuck, H. Wennemers), Wiley-VCH, Weinheim, 2004, pp. 404-421.

5. S. A. Ivanov, S. Muller, Engineering of a reverse-joined twin ribozyme for site-directed alteration of RNA sequence, «The 6th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids (NACON VI)», 2004, 4th - 8th April, Tapton Hall, Sheffield, UK.

6. D. Strohbach, S. A. Ivanov, S. Muller, Are tertiary stabilized hammerhead ribozymes better ligases? «The 6th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids (NACON VI)», 2004, 4th- 81" April, Tapton Hall, Sheffield, UK.

7. S. A. Ivanov, S. Muller, Chemical synthesis of a reverse-joined hairpin ribozyme containing an artificial branch, Cambridge Symposium on Nucleic Acids Chemistry and Biology», 2003, 31s1 August - 3rd September, Queens' College, Cambridge, UK.

оя.оо

Подписано в печать 20 апреля 2005 г.

Заказ 504. Формат 60 х 90/16. С Г4^

Тираж 100 экз. I L I ^

Отпечатано в салоне оперативной печати |1Кф| | с Í ►

Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ. Тел. 77&97»7" § /

19 МАИ 2005

Список сокращений

Введение б

I. Влияние структуры шпилечных рибозимов на их каталитическую 9 активность в реакциях расщепления и лигирования РНК обзор литературы)

1.1 Строение и свойства шпилечных рибозимов

1.1.1 Минимальный шпилечный рибозим

1.1.1.1 Происхождение минимального шпилечного рибозима

1.1.1.2 Первичная, вторичная и третичная структура минимального 13 шпилечного рибозима

1.1.1.3 Сворачивание рибозим-субстратного комплекса

1.1.1.4 Каталитический механизм действия шпилечных рибозимов

1.1.2 Обращенный шпилечный рибозим, его происхождение и свойства

1.2 Шпилечные рибозимы в реакциях расщепления и лигирования РНК

1.2.1 Природные рибозимы

1.2.1.1 Кинетика и термодинамика реакций расщепления и 36 лигирования РНК

1.2.1.2 Влияние стабильности и структуры рибозим-субстратного 41 комплекса на активность рибозима

1.2.2 Искусственные рибозимы

1.2.2.1 Вилочный шпилечный рибозим

1.2.2.2 Обращенный шпилечный рибозим

II. Дизайн и синтез двойного обращенного рибозима 53 для сайт-направленного изменения последовательности РНК результаты и их обсуждение)

11.1 Дизайн двойного рибозима 54 как инструмента молекулярного воздействия

11.1.1 Стратегия сайт-направленного изменения 54 последовательности РНК

11.1.2 Двойной рибозим R-DRBV

11.1.2.1 Предполагаемый способ синтеза рибозима R-DRBV

11.1.2.2 Синтез РНК посредством удлинения праймера при 62 помощи РНК-полимеразы фага Т

11.1.2.3 Разветвленный рибозим R-RB

11.1.2.3.1 Строение рибозима R-RB

11.1.2.3.2 Химический синтез рибозима R-RB

11.1.2.3.3 Каталитические свойства рибозима R-RB

II.2 Оптимизация структуры обычного обращенного рибозима 81 в реакциях расщепления и лигирования РНК

11.2.1 Влияние природы нуклеотида 81 в месте соединения доменов рибозима на его активность

11.2.2 Влияние длины полинуклеотидного линкера 87 на активность рибозима

0 II.3 Двойной обращенный рибозим R-DRV в реакции сайт-направленного изменения последовательности РНК

11.3.1 Модельная реакция изменения последовательности 90 субстрата S40F3F

11.3.2 Синтез двойного рибозима R-DRV

11.3.3 Свойства рибозима R-DRV в реакции расщепления РНК

11.3.4 Изменение последовательности РНК 103 при помощи рибозима R-DRV

11.3.5 Оптимизация условий 105 реакции изменения последовательности РНК

11.3.6 Каталитическая активность рибозима R-DRV 109 U.3.7 Внутреннее мечение РНК остатком молекулы-красителя Су

III. Экспериментальная часть

III.1 Реактивы и материалы

111.1.1 Реагенты и растворители

111.1.2 Ферменты

111.1.3 Буферные растворы

111.1.4 Разделяющие материалы

111.1.5 Приборы 117 111.2 Методы и методики

111.2.1 Физико-химические методы анализа

111.2.1.1 Анализ РНК при помощи A.L.F. секвенатора ДНК

111.2.1.2 Анализ РНК при помощи LiCor 4200 секвенатора ДНК

111.2.1.3 Методы при получении РНК и ДНК

111.2.2 Синтезы

111.2.2.1 Синтез амидофосфита Ы4-(6-гидроксигексил-0- 121 левулинил)-5-метил-5'-0-(4,4'-диметокситрифенил-метил)-1 -р-0-2'-дезоксицитидина (8)

111.2.2.2 Синтез субстратных РНК

111.2.2.3 Мечение субстратных РНК

111.2.2.4 Синтез разветвленного рибозима R-RB

111.2.2.5 Синтез немодифицированных рибозимов

111.2.2.6 Синтез РНК-фрагментов, 134 содержащих 2',3'-циклическуга фосфатную группу

