Структурно-функциональный анализ нового белка хампина как компонента ядерного интерактома тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М М. ШЕМЯКИНА И Ю А ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

ДМИТРИЕВ РУСЛАН ИГОРЕВИЧ

Структурно-функциональный анализ нового белка хампина как компонента ядерного интерактома

02 00 10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

III

003164Э51

Москва - 2008

Работа выполнена в группе мембранных биоэнергетических систем Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель

кандидат химических наук

Н Б Пестов

Официальные оппоненты.

член-корр РАН, доктор химических наук доктор химических наук

А Г Габибов ТВ Демидкина

Ведущая организация

Институт биологии гена РАН

Защита состоится «5» марта 2008 г в 10 часов на заседании специализированного диссертационного совета при Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН по адресу 117997, ГСП-7, г Москва, В-437, ул Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан « 4 » февраля 2008 г Ученый секретарь

Диссертационного совета доктор физ -мат наук

В А Олейников

Актуальность проблемы Создание полных карт взаимодействий между биомолекулами (например, белками) является одним из главных подходов в изучении принципов функционирования живого организма в наши дни Данная информация важна как с точки зрения фундаментальной науки, так и с точки зрения практических приложений, в особенности, для медицины Для решения этой задачи принято использовать высокопоточные методы анализа структурных компонентов живой клетки и организма в целом К таким методам в нашу «постгеномную эру» следует отнести анализ протеомов организмов, изучение совокупности всех белок-белковых взаимодействий в рамках конкретного протеома, называемой термином «интерактом», а также ряд других - изучение «метаболома», «деградома» и прочих Несмотря на достаточно глобальный характер этой задачи, уже сейчас можно утверждать, что она не является невыполнимой Развитие методов в изучении белок-белковых взаимодействий уже позволяет аннотировать предварительные карты белковых взаимодействий целых организмов, например, полные для дрожжей или частичные для человека В то же время, учитывая специфические особенности отдельных белков, в картах интерактомов будут оставаться «темные пятна» В таких случаях основная надежда остается на усилия небольших групп ученых, применяющих низкопоточные методы, и решающих такие проблемы применительно к особенностям индивидуальных белков Не следует также забывать, что важным критерием характеристики взаимодействия между белками является его функциональная значимость Для решения таких задач пока еще не существует универсальных высокопоточных подходов

Ранее в нашей лаборатории был идентифицирован фрагмент белка, кодируемого геном мыши 4121402D02Rik, как возможный партнер бета-субъединицы семейства Х,К-АТФаз ßM в бактериальной двугибридной системе Анализ консервативности данного гена у млекопитающих показал, что кодируемые им белки у млекопитающих имеют высокую степень гомологии 100% идентичности первичной структуры между белками человека и шимпанзе и 95% идентичности между белками человека и мыши В то же время, анализ баз данных маркеров экспрессируемых последовательностей указывал на существование альтернативного сплайсинга первичного транскрипта данного гена Функция этого нового белка, названного нами «хампином», была неизвестной Единственной работой, в которой выдвигались предположения о возможной функции хампина, была работа Марина (Marin, 2003), в которой он показал, что хампин - это отдаленный гомолог хорошо изученного белка дрозофилы, белка MSL1 Последний является компонентом рибонуклеопротеидного комплекса MSL (синонимы - «компенсасома», «комплекс компенсации дозы гена» DCC), участвующего в реорганизации структуры хроматина у самцов мух рода Drosophila, и избирательно повышающего его активность в 2 раза, по сравнению с Х-хромосомами самок

(Lucchesi, 2005) Современные данные о механизме работы компенсасомы дрозофил позволяют утверждать, что белок MSL1 является структурным компонентом комплекса, важным для корректной ассоциации компенсасомы со специфическими участками хроматина С другой стороны, млекопитающие не используют компенсасомы для компенсации дозы гена Поэтому гомология между хампином и белком MSL1 может быть причиной их общих функций, сохранившихся в процессе эволюции и, по-видимому, связанных с консервативными механизмами реорганизации структуры хроматина применительно к регуляции экспрессии генов

Учитывая интерес, который вызывают в настоящее время исследования в области механизмов регуляции экспрессии генов, мы решили сфокусировать свое внимание на изучении структуры и функции нового белка хампина Данная работа представляется актуальной как с точки зрения изучения свойств данного белка, так и с точки зрения развития методологии изучения новых, ^охарактеризованных белков протеома млекопитающих

Цели и задачи исследования Целью данной работы было изучение свойств и особенностей хампина млекопитающих применительно к его роли в глобальном интерактоме млекопитающих Поэтому в ходе настоящей работы предполагалось решить следующие задачи

1 Изучить первичную структуру изоформ хампина в модельном организме мыши, а также характер их распределения в различных тканях

2 провести сравнение первичных структур гомологов хампина у других организмов и выяснить, какие из участков его первичной структуры подверглись наибольшим изменениями в процессе эволюции, а какие являются наиболее консервативными

3 определить внутриклеточную локализацию изоформ хампина в организме мыши и выяснить, какими участками его структуры она обеспечивается

4 с помощью дрожжевой двугибридной системы провести поиск белок-белковых взаимодействий хампина в организме мыши

5 подтвердить взаимодействия, идентифицированные в дрожжевой двугибридной системе, с помощью альтернативных методов - связывания in vitro, ко-локализации в клетке или функционально

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы нами было впервые изучено разнообразие изоформ хампина в организме мыши, образующееся в результате альтернативного сплайсинга кодирующей мРНК Интересной особенностью оказалось, что разные изоформы белка являются результатом использования разных комбинаций экзонов

На основании сравнения первичных структур хампина и его гомологов в организмах животных мы показали, что гены, кодирующие белки данного семейства, присутствуют у членистоногих и позвоночных животных, но не обнаруживаются у круглых червей и представителей других царств эукариот - растений и грибов С помощью обратной транскрипции - ПЦР мы показали, что отдельные изоформы хампина содержатся во всех тканях, тогда как по крайней мере две из его изоформ специфичны для семенников Мы также изучили внутриклеточную локализацию всех изоформ хампина в организме мыши Оказалось, что все они имеют ядерную локализацию Сравнительный анализ структуры изоформ показал, что в молекуле хампина имеет место существование по крайней мере двух сигналов ядерной локализации - одного, неизвестного ранее и присущего всем изоформам хампина, и другого, который содержится в последовательности высоконсервативного домена РБНВ и, вероятно, функционирует как добавочный Мы показали, что, как и MSL1 дрозофилы, хампин млекопитающих способен взаимодействовать с ацетилтрансферазой гистонов семейства MYST1 через свой высококонсервативный домен РЕНЕ Таким образом, одной из его консервативных функций является взаимодействие с ацетилтрансферазой гистонов MYST1, важной для ацетилирования гистона Н4 по остатку К16 как у млекопитающих, так и дрозофилы С помощью дрожжевой двугибридной системы мы открыли ряд новых взаимодействий хампина, неизвестных для его гомолога MSL1, и связывающих его функцию с регуляцией активности ДНК-полимеразы альфа (р180) и некоторых белков-супрессоров опухолей Большинство открытых взаимодействий было подтверждено с помощью аффинной хроматографии В ходе проведения данных экспериментов была разработана новая система гибридных белков, позволяющая иследовать белок-белковые взаимодействия т vitro Дополнительно, в ходе работы был проведен структурно-функциональный анализ некоторых малоизученных белков-партнеров хампина и MYST1 ТТС4, NOP17, ТТС35 и его партнера RASSF1C

В целом полученные результаты позволяют реконструировать фрагмент интерактома млекопитающих, содержащий в своем центре белок хампин и указывают на то, что он является важным компонентом некоторых сигнальных путей, происходящих в клеточном ядре В то же время, сложность структуры узла интерактома применительно к отдельно взятому белку показывает, насколько мало изучены в наше время такие процессы как регуляция транскрипции РНК-полимеразой II или ацетилирование гистонов Безусловно, данные результаты являются дополнительным стимулом в изучении интерактома млекопитающих

Стоит отметить, что выполненная работа представляет не только теоретический, но и практический интерес полученные данные проливают свет на аспекты функционирования жизненно важных систем клетки, имеющих нарушенную функцию в ходе злокачественной трансформации Так, недавно было обнаружена взаимосвязь между функцией белка MYST1 и трансформацией клеток (Fraga, 2005), запуском ATM-зависимых сигнальных каскадов в ответ на повреждение структуры геномной ДНК (Gupta, 2006), а также его роль в регуляции супрессорной активности широко известного белка р53 (Sykes, 2006) С другой стороны, функция белков RASSF1C и ТТС4 в механизмах супрессии опухолей остается малоизученной в наши дни Очевидно, что открытие новых функциональных взаимосвязей для всех этих белков является важной вехой в изучении их функции и, как следствие, в разработке новых средств терапии рака

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на VIII-x чтениях, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова (Москва, Россия, 2006), 1-ой международной конференции молодых ученых «Биология от молекулы до биосферы» (Харьков, Украина, 2006), международной конференции «Экспериментальная биология -2007» (Вашингтон, США, 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ - 3 статьи в реферируемых журналах и 5 в сборниках тезисов

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав основной части (литературный обзор, результаты и обсуждение, экспериментальная часть), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 145 ссылок Материал проиллюстрирован 37 рисунками и 4 таблицами

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение первичной структуры хампина мыши, ее филогенетический анализ и определение тканевой специфичности экспрессии его изоформ

В базах данных нуклеотидных последовательностей нами был обнаружен ген, кодирующий белок мыши, включающий идентифицированный нами фрагмент хампина Этот ген, в настоящее время условно называемый 4121402D02Rik, расположен на хромосоме 11 (llqD) Его последовательность включает в себя 10 интронов и 11 экзонов, а его протяженность составляет около 10 т п о

