Бинарные рибозимы "головка молотка"

Воробьева, Мария Александровна

Бинарные рибозимы "головка молотка" тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Воробьева, Мария Александровна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Новосибирск МЕСТО ЗАЩИТЫ

2007 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Бинарные рибозимы "головка молотка"»

Автореферат диссертации на тему "Бинарные рибозимы "головка молотка""

На правахрукописи, _

I '' и 1...-

О О

ии30550В5

ВОРОБЬЕВА МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА БИНАРНЫЕ РИБОЗИМЫ «ГОЛОВКА МОЛОТКА»

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат г>

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск, 2007 г.

003055065

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель: к.х.н. Веньяминова Алия Гусейновна

Официальные оппоненты: д.б.н. Загребельный Станислав Николаевич

к.х.н. Коваль Владимир Васильевич

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-

химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ)

Защита состоится « » фе&р&ЛА 2007 г. в ^О часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « 2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

д.х.н. Фёдорова О.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Селективное ингибирование экспрессии определенных генов на уровне их мРНК является одной из актуальных задач молекулярной биологии, биотехнологии и фундаментальной медицины. В последние десятилетия интенсивно ведется поиск агентов, способных специфично взаимодействовать с мРНК. Среди таких соединений следует назвать антисенс-олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК и каталитические нуклеиновые кислоты, или НК-энзимы. В основе конструирования этих агентов лежит использование последовательностей нуклеотидов, комплементарных определенным участкам мРНК-мишени. В настоящее время они находят широкое применение в качестве инструментов функциональной геномики и диагностики, а также как средства для подавления терапевтически значимых генов. Одним из перспективных направлений в этой области является конструирование НК-энзимов - олигонуклеотидов с характерной вторичной структурой, способных высокоспецифично расщеплять РНК. Среди НК-энзимов особый интерес вызывают рибозимы типа «головка молотка», обладающие высокой каталитической активностью при сравнительно небольшой длине олигонуклео-тидной цепи. Подробно исследованы пространственная структура рибозима «головка молотка», механизм расщепления фосфодиэфирной связи в РНК и каталитический цикл расщепления РНК этим рибозимом, что позволяет конструировать новые варианты рибо-зимов на основе модели «головки молотка» с использованием этих данных. К настоящему времени достигнут значительный прогресс в области конструирования рибозимов «головка молотка» как искусственных ингибиторов экспрессии генов на уровне мРНК; показано, что они способны эффективно подавлять экспрессию вирусных генов, онкогенов, факторов роста и других терапевтически важных генов. Тем не менее, до настоящего времени не прекращается поиск вариантов рибозимов «головка молотка», обладающих улучшенными каталитическими свойствами в сочетании с устойчивостью к действию нуклеаз и способностью взаимодействовать с протяженными структурированными РНК. Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось создание на основе модели «головка молотка» бинарных рибозимных конструкций, способных к «самосборке» из отдельных олигонуклеотидов на РНК-субстрате и обладающих высокой каталитической активностью и устойчивостью в биологических средах.

В ходе исследования решались следующие задачи:

• выбор оптимальной структуры бинарных рибозимов, исследование их способности расщеплять РНК в сравнении с аналогичным полноразмерным рибозимом;

• исследование кинетики различных стадий расщепления РНК бинарным рибозимом «головка молотка», сравнение каталитических циклов бинарного и полноразмерного рибозимов;

• создание бинарных рибозимов, обладающих повышенной устойчивостью в биологических средах в сочетании с высокой каталитической активностью;

• исследование расщепления протяженного структурированного фрагмента природной мРНК новыми бинарными рибозимами.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые созданы бинарные рибо-зимы, состоящие из двух олигорибонуклеотидов, которые после связывания с РНК формируют структуру «головки молотка» без петли-коннектора. На модельном РНК-субстрате показано, что бинарные рибозимы в условиях избытка расщепляют РНК с той же эффективностью, что и полноразмерный рибозим, а в условиях недостатка по отношению к РНК бинарные рибозимы более эффективны, чем полноразмерный аналог. Проведено исследование кинетики взаимодействия бинарного и полноразмерного рибозимов с РНК и продуктами расщепления. Показано, что повышенная эффективность расщепления РНК бинарными рибозимами обусловлена улучшенным соотношением скоростей ассоциации и диссоциации в каталитическом цикле. Сконструированы устойчивые в биологических средах модифицированные бинарные рибозимы. Показано, что оптимальным соотношением стабильность/активность обладают рибозимы, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотиды в неконсервативных положениях и 2'-аминоуридин в полуконсервативных положениях 4 и 7. Исследовано расщепление бинарными и полноразмерными рибозимами 190-звенного фрагмента MDR1 мРНК с выраженной вторичной структурой. Показано, что бинарные рибозимы расщепляют структурированную РНК значительно эффективнее, чем их полноразмерные аналоги. Результаты исследования позволяют рассматривать бинарные рибозимы «головка молотка» как перспективные высокоспецифичные ингибиторы экспрессии генов на уровне мРНК. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты работы были представлены на конференциях XIV International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Левен, Бельгия, 2002 г, 5th Cambridge Symposium «Nucleic Acids Chemistry & Biology», Кембридж, Великобритания, 2003 г, 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, Варшава, Польша,

2004 г, XV International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Миннеаполис, США, 2004 г, International Conference on Chemical Biology, Новосибирск, Россия,

2005 г, международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, Россия, 2006 г, XVI International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Берн, Швейцария, 2006 г и др. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 121 странице, содержит 46 рисунков и 10 таблиц. Библиография включает 256 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Немодифицированный бинарный рибозим: конструирование и каталитическая активность

В данной работе предложено использовать для направленного расщепления РНК бинарные рибозимы, представленные двумя отдельными олигомерами, которые при связывании с РНК образуют структуру «головки молотка» без петли-коннектора. Замена протяженного олигомера-рибозима двумя олигонуклеотидами позволяет существенно упростить синтез и выделение рибозимных конструкций. Кроме того, мы предположили, что использование бинарной системы позволит регулировать каталитическую активность рибозима за счёт изменения соотношения концентраций его компонентов. Возможно, что при использовании бинарных рибозимов для воздействия на РНК в биологических системах компоненты рибозима будут проникать в клетку лучше, чем полноразмерный рибозим, имеющий больший суммарный заряд.

В первой части работы были сконструированы бинарный рибозим «головка молотка» и его полноразмерный аналог, который мы использовали в качестве контроля. Субстрат-связывающие участки рибозимов содержали по 7 нуклеотидов; предварительно было показано, что такая длина обеспечивает как эффективное образование рибозим-субстратного комплекса, так и быструю диссоциацию продуктов расщепления РНК от рибозима. Каталитический кор содержал общую для всех рибозимов «головка молотка» консервативную последовательность. Стебель II представлял собой последовательность, наиболее часто используемую при конструировании транс-рибозимов. Компоненты бинарного рибозима мы обозначили как «левая цепь» и «правая цепь». В качестве субстрата для исследования каталитической активности рибозимов была выбрана мРНК гена множественной лекарственной устойчивости тс1г1, конкретной мишенью для расщепления был участок в области инициации трансляции. В качестве модельного РНК-субстрата для первичного тестирования каталитической активности рибозимов использован 19-звенный синтетический олигорибонуклеотид (1ША19), соответствующий нуклеотидам 127-145 МОЯ! мРНК (рис. 1).

Каталитическая активность бинарного рибозима Ьт11г1 была исследована при различных соотношениях рибозим:РНК, в сравнении с активностью аналогичного полноразмерного рибозима {1ИуЛ. Как видно из рис. 1А, в условиях избытка как бинарный, так и полноразмерный рибозимы расщепляли РНК с одинаково высокой эффективностью (80 % через 1 мин после начала реакции). В условиях недостатка рибозима по отношению к РНК наблюдались существенные различия в расщеплении РНК бинарным и полноразмерным рибозимами. При 10-кратном недостатке обоих компонентов расщепление РНК протекало с меньшей скоростью по сравнению с полноразмерным рибозимом, а предельная степень расщепления не превышала 20 % (рис. 1Б, кривая 5). Однако достаточно было

увеличить концентрацию только одной из цепей бинарного рибозима, чтобы эффективность расщепления заметно возросла (см., например, рис. 1Б, кривая 4). При этом общая концентрация бинарного рибозима была ограничена концентрацией второй цепи и составляла одну десятую от концентрации РНК, т.е., расщепление по-прежнему протекало в условиях недостатка рибозима по отношению к РНК. При эквимолярном соотношении концентраций «избыточной» цепи рибозима и РНК-субстрата начальная скорость и предельная степень расщепления РНК бинарным рибозимом были выше, чем в случае полноразмерного рибозима. Этот эффект мы наблюдали при повышении концентрации как «правой», так и «левой» цепи рибозима, однако более выгодным оказалось использование избытка «правой» цепи (рис. 1Б, кривые 1,2).

1™А19 ^

б'-АОСОСОАССиССОСАийСА-З' З'-СвСиССА СССиАСС-5

"Левая" цепь

А А

С д^

9Р. "Правая" цепь

II А и

ГША19 ^

¡У-АОСССОАСОи СО ОвА иввА-? З'-С в С II С С А С и А С С - 5'

ее

ЯИг,

А А С А

„А и 11 ее

в С А в

ви

•Цп III А

си

1№1 ЫпИг!