11.2.3 Определение нуклеотидного состава рибозима R-RB

11.2.4 Получение РНК посредством удлинения праймера при 136 помощи РНК-полимеразь; фага

11.2.5 Расщепление РНК-субстратов

11.2.6 Лигирование РНК-фрагментов

11.2.7 Изменение последовательности РНК

И.2.8 УФ плавление дуплексов

II.2.9 Определение периода полураспада 141 2',3'-циклической фосфатной группы в составе РНК

Выводы

В настоящее время в молекулярной биологии и смежных областях науки много внимания уделяется изучению клеточных процессов с участием рибонуклеиновых кислот - трансляции и функционированию рибосомы (мРНК, тРНК, рибосомальные РНК), регуляции экспрессии генов (малые интерферирующие РНК, siRNA), процессингу РНК, - а также каталитически активным РНК (интроны I и II группы, рибозимы различных видов). При установлении роли рибонуклеиновых кислот в этих процессах часто стоит задача сайт-направленного изменения их нуклеотидной последовательности или введения модификаций. Модификация может вводиться как на 5'- или З'-конец РНК, так и в ее центральную часть и представлять собой измененный по углеводному остатку, фосфатной группе или гетероциклическому основанию нукпеотид, флуоресцентный краситель, остаток какой-либо реакционно-способной или репортерной молекулы и т. п. В случае природных мутаций, вставок или делеций изменение последовательности РНК может быть произведено методом сайт-направленного мутагенеза [1, 2]. Задача изменения центральной части цепи РНК за счет введения неприродного фрагмента более трудна, так как синтезировать рибонуклеиновую кислоту, содержащую модификацию в заданной позиции цепи, при помощи ферментативного подхода невозможно. Для сайт-направленного введения модифицированного фрагмента в цепь РНК существует несколько подходов. Наиболее общий из них основан на методе твердофазного синтеза олигонуклеотидов. Однако с его помощью сегодня нельзя успешно получать молекулы РНК длиной более 100 звеньев [3]. Альтернативный подход заключается в сборке целевой РНК из олигорибонуклеотидных фрагментов, один из которых содержит модифицированное звено, методом ферментативного или химического лигирования. В работах Уленбека и сотр. [4, 5] по ферментативному лигированию РНК при помощи РНК-лигазы фага Т4 было показано, что эффективность такого процесса невысока (5 - 25 %) и зависит от нуклеотидного состава и длины соединяемых фрагментов. Невысокие выходы продуктов (4-16 %) наблюдали также З.А. Шабарова и сотр. в экспериментах по химическому лигированию РНК [6]. Очевидно, что при сборке молекулы РНК из нескольких фрагментов методом ферментативного или химического лигирования выход целевого продукта будет незначителен. Интересный способ получения модифицированных рибонуклеиновых кислот недавно был предложен Салленгером и сотр. [7]. Он основан на способности интрона группы I катализировать in trans сплайсинг РНК. Неприродный фрагмент вводится в З'-концевой экзон, соединенный с интроном -каталитическим мотивом. В процессе сплайсинга 3'- и 5'-концевой экзоны соединяются, образуя полноразмерную РНК. Однако этот подход не позволяет ввести модифицированный фрагмент в 5'-концевую часть рибонуклеиновой кислоты. Более того, чтобы им воспользоваться, необходимо сначала модифицировать З'-концевой экзон.

Из приведенных данных следует, что проблема сайт-направленного изменения центральной части протяженной РНК на настоящий момент полностью не решена. Поэтому разработка действенного метода, позволяющего направленно вводить во внутренний участок цепи РНК неприродный модифицированный фрагмент с требуемым функциональным свойством, является актуальной и важной задачей. Решение ее приблизит нас не только к пониманию механизмов протекания клеточных процессов с участием РНК, но и позволит получать рибонуклеиновые кислоты с заданными биологическими и физико-химическими свойствами. В связи с этим настоящая работа посвящена созданию инструмента молекулярного воздействия, с помощью которого возможно сайт-направленное изменение первичной структуры РНК, т.е. замещение внутреннего участка цепи РНК на олигорибонуклеотид, содержащий в требуемой позиции природный или модифицированный фрагмент. Такой инструмент предполагалось создать на основе шпилечных рибозимов.

Результатом проделанной работы было создание на основе обращенного и вилочного шпилечных рибозимов двойного обращенного рибозима -инструмента молекулярного воздействия, с помощью которого возможно сайт-направленное изменение нуклеотидной последовательности внутренней части молекулы РНК. Изменение первичной структуры РНК достигается путем замещения участка ее цепи на олигорибонуклеотид, содержащий в требуемой позиции природный или модифицированный фрагмент. Процесс состоит из двойного расщепления изменяемой РНК, замещении вырезанного участка цепи на новый, содержащий требуемую модификацию, и соединения модифицированного олигорибонуклеотида с полученными при расщеплении РНК 5'- и З'-концевыми фрагментами. В целях повышения эффективности лигирования оптимизирована структура обращенного рибозима, входящего в состав двойного рибозима. Показано, что выход продукта лигирования зависит как от природы нуклеотида в месте соединения субстрат-связывающего и каталитического доменов обращенного рибозима, так и длины полинуклеотидного линкера между ними. Рибозим, содержащий в месте соединения доменов аденозин и гептааденилатный линкер обладал наивысшей активностью. Найдены оптимальные условия проведения процесса изменения последовательности РНК: продолжительность этапов расщепления и лигирования РНК и концентрация кофакторов (ионов Мд2+ и полиамина спермина) и модифицированного олигорибонуклеотида. Даны рекомендации по выбору температуры проведения реакции.