При анализе баз данных маркеров экспрессируемых последовательностей (EST) мы обнаружили по крайней мере четыре варианта мРНК мыши, кодирующие полипептиды разной длины и являющиеся, по-видимому, продуктами альтернативного сплайсинга первичного транскрипта гена хампина На основании предполагаемого числа аминокислотных остатков в белковых продуктах этих мРНК нами предложена следующая номенклатура хампин А (экзоны 1, 3, 4, 6-11, 616 а о), хампин В (экзоны 1, 3, 4, 7-11, 600 а о), хампин С (экзоны 1, 3-5, 463 а о ) и хампин D (экзоны 2-4, 7-11, 370 а о) С помощью ОТ-ПЦР (см рис 3) мы обнаружили также существование новой изоформы хампина, Е, (кодируемой экзонами 2, 4-5, 233 а о), чья последовательность была позднее депонирована нами в базу данных GenBank (ABD46887) Анализ первичной структуры белка хампина (изоформа А) с помощью программы MotifScan обнаружил наличие следующих участков так называемого FHA-участка (Forkhead-associated), двусоставного сигнала ядерной локализации NLS BP (Bipartite Nuclear Localization Signal) в его С-концевой последовательности, Рго-богатого региона низкой сложности, почти полностью занимающего N-концевую часть молекулы, и региона coiled-coil, богатого остатками Leu и Gin Наиболее протяженные хампины А и В содержат все вышеуказанные структурные компоненты, а укороченные с С-конца варианты С и Е не содержат FHA-участок и сигнал ядерной локализации Укороченные с N-конца разновидности D и Е имеют только небольшой фрагмент coiled-coil и не имеют Рго-богатого региона

Нами был проведен тщательный поиск ортологов хампина в базах данных геномных и экспрессированных последовательностей, что позволило реконструировать почти полноразмерные аминокислотные последовательности хампинов курицы (Gallus gallus), лягушки (Xenopus laevis), некоторых рыб рыбы-зебры (Danto reno), форели (Oncorhynchus myhss), иглобрюха (Tetraodon nigroviridis), а также пчелы (Apis mellifera) и отдельные участки хампина малярийного комара (Anopheles gambiae) Множественное выравнивание последовательностей хампина однозначно выявляет два весьма консервативных участка - в coiled coil регионе и домене РЕНЕ Нам не удалось обнаружить гомологичных по отношению

к хампину мыши последовательностей в геномах бактерий, простейших, грибов, растений и низших животных, таких как круглые черви (СаепогИаЬсИИя е1е%апз). Все эти факты, в особенности отсутствие гена хампина у С. elegans позволяют выдвинуть гипотезу об эволюционном происхождении хампина примерно во время отделения ветви истинновторичнополостных животных (Сое1оша1а), у которых он в настоящее время и обнаруживается. Анализ первичных структур белков МБЬ1 и хампина позволил нам выдвинуть гипотезу о том, что ген т$1-1 произошел от гена хампина путем добавления дополнительных экзонов и интенсивной мутации всей новообразованной последовательности.

Рис. 1. Родословное древо белков хампин-MSLl-NSLl, построенное на основании сравнения первичных структур гомологов хампина из разных организмов. Для выравнивания аминокислотных последовательностей использовали программу ClustalW ¡"http: f/w w' w. е b ¡. а с. u k/c 1 и s t a I w/ !. дерево строили с помощью программы Treeview 1.6.6. {"http://taxonomv.zoologv.gia.ac.uk/rod/treeview.html). Обозначения: Apis -пчела, Aedes, Anopheles - комар, Drosophila - плодовая муха, Telraodon, Fugu - рыба-иглобрюх, Danio - рыба-зебра, Gallus - курица, Xenopus - лягушка, Mus - мышь, Homo - человек.

Сравнение последовательностей хампина, анализ консервативности и предсказание структурно-функциональных элементов дают основания для выделения четырех структурных доменов в молекулах протяженных разновидностей (А и В) хампинов позвоночных (рис. 2): домен I - богатый Pro, чрезвычайно вариабельный, последовательность низкой сложности; домен Нее - короткий консервативный домен, представляющий собой coiled-coil регион); домен III - умеренно консервативный; домен IVpehe - консервативный, содержит сигнал ядерной локализации NLS BP и FHA-участок.

Apis hampln

Xenopus

Gallus haï Homo har

Drosophila NSL1

I \ Нее III 1 ¡V роЬе 616

(ХР 999155) [ГУ—-'] Д.Я 600

8?Я&п Р~~Т~ ИЖ^П 463

хампин В I I |>. 37(1

(ВАВМК31 Ц_I_I :

Л-ЕГВД 1 233

Рис. 2. Первичная структура изоформ хампина мыши. Вверху - схематично представлены структуры всех изоформ мыши (разные домены окрашены в разные цвета). Справа указано число аминокислотных остатков, составляющих ту или иную изоформу белка. Внизу представлена более подробная первичная структура.

Для определения тканевой специфичности продуктов альтернативного сплайсинга гена хампина мы провели анализ содержания различных вариантов мРНК хампина в тканях мыши с помощью полимеразной цепной реакции после реакции обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Для этого использовались праймеры, позволяющие выявить различные продукты сплайсинга. В качестве положительного контроля были выбраны праймеры, специфичные к кДНК глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ОАРОН). Результаты анализа ряда тканей новорожденной и взрослой мыши (рис. 3), показывают, что мРНК, кодирующие хампин А, В и С, присутствуют во всех исследованных тканях. Таким образом, данные ОТ-ПЦР показывают, что мРНК хампинов А, В и С присутствуют во всех исследованных тканях мыши, причем не обнаруживается зависимости уровня экспрессии гена от возраста организма (рис. 3). Два других продукта сплайсинга мРНК, соответствующие хампинам Б и Е, обладают высокой тканевой специфичностью и обнаружены исключительно в семенниках. Любопытно, что оба эти полипептида содержат Ы-концевую последовательность, которая кодируется экзоном 2, а не экзоном 1, в противоположность хампинам А, В и С, не имеющим строгой тканевой специфичности. Логично предположить, что в семенниках хампин выполняет какую-то специфическую функцию.

Рис. 3. Анализ тканевой специфичности экспрессии гена хампина в организме мыши. Приведены результаты электрофоретического анализа продуктов ОТ-ПЦР в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для изоформ А и В использовали одну пару праймеров, различая продукты по электрофоретической подвижности (разница 48 и.о.).

Бактериальная продукция фрагментов хампина и получение специфических антител

Следующей задачей данной работы стало получение антител к хампину - как поли-так и моноклональных, с целью детекции интактного белка в образцах тканей мыши и, возможно, других млекопитающих. Было решено использовать в качестве антигена препараты белка, полученные с помощью продукции в бактериях. Успешным оказалось получение рекомбинантных фрагментов белка хампина - РНАМ (фрагмент Е266-К616 хампина А) и 1ШАМ (фрагмент Ь259-А463 хампина С); открытые рамки считывания этих полипептидов были успешно амплифицированы с помощью ПЦР и затем клонированы в плазмидные ДНК рС)Е30, позволяющие осуществлять бактериальную продукцию интересующего полипептида с Ы-концевой гексагистидиновой последовательностью.

В результате иммунизации кроликов полипептидом 1)НАМ нами были получены специфические поликлональные антитела к хампину мыши, а с помощью слияния клеток миеломы со спленоцитами мыши было получено несколько гибридомных клонов, два из которых секретировали специфические антитела к антигену иНАМ - клоны ХВ7 и ZB2. Гибридомная линия ZB2 привлекла наибольший интерес, поскольку антитела, секретируемые ею, способны распознавать антиген в условиях иммуноблотинга. Эпитоп данного антитела был позднее картирован нами благодаря использованию укороченных фрагментов молекулы хампина - он находится в координатах Ь259-К332 молекулы хампина А.

Изучение внутриклеточной локализации изоформ хампина и картирование участков, содержащих сигналы ядерной локализации

Для выяснения внутриклеточной локализации белка хампина было решено использовать такие подходы как использование химер с флуоресцентными белками и иммунофлуоресценцию. Поскольку получение антител, специфичных ко всем пяти известным изоформам хампина представляется невозможным (например, антитело, специфичное к изоформе О, но не распознающее изоформы А-С, будет взаимодействовать и с изоформой Е и т.д.), то метод использования химер изоформ хампина с флуоресцентными белками является достаточно привлекательным для изучения внутриклеточной локализации изоформ в клеточных линиях.

Интересно, что изоформы хампина, имеющие в своей структуре домен 1УреЬе, обладают сигналом ядерной локализации ТЧЬЭ ВР, в то время как изоформы С и Е не имеют таких сигналов в своей последовательности и поэтому они могут локализоваться в иных внутриклеточных компартментах. Для выяснения внутриклеточной локализации изоформ хампина мы амплифицировали полноразмерные открытые рамки считывания всех известных изоформ хампина мыши с помощью ПЦР и клонировали их в вектор для экспрессии химерного белка с С-концевым зеленым флуоресцентным белком (рЕОРР-Ю). Полученными плазмидными ДНК трансформировали фибробласты мыши линии ЗТЗ. В результате было обнаружено, что изоформы хампина, независимо от наличия или отсутствия в своем составе домена 1УреЬе, локализуются исключительно в клеточном ядре:

О Е

Рис. 4. Внутриклеточная локализация изоформ хампина А, С, О и Е (показаны буквами), в составе химеры с зеленым флуоресцентным белком (вРР) в клетках линии ЗТЗ (фибробласты). Представлены совмещенные фазовоконтрастные (черно-белый) и флуоресцентные изображения (зеленый цвет).

Интересно, что ядерная локализация наблюдается также в случае изоформ И и Е, специфичных для семенников, как показано с помощью ОТ-ПЦР, - т.е. в случае их

эктопической экспрессии. Чтобы проверить, сохраняется ли внутриклеточная локализация у данных изоформ и в других линиях клеток, мы провели подобные эксперименты по трансфекции с рядом других линий клеток - миобластов мыши С2С12, YPEN-1 (опухоль простаты крысы) и НЕК293Т (трансформированная линия эмбриональных почек человека). Было обнаружено, что и в других линиях клеток изоформы хампина сохраняют свою ядерную локализацию. Это позволило нам предположить, что центральная часть молекул хампина (домен III и/или С-концевая часть домена IIcc, координаты L259-A460 хампинов А-С) должна содержать неизвестные, но вполне универсальные для клеток млекопитающих сигналы ядерной локализации. Для подтверждения этой гипотезы мы сконструировали плазмидную ДНК, кодирующую фрагмент хампина L259-A460 (нумерация справедлива для изоформ А-С), слитую с N-концевым зеленым флуоресцентным белком (используя вектор pEGFP-СЗ); полученной ДНК осуществили трансфекцию фибробластов линии ЗТЗ. В результате была также обнаружена ядерная локализация для химерного белка (рис.5). Столкнувшись с таким интересным феноменом, мы решили сузить регион в молекуле хампина, важный для его внутриклеточного сортинга. Для решения этой задачи мы сконструировали серию делеционных мутантов молекулы хампина, слитых с GFP и провели анализ их внутриклеточной локализации в клетках фибробластов мыши ЗТЗ. Таким образом, мы обнаружили, что фрагмент молекулы хампина А с координатами в области аминокислотных остатков 319-348 содержит последовательность, ответственную за внутриклеточную сортировку белка в клеточное ядро. То есть, фрагмент хампина А и присущий всем изоформам белка 3,9SKPFSCGRSGKGHKRKTPFGNTERKTPVKK348 является минимально необходимым для сортировки белка в клеточное ядро.