Ч с

о»

и «

а л

1 2 Время, мил

60 90

Время, мин

Рис. 1. Расщепление 1ША19 немодифицированными бинарным и полноразмерным рибозимами. Условия реакции: 37 °С; 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ М§С12, начальная концентрация [32Р]-ША19 100 нМ.

А. Кинетика расщепления РНК в условиях избытка рибозима. [П11г1] = [ЯШ,] = [Ы^] = 1 мкМ. Б. Кинетика расщепления РНК в условиях недостатка рибозима. Кинетические кривые: 4111*7,] = 100 нМ, [Ы1г,] = 10 нМ, 2 - [1*1*7,,] = 10 нМ, [1^] = 100 нМ, 3 - [ШЫ] = 10 нМ, 4 - [1*1*7,] = 40 нМ, [1Л*7,] = 10 нМ, 5 - [БЖ^!] = [1.1*2,1 = 10 нМ.

Повышение эффективности расщепления при росте концентрации лишь одной из цепей объясняется, как мы предполагаем, особенностями взаимодействия бинарного рибозима с РНК. Наиболее вероятным путем образования рибозим-субстратного комплекса представляется связывание одной из цепей с РНК-субстратом с последующим присоединением второй цепи к этому двойному комплексу. Чтобы проверить это предположение, методом задержки в геле была исследована «сборка» комплекса бинарный рибозим-РНК.

Для наблюдения за ходом реакции был использован нерасщепляемый аналог РНК-субстрата, содержащий в сайте расщепления 2'-0-метилцитидин (ИЧА19Ш, рис. 2).

5'- АбСССОАСби ств в в А V С в А - 31 3' - СгСОССА С С С и АС С - 5' А С А в

В А(3 А ев и А и в с

в с р р

ЬЯг,

К1 К2 КЗ К4 0.5

10 15 30 мин

«а. «и- -»-и^-РИА^—ИРг,

«к «к- тш КЫА1

Рис. 2. Образование трехкомпо-нентного комплекса бинарный рибозим-РНК (радиоавтограф 15 %-ного нативного ПААГ). Условия реакции: 25 °С; 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ М$С12, 10 нМ ЬКгь 50 нМ 50 нМ [32Р]-ШЧА19т

Контроли: К1 - ША19т, К2 - комплекс LRzl•RNA19m, КЗ- комплекс и<7,-1ШЛ1<)т-иКхь К4 - комплекс ГШ/гИМА!?"'.

Дорожки 0.5,...,30 - 1ША19т после инкубации с компонентами бинарного рибозима Ы^ и К в течение указанного времени.

Как видно из приведенного на рис. 2 радиоавтографа, уже через 30 с после начала инкубации с обоими компонентами рибозима весь РНК-субстрат оказывается связанным в двухкомпонентный комплекс М^'ЮЧАХЭ1", а затем наблюдается присоединение к этому комплексу ЬГ^г, с образованием трехкомпонентного комплекса 1ШЛ19|п' . Таким образом, при более высокой концентрации одного из рибо-зимных компонентов («избыточная» цепь) этот олигомер первым связывается с субстратом, «подготавливая» его для связывания со вторым компонентом бинарного рибозима.

Чтобы количественно охарактеризовать кинетику расщепления РНК рибозимами «головка молотка», используют, как правило, схему Михаэлиса-Ментен, при этом реакцию ведут как при недостатке рибозима по отношению к РНК-субстрату, так и при его избытке. В условиях избытка обоих компонентов бинарного рибозима по отношению к РНК-субстрату мы наблюдали гиперболический рост скорости реакции с повышением концентрации рибозима, что позволило применить схему Михаэлиса-Ментен и определить параметры Км и ^(табл. 1).

Таблица 1. Кинетические параметры кс,„ и Км расщепления 1ША19 бинарным и полноразмерным рибозимами в условиях избытка рибозимов.

Условия реакции: 25 °С; 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ М§С12, начальная концентрация [32Р]-ШЧА19 50 нМ, концентрация рибозимов 100-3200 нМ.

Рибозим Км, мкМ к^, МИН"' кса/Км, мшГ'-мкМ"1

ты 0.21±0.05 15.9±1.0 76.3

Ы [11*7,1 0.89±0.17 21.5±1.7 24.1

При расщеплении коротких РНК-субстратов в условиях избытка рибозима по отношению к РНК значение ксМ совпадает со значением константы расщепления фосфоди-эфирной связи. Как видно из приведенных в табл. 1 данных, полноразмерный и бинарный рибозимы обладают близкими значениями параметра кса,. Таким образом, разделение

полноразмерного рибозима на два отдельных олигомера не искажает структуру активного центра рибозима и практически не влияет на химический шаг реакции. Значение константы Михаэлиса Км, в свою очередь, характеризует стабильность рибозим-субстратного комплекса. В случае бинарного рибозима стабильность комплекса оказалась в 4.5 раза ниже, чем для полноразмерного рибозима. Поскольку дуплексы I и III в комплексах бинарного и полноразмерного рибозимов с РНК одинаковы, можно предполагать, что снижение стабильности рибозим-субстратного комплекса обусловлено, главным образом, понижением устойчивости дуплекса II в отсутствие тетрануклеотидной петли-коннектора. Тем не менее, несмотря на пониженную стабильность рибозим-субстратного комплекса, бинарные рибозимы проявляют высокую каталитическую активность, расщепляя РНК в каталитическом режиме более эффективно, чем их полноразмерные аналоги.

2. Бинарные рибозимы с модифицированным стеблем II

На следующем этапе работы мы исследовали влияние стабилизации дуплекса II на каталитическую активность бинарных рибозимов. Для повышения стабильности дуплекса II были использованы два подхода - введение на конец дуплекса остатка интеркалятора и замена рибонуклеотидов их 2'-0-метил аналогами (рис. 3).

А ♦ Б 1

5'- АбССССАССиС1бСкиСС1- 3' 5'-Д1!СвС5А0 60Св0САиеСА- 3'

3* - с й с и с с а с с с 1] а с с — 5' 3' - с5сос са сссиасс-5'

а с„ а с„

а сз а "с

о а0 а снгсн2он о ад а

с а и «. сиош^и

А и Р>т: ~ .А® ^^ А"У

р р РТ

Е1Е2 ¡ЧКг

ЫпИг2: Р., = ОН, Я2 = 0(СН2)3МН2 ЫпЯгб: К, = ОН, 112 - 0(СН2)3Ш2

ЬтКгЗ: Я, = ОН, Я2 = 0(СН2)3Ш/>/т Ьт1{г7: Я, = ОН, = 0(СН2)3№1Р/ш

ЫпНЫ:11, = ЫН(СН2)3МНРЛл, Я2 = ОН ЬтИгв: Я, - Ш(СН2)3МНПт, Я2 = ОН

ЬтКг5: Я, = Ш(СН2)3ШР/ш, Я2 = 0(СН2)3МШ"/т

Рис. 3. Бинарные рибозимы «головка молотка» с модифицированным стеблем II. Стрелкой указан сайт расщепления.

В рамках первого подхода был использован остаток красителя №(2-гидроксиэтил)феназиния, который способен стабилизировать олигонуклеотидные дуплексы за счёт стэкинг-взаимодействий, в том числе интеркаляции, и электростатических взаимодействий. Для введения остатка феназиния на 5'-конец «левой» цепи рибозима или на З'-конец «правой» цепи в эти положения был введён аминопропильный линкер. На примере рибозима ЫпКг2, содержащего аминопропилфосфат на З'-конце «правой» цепи, было показано, что введение аминолинкера практически не влияет ни на стабильность рибозим-субстратного комплекса (Км), ни на константу расщепления фосфоди-эфирной связи кса[ (ср. значения этих параметров для Ыпкг! и ЫпТШ, табл. 2).

Была исследована каталитическая активность бинарных рибозимов, содержащих остаток М-(2-гидроксиэтил)феназиния на 3'-конце «правой» цепи (binRz3) или на 5'-конце «левой» цепи (binRz4). Анализируя значения кинетических параметров расщепления РНК в условиях избытка рибозима (табл. 2), можно заключить, что в случае binRz3 значение Км понижается примерно в 1.5 раза по сравнению с binRz2, что говорит о некоторой стабилизации рибозим-субстратного комплекса. Для binRz4 значение Км по сравнению с binRz2 практически не изменяется, т.е., интеркалятор, находящийся на 5'-конце «левой» цепи, не стабилизирует комплекс. При этом наличие остатка феназиния на З'-конце «правой» цепи рибозима binRz3 не влияет на константу расщепления фосфоди-эфирной связи (kcat). В случае же рибозима binRz4, содержащего Phn на 5'-конце «левой» цепи, k^t снижается по сравнению с немодифицированным рибозимом binRz2 примерно в 2.5 раза, т.е., введение интеркалятора в это положение снижает скорость расщепления фосфодиэфирной связи. Можно предполагать, что остаток Н-(гидроксиэтил)феназиния, присоединенный к «левой» цепи рибозима, взаимодействует с активным центром и/или стабилизирует активную конформацию рибозима.