Работа включает литературный обзор, посвященный влиянию структуры шпилечных рибозимов на их каталитическую активность в реакциях расщепления и лигирования РНК.

I. ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ШПИЛЕЧНЫХ РИБОЗИМОВ НА ИХ КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ В РЕАКЦИЯХ РАСЩЕПЛЕНИЯ И ЛИГИРОВАНИЯ РНК обзор литературы)

Настоящий литературный обзор посвящен рассмотрению зависимости каталитической активности шпилечных рибозимов в реакциях расщепления и лигирования РНК от их структуры. В связи с тем, что структура рибозима определяет строение и свойства образуемого им с субстратной РНК комплекса, реакции расщепления и лигирования рассматриваются с позиции особенностей строения рибозим-субстратных комплексов. В литературном обзоре значительное внимание уделяется комплексам, образованным рибозимами, имеющими шпилечную структуру, что обусловлено нашим решением создавать инструмент молекулярного воздействия на основе шпилечных рибозимов. С целью показать преимущество использования таких рибозимов для получения функционального инструмента и, следовательно, обосновать наш выбор каталитические свойства шпилечных рибозимов сравниваются со свойствами рибозимов других видов. Предлагаемый нами подход сайт-направленного изменения внутренней последовательности цепи РНК состоит из двух важных этапов: двойного расщепления исходной молекулы РНК при помощи инструмента молекулярного воздействия и последующего лигирования полученных 5'- и З'-концевого РНК-фрагментов с модифицированным олигорибонуклеотидом. Очевидно, что успешное применение разрабатываемого инструмента возможно при условии эффективного и быстрого протекания обоих этапов. Вследствие этого в литературном обзоре процессам расщепления и лигирования РНК шпилечными рибозимами уделяется основное внимание. Обсуждаются факторы, влияющие на каталитическую активность рибозимов, а именно: нуклеотидный состав рибозим-субстратного комплекса, особенности строения его вторичной и пространственной структуры, солевой состав реакционной смеси. Исследуется взаимосвязь между положением равновесия «расщепление - лигирование» и жесткостью структуры рибозим-субстратного комплекса, в связи с чем рассматриваются комплексы, образованные с участием не только природного минимального шпилечного рибозима, но и его природных аналогов и искусственных производных. Для сравнения каталитической активности рибозимов различных видов приводятся кинетические параметры осуществляемых ими реакций. Как с кинетической, так и термодинамической точек зрения обосновывается зависимость эффективности и скорости реакций расщепления и лигирования РНК от структуры рибозим-субстратного комплекса. На основании данных, представленных и обсуждаемых в настоящем литературном обзоре, предлагаются действенные пути воздействия на каталитическую активность шпилечных рибозимов.

1.1

Строение и свойства шпилечных рибозимов

выводы

Впервые на основе обращенного и вилочного шпилечных рибозимов разработан и получен двойной обращенный рибозим - инструмент молекулярного воздействия, с помощью которого осуществлено сайт-направленное . введение во внутренний участок цепи РНК модифицированного фрагмента; изучена активность полученного рибозима; найдены оптимальные условия проведения процесса.

Впервые предложена и методом твердофазного олигонуклеотидного синтеза получена 81-звенная разветвленная молекула РНК, обладающая каталитической активностью в реакциях расщепления различных РНК-субстратов, - разветвленный обращенный шпилечный рибозим.

Оптимизирована структура обращенного шпилечного рибозима и изучены его каталитические свойства в реакциях расщепления и лигирования РНК.

Показана возможность синтеза модифицированных по 5'-концу рибонуклеиновых кислот посредством удлинения РНК-праймера на одноцепочечной матричной ДНК при помощи РНК-полимеразы фага Т7.

1. P. Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem J. 1986, 237, 1-7.

2. A. Shimada, PCR-based site-directed mutagenesis, Methods Mol. Biol. 1996, 57, 157-65.

3. S. Muller, J. Wolf, S. A. Ivanov, Current strategies for the synthesis of RNA, Curr. Org. Synth. 2004, 1, 293-307.

4. M. Krug, P. L. de Haseth, О. C. Uhlenbeck, Enzymatic synthesis of a 21-nucleotide coat protein binding fragment of R17 ribonucleic acid, Biochemistry 1982, 21, 4713-4720.

5. P. J. Romaniuk, О. C. Uhlenbeck, Joining of RNA molecules with RNA ligase, Methods Enzymol. 1983, 100, 52-59.

6. N. G. Dolinnaya, N. I. Sokolova, D. T. Ashirbekova, Z. A. Shabarova, The use of BrCN for assembling modified DNA duplexes and DNA-RNA hybrids; comparison with water-soluble carbodiimide, Nucleic Acids Res. 1991, 19, 3067-3072.