N

N + С N + С N + (с)

■ Q

4 6 im^ ¡¡Ш ¿rt.l**» ... В

9 • ft 10 шшшш •

Рис. 5. Структура делеционных фрагментов хампина, слитых с вРР, использованных для картирования сигнала его ядерной локализации (в области а.о. 259-460 в последовательности хампина А) и их

внутриклеточная локализация в клетках ЗТЗ Структура делеционных фрагментов показана слева, а результаты трансфекции, выявленные с помощью флуоресцентной микроскопии справа

Слева цифры возле структур химерных белков соответствуют их расположению на микрофотографиях с изображением результатов микроскопии Буквы N и С расположенные рядом со структурами химреных белков обозначают ядерную и цитоплазматическую локализации соответственно

Справа представлены фазовоконтрасгные и флуоресцентные изображения клеток В (2) представлено совмещенное изображение флуоресценции в двух каналах - красном (DsRed) и зеленом (химера GFP-хампин, фрагмент 259-460) Шкала в секции (1) соответствует 50 мкМ

Мы также проанализировали консервативность данной полипептидной последовательности в структурах хампина у разных таксонов животных Оказалось, что и у мыши и у крысы этот регион консервативен на 100%, идентичность ее структуры с хампином человека, макаки (Macaca mulatto), шимпанзе (Pan troglodytes) составляет 93%, 86% с опоссумом (Monodelphis domestica) и 72% с курицей (Gallus gallus) В то же время, идентичность структуры этого фрагмента с фрагментами хампина из таких организмов как земноводные или рыбы не представляется значимой (около 30%) Чтобы оценить «универсальность» этой аминокислотной последовательности для ядерного сортинга, мы осуществили трансфекцию химерой GFP-фрагмент 319-348 клеток человека НЕК293Т Оказалось, что и в этом случае данная последовательность функционировала как сигнал для сортировки в ядро зеленого флуоресцентного белка Таким образом, можно полагать, что данная последовательность является необходимой для ядерного сортинга в молекулах хампина у плацентарных млекопитающих

Принимая во внимание данные результаты, интересным оказался вопрос о существовании/ функциональной активности сигналов ядерной локализации в домене IVpehe изоформ хампина A/B/D, предсказанных на основании биоинформатических подходов -сигнал типа "NLS BP" Поэтому мы сконструировали химеру зеленого флуоресцентного белка (GFP) с С-концевым фрагментом хампина А (461-616, домен IVpehe) и протестировали ее внутриклеточную локализацию Оказалось, что она также содержит функционально активные сигналы ядерной локализации и приводит к полной сортировке флуоресцентного белка в ядро (не показано)

С помощью полученных нами антител к хампину, мы провели также иммуноцитохимические эксперименты, направленные на определение внутриклеточной локализации эндогенного белка Окрашивание клеток фибробластов мыши (ЗТЗ) с помощью поли- и моноклональных антител к хампину показало, что основная часть белка присутствует в клеточном ядре, и практически полностью отсутствует в остальных отделах клетки

Рис. 6. Иммунофлуоресцентное окрашивание фибробластов мыши линии ЗТЗ с помощью моноклонального антитела ZB2 к хампину. Слева направо: мечение антителом ZB2 (зеленое свечение), окрашивание ядер с помощью пропидий иодида (красное свечение), совмещение изображений флуоресценции в двух каналах. Линейка (справа) соответствует 50 мкм.

Таким образом, мы наблюдали локализацию всех изоформ хампина одновременно (в клетках фибробластов - изоформы А-С) в клеточном ядре, что хорошо согласуется в вышеприведенными результатами экспериментов по экспрессии отдельных изоформ хампина.

Результаты поиска белковых взаимодействий хампина и его партнеров в дрожжевой двугибридной системе

С целью определения физиологической роли хампина мы осуществили поиск его белок-белковых взаимодействий, используя дрожжевую двугибридную систему MatchMaker III (BD Biosciences). В качестве «наживки» использовали фрагмент хампина а е266-К616, который присутствует во всех тканях. В результате скрининга библиотеки кДНК 17-дневного эмбриона мыши было идентифицировано пять истинно положительных клонов кДНК, кодирующих белки ТТС4, К1АА0103/ ТТС35, NOP17, GC BP и MYST1. Мы также предприняли дополнительные эксперименты по поиску взаимодействий уже открытых партнеров хампина в дрожжевой двугибридной системе, используя в качестве «наживки» белки ТТС4, ТТС35, NOP 17 и MYST1. Нам не удалось обнаружить истинно положительных взаимодействий в случае белков ТТС4 и NOP 17, однако мы открыли два новых взаимодействия для белка ТТС35 (с белками RASSF1C и PRP3) и MYST1 (NELF-C и один клон, соответствующий С-концевому фрагменту хампина а). Поиск белок-белковых взаимодействий для супрессора опухолей RASSF1C обнаружил новое взаимодействие между белками RASSF1C и RNF10. Результаты идентификации новых взаимодействий приведены в таблице 1. Как видно, хампин способен взаимодействовать с набором белков, наиболее изученным из которых является ацетилтрансфераза гистонов MYST1. Поскольку MYST1 является ортологом MOF дрозофилы, то можно заключить, что взаимодействие белков

хампин/МБЫ с данной ацетилтрансферазой гистонов является чрезвычайно консервативным По-видимому, участие этих белков в ацетилировании гистона Н4 К16 сохраняется у всех истинновторичнополостных животных (СоеЬпШа) Учитывая также, что для скрининга взаимодействий был использован фрагмент хампина, имеющий в своем составе домен РЕНЕ, а также то, что у дрозофилы он важен для взаимодействия "МБЫ-МОР", можно заключить, что и у млекопитающих данное взаимодействие осуществляется через этот домен Дополнительным фактом, подтверждающим это, является идентификация фрагмента хампина А (У437-К616) при поиске взаимодействий МУЭТ! (см таб 1) Помимо белка МУ8Т1, большинство белков, идентифицированных в результате наших двугибридных скринингов, к настоящему моменту малоизученны Более того, функциональная роль некоторых из них начала открываться только во время выполнения данной работы Белок К1АА0103/ТТС35 принадлежит к числу малоизученных белков клеточного ядра Анализ его последовательности с помощью программы МойКсап выявляет т н ТРЛ-мотив последовательности, обнаруженный у широкого набора белков ТРЯ-мотив представляет собой структуру из 34 а о и, по-видимому, важен для белок-белковых взаимодействий Также последовательность данного белка содержит сигнал ядерной локализации типа N1^ ВР Действительно, данный белок был обнаружен среди других в работе, посвященной идентификации белков клеточного ядра (Dreger, 2001) В результате наших экспериментов обнаружено, что белок ТТС35 способен к взаимодействию по крайней мере с двумя белками - КАвБРЮ и РЯРЗ

Таб 1 Результаты идентификации новых белок-белковых взаимодействий в дрожжевой двугибридной

системе

«Наживка» Идентифицированный партнер № депонирования в GenBank Координаты, а о Длина, а о, домены Известная или гипотетическая функция партнера

Хампин К1АА0103/ ТТС35 NP_080012 Полноразмерный 297, TPR2 нет

ТТС4 NP_082485 Полноразмерный 386, TPR Возможный ко шаперон, супрессор опухолей,

GC BP NP_666371 Р83 - С конец 619, C2H2 Zn finger Фактор транскрипции, регулирует экспрессию гена 1Ь12 р35 в макрофагах

NOP 17 NP„083682 Полноразмерный 290, NOP 17 Возможно вовлечен в процессинг пре-рРНК

«Наживка» Идентифицированный партнер № депонирования в GeuBank Координаты, a.o Длина, а.о, домены Известная или гипотетическая функция партнера

MYST1 NP_080646 G39 - С-конец 458, MYST, С2НС Zn Finger, chromodom am Ацетилтран сфераза гистонов(Н4 К16)

К1АА0103/ ТТС35 RASSF1C NP_062687 Полноразмерный 270, RA Супрессор опухолей

PRP3 NP_081817 Б291 - С-конец 683, PWI Фактор сплайсинга

MYST1 NELF-C/TH1L NP_065605 Полноразмерный 592 Негативная регуляция элонгации траскрипции РНК полимеразой П и протеинкиназы А-гаГ

хампик А AK_014463 У437-К616 616 -

RASSF1C RNF10 NP_057907 G372 - С-конец 805 Нет

Белок RASSF1C является близкородственным супрессору опухолей RASSF1A Оба белка имеют домен, необходимый для ассоциации с онкобелком ras, но предполагается, что ассоциация с этим белком in vivo происходит, скорее всего, в результате гетеродимеризации с другими родственными белками, например, Norel Обе изоформы RASSF1 обладают также консенсусным сайтом фосфорилирования киназой ATM, способны ассоциироваться с микротрубочками и участвовать в их стабилизации Ген, кодирующий RASSF1A, часто подвергается эпигенетической инактивации посредством метилирования ДНК при многих видах рака и принято считать, что соответствующий белок играет важную роль в супрессии опухолей (Li, 2004) Другим TPR-мотив содержащим белком является еще один из идентифицированных партнеров хампина - белок ТТС4 (от «Tetratncopeptide repeat protein 4») В некоторых работах показано, что ген, кодирующий данный белок, поврежден в ряде опухолей и поэтому выдвигались предположения о роли белка в супрессии развития опухолей (Su, 1999, Poetsch, 2000) В то же время, сообщалось, что гомолог ТТС4 у Drosophila, названный Dpit47, является ядерным ко-шапероном ДНК-полимеразы альфа совместно с Hsp90 (Crevel, 2001) По-видимому, он выполняет функцию ингибирования активности ДНК-полимеразы на определенных стадиях клеточного цикла Фактор транскрипции GC BP первоначально был идентифицирован как белок, связывающий последовательность ДНК промотора гена IL-12 р35 с GC-консенсусным мотивом и ингибирующий экспрессию