Таблица 2. Кинетические параметры расщепления RNA19 в условиях избытка бинарных рибозимов с модифицированным стеблем II. Условия реакции: 25 °С; 50 мМ Трис-НС1 (рН7.5), 10 мМ MgCb, начальная концентрация [32P]-RNA19 50 нМ, концентрация рибозимов 100-3200 нМ.

Для повышения стабильности дуплекса II был использован также другой подход: замена рибонуклеотидов в составе этого дуплекса их 2'-0-метил аналогами. Известно, что дуплексы, образованные олиго(2'-0-метилрибонуклеотидами), как правило, более стабильны, чем аналогичные олигорибонуклеотидные дуплексы (Cummins L. L. et al. Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 2019-2024). Мы предположили, что введение 2'-0-метилрибонуклеотидов в дуплекс II позволит повысить его стабильность, не исказив при этом конформации дуплекса, т.к. 2'-0-метилрибонуклеозиды имеют СЗ'-эндо конформацию, как и рибонуклеозиды, что позволяет им образовывать дуплексы стандартного А-типа. Данные о каталитической активности рибозимов с 2'-0-метилированным стеблем II приведены в табл. 2. В условиях избытка рибозима по отношению к РНК значение Км для рибозима binRz6 понижается в 1.5 раза по сравнению с немодифицированным binRz2, т.е., имеет место некоторая стабилизация рибозим-субстратного комплекса. Присоединение к 3'-концу модифицированной «правой» цепи рибозима М-(2-гидроксиэтил)феназиния не вызывает дополнительной стабилизации ком-

Рибозим Km, mkM kc,,, мин"1 кс«(/1См, мин'-мкМ"1

binRz2 1.1±0.4 19.4±2.7 17.0

binRz3 0.71±0.35 23.2±4.6 32.8

binRz4 1.15±0.16 7.2±0.4 6.3

binRz5 1.7±0.3 10.5±0.8 6.2

binRz6 0.65±0.25 13.8±2.0 21.1

binRz7 0.55±0.21 14.2±2.1 25.8

binRz8 0.42±0.07 3.3±0.1 7.8

binKzl 0.89±0.17 21.5±1.7 24.1

flRzl 0.21±0.05 15.9±1.0 76.3

плекса binRz7«PHK и не влияет на константу расщепления. Напротив, введение интерка-лятора на 5'-конец «левой» цепи рибозима (binRz8) позволяет добиться 2.5-кратного, по сравнению с немодифицированным рибозимом, повышения стабильности рибозим-субстратного комплекса. К сожалению, одновременно наблюдается значительное понижение константы расщепления фосфодиэфирной связи (ки1) и, таким образом, суммарный эффект от введения двух модификаций оказывается отрицательным.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что в рамках рассмотренных нами подходов дуплекс II может быть стабилизирован путем замены олигорибонуклеоти-дов их 2-О-метил аналогами одновременно с введением остатка интеркалятора на 5'-конец «левого» компонента рибозима, однако такая модификация снижает константу расщепления фосфодиэфирной связи в РНК. Введение 2'-0-метилрибонуклеотидов в стебель II практически не изменяет каталитическую активность бинарных рибозимов, что дает возможность использовать эту модификацию в качестве защиты от расщепления эндорибонуклеазами при конструировании рибозимов для использования их в клеточных системах.

3. Сравнение кинетических схем расщепления РНК бинарным и полноразмерным рибозимами

Как было показано в разделе 1, бинарный рибозим binRzl и его полноразмерный аналог flRzl обладают близкими значениями константы расщепления фосфодиэфирной связи. Это позволяет надеяться, что строение активного центра бинарного и полноразмерного рибозимов одинаково. Следовательно, различия в каталитической активности бинарных и полноразмерных рибозимов, в «поведении» рибозимов в ходе каталитического цикла, обусловлены особенностями взаимодействия этих рибозимов с РНК-субстратом и продуктами расщепления, и для выявления этих различий необходимо было исследовать кинетику различных стадий этого взаимодействия. За основу была взята описанная в литературе кинетическая схема расщепления РНК полноразмерным рибозимом «головка молотка» (Stage-Zimmermann Т. К. et al. RNA. 1998. V. 4. Р. 875-889). Основные стадии каталитического цикла полноразмерного рибозима — это обратимая ассоциация рибозима и РНК, расщепление фосфодиэфирной связи в РНК и обратимая диссоциация продуктов реакции от рибозима, которая может происходить двумя различными путями (рис. 4А). Бинарный рибозим состоит из двух отдельных олигомеров, поэтому образование рибо-зим-субстратного комплекса включает в себя, как было показано в разделе 1, две последовательных стадии: образование комплекса одного из компонентов с субстратом и присоединение к этому комплексу второго компонента рибозима. Другим отличием каталитического цикла бинарного рибозима является, как мы предполагаем, стадия диссоциации продуктов расщепления. Дуплекс II обладает меньшей стабильностью, чем дуплексы компонентов рибозима с продуктами расщепления, и диссоциирует первым. Затем неза-

висимо друг от друга диссоциируют два отдельных комплекса продуктов расщепления с компонентами рибозима. С учетом сделанных предположений кинетическую схему расщепления РНК бинарным рибозимом можно представить следующим образом (рис. 4Б).

А _ Шг-Р2 + Р1.

1 к, ЯРг + З^^КгЗ—* к.,

-ЛЯ2-Р1-Р2. к"3

+ Р2'

Р1 + Р2

ь у1Кг'мЧ1

к*.ТЧ к2

LRz.RRz.S_

^Чигв+иь^

RRz•P2

к.з I к.

Рис. 4. Кинетические схемы расщепления РНК полноразмерным рибозимом (А) и бинарным рибозимом (Б), в - РНК-субстрат, Р1, Р2 -продукты расщепления, АЛг - полноразмерный рибо-зим, ЬНг, КИг - «левый» и «правый» компоненты бинарного рибозима, соответственно.

к^

LRz+P1+RRz■P2

Н4

Поскольку бинарный рибозим и его полноразмерный аналог обладают близкими значениями константы расщепления фосфодиэфирной связи, для выявления различий во взаимодействии этих рибозимов с РНК нам необходимо было исследовать стадии ассоциации рибозим-субстратного комплекса и диссоциации продуктов реакции от рибозима.

3.1. Исследование «сборки» комплексов рибозим-РНК и их диссоциации

При исследовании стадии ассоциации рибозима (или его компонентов) с РНК мы следили непосредственно за образованием рибозим-субстратных комплексов, используя нерасщепляемый аналог РНК-субстрата ШЧА19т. Разделение радиоактивно меченого РНК-субстрата и рибозим-субстратных комплексов проводили методом нативного гель-электрофореза в 15 %-ном ПААГ, содержащем 50 мМ Трис-ацетат (рН 7.5) и 10 мМ МвС12, т.е., в тех же буферных условиях, в которых проходит расщепление РНК рибози-мами. Найденные значения констант скорости ассоциации (табл.3) совпадают по порядку величины с константами, приведенными в литературе для полноразмерных рибозимов «головка молотка». Как видно из полученных данных, при «сборке» трехкомпонентного комплекса бинарный рибозим-субстрат наблюдается кооперативный эффект: присоединение одной из цепей к РНК ускоряет присоединение второй цепи примерно в два раза. При этом константы скорости образования комплекса бинарный рибозим-РНК имеют близкие значения с константой скорости образования комплекса полноразмерный рибо-зим-РНК Ш^г1»1ША19ш. Интересно отметить, что присоединение «левой» цепи рибозима ГН^! к комплексу второй цепи с субстратом Ш^'Щ^А^"1 происходит быстрее, чем присоединение «правой» цепи к двойному комплексу Ы^'Н^ЧАИ"1. Эти результаты коррелируют с данными по расщеплению РНК бинарными рибозимами: в каталитиче-

ском режиме наибольшая эффективность расщепления достигается при использовании недостатка «левой» цепи по отношению к «правой» цепи и субстрату (см. раздел 1). Одной из причин этого эффекта является, как следует из значений констант скорости ассоциации, более быстрое присоединение «левой» цепи к комплексу правой цепи с субстратом.

Таблица 3. Константы скорости ассоциации бинарного и полноразмерного рибозимов с субстратом.

Условия реакции: 25 °С; 50 мМ ТрисНО (рН 7.5), 10 мМ М^Ь, концентрация [32Р]-1Щ419т, ЬКг,.[32Р]-1ША19т или Ш*21,[32Р]-1ША19,п 0.1 мкМ, концентрация МШ или одной из цепей бинарного рибо-зима (ЬИг,, КНг,) 50-600 нМ.