7. M. B. Long, J. P. Jones 3rd, B. A. Sullenger, J. Byun, Ribozyme-mediated revision of RNA and DNA, J. Clin. Invest. 2003, 112, 312-318.

8. W. L. Gerlach, J. M. Buzayan, I. R. Schneider, G. Bruening, Satellite tobacco ringspot virus RNA: Biological activity of DNA clones and their in vitro transcripts, Virology 1986, 151, 172-185.

9. J. M. Buzayan, W. L. Gerlach, G. Bruening, P. Keese, A. R. Gould, Nucleotide sequence of satellite tobacco ringspot virus RNA and its relationship to multimeric forms, Virology 1986, 151, 186-199.

10. A. Hampel, R. Tritz, RNA catalytic properties of the minimum (-)sTRSV sequence, Biochemistry 1989, 28, 4929-4933.

11. J. M. Buzayan, W. L. Gerlach, G. Bruening, Non-enzymatic cleavage and ligation of RNAs complementary to a plant virus satellite RNA, Nature 1986, 323, 349-352.

12. J. Haseloff, W. L. Gerlach, Sequences required for self-catalysed cleavage of the satellite RNA of tobacco ringspot virus, Gene 1989, 82, 43-52.

13. M. Zuker, On finding all suboptimal foldings of an RNA molecule, Science 1989, 244, 48-52.

14. N. K. Tanner, Ribozymes: the characteristics and properties of catalytic RNAs, FEMS Microbiol. Rev. 1999, 23, 257-275.

15. A. C. Forster, R. H. Symons, Self-cleavage of plus and minus RNAs of a virusoid and a structural model for the active sites, Cell 1987, 49, 211-220.

16. D. M. J. Lilley, Structure, folding and catalysis of the small nucleolytic ribozymes, Curr. Opin. Struct. Biol. 1999, 9, 330-338.

17. P. A. Feldstein, J. M. Buzayan, G. Bruening, Two sequences participating in the autolytic processing of satellite tobacco ringspot virus complementary RNA, Gene 1989, 82, 53-61.

18. C. J. Hutchins, P. D. Rathjen, A. C. Forster, R. H. Symons, Self-cleavage of plus and minus RNA transcripts of avocado sunblotch viroid, Nucleic Acids Res. 1986, 14, 3627-3640.

19. U. C. Uhlenbeck, A small catalytic oligoribonucleotide, Nature 1987, 328, 596600.

20. A. Hampel, R. Tritz, M. Hicks, P. Cruz, «Hairpin» catalytic RNA model: evidence for helices and sequence requirement for substrate RNA, Nucl. Acids Res. 1990, 18, 299-304.

21. M. J. Fedor, Structure and function of the hairpin ribozyme, J. Mol. Biol. 2000, 297, 269-291.

22. A. Berzal-Herranz, S. Joseph, J. M. Burke, In vitro selection of active hairpin ribozymes by sequential RNA-catalyzed cleavage and ligation reactions, Genes Dev. 1992, 6, 129-134.

23. S. Joseph, A. Berzal-Herranz, В. M. Chowrira, J. M. Burke, Substrate selection rules for the hairpin ribozyme determined by in vitro selection, mutation, and analysis of mismatched substrates, Genes Dev. 1993, 7, 130-138.

24. A. Siwkowski, M. Humphrey, M. B. De-Young, A. Hampel, Screening for important base identities in the hairpin ribozyme by in vitro selection for cleavage, Biotechniques 1998, 24, 278-284.

25. В. H. Chowrira, J. M. Burke, Binding and cleavage of nucleic acids by the «hairpin» ribozyme, Biochemistry 1991, 30, 8518-8522.

26. A. Sekiguchi, Y. Komatsu, M. Koizumi, E. Ohtsuka, Mutagenesis and self-ligation of the self-cleavage domain of the satellite RNA minus strand of tobacco ringspot virus and its binding to polyamines, Nucl. Acids Res. 1991, 19, 6833-6838.

27. A. Berzal-Herranz, S. Joseph, В. M. Chowrira, S. E. Butcher, J. M. Burke, Essential nucleotide sequences and secondary structure elements of the hairpin ribozyme, EMBO J. 1993, 12, 2567-2573.

28. Y. Komatsu, M. Koizumi, H. Nakamura, E. Ohtsuka, Loop-Size Variation To Probe a Bent Structure of a Hairpin Ribozyme, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3692-3696.

29. Z. Cai, I. J. Tinoco, Solution structure of loop A from the hairpin ribozyme from tobacco ringspot virus satellite, Biochemistry 1996, 35, 6026-6036.

30. S. E. Butcher, F. H.-T. Allain, J. Feigon, Solution structure of the loop В domain from the hairpin ribozyme, Nat. Struct. Biol. 1999, 6, 212-216.

31. B. Sargueil, D. B. Pecchia, J. M. Burke, An improved version of the hairpin ribozyme functions as a ribonucleoprotein complex, Biochemistry 1995, 34, 7739-7748.

