Развитие химических методов изучения структуры и функции сложных рибонуклеопротеидных систем тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГ О ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ДОНЦОВА Ольга Анатольевна

РАЗВИТИЕ ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ СЛОЖНЫХ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИДНЫХ СИСТЕМ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ

доктор химических наук, академик РАН, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

А.А. Богданов

доктор химических наук, академик РАН, профессор

А.А. Краевский

доктор химических наук, профессор

доктор биологических наук

В.И. Цетлип М.Б. Гарбер

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биоорганической химии СО РАН.

Защита состоится 22 апреля 1997 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: Москва 119899, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Диссертация в виде научного доклада разослана марта 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических паук

И.Г.Смирнова

I. Общая характеристика работы. 1.1. Актуальность проблемы.

Биосинтез белка на рибосомах (трансляция) является одним из основных этапов реализации генетической информации в клетке. Понимание молекулярного механизма процесса трансляции требует установления с высоким разрешением пространственной структуры рибосомы, а также взаиморасположения лигандов и компонентов рибосомы в процессе трансляции. Рибосома прсдставляе! собой сложный рибонуклеонрогеидный комплекс, состоящий из двух субчастиц: малой и большой. Малая (30S) субчастица рибосом Escherichia coli содержит протяженную молекулу 16S рРНК и 21 белок. В состав большой субчастицы (50S) входят две молекулы рРНК: 5S и 23S рРНК, сильно отличающиеся по длине, а также 34 белка. В процессе трансляции с рибосомой связываются лиганды: молекула mPÍIK, две молекулы тРНК и несколько белковых факторов, способствующих осуществлению различных этапов процесса биосинтеза белка. В настоящее время установлено, что рРНК играют ключевую роль в процессе функционирования рибосомы. Таким образом, изучение структуры рРНК в составе рибосомы, ее контактов как с компонентами рибосомы, так и с лигандами является фундаментальной проблемой, без решения которой невозможно понимание механизма работы белок-синтезирукмцей системы клетки.

Хотя структура и функции рибосомы изучаются более 30 лет различными методами, к моменту начала выполнения данной работы количество достоверных данных о контактах mPÍIK с рибосомной РНК и белками, пространственной организации элементов декодирующего центра малой субчастицы было весьма офаннчено, еще меньше информации было доступно о взаиморасположении различных элементов структуры рРНК большой субчастицы рибосом.

Следует отметить, что применение метода рентгено-структурного анализа для изучения структуры рибосом весьма затруднительно. Хотя кристаллы рибосом получены достаточно давно, а в настоящее время разработаны и методы введения тяжелых атомов в определенные точки рибосомы, тем не менее определение структуры рибосом этом методом с высоким разрешением остается делом далекого будущего.

В последнее время большие успехи были достигнуты в изучении гонкой структуры рибосом методом электронной микроскопии высокого разрешения, который позволяет выявить в ее структуре элементы с разрешением около 20А. Это дает возможность наблюдать в рибосомных

субчастицах отдельные спирали РНК. Однако электронно-микроскопические данные не позволяют соотнести детали получаемых на их основе моделей с определенными элементами вторичной структуры рРНК, а также определить положение неструктурированных районов рРНК и участков их взаимодействия с мРНК.

В связи с этим для понимания пространственной организации рРНК в составе рибосомы и механизма ее функционирования необходимы данные о взаиморасположении отдельных структурных элементов рРНК, о контактах мРНК с рРНК и рибосомными белками. Одним из немногих подходов к решению данной задачи является метод химической модификации. Поэтому разработка химических подходов для изучения тонкой структуры сложных рибонуклеопротеидных объектов, таких как рибосома, является актуальной задачей.

1.2. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка методов химической модификации, применимых для изучения структуры и функции сложных рибонуклеопротеидных объектов, состоящих из высокомолекулярных РНК и большого набора белков, и использование их для изучения структуры функционирующей рибосомы. При этом ставилась задача разработать комбинированный подход, который позволил бы получать информацию как о контактах гетероциклических оснований нуклеотидов РНК с компонентами рибосомы, так и о вовлеченности их сахарофосфатных остатков во внутририбосомные взаимодействия. Таким образом планировалось решить следующие задачи.

1. Разработать метод фотоаффинной химической модификации рибосом аналогами РНК (мРНК, 5Б рРНК), содержащими фотоаффинные производные нуклеотидов, статистически распределенные по всей длине молекулы. Разработать методы анализа, позволяющие выявить положение сшивки в длинных молекулах рРНК с нуклеотидным разрешением.

2. Найти условия применения тиофосфатного метода изучения РНК-белковых взаимодействий к исследованию контактов фосфатных групп молекул РНК в сложных рибонуклеопротеидных комплексах.

3. Изучить строение декодирующего центра рибосомы и особенности взаимодействия мРНК с компонентами рибосомы на разных этапах процесса трансляции с использованием комбинации тиофосфатного метода и метода фотоаффинной химической модификации.

4. Используя комбинацию методов фотоаффинного химического сшивания и тиофосфатного, изучить внутририбосомные взаимодействия в функционирующей рибосоме на примере 5S рРНК-белкового комплекса.

5. Разработать метод введения модифицированных иуклеотидных остатков в определенные, заранее заданные положения длинных молекул рРНК в составе рибосомы с целью применения метода фотоаффинной химической модификации для изучения пространственной структуры длинных молекул рРНК и динамики ее изменения r процессе функционирования рибосомы.

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы.

В данной работе получило развитие использование химических подходов для изучения структурно-функциональных отношений в исследовании сложных рибонуклеопротеидных систем, таких как рибосома Escherichia colt.

Разработан новый вариант метода фотоаффинного химического сшивания, применимый для исследования сложных рибонуклеопротеидных систем. В основу метода положено использование фотоаффинных аналогов нуклеотидов, включение которых во внутренние участки цепи РНК практически не искажает ее конформацию и мало влияет на биологическую активность исследуемой молекулы. Фотоаффинные аналоги нуклеотидов образуют химические сшивки с расположенными в непосредственной близости реакционно способными [руинами белков и нуклеиновых кислот под действием облучения УФ-светом с длиной волны 320-340 им, т.е. в условиях, когда биологическая активность рибосом полностью сохраняется Такой подход позволяет вводить фотометки в реальные биологические молекулы и изучать их контакты в функционирующих биологических системах. Данный метод был применен для изучения контактов мРНК и 5S рРНК в прокариотической рибосоме. Применение набора различных фогоаффишшх аналогов нуклеотидов необходимо для более полного выявления возможных взаимодействий исследуемой молекулы PIIK с компонентами рибосомы. Рибосомные РНК играют важную роль не только в формировании структуры, но и в функционировании рибосомы, поэтому установление РНК-РНК контактов с нуклеотидным разрешением является чрезвычайно важным для понимания механизма работы рибосомы, В процессе выполнения данной работы был разработан метод анализа, позволяющий точно определить пуклеотидные остатки как длинтшх молекул рРНК, так и мРНК (5S рРНК), участвующие в образовании сшивки. В настоящее время этот подход активно используется для исследования

различных сложных молекул РНК и рибонуклсопротевдных комплексов (например, сплайсосом).

Применение метода фотоаффинной химической модификации позволило выявить нуклеотидные остатки рРНК и рибосомные белки, формирующие декодирующий центр рибосомы, изучить перераспределение контактов мРНК с рибосомой на разных этапах трансляции.

Применение тиофосфатного метода обнаружения фосфатных остатков мРНК, вовлеченных в прочные взаимодействия с компонентами рибосомы, позволило сделать вывод, что только несколько фосфатных групп мРНК, расположенных перед кодовом в Р-участке рибосомь^могут быть вовлечены в сильные взаимодействия, тогда как в декодирующей области мРНК фосфатные остатки не защищаются компонентами рибосомы.

Данные, полученные нами с помощью метода фотоаффинной химической модификации вместе с данными электронной микроскопии высокого разрешения, легли в основу модели пространственной структуры 16S рРНК в составе малой субчастицы рибосом (R.Brimacombe et al, J. Mol. Biol., послано в печать) и позволили предложить модель взаиморасположения мРНК и компонентов 16S рРНК в декодирующем центре рибосомы.

Изучение топографии и пространственной организации 5S рРНК в рибосоме описанными выше методами позволило выявить прямые контакты этой рРНК с нуклеотидами 23 S рРНК, расположенными в непосредственной близости от двух важнейших функциональных центров рибосомы, определить фосфатные остатки вовлеченные в образование комплексов со специфическими рибосомными белками как в изолированном комплексе, так и в составе рибосомы, фосфатные остатки вовлеченные в возможные взаимодействия с малой субчастицей рибосом, фосфатные группы, расположенные в изломах пространственной структуры молекулы 5S рРНК. Важность для функционирования рибосомы нуклеотида U89 в 5S рРНК, участвующего в образовании сшивки с функциональными доменами большой субчастицы, была подтверждена методом сайт-напрвленного мутагенеза. Все эти данные позволили нам предложить модель пространственной структуры молекулы 5S рРНК и ее расположения в большой субчастице рибосом, а также высказать предположения о возможной функциональной роли молекулы 5S рРНК в процессе трансляции.

Личный вклад автора. В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии во всех этапах

исследования - от постановки задачи, проведения экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

1.4. Апробация работы.

Материалы работы доложены и обсуждены на Международной конференции "Protein biosynthesis" (Пущино, Россия, 1991), Международной конференции "Modem enzymoiogy: problems and trends" (Санкт-Петербург, Россия, 1992), Международном симпозиуме "Translational apparatus" (Берлин, Германия, 1992), 10-ом Советско-немецком симпозиуме (Суздаль, Россия, 1993), Международной конференции "Biocatalysis: fundamentals and applications" (Москва, Россия, 1993), Международной конференции "Translational control" (Колд Спринт Харбор, США, 1994), 16-ом международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Дели, Индия, 1994), 3-ем Международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, Россия, 1995), Международном симпозиуме "Frontiers in translation" (Виктория, Канада, 1995), Российско-французском симпозиуме по регуляции экспрессии генов (Новосибирск, Россия, 1995), Международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии" (МГУ, Москва, 1995), Первой ежегодной конференции РНК-общества "RNA'96" (Медисоп, США, 1996), а также на семинарах в МГУ и Макс-Планк-Институте Молекулярной генетики (Берлин, Германия).

Главные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в обобщенном виде в настоящем докладе. Работа выполнена в 1987-1996 гг.

Тезисы защи гы.

- создание экспериментальных подходов к изучению структуры и функции сложных рибопуклеопротеидных систем на основе химической модификации РНК;

- изучение топографии мРНК на рибосоме методами фоюаффинного химического сшивания и тиофосфатным на разных этапах трансляции. Построение молекулярной модели структуры мРНК-связывающего центра

рибосомы:

- изучение структуры и топографии 5S рРНК п рибосоме, создание модели структурной организации 5S pPIIK в рибосоме;

- разработка подходов для введения модификаций в заранее заданные участки длинных молекул рибосомных РНК;

- совокупность идей, теоретических подходов, экспериментальных методов и результатов, которую можно сформулировать как новое научное направление

"Химические подходы к изучению структуры и функции сложных рибонуклеопротеидных систем".

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 55 страницах и включает общую характеристику работы, экспериментальную часть, описание основных результатов и выводы. Работа содержит 23 рисунка.

2. Материалы, использованпыс в работе.

Рибосомы, рРНК и рибосомные белки были выделены из клеток Escherichia coli MRE 600 традиционными методами. Олиго-дезоксирибонуклеотиды, использованные в данной работе, были в основном синтезированы В.А. Тишковым или Т.С. Орецкой на химическом факультете МГУ. Фаг М13тр18, содержащий ген 5S рРНК, использованный для дальнейшего клонирования этого гена под контроль Т7 промотора, был любезно предоставлен Т. Дорингом (Макс-Планк-Институт Молекулярной генетики). 6-тиогуанозшлрифосфат и 5-метиленаминоуридинтрифосфат были синтезированы В. Власовым (Институт Биоорганической химии СО РАН, Новосибирск), N-оксисукцинимидный эфир трифторметилдиазирин-бензойной кислоты был синтезирован Д. Бочкаревым (Институт белка РАН, Пущино). РНКаза Н была выделена в лаборатории Р.Бримакомба, а Т7-РНК-полимераза - в лаборатории К.Ниерхауса (Макс-Планк-Институт Молекулярной Генетики, Берлин, Германия). Остальные реагенты, ферменты и соли использовали в виде коммерческих препаратов.

3. Метод фотоаффшшого химического сшивания и его применение для изучения топографии мРНК на рибосоме.

Начало исследования рибосом методом аффинной модификации было положено Е.С.Бочкаревой, В.Г.Будкером, и А.С. Гиршовичем в лаборатории Д.Г.Кнорре в начале 1970-х годов. К моменту начала выполнения данной работы имелись весьма ограниченные сведения о контактах мРНК с рибосомой. Методом иммуно-электронной микроскопии (Evstafieva et al. EMBO J. 1983, v.2, pp.799-804) было показано, что 3',5'-копцы polyU в рибосоме сближены между собой, и высказано предположение, что мРНК образует петлю на "шее" малой субчастицы рибосом. Были предприняты также попытки установления контактов мРНК с компонентами рибосомы с помощью химической модификации рибосом аналогами мРНК. Однако, в большинстве случаев использовались либо производные коротких

синтетических олигонуклеотадов (Гимаутдинова и др. Мол. Биол. 1982, т. 16, с.752-761; 1984, т. 18, с. 907-917), либо длинные полишстронные мРНК (Вгоис1е е! а1., Eur.J. ВшсЬет. 1983, v. ] 32, рр. 139-145), которые неоднозначно связывшотся с рибосомой. Кроме того, для образования сшивок в ряде сл}-чаев использовались реагенты, требующие длительного времени инкубации для протекания реакции, в других случаях исследуемые комплексы облучали жестким ультрафиолетовым снегом, воздействие которого приводит к нарушению структуры рибосомы и потере се активности. Вследствие этог о имеющиеся в литературе данные о контактах мРНК с рибосомными белками были достаточно противоречивы. Необходимо подчеркнуть также, что данные о контактах мРНК с рнбосодшыдш РНК практически отсутствовали.

В ходе выполнения нашей работы были разработаны аналоги мРНК, которые специфически связываются с рибосомой и активны в формировании рибосомных комплексов, соответствующих разным стадиям процесса трансляции. В дашгом исследовании были использованы фотоаффгагные реагенты, представляющие собой аналоги нуклеотидов, которые могут быть введены в цепь мРНК без изменения ее биологической активности и способны образовывать сшивки как с рибосомными РНК, так и с рибосомными белками под действием облучения мягким УФ-светом в течение небольших временных промежутков, в условиях, когда не нарушается структура функциональных рибосомных комплексов.

3.1. Введение фотоаффинных реагентов в молекулу РНК.