данного гена в клетках макрофагов Белок NOP17, гомологичный белку дрожжей с таким же названием, не имеет известной функции Дрожжевой гомолог NOP 17 изучен в большей степени, - было показано, что он локализуется в ядрышке и участвует в процессинге пре-рРНК, т е вовлечен в биогенез рибосом В то же время, идентичность его первичной структуры составляет только около 29% NOP 17 человека, и стоит подходить с осторожностью к перенесению его функции на гомологи млекопитающих Большой интерес вызывает идентификация взаимодействия между белками MYST1 и NELF-C Показано, что последний вовлечен в процессы регуляции элонгации транскрипции РНК-полимеразой II, поскольку является компонентом комплекса NELF, участвующего в феномене «промотор-проксимального паузинга» Таким образом, данное взаимодействие напрямую связывает ацетилирование гистона Н4 К16 (и декомпактизацию хроматина) с регуляцией транскрипции

Сравнение профилей экспрессии генов, кодирующих идентифицированные белки с помощью ОТ-ПЦР различных тканей мыши выявило, что гены, кодирующие белки-партнеры хампина экспрессируются во всех исследованных тканях (не показано) Таким образом, можно предполагать, что идентифицированные взаимодействия вполне могут иметь место, по крайней мере, в организмах всех позвоночных и, вероятно, во всех клеточных типах

Разработка двухтеговой системы для экспрессии в бактериях

Столкнувшись с такого рода проблемами, как высокая токсичность, подверженность к протеолизу или низкая растворимость отдельных белков-партнеров хампина, мы решили сконцентрировать свои усилия по подтверждению взаимодействий на методах связывания т vitro с помощью аффинной хроматографии с применением гибридных белков В результате, нами было сконструировано три плазмидных вектора - pDIHTHQ, pHPMLQ и pCBDQ, кодирующих соответственно домен I протон-транспортирующей трансгидрогеназы Е coli (Metl-Lys394), первую цитоплазматическую петлю (Thrl66-Ser371) и кальмодулин-связывающий домен Са-АТФазы плазматической мембраны РМСА4Ь человека (Lysl057-Vall205) Все плазмидные ДНК построены на основе вектора pQE40 (Qiagen) и получены заменой последовательности, кодирующей дигидрофолатредуктазу, на соответствующую D1HTH ("Domain 1 H-TransHydrogenase" 1-394), HPML ("Human Plasma Membrane calcium pump Loop" 166-371) и CBD ("Calmodulme Binding Domain" 1057-1205) Клонирование в данные векторы позволяет получить интересующий белок, слитый с С-концевой частью полипептидов D1HTH, HPML или CBD Также, все эти векторы кодируют N-концевую гексагистидиновую последовательность, позволяющую проводить очистку с помощью металлоаффинной хроматографии Ко всем . трем полипептидами известны

высокоспецифичные моноклональные антитела, пригодные для иммунопреципитации, а CBD может также взаимодействовать с кальмодулином, что также может быть использовано для его очистки (Pestov, 2007).

Применение данных белковых меток впервые позволило продуцировать полноразмерный хампин в бактериях (изоформы А-Е), - ранее до этого удавалось клонировать лишь его фрагменты. Полипептиды D1HTH и CBD были протестированы на примере взаимодействия «хампин A-MYST1», поскольку оно уже было продемонстрировано для хампина А человека (Smith, 2005). Для этого мы химеризовали хампин А с D1HTH (белок D1 НТН-хампин A) a MYST1 - с CBD (белок CBD-MYST1). Белок CBD-MYST1 оказался хорошо растворимым в фосфатно-солевом буфере и имел электрофоретическую подвижность около 75 кДа. Было обнаружено, что наилучшими свойствами для взаимодействия (отношение сигнал/шум) обладает буферный раствор состава 25 мМ HEPES-Na, рН 7.6, 400 мМ NaCl, 0.5% NP-40, 1 мМ MgCl2, 1мМ СаС12. Таким образом, можно считать, что данная система полипетидных меток является удовлетворительной для подтверждения взаимодействий между двумя белками in vitro.

А В

CBD-MYST1 D1HTH-HAMPIN А

£ Q г.

Рис. 7. Анализ результатов экспериментов по взаимодействию между белками 1)1НТН-Ьатрш А и < В1)-МУ8Т1 с помощью вестерн-блоттинга. А: результаты иммуноблотинга образцов, полученных в ходе эксперимента по взаимодействию между белками СВР, СВП-М\'8Т1, ГЛНТН, ОШТН-хамнин А с последующим осаждением на кальмодуяин-сефарозе (пулл-даун). В: результаты иммуноблотинга образцов, полученных в ходе эксперимента по ко-иммунопреципитации вышеперечисленных белков с помощью моноклонального антитела, специфичного к полипентиду I) 1НТН, из бактериальных экстрактов. В обоих случаях для иммунодетекции использовались моноклональные антитела к иолипептидам СВО и 01НТН.

Применение двухтеговой системы для подтверждения взаимодействий и картирования участков взаимодействий между хамнином и некоторыми белками

Получив, таким образом, новый инструмент для изучения белок-белковых взаимодействий, мы, наконец, приступили к подтверждению открытых нами ранее взаимодействий. В первой серии экспериментов мы предприняли попытку детектировать

эндогенный комплекс, состоящий из белков хампин, ТТС4 и ЫОР17 - к которым нам удалось получить специфические антитела Было обнаружено, что и хампин, и ТТС4 детектируются в ядерных экстрактах из клеток миеломы мыши и легко экстрагируются в присутствии 1% Тритона XI00 Нам удалось выделить комплекс, содержащий хампин и КОР 17, используя аффинную хроматографию на рекомбинантном белке ТТС4 (не показано) Таким образом, впервые была показана ассоциация хампина с белками, отличными от ацетилтрансферазы гистонов МУ8Т1 Полученный ядерный экстракт из клеток миеломы мыши был использован в следующей серии экспериментов, - аффинной хроматографии с использованием рекомбинантных изоформ хампина А и С в качестве лигандов В результате мы показали, что ОШТН-меченные хампин А и С связывают эндогенный белок ТТС4 примерно с одинаковой эффективностью, напротив, белок ТТС4 отсутствует в элюате с сорбента, содержащего только полипептид ИШТН, что говорит о специфичности наблюдаемых взаимодействий Аналогичным способом мы показали, что белок МОР 17 связывается только с хампином А (но не с хампином С) В последней серии экспериментов мы изучали возможность взаимодействий в бактериальных экстрактах, проверяя, таким образом, необходимость наличия каких-то специфических факторов (присутствующих в клетках эукариот), важных для белковых взаимодействий хампина и других белков Оказалось, что изоформы хампина способны со-осаждаться с белками КОР 17 и ТТС4 даже из бактериальных экстрактов Дополнительно, мы успешно клонировали в созданные нами векторы ряд открытых рамок считывания, кодирующих такие белки как КЕЬИ-С (химера с ШНТН), КЛАЛО 103 (химера с НРМЬ), ЯАЭЗРЮ (химеры с ШНТН, НРМЬ) Полученные плазмидные ДНК тестировались на предмет экспрессии соответствующих полипептидов, - в результате нам удалось осуществить бактериальную продукцию БШТН-меченных белков КЕЬР-С и КАЭБРЮ (обе эти химеры оказались растворимыми), а также НРМЬ-меченные белки ЯАЗБР! С и К1АА0103 Используя белковые метки Б1НТН, СВБ и НРМЬ, мы подтвердили также взаимодействия "ИЕЬР-С - МУЗТ1", "хампин - К1АА0103" и "К1АА0103 - ЯАЗЗПС", используя осаждение антителами и хроматографию на кальмодулин-сефарозе из бактериальных экстрактов Оказалось, что с ТРЯ-мотив-содержащим белком К1АА0103 взаимодействует хампин А, но не хампин С

А: В:

Б В» D1KTH-HAMPIN А/С Ц N0P17

ТТС4

HPML-KIAA0103

+ - + - + - IP

С: D:

<М» D1HTH-NELF-C ~ D1HTH-RASSF1C

+ - + - IP

Рис. 8. Результаты подтверждения идентифицированных взаимодействий с помощью методов связывания in vitro. А: Анализ взаимодействия между белками хампин А,С и белками ТТС4 и ТТС35 (К1АА0ЮЗ) с помощью ко-иммунопреципитации из экстрактов растворимых белков E.coli. Представлены результаты иммуноблотинга образцов элюатов, полученных в ходе эксперимента, с помощью кроличьих антител, специфичных к белкам DIHTH, ТТС4 и HPML. Обозначение «1Р» +/- соответствует проведению иммунопреципитации с моноклональным антителом, специфичным к белку D1HTH (+) или контрольным (не взаимодействующим с ним) (-). В^ Результаты пулл-дауна ядерного экстракта клеток миеломы мыши на D1 НТН-меченных изоформах хампина А и С. Ядерный экстракт инкубировали с данными полипептидами и контрольным (просто D1HTH), сорбированными на Ni-NTA-агарозу, промывали и подвергали элюции. Препараты элюатов анализировали с помощью мышиных антител, специфичных к белку NOP17. С: Результат эксперимента по взаимодействию между белками MYST1 и NELF-C, сверхпродуцированными в E.coli. Экстракты, содержащие белки, инкубировали с кальмодулин-сефарозой, промывали и подвергали элюции. Для иммунодетекции использовали моноклональное антитело, специфичное к иолипептиду DIHTH. JD: Результат эксперимента но взаимодействию между белками RASSF1C и КЛАА0103 (ТТС35), сверхпродуцированными в E.coli. Экстракты, содержащие белки, подвергали иммунопреципитации с использованием антитела, специфичного к белку HPML, а для иммунодегекцию применяли кроличьи антитела к иолипептиду D1HTH. Обозначения «1Р» +/- соответствуют проведению иммунопреципитации с моноклональным антителом, специфичным к белку HPML (+) или контрольным (не взаимодействующим с ним) (-).