32. D. Porschke, J. M. Burke, N. G. Walter, Global structure and flexibility of hairpin ribozymes with extended terminal helices, J. Mol. Biol. 1999, 289, 799-813.

33. Y. Komatsu, I. Kanzaki, M. Koizumi, E. Ohtsuka, Modification of primary structures of hairpin ribozymes for probing active conformations, J. Mol. Biol. 1995, 252, 296-304.

34. A. I. H. Murchie, J. B. Thomson, F. Walter, D. M. J. Lilley, Folding of the hairpin ribozyme in its natural conformation achieves close physical proximity of the loops, Mol. Cell 1998, 1, 873-881.

35. P. B. Rupert, A. R. Ferre-D'Amare, Crystal structure of a hairpin ribozyme-inhibitor complex with implications for catalysis, Nature 2001, 410, 780-786.

36. D. J. Earnshaw, B. Masquida, S. MQIIer, S. T. Sigurdsson, F. Eckstein, E. Westhof, M. J. Gait, Inter-domain cross-linking and molecular modelling of the hairpin ribozyme, J. Mol. Biol. 1997, 274, 197-212.

37. S. P. Ryder, S. A. Strobel, Nucleotide analog interference mapping of the hairpin ribozyme: implications for secondary and tertiary structure formation, J. Mol. Biol. 1999, 291, 295-311.

38. K. J. Young, J. S. Vyle, T. J. Pickering, M. A. Cohen, S. C. Holmes, O. Merkel, J. A. Grasby, The role of essential pyrimidines in the hairpin ribozyme-catalysed reaction, J. Mol. Biol. 1999, 288, 853-866.

39. D. Klostermeier, D. P. Millar, Energetics of hydrogen bond networks in RNA: hydrogen bonds surrounding G+1 and U42 are the major determinants for the tertiary structure stability of the hairpin ribozyme, Biochemistry 2002, 41, 1409514102.

40. R. Pinard, D. Lambert, N. G. Walter, J. E. Heckman, F. Major, J. M. Burke, Structural basis, for the guanosine requirement of the hairpin ribozyme, Biochemistry 1999, 38, 16035-16039.

41. N. G. Walter, J. M. Burke, D. P. Millar, Stability of hairpin ribozyme tertiary structure is governed by the interdomain junction, Nat. Struct. Biol. 1999, 6, 544-549.

42. В. M. Chowrira, J. M. Burke, Novel guanosine requirement for catalysis by the hairpin ribozyme, Nature 1991, 354, 320-322.

43. J. A. Grasby, K. Mersmann, M. Singh, M. J. Gait, Purine functional groups in essential residues of the hairpin ribozyme required for catalytic cleavage of RNA, Biochemistry 1995, 34, 4068-4076.

44. S. E. Butcher, J. E. Heckman, J. M. Burke, Reconstitution of hairpin ribozyme activity following separation of functional domains, J. Biol. Chem. 1995, 270, 29648-29651.

45. C. Shin, J. N. Choi, S. I. Song, J. T. Song, J. H. Ahn, J. S. Lee, Y. D. Choi, The loop В domain is physically separable from the loop A domain in the hairpin ribozyme, Nucleic Acids Res. 1996, 24, 2685-2689.

46. V. Grum-Tokras, M. Milanovic, J. E. Wedekind, Crystallization and X-ray diffraction analysis of an all-RNA U39C mutant of the minimal hairpin ribozyme, Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 2003, 59, 142-145.

47. R. Pinard, J. E. Heckman, J. M. Burke, Alignment of the two domains of the hairpin ribozyme-substrate complex defined by interdomain photoaffinity crosslinking, J. Mol. Biol. 1999, 287, 239-251.

48. F. U. Hartl, M. Hayer-Hartl, Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein, Science 2002, 295, 1852-1858.

49. A. Horovitz, Y. Fridmann, G. Kafri, O. Yifrach, Review: allostery in chaperonins, J. Struct. Biol. 2001, 135, 104-114.

50. Т. Н. W. Koning, D. Schumperli, RNAs and ribonucleoproteins in recognition and catalysis, Eur. J. Biochem. 1994, 219, 25-42.

51. J. Hsieh, A. J. Andrews, C. A. Fierke, Roles of protein subunits in RNA-protein complexes: lessons from ribonuclease P, Biopolymers 2004, 73, 79-89.

52. E. L. Bertrand, J. J. Rossi, Facilitation of hammerhead ribozyme catalysis by the nucleocapsid protein of HIV-1 and the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, EMBO J. 1994, 13, 2904-2912.

53. T. Coetzee, D. Herschlag, M. Belfort, Escherichia coli proteins, including ribosomal protein S12, facilitate in vitro splicing of phage T4 introns by acting as RNA chaperones, Genes Dev. 1994, 8, 1575-1588.

54. G. Mohr, M. Caprara, Q. Guo, A. Lambowitz, A tyrosyl-tRNA synthetase can function similarly to an RNA structure in the Tetrahymena ribozyme, Nature 1994, 370, 147-150.