Для изучения окружения функциональной молекулы РНК в рибосоме методом фотоаффшшого химического сшивания необходимо ввести в нее фотоаффинные аналоги нуклеотидов. Это возможно осуществить путем транскрипции РНК с соответствующей ДНК матрицы с помощью Т7-РНК полимеразы, заменяя один из рибонуклеозидгрифосфатов его фотоаффинным аналогом. Таким образом,при выборе реагента необходимо найти трифосфаты таких фотоаффинных аналогов нуклеотидов, которые являются эффективными субстратами Т7-РНК полимеразы. Кроме того при включении в цепь РНК данный аналог не должен сильно искажать структуру молекулы РНК и заметно влиять на ее биологическую активность в процессе трансляции. Используемые фотоаффинные реагенты должны образовывать сшивки с близлежащими компонентами рибосомы при облучении мягким УФ-светом (с длиной волны больше 300 им), т.е. в условиях, ненарутпающих целостность исследуемого рибонуклеопротеидного комплекса.

В ходе данной работы для изучения топографии мРНК на рибосоме были использованы два типа реагентов, удовлетворяющих перечисленным

выше требованиям. Это реагенты, образующие сшивки так называемой "нулевой дайны" - 4-тиоуридин (яи), 6-тиогуанин (бО), 5-иодоуридин (¡11) (рис.1); и реагент, в котором фотоаффинная группа расположена на расстоянии около юА от атома С5 в остатке уридина (ТОВ-Ц) (рис.1).

10 а

0 О

1 IV ¿рз

Рисунок 1. Фотоаффинные реагенты, использованные в работе. Я- остаток рибозы.

I - 4-тиоуридин (бЦ).

II - 6-тиогуанин ($6).

III - 5-иодоуридин (¡Ц).

IV - диазириновое производное 5-метиленаминоуридина (ТОВ-Ц).

Реагенты "нулевой длины" способны образовывать сшивку с расположенными в непосредственной близости (3-4А) реакционно способными группами как РНК, так и белков. За редким исключением, детальный механизм фотохимических реакций не известен, однако он отличается для разных реагентов "нулевой длины". В разных реагентах фотоаффинные группы по разному ориентированы в пространстве. Именно

поэтому для более полного выявления контактов молекулы РНК с близлежащими компонентами рибонуклеопротеидного комплекса необходимо использовать набор реагентов. Применение реагентов "нулевой длины" ограничено тем, что они способны образовывать химические снпгвки к основном из одноценочечных районов РНК, а само образование сшивки достаточно жестко детерминировано взаимной пространственной ориентацией функциональных групп компонентов рибонуклео1гротеидного комплекса (РНП) и фотоаффинной группы реагента.

Для выяснения пространственного окружения того или иного нуклеотида исследуемой молекулы РНК в рибосоме необходимо использовать реагенты, в которых фотоаффинная группа обладает некоторой подвижностью, меньшей специфичностью и, таким образом, может атаковать практически любые химические связи в пределах длины реагента. Таким реагентом и является ТВВ~и. Кроме того, в отличие от бИ и яО, практически не способных образовывать химические сшивки, если они расположены в двойной спирали РНК, в ТБВ-и фотоаффинная группа расположена таким образом, что она выходит из бороздки двойной спирали и может реагировать со сближенными компонентами рибоиуклеопротеидного комплекса.

Все перечисленные выше реагенты способны образовывать ковалептиые сшивки с компонентами РНК при облучении УФ-светом с длиной волны больше 300 нм. Проведенные контрольные эксперименты по облучению рибосомных комплексов не содержащих фотоаффиных реагентов показали, что в этих условиях не наблюдается сшивания РНК с компонентами рибосомы, а рибосомы полностью сохраняют свою биологическую активность.

Трифосфаты перечисленных выше реагентов являются субстратами РНК-полимеразы фага Т7, однако они включаются в цепь РНК с разной эффективностью. Производные уридина оказались лучшими субстратами 'Г7-РНК-полимеразы, чем тиогуанозшприфосфат. Поскольку количество модифицированных оснований не должно превышать 1-2 остатка на молекулу (для сохранения биологической активности исследуемой молекулы и удобства дальнейшего анализа сшивок), в каждом случае были найдены опггамальные соотношения нуклеозидтрифосфата и его модифицированного аналога в транскрипционной смеси. Соотношение модифицированных и немодифицированных остатков в синтезированной молекуле РНК контролировалось измерением соотношения З'-нуклеозндмонофосфатов, образующихся после исчерпывающего гидролиза молекулы РНК РНКазой Т2. Образующиеся в результате гидролиза нуклеотиды разделяли двумерной тонкослойной хроматографией. Если при этом З'-фосфатный остаток является радиоактивно меченным, то измеряя радиоактивность пятен на двумерной

хроматограмме, соответствующих модифицированным и

немодифицированным нуклеотидам, можно с высокой точностью оценить, сколько модифицировашых нуклеотидных остатков в среднем содержит каждая молекула Р1Ж. Введение радиоактивной метки достигается в процессе Т7-транскрипции добавлением в транскрипционную смесь а-[32Р]-иТР. При этом радиоакгивный фосфатный остаток остается связанным с нуклеотидом, соседним сив последовательности мРНК. Пример такого анализа в случае яСт-содержащих мРНК приведен на рис. 2.

8», ■'

д, '-¿у в. с. - V

Рисунок 2. Анализ содержания остатков б-тиогуанозина в мРНК 07,012 с помощью гидролиза РНКазой Т2 с последующим разделением нуклеотидов двумерной тонкослойной хроматографией. А - мРНК, синтезированная из нормальных гИТР. В - мРНК, то же, что А, но ОТР заменен на вСТР, С - мРНК, синтезированная из нормальных гЫТР и вОТР, соотношение ОТРчОТР = 1:1.

Пятна на хроматограммах соответствуют: 1 - Ар, 2 - Ср, 3 - (5р, 4 -ир, 5 - эвр

Если в случае фотореагентов "нулевой длины" модифицированные нуклеотидные остатки можно вводить непосредственно в ходе транскрипции, то в случае "ГОВ-П в транскрипцию вводится трифосфат его предшественника - 5-метиленаминоуридина. Фотоаффинная группа вводится в синтезированную молекулу РНК (после ее очистки) обработкой 14-оксисукцинимидным эфиром трифтордиазиринбензойной кислоты. При этом селективно модифицируется нужная аминогруппа, а аминогруппы гетероциклических оснований не затрагиваются. Выход модификации составляет 80-90%.

3.2. Выбор мРНК для изучения мРНК-связывающего центра рибосомы.

Для изучения топографии мРНК на рибосоме были сконструированы небольшие по размерам аналоги мРНК. Эти мРНК содержат природные сигналы инициации трансляции - последовательность Шайна-Дальгарно (ББ)

л. сссаасш(К5ВиСиАидиАССААСССАААССАСАа и+4

С<КЗААСШ№и1)СиАуСС11АСААСаС7АААССАСАО и+5

ЦССААССАдСииСиАиССАиСЛАСаСААСиСССАС и+й,+16

СОСААССАССиисиМОСААиААСССАААССАСАО и+7 ССС.ЛА^^БВОБАУООЛАСТАСОСАиААСОЛСЛа тл8.чз

ССС^ХАгаАССииаиАДСОАААГиСОСАААОСАСАО и+9

С()ОААССАС(;Г)1)ОиА1]ОСАЛЛССиССЛЛЛС;СА('А(; и но

СССМС«АСС1/иС1;А1Юа ААСА АСГСАААООЛСЛО и+11

ООСААССАССиУСХ) АиССААСААСаиС! ААСС АСАС 042

ССС^ХЛСОАССииСиАЦССААСААСССАи О ^ 14

СГХ1А^САС0тТСТ1АДССАЛСААСПСААиСАСАС и+15

е. сссаассдссиисиацссисаассаасасасас 04

стг,ллсоагл;шг.па11г,ас1)асъ'саасассасл 65,010

ОССААССА№ииСиАиса!С,ха)С«».САГС АСА Ой,С11

СССААС&М1<>иисиАуССиССАССАССАСЛСАС 07.612

сссаассассцисиауеиааиссиссг.асасса gs.gr>

в. оосассасаааасаасатох1асассгаасаааасааааа ш,10 оосасвлйааааоаао/^аисассас^сллалслаллл U5.ll сссмеаоаааасаасаусасуассааусааааоааааа шд2 ссоассасаааасмааисасасссаааисааасааааа ц7.13 сооассасаааасаасатасасисааасиааасааааа 118,14 ссо ассас а а ало аас ацо асасоиааао а1гааоааааа ъ'9,16

Г. ОООЛАООА С СтААА А А ААЦОС.и С в О АА А СО АС АС И 5

ССаААССАСОАААААААШССОГ'ОЛЛАССЛОЛС Т77

ОССМ№АСОАААЛААА11СССССА11АЛССАОла и У

(ХЮААГ.САСОААААЛЛАНЦСССЮАААЦССАСАС и 11

ССОМСО^СААААСААиАиООАСАСаАААСЛАААСМААА (8К. -11

ССОМССАССААААаиАААПОаАСАССАААСАААЛОЛААЛЛ <81м, -3)

(;ССАЛ(;С,АСОАААиАМСА1ЮОАСЛС()АЛАГ|ААААС;ААААА (8Ы, -5)

сссаа13(засоа11ааааасау£САСАССААЛи^ХААЛОААААА (8!Ч, -7)

С0Г!ААГ;САШААА1;А11ССАГЛСС.АААСААААСАМЛЛ (44 -1)

СООМ^АГ,ОАТ1АОАиССАСАСС.^\АОАА,\А(5АЛ,\АА (4Ы, -3)

СССААООАОССиЛААЛШСАГАССАААаААААОААААА (4.\, -4)

Рисунок 3. Первичная струетда модельных мРНК, использованных в работе. А. мРНК сго-типа для нзучекия топографии колрруютей части мРНК с использованием фогоаффиняых производных уридина в качестве фотоаффинного решента В мРНК дли изучения топографии кодирующей части чИПС с использованием 6-тиогуанозина в качестве фоюаффкнного реагент В мРНК с лршпволыгой последовательностью для изучения топографии кодирующей части с помощыо фотоаффшшых аналою» уризипа Г. мРНК .гая изучения топографии кодирующей част «РНК с использование« диазирянового производного чридина в качестве фотсаффютого реагенчз Д. Модельные мРНК. используемые дш изучения топографии З'-концевой иекодирующей часта мРНК со сиейсеркыми участками длиной 8 и 4 пухлеотвдных остатка, а также с различной длиной последовательности Шайна-Дальгарно.

и штициаторный AUG кодон, наличие которых необходимо для обеспечения их правильного и прочного связывания с рибосомой. Длина модельных мРНК - около 30 нуклеотидных остатков - с одной стороны, достаточна для прочного связывания и вюпочает в себя участок связывания с рибосомой; с другой стороны, небольшой размер мРНК дает возможность включения фотореагента в нужное положение ее цепи как в кодирующей части, так и в области перед кодоном в Р-участке. Кроме того, последовательность мРНК планировалась так, чтобы облегчить дальнейшую идентификацию модифицированного нуклеотидного остатка, участвующего в формировании сшивки. Все это в сочетании с возможностью получения мРНК в препаративных количествах делает модельные мРНК оптимальными для изучения структуры мРНК-связывающего центра рибосомы E.coli.

В работе использованы мРНК двух типов (рис. 3). мРНК первого типа основаны на структуре мРНК Cro-белка фага лямбда, они содержат протяженную SD-последовательность и короткий U-богатый спейсерный участок между SD-последователыюстъю и инициаторным AUG кодоном. В области за инициаторным кодоном расположены либо 1-2 остатка U (рис. ЗА), либо G (рис. ЗБ) в положениях от +3 (положение А в AUG кодоне принимается за +1) до +16, которое, по литературным данным, ограничивает участок связывания мРНК с рибосомой в кодирующей части мРНК. Последовательность мРНК второго типа (рис. 3 В, Г, Д) является произвольной, за исключением наличия в них SD-последовательности и инициаторного кодона. При изучении кодирующей части 1-2 остатка уридина располагались в положениях от +4 до +16 (аналогично мРНК первого типа). Использование мРНК с различными последовательностями в кодирующей части и различной структурой инициаторной области позволило попытаться выявить универсальность обнаруженных контактов и изучить зависимость выхода той или иной сшивки мРНК с компонентами рибосомы от последовательности мРНК. Использование мРНК с произвольной последовательностью позволило изучить топографию спейсерного района мРБК на рибосоме. С этой целью использовались последовательности мРНК, имеющие спейсерные участки различной длины, в одно из положений которых помещали остаток уридина (рис. ЗД).

3.3. Комплексы рибосомы с лнгапда.мн, использованные в работе.

В процессе трансляции можно выделить несколько основных стадий. На стадии инициации рибосома связывает мРНК, образуя бинарный комплекс, с Р-участком которого затем связывается инициаторная íMet-TPHKfMet. Хотя in vivo эта процессы катализируются факторами инициации, в системе in vitro возможно образование такого инициаторного комплекса и в

отсутствии этих факторов. Полученный комплекс является биологически активным, поскольку он способен участвовать в дальнейших процессах биосинтеза белка на рибосомах.

На следующей стадии с А-участком рибосомы связывается аминоанил-тРНК в соответствии с последовательностью второго кодона мРНЕС В этом процессе участвует фактор инициации Tu, однако в системе in vitro возможно и бесфакторное связывание аа-тРНК. Как только произошло правильное связывание второй тРНК с рибосомой в А-участке, происходит реакция транснситидации и образуется прстранслокациошшй комплекс.

Добавление к цретранслокационному комплексу фактора элонгации EF-G приводит к транслокации, при этом тРНК из Р-участка перемещается в Е-участок. из А-участка в Р- участок, я мРНК" в рибосоме передвигается ira один кодон.

Все перечисленные выше рибосомные комплексы: бинарный, тройной (шшциаторный), претранслокационный и посттранслокационный, были использованы для изучения взаимодействия мРНК с компонентами рибосомы на разных этапах трансляции.

3.4. Образовать химических сшивок и методы их анализа.

Сформированные рибосомные комплексы, содержащие мРНК с фотоактивирусмыми группами, очищали от избытка несвязавшихся лигандов цетрифугированием в градиенте концен-фации раствора сахарозы и облучали 3-5 мин УФ-светом с длиной волны > 310 нм. При этом происходи! образование химических сшивок остатков фотопуклеотидов с компонентами рибонуклеопротеидного комплекса. В контрольном эксперименте с использованием немодифицированных мРНК сшивок не наблюдается.

На первом этане анализа сшивок 30S и 50S субчастицы рибосом разделяли центрифугированием в градиенте концентрации раствора сахарозы при ннзкои конпетттрации ионов Mg2* , т.е. в условиях диссоциации рибосом на субчастицы. Во всех случаях наблюдалась тот,ко модификация малой субчастицы рибосом.

Затем разделяли сшитые с мРНК рРНК и белки центрифугированием в градиенте концентрации раствора сахарозы в присутствии диссоциирующих агентов, в условиях полного разрушения нековалентных РНК-белковых комплексов. Оказалось, что мРНК сшивается как с 16S рРНК. так и с рибосомными белками. Сшивки с pPIIK и белками анализировали отдельно.