Чтобы оценить скорость диссоциации комплексов полноразмерного и бинарного ри-бозима с радиоактивно меченым РНК-субстратом, к комплексу добавляли большой избыток «холодного» субстрата и следили за вытеснением меченого субстрата из комплекса. Полученные константы свидетельствуют о том, что комплекс полноразмерного рибозима с РНК (кдисс = 0.012±0.002 мин'1) примерно в 2 раза стабильнее, чем комплекс бинарного рибозима (кдасс = 0.020±0.003 мин"1). После образования комплекса рибозим-субстрат возможны два пути превращения этого комплекса: диссоциация или реакция расщепления фосфодиэфирной связи. Константы расщепления фосфодиэфирной связи составляют 21.5 мин"1 для бинарного рибозима ЫпКг1 и 15.9 мин"1 для его полноразмерного аналога АЯг1 (см. табл. 1). Таким образом, скорость расщепления приблизительно на 3 порядка превышает скорость диссоциации рибозима из комплекса с субстратом. Поэтому снижение стабильности рибозим-субстратного комплекса при переходе от полноразмерного рибозима к бинарному не должно существенно понижать эффективность расщепления РНК.

3.2. Исследование скорости диссоциации продуктов расщепления РНК от рибозима

Другим важным отличием в каталитических циклах бинарного и полноразмерного рибозимов является стадия диссоциации продуктов расщепления РНК от рибозима. В условиях недостатка рибозима по отношению к РНК именно скорость освобождения из комплекса с продуктами определяет в большинстве случаев число оборотов реакции и эффективность расщепления РНК. Чтобы сравнить скорости диссоциации продуктов от бинарного и полноразмерного рибозимов, были использованы 11-звенный и 8-звенный олигорибонуклеотиды Р1 (5'-АОСОСОАООиСр) и Р2 (5'-ОООАШОА), соответствующие продуктам расщепления РНК-субстрата 1ША19. В случае полноразмерного рибозима были определены также константы скорости диссоциации каждого из продуктов из

Реакция комплексообразования Константа скорости ассоциации, мкМ"'-мин"'

[Л1г, + КМЛ19"' 28±3

ККг, + ША19т 17±1

Ш2,'ША19га + 34±7

ВКг,«ША19га + ЬОг, 44±7

ШШ + ШЧА19т 36±8

тройного комплекса рнбознма с двумя продуктами расщепления АК21«Р2«Р1. Комплекс бинарного рибозима с обоими продуктами реакции нам не удалось наблюдать даже при очень больших избытках компонентов рибозима по отношению к продуктам, что подтверждает предположение об очень низкой стабильности такого комплекса. Поэтому были определены только константы диссоциации каждого из продуктов от соответствующей цепи бинарного рибозима. Значения констант диссоциации приведены в табл. 4.

Таблица 4. Константы скорости диссоциации комплексов полноразмерного и бинарного рибозимов

Условия реакции: 25 °С; 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ MgCl2, 50 нМ [32Р]-Р1 или [32Р]-Р2, 5 мкМ немеченый Р1 или Р2, 500 иМ ШШ, или 1Л1г,.

А Б

0 0.17 0.5 1 2 3 5 10 15 Время, мин 0 0.17 0.5 12 3 5 10 15 Ь1?г,1>1—>- ^ П1Ш-Р1—»-

тт

1 1

I....................................I Р1—► , ,. # >

Рис. 5. Диссоциация комплексов ЬКг1'Р1 (А) и ПКг1»Р1 (Б) (радиоавтографы 15 %-ного нативного ПААГ). Условия реакции: 25 °С; 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ М^Ь, 500 нМ Ы^ или П1Ы. Концентрации [32Р]-меченого и немеченого Р1 50 нМ и 5 мкМ, соответственно.

На основании полученных результатов можно сделать общий вывод о том, что разделение рибозима "головка молотка" на два отдельных олигомера не сказывается на стадии ассоциации рибозим-субстратного комплекса и существенно ускоряет диссоциацию одного из продуктов реакции от рибозима. Полученные результаты хорошо согласуются с данными по расщеплению РНК (см. рис. 1Б, кривые 1,2): использование недостатка «левой» цепи рибозима при эквивалентном соотношении «правой» цепи и субстрата позволяет добиться максимальной эффективности расщепления, превосходящей эффективность расщепления РНК полноразмерным рибозимом. Как следует из значений кинетических констант, причиной этого является сочетание высокой скорости ассоциации «левой» цепи с комплексом «правая» цепь-субстрат, независимой диссоциации продуктов реакции от рибозима и максимально быстрого освобождения «левой» цепи из комплекса с продуктом расщепления. Таким образом, бинарные рибозимы «головка молотка» обладают улучшенным по сравнению с полноразмерными аналогами соотношением скоростей ассоциации и диссоциации в каталитическом цикле.

с продуктами расщепления РНК.

Реакция диссоциации Константа скорости диссоциации, мин"1

ШШ«Р>Р1 — ПКг1»Р2+Р1 0.20±0.04

Л1Ы'Р1 -> 1Жг1+Р1 0.18±0.03

1Л*г,'Р1 — 1Л/,+Р1 не определено (см. рис. 5)

ШШ«Р2'Р1 Ш1г1«Р1+Р2 0.016±0.005

ГШг1,Р2 -> ШЫ+Р2 0.020±0.001

Ш121,Р2 -> Ми,+Р2 0.05±0.005

4. Модифицированные бинарные рибозимы, устойчивые в биологических средах

Одним из важных факторов, которые необходимо учитывать при конструировании рибозимов "головка молотка" для расщепления мРНК, является быстрая деградация незащищенных рибозимов в биологических средах под действием эндо- и экзонуклеаз. Поскольку перспективной задачей данной работы было создание бинарных рибозимов для воздействия на РНК в биологических системах, необходимо было повысить стабильность бинарных рибозимов к действию нуклеаз и сохранить при этом высокую каталитическую активность. Для этого мы использовали стратегию модификации, описанную ранее для полноразмерных рибозимов.

5'- AGCGCGAGGU C'G GGAUGGA -3 . _ т jnvCmGmCnVCmCInA стстст0тдтстст _ 5 Ат С

binRz9: R = 0(CH2)3NH2 binRzlO:R = T|11V

G АГ„т

A"Um G^C1" GmCm P P

AGCGCGAGG - TinvCn*3mCmUInC'nCmA

binRzll: R - 0(CH2)3NH2 binRzl2: R = Tillv

U C^G

GGGAUGGA - 3' СтСшС[пОтАшСтСт - 5' А» С-вЧ gA

g гЛ.

(.mgm ü U WH;

A"U" G"Cm G"Cm P P

5'- AGCGCGAGGU С GGGAUGGA - 3' 3' - TinvCmGroC'rUmC1T1CmA cmCmClnUmAmCmCIn - 51 А

blnRzU: R = 0(CH2)3NH2 binRzU: R = Tinv

i G

G Ar„A C"Gm u A™Um GmCm Qii^m

2'-аминоуридин

'inv-

f^-OH

5'- AGCGCGAGGU 3' - cmGmCrnUIT1CInClnA

■GGGAUGGA CmCroCrnUmAmCrrtm -

G А

C"G™ A"U" Gmcm

GmCm A" G'

Gmum

AGCGCGAGGU C*GGGAUGGA - 3' 31 - CmGmCnÜmCmCInA CmCmCmUmAmCmCm - 51 A" CJ,™, зА

flRz4

A"U" G"t" G"C* Am G" G"Um

Рис. 6. Модифицированные рибозимы «головка молотка».

A. Бинарные рибозимы, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотвды в дуплексах I, II, III и в неконсервативных положениях каталитического кора.

Б. Бинарные рибозимы, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотиды в дуплексах I, II, III и в неконсервативных положениях каталитического кора и 2'-аминоуридин в положениях 4 и 7.

B. Бинарные рибозимы с ^модифицированным каталитическим кором, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотиды в дуплексах I, II и III.

Г. Полноразмерный рибозим, содержащий 2'-0-метилрибонуклеотиды в дуплексах I, II, III и в неконсервативных положениях каталитического кора.

Д. Полноразмерный рибозим, содержащий 2'-0-метилрибонуклеотиды в дуплексах I, И, III и в неконсервативных положениях каталитического кора и 2'-аминоуридин в положениях 4 и 7. Стрелкой указан сайт расщепления.

Были сконструированы модифицированные бинарные рибозимы, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотиды во всех неконсервативных положениях и 2'-0-метилуридин (binRz9, binRzlO, рис. 6А) либо 2'-аминоуридин (binRzll, binRzl2, рис. 6Б) в полуконсервативных положениях 4 и 7. Для защиты З'-концов мы использовали 12

3-(аминопропил)фосфатную группу или остаток тимидииа, присоединенный З'-З'-фосфодиэфирпой связью. Чтобы оценить влияние 2'-модификаций в каталитическом коре на активность, были созданы рибозимы binRzl3, binRzl4 с немодифицированным каталитическим кором (рис. 6В).

4.1. Устойчивость бинарных рибозимов к действию нуклеаз сыворотки

В качестве модельной системы для исследования устойчивости компонентов бинарных рибозимов к действию экзо- и эндонуклеаз мы использовали культуральную среду IMDM, содержащую 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. Реакционные смеси после инкубации компонентов рибозимов в среде с сывороткой анализировали электрофорезом в 20 %-ном денатурирующем ПААГ (рис. 7) и из полученных данных рассчитывали времена полужизни компонентов рибозимов (табл. 5).