55. J. A. Esteban, A. R. Banerjee, J. M. Burke, Kinetic mechanism of the hairpin ribozyme. Identification and characterization of two nonexchangeable conformations, J. Biol. Chem. 1997, 272, 13629-13639.

56. G. Bokinsky, D. Rueda, V. K. Misra, M. M. Rhodes, A. Gordus, H. P. Babcock, N. G. Walter, X. Zhuang, Single-molecule transition-state analysis of RNA folding, Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA 2003, 100, 9302-9307.

57. D. Thirumalai, N. Lee, S. A. Woodson, D. Klimov, Early events in RNA folding, Annu. Rev. Phys. Chem. 2001, 52, 751-762.

58. P. Brion, E. Westhof, Hierarchy and dynamics of RNA folding, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997, 26, 113-137.

59. K. J. Hampel, J. M. Burke, A conformational change in the «loop Е-like» motif of the hairpin ribozyme is coincidental with domain docking and is essential for catalysis, Biochemistry 2001, 40, 3723-3729.

60. Y. Komatsu, I. Kanzaki, E. Ohtsuka, Enhanced folding of hairpin ribozymes with replaced domains, Biochemistry 1996, 35, 9815-9820.

61. D. M. J. Lilley, Folding and catalysis by the hairpin ribozyme, FEBS Lett. 1999, 452, 26-30.

62. N. G. Walter; K. J. Hampel, К. M. Brown, J. M. Burke, Tertiary structure formation in the hairpin ribozyme monitored by fluorescence resonance energy transfer, EMBO J. 1998, 17, 2378-2391.

63. S. A. McKinney, E. Tan, T. J. Wilson, M. K. Nahas, A.-C. Declais, R. M. Clegg, D. M. J. Lilley, T. Ha, Single-molecule studies of DNA and RNA four-way junctions, Biochem. Soc. Trans. 2004, 32, 41-45.

64. S. E. Butcher, F. H. Allain, J. Feigon, Determination of metal ion binding sites within the hairpin ribozyme domains by NMR, Biochemistry 2000, 39, 21742182.

65. M. J. Fay, N. G. Walter, J. M. Burke, Imaging of single hairpin ribozymes in solution by atomic force microscopy, RNA 2001, 7, 887-895.

66. P. B. Rupert, A. P. Massey, S. T. Sigurdsson, A. R. Ferre-D'Amare, Transition state stabilization by a catalytic RNA, Science 2002, 298, 1421-1424.

67. X. Zhuang, H. Kim, M. J. Pereira, H. P. Babcock, N. G. Walter, S. Chu, Correlating structural dynamics and function in single ribozyme molecules, Science 2002, 296, 1473-1476.

68. A. Hegg, M. J. Fedor, Kinetics and thermodynamics of intermolecular catalysis by hairpin ribozymes, Biochemistry 1995, 34, 15813-15828.

69. N. G. Walter, D. A. Harris, M. J. Pereira, D. Rueda, In the fluorescent spotlight; global and local conformational changes of small catalytic RNAs, Biopolymers 2001, 61, 224-242.

70. T. J. Wilson, D. M. Lilley, Metal ion binding and the folding of the hairpin ribozyme, RNA 2002, 8, 587-600.

71. В. М. Chowrira, A. Berzal-Herranz, J. М. Burke, Ionic requirements for RNA binding, cleavage, and ligation by the hairpin ribozyme, Biochemistry 1993, 32, 1088-1095.

72. Z. Y. Zhao, T. J. Wilson, K. Maxwell, D. M. J. Lilley, The folding of the hairpin ribozyme: dependence on the loops and the junction, RNA 2000, 6, 1833-1846.

73. F. Walter, A. I. H. Murchie, D. M. J. Lilley, Folding of the four-way RNA junction of the hairpin ribozyme, Biochemistry 1998, 37, 17629-17636.

74. U. Mayor, N. R. Guydosh, С. M. Johnson, J. G. Grossmann, S. Sato, G. S. Jas, S. M. Freund, D. O. Alonso, V. Daggett, A. R. Fersht, The complete folding pathway of a protein from nanoseconds to microseconds, Nature 2003, 421, 863-867.

75. D. M. J. Lilley, Origins of RNA catalysis in the hairpin ribozyme, ChemBioChem 2001, 2, 729-733.

76. M. I. Page, W. P. Jencks, Entropic contributions to rate accelerations in enzymic and intramolecular reactions and the chelate effect, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1971, 68, 1678-1683.

77. A. Hampel, J. A. Cowan, A unique mechanism for RNA catalysis: the role of metal cofactors in hairpin ribozyme cleavage, Chem. Biol. 1997, 4, 513-517.

78. F. Basolo, R. G. Pearson in Mechanisms of Inorganic Reactions. A Study of Metal Complexes in Solution, Wiley, New York, 1967, pp. 164-165.

79. J. A. Cowan, Metallobiochemistry of RNA. Co(NH3)6]3+ as a probe for Mg2+(aq) binding sites, J. Inorg. Biochem. 1993, 49, 171-175.

80. S. Nesbitt, L. A. Hegg, M. J. Fedor, An unusual pH-independent and metal-ion-independent mechanism for hairpin ribozyme catalysis, Chem. Biol. 1997, 4, 619-630.