3.5. Анализ сшивок с рибосомными белками.

Сшивки мРНК с рибосомными белками анализировали в две стадии. Па первом этапе производили частичное разделение белков, сшитых с

1 2 34 5

m$2

s7

||st8,S21

Рисунок 4, Анализ сшивок мРНК и+7 с рибосомными белками электрофорезом в ПААГ.

1 - в бинарном комплексе,

2 - в тройном комплексе,

3 - в претранслокационном комплексе с деацшшрованной тРНК*1е1 (перед реакцией радиоактивности транспептидации), говорит О

4 - в претранслокационном после траиспептидации, 5- в посттранслокационном комплексе.

радиоактивно меченой мРНК путем электрофореза в ПААГ, содержащем мочевину и ДСН. Пример такого разделения для мРНК 11+7 (рис.3) в различных рибосомных комплексах приведен на рис.4. Такой анализ позволяет также оценить эффективность пришивки к тому или иному рибосомному белку. На втором этапе с помощью антител против индивидуальных рибосомных белков идентифицировали

конкретный белок, сшитый с мРНК. Для этого овечьи антитела предварительно иммобилизовали на агарозе (используя агарозу с пришитыми антителами козы к антителам овцы), затем добавляли раствор белков сшитых с радиоактивной мРНК. Наличие в пробирке взаимодействии

комплексе специфического антитела с белком, сшитым с мРНК. Пример такого

Рибосомные белки, соответствующие зоне анализа приведен на рис.5, в геле, указаны рядом с зоной. В результате исследования

белкового состава мРНК-связывающего центра рибосомы было установлено, что наиболее эффективно в бинарном комплексе с мРНК сшиваются белки S18, S21 (рис.4). С этими белками сшиваются нуклеотиды, расположешпле в области перед инициаторным кодоном, а также нуклеотиды инициаторного кодона. При переходе к тройному комплексу выход сшивки с белками S18, S21 снижается, появляется сшивка с белком S7 (из положений -3, -4 мРНК) и S2, при переходе к претранслокационному комплексу белок S7 модифицируется с наибольшим выходом, а после транслокации спектр пришивок становится аналогичным тому, который был получен в тройном комплексе (рис.4). Полученные данные свидетельствуют о сильном изменении контактов мРНК с белками в процессе транслокации.

I

uL

i ii III I i Li

1» 11 12 13 14 1?

1" IS 14 211 21

££ЛКП 4iS

срм В области за

инициаторным кодовом мРНК контактирует с белками S2 в области от -4 до 6. Sil (-5 - -1-4). S5 (тА --S); S3, S4 (-11 - -46). Таким образом, ^ти белки \ частв\ ют в формировании мРНК-Pucvhok 5. Анализ рибосомных белков, сшивающихся с связывающего центра мРНК UJ7 в тройном комплексе. с помощью рибосомы. Выхот

иммобилизованных аши!ел к индивидуальным пришивки К Этим рибосомным белкам

оелкам невысок и не зависит от типа использованного рибосомного комплекса.

Применение тиосодержащих производных приводило к получению сходного спектра белков, сшивающихся с мРНК, содержащего перечисленные выше белки, за исключением Sil. Этот белок эффективно сшивается с мРНК, в состав которых входит iU.

Данные о белковом составе мРНК-связывающего центра рибосомы суммированы на рисунке 6.

I аким образом. используя ра;-дичные рсагсшы "нулевой длины'. нам удалось сущееi-венно дополнить данные о белковом составе мРНК-свя-зываюшего цептрз рибосомы на разных этапах трансляции. Белки S18 и S21 важны для взаимодействия с выходящим из декодирующего центра участком мРНК. белок S7 важен для стабилизации кодон-антикодонового дуплекса а Р-участке п прилегающей к нему части спейсерното района мРНК на рибосоме. Белки Sil. S5. S2. S5 и SI также являются компонентами мРНК-связывающего центра рибосомы. Возможная функциональная роль белков S3 и S4 будет обсуждена ниже.

«•J к5 -10 »15

v-t М 11~П 4NT Д-Д'-IN AUGIД ДЫ1Д)ЧМ1ЛI Л-Л Л №ПДЪП II ¡1 II I -

I

T^SHR".'

Рисунок <-> Схема контактов мРНК с белками в мРШС-связывающем центре рибосомы. Белки, локализованные в "голове" малой субчастицы рибосом, расположены над мРНК, белки, находящиеся в "теле" малой субчастицы рибосом, - под мР!ГК.

3.6. Анализ сшивок с рибосомными РНК.

Для анализа положения сшивки внутри длинных молекул РНК нами был разработан метод, включающий в себя два этапа. На первом этапе определяется район молекулы рРНК, содержащий сшивку. Для этого мы использовали гидролиз рРНК РНКазой Н в присутствии пар олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных определенным участкам рРНК. При этом пары олигонуклеотидов были подобраны таким образом, что в каждом случае выщепляется фрагмент рРНК длиной около 100 нуклеотидов, который становится радиоактивно меченным, только если он содержит сшивку с мРНК. Использование набора пар олигонуклеотидов позволяет протестировать сшивки в молекуле рРНК по всей ее длине (рис.7).

А.

1 2 3 4 5 6 7 8

б.

1 2345678

ЮОО________1500 ^

_ 1

_ 2

_ 3

_ 4

_ 5

_' >_15_ 6

13» ШО 7 ~ 1382 1«!>«8

Рисунок 7. Анализ районов 168 рРНК сшитых с мРНК и-~7 в бинарном (А) и тройном (Б) рибосомном комплексе гидролизом РНКазой Н в присутствии пар олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных районам . 16Э рРНК, обозначенным на схеме. Стрелками на электрофореграмме указаны фрагменты, содержащие сшивку.

А С С Т X, X) С| С?

А

1234567 8 9 С

— • - а!-«

Й»

м»

Ша

> \

\

7±

Рисунок 8. Анализ точного положения сшивки 16Б рРНК с мРНК.

А - Определение фрагмента 165 рРНК минимальной длины, содержащего сшивку с мРНК и+6,+ 16 с помощью гидролиза РНКазой Н в присутствии пар олигонуклеотидов, комплементарных участкам рРНК, обозначенным на схеме. Фрагменты рР11К, содержащие сшивку. <н мечены стрелками на *лекгрофореграмме и на схеме

К В - определение иуклеотнаа 16Э рРНК. ччас (вуюшсго в формировании сшивки с я РНК (.'-6.-16 и и~7 соответственно. с помощью реакции обратной транскрипции Л.( (т.Т -сиквенс.ные дорожки, X - обратная транскрипция с фраьмеша. содержащего сши«к\ ( -консольные дорожки - обратная транскрипция с того же фра! мен ¡а р!'НК не

содержащею сшивку

Стрелками обозначено положение остановки обратной транс-крипты ( один нуклеотнд до ) частвующе-1 о и сшивке)

Использование других пар олигонуклеотидов, комплементарных участкам внутри определенного ранее района рРНК. позволяет хсшжжшь положение сшивки с точностью до 20-30 пуклеотидои Пример кжого анализа сшивок 16Б рРНК с мРНК 11+6,^-16 и показан на рис.8А.

Следующим этапом является установление конкретного нуклеотпда рРНК. участвующего в образовании сшивки. С этой целью мы использовали реакцию обратной транскрипции. Фрагмент рРНК длиной около 200 нуклеотидов, содержащий сшивку, очищали от нес шичою фрагмент псктрофоречом в 11ЛАГ и использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции с соошеачвуюшето ДНК-праймера. Обратная транскриптаза останавливается за один нуклеотид до того, который участвует

в образовании сшивки, что приводит к появлению стоп-сигнала на радиоавтограмме геля после разделения фрагментов ДНК, образующихся в результате реакции обратной транскрипции (рис.8Б,В). Такой стоп-сигнал отсутствует в контрольной дорожке. В качестве контроля используется несшитый фрагмент рРНК, вырезанный из того же геля, что и содержащий сшивку с мРНК, и, следовательно, прошедший через те же обработки. Пример такого анализа для мРНК и+6,+16 и и+7 показан на рис. 8 Б, В. Использование двух независимых подходов для анализа сшивки внутри протяженных молекул РНК позволяет получить данные с высокой степенью достоверности. Следует отметать, что метод обратной транскрипции является чрезвычайно чувствительным, он реагирует на случайные разрывы цепи РНК, на наличие устойчивой вторичной структуры, модифицированных оснований и т.д. Таким образом, использование только этого метода может привести и зачастую приводит к появлению большого количества артефактов. Дополнительная информация о локализации пришивки в пределах небольшого определенного фрагмента рРНК, полученная анализом с помощью РНКаз ы Н, позволяет однозначно выявить стоп-сигнал, соответствующий пришивке.

3.7. Определение нуклеотидного остатка мРНК, участвующего в образовании сшивки.

Все использованные нами молекулы мРНК содержали два или более фотоаффинных нуклеотидных остатка, которые могут участвовать в образовании сшивки. В связи с этим необходимо определить какой именно

Рисунок 9. Определение положения остатка тиоуридина в мРНК и+6 с помощью метода фингерпринтов.

А - фингерпринт несшитой мРНК, Б - фингерпринт мРНК сшитой с фрагментом 165 рРНК, содержащим нуклеотид Ш052. Положение пятна 5,

соответствующего фрагменту мРНК, содержащему

нуклеогидный остаток и+6, обозначено стрелкой. Другой стрелкой обозначена точка нанесения образца.

о— ' ' .

нуклеотидный остаток мРНК принимает участие в образовании конкретной сшивки с РНК или белком. С этой целью очищенную мРНК, сшитую с фрагментом рРНК или белком, подвергали исчерпывающему гидролизу РНКазой ТТ. Получающиеся в результате гидролиза олигорибонуклеотиды разделяли двумерной тонкослойной хроматографией и радиоавтографировали, получая соответствующие фишерпринты. При этом олигорибонуклеотид, участвующий в формировании сшивки либо исчезает (если он содержит один остаток уридина), либо изменяет свою подвижность (если содержит несколько остатков уридина). В качестве контроля использовали несшитую мРНК. Пример такого анализа для сшивки мРНК и+6,+16 с нуклеотидным остатком Ш052 в 16Б рРНК приведен на рис.9. Пятно 5, соответствующее олигорибонуклеотиду, содержащему остаток уридина в положении +6 мРНК, исчезает с фингерпринта.

3.8. Нуклеотидные остатки 16Б рРНК, входящие в состав мРНК-связыванмцего центра рибосомы.

Данные о химических сшивках мРНК с 16Б рРНК, полученные с помощью различных фотоаффинных реагентов, суммированы на рис.10.

С помощью реагента "нулевой длины" бИ были обнаружены следующие контакты кодирующей части мРНК с 168 рРНК: я У в положении -4 мРНК сшивается с С1402 в 16Я рРНК; +6 - Ш052: +7 - С1395; +11, +12, ■•"13 - А532. Применение другого реагента "нулевой длины" - йО - позволило выявить дополнительные контакты мРНК с 16Я рРНК: л О в положениях +8 и 4-9 сшивается с А1196 в ! 6Я рРНК, а в положении +11 с (5530.

С помощью ТГ)В-1] было установлено, что нуклеотидный остаток в положении +2 мРНК может быть сшит с 0926 168 рРНК.

Отличительной чертой всех перечисленных выше сшивок мРНК с 16Б рРНК является то, что они строго зависят от присутствия в комплексе тРНК в Р-участке (рис.7). Эти сшивки отсутствуют в бинарном комплексе мРПК с рибосомой, что свидетельствует о том, что в тройном комплексе происходит изменение взаиморасположения мРНК и компонентов рибосомы, т.е происходит фиксация мРНК, в том числе и за счет множественных контактов ее нуклеотидных оснований с основаниями рРНК, что, по-видимому, способствует приобретению мРНК кон формации, оптимальной для связывания второй 1РНК.

Введение в комплекс второй тРНК приводит к исчезновению сшивок из позиций мРНК +4 н +6, что и следовало ожидать, поскольку при этом мРПК в А-участке переходит в состояние РНК-РНК дуплекса. На интенсивность пришивки из других положений кодирующей части связывание второй тРНК влияет незначительно.

Рисунок 10. Диатрамма сшивок мРНК с. нуклеотидами 16S рРНК. Сшивки, полученные с помощью sU обозначены стрелками, sG и TDB-U - отмечены черными квадратами. Спирали 16S рРНК обозначены цифрами. Консервативные нуклеотиды 16S рРНК выделены крупным шрифтом. Черными кругами обозначены нуклеотиды рРНК, защищаемые от модификации тРНК в Р-участке, треугольниками - в А-участке (Moazed and Noller. Cell, 1986, v.47, pp.985-994). Взаимодействие SD-последовательности мРНК с 3'- концом 16S рРНК отмечено пунктирными линиями.

При переходе к постгранслокационному комплексу спектр пришивок становится аналогичным тому, который наблюдался в тройном комплексе. Например, в тройном и претранслокационном комплексах мРНК не способна сшиваться с 16S рРНК из положения +9, однако после транслокации мРНК на один триплет (в постгранслокационном комплексе) этот остаток перемещается в положение +6 относительно кодона в Р-участке рибосомы, и при этом наблюдается сшивка с U1052. Аналогичные данные получены и для остальных пришивок из кодирующей части мРНК. Эти данные свидетельствуют о том, что наличие тРНК в Е-участке рибосомы не оказывает значительного влияния на спектр контактов мРНК в ее кодирующей части с компонентами малой субчастица рибосом. С другой

стороны, эти данные позволяют однозначно установить, что все перечисленные выше контакты отражают реальную ситуацию в рибосоме и не являются артефактами, возникающими за счет неспецифического связывания мРНК.

Наличие сшивок с рРНК из кодирующей части мРНК в тройном комплексе не зависит от последовательности мРНК как в кодирующей части, так и в области перед инициаторным кодоном, т.е. не зависит от длины последовательности Шайна-Дальгарно, а также от длины и состава спсйсерного участка, хотя интенсивность той или иной пришивки может меняться. Так, в мРНК сго-типа со спсйсерной областью длиной в 4 нуклеотида сшивка из положения +6 является более интенсивной, чем сшивки из положений +7 и +4, тогда как в других мРНК (со спейсерной областью длиной 6-8 нуклеотидов) ее шггснсивность несколько снижена, а наиболее интенсивными являются сшивки из положений +7 и +4. Эффективность сшивки из положения +12 мРНК не зависит от размера спейсерной области мРНК, однако зависит от ее состава. Так, в мРНК с пиримидин-богатой спейсерной областью она ниже, чем в мРНК с пурин-богатой спейсерной областью. Таким образом, хотя во всех мРНК не зависимо от их последовательности были обнаружены перечисленные выше сшивки, интенсивность каждой конкретной сшивки (а, следовательно, и локальная конформация мРНК-связывающего центра) зависит о г последовательности мРНК. Это наблюдение позволяет предположить, что в зависимости от последовательности мРНК может изменяться вклад каждого отдельного контакта в общий процесс фиксации мРНК па рибосоме, что позволяет рибосоме "учесть" вес особенности локальной конформации данной конкретной мРНК и сориентировать ее в мРНК-связывающем центре так, чтобы связывание второй тРНК и последующие стадии процесса трансляции протекали оптимально.