RRz„ LRz,, RRz,, LRz„

1 5 10 30 60 180 1440 мин 1 5 10 30 60 1801440 мин 1 S 10 30 60 180 1440 мин 1 5 10 30 60 100 1440

Рис. 7. Устойчивость модифицированных бинарных рибозимов в культуральной среде 1МБМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, при 37 °С (радиоавтограф 20 %-ного денатурирующего ПААГ). Дорожки 1, ... ,1440 - компоненты рибозимов после инкубации в течение указанного времени. Стрелкой указано положение исходного [32Р]-меченого олигонуклеотида.

Таблица 5. Времена полужизни компонентов бинарных рибозимов при инкубации в культуральной среде с сывороткой.

ЫЪ:^ 1Шгк - «правый» и «левый» компоненты бинарного рибозима Ьтих№. Структуры бинарных рибозимов см. рис. 1, 3 и 6.

В случае немодифицированного бинарного рибозима Ып№1 оба его компонента, как и следовало ожидать, очень быстро деградировали при инкубации в сыворотке: время их полужизни составляло около 1 мин. Введение 2'-0-метилрибонуклеотидов в субстрат-связывающие участки и стебель II в сочетании с модификацией 3'-концов (рибозимы ЫпТ1х13, ЫпНгН) позволило увеличить время полужизни «левого» компонента бинарно-

Бинарный рибозим ti/2 компонентов рибозима, мин

RRzn LRzn

binRz9 1700±90 1400±100

binRzlO 2300±420 1400±100

binRzll 1700±160 1400±100

binRzl2 1400±60 1400±100

binRzl3 0.70±0.04 770±170

binRzl4 0.60±0.02 770±170

binRzl 0.56±0.03 1.1±0.1

го рибозима (Ы^з = Ы^г^) до 770 мин"1, в то время как устойчивость «правого» компонента (М^з, Ш^,,) осталась на прежнем уровне. Можно полагать, что это связано с различным нуклеотидным составом компонентов рибозима. Дополнительная модификация неконсервативных рибонуклеотидов каталитического кора (рибозимы ЫпТ1г19-Ып11212) резко повысила устойчивость «правого» компонента рибозима (\\/2 = 1400-2300 мин), при этом устойчивость «левого» компонента (Ы^ = Ы^ю = 1Лги = ЬКги) увеличилась в 2 раза. Тип З'-концевой модификации и тип 2'-заместителя в положениях 4 и 7 не влияли на устойчивость модифицированных бинарных рибозимов.

4.2. Каталитическая активность модифицированных бинарных рибозимов

Кинетические параметры расщепления РНК модифицированными бинарными рибо-зимами были определены в условиях избытка обоих компонентов рибозима по отношению к РНК (табл. 6). Оказалось, что введение 2'-0-метилрибонуклеотидов в субстрат-связывающие участки и стебель II (ЫпКг13, ЫпЯг14) не влияет ни на стабильность рибо-зим-субстратного комплекса, ни на константу расщепления фосфодиэфирной связи: оба рибозима практически не отличались по кинетическим параметрам от немодифицирован-ного рибозима Ып11г1.

Рибозим Км, мкМ кса,, мин"1 кСа/Км> мин^-миМ"1

ЫпКг9 0.41±0.10 0.9±0.1 2.2

ЫпКгЮ 0.45±0.17 0.8±0.1 1.8

ЫпЛгН 0.33±0.05 3.8±0.2 11

ЫпКг12 0.30±0.07 4.2±0.3 14

ЫпИгО 0.77±0.31 22.Ш.2 29

Ып11г14 0.83±0.24 22.2±2.5 27

0.89±0.17 21.5±1.7 24.1

ЬтИгб 0.65±0.25 13.8±2.0 21

Таблица 6. Кинетические параметры расщепления 1ША19 модифицированными рибозимами в условиях избытка рибозимов. Условия реакции: 25 °С;50 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ М^Ь, начальная концентрация [32Р]-1ША19 50 нМ, концентрация рибозимов 100-3200 нМ.

В случае максимально модифицированных (и, соответственно, наиболее нуклеолитически стабильных) бинарных рибозимов ЫпИ29-Ып1Ш2, содержащих 2'-модификации не только во фланкирующих участках и стебле II, но и в каталитическом коре, происходило снижение константы расщепления (кса1) в 5-25 раз. Такое понижение можно объяснить частичным искажением пространственной структуры активного центра рибозима после введения заместителя в 2'-положение. При этом рибозимы ЫпНхН и Ып1*7Л2, содержащие в положениях \)АЦ]1 2'-аминоуридин, аминогруппа которого способна отдавать/акцептировать протон, расщепляли РНК-субстрат более эффективно, чем их аналоги Ып!^) и Ып11г10, содержащие в этих же положениях 2'-0-метилуридин. Одновременно положительным эффектом от 2'-модификаций каталитического кора стала дополнительная стабилизация рибозим-субстратного комплекса: для всех четырёх максимально модифицированных рибозимов наблюдается двукратное сни-

жение величины Км. Таким образом, снижение кга, вызванное введением 2'-заместителей, частично компенсируется стабилизацией рибозим-субстратного комплекса. Следует отметить, что модифицированные рибозимы ЬтКг9-ЫпКг14, несущие на З'-конце «правого» компонента различные модификации - 3-(аминопропил)фосфатную группу или дополнительный «инвертированный» остаток тимидина, обладали практически одинаковыми кинетическими параметрами (см. табл.6).

Мы исследовали также расщепление РНК модифицированными бинарными рибози-мами при недостатке одного из компонентов рибозима (рис. 8). Для сравнения приведены кривые расщепления полноразмерными рибозимами ПИгЗ и 111^4, содержащими аналогичный набор 2'-модификаций (см. структуры на рис.6 Г, Д). Можно видеть, что в условиях недостатка рибозимов скорость расщепления модифицированными бинарными рибозимами также зависела от типа 2'-модификации в положениях 4 и 7: рибозим ЫпИг12, содержащий в этих положениях 2'-аминоуридин, расщеплял РНК значительно быстрее. Платовые значения степени расщепления во всех случаях были высокими (70-90%). При этом бинарные и полноразмерные рибозимы с одинаковыми модификациями в положениях 4 и 7 демонстрировали близкий ход кривых.

Таким образом, необходимым условием устойчивости бинарных рибозимов в биологических средах является защита З'-конца в сочетании с 2'-модификацией всех неконсервативных рибонуклеотидов. Хотя модификация каталитического кора снижает активность рибозимов, она остается достаточно высокой для эффективного расщепления РНК и в сочетании с высокой устойчивостью рибозимов к нуклеолитической деградации дает возможность использовать их для воздействия на РНК в живых системах. Однако необходимо учитывать, что для этого рибозимы должны обладать способностью взаимодействовать с протяженными природными РНК, в которых выбранный участок расщепления обычно структурирован и может быть недоступен для связывания. Поэтому заключи-

юо п

Рнс. 8. Расщепление 1ША19 модифицированными бинарными и полноразмерными рибозимами в условиях недостатка рибозима. Условия реакции: 37 °С;50 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ М§С12, начальная концентрация [32Р]-К1ЧА19 100 нМ, [1Л1г] =20 нМ, [Ш1г] = 100 нМ, [Ш{г] = 20 нМ. Структуры рибозимов приведены на рис. 6.

зо «о 90

Время,мин

120

тельным этапом нашей работы стало исследование каталитической активности бинарных рибозимов в реакции расщепления протяженного структурированного фрагмента РНК.

5. Расщепление 190-звенного фрагмента ]УГОШ мРНК бинарными н полноразмерными рибозимами

Для исследования способности сконструированных в данной работе бинарных и полноразмерных рибозимов расщеплять протяженную РНК в качестве субстрата был использован 5'-концевой 190-звенный фрагмент мРНК гена множественной лекарственной устойчивости тс1г1. Вторичная структура 190-звенного РНК-транскрипта (ГША190), представленная на рис. 9, совпадает со структурой соответствующего участка в составе полноразмерной ГуГОЮ мРНК (Куликов Р. Н. и др. Известия АН. Серия химическая. 2003. Т. 52. С. 235-245). Как видно из рисунка, участок связывания рибозимов в области инициации трансляции (выделен серым цветом) вовлечен в образование вторичной структуры РНК и потенциально не является доступным для связывания. Все исследованные ри-бозимы расщепляли РНК строго специфично по единственной целевой фосфодиэфирной связи С^-Опз. На рис.9 для примера приведен радиоавтограф расщепления РНК в условиях недостатка бинарного и полноразмерного рибозимов Ып11г2 и ПКг1.

ты ЫпР?г2

5°си Время, мин К 0.5 5 15 30 60 120 2401080 К 0.5 5 15 30 60 120 240 1080 1 Т1

иидС "** I ЦЧ" " »тфВ

и „4й сСо ^ _

,, адиии сс иио " ЛСиДАА= "а" "сс* "с. 4

''иииииСА. ,,Ди

"А и

а с

А и

ИОД им

о с

А и А и

ДДА ЭССАДАд

"идДсо0и "■с, и с с

Рис. 9. Расщепление ШЧА190 немодифицированными бинарным и полночи0" размерным рибозимами. Радиоавтограф 8 %-ного денатурирующего ПААГ | В" после разделения продуктов расщепления. Дорожка К - РНК после инкуба-

ос и'исСд ч™ в буфере в течение 18 ч, дорожки Ь и Т1 - ограниченный статистиче-°аесв»». ® скип гидролиз РНК в присутствии 2М имидазола и рибонуклеазы Т1, соот-'"¡¡Ь"1 ветственно Дорожки 0.5,...,1080 - РНК после инкубации с рибозимом в

51 течение указанного времени.