Таким образом, нам удалось подтвердить все открытые взаимодействия, которые мы изучали. На основании наших экспериментов можно сделать вывод, что с белками MYST1, KIAA0103 (ТТС35), NOP 17 взаимодействует С-концевой домен хампина (IVpehe), присутствующий у изоформ А, В и D, в то время как с белком ТТС4 должны взаимодействовать все его изоформы (предположительно через домены Нее и III, включающие в себя остатки 259-460 хампина А). Следовательно, аннотированный нами

фрагмент интерактома животной клетки, включающий в себя хампин, имеет высокую степень достоверности.

Рис. 9. Схема фрагмента интерактома млекопитающих, полученная в результате поиска белок-белковых взаимодействий, проведенного в настоящей работе и сопоставления полученных результатов с информацией в базах данных по белковым взаимодействиям. Центральным узлом фрагмента является хампин, связывающий ацетшггрансферазу гистонов МУ8'Г1 с такими белками как супрессор опухолей ИАЗЗР1С, фактор сплайсинга РЯРЗ и рядом малоизученных белков - БС ВР, Ж)Р17, ТТС4 и др.

Характеристика некоторых партнеров хампина и их ко-локализация в клетке

На завершающем этапе работы было решено сконцентрировать свои усилия на изучении локализации в клетке ряда белков - новых компонентов ядерного интерактома и функциональной значимости некоторых из открытых взаимодействий. Для решения задачи изучения внутриклеточной локализации мы воспользовались, во-первых, методом создания химер белков на основе флуоресцентного белка и, во-вторых, полученными нами антителами для детекции эндогенных белков. Так, мы сконструировали плазмидные ДНК (на основе плазмидной ДНК рЕОРР-С1, ОоШесЬ), кодирующие ряд химерных белков с 1Ч-концевым ОБР: ТТС4, ТТС35, МУ8Т1, КА88Р1С. Очищенными плазмидными ДНК трансфицировали клетки фибробластов ЗТЗ и НЕК293Т и наблюдали внутриклеточную локализацию соответствующих химерных белков, используя флуоресцентный микроскоп.

1ША ро1 На

г г

А (МУБТ!) В ТТС35

С КАввПС £ ТТС4

Рис. 10. Результаты экспрессии химер белков мыши МУ8Т1, ТТС35, ТТС4 и ЯА88Р1С с СРР/ИРР в культивируемых клетках человека НЕК293Т и фибробластов мыши ЗТЗ. А± Показаны результаты трансфекции клеток НЕК293Т (1,3,5) и ЗТЗ (2,4,6) химерным белком ОРР-МУБП. 1 - фазовоконтрастное изображение клеток, 3 - флуоресценция, 5 - совмещенное изображение; 2 - локализация белка DsR.ec! (флуоресценция всей клетки), 4 - локализация вРР-МУ8Т1, 6 - совмещенное изображение; результаты трансфекции клеток НЕК293Т (1,3,5) и ЗТЗ (2,4,6) химерным белком ОРР-ТТС35. 1 - фазовоконтрастное изображение клеток, 3 - флуоресценция, 5 - совмещенное изображение; 2 - локализация белка DsR.ec! (флуоресценция всей клетки), 4 - локализация СРР-МУ8Т1, 6 - совмещенное изображение; О Представлены результаты трансфекции плазмидной ДНК ОРР-11А88Р1С клеток фибробластов ЗТЗ (1,3,5) и НЕК293Т (2,4,6). 1,2 - флуоресценция ядер, окрашенных ОАР1 (синий цвет); 3,4-флуоресценция химеры СРР-ЯА88Р1С (зеленый цвет); 5,6 - совмещенные изображения; 1)± Результаты трансфекции клеток фибробластов ЗТЗ плазмидными ДНК, кодирующими химеры белка ТТС4 с белками ИРГ (ОзЛеё) и вРР. 1,3,5 - экспрессия плазмидной ДНК, кодирующей химеру СРР-ТТС4. 1 - флуоресценция белка вРР-ТТС4, 3 - флуоресценция белка ИРР-ЭКА-Г^аве I (ко-трансфекция), 5 - совмещенное изображение; 2,4,6 - экспрессия плазмидной ДНК, кодирующей химеру ТТС4-ИРР. 2 - флуоресценция белка ТТС4-КРР, 4 - флуоресценция ядер, окрашенных ОАР1, 6 -совмещенное изображение. Линейка соответствует 50 мкМ.

Оказалось, что при таких условиях МУ8Т1 локализуется строго в ядре, в то время как ТТС35 локализуется по всей клетке, не обнаруживая заметного обогащения в ядре.

Неожиданно то, что ТТС4 также не обнаруживал накопления в ядре, причем в случае использования двух разных химер - одной с М-концевым СИР и другой с С-концевым ЯРР (белком ОэКес!). Химерный белок СРР-ИАЗЗРЮ обнаруживался в цитоплазме, ассоциируясь с микротрубочками - как это было показано ранее в работах других исследователей. Используя антитела, полученные нами ранее, мы провели окрашивание фиксированных культивируемых клеток фибробластов мыши ЗТЗ.

Рис. 11. Ко-локализация эндогенных белков К ^М К и ТТС4, а также КА58Р1С и 1'М I в клетках фибробластов мыши ЗТЗ. Слева представлены результаты окрашивания фиксированных клеток антителами к ТТС4 (зеленое свечение) и КА8БР1С (красное свечение). Справа показаны результаты окрашивания фиксированных клеток антителами к Г'\1[. (зеленое свечение) и С (красное свечение). ПАР1 (синее

свечение) соответствует окрашиванию ядер в обоих случаях. Линейка соответствует 50 мкМ.

При окрашивании клеток с помощью флуоресцентно меченных вторых антител, мы обнаружили ряд интересных фактов: во-первых, эндогенный белок ТТС4 локализовался в ядре, но не во всех клетках. В обычной асинхронной культуре, имеющей 50-70% конфлюэнтности, можно было наблюдать как клетки, имеющие ядерный ТТС4, так и те, где обнаруживалось заметное преобладание цитоплазматического мечения. Стоит обратить внимание, что при мечении антителами к ТТС4 окрашивается не ядро целиком, как в случае ядерного красителя РАР1, а определенные внутриядерные структуры и ядерная мембрана. Наиболее интересно, что ядерное накопление белка ЯЛвБРЮ коррелирует с накоплением внутриядерных точечных структур с белком ТТС4 (рис. 11), более того, - также наблюдается частичная ко-локализация этих белков (в «тельцах ЯА88Р1С» или РМЬ). Вероятно, что эта ко-локализация обусловлена существованием эндогенного комплекса, включающего в себя белки КАЗБРЮ, ТТС35, хампин А и ТТС4, ассоциированного на некоторых этапах жизни клетки с ядерными тельцами РМЬ. С другой стороны, принимая во внимание факт, что и ТТС4, и ТТС35 имеют т.н. ТРЯ-мотив последовательности, можно предположить и прямое взаимодействие между белками ТТС4 и ИАЗБРЮ. Факт того, что белок ТТС4 имеет динамический характер внутриклеточной локализации, привлек наше внимание. С другой стороны, отсутствие его сортировки в клеточное ядро при сверхпродукции также представляется достаточно интересным феноменом. Неудивительно, что мы решили уделить

часть времени в рамках данной работы изучению этих особенностей. Динамический характер внутриклеточной локализации ТТС4 был подтвержден и в экспериментах по окрашиванию клеток других клеточных линий - человека (НЕК293Т и ЮЭ), крысы (УРЕЬМ) и мыши (\УЕН1-3) (не показано).

Рис. 12. Внутриклеточная локализация белка 1ЧОР17 и его ко-локализация с хампином (слева) и влияние ко-экспрессии химеры хампина А с (.11' на внутриклеточную локализацию химеры ТТ< 1К11' (справа).

Слева представлены результаты иммунофлуоресцентного окрашивания фиксированных клеток фибробластов ЗТЗ с помощью антител к белкам 1ЧОР17 и МСМЗ (А) и МОР 17 и хампину (В). В Обоих случаях Г-ЮР17 представлен красной флуоресценцией, а МСМЗ и хамнин флуоресценцией в зеленом свете. [)ЛР! (синее свечение) соответствует окрашиванию ядер в обоих случаях. Справа: Ко-трансфекция химеры хампина А с ОРР (зеленое свечение) с белком ТТС4-КРР (красное свечение), приводящая к накоплению белка ТТС4-К!Р в определенных ядерных структурах, ко-локализующихся с хампином А. Синяя флуоресценция соответствует окрашиванию ядер с помощью РАР1. Показаны совмещения изображений флуоресценции в разных каналах. Линейка соответствует 50 мкМ.

Поскольку один из партнеров ТТС4 - это ДНК-полимераза альфа, которая подвержена изменению внутриклеточной локализации в процессе клеточного цикла, мы предположили, что и локализация ТТС4 также является функцией фазы цикла клетки. Сравнение его локализации в культурах клеток с низкой плотностью (20-30% конфлюэнтности) и в культурах с высокой плотностью (100% конфлюэнтности) выявило чрезвычайно разительный контраст: при низкой плотности ТТС4 имеет ядерную локализацию, в то время как в практически неделящихся клетках он полностью отсутствует в ядре. Данные

результаты хорошо соотносятся с предположением о том, что внутриклеточная локализация ТТС4 зависит от прогресса клеточного цикла Это предположение было подтверждено с помощью эксперимента по синхронизации клеток Мы обнаружили, что наибольшая концентрация ядерного пула ТТС4 приходится на время 7-10 ч (после добавления сыворотки), что соответствует 01 и ранней 8-фазам В дальнейшем наблюдается постепенная делокализация белка в цитоплазму и в процессе деления ядерный пул ТТС4 полностью истощается, чтобы вновь восстановиться с течением фазы Вполне возможно, что максимальное накопление ТТС4 на границе фаз в 1/8 необходимо для взаимодействия и ингибирования активности ДНК полимеразы альфа до начала репликации ДНК Таким образом, эти результаты недвусмысленно указывают по крайней мере на две функции белка ТТС4 в ядерном интерактоме - регуляцию активности ДНК-полимеразы альфа и процессы, протекающие с участием комплексов, включающих белок ЯА88Р1С