Важно, что кодирующая часть мРНК сшивается с консервативными нуклеотидами в последовательности 168 рРНК, либо с соседними с ними нуклеотидами (рис.10) Всс эти сшивки расположены в районах 168 рРНК, важность которых для функционирования рибосомы была показана ранее другими методами: район "1400"-спираль 28 (сшивки +4/1402, +7/1395, +2/926), спираль 34 (+6/1052 и +8,+9/1196), район "530" (+11/530 и +12/532), в этих районах расположены летальные мутации, мутации устойчивости тс антибиотикам, мутации, влияющие на точность трансляции (О'Соппот е! а1. ВюсЬетп. Се11.Вк>!. 1995, у.73, рр.859-868). В районе " 1400"-спираль 28-расноложены участки, защищаемые тРНК в присутствии ро!у!1 от действия химических реагентов в Р-участке, а в районе "530" - в А-участтсе (рис.10). Наши данные позволяют предположить, что функциональная важность

перечисленных выше районов связана с их участием в непосредственных контактах мРНК и стабилизации кодон-ангакодоновых взаимодействий в процессе трансляции.

Хотя указанные участки 16S рРНК далеко отстоят друг от друга во вторичной структуре мРНК, они должны быть сближены в пространстве в составе рибосомы. Фрагменты 16S рРНК, изображенные на рис.10 выше мРНК, расположены в "голове" малой субчастицы рибосом, а фрагменты, расположенные ниже мРНК, - в ее "теле". Таким образом, мРНК располагается в области между "головой" и "телом" малой субчастицы рибосом. Нуклеотидный остаток G926, образующий сшивку с TDB-U в положении +2 мРНК из кодон-антикодонового дуплекса в Р-участке, выпетливается из спирали 28, которая соединяет "голову" и "тело" 30S субчастицы рибосом. Этот нуклеотад может проникать в бороздку спирали мРНК, стабилизируя тем самым правильную ориентацию кодон-антикодонового дуплекса в Р-участке. Необходимо отметить, что третья пара в этом кодон-антикодоновом дуплексе также контактирует с 16S рРНК, однако в этом случае во взаимодействии с С1400 участвует вобл-основание антикодона тРНК (Offengand et al. Biochemistry, 1979, v. 18, pp.4322-4332).

В области перед кодоном, расположенным в Р-участке^ мРНК также образует ряд сшивок с 16S рРНК (рис.10).

Все мРНК образуют сшивку с З'-концевой областью 16S рРНК в непосредственной близости от нуклеотада G1530, при этом с наибольшей эффективностью сшиваются нуклеотиды спейсерного участка мРНК, непосредственно прилегающего к последовательности Шайна-Дальгарно. Известно, что нуклеотиды А1531 и G1530 консервативны в рибосомах всех исследовапных организмов. Таким образом, данная сшивка мРНК и рРНК может отражать наличие контакта мРНК с 16S рРНК, необходимого для правильной ориентации выходящего из рибосомы участка мРНК. Образование данной сшивки не зависит от размера и состава спейсерной области, а также от присутствия одной или двух молекул тРНК в рибосомном комплексе.

Спейсерная область мРНК может быть также сшита с двумя другими нуклеотидами в рРНК: с А1360, расположенным в неконсервативной области 16S рРНК в "голове" малой субчастицы, и с нуклеотидом А665, соседним с консервативным G664, расположенным в "теле" малой субчастицы рибосом. Эффективность сшивки с А665 не зависит от присутствия тРНК, а эффективность пришивки к А1360 несколько увеличивается в ее присутствии. При этом мРНК с 8-ми нуклеотидным спейсерным районом сшивается только с А1360, а мРНК с 4-х нуклеотидным спейсером - только с А665. После транслокации мРНК с 4-х нуклеотидным спейсером на один шаг пропадает

пришивка к А665 и появляется пришивка к AI 360. Таким образом, спейсерный участок в области между последовательностью Шайна-Дальгарно и кодоном в Р-участке не имеет строго фиксированного сайта связывания на рибосоме и укладывается на ней оптимальным образом в зависимости от своего размера и состава.

Контакты в области перед кодоном в Р-участке также важны и на стадии элонгации для обеспечения правильной ориентации выходящей области мРНК. Изменение таких взаимодействий может приводить к сдвигу рамки считывания (Tapprich et al. in "The ribosome: structure, function and evolution. Hill et al eds. 1990, pp.236-242).

4. Изучение взаимодействии сахарофосфатного остова чРНК с компонентами рибосомы тиофосфатным методом.

К моменту проведения данной работы в литературе отсутствовали достоверные данные о контактах сахарофосфатного остова мРНК с компонентами рибосомы. Для изучения таких взаимодействий мы использовали тиофосфатный метод, разработанный Экшгайном и сотр. при изучении контактов тРНК со специфическими аминоацил-тРНК-синтетазами (Shartz et al. Proc. Natl. Acad. Sei USA, 1991, v.88, pp.6131-6136). Полученные данные находились в хорошем соответствии с результатами рентгено-структурного анализа данного комплекса (Rudinger et al.Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1992, v. 89, pp.5882-5886). Метод основан на использовании РНК с фосфатными группами, статистически замещенными на их тиофосфатные аналоги. Это достигается в процессе Т7 транскрипции РНК с частичным замещением одного из трифосфатов на его а-тиофосфатный аналог аналогично тому, как это было описано ранее для статистического введения фотоаффинных аналогов в цепь РНК. Радиоактивная метка вводится на 5'-конец молекулы. Цепь РНК расщепляется иодом в том месте, где находится тиофосфатная группа. Обычные фосфодиэфирные связи в этих условиях не гидролизуготся. Гипотетический механизм реакции предложен Экштайном. Он основан на том, что после атаки иодом тиогруппы в реакцию вовлекается 2'-гидроксильная группа рибозы. Если одна из тиофосфатных групп вовлечена в сильные взаимодействия с белком или в формирование сложной третичной структуры РНК, го она защищается от расщепления. Фрагменты РНК после расщепления в составе функционального комплекса и в свободном состоянии разделяются электрофорезом в полиакриламидном теле. При этом, если конкретный тиофосфатный остаток защищается от расщепления, то соответствующая полоса в геле будет отсутствовать или существенно ослабляться. Аналогичный эффект может наблюдаться, если

наличие тиофосфатного остатка в определенном месте препятствует включению РНК в функциональный комплекс, а изучаемый комплекс в процессе выделения освобождается от избытка несвязавшейся РНК.

— - - Для изучения

^ , д^нч т. .. * « < « . контактов мРНК с

тщшШШ1 фвтшяк -таттт. -чг компонентами риоо-

•■- „ ^ "^Г- « ,.,•«. ? г Г ..

Т ^ 14 " • - « СОМЫ В тройном, пре-

г £ ^ ли ^» _

щ ь ^ И посттранслокаци-

' ---~ онном комплексах

к ^ ----^¡-х описанным выше

: * *.' . - * I методом были ис-

- , " г ~ пользованы мРНК

*-'---- ---двух типов - сго-

г Г;;; : мРНК (рис.За, мРНК

- ^ ^ ^ ^ и+6) и МЁ-мРНК

(ОСС(А40)1ААА-

Рисунок 11 Спектры расщепления тиофосфат-содержащеи \JIJC (АлО

МР-мРНК I), С, в, А - мРНК, транскрибированные в дддгг\ г> у ' присутствии соответствующих а-тио-трифосфатов. N - мРНК, от

несодержащая тиофосфатов Дорожки 1,2- расщепление сго-мРНК, МБ-мРНК мРНК в составе пре- и постгранслокационных комплексов, не содержит сигна-Дорожкн 3, 4 - в составе тройного комплекса. Дорожка 0 - лов инициации тран-расщепление свободной мРНК в растворе. Кодоны АиО-ииС сляции в неко-выделены рамкой. Черной стрелкой показаны фосфатные дИВу10щей части В остатки с повышенной доступностью, белой стрелкой -

защищенные фосфатные остатки. результате экспери-

ментов было показано, что наличие тиофосфатных остатков в любых положениях не препятствуют связыванию модифицированных мРНК с рибосомой, а мРНК полностью сохраняет свою способность к трансляции.

В кодирующей области мРНК независимо от ее нуклеотидной последовательности полностью доступна действию иода во всех рибосомных комплексах (рис.11). Некоторая, весьма слабая защита, наблюдалась лишь для тиофосфатных остатков в положениях +1 и +3, входящих в состав инициаторного А1ГС-кодона. Тиофосфатный остаток в положении +7 становится более доступным атаке иода в рибосомных комплексах, содержащих тРНК. В области перед А1Ю-кодоиом в МР-мРНК защищается тиофосфатный остаток в положении -2, а в сго-мРНК - помимо остатка -2 наблюдается слабая защита и фосфатных остатков в положениях -5 и -7.

Таким образом, результаты, полученные методом фотоаффинного химического сшивания, находятся в хорошем соответствии с данными, полученными тиофосфатным методом. Согласно данным о защите

фосфатных остатков мРНК в области за инициаторным кодоном не имеет плотных контактов с компонентами рибосомы, а фосфатная группа у остатка +7 обладает повышенной реакционной способностью в реакции расщепления иодом, что свидетельствует об изменении конформации цепи РНК в данной области. В области перед инициаторным кодоном слабые защиты фосфатных остатков зависят от последовательности этого района мРНК, в особенности от наличия SD-последовательности. Согласно данным фотоаффшшого химического сшивания эти защиты, по-видимому, обусловлены взаимодействием с рибосомгплми белками S7 (положение -2) и S18, S21.

Отсутствие плотных одиночных контактов мРНК с рибосомой в процессе трансляции вполне объяснимо, поскольку в процессе биосинтеза белка матрица должна двигаться вдоль рибосомы, и наличие сильных контактов существенно затруднило бы этот процесс.

5. Модель пространственного расположения mPIIK в декодирующем центре рибосомы.

Наличие данных о многочисленных контактах мРНК с нуклеотидными остатками 16S рРНК, полученных с помощью метода фотоаффинного химического сшивания и тиофосфатного метода, создает предпосылки для

создания модели мРНК-связывающего центра рибосомы. Следует отмстить, что в последнее время для изучения структуры рибосом получил развитие метод элскфонной микроскопии высокого разрешения. С. помощью данного метода получена модель структуры малой субчастицы рибосом с разрешением около 20Ä, что соответствует диаметру двойной спирали РНК. Основываясь на данных о точечных контактах мРНК с 16S рРНК и данных электронной микроскопии высокого разрешения, а также принимая во внимание литературные данные по футпринтингу тРНК, сшивкам тРПК с рРНК, участкам связывания рРНК с белками и между собой, данные ИЕМ о топографии различных структурных и функциональных элементов рибосомы и лигандов на поверхности рибосомы и др., мы получили возможность соотнести отдельные элемент электронно-микроскопической модели с конкретными фрагментами 16S рРНК и начать разработку модели взаиморасположения мРНК с тРНК и 16S рРНК в мРНК- связывающем центре рибосомы на разных стадиях трансляции.

Согласно нашим данным кодоп-аптикодоновый дуплекс в Р-участке фиксирован за счет взаимодействия с G926 в спирали 28, соединяющей "голову" и "тело" малой субчастицы рибосом. Наличие двух сшивок мРНК с данной спиралью (+2/926 и +7/1395) позволяет предположить их взаимную ориентацию. Другим фрагментом структуры, образующим две сшивки с

мРНК, является спираль 34 (+6/1052 и +8/1196), что также позволяет смоделировать взаимное расположении этих элементов в тройном комплексе. Как мы подчеркивали выше, контакт этой спирали с положением +6 мРНК при связывании второй тРНК исчезает, и связывание второй тРНК может изменить расположение второго кодона мРНК относительно спирали 34. В соответствии с нашими данными, петля "530" (сшивки +11/530 и +12/532) сближена с районом "1400" (+7/1395 и +4/1402) в мРНК-связываюшем центре рибосомы. Спейсерная область мРНК в зависимости от длины и нуклеотидной последовательности может располагаться либо ближе к "голове", либо к "телу" малой субчастицы. Модель не включает в себя рибосомные белки, т.к. пространственная структура белков мРНК-связываюшего центра еще не известна. Однако, следует иметь ввиду, что эти белки играют существенную роль в формировании структуры декодирующего центра рибосомы и вносят свой вклад в формирование контактов мРНК с рибосомой.

Цепь мРНК на данной модели располагается таким образом, чтобы фосфатные остатки мРНК в кодирующей части не были вовлечены в сильные взаимодействия с компонентами рибосомы. Согласно результатам, полученным с помощью тиофосфатного метода, мРНК в рибосоме должна иметь несколько изгибов сахарофосфатного остова, один из которых должен располагаться между +7 и +8 положениями. Это подтверждается и данными, полученными с помощью фотоаффинного химического сшиваниия, согласно которым нуклеотидные основания этих нуклеотидных остатков ориентированы в противоположные стороны (в сторону "тела" и "головы" соответственно).

Электронная микроскопия высокого разрешения комплексов с рибосомой мРНК и тРНК выявила некоторые различия в структуре такой функционирующей рибосомы по сравнению со свободной рибосомой. Наиболее существенным оказалось образование контакта между "головой" и "телом" малой субчастицы рибосом в области контакта кодирующей части мРНК (в районе положения +15) с рибосомой (R.Briraacombe et al, J.Mol.Biol., послано в печать). Данный контакт отсутствует в свободной рибосоме и появляется только при связывании мРНК и формировании функционального комплекса. Появление такого контакта способствует фиксации мРНК на рибосоме, что обеспечивает стабильность элонгирующей рибосомы. Следует отметить, что подобный способ фиксации матричного полинуклеотида используется и РНК- и ДНК-полимеразами. Таким образом, можно предположить, что конформационное изменение структуры после связывания матричного полинуклеотида, приводящее к замыканию кольца вокруг матрицы, закрепляющее ее на рибосоме, является общим свойством

подобных систем. Наши данные по топографии мРНК па рибосоме позволяют предположить, что наиболее вероятными кандидатами на формирование такого контакта являются рибосомные белки S3 и S4. Данное предположение требует дальнейшей экспериментальной проверки.

Отсутствие сильных взаимодействшЧ кодирующей части мР11К с компонентами рибосомы объясняет необходимость фиксации мРНК на рибосоме с помощью конформационных изменений в структуре малой субчастицы рибосом после связывания мРНК, приводящих к образованию кольцеобразной структуры вокруг мРНК, препятствующей диссоциации мРНК до сс полного прочтения. Правильная пространственная ориентация мРНК на рибосоме в процессе трансляции может достигаться за счет существования большого числа точе'птах взаимодействий как нуклеотидных оснований, так и сахарофосфатпого остова мРНК с рРНТС и рибосомными белками. Выбор конкретных точек контакта зависит от структуры мРНК, причем спектр контактов меняется в процессе трапелокации.