Щ/ Условия реакции: 37 °С; 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ МеС12, 200 мМ

КС1. Начальная концентрация [32Р]-1ША190 0.5 мкМ, [П1Ы] = 0.1 мкМ, " [1Шг2] = 0.5 мкМ, [1Л*г2] = 0.1 мкМ.

В условиях избытка по отношению к РНК и при эквивалентном соотношении рибо-зимхубстрат оба рибозима расщепляли РНК с одинаково высокой эффективностью. В условиях недостатка бинарный рибозим был заметно более эффективным (рис. 9), как и в случае короткого РНК-субстрата. Из кинетических параметров расщепления (табл. 7) можно видеть, что для рибозимов ЫпКг2 и ПКг1 происходит значительное снижение 16

константы к<.а1 по сравнению с расщеплением короткого субстрата (табл. 1). Это связано, скорее всего, с более низкой скоростью конформационного перехода рибозим-

Таблица 7. Кинетические параметры расщепления 1ШЛ190 бинарными и полноразмерными рибозимами в условиях избытка рибозимов. Условия реакции: 37 °С; 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ М^Ь, 200 мМ КС1., начальная концентрация [32Р]-1ША190 0.1 мкМ, концентрация рибозимов 0.25-8 мкМ. Структуры бинарных рибозимов см. рис. 1, 3 и 6.

Затем мы исследовали каталитическую активность модифицированных бинарных и полноразмерных рибозимов в реакции расщепления 190-звенной РНК (рис.10). Модифицированные рибозимы специфично расщепляли РНК, при этом, как и в случае короткого субстрата, рибозим ЫпКг12, содержащий 2'-аминоуридин в положениях 4 и 7, был заметно эффективнее рибозима ЫпК/Ю, содержащего в этих положениях 2'-0-метилуридин.

Время, мин Время, мин

Рис. 10 Расщепление RNA190 модифицированными бинарными и полноразмерными рибозимами. Условия реакции: 37 °С; 50 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 10 мМ MgCl2, 200 мМ KCl. Начальная концентрация [32P]-RNA190 0.5 мкМ.

А. Расщепление РНК в условиях избытка рибозимов: [RRz] = [LRz] = 1 мкМ, [flRz] = 1 мкМ. Б. Расщепление РНК в условиях недостатка рибозимов: [RRz] = 0.5 мкМ, [LRz] = 0.1 мкМ, [flRz] = 0.1 мкМ.

В условиях избытка бинарный рибозим binRzlO был эффективнее своего полноразмерного аналога flRz3, в то время как кривые расщепления РНК рибозимами binRzl2 и flRz4, содержащими 2'-аминоуридин, практически совпадали (рис. 10А). В условиях недостатка рибозима, как можно видеть из кривых (рис. 10Б), оба модифицированных бинарных рибозима были значительно эффективнее полноразмерных аналогов.

Анализ параметров расщепления (табл. 7) показывает, что общая каталитическая эффективность расщепления модифицированными бинарными рибозимами в обоих случаях выше, чем полноразмерными, при этом повышение эффективности обусловлено более

субстратного комплекса в активное состояние.

Рибозим Км, мкМ kcat, мин"1 kcat^M; мин"'-мкМ"'

binRz2 2.6±1.0 0.30±0.06 0.12

binRzlO 2.7±1.1 0.009±0.002 0.003

binRzl2 3.0±0.6 0.19±0.02 0.06

flRzl 1.5±0.4 0.38±0.04 0.25

flRz3 2.9±0.4 0.0029±0.0002 0.001

flRz4 1.7±0.4 0.07±0.01 0.04

высоким значением константы к^,. Мы предполагаем, что причиной этого является большая конформационная гибкость бинарного рибозима, которая способствует «подстраива-нию» рибозима к структурированной РНК-мишени, а также увеличению скорости кон-формационных переходов рибозим-субстратного комплекса в активное состояние. Кроме того, способность одной из цепей бинарного рибозима первой связываться с РНК-субстратом в случае протяженной структурированной РНК может способствовать «разворачиванию» вторичной структуры в участке связывания и тем самым ускорять образование рибозим-субстратного комплекса.

Таким образом, бинарные рибозимы «головка молотка» обладают улучшенными каталитическими свойствами по сравнению с полноразмерными аналогами и способны эффективно расщеплять не только короткий РНК-субстрат, но и протяженный структурированный фрагмент РНК. Возможность избирательной химической модификации бинарных рибозимов для достижения их устойчивости в биологических системах при сохранении высокой каталитической активности позволяет рассматривать эти рибозимные конструкции в качестве основы для создания искусственных ингибиторов экспрессии генов на уровне мРНК.

Выводы

1. Впервые созданы бинарные рибозимы, состоящие из двух частично комплементарных олигорибонуклеотидов, которые после связывания с РНК-субстратом формируют каталитически активную структуру «головка молотка» без петли-коннектора. Проведено исследование расщепления модельного РНК-субстрата бинарными рибозимами в сравнении с их полноразмерным аналогом. Показано, что:

- в условиях избытка бинарные рибозимы расщепляют РНК практически с той же эффективностью, что и полноразмерный аналог;

- в условиях недостатка по отношению к РНК при оптимальном соотношении концентраций двух компонентов бинарные рибозимы расщепляют РНК более эффективно, чем полноразмерный рибозим; при этом максимальная эффективность расщепления достигается при использовании избытка «правой» цепи рибозима по отношению к «левой» цепи.

2. Проведено сравнительное исследование кинетики различных стадий взаимодействия бинарного и полноразмерного рибозимов «головка молотка» с РНК-субстратом и продуктами расщепления. Показано, что:

- разделение рибозима «головка молотка» на два отдельных олигомера не снижает скорость ассоциации рибозим-субстратного комплекса и практически не влияет на стадию расщепления фосфодиэфирной связи;

- скорость диссоциации продуктов расщепления РНК от бинарного рибозима зависит от типа продукта (5'-концевой или З'-концевой), при этом оба продукта расщепления диссоциируют от бинарного рибозима значительно быстрее, чем от полноразмерного;

- повышенная эффективность расщепления РНК бинарным рибозимом обусловлена улучшенным соотношением скоростей ассоциации и диссоциации в каталитическом цикле.

3. Сконструированы устойчивые в биологических средах модифицированные бинарные рибозимы, в которых защищены 2'-гидроксилы всех неконсервативных рибонуклео-тидов и З'-концы обоих компонентов рибозима. Показано, что оптимальным соотношением стабильность/активность обладают 3'-модифицированные рибозимы, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотиды во всех неконсервативных положениях и остатки 2'-аминоуридина в полуконсервативных положениях 4 и 7.

4. Исследовано расщепление бинарными и полноразмерными рибозимами 190-звенного 5'-концевого фрагмента мРНК гена множественной лекарственной устойчивости тс1г1, обладающего выраженной вторичной структурой. Показано, что бинарные рибозимы расщепляют структурированную природную РНК значительно эффективнее, чем их полноразмерные аналоги, как в условиях избытка, так и в условиях недостатка рибозимов.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Kuznetsova М.. Fokina A., Lukin М., Repkova М., Venyaminova A., Vlassov V. Catalytic DNA and RNA for targeting MDR1 mRNA. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003. V.23. № 5-8. P.1521-1523.

2. Kuznetsova M„ Novopashina D., Repkova M., Venyaminova A., Vlassov V. Binary hammerhead ribozymes with high cleavage activity. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. V.24. N 6-7. P. 1037-1042.

3. Vorobieva M.. Gusseva E., Repkova M., Kovalev N., Zenkova M., Venyaminova A., Vlassov V. Modified binary hammerhead ribozymes with high catalytic activity. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2005. V.24. N 5-7. P. 1105-1109.

4. Vorobieva M.. Zenkova M., Venyaminova A., Vlassov V. Binary hammerhead ribozymes with improved catalytic activity. // Oligonucleotides. 2006. V.16. N 3. P.239-252.

5. Воробьева M.A.. Ковалев H.A., Зенкова M.A., Веньяминова А.Г., Власов В.В. Бинарные рибозимы «головка молотка». // Информ. вестник ВОГиС. 2006. Т. 10. № 2. С.321-330.

6. Воробьева М.А., Зенкова М.А., Веньяминова А.Г., Власов В.В. Бинарные рибозимы «головка молотка» - новые инструменты для расщепления мРНК гена mdrl. //Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. 2007. Т. 5. Вып. 1. С.111-117.