Факт частичной ко-локализации эндогенного белка ТТС4 с хампином натолкнул нас на мысль, что ядерная локализация сверхпродуцированного ТТС4 может быть зависима от присутствия хампина Действительно, при ко-трансфекции клеток ЗТЗ плазмидными ДНК, кодирующими химеру ТТС4-КРР с йРР-химерой хампина А (рис 12) мы обнаружили, что в клетках, содержащих сверхпродуцированный хампин, обнаруживается накопление ядерного ТТС4 и ко-локализация белков Таким образом, можно полагать, что хампин важен для сортировки белка ТТС4 в ядро, и отсутствие ядерной локализации ТТС4 при обычной сверхпродукции вызвано отсутствием адекватных (для большего количества ТТС4) количеств хампина в клетке

Совершенно иной характер внутриклеточной локализации обнаружил белок НОР 17 в клетках фибробластов мыши Изначально предполагалось, что, как и свой дрожжевой гомолог, КОР 17 мыши должен локализоваться в ядрышках, однако напротив, мы наблюдали мечение всего ядра без каких-либо ярко выраженных специфических структур Характер локализации белка 1\ЮР17 мыши напоминает таковую для белков МЕСР2 (не показано) и МСМЗ он практически полностью ко-локализуется с хроматином, причем даже во время деления клетки (рис 12) Можно полагать, что 1МОР17 млекопитающих представляет собой белок, всегда ассоциированный с хроматином Поэтому, участвует ли он в процессинге рРНК, как и КОР 17 дрожжей, является спорным вопросом Стоит обратить также внимание на неполную ко-локализацию Ж)Р17 и хампина в ряде клеток, что может косвенно подтверждать данные о том, что с №ЭР17 взаимодействуют только изоформы А и В, но не С

выводы

1 Установлена структура изоформ хампина в организме мыши и изучена их тканевая специфичность Три изоформы (А, В, С) обнаруживаются во всех тканях, тогда как две остальные (D, Е) специфичны для семенников

2 Показано, что все изоформы хампина мыши локализуются в клеточном ядре, причем некоторые из изоформ имеют по два сигнала ядерной локализации

3 С помощью дрожжевой двугибридной системы открыты взаимодействия хампина А с рядом ядерных малоизученных белков - MYST1, NOP17, ТТС4, ТТС35 и GC BP

4 Предложена новая система белковых меток на основе полипептидов D1HTH, HMPL и CBD, позволяющая исследовать белковые взаимодействия т vitro Данная система опробована на примере взаимодействия «хампин-MYSTl»

5 Большинство белковых взаимодействий, открытых с помощью двугибридного скрининга, подтверждено с помощью альтернативных подходов, таких как связывание in vitro и ко-локализация белков в клетке

6 Показано, что С-концевой домен хампина IVpehe участвует во взаимодействии с белками ТТС35, NOP17 и MYST1, тогда как центральный регион белка взаимодействует с белком ТТС4

7 Изучены свойства некоторых новых белков ядра, идентифицированных в ходе работы ТТС4, RASSF1C, MYST1, ТТС35 и NOP17 Показано, что хампин влияет на внутриклеточную локализацию белка ТТС4 в клеточном ядре

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ-

Статьи

1 Дмитриев Р.И., Пестов H Б , Корнеенко Т В , Герасимова А В , Жао X , Модянов H H , Костина M Б , Шахпаронов M И (2005) Тканеспецифичность продуктов альтернативного сплайсинга мРНК мыши, кодирующей новый белок хампин, гомологичный белку MSL1 дрозофилы Биоорган хим 31,363-371

2 Дмитриев Р.И, Пестов H Б, Корнеенко Т В, Шахпаронов M И (2006) Внутриклеточная локализация изоформ хампина Докл Акад Наук, 408,268-270

3 Dmitnev R I., Komeenko Т V , Bessonov А А, Shakhparonov M I, Modyanov N N , Pestov N В (2007) Characterization of hampin/MSLl as a node m the nuclear interactome Biochem Biophys Res Commun , 355, 1051-1057

Тезисы конференций

1 Dmitriev R. I., Komeenko T V, Shakhparonov M I (2006) A Novel Interaction between Transcription Repressor of IL-12 p35 Gene GC BP and Hampin J Gen Physiol, 128, 14a

2 Дмитриев P И., Пестов H Б , Корнеенко Т В , Бессонов А А , Шахпаронов M И, Структура и функция хампина - нового белка млекопитающих Тезисы докладов, VIII чтения, поев памяти акад Ю А Овчинникова, Москва-Пущино (25-27 октября 2006) С 80

3 Дмитриев Р.И., Пестов H Б , Корнеенко Т В , Бессонов А А , Шахпаронов M И Структура и функция хампина - белка млекопитающих, гомологичного белку MSL1 Drosophila Тезисы докладов, 1я международная конференция молодых ученых «Биология от молекулы до биосферы» Харьков, Украина (21-23 ноября 2006), С 103

4 Dmitriev R.I, Komeenko T V , Pestov N В , Modyanov N N , Shakhparonov M I (2007) Identification of novel protein-protem interactions pertinent to regulation of mammalian hampin/MSLl and histone acetylase MYST1/MOF Experimental Biology 2007 Meeting, Washington, USA (28 апреля - 2 мая 2007), FASEB J, 21, A283-C

5 Дмитриев Р.И , Абдулин P A, Пестов H Б , Шахпаронов M И , Свойства потенциального супрессора опухолей белка ТТС4 Тезисы докладов, Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, (2022 сентября 2007), ИМБиГ, Киев, Украина, С 161

Заказ № 142/01/08 Подписано в печать 30 01 2008 Тираж81экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 > Г'} www cjr ru , e-matl info@cfr ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ---------------------------------------------------------------------------------------------------б

ГЛАВА 1. ЭВОЛЮЦИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ, ИМЕЮЩИХ В СВОЕМ СОСТАВЕ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ ГИСТОНОВ МУБТ1 (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)—

Предисловие

Структура и функция компенсасомы — комплекса, включающего в себя белки МБЫ и

МОБ у БгозорЫ1а

Основные компоненты компенсасомы

Дополнительные компоненты комплекса

Механизм работы компенсасомы

Комплекс МБЬ у других организмов?

Другие комплексы с участием хампина /МБЫ и ацетилтрансферазы МУБТ1

Ацетилтрансферазы МУБТ и апоптоз

Эволюционные аспекты, связанные с функционированием комплексов на основе ацетилтрансферазМУБП

Современные представления о механизме функционирования хроматина согласно парадигме «сканирования хроматина»

- Подвижность белков в ядре

Флуктуации доступности нуклеосом

Открытые состояния», случайное связывание и общая схема ядерных процессов —

ГЛАВА 2: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение первичной структуры хампина мыши, ее филогенетический анализ и изучение тканевой специфичности экспрессии его изоформ

Бактериальная продукция фрагментов хампина и получение специфических антител - 45 Изучение внутриклеточной локализации изоформ хампина и картирование участков, содержащих сигналы ядерной локализации

Результаты поиска белковых взаимодействий хампина и его партнеров в дрожжевой двугибридной системе

Анализ тканевой специфичности партнеров хампина, их краткая характеристика, филогенетический анализ

Бактериальная продукция партнеров хампина. Получение антител к некоторым белкам. Проблемы.

Разработка двухтеговой системы для экспрессии в бактериях. Свойства белков.

Оптимизация условий связывания на примере взаимодействия MYSTl-хампин

Применение двухтеговой системы для подтверждения взаимодействий и картирования участков взаимодействий между хампином и некоторыми белками

Характеристика некоторых партнеров хампина и их ко-локализация в клетке

Необычные свойства ТТС4 и регуляция его внутриклеточной локализации

Внутриклеточная локализация белков NELF-C и NELF-D—.

ГЛАВА 3: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР, использованные в работе

Конструирование экспрессирующих плазмидных ДНК -.

Свойства белков, продуцированных в бактериях

Методы исследования

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ-----------------------------------------------------.-.-.

Актуальность проблемы

Одним из главных подходов в современной науке биоорганической химии является использование высокопоточных методов для анализа структурных компонентов живой клетки и организма в целом. К таким методам в нашу «постгеномную эру» следует отнести анализ протеомов организмов, изучение совокупности всех белок-белковых взаимодействий в рамках конкретного протеома, называемой термином «интерактом», а также ряд других - изучение «метаболома», «деградома» и прочих. Предполагается, что создание полных карт взаимодействий между биомолекулами (в данном случае белками) позволит лучше понять принципы функционирования живого организма. Действительно, такая информация важна как с точки зрения фундаментальной науки, так и с точки зрения ее практических приложений, в особенности, - для медицины. Несмотря на достаточно глобальный характер этой задачи, уже сейчас можно утверждать, что она не является невыполнимой. Развитие методов в изучении белок-белковых взаимодействий уже позволяет аннотировать предварительные карты белковых взаимодействий целых организмов, например, полные для дрожжей () или частичные для человека О- В то же время, учитывая специфические особенности отдельных белков в картах интерактомов будут оставаться^ «темные пятна». В таких случаях основная надежда остается на усилия небольших групп ученых, применяющих низкопоточные методы, и решающих такие проблемы применительно к особенностям индивидуальных белков. Не следует также забывать, что важным критерием характеристики взаимодействия между белками*, является его функциональная значимость. Для решения таких задач пока еще не существует универсальных высокопоточных подходов.

Ранее в нашей лаборатории был идентифицирован фрагмент белка, кодируемого геном мыши 4121402002Шк, как возможный партнер бета-субъединицы семейства Х,К-АТФаз Рм в бактериальной двугибридной системе. Анализ консервативности данного гена у млекопитающих показал, что кодируемые им белки у млекопитающих имеют высокую степень гомологии: 100% идентичности первичной структуры между белками человека и шимпанзе и 95% идентичности между белками человека и мыши. В то же время, анализ баз данных маркеров экспрессируемых последовательностей указывал на также существование альтернативного сплайсинга первичного транскрипта данного гена. Функция этого нового белка, названного нами «хампином», была неизвестной. Единственной работой, в которой выдвигались предположения о возможной функции хампина, была работа Марина 0, в которой он показал, что хампин является отдаленным гомологом хорошо изученного белка дрозофилы, белка MSL1. Последний является компонентом рибонуклеопротеидного комплекса MSL (синонимы — «компенсасома», «комплекс компенсации дозы гена» DCC), участвующего в реорганизации структуры хроматина у самцов мух рода Drosophila, и избирательно повышающего его активность в 2 раза, по сравнению с Х-хромосомами самок 0- Современные данные о механизме работы компенсасомы дрозофил позволяют утверждать, что белок MSL1 является структурным компонентом комплекса, важным для корректной ассоциации компенсасомы со специфическими участками хроматина. С другой стороны, млекопитающие не используют компенсасомы для компенсации дозы гена Q. Поэтому гомология между хампином и белком MSL1 может быть причиной их общих функций, сохранившихся в процессе эволюции и, по-видимому, связанных с консервативными механизмами реорганизации структуры хроматина применительно к регуляции экспрессии генов.