6. Топография и структура 5S рРНК в рибосоме.

Рибосомные РНК играют важную роль в функционировании рибосомы. В состав рибосомы помимо молекул 16S и 23S рРНК с протяженной

тюлшгуклеотидной цепью входит и небольшая молекула 5S рРНК длиной 120 нуютеотидов. Эта молекула - компонент большой субчастицы - чрезвычайно важна для работы рибосомы. Рибосомы, лишенные 5S рРНК, не обладают биологической активностью (Dohme and Nierhaus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976. v.73, pp.2221-2225). Более того, некоторые точеные мутации в 5S рРНК также приводят к инактивации рибосом (Goringer and Wagner. Bíocheni. Hoppe-Seyler, 1986, v.367, pp.769-780). Описанные выше методы -фотоаффишюго химического сшивания и тиофосфатный - примешшы и для изучения пространственной организации 5S рРНК в рибосоме.

Для статистического введения модифицированных нуклеотидных остатков в молекулу 5S рРНК необходимо было клонировать ген 5S рРНК, поместив его под контроль промотора фага Т7. Как известно из литературы, транскрипция РНК Т7 РНК полимеразой осуществляется достаточно эффективно, если на ее 5'-конце располагаются минимум два остатка G. Для соблюдения этого условия в молекуле 5 S рРНК в процессе клонирования были проведены точечные замены: 5'-концевой остаток U был заменен на G, Al 19 - на С (для восстановления комплементарной пары), а остаток U120 был делегирован (рис.12). Данные замены, а также введение последовательност и

G

T 10 26 30 jo

pUG CCUG G CG G CCG UAG CG CG G UG G UCCCACCUG ACCCCAUG 8 3 1 I 12 11

50 60 70 80

CCG AACUCAG AAG UG AAACG CCG UAG CG CCG AUG G UAG UG UG 10 4 3 6 1 7 5

С Д

90 100 HO t t

G G G UCUCCCCAUG CG AG AG UAG G G AACUG CCAG G CAU,,„ 1 13 2 0

Рисунок 12. Последовательность 5S рРИК с разбиением на фрагменты, образующиеся после гидролиза РНКазой Т1. Нуклеотидные замены показаны стрелками, остатки уридина выделены, олигонуклеотиды, содержащие радиоактивную метку, пронумерованы.

Т7-промотора непосредственно перед геном 5S рРНК было осуществлено с помощью ПЦР. ДНК-дуплекс использовался как матрица в синтезе 5S рРНК, а также был клонирован в плазмиду pUC 18 и отсеквенировап.

Полученные 5 S рРНК транскрипты включались в рибосому в процессе реконструкции и активность таких рибосом не отличалась от реконструированных с натавной 5S рРНК.

5,1. Изучение топографии 5S рРНК методом фотоаффинного химического сшивания.

Для изучения контактов 5S рРНК с компонентами рибосомы был использован фотореагенг "нулевой длины" - тиоуридин. Эффективность этого реагента для выявления РНК-РНК и РНК-белковых контактов в рибосоме была показана в процессе изучения топографии мРНК на рибосоме (разд.З). Для статистического введения sU в цепь 5 S рРНК использовали метод Т7 транскрипции, как описано выше. Молекулы 5S рРНК со статистически распределенными остатками тиоуридина сохраняли свою биологическую активность.

После реконструкции 50S субчастиц, 70S рибосом или рибосомных комплексов, содержащих модифицированную 5S рРНК, их очищали ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы и облучали мягким УФ-светом, выделяли модифицированные 50S субчастицы и разделяли модифицированные рРНК и белки так, как это уже было описано в разделе 3.

Анализ модифицированных рибосомных белков показал, что с 5 S рРНК сшивается только белок L18 с небольшим выходом. Хорошо известно, что

1

8

»

r r t

tí-

белок L18 специфически взаимодействует с молекулой 5S рРНК и входит в состав 5S рРНК-белкового домена 50S субчастицы

Суммарный выход сшивки ?S рРНК с 23S рРНК достигает 80%, что свидетельствует о высокой специфичности контактов.

Анализ сшивок с 23S рРНК проводили используя метлы анализа, разработанные в процессе изучения контаткюв мРШС с 16S рРНК На первом этапе выявляли район пришивки (длиной 200-300 нуклеотидных остатков) с помощью гидролиза РНКазой Н в присутствии пар олигодезоксирибонуклеотидов, компле-) I Tt "Г ментарных заранее заданным районам

1 --- — рРНК. Было обнаружено два района,

содержащих сшивку с 5S рРНК Затем район пришивки определяли более точно, используя др\гую комбинацию пар олигодезоксирибонуклеогндии Пример такого анализа для одной из пришивок показан на рис.!? Конкретный нуклеотднын остаток 23.S рРНК, участвующий в образовании каждой из сшивок определяли с Положение олигонуклеотидов и помощью реакции обратной транс-РАшеры вышепляемых фрагментов крипции. Рез\лыаш анализа одной из Цифра рядом с сшикок представлены на рис Ы

В результате исследования было

97S 100S ÍSO (

líocj

Рисунок ! > Ана.пп положения сшивок 58 рРНК с 235 рРНК Дорожки 1-6 -анализ сшивок с районом 850-1050 гидролпюм РНКазой И в присутствии пар олигодезоксирнбонуклеошдов

\ низаны на схеме

полосой в геле указывает размер фрагмента. Фигурной скобкой отмечен фрагмент, сшивающийся с 5S РРНК установлено, что 5S рРНК сшивается с

Дорожки т, 8 - сравнение интен- Двумя нуклеотидами 23S рРНК: А960 и

сивиослei'i пришивок к районам "2475" С 2475.

(в присутствие олиго-нуклеошдов Для установления конкретного

компле-менгарных участкам "2426" и НуКЛеотилного остатка 5S рРНК.

"25! 1") п "%о" 1как в дорожке 1 ) ,

участвующего в формировании сшибки

с каждым из районов 23S рРНК использовали метод фиш ерпринтов.

Очищенную 5S рРНК, сшитую с одним из фрагментов 23S рРНК, подвергали

960-

исчерхшвающему гидролизу РНКазой Т1 и разделяли двумерной тонкослойной хроматографией (рис. 15А,В). При этом пятно 13 (соответствующее фрагменту UCUCCCCAUGp, рис.12, район 87-96 последовательности 5S рРНК) изменяло свою подвижность. Дашшй

олигорибонуклеотид содержит несколько остатков U, которые способны образовывать сшивки после замены на sU. Для установления конкретного остатка тиоуридина сшитый и несшитый олигорибонуклеотид 13 элюировали с хроматограммы, подвергали

исчерпывающему гидролизу РНКазой А и вновь разделяли двумерной хроматографией (рис.15СД). При этом радиоактивными остаются нуклеотиды Ср и Ар на контрольной хроматограмме. Исчезновение пятна Ср на хроматограмме после гидролиза сшитого олигорибонуклеотида

свидетельствует об участии

нуклеотидного остатка U89 5S рРНК в сшивке. В результате анализа обеих сшивок было установлено, что в их образовании участвует один и тот же нуклеотид U89.

Таким образом, в результате работы мы установили, что один и тот же нуклеотид U89, расположенный в D-петле 5S рРНК (рис.17), участвует в сшивке с одним из двух нуклеотидов - А960 или С 2475 в 23S рРНК.

Выход сшивки с нуклеотидом А960 не зависит от условий выделения 23 S рРНК и рибосомных белков, а также от активности реконструированных субчастиц. Наоборот, выход сшивки с нуклеотидом С2475 зависит от условий выделения рРНК и белков и возрастает с увеличением активности реконструированных 50S субчастиц. Когда активность реконструированных субчастиц соизмерима с нативными, выход обеих сшивок становится приблизительно равным. Таким образом, сшивка U89/A960, по-видимому, отражает постоянный контакт 5S рРНК с 23S рРНК, формирующийся в ходе сборки 50S субчастицы рибосом, а сшивка U89/C2475 соответствует контакту

Рисунок 14. Определение

нуклеотидного остатка 23 Б (район 943-975) с 58 рРНК с помощью обратной транскрипции. А, О, С, Т -сиквенсные дорожки, Х- обратная транскрипция с выделенного фрагмента 23 Б рРНК, содержащего сшивку. К - обратная транскрипция с контрольного фрагмента, несодер-жащего сшивку.

/

о.

С.

D.

между' элши молекулами, возникающему при ооразовании активной «информации 50S субчастицы рибосом.

Поскольку тиоуридин образует сшивкн т.н. "нулевой длины", т.е. для образования новой ковалентной связи основания должны бьпь в среднем на расстоянии порядка ЗА друг от друга, то небольшие изменения и конформашш данною участка 23S рРНК или 5S рРНК могут приводить к возникновению или исчезновению сшивки. Как отмечалось выше, сшивание тиоуридипа с основаниями 23S рРНК происходит с очень высоким выходом. Если обычно выход сшивки тиоуридин-содержащей мРНК с 16S рРНК не превышал 10-15%, то в данном случае суммарный выход сшивки составлял около 80% Это свидетельствует о гом. что основания, формирующие сшивку, достаточно жестко фиксированы и структуре комплекса 23S рРНК с 5S рРНК Более uno. известно, что тиоуридин образует сшивки с гетероциклическими основаниями Р11К только если они находятся в стэкинг-конформации, а атом серы перекрывается с двойной связью re героинкла. Все это позволило чам высказать предположение, что основание U89 в 5S рРНК. Л%0 и (."247 5 н 23S рРНК образуют "стопку" так, что остаток уридина интеркаллирован между /\ и С 23S рРНК (рис. 16). При этом образование такого узла характерно для рибосом с максимальной активностью. Ясно, что даже небольшое смещение плоскости основания С2475 будет нарушать спкшп-конфирмацию и приводить к уменьшению выхода сшивки.

Можно предположить, что данный контакт является чрезвычайно важным для функционирования рибосомы Это предположение было проверено методом сайт-специфического мутагенеза. Замена U на G, которая должна сильно изменять взаимное расположение оснований в "стопке".

Рисунок 15 Определение нуклеотидного остатка 5Б рРНК, сшитого с 238 рРНК. А. В - Т1 фингерпринт свободной 5Б рРНК и сшитой с фрагментом 238 рРНК

еоответсткенно Пятна на чронагограммс пронумерованы в соответствии с рис 12 Пятна, изменившие подвижность в сшитом образце обозначены стрелками С. О - вторичный шдродкч РНКазой А Фрагментов соответствующих обо-о иачеикым стрелками пятнам в контрольном и сшитом образцах соответствию Последовательность фрагмента у каина рядом с пятном.

АС гВМА

Рисунок 16. Схема взаиморасположения остатков U89 5S рРНК и С2475, А960 в 23 S рРНК, участвующих в образовании сшивки.

приводит к инактивации рибосом, в то время как замена U на С мало сказывается иа активности рибосом.

Нуклеотиды С2475 и А960 удалены друг от друга во вторичной структуре 23S рРНК и относятся к разным ее доменам. Однако, поскольку они образуют сшивку с одним и тем же основанием 5S рРНК, эти нуклеотидные остатки должны быть сближены в рибосоме (рис.16, 17). Нукле-отид С2475 расположен в петле спирали 89 домена V (рис.17), непосредственно примыкающей к пептидил-транс-феразному кольцу 23 S рРНК -важнейшему функциональному центру рибосомы, участвующему в осуществлении пептидил-трансферазной реакции. Нуклеотид А960 домена П 23S рРНК находится в петле спирали 39 (рис.17), расположенной в непосредственной близости от спирали 41, которая примыкает к так называемому GTP-азному центру рибосомы. Этот центр является составной частью участка связывания фактора элонгации EF-G, который катализирует процесс транслокации на рибосоме. Кроме того, здесь же расположена спираль 38, которая сшивается с тРНК, находящейся в А-участке рибосомы. Таким образом^в составе 50S субчастицы рибосом эти два функциональных центра сближены между собой и с D-петлеЙ 5S рРНК.

Из данных ИЕМ известно, что пептидил-трансферазгшй центр рибосомы расположен в основании центрального протуберанца большой субчастицы. Таким образом, можно заключить, что D-петля 5S рРНК также локализована в основании центрального протуберанца большой субчастицы рибосом.

Интересно, что в отличие от мРНК, только один остаток тиоуридина в молекуле 5S рРНК способен сшиваться с рРНК. Участок мРНК, связанный с рибосомой, имеет одноцепочечную структуру, которая оптимальна для фотохимического сшивания остатков 4-тиоуридина, поэтому большинство оснований мРНК способны образовывать сшивки. 5S рРНК сильно структурирована, при этом лишь весьма ограниченное число остатков уридина в ее молекуле расположено в одноцепочечных участках и способно сшиваться с компонентами рибосомы.

■г.'.инг ; •

/К'

. -л- .

74 -f,-...

Рисунок 17 Структурные элементы 5 Я рРНК и 23 Б рРШС участвующие в формировании сшивки.

Применение -ГОВ-и позволяет выявить существенно большее количество компонентов рибосомы, сближенных с 5Я рРНК, поскольку в данном случае в образовании сшивок могут участвовать и модифицированные остатки уридина, расположенные в участках двойной спирали РНК. Данная работа ведется в настоящее время.

5.2. Анализ структуры 5S рРНК тиофосфатным методом.

Для получения более полной информации о контактах 5S рРНК с компонентами рибосомы и особенностях ее структуры был использован тиофосфатный метод. Следует отметить, что в составе комплекса со специфическими белками L5, L18, L25 5S рРНК мало доступна, а в составе рибосомы почти не доступна действию химических агентов, модифицирующих ее основания. В то же время молекула иода, используемая для расщепления тиофосфат-содержащих молекул РНК, благодаря споим малым размерам и злекгронейгральности, способна глубоко проникать в структуру исследуемого рибонуклеопротеидного комплекса, что и было подтверждено при исследовании этим методом контактов мРНК в рибосоме.

Кроме того, в литературе отсутствует информация о возможных взаимодействиях фосфатных групп 5S рРНК с компонентами рибосомы.

Тиофосфатные группы статистически вводились в молекулу 5S рРНК в процессе ее транскрипции, после чего на 5'-конец молекулы вводилась радиоактивная метка. После реконструкции комплекса с рибосошшми белками или рибосом, 5S рРНК подвергалась обработке иодом как в составе рибонуклеопротеидного комплекса, так и в свободном состоянии, до и после реконструкции рибосом. Пример такого анализа структуры 5S рРНК в составе 70S рибосом показан на рис.18.

В растворе, за исключением одного остатка (А73), все фосфатные остатки в равной степени доступны атаке иодом (рис.18). Фосфатный остаток А73 частично защищается от расщепления и, вероятно, может принимать участие в неких третичных взаимодействиях. Однако доступность всех остальных фосфатных остатков свидетельствует об отсутствии у молекулы 5S рРНК в растворе жесткой третичной структуры.