Подписано к печати «9» января 2007 г. Формат бумаги 60x84, 1/16. Тираж 120 экз. Заказ № 1987 Отпечатано «Документ-Сервис», 630090, Новосибирск, ул. Институтская 4/1, тел 335-66-00

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Воробьева, Мария Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. КОНСТРУИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА РИБОЗИМОВ «ГОЛОВКА МОЛОТКА» (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Строение и свойства рибозима «головка молотка»

1.1.1. Разделение рибозима «головка молотка» на субстратную и каталитическую части

1.1.2. Субстратная специфичность рибозима

1.1.3. Пространственная структура рибозима «головка молотка»

1.1.4. Роль ионов двухвалентных металлов в расщеплении РНК рибозимом «головка молотка»

1.1.5. Кинетическая схема расщепления РНК рибозимом «головка молотка»

1.2. Создание искусственных рибозимов «головка молотка» для направленного расщепления РНК

1.2.1. Минимизация длины рибозима «головка молотка»

1.2.1.1. Минизимы

1.2.1.2. Димерные минизимы

1.2.1.3. Рибозимы, содержащие ненуклеотидные вставки

1.2.1.4. Двухкомпонентные рибозимы

1.2.2. Повышение устойчивости рибозимов в биологических средах

1.2.3. Регуляция каталитической активности рибозимов 32 1.2.3.1. Использование молекул-эффекторов для регуляции каталитической активности рибозима «головка молотка»

Олигонуклеотиды-эффекторы, комплементарные РНК-субстрату

Аллостерические эффекторы 35 Олигонуклеотиды-эффекторы, способные связываться с НК-энзимом и с субстратом одновременно 38 1.2.3.2. Подходы к увеличению эффективности расщепления структурированных природных РНК рибозимами

1.3. Применение рибозимов «головка молотка»

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и приборы

2.2. Основные методы работы

2.3. Методики эксперимента

2.3.1. Выделение и анализ олигонуклеотидов

2.3.2. Введение радиоактивной метки в синтетические РНК-субстраты

2.3.3. Введение радиоактивной метки в 190-звенный фрагмент

МБЮ мРНК (ША190)

2.3.4. Гидролиз 1ША190 в имидазольном буфере и с помощью РНКазы Т

2.3.5. Расщепление РНК бинарными и полноразмерными рибозимами 56 Расщепление синтетического фрагмента МОШ мРНК (1№А19) 56 Определение кинетических параметров (Км и ксаО расщепления 1№А19 рибозимами 56 Расщепление 190-звенного фрагмента МБЮ мРНК рибозимами 57 Определение кинетических параметров (Км и к^О расщепления 1МЧА190 рибозимами

2.3.6. Исследование сборки комплекса бинарный рибозим-РНК методом нативного гель-электрофореза

2.3.7. Исследование кинетических циклов бинарного и полноразмерного рибозимов

Определение констант скорости ассоциации рибозим-субстратных комплексов для полноразмерного рибозима, бинарного рибозима и компонентов бинарного рибозима

Определение констант скорости диссоциации рибозим-субстратных комплексов

Определение констант скорости диссоциации продуктов расщепления РНК от бинарного и полноразмерного рибозимов

2.3.8. Исследование устойчивости компонентов бинарного рибозима в культуральной среде

3. СОЗДАНИЕ БИНАРНЫХ РИБОЗИМНЫХ КОНСТРУКЦИЙ НА ОСНОВЕ

МОДЕЛИ «ГОЛОВКА МОЛОТКА» И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ)

3.1. Немодифицированный бинарный рибозим: конструирование и каталитическая активность

3.2. Бинарные рибозимы с модифицированным стеблем II

3.3. Сравнение кинетических схем расщепления РНК бинарным и полноразмерным рибозимами

3.3.1. Исследование «сборки» комплексов рибозим-РНК и их диссоциации

3.3.2. Исследование скорости диссоциации продуктов расщепления РНК от рибозима

3.4. Модифицированные бинарные рибозимы, устойчивые в биологических средах

3.4.1. Устойчивость бинарных рибозимов к действию нуклеаз сыворотки

3.4.2. Каталитическая активность модифицированных бинарных рибозимов

3.5. Расщепление 190-звенного фрагмента МОШ мРНК бинарными и полноразмерными рибозимами

ВЫВОДЫ

Введение диссертация по химии, на тему "Бинарные рибозимы "головка молотка""

Селективное ингибирование экспрессии определенных генов на уровне их мРНК является одной из актуальных задач молекулярной биологии, биотехнологии и фундаментальной медицины. В последние десятилетия интенсивно ведется поиск агентов, способных специфично взаимодействовать с определенными последовательностями мРНК, и их апробация в качестве инструментов функциональной геномики и диагностики, а также терапевтических средств, подавляющих экспрессию генов, ответственных за развитие различных заболеваний. В основе конструирования таких агентов - антисенс-олигонуклеотидов, малых интерферирующих РЖ и каталитических нуклеиновых кислот (НК-энзимов) - лежит использование последовательностей НК, комплементарных определенным участкам выбранной мРНК-мишени [1-3].

Одним из перспективных направлений в этой области является конструирование НК-энзимов - олигорибо- и олигодезоксирибонуклеотидов с характерной вторичной структурой, способных высокоспецифично расщеплять РНК [4,5]. Среди НК-энзимов особый интерес вызывают рибозимы типа «головка молотка». Эти рибозимы обладают высокой каталитической активностью при сравнительно небольшой длине олигонуклеотидной цепи и широкой субстратной специфичностью, благодаря чему в любой мРНК можно найти последовательности - мишени для рибозимного расщепления. Подробно исследованы пространственная структура рибозима «головка молотка», механизм расщепления фосфодиэфирной связи в РНК и каталитический цикл расщепления РНК этим рибозимом, что позволяет конструировать новые варианты рибозимов на основе модели «головка молотка» с использованием этих данных. К настоящему времени опубликовано очень большое число работ, посвященных конструированию рибозимов «головка молотка» как искусственных ингибиторов экспрессии генов на уровне мРНК; показано, что они способны эффективно подавлять экспрессию вирусных генов, онкогенов, факторов роста и других терапевтически важных генов (см. обзоры [2,5-7]). Тем не менее, до настоящего времени не прекращается поиск вариантов рибозимов «головка молотка», обладающих улучшенными каталитическими свойствами в сочетании с устойчивостью к действию нуклеаз и способностью ингибировать экспрессию генов не только на уровне культур клеток, но и в живых организмах.

В ходе исследования решались следующие задачи:

В результате проделанной работы были созданы новые бинарные рибозимы «головка молотка», обладающие высокой каталитической активностью и устойчивостью в биологических средах. Уникальной особенностью бинарных рибозимов является способность одной из цепей рибозима первой связываться с РНК, ускоряя тем самым связывание второй цепи. Благодаря улучшенному соотношению скоростей ассоциации и диссоциации в каталитическом цикле бинарные рибозимы расщепляют протяженную структурированную РНК значительно эффективнее, чем их полноразмерные аналоги. Сочетание этих свойств позволяет рассматривать бинарные рибозимы «головка молотка» как перспективные высокоспецифичные ингибиторы экспрессии генов на уровне мРНК.

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

выводы

• в условиях избытка бинарные рибозимы расщепляют РНК практически с той же эффективностью, что и полноразмерный аналог;

• в условиях недостатка по отношению к РНК при оптимальном соотношении концентраций двух компонентов бинарные рибозимы расщепляют РНК более эффективно, чем полноразмерный рибозим; при этом максимальная эффективность расщепления достигается при использовании избытка «правой» цепи рибозима по отношению к «левой» цепи.

• разделение рибозима «головка молотка» на два отдельных олигомера не снижает скорость ассоциации рибозим-субстратного комплекса и практически не влияет на стадию расщепления фосфодиэфирной связи;

• скорость диссоциации продуктов расщепления РНК от бинарного рибозима зависит от типа продукта (5'-концевой или З'-концевой), при этом оба продукта расщепления диссоциируют от бинарного рибозима значительно быстрее, чем от полноразмерного;

• повышенная эффективность расщепления РНК бинарным рибозимом обусловлена улучшенным соотношением скоростей ассоциации и диссоциации в каталитическом цикле.

3. Сконструированы устойчивые в биологических средах модифицированные бинарные рибозимы, в которых защищены 2'-гидроксилы всех неконсервативных рибонуклеотидов и З'-концы обоих компонентов рибозима. Показано, что оптимальным соотношением стабильность/активность обладают З'-модифицированные рибозимы, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотиды во всех неконсервативных положениях и остатки 2'-аминоуридина в полуконсервативных положениях 4 и 7.

4. Исследовано расщепление бинарными и полноразмерными рибозимами 190-звенного 5-концевого фрагмента мРНК гена множественной лекарственной устойчивости т<Лг1, обладающего выраженной вторичной структурой. Показано, что бинарные рибозимы расщепляют структурированную природную РНК значительно эффективнее, чем их полноразмерные аналоги, как в условиях избытка, так и в условиях недостатка рибозимов.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Воробьева, Мария Александровна, Новосибирск

1. Kurreck J. Antisense technologies. 1.provement through novel chemical modifications. // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. № 8. P. 1628-1644.

2. Rayburn E., Wang H., He J., Zhang R. RNA silencing technologies in drug discovery and target validation. // Lett. Drug Design Discov. 2005. V. 2. № 1. P. 1-18.