81. K. J. Young, F. Gill, J. A. Grasby, Metal ions play a passive role in the hairpin ribozyme catalysed reaction, Nucleic Acids Res. 1997, 25, 3760-3766.

82. Справочник по аналитической химиии. 1 Под ред. Ю. Ю. Лурье. М.: Химия, 1979.

83. S. Nakano, D. М. Chadalavada, Р. С. Bevilacqua, General acid-base catalysis in the mechanism of a hepatitis delta virus ribozyme, Science 2000, 287, 14931497.

84. D. B. McKay, J. E. Wedekind in The RNA World (Ed.: R. F. Gesteland, T. R. Cech, J. F. Atkins), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1999, chapter 11.

85. D. J. Earnshaw, M. J. Gait, Hairpin ribozyme cleavage catalyzed by aminoglycoside antibiotics and the polyamine spermine in the absence of metal ions, Nucleic Acids Res. 1998, 26, 5551-5561.

86. S. Ravindranathan, S. E. Butcher, J. Feigon, Adenine protonation in domain В of the hairpin ribozyme, Biochemistry 2000, 39, 16026-16032.

87. P. C. Bevilacqua, T. S. Brown, S. Nakano, R. Yajima, Catalytic roles for proton transfer and protonation in ribozymes, Biopolymers 2004, 73, 90-109.

88. T. J. Wilson, Z.-Y. Zhao, K. Maxwell, L. Kontogiannis, D. M. J. Lilley, Importance of specific nucleotides in the folding of the natural form of the hairpin ribozyme, Biochemistry 2001, 40, 2291-2302.

89. R. Pinard, K. J. Hampel, J. E. Heckman, D. Lambert, P. A. Chan, F. Major, J. M. Burke, Functional involvement of G8 in the hairpin ribozyme cleavage mechanism, EMBO J. 2001, 20, 6434-6442.

90. S. P. Ryder, S. A. Strobel, Comparative analysis of hairpin ribozyme structures and interference data, Nucleic Acids Res. 2002, 30, 1287-1291.

91. Pauling, Molecular architecture and biological reactions, Chem. Eng. News 1946, 24, 1375-1377.

92. Р. С. Bevilacqua, Mechanistic considerations for general acid-base catalysis by RNA: revisiting the mechanism of the hairpin ribozyme, Biochemistry 2003, 42, 2259-2265.

93. Y. Komatsu, M. Koizumi, A. Sekiguchi, E. Ohtsuka, Cross-ligation and exchange reactions catalyzed by hairpin ribozymes, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 185-190.

94. S. M. Nesbitt, H. A. Erlacher, M. J. Fedor, The internal equilibrium of the hairpin ribozyme: temperature, ion and pH effects, J. Mol. Biol. 1999, 286, 1009-1024.

95. M. J. Fedor, Tertiary structure stabilization promotes hairpin ribozyme ligation, Biochemistry 1999, 38, 11040-11050.

96. M. K. Nahas, T. J. Wilson, S. Hohng, K. Jarvie, D. M. J. Lilley, T. Ha, Observation of internal cleavage and ligation reactions of a ribozyme, Nut. Struct. Mol. Biol. 2004, 11, 1107-1112.

97. K. J. Hertel, D. Herschlag, О. C. Uhlenbeck, A kinetic and thermodynamic framework for the hammerhead ribozyme reaction, Biochemistry 1994, 33, 3374-3385.

98. J. A. Gerlt, F. H. Westheimer, J. M. Sturtevant, The enthalpies of hydrolysis of acyclic, monocyclic, and glycoside cyclic phosphate diesters, J. Biol. Chem. 1975, 250, 5059-5067.

99. K. J. Hertel, О. C. Uhlenbeck, The internal equilibrium of the hammerhead ribozyme reaction, Biochemistry 1995, 34, 1744-1749.

100. N. G. Walter, J. M. Burke, Real-time monitoring of hairpin ribozyme kinetics through base-specific quenching of fluorescein-labeled substrates, RNA 1997, 3, 392-404.

101. Y. Komatsu, M. Shirai, S. Yamashita, E. Ohtsuka, Construction of hairpin ribozymes with a three-way junction, Bioorg. Med. Chem. 1997, 5, 1063-1069.

102. Y. Komatsu, I. Kanzaki, M. Shirai, I. Kumagai, S. Yamashita, E. Ohtsuka, Functional domain-assembly in hairpin ribozymes, J. Biochem. 2000, 127, 531536.

103. M. Zacharias, P. J. Hagerman, Bulge-induced bends in RNA: quantification by transient electric birefringence, J. Mol. Biol. 1995, 247, 486-500.

104. D. Klostermeier, D. P. Millar, Helical junctions as determinants for RNA folding: origin of tertiary structure stability of the hairpin ribozyme, Biochemistry 2000, 39, 12970-12978.

105. P. A. Feldstein, G. Bruening, Catalytically active geometry in the reversible circularization of «mini-monomer» RNAs derived from the complementary strand of tobacco ringspot virus satellite RNA, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 1991-1998.