При расщеплении модифицированных 5S рРНК в составе комплексов с инидивидуалышми рибосомными белками от действия иода защищается ряд тиофосфатных остатков. Данные суммированы на рис. 19. Белок L18 защищает от расщепления тиофосфатные остатки G6, G7, А34, расположенные в спиралях I и III, формирующих участок связывания этого белка с молекулой 5S рРНК, что соответствует литературным данным. Белок L25 защищает тиофосфатные остатки нуклеотидов G6, G7, G9, G10 (спираль I), G20, G21, U22 (спираль П), U80, U82, С90, С91 (спираль IV)- Если спираль IV была известна ранее как участок связывания данного белка, то непосредственное участие спиралей I и II в формировании участка связывания белка определено впервые, правда важность данных спиралей для связывания белка L25 косвенно следовала из данных мутагенеза. В комплексе с тремя рибосомными белками спекгр защит существенно изменяется. Появляются новые защищенные фосфатные остатки (А39, А73, А99, А101), ряд защит исчезает (G9, G10, G20, G21). Полученные данные свидетельствуют, что в процессе формирования полного комплекса, характеризующегося кооперативным связыванием трех белков, происходит конформационная перестройка, сопровождающаяся изменением участков связывания белков в составе данного комплекса. Появление новых защит может быть вызвано также связыванием белка L5. Таким образом, в отличие от результатов химической модификации оснований РНК в комплексе как с индивидуальными, так и с тремя белками, когда большинство оснований недоступно действию химических агентов, всего несколько тиофосфатных остатков защищается от действия иода.

1 2 345 12345 12345 12345 12345

*

У -V % **

14-I *

Д- Л:

4 !

¡¡згг1*: и *

5, ••

' ^ ' 1 кТ'л, - 1 , С ' .. ■>

Рисунок 18. Анализ доступности фосфагот. остатков рРПК действию иода К - растепление немодифицированного транскрипта.

Л. и. й. С - разделение фрагментов в ПААГ после расщепления рРПК. транскрибированной в присутствии тиофосфатного производного соответствующего п\каеоти.м

Дорожка 1 - 5Я рРНК и растворе л оцлчавие пода Дорожка 2 - растепление подом рРНК в растворе Дорожка 3 - 58 рРНК. выделенная из 705 риоосом в отсутствие иода Дорожка •! - растепление 58 рРНК. выделенной 1« 70$ рибосом Дорожка 4 -расщепление рРНК ь составе 7и$ риоосомы

1 *S 'I n " »* p CC*

• • ■ _CGU л ■/■■ -ucCCAr • г С CC д

UGCCUGGCGG0 AGСGCGGUG^u° ACСUGA° _ U^ ■ . Illlllll В i i i I С G A CGaUGCCGCAa .„„^AGACUp . „С G

G-C-G-C A G

UACGGACCGUC A CGaUGCCGCAAAguGaAGAСUQ^

no

G-C

VA G U-A* G-U + A G 100—G С G A c U * G A C-G G—

A-U *

IV C~G

C-G .C-G -C-G

"и и c D

so

Рисунок 19. Данные по защите фосфатных остатков 5S рРНК в комплексах с рибосомными белками. ■ - в комплексе с белком L25, в комплексе с белком L18, *- в комплексе с тремя белками.

Тиофосфат-содержащие молекулы 5S рРНК включались в рибосому в процессе реконструкции, не изменяя ее активность. В отличие от немодифицированпой 5S рРНК, которая включается в рибосому в эквимолярном количестве, при реконструкции тиофосфат-содержащей 5S рРНК в рибосому требовался ее двухкратный избыток. Это свидетельствует о том, что наличие тиофосфатных остатков в некоторых положениях молекулы 5S рРНК препятствует ее включению в рибосому. Для определения таких положений 5S рРНК была выделена из реконструированных очищенных 50S субчастиц или 70S рибосом и подвергнута расщеплению иодом. Если полоса после разделения фрагментов в геле, соответствующая какому-либо нуклеотиду (например, G33 на рис.18, дорожка G4), оказывается слабее полосы, соответствующей этому же нуклеотиду после расщепления 5S рРНК в растворе (дорожка G2), то это означает, что наличие в данном положении тиофосфатной группы препятствует включению такой молекулы 5S рРНК в рибосому. Усиление интенсивности определенной полосы (например, А39 на рис.18, дорожка А4) свидетельствует о предпочтительности молекул 5S рРНК

?„t/ccrGuVrÍÍ-^ »

r M.MJ III

r i 1С

В i X i i с

IV

ii т , , T iiiä*

.....

G С G.'gGGUGG

1

Л чО) GG

ÍÜW-A*--¿S-U+ -

>g е G*

'GÁ-íU'Tg-— «и

ühg;43" A-ü. C-G C-G' C-G C-G U ü С

G

С""

-J)

I

I i 11 i uix L 1,1

м i 111 u В Mil

CG-A UG'CGG.C Ад/л,„, ,ó"AAGAC Ur

■—- tñ I :

даяК

С ß

rc

AG c A

б

90

Рисунок 20. Результаты расщепления иодом тиофосфат-содержащих 5S рРИК в составе 50S субчастицы (a) u 70S рибосомы (б). Фосфатные остатки, отбирающиеся в реконструкции, обведены кружком, тиофосфатные - квадратом Защищенные остатки указаны стрелками, размер стрелки соответствует силе эффекта Длинные пунктирные стрелки - усиление доступности тиофосфатного остатка. Заштрихованная область -недоступный анализу район.

с такой модификацией в процессе реконструкции. Данные об отборе фосфатных или тиофосфатных остатков суммированы на рис.20. Эти результаты в дальнейшем использовались в для определения, защищается ли данный тиофосфатный остаток в рибосоме, или при реконструкции происходит отбор молекул 5 S рРНК, в данном положении которых не содержатся тиофосфатные остатки.

Известно, что в ряде случаев замена фосфатных остатков на тиофосфатные приводит к нарушению координации ионов магния, что в свою очередь инактивирует такие функциональные молекулы, как рибозимы. Однако частичная замена ионов магния на марганец приводит к восстановлению координации и, следовательно, восстановлению активности молекулы. Если координация ионов магния важна при отборе фосфатных остатков в процессе реконструкции, то введение в реконструкционную смесь ионов марганца должно приводить к снижению или снятию эффекта. Однако, в нашем случае замена ионов магния на ионы марганца не привела к изменению спектра интенсивности полос в геле. Это свидетельствует о том, что отбираемые фосфатные участки, по-видимому, участвуют не в координации с ионами двухвалентных металлов, а важны для формирования третичной структуры молекулы 5S рРНК в составе рибосомы. Из процесса реконструкции 50S субчастицы или 70S рибосомы в значительной степени исключаются молекулы 5S рРНК содержащие тиофосфатные остатки в положениях G9, Al5, Cl9, С28, А29, U32, А50, А57, G54, С62, С63, G64, G72, U80, G81, G96, G98, А99, U103. Наличие тиофосфатных остатков в положениях С36, С37, А39, G44, G56 способствует преимущественному включению таких молекул 5S рРНК в рибосому. Данные остатки могут играть существенную роль в формировании пространственной структуры молекулы 5S рРНК. Набор отбираемых фосфатных или тиофосфатных остатков практически не различается для 50S субчастиц и 70S рибосом (рис.20).

Количество защищенных тиофосфатных остатков существенно возрастает при переходе от комплекса с рибосомными белками к 50S субчастице или 70S рибосоме. Данные суммированы на рис.20. Это свидетельствует о том, что в составе рибосомы существенно большее число фосфатных остатков вовлечены в различного рода взаимодействия. При этом значительная часть фосфатных остатков, защищенных в комплексе с тремя белками, остается защищенной и в рибосоме (А34, А73, U80, U82, А99). Некоторые защиты (U22, A3 9) пропадают в рибосоме, что свидетельствует о дальнейшей конформационной перестройке молекулы 5 S рРНК в составе рибосомы.

Наиболее сильная защита в 5S рРНК в составе 50S субчастицы

наблюдалась для тиофосфатных остатков U83, U84 (спираль IV). Тиофосфаты, защищенные слабо или умеренно, образуют районы, распределенные по всей молекуле 5S рРНК.

Несколько тиофосфатных остатков в молекуле 5S рРНК при включении ее в рибосому становятся более доступными атаке иодом (С26, С36, С37, С42, А78). Они расположены в петлях 5S рРНК. Увеличение доступности тиофосфатных остатков свидетельствует о локальном изменении конформации сахарофосфатного остова молекулы РНК на данном участке Такие коцформационные изменения кепи РНК могут быть вызваны как связыванием белка, так и изгибом цепи сахарофосфатного остова молекулы РНК при формирования сс третичной структуры.

При переходе к 70S рибосоме происходи! некоторое изменение спектра защит (рис.20). Появляются новые защшцетше остатки (С38, А46, U48, U55, U74, С70, С71) и усиливается интенсивность ранее существовавших в 50S субчастице защит (U40, С62, С63, G79, U80, U82, А101, G102). За исключением одного (U55, рис.18, дорожка U5), все перечисленные выше фосфатные остатки расположены в пределах районов, защита фосфатных остатков в которых была уже обнаружена в 50S субчастице (рис.20). Таким образом, 'эти районы становятся менее доступными атаке иодом в 70S рибосоме, что свидетельствует о более прочных взаимодействиях 5S рРНК с компонентами рибосомы в составе 70S рибосомы. Тиофосфатный остаток U55 был полностью доступен атаке иодом в составе 50S субчастицы и становится наиболее сильно защищенным в 70S рибосоме. Он расположен вне участков повышенной защиты 5S рРНК в составе 50S субчастицы и 70S рибосомы (в данной области обнаружены только 3 слабозащшцснных остатка). Это дает нам основания предполагать, что данный тиофосфатный остаток защищается 30S субчастицсй рибосом и, следовательно, расположен в области контакта большой и малой субчастиц в рибосоме.

Таким образом, большинство наблюдаемых эффектов связано с конформациошюн перестройкой 50S субчастицы в составе рибосомы. При этом несколько слабозащшцеиных фосфатных остатков (G13, G16, С35, А50) становятся доступными атаке иодом. Доступность тиофосфатных остатков СЗб, С37, С42 и А78, которая была повышена в 50S субчастице, становится такой же как в растворе, однако появляются три новых фосфатных остатка с повышенной доступностью (G54, G85, G86). Следует отметить, что тиофосфатный метод действительно позволяет исследовать структуру РНК с нукдеотидным разрешением, а перечисленные выше эффекты не связаны с простым экранированием 5S рРНК рибосомой от действия иода: в ряде случаев фосфатные остатки соседних нуклеотидов обладают

противоположной реакционной способностью. Например, фосфатные остатки U55 и G84 полностью защищены от действия иода, а фосфатные остатки U54 и G85 обладают повышенной доступностью.

Изучение 5S рРНК тиофосфатным методом в составе тройного, пре- и посттранслокационных комплексов показало схожесть спектров защит 5S рРНК в функциональных комплексах и 70S рибосоме, что свидетельствует об отсутствии сильных конформационных изменений в структуре 5S рРНК на разных этапах трансляции.

5.3. Модель пространственной организации молекулы 5S рРНК в рибосоме.

5S рРНК расположена в центральном протуберанце большой субчастицы рибосомы. По данным иммунной электронной микроскопии ее 5'-и З'-концы (сближенные за счет образования двойной спирали I) и С-петля (нуклеотиды А39, U40) расположены на тыльной стороне центрального протуберанца (рис.21), а расстояние между ними составляет около 50А (Sliatsky et al. FEBS Lett. 1980, v. 121, pp.97-100, Evstafieva et al. FEBS Lett. 1985, v.185, pp.57-61). Наши данные фотоаффинного химического сшивания позволили локализовать петлю D в непосредственной близости от пептидил-трансферазного центра рибосомы, расположенного в основании центрального протуберанца. Таким образом, ветвь 5S рРНК, образованная спиралью V. петлей Е, спиралью IV, петлей D направлена к основанию центрального протуберанца (рис.21). На электронномикроскопической модели 50S субчастицы, полученной с разрешением около 20 А, можно выделить структурный элемент, по размерам соответствующий двойной спирали РНК, который, по-видимому, представляет собой ветвь V-E-IV-D молекулы 5S рРНК.

Ветвь 5S рРНК, образованная спиралью II, петлей В, спиралью III, петлей С, не может разместиться в центральном протуберанце рибосомы в развернутом виде, поэтому предполагается, что в составе рибосомы она должна быть изогнута. Согласно данным, полученным тиофосфатным методом, в формирование данного изгиба вовлечена петля В (рис.20). В петле В расположен нуклеотидный остаток U55, который может контактировать с малой субчастицей рибосом. Согласно результатам электронной микроскопии высокого разрешения, данный контакт образует "голова" малой субчастицы рибосом и вершина центрального протуберанца большой субчастицы рибосом (рис.21). Рядом с U55 в петле В расположен фосфатный остаток G54, обладающий повышенной доступностью к действию иода. В противоположной цепи петли В расположен фосфатный остаток С26, также обладающий повышенной реакционной способностью. Кроме того, в петле В

Рисунок 21. Модель расположения 5S рРНК в 70S рибосоме.

расположен кластер фосфатных и тиофос-фатных остатков, отбирающихся в процессе реконструкции рибосомы (рис.20).

Перечисленные выше данные, а также результаты исследования конфор.мацин сахарофосфатного остова молекулы 5S рРНК, полученные тнофосфатным методом, использовались для построения компьютерной модели пространственной организации молекулы 5S рРНК в рибосоме.

Для построения модели применялась компьютерная программа "ERNA-3D". разработанная п Макс-11.таак-Ннституте Молекулярной Генетики в Перлине Результат компькнерного моделирования представлены на рис 22. Видно, что спираль Iii поверниа относительно остальной молекулы таким образом. чп> расстояние между петлей С и 3',5'-копцом молекулы составляет ^OÄ. а фосфатный остаток- U55 в однонепочечном районе пегли В находи гея на внешней стороне молекулы,

В представленной модели (рис.22) тиофосфатные остатки сильно или умеренно защищенные от расщепления (на рис 22 обозначены черным или темно-серым цветам) образуют два кластера, в которые вло.ш м слабозащищенные остатки (обозначены серым цветом). Первый кластер расположен в узле структуры и включает в себя элементы спиралей II и Ш, петель А, В, С. Данный кластер, по-видимому, представляет собой участок связывания белка 1.18 По данным химической.) и ферментативного футпринтинга. а также зашиты фосфатов, участок связывания данною белка включает в себя нуклеотидиые остатки, расположенные вдоль всей ветви А-11-B-11I-C Кроме того, по данным ЯМР-слектроскопни. для ею взаимодействия с 5S рРНК необходима целостноеib структуры молекулы.

Рисунок 22 Модель пространственной структуры 5S рРНК в рибосоме, представленная в двух ориентаниях (а, б). Положения сильно защищенных фосфатных остатков обозначены черным цветом, умеренно защищенных - темно-серым, слабо защищенных -серым. Положения фосфатных остатков с повышенной реакционной способностью заштрихованы.