3. Scherer L., Rossi J. Approaches for the sequence-specific knockdown of mRNA.//Nat. Biotechnol. 2003. V. 21.№ 12. P. 1457-1465.

4. Peracchi A. Prospects for antiviral ribozymes and deoxyribozymes. // Rev. Med. Virol. 2004. V. 14. № 1. P. 47-64.

5. Schubert S., Kurreck J. Ribozyme- and deoxyribozyme-strategies for medical applications. // Curr. Drug Targets. 2004. V. 5. № 6. P. 667-681.

6. Citti L., Rainaldi G. Synthetic hammerhead ribozymes as therapeutic tools to control disease genes. // Curr. Gene Ther. 2005. V. 5. № 1. P. 11-24.

7. Grassi G., Dawson P., Guarneri G., Kandolf R., Grassi M. Therapeutic potential of hammerhead ribozymes in the treatment of hyper-proliferative diseases. // Curr. Pharm. Biotechnol. 2004. V. 5. № 4. P. 369-386.

8. Cech T. R., Zaug A. J., Grabowski P. J. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor of Tetrahymena: involvement of a guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence. // Cell. 1981. V. 27. № 3. Pt 2. P. 487-496.

9. Guerrier-Takada C., Gardiner K., Marsh T., Pace N., Altman S. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. // Cell. 1983. V. 35. № 3 Pt 2. P. 849-857.

10. Doherty E. A., Doudna J. A. Ribozyme structures and mechanisms. // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. № 1. P. 597-615.

11. Doudna J. A., Cech T. R. The chemical repertoire of natural ribozymes. // Nature. 2002. V. 418. № 6894. P. 222-228.

12. Kuimelis R. G., McLaughlin L. W. Mechanisms of ribozyme-mediated RNA cleavage. // Chem. Rev. 1998. V. 98. № 3. P. 1027-1044.

13. Salehi-Ashtiani K., Szostak J. W. In vitro evolution suggests multiple origins for the hammerhead ribozyme. // Nature. 2001. V. 414. № 6859. P. 82-84.

14. Conaty J., Hendry P., Lockett T. J. Selected classes of minimised hammerhead ribozymes have very high cleavage rates at low Mg2+ concentration. // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. № 11. P. 2400-2407.

15. Uhlenbeck 0. C. A small catalytic oligoribonucleotide. // Nature. 1987. V. 328. №6131. P. 596-600.

16. Haseloff J., Gerlach W. L. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activities. //Nature. 1988. V. 334. № 6183. P. 585-591.

17. Hertel K. J., Pardi A., Uhlenbeck 0. C., Koizumi M., Ohtsuka E., Uesugi S., Cedergren R., Eckstein F., Gerlach W. L., Hodgson R. Numbering system for the hammerhead. // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. № 12. P. 3252.

18. Martick M., Scott W. G. Tertiary contacts distant from the active site prime a ribozyme for catalysis. // Cell. 2006. V. 126. № 2. P. 309-320.

19. Penedo J. C., Wilson T. J., Jayasena S. D., Khvorova A., Lilley D. M. Folding of the natural hammerhead ribozyme is enhanced by interaction of auxiliary elements. // RNA. 2004. V. 10. № 5. P. 880-888.

20. De la Pena M., Gago S., Flores R. Peripheral regions of natural hammerhead ribozymes greatly increase their self-cleavage activity. // EMBO J. 2003. V. 22. № 20. P. 5561-5570.

21. Canny M. D., Jucker F. M., Kellogg E., Khvorova A., Jayasena S. D., Pardi A. Fast cleavage kinetics of a natural hammerhead ribozyme. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. №35. P. 10848-10849.

22. Burke D. H., Greathouse S. T. Tertiary stabilizing elements form a natural type III cis-cleaving hammerhead ribozyme direct trans-cleavage at physiological divalent magnesium. // BMC Biochemistry. 2005. V.6.14.

23. Weinberg M. S., Rossi J. J. Comparative single-turnover kinetic analyses of trans-cleaving hammerhead ribozymes with naturally derived non-conserved sequence motifs. // FEBS Letters. 2005. V. 579. № 7. P. 1619-1624.

24. Perriman R., Delves A., Gerlach W. L. Extended target-site specificity for a hammerhead ribozyme. // Gene. 1992. V. 113. № 2. P. 157-163.

25. RufFner D. E., Stormo G. D., Uhlenbeck O. C. Sequence requirements of the hammerhead RNA self-cleavage reaction. // Biochemistry. 1990. V. 29. № 47. P. 10695-10702.

26. Shimayama T., Nishikawa S., Taira K. Generality of the NUX rule: kinetic analysis of the results of systematic mutations in the trinucleotide at the cleavage site of hammerhead ribozymes. // Biochemistry. 1995. V. 34. № 11. P. 3649-3654.

27. Zoumadakis M., Tabler M. Comparative analysis of cleavage rates after systematic permutation of the NUX consensus target motif for hammerhead ribozymes. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. № 7. P. 1192-1196.

28. Symons R. H. Small catalytic RNAs. // Annu. Rev. Biochem. 1992. V. 61. P. 641-671.

29. Kore A. R., Vaish N. K., Kutzke U., Eckstein F. Sequence specificity of the hammerhead ribozyme revisited; the NHH rule. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. № 18. P.4116-4120.

30. Hammann C., Lilley D. M. Folding and activity of the hammerhead ribozyme. // ChemBioChem. 2002. V. 3. № 8. P. 690-700.

31. Tanner N. K. Ribozymes: the characteristics and properties of catalytic RNAs. // FEMS Microbiol. Rev. 1999. V. 23. № 3. P. 257-275.

32. Scott W. G. Biophysical and biochemical investigations of RNA catalysis in the hammerhead ribozyme. // Quart. Rev. Biophys. 1999. V. 32. № 3. P. 241-284.

33. Blount K. F., Uhlenbeck O. C. Internal equilibrium of the hammerhead ribozyme is altered by the length of certain covalent cross-links. // Biochemistry. 2002. V. 41. №21. P. 6834-6841.

34. Bravo C., Woisard A., Fourrey J. L., Laugaa P., Favre A. A Y form of hammerhead ribozyme trapped by photo-cross-links retains full cleavage activity. // Biochimie. 1999. V. 81. № 3. P. 201-212.

35. Murray J. B., Szoke H., Szoke A., Scott W. G. Capture and visualization of a catalytic RNA enzyme-product complex using crystal lattice trapping and X-ray holographic reconstruction. // Mol. Cell. 2000. V. 5. № 2. P. 279-287.

36. Pley H. W., Flaherty K. M., McKay D. B. Three-dimensional structure of a hammerhead ribozyme. // Nature. 1994. V. 372. № 6501. P. 68-74.

37. Scott W. G., Finch J. T., Klug A. The crystal structure of an all-RNA hammerhead ribozyme: a proposed mechanism for RNA catalytic cleavage. // Cell. 1995. V. 81. №7. P. 991-1002.

38. Sigurdsson S. T., Tuschl T., Eckstein F. Probing RNA tertiary structure: interhelical crosslinking of the hammerhead ribozyme. // RNA. 1995. V. 1. № 6. P. 575-583.

39. Wang L., Ruffner D. E. An ultraviolet crosslink in the hammerhead ribozyme dependent on 2- thiocytidine or 4-thiouridine substitution. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. №21. P. 4355-4361.

40. Takagi Y., Warashina M., Stec W. J., Yoshinari K., Taira K. SURVEY AND SUMMARY: Recent advances in the elucidation of the mechanisms of action of ribozymes. //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. № 9. P. 1815-1834.

41. Bassi G. S., Mollegaard N. E., Murchie A. I., von Kitzing E., Lilley D. M. Ionic interactions and the global conformations of the hammerhead ribozyme. // Nat. Struct. Biol. 1995. V. 2. № 1. P. 45-55.

42. Hammann C., Cooper A., Lilley D. M. Thermodynamics of ion-induced RNA folding in the hammerhead ribozyme: an isothermal titration calorimetric study. //Biochemistry. 2001. V. 40. № 5. P. 1423-1429.

43. Torres R. A., Bruce T. C. The mechanism of phosphodiester hydrolysis: near in-line attack conformations in the hammerhead ribozyme. // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. №5. P. 781-791.

44. Markley J. C., Godde F., Sigurdsson S. T. Identification and characterization of a divalent metal ion-dependent cleavage site in the hammerhead ribozyme. // Biochemistry. 2001. V. 40. № 46. P. 13849-13856.

45. Leclerc F., Karplus M. Two-metal-ion mechanism for hammerhead-ribozyme catalysis. //J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110. № 7. P. 3395-3409.

46. Curtis E. A., Bartel D. P. The hammerhead cleavage reaction in monovalent cations. // RNA. 2001. V. 7. № 4. P. 546-552.

47. Murray J. B., Seyhan A. A., Walter N. G., Burke J. M., Scott W. G. The hammerhead, hairpin and VS ribozymes are catalytically proficient in monovalent cations alone. // Chem. Biol. 1998. V. 5. № 10. P. 587-595.