Учитывая интерес, который вызывают в настоящее время исследования в области механизмов регуляции экспрессии генов, мы решили сфокусировать свое внимание на изучении структуры и функции нового белка хампина. Данная работа представляется актуальной как с точки зрения изучения свойств данного белка, так и с точки зрения? развития методологии изучения новых, ^охарактеризованных белков протеома млекопитающих.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было изучение свойств и. особенностей хампина млекопитающих применительно к его роли в глобальном интерактоме млекопитающих. Поэтому в ходе настоящей работы предполагалось решить следующие задачи:

1. Изучить первичную структуру изоформ хампина в модельном организме мыши, а также характер их распределения в различных тканях.

2. провести сравнение первичных структур гомологов хампина у других организмов и выяснить, какие из участков его первичной структуры подверглись наибольшим изменениями, а какие являются наиболее консервативными.

3. определить внутриклеточную локализацию изоформ хампина в организме мыши и выяснить, какими участками его структуры она обеспечивается.

4. с помощью дрожжевой двугибридной системы провести поиск белок-белковых взаимодействий хампина в организме мыши.

5. подтвердить взаимодействия, идентифицированные в дрожжевой двугибридной системе, с помощью альтернативных методов - связывания in vitro, ко-локализации или функционально.

Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе работы нами было впервые изучено разнообразие изоформ хампина в организме мыши, образующееся в результате альтернативного сплайсинга кодирующей мРНК. Интересной особенностью оказалось, что разные изоформы белка являются результатом использования разных комбинаций экзонов.

На основании сравнения первичных структур хампина и его гомологов в организмах животных мы показали, что гены, кодирующие белки данного семейства, присутствуют у членистоногих и позвоночных животных, отсутствуя у круглых червей и представителей других царств эукариот - растений и грибов. С помощью обратной транскрипции — ПЦР мы показали, что отдельные изоформы хампина содержатся виртуально во всех тканях, тогда как по крайней мере две из его изоформ специфичны для семенников.

Мы также изучили внутриклеточную локализацию всех изоформ хампина в организме мыши. Оказалось, что все они имеют ядерную локализацию. Сравнительный анализ структуры изоформ показал, что в молекуле хампина имеет место существование по крайней мере двух сигналов ядерной локализации - одного, неизвестного ранее и? присущего всем изоформам хампина, и другого, который содержится в последовательности высоконсервативного домена РЕНЕ и, вероятно, функционирует как добавочный.

Независимо от зарубежных групп исследователей, мы показали, что, как и MSL1 дрозофилы, хампин млекопитающих способен взаимодействовать с ацетилтрансферазой. гистонов семейства MYST1 через свой высоко консервативный домен РЕНЕ. Таким' образом, одной из его консервативных функций является взаимодействие с ацетилтрансферазой гистонов MYST1, важной для ацетилирования гистона Н4 по остатку К16 как у млекопитающих, так и дрозофилы.

С помощью дрожжевой двугибридной системы мы открыли ряд новых взаимодействий хампина, неизвестных для его гомолога MSL1, и связывающих его функцию с регуляцией активности ДНК-полимеразы альфа (р180) и некоторых белков-супрессоров опухолей. Большинство открытых взаимодействий было подтверждено с помощью методов аффинной хроматографии. В ходе проведения данных экспериментов была разработана новая система гибридных белков, позволяющая изучать белок-белковые взаимодействия in vitro.

Дополнительно, в ходе работы был проведен структурно-функциональный.анализ некоторых малоизученных белков-партнеров хампина и MYST1: ТТС4, NELF-C, ТТС35 и его партнера RASSF1C.

В целом полученные результаты позволяют реконструировать фрагмент интерактома млекопитающих, содержащий в своем центре белок хампин и указывают на то, что он является важным компонентом некоторых сигнальных путей, происходящих в клеточном ядре. В то же время, сложность структуры узла интерактома применительно к отдельно взятому белку показывает, насколько мало изучены в наше время такие процессы как регуляция транскрипции РНК-полимеразой II или ацетилирование гистонов. Безусловно, данные результаты являются дополнительным стимулом в изучении интерактома млекопитающих.

Стоит отметить, что выполненная работа представляет не только теоретический, но и практический интерес: полученные данные проливают свет на аспекты функционирования жизненно важных систем клетки, имеющих нарушенную функцию в ходе злокачественной трансформации. Так, недавно было обнаружена взаимосвязь между функцией белка МУ8Т1 и трансформацией клеток 0> запуском АТМ-зависимых сигнальных каскадов в ответ на повреждение структуры геномной ДНК ()> а также его роль в регуляции супрессорной активности широко известного белка р53 О- С другой стороны, функция белков КА8БР1С и ТТС4 в механизмах супрессии опухолей остается, малоизученной в наши дни. Очевидно, что открытие новых функциональных взаимосвязей для всех этих белков является важной вехой в изучении их функции и, как следствие, в разработке новых средств терапии рака.

выводы

1. Установлена структура изоформ хампина в организме мыши и изучен характер их тканевой специфичности. Три изоформы (А, В, С) содержатся во всех тканях, тогда как две остальные (D, Е) имеют тканевую специфичность, ограниченную семенниками.

2. Показано, что все изоформы хампина мыши локализуются в клеточном ядре, причем некоторые из изоформ имеют по два участка последовательности, ответственных за сортировку в клеточное ядро.

3. С помощью дрожжевой двугибридной системы открыты взаимодействия хампина А с рядом ядерных и малоизученных белков - MYST1, NOP 17, ТТС4, KIAA0103 и GC BP, а также новые взаимодействия для некоторых из его партнеров.

4. Предложена новая система белковых меток на основе полипептидов D1HTH, HMPL и CBD, позволяющая подтверждать белковые взаимодействия in vitro. Ее применимость опробована на примере взаимодействия «хампин-MYSTl».

5. Большинство белковых взаимодействий, открытых с помощью двугибридного скрининга, подтверждено с помощью альтернативных подходов, таких как связывание in vitro и ко-локализация белков в клетке.

6. Показано, что домен хампина IVpehe участвует во взаимодействии с; белками ТТС35, NOP 17 и MYST1, тогда как центральный регион белка, включающий в себя домены Нее и III, взаимодействует с белком ТТС4.

7. Изучены свойства некоторых новых белков ядра, идентифицированных в ходе работы: ТТС4, RASSF1C и других.

БЛАГОДАРНОСТИ

1. Cosgrove MS, Wolberger С. How does the histone code work? Biochem CellBiol. 2005 Aug; 83(4):468-76.

2. Turner BM. Cellular memory and the histone code. Cell. 2002 Nov 1;111(3):285-91.

3. Sterner DE, Berger SL. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol Mol Biol Rev. 2000 Jun;64(2):435-59.

4. Clayton AL, Hazzalin CA, Mahadevan LC. Enhanced histone acetylation and transcription: a dynamic perspective. Mol Cell. 2006 Aug 4;23(3):289-96.

5. Neal КС, Pannuti A, Smith ER, Lucchesi JC. A new human member of the MYST family of histone acetyl transferases with high sequence similarity to Drosophila MOF. Biochim Biophys Acta. 2000 Jan 31;1490(l-2):170-4.

6. Taipale M, Rea S, Richter K, Vilar A, Lichter P, Imhof A, Akhtar A. hMOF histone acetyltransferase is required for histone H4 lysine 16 acetylation in mammalian cells. Mol Cell Biol. 2005 Aug;25(l 5):6798-810.

7. Shogren-Knaak M, Ishii H, Sun JM, Pazin MJ, Davie JR, Peterson CL. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 2006 Feb 10; 311(5762):844-7.

8. Gupta A, Sharma GG, Young CS, Agarwal M, Smith ER, Paull TT, Lucchesi JC, Khanna KK, Ludwig T, Pandita TK. Involvement of human MOF in ATM function. Mol Cell Biol. 2005 Jun;25( 12): 5292-3 05.

9. R I. Dmitriev, TV Korneenko, АА Bessonov, MI. Shakhparonov, NN. Modyanov, NB Pestov. Characterization of hampin/MSLl as a node in the nuclear interactome Biochemical and Biophysical Research Communications (2007) 355, 1051-1057.

10. Taipale M, Akhtar A. Chromatin mechanisms in Drosophila dosage compensation. Prog Mol Subcell Biol. 2005;38:123-49.

11. Belote J., Lucchesi J. Male-specific lethal mutations of Drosophila melanogaster. Genetics 1980, 96, 165-186.

12. Kuroda MI, Keraan MJ, Kreber R, Ganetzky B, Baker BS. The maleless protein associates with the X chromosome to regulate dosagecompensation in Drosophila. Cell. 1991 Sep 6;66(5):935-47.

13. Palmer MJ, Mergner VA, Richman R, Manning JE, Kuroda MI, Lucchesi JC. The male-specific lethal-one (msl-1) gene of Drosophila melanogaster encodes a novel protein that associates with the X chromosome in males. Genetics. 1993 Jun;134(2):545-57.

14. Morales V, Straub T, Neumann MF, Mengus G, Akhtar A, Becker PB. Functional integration of the histone acetyltransferase MOF into the dosage compensation complex.

15. Marin I. Evolution of chromatin-remodeling complexes: comparative genomics reveals the ancient origin of "novel" compensasome genes. J Mol Evol. 2003 May;56(5):527-39.

16. Beckmann K, Grskovic M, Gebauer F, Hentze MW. A dual inhibitory mechanism restricts msl-2 mRNA translation for dosage compensation in Drosophila. Cell. 2005 Aug 26;122(4):529-40.