Другой кластер защищенных фосфатных остатков расположен на одной стороне спирального элемента V-E-IV-D. Этот кластер, вероятно, представляет собой участок связывания белка L25, который, по разным данным, взаимодействует с этим элементом структуры 5S рРНК, причем, согласно нашим данным, это взаимодействие существенно упрочняется в рибосоме. На данной модели виден излом цепи сахарофосфатного остова в районе G85, G86, наличие которого согласуется с повышенной доступностью данных фосфатных остатков действию иода.

На модели можно выделить и защищенные тиофосфатные остатки, расположенные вне этих кластеров (G9, G10, С38, U40 и G23). Защита фосфатных остатков С38 и U40, по всей видимости, вызвана белком L5, который сшивается с этим районом 5S рРНК. Защита G9, G10 также скорее всего вызвана белком L5, поскольку защита фосфатных остатков в данном районе 5S рРНК была обнаружена в комплексе с тремя белками. Таким образом, L5 может стабилизировать пространственную структуру 5S рРНК

путем точечного взаимодействия с различными структурными элементами ее молекулы (спираль I и петля С).

Фосфатный остаток G23 слабозагцшценный как в 50S, так и в 70S рибосоме, на модели пространственной структуры 5S рРНК расположен в участке поворота цепи РНК, который находится под структурным элементом петли В, включающим U55. Это делает понятной некоторую экралированность данного фосфатного остатка.

Следует отметить, что нельзя исюночить возможность защиты некоторых фосфатных остатков 5S рРНК 23S pPIIK или другими белками большой субчастицы рибосом.

Представленная модель хорошо вписывается в модель 70S рибосомы, полученной с помощью электронной микроскопии высокого разрешения (рис.21). При этом 5-3'- конец молекулы расположен на тыльной стороне центрального протуберанца, а петля С (А39, U40) - на стороне, обращенной к L1 выступу. Нуклеотид U55 находится в области контакта большой и малой субчастиц рибосом. Структурный элемент V-E-IV-D направлен к основанию центрального протуберанца большой субчастицы рибосом.

5.4. Возможная функциональная роль молекулы 5S рРНК.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в структуре молекулы 5S рРНК не происходит сильных конформационных изменений при переходе от 70S рибосомы к различным функциональным комплексам. Данное наблюдение позволяет предположить жесткость и неизменность структуры этой молекулы на исследованных этапах трансляции. Таким образом, обсуждаемая в литературе гипотеза о том, что в процессе работы рибосомы (в претранслокационном комплексе) происходит изменение конформации 5S рРНК, в результате которого у нее появляется возможность комплементарного связывания с молекулой тРНК (Cristensen et al. Biochemistry, 1985, v.24, pp.2284-2291), кажется маловероятной.

В то же время, элементы структуры 5S рРНК сближены с важтп.тми функцнонаш.ными центрами рибосомы - пептидилтраисферазным и BF-G-доменом с одной стороны и 30S субчастицей с другой стороны. Следовательно, 5S рРНК может играть существенную роль не только в организации структуры этих функциональных центров, но и служить передаточным звеном между различными функциональными центрами рибосомы в процессе ее работы. Ясно также, что отсутствие такого звена должно приводить к инактивации рибосомы, что и наблюдалось рядом авторов.

6. Перспективы применения методов химической модификации для изучения пространственной организации и функции высокомолекулярных рибосомных РНК.

Методы химческой модификации весьма эффективны для изучения структуры и функции нуклеиновых кислот в составе сложных рибонуклеопротеидных комплексов, таких как рибосомы. При этом метод фотоаффинной химической модификации позволяет получить данные о контактах между конкретными нуклеотадными остатками различных молекул РНК. Однако, описанные выше методы основаны на статистическом введении фотоаффинной метки в молекулы РНК. Такой подход эффективен для изучения коротких молекул РНК, но при переходе к длинным молекулам рибосомных РНК его применение становится весьма затруднительным. В связи с этим возникает необходимость разработки подхода, позволяющего вводить фото-метки в определенные заранее выбранные участки рРНК. Разработка такого подхода в настоящее время является весьма актуальной, поскольку развитие методов электронной микроскопии рибосом позволяет подойти к созданию реальной модели укладки молекулы рРНК в рибосоме, лишь в том случае, если доступна информация о различных внутримолекулярных контактах рРНК. В настоящее время в нашей лаборатории ведется разработка такого подхода.

Ранее для установления контактов между отдельными участками высокомолекулярных РНК использовался метод химического сшивания с применением бифункциональных реагентов (Brimacombe et al. in: The Ribosome, Hill et al. eds, 1990, pp. 93-106). Этот подход имеет ряд существенных недостатков: бифункциональные реагенты способны реагировать только с участками рРНК, расположенными на поверхности рибосомы, а применение высоких концентраций реагентов приводит к потере биологической активности рибосом.

Предлагаемый нами метод основан на возможности реконструкции активных рибосомных субчастиц, содержащих фрагментированную в определенных участках молекулу рРНК (Afonina et al. Biochimie, 1991, v.73, pp.777-787), что позволяет ввести фогоактивированную группу в место разрыва цепи рРНК и после реконструкции получить субчастицу рибосомы, содержащую активную группу в определенном участке рРНК.

Следует отметить, что применение метода лигирования фрагментов РНК в составе гибридного дуплекса с ДНК, разработанного Мур и Шарпом для коротких РНК (Moore and Sharp, Science, 1992, v.256, pp.992-997), невозможно в случае длинных и сильно структурированных фрагментов рРНК. Такие попытки предпринимались в нашей лаборатории и в других

лабораториях мира, однако ни в одпом случае не удалось добиться дотирования фрагментов рРНК с заметным выходом. Возможность реконструкции активных рибосом, содержащих рРНК с разрывом в заранее заданном районе, позволяет избежать процедуры лигировапия.

На первом этапе возникает необходимость гидролиза молекулы рРНК по единственной заранее выбранной межнуклеотидной связи. Для этого могут быть исполъзованы два подхода. Один из них основан на применении рибозимов типа "головки молотка". Однако, как показали наши эксперименты, в случае молекул РНК с сильно развитой вторичной и третичной структурой, эффективность гидролиза таких молекул сильно зависит от положения гидролизуемой связи в молекуле рРНК и от наличия определенного триплета в последовательности РНК в данном мсстс, т.е. метод не универсален. Кроме того, фосфатный остаток остается связанным с З'-концом фрагмента в месте разрыва, что затрудняет последующее введение фотометки. Второй подход основан на гидролизе рРНК РНКазой II в присутствии олигодезоксирибонуклеотидов. Гидролиз рРНК при этом проходит практически с количественным выходом. Однако, в присутствии обычных олигодезоксирибонуклеотидов РНКаза Н вносит множествегаше разрывы в цепь РНК в пределах участка связывания олигонуклеотида. В литературе описано применение олигонутслеотидов. содержащих различные модифицированные остатки Сахаров, приводящее к повышению специфичности гидролиза. В результате совместной работы с лабораторией З.А. Шабаровой было показано, что с наибольшей специфичностью и эффективностью гидролиз молекулы ^ рРНК РНКазой II протекает в гетеродуилексе РНК с "химерными" олигонуклеотидами, состоящими из блока 4-х дезоксирибонуклсотидои на 5'-конце молекулы и блока модифицированных по 2'-положению рибозы нуклеотидных оаатков. При этом в молекуле РНК гидролизуется межнуклеотидная связь, прилегающая к РНК-ДНК гетеродуплексу (рис.23). В данной работе были использованы "химерные" олигонуклеотиды, содержащие 2'-ОМе-производтгаге нуклеотидных остатков. Длина модифицированного блока составляла 10-12 нуклеотидов. Был исследован гидролиз 16Б рРНК в присутствии пяти олигонуклеотидов, комплементарных участкам рРНК: 342-359, 548-565, 695712, 1124-1141, 1367-1384.

Положение места разрыва определяли с помощью реакции обратной транскрипции. Пример такого анализа показан на рис.23. Во всех случаях в цепь РНК вносился разрыв только по одной из межнуклеотпдпых связей (359-360, 565-566, 712-713, 1 141-1142, 1384-1385). Фрагментация РНК была исчерпывающей.

В результате гидролиза РНК РНКазой Н фосфатная группа остается на 5'-конце фрагмента в месте разрыва, а З'-конец второго фрагмента остается свободным и может быть использован для связывания с ним модифицировапного нуклеотида с помощью реакции лигирования его 5',3'-дифосфата, катализируемой Т4 РНК-лигазой.

В качестве модифицированного субстрата РНК-лигазы использовали 4-тиоуридин-5',3 '-дифосфат, который, как описано выше, эффективен в образовании сшивок как с рРНК, так и с рибосомными белками и, с другой стороны, практически не влияет на биологическую активность РНК. Кроме того, тио-группа данного нуклеотида может бьпъ использована для дальнейшего введения необходимых модификаций в молекулу рибосомной РНК.

В реакции использовали 5'-[32Р]-$ир, который был получек введением радиоактивной метки в в^Гр с помощью у-[32Р]-АТР и полинуклеотидкиназы. Наличие радиоактивной метки, связанной с фотоактивным нуклеотидом, с одной стороны, позволяет контролировать эффективность лигирования, а с другой, существенно облегчает анализ сшивок в рРНК. Оказалось, что во всех случаях введение метки на З'-конец фрагмента в месте разрыва проходило с существенно большей эффективностью, чем на З'-конец 168 рРНК. Это позволило подобрать условия лигирования таким образом, что в реакцию лигирования вступал преимущественно З'-конец фрагмента, возникающего в результате рибонуклеазного расщепления. В трех случаях (разрыв после нукпеотидов 565, 712, 1141) фрагменгарованные рРНК после введения метки сохраняли способность к реконструкции.

Для отработки методов исследования внутририбосомных контактов рРНК на первом этапе были выбраны 308 субчастицы, содержащие фотометку, связанную с положением 1141 молекулы 16Б рРНК. После облучения реконструированных 308 субчастиц мягким УФ-светом, рибосомные РНК были выделены методом фенольной депротеинизации. Анализ выделенных фрагментов рРНК позволил обнаружить сшивку между двумя фрагментами рРНК.

Таким образом, предварительные данные показывают, что разрабатываемый нами метод может быть источником информации о сближенности определенных элементов структуры длинных рибосомных рРНК в рибосоме. Если данные о топографии мРНК, тРНК, 58 рРНК позволяют получить информацию о взаиморасположении структурных элементов рРНК, сближенных с этими молекулами, то информацию о структуре участков рРНК, удаленных от районов связывания этих молекул, которые практически отсутствуют в литературе, получить другими методами весьма затруднительно.

А.

» '

В.

С.

VI

О

• •

Применение разрабатываемого метода особенно актуально для исследования структуры 235 рРНК в составе рибосомы. 23Я рРНК имеет длину около 3000 иуклеотидных остатков, и информация о контактах различных ее структурных элементов между собой весьма ограничена. Здесь существенно и то, что предлагаемый подход предполагает использовать фрагменты рРНК, уже несущие все необходимые природные модификации (минорные пуклеотидные остатки), что особенно существенно в случае 23 Б рРНК. Мы надеемся, что применение описанного выше подхода для изучения пространственной организации 238 рРНК позволит выявить Рисунок 23 Определение мест гидролиза 16Я рРНК внутримолекулярные кон-присутсшвип "химерных" хакхы в 23Я рРНК И. НС-

565

(165 гЮЧА) 3'-СССиСАШЛАООСиЛАШ-5' (оВД ЛОТЛАЦиСССАЦиЛА

712

4.

(16Я гКЫА) З'-АОСтЛООиСИАОАОАиОСви-')1 (оЬ^о) ТССАО АТ1П 1СИАС ОСА

1141

I

(16Я гЯКА) 3'-ОСССССОССТКХ}СОАССС;и-5' (011?0) ОССТОСАССОСТОССЛ

в

с

пользуя результаты электронной микроскопии высокого разрешения, позволит

РНКазой Н в

олигонуклеогидов. Дезокси-блок выделен Участки связывания олигонуклеогидов и положения мест разрыва (указаны стрелкой) приведены на схеме. А, С, О, и - сиквенсные дорожки. Х-обратная транскрипция с 168рРНК после гидролиза РНКазой Н нам подойти к пониманию в присутствии "химерного" олигонуклеотида. К - пространственной организа-обратная транскрипция с исходной 16Б рРНК. цки этой молекулы в составе

рибосомы.

Разрабатываемый нами метод фотоаффиппой химической модификации молекул рРНК потенциально эффективен и для изучения прострапственпого окружения того или иного района рибосомной РНК в процессе работы рибосомы. Мы надеемся, что данный подход позволит определить, какие именно конформационные изменения происходят в

исследуемом районе рРНК на той или иной стадии трансляции, что является необходимым для понимания молекулярного механизма работы рибосомы.

Введение тио-группы в определенные положения молекул рРНК открывает также дополнительные возможности для изучения структуры и функции этого сложного рибопуклеопротеида путем модификации тио-группы различными реагентами. Например, модификация тио-группы различными производными фенантролина позволит с помощью комплекса меди с фенантролином специфически расщепить прилегающие к этому комплексу участки сахарофосфатного остова РНК и определить, как различается спектр разрывов цепи РНК в рибосоме на разных этапах трансляции.

Наличие тио-группы позволяет также вводить флюорофоры в определенные положения рРНК как в малой, так и в большой субчастице рибосом, что открывает новые возможности для изучения быстрой кинетики нерестраивания структуры рибосомы в процессе ее функционирования. Введение в те же положения диазириновой группы, которая под действием УФ-света образует короткоживущую карбеновую частицу, способную в течение нескольких наносекунд реагировать с практически любыми группами РНК и белков, и, тем самым фиксировать возникающие контаткты, также перспективно в изучении быстрых изменений в структуре рибосомы.

Следует подчеркнуть важность полученных с помощью разработанных в работе методов данных для компьютерного моделирования третичной структуры всей молекулы рРНК в составе рибосомы.

Так, идентификация спектра контактов мРНК с компонентами рибосомы на разных этапах трансляции оказалась важной не только для понимания природы взаимодействия мРНК в декодирующем центре рибосомы. К моменту начала выполнения данной работы существовали две основные модели пространственной структуры рРНК в составе малой субчастицы рибосомы (Brimacombe et al. J.Mol.Biol. 1988, v.199, pp.115-136, Stem et al. J.Mol. Biol. 1988, v. 204, pp.447-481). Эти модели были построены на основе данных о контактах рРНК с рибосомными белками и карты пространственного расположения белков малой субчастицы рибосом, получетюй с помощью рассеяния нейтронов. В этих моделях, в частности, спирали 34 и 18 16S рРНК находились на значительном удалении друг от друга и от возможного участка связывания мРНК. В результате нашей работы было установлено, что эти спирали 16S рРНК сближены с нуклеотидами +6, +8 (спираль 34) и +11 (спираль 18), что свидетельствовало о том, что обе модели пространственной структуры рРНК были неверны. Дальнейшее развитие метода привело к идентификации еще некоторых контактов мРНК с

16S рРНК, что, совместно с данными по топографии тРНК (Brimacombe et al. in: the Translational Apparatus, Stnicnirc, Function, Regulation, Evolution. Nierhaus et al. eds. 1993, pp.433-444) и результатами электронной микроскопии рибосом, позволило подойти к созданию новой модели пространственной организации рР1Ж в составе рибосомы. Развитие же нового метода установления контактов внутри протяженных молекул рРНК позволит нам получить новые данные о структурной организации районов рРНК расположенных вдали от функциональных центров. В настоящее время отсутствие таких данных препятствует уточнению третичной структуры 16S рРНК и созданию .модели пространственной организации 23,S pPIIK в составе рибосомы.