106. C. Schmidt, R. Welz, S. Muller, RNA double cleavage by a hairpin-derived twin ribozyme, Nucleic Acids Res. 2000, 28, 886-894.

107. S. Muller, R. Welz, S. A. Ivanov, K. Bossmann in Highlights in Bioorganic Chemistry: Methods and Applications (Ed.: C. Schmuck, H. Wennemers), Wiley-VCH, Weinheim, 2004, pp. 404-421.

108. R. Welz, C. Schmidt, S. Muller, Spermine supports catalysis of hairpin ribozyme variants to differing extents, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001, 283, 648654.

109. S. Muller, докторская диссертация, 2002, Humboldt-Universitat zu Berlin, Берлин

110. S. Joseph, J. M. Burke, Optimization of an anti-HIV hairpin ribozyme by in vitro selection, J. Biol. Chem. 1993, 268, 24515-24518.

111. R. Welz, S. Muller, 5-(Benzylmercapto)-1/-/-tetrazole as activator for 2'-0-TBDMS phosphoramidite building blocks in RNA synthesis, Tetrahedron Lett. 2002, 43, 795-797.

112. D.K. Muller, С.Т. Martin, J.E. Coleman, Processivity of proteolytically modified forms of T7 RNA polymerase, Biochemistry 1988, 27, 5763-5771.

113. S. S. Daube, P. H. von Hippel, Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes, Science 1992, 258, 1320-1324.

114. A. J. Carpousis, J. D. Gralla, Cycling of ribonucleic acid polymerase to produce oligonucleotides during initiation in vitro at the lac UV5 promoter, Biochemistry 1980, 19, 3245-3253.

115. С. T. Martin, D. K. Muller, J. E. Coleman, Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase, Biochemistry 1988, 27, 3966-3974.

116. W. Y. Yin, T. A. Steitz, Structural basis for the transition from initiation to elongation transcription in T7 RNA polymerase, Science 2002, 298, 1387-1395.

117. T. Wada, A. Kobori, S. Kawahara, M! Sekine, Synthesis and hybridization ability of oligodeoxyribonucleotides incorporating A/-acyldeoxycytidine derivatives, Eur. J. Org. Chem. 2001, 4583-4593.

118. J. R. Wyatt, G. T. Walker, Deoxynucleotide-containing oligoribonucleotide duplexes: stability and susceptibility to RNase V1 and RNase H, Nucleic Acids Res. 1989, 17, 7833-7842.

119. T. Horn, C. A. Chang, M. S. Urdea, An improved divergent synthesis of comb-type branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) containing multiple secondary sequences, Nucleic Acids Res. 1997, 25, 4835-4841.

120. B. S. Sproat, B. Beijer, M. Grotli, U. Ryder, K. L. Morand, A. I. Lamond, Chem. Soc. Perkin. Trans. 1 1994, 419-431.

121. S. Iwai, E. Ohtsuka, 5'-Levulinyl and 2'-tetrahydrofuranyl protection for the synthesis of oligoribonucleotides by the phosphoramidite approach, Nucleic Acids Res. 1988, 16, 9443-9456.

122. M. D. Sorensen, M. Meldgaard, V. К. Rajwanshi, J. Wengel, Branched oligonucleotides containing bicyclic nucleotides as branching points and DNA or LNA as triplex forming branch, Bioorg. Med. Chem. Let. 2000, 10, 1853-1856.

123. К. K. Oligvie, M. J. Nemer, G. H. Hakimelahi, Y. A. Proba, M. Lucas, N-levulination of nucleosides, Tetrahedron Lett. 1982, 23, 2615-2618.

124. K. Ganeshan, T. Tadey, K. Nam, R. Braich, W. C. Purdy, J. D. Boeke, M. J. Damha, Novel approaches to the synthesis and analysis of branched RNA, Nucleosides Nucleotides 1995, 14, 1009-1013.

125. T. Wu, К. K. Oligvie, R. T. Pon, Prevention of chain cleavage in the chemical synthesis of 2-silylated oligoribonucleotides, Nucleic Acids Res. 1989, 17, 3501-3517.

126. M. J. Damha, K. Ganeshan, R. H. E. Hudson, S. V. Zabarylo, Solid-phase synthesis of branched oligoribonucleotides related to messenger RNA splicing intermediates, Nucleic Acids Res. 1992, 20, 6565-6573.

127. F. Wincott, A. DiRenzo, C. Shaffer, S. Grimm, D. Tracz, C. Workman, D. Sweedler, C. Gonzalez, S. Scaringe, N. Usman, Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes, Nucleic Acids Res. 1995, 23, 2677-2684.

128. J. F. Milligan, О. C. Uhlenbeck, Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase, Methods Enzymol. 1989, 180, 51-62.

129. R. Welz, кандидатская диссертация, 2003, Humboldt-Universitat zu Berlin, Берлин.

130. S. Hohng, C. Joo, T. Ha, Single-molecule three-color FRET, Biophys. J. 2004, 87, 1328-1337.

131. R. Welz, K. Bossmann, C. Klug, C. Schmidt, H.-J. Fritz, S. Muller, Site-directed alteration of RNA sequence mediated by an engineered twin ribozyme, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 2424-2427.