17. Abaza I, Coll O, Patalano S, Gebauer F. Drosophila UNR'is required for translational repression of male-specific lethal 2 mRNA during regulation of X-chromosome dosage compensation. Genes Dev. 2006 Feb l;20(3):380-9.

18. Kelley RL, Solovyeva I, Lyman LM, Richman R, Solovyev V, Kuroda MI. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 1995 Jun 16;81(6):867-77.

19. Borden KL, Freemont PS. The RING finger domain: a recent example of a sequence-structure family. Curr Opin Struct Biol. 1996 Jun;6(3):395-401.

20. Copps K, Richman R, Lyman LM, Chang KA, Rampersad-Ammons J, Kuroda MI. Complex formation by the Drosophila MSL proteins: role of the MSL2 RING finger in protein complex assembly. EMBO J. 1998 Sep 15;17(18):5409-17.

21. Lyman LM, Copps K, Rastelli L, Kelley RL, Kuroda MI. Drosophila male-specific lethal-2 protein: structure/function analysis and dependence on MSL-1 for chromosome association. Genetics. 1997 Dec; 147(4): 1743-53.

22. Straub T, Neumann MF, Prestel M, Kremmer E, Kaether C, Haass C, Becker PB. Stable chromosomal association of MSL2 defines a dosage-compensated nuclear compartment. Chromosoma. 2005 Nov;l 14(5):352-64. Epub 2005 Nov 12.

23. Gorman M, Franke A, Baker BS. Molecular characterization of the male-specific lethal-3 gene and investigations of the regulation of dosage compensation in Drosophila. Development. 1995 Feb;121(2):463-75.

24. Koonin EV, Zhou S, Lucchesi JC. The chromo superfamily: new members, duplication of the chromo domain and possible role in delivering transcription regulators to chromatin. Nucleic Acids Res. 1995 Nov 11;23(21):4229-33.

25. Morales V, Regnard C, Izzo A, Vetter I, Becker PB. The MRG domain mediates the functional integration of MSL3 into the dosage compensation complex. Mol Cell Biol. 2005 Jul;25(14):5947-54.

26. Buscaino A, Kocher T, Kind JH, Holz H, Taipale M, Wagner K, Wilm M, Akhtar A. MOF-regulated acetylation of MSL-3 in the Drosophila dosage compensation complex. Mol Cell. 2003 May; 11 (5): 1265-77.

27. Buscaino A, Legube G, Akhtar A. X-chromosome targeting and dosage compensation are mediated by distinct domains in MSL-3. EMBO Rep. 2006 May;7(5):531-8. Epub 2006 Mar 10.

28. Lee CG, Chang KA, Kuroda MI, Hurwitz J. The NTPase/helicase activities of Drosophila maleless, an essential factor in dosage compensation. EMBO J. 1997 May 15;16(10):2671-81.

29. Lee CG, Reichman TW, Baik T, Mathews MB. MLE functions as a transcriptional regulator of the roX2 gene. J Biol Chem. 2004 Nov 12;279(46):47740-5. Epub 2004 Sep 9.

30. Bone JR, Lavender J, Richman R, Palmer MJ, Turner BM, Kuroda MI. Acetylated histone H4 on the male X chromosome is associated with dosage compensation in Drosophila. GenesiDev. 1994 Jan;8(l):96-104.

31. Gu W, Szauter P, Lucchesi JC. Targeting of MOF, a putative histone acetyl transferase, to the X chromosome of Drosophila melanogaster. Dev Genet. 1998;22(l):56-64.

32. Smith ER, Pannuti A, Gu W, Steurnagel A, Cook RG, Allis CD, Lucchesi JC. The drosophila MSL complex acetylates histone H4 at lysine 16, a chromatin modification linked to dosage compensation. Mol Cell Biol. 2000 Jan;20(l):312-8.

33. Franke A, Baker BS. The roxl and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila. Mol Cell. 1999 Jul;4(l):l 17-22.

34. Kelley RL. Path to equality strewn with roX. Dev Biol. 2004 May 1 ;269(1): 18-25.

35. Oh H, Park Y, Kuroda MI. Local spreading of MSL complexes from roX genes on the Drosophila X chromosome. Genes Dev. 2003 Jun 1;17(11):1334-9.

36. Fagegaltier D, Baker BS. X chromosome sites autonomously recruit the dosage compensation complex in Drosophila males. PLoS Biol. 2004 Nov;2(l l):e341. Epub 2004 Oct 5.

37. Deng X, Rattner BP, Souter S, Meller VH. The severity of roXl mutations is predicted by MSL localization on the X chromosome. Mech Dev. 2005 0ct;122(10):1094-105.

38. Jin Y, Wang Y, Johansen J, Johansen KM. JIL-1, a chromosomal kinase implicated in regulation of chromatin structure, associates with the male specific lethal (MSL) dosage compensation complex. J Cell Biol. 2000 May 29; 149(5): 1005-10.

39. Lerach S, Zhang W, Deng H, Bao X, Girton J, Johansen J, Johansen KM. JIL-1 kinase, a member of the male-specific lethal (MSL) complex, is necessary for proper dosage compensation of eye pigmentation in Drosophila. Genesis. 2005 Dec;43(4):213-5.

40. Gilfillan GD, Straub T, de Wit E, Greil F, Lamm R, van Steensel B, Becker PB. Chromosome-wide gene-specific targeting of the Drosophila dosage compensation complex. Genes Dev. 2006 Apr l;20(7):858-70. Epub 2006 Mar 17.

41. Corona DF, Clapier CR, Becker PB, Tamkun JW. Modulation of ISWI function by site-specific histone acetylation. EMBO Rep. 2002 Mar;3(3):242-7.

42. Furuhashi H, Nakajima M, Hirose S. DNA supercoiling factor contributes to dosage compensation in Drosophila. Development. 2006 Nov;133(22):4475-83. Epub 2006 Oct 11.

43. J.C. Lucchesi, W.G. Kelly, B. Panning, Chromatin remodeling in dosage compensation, Annu. Rev. Gen., 39(2005)615-651.

44. Minakhina S, Yang J, Steward R. Tamo selectively modulates nuclear import in Drosophila. Genes Cells. 2003 Apr;8(4):299-310.

45. Marin I, Baker BS. Origin and evolution of the regulatory gene male-specific lethal-3. Mol Biol Evol. 2000 Aug; 17(8): 1240-50.

46. Tominaga K, Kirtane B, Jackson JG, Ikeno Y, Ikeda T, Hawks C, Smith JR, Matzuk MM, Pereira-Smith OM. MRG15 regulates embryonic development and cell proliferation. Mol Cell Biol. 2005 Apr;25(8):2924-37.

47. Prakash SK, Van den Veyver IB, Franco B, Volta M, Ballabio A, Zoghbi HY. Characterization of a novel chromo domain gene in xp22.3 with homology toDrosophila msl-3.

48. Sanjuan R, Marin I. Tracing the origin of the compensasome: evolutionary history of DEAH helicase and MYST acetyltransferase gene families. Mol Biol Evol. 2001 Mar;18(3):330-43.

49. Eisen A, Utley RT, Nourani A, Allard S, Schmidt P, Lane WS, Lucchesi JC, Cote J. The yeast NuA4 and Drosophila MSL complexes contain homologous subunits important for transcription regulation. J Biol Chem. 2001 Feb 2;276(5):3484-91. Epub 2000 Oct 17.

50. Doyon Y, Cote J. The highly conserved and multifunctional NuA4 HAT complex. Curr Opin Genet Dev. 2004 Apr; 14(2): 147-54.

51. Dou Y, Milne TA, Tackett AJ, Smith ER, Fukuda A, Wysocka J, Allis CD, Chait BT, Hess JL, Roeder RG. Physical association and coordinate function of the H3 K4 methyltransferase MLL1 and the H4 K16 acetyltransferase MOF. Cell. 2005 Jun 17;121(6):873-85.

52. Li D, Burch P, Gonzalez O, Kashork CD, Shaffer LG, Bachinski LL, Roberts R. Molecular cloning, expression analysis, and chromosome mapping of WDR6, a novel human WD-repeat gene. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Jul 21;274(1):117-23.

53. Sykes SM, Meliert HS, Holbert MA, Li K, Marmorstein R, Lane WS, McMahon SB. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 2006 Dec 28;24(6):841-51.

54. Strahl, B. D., and Allis, C. D. (2000) Nature 403, 41-45

55. Imbalzano, A. T., and Xiao, H. (2004) Adv. Protein Chem. 67, 157-179

56. Van Holde K, Zlatanova J., Scanning Chromatin: A new paradigm? J. Biol. Chem. 2006, 281, 12197-12200.

57. Thomas, J. O., and Rees, C. (1983) Eur. J. Biochem. 134, 109-115

58. Caron, F., and Thomas, J. 0.(1981) J. Mol. Biol. 146,513-537

59. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., and Kenworthy, A. (2001) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444456

60. Goulian, M., and Simon, S. M. (2000) Biophys. J. 79, 2188-2198

61. Misteli, T., Gunjan, A., Hock, R., Bustin, M., and Brown, D. T. (2000) Nature 408, 877-881

62. Phair, R. D., Scaffidi, P., Elbi, C., Vecerova, J., Dey, A., Ozato, K., Brown, D. T., Hager, G., Bustin, M., and Misteli, T. (2004) Mol. Cell. Biol. 24, 6393-6402

63. Polach, K. J., and Widom, J. (1995) J. Mol. Biol. 254, 130-149

64. Li, G., and Widom, J. (2004) Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 763-769

65. Szabo, A., and Shoup, D. (1982) J. Chem. Phys. 77, 4484-4493

66. Zhou, H.-X. (1998) J. Chem. Phys. 108, 8146-8154

67. Zhou, H.-X., Wlodek, S. T., and McCammon, J. A. (1998) PNAS 95, 9280-9283

68. Chen, D., Dundr, M., Wang, C., Leung, A., Lamond, A., Misteli, T., and Huang,S. (2005) J.Cell Biol 168,41-54.

69. Catez, F., Yang, H., Tracey, K.J., Reeves, R., Misteli, T., and Bustin, M. (2004) Mol. Cell. Biol. 24,4321-4378

70. Green, M. (2005) Mol. Cell 18, 399^102.