Другим важным аспектом применения метода фотоаффиттной химической модификации является возможность установления функциональной роли того или иного пуклеотида в рРНК. Например, по данным мутагенеза спирали 34, 18 и 28 16S рРНК важны для функционирования рибосом. С помощью метода химического сшивания с использованием реагентов "нулевой длины" мы идентифицировали прямые контакты с мРНК нуклеотвдов 16S рРНК, расположенных в этих спиралях. Это дает возможность высказать предположение, что функциональная роль этих элементов заключается именно в их участии в формировании мРНК-связывающего центра рибосомы. Нуклеотид G926, сшивающийся с остатком уридина в инициаторном кодоне в составе кодон-антикодонового дуплекса, может ш-рать существенную роль в фиксации этого дуплекса в рибосоме Но данным сайт-специфического мутагенеза, делеция G926 нуклеотида приводит к ухудшению связывания тРНК с Р-участком рибосомы, по-видимому, за счет ослабления фиксации мРНК в этом центре рибосомы.

С другой стороны, данные фотоаффинного химического сшивания позволяют выявить те нуклеотидные остатки РНК, функциональная важность которых может быть затем проверена с помощью сайт-специфического мутагенеза. Так, например, изучение спектра пришивок 5S рРНК с 23S рРТТК позволило установить, что один и тот же нуклеотид образует сшивку с двумя удаленными друг от друга в первичной структуре нуклеотидами 23 S рРНК. Для того, чтобы проверить, насколько этот остаток функционально важен, был использован метод сайт-специфического мутагенеза, который подтвердил необходимость наличия пиримидинового остатка в данном положении 5S рРНК. Таким образом, фотоаффинная химическая модификация позволяет выбрать нуклеотиды для изучения их функциональной роли генетическими методами.

Использование реагентов на основе диазирина, как уже отмечалось выше, открывает новые перспективы в изучении структурных превращений в

РНП за реальные времена протекания биохимической реакции с участием РНП, поскольку время жизни карбеновой частицы, генерируемой нри УФ-облучешш диазириновой группы, существенно меньше времени протекания реакций в сложных рибонуклеопротеидных системах. Данное свойство позволяет зафиксировать с помощью химических сшивок быстропротекаюхцие конформационные перестройки в структуре РНП. Такой подход особенно важен, поскольку до настоящего времени при изучении динамики работы рибосомы, например, исследовались только отдельные устойчивые ее комплексы с лигандами.

Необходимо подчеркнуть, что разработанные нами методы применимы не только для изучения рибосом, но и для исследования других рибонуклеопротеидных объектов или функциональных молекул РНК. В последнее время эти методы стали активно использоваться для исследования компонентов сплайсосомы, механизма самосплайсинга и других реакций с участием рибозимов.

Выводы.

1. Показана возможность использования ряда производных нуклеотндных оснований РНК в качестве фотоаффинных реагентов для изучения контактов РНК с компонентами сложных рибонуклеопротеидных систем. Разработаны методы точного определения нуклеотндных остатков, принимающих участие в образовании сшивок между молекулами РНК различной длины.

2. С помощью метода фотоаффинного химического сшивания изучены контакты нуклеотндных оснований мРНК как с нуклеотидными остатками 1рРНК, так и с рибосомнымн белками в различных функциональных комплексах, отражающих основные этапы трансляции. С помощью тиофосфатного метода изучены контакты сахарофосфатного остова молекулы мРНК с рибосомой.

3. Предложена молекулярная модель пространственной организации мРНК-связывающего центра рибосомы.

4. Показана применимость метода фотоаффинной химической модификации и тиофосфатного, основанных на статистическом введении модифицированных звеньев в цепь РНК, для изучения структуры и топографии 5 Б рРНК в рибосоме.

5. Методом фотоаффинной химической модификации выявлен контакт одного пуклеотидного основания 55 рРНК с двумя основаниями 235 рРНК, расположенный в непосредственной близости от двух функциональных петров рибосомы: пептидилтрансферазного и центра связывания фактора элонгации (т Высказаны предположения о возможной функциональной роли молекулы 58 рРНК в работе рибосомы.

6. Изучены структурные особенности сахарофосфатного остова молекулы 58 рРНК в составе рибосомы и контакты се фосфатных остатков с рибосомой на разных этапах трансляции.

7. Предложена модель пространственной структуры 5 Б рРНК в составе рибосомы и ее локализации в центральном протуберанце большой субчастицы рибосом.

8. Разработан мешд селективного введения модифицированного пуклеотидного остатка в определенные заранее заданные положения длинных молекул рибосомных РНК. Показана возможность реконструкции рибосомных субчастиц, содержащих фрагмент и роваиную модифицированную рРНК, и образования химических сшивок между различными фрагментами РНК.

Список основных публикаций по теме диссертации.

Обзоры.

1. Bogdanov A., Dontsova О., Brimacombc R. Messenger RNA path through the prokaryotic ribosome. 1993. The translational apparatus. Eds. K. Nierhaus et al. Plenum Press. New-York.

2. Богданов A.A., Лаврик И.Н., Докудовская C.C., Донцова O.A. Структура 5S рРНК в рибосоме. 1995. Молекуляр. биология, т.29. с.1218-1227.

3. Дабровски М., Юиеманн Р., Шафер М.А., Шпал К.М.Т., Ниерхаус К.Х., Алексеева Е.В., Донцова O.A., Шпанченко О.В., Богданов A.A. Фосфатные остатки РНК-лигандов, взаимодействующие с рибосомой на различных стадиях трансляции. Изучение с помощью тиофосфатного метода. 1996. Биохимия, т.61, с.1971-1982.

Статьи в научных журналах.

4. Донцова O.A., Копылов A.M., Богданова C.JI. Синтез в клетках E.coli коротких РЖ, закодированных в плазмидах. 1989. Биохимия, т. 54, с. 870877.

5. Донцова O.A., Ефимов A.B., Копылов A.M. Изучение 5S рРНК-белкового комплекса Escherichia coli с помощью модификации карбодиимидом. 1990. Биологические науки, т.314, с.22-30.

6. Донцова O.A., Богданова С.Л., Розен К.В., Скрябин Г.А., Скрипкин Е.А., Копылов A.M., Богданов A.A. Фотоаффинная модификация малой субчастицы рибосом E.coli диазирильными производными мРНК. 1990. Докл. АН СССР, т.313, с.730-733.

7. Dontsova О., Kopylov A., Brimacombe R. The location of mRNA in the ribosomal 30S initiation complex; site-directed cross-linking of mRNA analogues carrying several photo-reactive labels simultaneously on either side of the AUG start codon. 1991. EMBO J. v.10, pp.2613-2620.

8. Dontsova O., Dokudovskaya S., Kopylov A., Bogdanov A., Rinke-Appel J., Junke N. and Brimacombe R. Three widely separated positions in the 16S RNA lie in or close to the ribosomal decoding region; a site-directed cross-linking study with mRNA analogues. 1992. EMBO J. v.ll, pp.3105-3116.

9. Dontsova O., Rosen K., Bogdanova S., Skripkin E., Kopylov A., Bogdanov A. Identification of the Escherichia coli 30S ribosomal subunit protein neighboring mRNA during initiation of translation. 1992. Biochimie. v.74, pp.363-371.

10. Rinke-Appel J., Junke N., Brimacombe R., Dokudovskaya S., Dontsova O. and Bogdanov A. Site-directed cross-linking of inRNA analogues to the 16S ribosomal RNA; a complete scan of cross-links from all positions between +1

and +16 on the mRNA, downstream from the decoding site. 1993. Nucleic Acids Res. v.21, pp.2853-2859.

11. Dokudovskaya S., Dontsova O., Bogdanova S., Bogdanov A. and Brimacombe R. niRNA-ribosomc interactions. 1993. Biotechnol.Appl.Biochem. v.18, pp.149-155.

12. Dontsova 0., Tishkov V., Dokudovskaya S., Bogdanov A., Döring Т., Rinke-Appel J., Thamxn S., Grcuer B. and Brimacombe R. Stein-loop IV of 5S ribosomal RNA lies close to the peptidyltransferase center. 1994. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. v.91, pp.4125-4129.

13. Rinke-Appel J., Junke N., Brimacombe R., Lavrik I., Dokudovskaya S., Dontsova O. and Bogdanov A. Contacts between 16S ribosomal RNA and mRNA, within the spacer region separating the AUG initiator codon and the Shine-Dalgarno sequence; a site-directed cross-linking study. 1994. Nucleic Acids Res. v.22, pp.3018-3025.

14. Богданова СЛ., Дегтярев А.И., Баранов П.В., Докудовская С.С.,Лаврик И.Н., Донцова O.A., Орецкая Т.С., Крынецкая Н.Ф., Шабарова З.А., Богданов A.A. Направленное разрезание молекул 16S рРНК по единичной межнуклсотидной связи. 1995. Биохимия, т.60, с.297-306.

15. Bogdanov A., Lavrik Т., Dokudovskaya S., Dontsova О., Structure and function of 5S rRNA in the ribosome. 1995. Biochemistry and Cell Biology. v.73, pp.869-876.

16. Dokudovskaya, S., Dontsova, ()., Shpanchenko, O., Bogdanov, A., Brimacombe, R. Loop IV of 5S Ribosomal RNA lias contacts both to Domain II and to Domain V of the 23S RNA. RNA, 1996. v.2, pp. 146-152.

17. Shpanchenko O.V., Zvereva M.I., Dontsova O.A., Nierhaus K.H., Bogdanov A.A. 5S rRNA sugar-phosphate backbone protection in complexes with specific ribosomal proteins. 1996. FKBS Lett, v.394, pp.71-75.

18. Alcxeeva E., Shpanchenko O., Dontsova O., Bogdanov A., Nierhaus K. Interaction of mRNA with the Escherichia coli ribosome: accessibility of phosphorothioate containing mRNA bound to ribosomes for iodine cleavage. 1996. Nucl. Acids Res. v.24, pp.2228-2235.

Тезисы докладов.

19. Копылов A.M., Скринкин F.А., Богданова СЛ., Донцова O.A., Богданов A.A. Экспрессия коротких РНК с плазм ид в Е.соИ. Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы докладов. Москва. 1986. т.2, с.432-433.

20. Скрипкин Е.А., Балакин А.Г., Донцова O.A., Богданова C.JL, Копылов A.M., Шатский И.Н., Богданов A.A. Подходы к дизайну мРНК. Всесоюзная конференция "Новые направления в биотехнологии". Пущино, 1988. Тезисы докладов, с.105-106.

21. Kopylov А.М., Dontsova O.A., Rosen К.V., Bogdanova S.L., Skripkin E.A., Skrjabin G.A., Balakin A.G., Evstafieva A.G., Shatsky I.N., Bogdanov A.A. Efficiency of translational initiation of prokaryotic mRNA. 3rd Cuban and International Seminar on Biotechnology, 1st Iberoamerican Congress on Biotechnology. Habana, Cuba. 1989, p.7-10.

22. Skripkin E.A. Dontsova O.A., Rosen K.V., Bogdanova S.L., Kopylov A.M., Bogdanov A.A. Upon location of mRNA initiation signals on prokaryotic ribosomes. EMBO/FEBS/IUB Advanced course "Mechanism and control of translation", the Netherlands, p.62.

23. Донцова O.A., Розен K.B., Скрипкин E.A., Копылов A.M. Модификация рибосом E.coli фотоаффинными производными мРНК. IV Всесоюзная школа-семинар "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии". Рига. 1990. Тезисы, с.29.

24. Dontsova O.A., Dokudovskaya S.S., Kopylov A.M., Bogdanov A.A., Brimacombe R. Cross-linking of thio-U-mRNA analogues to the E.coli ribosomes. Abstract of the lectures and posters presented at the International Conference on the protein biosynthesis. Pushchino. 1991. p.71.

25. Rinke-Appel J., Junke N., Brimacombe R., Dontsova O., Dokudovskaya S., Bogdanov A. The path followed by messenger RNA through the bacterial ribosome; a site-directed cross-linking study. Cold Spring Harbor, New-York. 1992. p.287.

26. Dontsova O., Dokudovskaya S., Kopylov A., Bogdanov A., Brimacombe R. Contacts between mRNA and the ribosome: a cross-linking study. International conference on The Translational Apparatus. Berlin. 1992. Abstract book. p. 122.

27. Dontsova O., Dokudovskaya S., Bogdanova S., Baranov P., Lavrik I., Brimacombe R., Bogdanov A. Intraribosomal RNA-RNA interactions; a photoaffinity cross-linking study. Abstract of papers presented at 1994 meeting on Translational Control. Cold Spring Harbor. New-York. p.62.

28. Bogdanov A., Dontsova O., Rinke-Appel J., Dokudovskaya S., Lavrik I., Alekseeva E., Shpanchenko O., Sergiev P., Baranov P., Shirokova E., Nierhaus К., Brimacombe R. Thio-substituted derivatives of RNA: application in protein biosynthesis studies. 1995. Nucleic Acids Symp. Series, pp.273-274.

29. Bogdanov A., Dontsova O., Rinke-Appel J., Dokudovskaya S., Lavrik I., Alexeeva E., Shpanchenko 0., Sergiev P., Nierhaus K.H., Brimacombe R. Thio-substituted derivatives of RNA: Application in protein biosynthesis studies.

Third international symposium on bioorganic chemistry. Dagomys. Russia. 1995. Abstract book. p.4.

30. Bogdanov A., Dontsova O., Dokudovskaya S„ Shpanchenko O.

Brimaconibe R. 5S rRNA topography in the ribosome. Frontiers in translation. An International Conference on The Structure and Function of the Ribosome. Victoria. Canada. 1995. Abstract book. p.61.

31. Dontsova O., Dokudovskaya S., Lavrik I., Baranov P., Sergiev P., Bogdanova S., Bogdanov A., Rinke-Appel J., Rrimacombe R. RNA-KNA interactions in the prokaryotic ribosome; a cross-linking study. Frontiers m translation. Program and Abstracts of the reports. p.VI-3

32. Dontsova 0., Dokudovskaya S., Baranov P., Sergiev P., Shpanchenko O. Brimacombe R. rRNA contacts inside the ribosome: cross-linking study RNA'96. The first annual meeting of the RNA society. Madison. USA. 1996. Abstract book, p.175.